CN111454872A - 禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株及其构建方法和应用 - Google Patents

禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111454872A
CN111454872A CN202010180295.0A CN202010180295A CN111454872A CN 111454872 A CN111454872 A CN 111454872A CN 202010180295 A CN202010180295 A CN 202010180295A CN 111454872 A CN111454872 A CN 111454872A
Authority
CN
China
Prior art keywords
clpv
gene
strain
pcr
escherichia coli
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010180295.0A
Other languages
English (en)
Inventor
孟霞
王亨
钟昊然
李建基
朱国强
陈艳飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangzhou University
Original Assignee
Yangzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangzhou University filed Critical Yangzhou University
Priority to CN202010180295.0A priority Critical patent/CN111454872A/zh
Publication of CN111454872A publication Critical patent/CN111454872A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株及其构建方法和应用，用于禽致病性大肠杆菌的致病机理的研究和防控。利用Red同源重组系统成功构建APEC TW‑XM菌株的clpV基因缺失株，获得缺失株TW‑XM△clpV。将clpV基因克隆到表达载体pBR322中，转化入缺失株TW‑XM△clpV，获得相应的基因回补株TW‑XMC△clpV。本发明通过腹腔注射大肠杆菌构建小鼠感染动物模型，检测发现脑、血、肺组织载菌量以及脑组织中脑膜炎相关炎症因子mRNA的表达均显著下降。证明clpV与APEC致病力密切相关。

Description

禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株及其构建方 法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，提供了一种禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株及其构建方法和应用。
背景技术
禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)脑膜炎是危害家禽业传染病之一，至今尚无有效的防治措施。大肠杆菌作为一种革兰氏阴性细菌，可释放一种多功能的杀伤武器T6SS(Type VI secretion system)，其分布广泛，功能多样，并且与细菌致病性密切相关。ClpV是T6SS的ATP酶，对T6SS系统的功能至关重要，研究发现ClpV是假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)重要的毒力基因，但ClpV是否与大肠杆菌致病性以及脑膜炎相关却鲜有研究。Red同源重组是大肠杆菌基因敲除的传统方法，但利用其构建clpV基因缺失株却未见资料可寻。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例提供一种禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株及其构建方法和应用。
为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：
第一方面，提供一种禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株，为敲除了clpV基因的禽致病性大肠杆菌株。
第二方面，提供所述的禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株的构建方法，利用Red同源重组系统构建APEC TW-XM菌株的clpV基因缺失株，获得缺失株TW-XM△clpV；包括：
S1、引物设计
根据GenBank中APEC TW-XM菌株的已知clpV基因序列设计引物P1/P2，用于扩增APEC TW-XM中的clpV基因，并可用于鉴定基因缺失突变株；
鉴定引物P1/P2：P1序列如SEQ ID NO.1所示；P2序列如SEQ ID NO.2所示；
P1：5′-TGCGGAGATAACCATTGAACAC-3′
P2：5′-ATCCCAGCCAAGCCGTAGTT-3′
设计一对同源重组引物P3/P4，使其5'端与clpV基因两翼序列同源，3'端与质粒pKD3中氯霉素抗性基因Cat两侧序列同源；P3序列如SEQ ID NO.3所示；P4序列如SEQ IDNO.4所示；
P3:5′-CTGATTGCCTCGCTGGAAGGCGACGACCCGCAAATCCGCAGTCAGCACTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3′
P4:5′-TGGTCATACAGGCTGTCGTTGATTTCCGTTTCCAGTCCGTAGTGCTGGCATATGAATATCCTCCTTAG-3′
S2、融合PCR产物的制备
以质粒pKD3为模板，P3/P4为引物进行PCR，扩增出两翼为clpV基因上下游同源序列，中间为氯霉素抗性基因Cat的DNA片段；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后采用琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化，得到纯化PCR产物；
S3、Red重组功能的诱导和感受态细胞的制备
将携带有质粒pKD46的APEC TW-XM接种于含有L-阿拉伯糖的LB培养基中，诱导培养，使pKD46中的Exo、Bet及Gam蛋白充分表达；将APEC TW-XM制备成感受态细胞；
S4、一次同源重组菌的构建及PCR鉴定
将S2中得到的纯化PCR产物与S3中制备的感受态细胞混匀，加入到Bio-Rad电击杯中，进行电击转化；将转化产物涂布于含有Amp和Cm抗性的LB平板，30℃培养过夜；次日挑取单菌落制备模板，以P1/P2为引物进行PCR鉴定，筛选获得clpV基因一次同源重组突变株TW-XM△clpV::Cat；
S5、二次同源重组菌的构建与鉴定
制备TW-XM△clpV::Cat的感受态细胞，按照S4的方法导入pCP20质粒并将转化产物涂布于含Amp和Cm双抗性的LB平板上，30℃培养筛选阳性转化子；将阳性转化子转接到无抗性的LB培养基中，42℃培养传代2～3次，划线分离单菌落并于37℃培养过夜，对各个单菌落进行Amp+和Cm+抗性检测，筛选出对二者均敏感的突变株；以P1/P2为引物进行PCR，经PCR鉴定和PCR产物测序，获得clpV基因缺失且不含抗生素标签的突变株；为TW-XM△clpV。
在一些实施例中，S2中，PCR程序为94℃4min；94℃30s，52℃60s，72℃60s，10个循环；94℃30s，63℃60s，72℃60s，25个循环；最后72℃延伸10min。
在一些实施例中，S4、S5中，PCR程序为94℃4min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，25个循环；最后72℃延伸10min。
在一些实施例中，S4中，在电压1.8kV，脉冲25μF，电阻200Ω的参数下进行电击转化。
在一些实施例中，所述的禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株的构建方法，还包括将clpV基因克隆到表达载体pBR322中，转化入缺失株TW-XM△clpV，获得相应的基因回补株TW-XMC△clpV，具体包括：
设计一对表达引物P5/P6；P5序列如SEQ ID NO.5所示；P6序列如SEQ ID NO.6所示；
P5：5′-TAACGCAGTCAGGCACCGTGTGGAAACCCTTCTATGACAGGAAATCA-3′
P6：5′-GTGAATCCGTTAGCGAGGTGCCTTATTGCATCTCTTCCGTAGCGA-3′
clpV基因回补株的构建与鉴定：以APEC TW-XM基因组DNA为模板，P3/P4为引物，PCR扩增得到clpV基因，经测序验证正确后克隆至表达载体pBR322中，进一步将重组质粒pBR322-clpV转化至TW-XM△clpV株，得到回补株TW-XMC△clpV。
第三方面，提供所述的禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株在制备禽致病性大肠杆菌减毒疫苗中的应用。
相对于现有技术，本申请取得了以下有益效果：
本发明利用Red同源重组系统成功构建APEC TW-XM菌株的clpV基因缺失株，获得缺失株TW-XM△clpV。将clpV基因克隆到表达载体pBR322中，转化入缺失株TW-XM△clpV，获得相应的基因回补株TW-XMC△clpV。为了进一步探究clpV基因的缺失是否会影响APEC毒力，本申请通过腹腔注射大肠杆菌构建小鼠感染动物模型，检测发现脑、血、肺组织载菌量以及脑组织中脑膜炎相关炎症因子mRNA的表达均显著下降。证明clpV与APEC致病力密切相关。本申请有助于深入了解ClpV在APEC致病性上的作用，为进一步研究APEC的致病机理及其防控奠定了基础。
附图说明
图1为融合PCR产物的鉴定图(M:DL2000 DNA Marker,1:The Cat gene amplifiedwith primer P3/P4)；
图2为一次重组菌TW-XM△clpV::Cat的PCR鉴定图(M:DL5000 DNA Marker,1:Widetype clpV；2:TW-XM△clpV::Cat)；
图3为二次重组菌TW-XM△clpV的PCR鉴定图(M:DL5000 DNA Marker,1:Wide typeclpV；2:TW-XM△clpV)；
图4为回补株TW-XMC△clpV的PCR鉴定图(M:DL5000 DNA Marker,1:Wide typeclpV；2:TW-XMC△clpV)；
图5为小鼠脑、血、肺组织载菌量结果(注：“**”表示APEC TW-XM组与TW-XM△clpV组相比较，差异极显著(P＜0.01)；“##”表示TW-XM△clpV组与TW-XMC△clpV组相比较，差异极显著(P＜0.01))；
图6为小鼠脑组织炎症因子表达结果(注：“**”表示APEC TW-XM组与TW-XM△clpV组相比较，差异极显著(P＜0.01)；“##”表示TW-XM△clpV组与TW-XMC△clpV组相比较，差异极显著(P＜0.01))。
具体实施方式
1材料
1.1主要仪器与设备
MicroPulserElectroporator(Bio-Rad)；PCR仪(Bio-Rad)；荧光定量PCR仪(ABI7500)。
1.2主要菌株、质粒、试剂
菌株APEC TW-XM；质粒pKD3、pKD46、pCP20、pBR322(TaKaRa)；氯化钠、胰蛋白胨，酵母提取物(Oxoid)；氨苄青霉素、氯霉素(生工生物工程有限公司，上海)；ExTaq DNA聚合酶、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker(TaKaRa)；L-阿拉伯糖(Sigma)；Faststart Universal SYBR GREEN Master(ROX)荧光定量试剂盒(Roche)。
1.3实验动物四周龄ICR小鼠(扬州大学比较医学中心)
2方法
2.1 clpV缺失株及回补株的构建
2.1.1引物合成与设计
根据GenBank中APEC TW-XM菌株的已知clpV基因序列设计引物P1/P2，用于扩增APEC TW-XM中的clpV基因，并可用于鉴定基因缺失突变株。此外，设计一对同源重组引物P3/P4，使其5'端与clpV基因两翼序列同源(用下划线标出)，3'端与质粒pKD3中氯霉素抗性基因Cat两侧序列同源(用下划线标出)。设计一对表达引物P5/P6，将clpV基因克隆至表达载体pBR322中。
所有引物均由擎科生物技术公司合成，引物序列见表1。
表1构建clpV基因缺失株与回补株引物序列
Figure BDA0002412289470000051
2.1.2融合PCR产物的制备和纯化
以质粒pKD3为模板，P3/P4为引物进行PCR，扩增出两翼为clpV基因上下游同源序列，中间为氯霉素抗性基因Cat的DNA片段。PCR程序为94℃4min；94℃30s，52℃60s，72℃60s，10个循环；94℃30s，63℃60s，72℃60s，25个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后采用琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化，测定DNA浓度，-20℃保存备用。2.1.3Red重组功能的诱导和感受态细胞的制备
将携带有质粒pKD46的APEC TW-XM接种于含有L-阿拉伯糖(终浓度30mmol/L)的LB培养基中，30℃诱导培养1h，使pKD46中的Exo、Bet及Gam蛋白充分表达。将APEC TW-XM制备成感受态细胞，40μL每管分装，-70℃保存备用。
2.1.4一次同源重组菌的构建及PCR鉴定
将2.1.2中得到的100ng纯化PCR产物与2.1.3中制备的40μL感受态细胞混匀，加入到0.1cm的Bio-Rad电击杯中，在电压1.8kV，脉冲25μF，电阻200Ω的参数下进行电击转化。将转化产物涂布于含有Amp和Cm抗性(Amp+浓度为100μg/mL，Cm+浓度为34μg/mL)的LB平板，30℃培养过夜。次日挑取单菌落制备模板，以P1/P2为引物进行PCR鉴定，PCR程序为94℃4min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，25个循环；最后72℃延伸10min。筛选获得clpV基因一次同源重组突变株TW-XM△clpV::Cat。
2.1.5二次同源重组菌的构建与鉴定
制备TW-XM△clpV::Cat的感受态细胞，按照2.1.4所描述的方法导入pCP20质粒并将转化产物涂布于含Amp和Cm双抗性的LB平板上，30℃培养筛选阳性转化子。将阳性转化子转接到无抗性的LB培养基中，42℃培养传代2～3次，划线分离单菌落并于37℃培养过夜，对各个单菌落进行Amp+和Cm+抗性检测，筛选出对二者均敏感的突变株。以P1/P2为引物，PCR程序同2.1.4，经PCR鉴定和PCR产物测序，获得clpV基因缺失且不含抗生素标签的突变株。命名为TW-XM△clpV。
2.1.6 clpV基因回补株的构建与鉴定
以APEC TW-XM基因组DNA为模板，P3/P4为引物，PCR扩增得到clpV基因，经测序验证正确后克隆至表达载体pBR322中，进一步将重组质粒pBR322-clpV转化至TW-XM△clpV株，得到回补株TW-XMC△clpV，并经PCR和基因测序鉴定，PCR程序同2.1.4。
2.2动物模型的构建
2.2.1菌液制备
将保存的APEC TW-XM，TW-XM△clpV和TW-XMC△clpV菌株三区划线法接种于LB平板培养基上，置于37℃培养箱中18-24h，挑取单个菌落分别接种于相应抗性的LB液体培养基中，置于37℃摇床培养12h，之后按照1∶100的比例转接至LB培养基中培养至OD630nm为1，将菌液用灭菌PBS洗涤两次，用生理盐水重悬，调整浓度为1×107cfu/mL。
2.2.2实验动物准备及分组
按《实验动物饲养和使用手册》饲养和管理实验动物，给予营养丰富且均衡的食物，自由饮水。将40只四周龄ICR小鼠随机分为四组，每组10只，分别为APEC TW-XM组，TW-XM△clpV组，TW-XMC△clpV组以及空白对照组。将上述浓度为1×107cfu/mL的菌液以每只100μL接种小鼠腹腔，接种100μL无菌生理盐水为空白对照组。观察各组小鼠脑膜炎发病症状。
2.3小鼠脑、血、肺组织载菌量的测定
攻菌12h后，在超净台中无菌采集各组小鼠脑、血、肺组织并称重，每个脏器加1mL无菌生理盐水，匀浆后利用平板计数法，在37℃环境下，置于37℃培养箱中12h后计数菌落形成单位。
2.4实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测炎症因子表达
取100mg小鼠脑组织提取RNA。以提取的RNA为模板，用反转录试剂盒合成DNA。设计大肠杆菌内参基因(GAPDH)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的定量检测引物用于分析脑部炎症因子mRNA相对表达情况。
所有引物均由擎科生物技术公司合成，引物序列见表2。
表2炎症因子的荧光定量PCR引物序列
Primer Sequences(5′-3′)
GAPDH-RT-F AACGGGAAGCCCATCACCATC
GAPDH-RT-R AAGACACCAGTAGACTCCACGA
IL-1β-RT-F ATGAAAGACGGCACACCCAC
IL-1β-RT-R GCTTGTGCTCTGCTTGTGAG
IL-6-RT-F TGCAAGAGACTTCCATCCAGT
IL-6-RT-R GTGAAGTAGGGAAGGCCG
IL-8-RT-F TGCTTTTGGCTTTGCGTTGA
IL-8-RT-R GTCAGAACGTGGCGGTATCT
TNFα-RT-F ACTGAACTTCGGGGTGATCG
TNFα-RT-R TGATCTGAGTGTGAGGGTCTGG
3统计与分析
将qRT-PCR获得的数据采用2-ΔΔCt法分析，采用Microsoft Excel统计载菌量数据，并用SPSS17.0数据分析软件进行方差和差异性分析。P＜0.01表示差异有极显著性意义。
4.结果
4.1融合PCR产物的制备和纯化
以质粒pKD3为模板，P3/P4为引物，PCR扩增出两侧与clpV基因上下游序列同源、中间为氯霉素抗性基因Cat的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳检测约为1100bp(图1)，与预期大小一致。表明扩增出了含氯霉素抗性基因Cat的clpV基因序列。
4.2一次同源重组菌的构建及PCR鉴定
融合PCR产物通过电转化导入含有pKD46的菌株中，经双抗(Amp++Cm+)筛选出阳性克隆，PCR扩增鉴定结果显示，对照野生菌：clpV扩增片段约2200bp，TW-XM△clpV::Cat重组体约1800bp(图2)，表明一次同源重组菌构建成功。
4.3二次同源重组菌的构建与鉴定
通过电转化将质粒pCP20导入TW-XM△clpV::Cat重组菌，经二次重组后筛选阳性克隆后PCR扩增鉴定结果显示，对照野生菌：clpV扩增片段约2200bp，重组体约为700bp(图3)，结果表明二次同源重组菌构建正确，将重组子命名为TW-XM△clpV。进一步对上述筛选的突变株clpV基因两侧序列克隆和序列测定，结果显示经二次重组后，突变株中clpV基因中氯霉素抗性基因Cat已完全消除，表明构建了clpV基因突变株TW-XM△clpV。
4.4 clpV基因回补株的构建与鉴定
以P1/P2为引物，将构建TW-XMC△clpV进行PCR检测。结果有两个特异性条带，其中700bp条带为clpV缺失株的二次同源重组条带，2200bp条带为回补质粒pBR322-clpV携带的clpV基因片段(图4)。测序验证显示序列结果正确，表明回补株TW-XMC△clpV构建正确。
4.5小鼠脑、血、肺组织载菌量
如图5，TW-XM△clpV组与APEC TW-XM组相比，小鼠脑、血、肺组织载菌量均极显著下降(P＜0.01)，其中TW-XM△clpV组脑组织未检测到细菌；TW-XMC△clpV组与TW-XM△clpV组相比各组织载菌量均极显著上升(P＜0.01)；APEC TW-XM组与TW-XMC△clpV组之间各组织载菌量无明显差异(P＞0.05)。
4.6脑组织炎症因子表达结果
如图6，APEC TW-XM组与对照组相比，小鼠脑部炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA相对表达量极显著升高(P＜0.01)；TW-XM△clpV组与APEC TW-XM组相比，各炎症因子mRNA表达量均极显著下降(P＜0.01)；APEC TW-XM组与TW-XMC△clpV组之间无统计学意义(P＞0.05)。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株及其构建方法和应用
<130> lyy2020031601
<141> 2020-03-16
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcggagata accattgaac ac 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcccagcca agccgtagtt 20
<210> 3
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgattgcct cgctggaagg cgacgacccg caaatccgca gtcagcactg tgtaggctgg 60
agctgcttcg 70
<210> 4
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggtcataca ggctgtcgtt gatttccgtt tccagtccgt agtgctggca tatgaatatc 60
ctccttag 68
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taacgcagtc aggcaccgtg tggaaaccct tctatgacag gaaatca 47
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgaatccgt tagcgaggtg ccttattgca tctcttccgt agcga 45

Claims (7)

1.禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株，其特征在于，为敲除了clpV基因的禽致病性大肠杆菌株。
2.权利要求1所述的禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株的构建方法，其特征在于，利用Red同源重组系统构建APEC TW-XM菌株的clpV基因缺失株，获得缺失株TW-XM△clpV；包括：
S1、引物设计
根据GenBank中APEC TW-XM菌株的已知clpV基因序列设计引物P1/P2，用于扩增APECTW-XM中的clpV基因，并可用于鉴定基因缺失突变株；
鉴定引物P1/P2：P1序列如SEQ ID NO.1所示；P2序列如SEQ ID NO.2所示；
设计一对同源重组引物P3/P4，使其5'端与clpV基因两翼序列同源，3'端与质粒pKD3中氯霉素抗性基因Cat两侧序列同源；P3序列如SEQ ID NO.3所示；P4序列如SEQ ID NO.4所示；
S2、融合PCR产物的制备：以质粒pKD3为模板，P3/P4为引物进行PCR，扩增出两翼为clpV基因上下游同源序列，中间为氯霉素抗性基因Cat的DNA片段；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后采用琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化，得到纯化PCR产物；
S3、Red重组功能的诱导和感受态细胞的制备
将携带有质粒pKD46的APEC TW-XM接种于含有L-阿拉伯糖的LB培养基中，诱导培养，使pKD46中的Exo、Bet及Gam蛋白充分表达；将APEC TW-XM制备成感受态细胞；
S4、一次同源重组菌的构建及PCR鉴定
将S2中得到的纯化PCR产物与S3中制备的感受态细胞混匀，加入到电击杯中，进行电击转化；将转化产物涂布于含有Amp和Cm抗性的LB平板，30 ℃培养过夜；次日挑取单菌落制备模板，以P1/P2为引物进行PCR鉴定，筛选获得clpV基因一次同源重组突变株TW-XM△clpV::Cat；
S5、二次同源重组菌的构建与鉴定
制备TW-XM△clpV::Cat的感受态细胞，按照S4的方法导入pCP20质粒并将转化产物涂布于含Amp和Cm双抗性的LB平板上，30 ℃培养筛选阳性转化子；将阳性转化子转接到无抗性的LB培养基中，42 ℃培养传代2～3次，划线分离单菌落并于37 ℃培养过夜，对各个单菌落进行Amp+和Cm+抗性检测，筛选出对二者均敏感的突变株；以P1/P2为引物进行PCR，经PCR鉴定和PCR产物测序，获得clpV基因缺失且不含抗生素标签的突变株；为TW-XM△clpV。
3.根据权利要求2所述的禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株的构建方法，其特征在于，S2中，PCR程序为94℃4min；94℃30 s，52℃60 s，72℃60 s，10个循环；94℃30 s，63℃60 s，72℃60 s，25个循环；最后72℃延伸10min。
4.根据权利要求2所述的禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株的构建方法，其特征在于，S4、S5中，PCR程序为94℃4min；94℃30s，57℃30 s，72℃30 s，25个循环；最后72℃延伸10min。
5.根据权利要求2所述的禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株的构建方法，其特征在于，S4中，在电压1.8 kV，脉冲25 μF，电阻200 Ω的参数下进行电击转化。
6.根据权利要求2所述的禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株的构建方法，其特征在于，还包括将clpV基因克隆到表达载体pBR322中，转化入缺失株TW-XM△clpV，获得相应的基因回补株TW-XMC△clpV，具体包括：
设计一对表达引物P5/P6；P5序列如SEQ ID NO.5所示；P6序列如SEQ ID NO.6所示；
clpV基因回补株的构建与鉴定：以APEC TW-XM基因组 DNA为模板，P3/P4为引物，PCR扩增得到clpV基因，经测序验证正确后克隆至表达载体pBR322中，进一步将重组质粒pBR322-clpV转化至TW-XM△clpV株，得到回补株TW-XMC△clpV。
7.如权利要求1所述的禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株在制备禽致病性大肠杆菌减毒疫苗中的应用。
CN202010180295.0A 2020-03-16 2020-03-16 禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株及其构建方法和应用 Pending CN111454872A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010180295.0A CN111454872A (zh) 2020-03-16 2020-03-16 禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010180295.0A CN111454872A (zh) 2020-03-16 2020-03-16 禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株及其构建方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111454872A true CN111454872A (zh) 2020-07-28

Family

ID=71677041

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010180295.0A Pending CN111454872A (zh) 2020-03-16 2020-03-16 禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111454872A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114317493A (zh) * 2022-01-06 2022-04-12 山东大学 适用于假单胞菌的基因组编辑系统及其构建方法与应用
CN115094079A (zh) * 2022-06-28 2022-09-23 上海交通大学 T6ss大肠杆菌工程菌及其构建方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108384865A (zh) * 2018-02-07 2018-08-10 扬州大学 Alpha菌毛基因在仔猪腹泻致病性大肠杆菌监测、鉴别中的应用
CN110055200A (zh) * 2019-01-07 2019-07-26 集美大学 一株变形假单胞菌clpV基因沉默菌株

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108384865A (zh) * 2018-02-07 2018-08-10 扬州大学 Alpha菌毛基因在仔猪腹泻致病性大肠杆菌监测、鉴别中的应用
CN110055200A (zh) * 2019-01-07 2019-07-26 集美大学 一株变形假单胞菌clpV基因沉默菌株

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FERNANDA DE PACE等: "The Type VI Secretion System Plays a Role in Type 1 Fimbria Expression and Pathogenesis of an Avian Pathogenic Escherichia coli Strain", 《INFECTION AND IMMUNITY》 *
JIALE MA等: "Two Functional Type VI Secretion Systems in Avian Pathogenic Escherichia coli Are Involved in Different Pathogenic Pathways", 《INFECTION AND IMMUNITY》 *
K A DATSENKO等: "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products", 《PROC NATL ACAD SCI U S A》 *
胡林等: "华东部分地区禽致病性大肠杆菌系统进化分群及毒力相关基因的检测", 《畜牧与兽医》 *
胡逢雪等: "大肠杆菌基因无痕敲除技术及策略", 《生物技术通讯》 *
钟昊然: "禽致病性大肠杆菌clpV基因缺失株的构建及其对Ⅰ型菌毛主要基因表达的影响", 《中国兽医学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114317493A (zh) * 2022-01-06 2022-04-12 山东大学 适用于假单胞菌的基因组编辑系统及其构建方法与应用
CN115094079A (zh) * 2022-06-28 2022-09-23 上海交通大学 T6ss大肠杆菌工程菌及其构建方法与应用
CN115094079B (zh) * 2022-06-28 2023-11-07 上海交通大学 T6ss大肠杆菌工程菌及其构建方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108531663B (zh) 鸭腺病毒DAdV-3和DAdV-A通用型检测引物及其应用
AU2016380351A1 (en) Novel CRISPR-associated transposases and uses thereof
CN110760511B (zh) 一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA、表达载体、CRISPR-Cas9系统
CN111454872A (zh) 禽致病性大肠杆菌VI型分泌系统clpV基因缺失株及其构建方法和应用
CN111778177B (zh) 一种牛支原体Mbov_0274基因突变株及其应用
CN107163113B (zh) 水稻半卷叶控制基因srl9及其叶形改良的用途
CN111748507A (zh) 一种牛支原体Mbov_0475基因突变株及其应用
CN113559134B (zh) 一种用于肿瘤治疗的药物
CN112342214B (zh) 一种靶向敲除斑点叉尾鮰zbtb38基因的sgRNA序列及其筛选方法
CN113444743A (zh) 含佐剂基因的羊支原体肺炎二价核酸疫苗的构建方法
CN114107304B (zh) 一种表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白的重组球虫载体及其检测方法
CN114134174B (zh) 一种LncRNA TUG1靶向调控hsa-miR-4638-3p的方法
CN111875678B (zh) 表达猪繁殖与呼吸综合征病毒gp3/gp5/m基因的重组伪狂犬病毒、构建方法和应用
CN109628361B (zh) 整合双拷贝功能性f4菌毛操纵子基因猪源益生菌ep1克隆株、构建方法及应用
CN110669714B (zh) 肠炎沙门菌减毒疫苗候选株的制备与应用
CN109504643B (zh) 整合四拷贝功能性f18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用
CN109593761B (zh) 一种与布鲁氏菌毒力相关的small RNA及其在制备弱毒布鲁氏菌中的应用
CN112226384B (zh) 一株导致广藿香青枯病的病原菌株及其应用
CN113652384A (zh) 一种副干酪乳杆菌s-nb基因缺失突变株及其构建方法和应用
US9340815B2 (en) Spontaneously immortalized avian cell line
CN109293751B (zh) 鼠疫耶尔森菌毒力相关蛋白sORF34及其编码基因与应用
CN110938577A (zh) 鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株、构建方法与应用
CN112941088B (zh) 与布氏杆菌毒力相关的基因及其在布氏杆菌毒力评价及制备弱毒布氏杆菌中的应用
WO2019237391A1 (zh) CRISPR/Cas9 靶向敲除人 TXGP1 基因及其特异性 gRNA
JP2009514506A (ja) Ｅ．コリ株ｄｓｍ６６０１のプラスミド不含のクローン

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200728