CN107429222B - 在体外培养分节丝状菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种培养分节丝状菌菌株的体外方法，其包括将真核宿主细胞与所述分节丝状菌菌株共培养，其中在丰富的组织培养液体培养基中，在低于5％的O₂水平下进行培养，所述丰富的组织培养液体培养基含有包括铁的细菌培养基组分。本发明还涉及用于遗传修饰分节丝状菌菌株的方法，其包括在体外培养菌株的步骤。

Description

在体外培养分节丝状菌的方法

技术领域

本发明涉及一种生长分节丝状菌(SFB)的体外方法。本发明还涉及用于遗传修饰SFB菌株的方法。

背景技术

分节丝状菌(Segmented filamentous bacteria，SFB)或分节丝状菌(Candidatusarthromitus)或Candidatus savagella或Arthromitus immunis或小鼠分节丝状菌(Arthromitus muris)是许多脊椎动物物种的肠(回肠末端(distal illeum))中发现的革兰氏阳性厌氧的、梭菌(Clostridia)相关的、形成孢子的共生体，所述脊椎动物物种包括小鼠、大鼠、兔子、鸟(例如，鸡)、鱼、两栖动物以及可能地人(Klaasen等人，1992；Yin等人，2012)。细丝的尺寸为0.5-1000μm长。SFB产生细胞内后代(Schnupf等人，2013；Ericsson等人，2014综述)。一旦形成的细胞内后代是单细胞的，直到它们开始细丝化(filament)并变成双细胞，然后成为三细胞。

对SFB已经获得了很大的兴趣，因为它们具有训练(educate)肠免疫系统和诱导生理性炎症的健康状态的独特能力(Schnupf等人，2013；Ivanov等人，2009)。SFB定植导致肠粘膜淋巴组织的成熟、诱导强的且广泛的IgA应答、刺激T细胞划分(compartment)、上调肠先天性防御调节子(mediators)，并诱导小肠Th17应答显著增加(Schnupf等人，2013；Ivanov等人，2009；Gaboriau-Routhiau等人，2009)。此外，SFB定植对全身应答起辅助作用，并且因此可以加剧脑炎和关节炎小鼠模型的病理，同时保护遗传易感小鼠免受I型糖尿病的发展(Lee等人，2011；Wu等人，2010；Chappert等人，2013；Kriegel等人，2011；Yurkovetskiy等人，2013)。

与其他共生体不同，分节丝状菌密切附着于回肠中的吸收性上皮细胞和覆盖派伊尔斑(Peyer’s patches)的细胞(Jepson等人，1993；Chase等人，1976)。这种定植不会导致病理；相反，它保护宿主免受病原体(Ivanov等人，2009)。

几种SFB菌株的基因组是本领域已知的。最近测序的大鼠和小鼠SFB基因组显示SFB的高度营养缺陷需求，并将SFB置于专性和兼性共生物(symbionts)之间(Pamp等人，2012)。这些发现表明，SFB从它们与宿主的相互作用中获得至少一些营养需求(Prakash等人，2011；Sczesnak等人，2011；Kuwahara等人，2011；Pamp等人，2012)。

然而，关于作为细菌的重要免疫刺激性能的基础的分节丝状菌-宿主相互作用的了解甚少，因为SFB已经抵抗体外培养50多年。

因此，需要一种在体外培养SFB的有效方法。

发明内容

本发明人已经在SFB的宿主以外的分节丝状菌-宿主细胞共培养系统中生长小鼠SFB。本发明人已经显示，在该系统中，从单定植(monocolonized)小鼠分离的单细胞SFB经历细丝化(filamentation)、分节(segmentation)并分化以释放活的感染性颗粒、单细胞的细胞内后代，其可以定植小鼠以诱导特征性免疫应答。本发明人还在该共培养系统中观察到SFB孢子的形成。在体外，细胞内后代可以附着于小鼠和人宿主细胞，并募集肌动蛋白。此外，SFB可以有力地刺激宿主先天性防御基因、炎性细胞因子和趋化因子的上调。SFB的这些免疫刺激性能增加了宿主对病原体的抗性，并且可以被利用以指导针对感兴趣的特定病原体的免疫。

因此，本发明提供了一种培养分节丝状菌(SFB)菌株的体外方法，其包括用真核宿主细胞、优选哺乳动物宿主细胞、更优选人宿主细胞与所述分节丝状菌共培养，其中在低于5％、优选低于4％的O₂水平下，在丰富的组织培养液体培养基中进行培养，所述丰富的组织培养液体培养基含有包括铁的细菌培养基组分，优选浓度在0.015至0.05mM。

如本文所用，分节丝状菌菌株是指分节丝状菌(Candidatus arthromitus)或Candidatus savagella或Arthromitus immunis或小鼠分节丝状菌(Arthromitus muris)，优选小鼠分节丝状菌(Arthromitus muris)。

有利地，该方法包括以下步骤：

a)在固体培养基上生长真核宿主细胞；

b)将在步骤a)中生长的真核宿主细胞浸入真核宿主细胞-SFB液体培养基中；

c)用SFB菌株、优选细胞内SFB后代攻击步骤b)的细胞培养物；

d)在液体培养基中，以低于5％、优选低于4％的O₂水平，共培养活的真核宿主细胞和SFB菌株；和任选地

e)回收培养的SFB菌株。

关于步骤a)：

真核宿主细胞可以是任何脊椎动物细胞，优选任何哺乳动物细胞，更优选任何人或鼠细胞(例如，小鼠细胞)。

在一个优选的实施方案中，真核宿主细胞是体外粘附细胞。有利地，这种粘附细胞能够分化，因此在体外延长时间段的汇合条件下进展顺利(fares well)。

在另一个优选的实施方案中，真核宿主细胞是上皮细胞。有利地，真核宿主细胞是来自胃肠道(如结肠或小肠)的细胞。

在另一个实施方案中，真核宿主细胞是癌症细胞，优选癌细胞，更优选腺癌细胞。

在一个最优选的实施方案中，真核宿主细胞是哺乳动物胃肠上皮粘附细胞或哺乳动物粘附癌细胞，特别是人或小鼠结肠上皮细胞或小肠细胞或人或小鼠腺癌细胞。

在一个具体的实施方案中，真核宿主细胞选自人Caco-2、TC7(其是Caco-2的亚克隆)或HeLa细胞系或小鼠mICcl2或CMT93细胞系，优选人Caco-2或TC7细胞系。

有利地，真核宿主细胞在0％(厌氧条件)至5％(即0至37.1托)的O₂水平下生长，优选0.5％至3％(即3.7至22.3托)，更优选1至2.5％(即7.4至18.6托)。

用于生长真核宿主细胞的湿度和温度条件可以通过本领域技术人员的常规试验来确定。温度优选为36℃至38℃，更优选为37摄氏度。

真核宿主细胞培养基的组成可以通过本领域技术人员的常规试验来确定。作为实例，培养基包含Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)或Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)：营养混合物F-12(Nutrient Mixture F-12)(DMEM/F12)改进培养基、灭活(或去补体的(decomplemented))胎牛血清(FCS)和氨基酸。

有利地，生长真核宿主细胞直到获得细胞汇合度至少为20％，并且按照递增的优选顺序为至少25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％，以及更优选100％。

在一个优选的实施方案中，将真核宿主细胞生长直至获得细胞单层。

在另一个优选的实施方案中，在步骤b)之前，将在步骤a)中生长的真核宿主细胞在板上、优选在组织培养孔或小室(transwell)上、更优选在组织培养小室上铺板。

有利地，真核宿主细胞的接种密度在每平方厘米1×10⁴至6×10⁴个细胞。作为实例，真核宿主细胞的接种密度为每培养孔(即每3.8cm²)6×10⁴至12×10⁴个细胞，或每培养小室(即每1.12cm²)为3×10⁴至6×10⁴个细胞。

有利地，当在步骤c)中加入SFB时，真核宿主细胞的培养密度在每平方厘米0.5×10⁵至3×10⁵个细胞。作为实例，真核宿主细胞的培养密度在每培养孔(即每3.8cm²)3×10⁵至6×10⁵个细胞或每培养transwell(即每1.12cm²)1×10⁵至3×10⁵个细胞。

关于步骤b)：

真核宿主细胞-SFB液体培养基是适于培养真核宿主细胞和SFB菌株的培养基。

有利地，所述液体培养基是丰富的组织培养基(例如，DMEM/F12改进培养基)，其含有包括铁的细菌培养基组分。

所述液体培养基可以包含脑心浸液(brain–heart infusion)和酵母/蛋白胨/酪蛋白氨基酸混合物。这些细菌培养基补充物是本领域公知的。

铁可以是亚铁形式(Fe²⁺态)和/或三价铁(Fe³⁺态)形式。作为实例，铁可以是Fe²⁺/Fe³⁺、3xFe²⁺、3xFe²⁺或血晶素(hemin)的形式，优选Fe²⁺/Fe³⁺、3xFe²⁺或3xFe²⁺的形式。

有利地，铁浓度为0.015至0.05mM，优选0.02至0.04mM。

在一个优选的实施方案中，所述液体培养基包含用于培养真核宿主细胞的培养基，如补充有胎牛血清、非必需氨基酸(如Glutamax^TM)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、脑心浸液、酵母/蛋白胨/酪蛋白氨基酸混合物和铁的DMEM/F12改进培养基。

液体培养基可补充去补体的胎牛血清(FCS)，特别是当液体培养基包含DMEM或DMEM/F12改进培养基时。有利地，液体培养基中补充有1％至5％、优选1％至3％、更优选2％的去补体的FCS。

有利地，所述液体培养基还包含糖、视黄酸和/或核苷酸。

关于步骤c)：

SFB菌株可以是野生型菌株或遗传修饰菌株。可以通过转化、转导或缀合从野生型SFB菌株获得遗传修饰的SFB菌株。

SFB菌株可以是细丝或细胞内后代的形式。

SFB菌株可以从受试者、特别是哺乳动物如人或小鼠(例如，SFB单相关小鼠)分离。从哺乳动物中分离SFB菌株的方法是本领域已知的(Lécuyer等人，2014)。

单SFB细丝可以通过以下方法分离：收集受试者的回肠、盲肠和/或结肠内容物，并使用倒置显微镜和连接到显微操纵器的微量移液管捕获单细丝。

可以通过以下方法在厌氧或低需氧条件(即0％-2％氧)下分离细胞内SFB后代：收集受试者的回肠、盲肠和/或结肠内容物，通过100-μm筛网过滤，使用密度梯度柱与其他排泄物质分离，并通过5-μm过滤器以获得单细胞细胞内后代的纯培养物(平均0.7μm)。也可以按照这种方法在5μm过滤器上收集SFB细丝。

如本文所用，术语“攻击”是指将细菌添加到真核宿主细胞，而不管该细菌是否与宿主细胞相互作用(附着/侵入)。

在优选的实施方案中，SFB菌株与真核宿主细胞紧密接触，优选与真核宿主细胞直接接触。

如本文所用，术语“紧密接触”是指真核宿主细胞和SFB菌株的共培养，其中所述真核宿主细胞和所述SFB菌株之间的距离小于或等于2cm。

有利地，SFB的接种密度在每平方厘米0.2×10⁴至10.10⁴个细胞。作为实例，SFB的接种密度在每培养孔(即每3.8cm²)1.10⁴至10.10⁴个细菌，或者每培养小室(即每1.12cm²)1.10⁴至10.10⁴个细菌。

有利的是，真核宿主细胞和SFB之间的比为0.1至100，优选为0.3至60。

关于步骤d)：

真核宿主细胞和SFB的共培养在0％(厌氧条件)至5％、优选在0.5至3％、更优选1至2.5％的O₂水平进行。

用于共培养活的真核宿主细胞和SFB菌株的湿度和温度条件可以通过本领域技术人员的常规试验来确定。温度优选为36℃至38℃，更优选为37℃。

共培养可以进行1、2、3、4、5或6天。

可以进行共培养，直到SFB菌株经历细丝化、分节、分化以释放细胞内后代或孢子。

有利地，诱导孢子形成的条件包括增加应激如氧化应激或短时间的抗生素(Davis和Savage，1976)。

关于步骤e)

培养的SFB菌株可以以细丝、细胞内后代或孢子的形式回收。

可以使用倒置显微镜和连接到显微操纵器的微量移液管回收SFB细丝。

SFB细胞内后代可以通过5-μm过滤器过滤从细丝中回收。可以在5μm过滤器上收集SFB细丝。

SFB孢子(即细菌孢子)可以通过本领域熟知的方法回收，如国际申请WO 2014/121298中公开的方法。

本发明还提供了申请人根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2014年12月23日在CNCM(国家微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes)，Docteur Roux路25号，巴黎)保藏的小鼠分节丝状菌(Arthromitusmuris)菌株，保藏号为CNCM I-4932。

本发明还提供了一种用于通过缀合遗传修饰分节丝状菌菌株的方法，其包括以下步骤：

i)用包含待引入SFB菌株中的感兴趣的DNA序列的重组穿梭载体DNA对大肠杆菌(Escherichia coli)菌株进行遗传修饰，其中所述穿梭载体DNA能够在大肠杆菌菌株和待遗传修饰靶向的SFB菌株中复制；

ii)根据本发明的培养的体外方法，将在步骤i)中获得的经遗传修饰的大肠杆菌菌株与待遗传修饰靶向的SFB菌株共培养，其中：

在本发明的所述培养方法的步骤c)中，步骤b)的细胞培养物用待遗传修饰靶向的SFB菌株(优选细胞内SFB后代)和所述遗传修饰的大肠杆菌菌株进行攻击；和

在本发明的培养方法的步骤d)中，活的真核宿主细胞、SFB菌株和遗传修饰的大肠杆菌菌株在液体培养基中、在低于5％的O₂水平共培养；

iii)回收步骤ii)的遗传修饰的SFB菌株。

重组穿梭载体DNA可以是重组梭菌(Clostridial)穿梭载体DNA，其包含感兴趣的DNA序列并且能够在大肠杆菌菌株和梭菌菌株中复制。这种载体的构建在本领域中是已知的(Heap等人，2009)。

有利地，感兴趣的DNA序列可以在用于细胞质表达的组成型SFB(如核糖体)的启动子控制下，或者融合至编码用于表面表达分泌型脂蛋白的核苷酸序列。作为实例，在SFB中功能性强启动子是Yang等人，2014描述的SFB SFBNYU_003340基因的启动子。

重组穿梭载体DNA可以包含一种或不同的可选择的抗生素标记物(即抗生素抗性盒)。可以使用任何可选择的抗生素标记物，如林可霉素、壮观霉素、甲砜霉素、氯霉素和四环素，优选林可霉素。在体外SFB生长抑制试验中，SFB对0.1μg/ml的林可霉素、4μg/ml的壮观霉素、1μg/ml的甲砜霉素、5μg/ml的氯霉素和0.6μg/ml的四环素敏感。有利地，重组穿梭载体DNA包含ERM/林可霉素抗性盒。

感兴趣的DNA序列可以是编码感兴趣的抗原的DNA序列。有利地，编码所述感兴趣的抗原的DNA序列是经用于在SFB中表达而优化的密码子，例如根据Sczesnak等人2011)描述的方法。作为实例，感兴趣的抗原可以是来自弗氏志贺菌(Shigella flexneri)的IpaB或IpaD、来自EPEC的紧密粘附素(intimin)和热不稳定毒素、以及来自ETEC的定植因子抗原I(Cfa/I)粘附素CfaE。

已经经密码子优化的、在SFB SFBNYU_003340基因的启动子控制下的感兴趣的DNA序列的实例在SEQ ID NO：17中提供。它编码绿色荧光蛋白(GFP)-卵白蛋白(Ova)肽融合蛋白。

大肠杆菌菌株可以是阴性选择的营养缺陷型大肠杆菌菌株(Danchin，1977)。

有利地，大肠杆菌菌株需要二氨基庚二酸用以生长。可以在丰富的培养基中针对二氨基庚二酸选择这种菌株。

大肠杆菌菌株的遗传修饰可以通过电穿孔、转导、热休克转化或原生质体融合进行。

步骤ii)的共培养允许通过缀合将所述穿梭载体DNA从大肠杆菌菌株转移到SFB。

有利地，首先将步骤b)的细胞培养物采用待遗传修饰靶向的SFB菌株进行攻击，然后在有SFB菌株生长之后，采用所述遗传修饰的大肠杆菌菌株进行攻击。

本发明还提供了一种通过电穿孔对分节丝状菌菌株进行遗传修饰的方法，其包括以下步骤：

i)根据本发明的体外方法培养和回收分节丝状菌菌株；

ii)将步骤i)中回收的SFB菌株与待转化的纯化质粒混合，优选在甘油/H₂O(例如，10％甘油/H₂O)中混合；

iii)向步骤ii)中获得的混合物施加电脉冲；

iv)回收遗传转化的SFB菌株。

在该方法的步骤i)中，SFB菌株可以在TC7细胞上培养2-4天。

在该方法的步骤i)中，SFB菌株可以通过收集SFB细胞并将其在0％(厌氧条件)至5％、优选在0.5至3％、更优选在1至2.5％的O₂水平下，放置在冰上进行回收。

在该方法的步骤ii)中，有利地，电场在6kV.cm^-1至30kV.cm^-1，优选在6.5kV.cm^-1至25kV.cm^-1。

在步骤ii)中，纯化的质粒可以设计用于梭菌的物种(Heap等人，2009)。作为实例，可以使用均由Heap等人，2009描述的质粒pMTL80110、pMTLP82254、pMTL83353、pMTL84422、pMTL85141、pMTL82151、pMTL83151、pMTL84151或pMTL85151(在GENBANK数据库中也以这些登录号参考)。有利地，质粒选自pMTL82151、pMTL83151、pMTL84151和pMTL85151，其还包含在这些质粒的多克隆位点FseI位点和PmeI位点之间克隆的ERM/林可霉素抗性盒。这些质粒被称为pMTL82151-ERM、pMTL83151-ERM、pMTL84151-ERM和pMTL85151-ERM，分别描述于SEQID NO：18、19、20和21。

质粒可以通过标准方法纯化，主要使用市售的试剂盒，例如，如

质粒纯化试剂盒。

在步骤iv)中，如果质粒包含抗生素抗性盒，则用相应的抗生素标记物体外选择采用质粒转化的SFB。

本发明还提供了一种通过化学转化遗传修饰分节丝状菌菌株的方法，其包括以下步骤：

i)根据本发明的体外方法培养和回收分节丝状菌菌株；

ii)将步骤i)中回收的SFB菌株与待转化的纯化质粒混合，优选在甘油/氯化钙(例如10％甘油/0.1M氯化钙)中混合；

iii)孵育在步骤ii)中获得的混合物；

iv)任选地，对所述混合物施加热休克；

v)回收遗传转化的SFB菌株。

在该方法的步骤i)中，SFB菌株可以在TC7细胞上培养2-4天。

在该方法的步骤i)中，SFB菌株可以通过收集SFB细胞并在0％(厌氧条件)至5％、优选在0.5至3％、更优选在1至2.5％的O₂水平下，放置在冰上进行回收。

在步骤iii)中，SFB菌株和纯化的质粒可以孵育15-45分钟，优选30分钟。

在步骤iv)中，有利地，热休克在41-43℃、优选在42℃施加15至45秒、优选30秒。

在步骤v)中，如果质粒包含抗生素抗性盒，则用相应的抗生素标记物体外选择采用质粒转化的SFB。

根据本发明的用于遗传修饰分节丝状菌菌株的方法还可以包括在体内选择转化的SFB菌株的步骤，其包括：向小鼠的肠施用(例如，口服)体外选择的经包含抗生素抗性盒的质粒转化的SFB，然后向所述小鼠施用相应的抗生素标记物，然后从所述小鼠回收活的遗传转化的SFB株。可以将抗生素标记物(例如，林可霉素)加入待施用至所述小鼠的小鼠饮用水中。作为实例，林可霉素可以以低稀释度优选50-500μg/L的饮用水中使用。

在口服摄取或胃肠外施用于受试者优选哺乳动物之后，活的遗传修饰的SFB菌株可以以细丝、细胞内后代或孢子，优选以孢子作为抗原递送载体。

因此，本发明还提供了表达感兴趣的抗原(例如，来自弗氏志贺菌的IpaB或IpaD、来自EPEC的紧密粘附素和热不稳定毒素、以及来自ETEC的定植因子抗原I(Cfa/I)粘附素CfaE)的分离的遗传修饰的SFB菌株，优选分泌所述抗原或在细菌表面上暴露所述抗原。

术语“表达感兴趣的抗原的遗传修饰的SFB菌株”和“遗传修饰以表达感兴趣的抗原的SFB菌株”在本文中可互换使用。

如本文所用，感兴趣的抗原是指衍生自不同于SFB的微生物或细胞(例如，肿瘤细胞)的(外源)抗原，人们旨在受试者中引发针对其的免疫应答。微生物可以是细菌、病毒或真菌生物体。细胞优选为哺乳动物来源，优选人来源。

鉴于SFB诱导B和T细胞应答(包括Th1和特别是Th17细胞)的强的能力，有利地，选择抗原以引发Th17应答。

抗原的具体实施方案包括衍生自腹泻病原体志贺菌(Shigella)、产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)或诱导粘附及擦拭性损伤(A/E)的致肠病性大肠杆菌(EPEC)的主要表面蛋白的抗原。对于志贺菌抗原，可以选择宿主细胞侵袭所需的三型分泌系统顶端(tip)蛋白IpaB和IpaD(Parsot 2009)。IpaB和IpaD在不同的志贺菌血清型中是保守的，并且作为与双突变体热不稳定毒素复合的重组蛋白质，在鼻内免疫后对志贺菌的致死性肺部攻击引发90％的保护作用，并且口服施用时具有40％的保护作用(Heine等人，2013)。此外，已经显示针对IpaB的抗体在体外抑制志贺菌斑块形成(Mills等人，1988)。对于ETEC抗原，可以选择定位在菌毛顶端的定植因子抗原I(Cfa/I)粘附素CfaE，并且在皮内施用后在非人灵长类动物Aotusnancymaae模型中引发对ETEC的保护(Fleckenstein等人，2014)。由于Cfa/I仅存在于EPEC菌株的一个子集中，其也可以包括热不稳定毒素(LT)。热不稳定毒素是高度免疫原性的，毒素的双突变体在疫苗研究中作为粘膜佐剂使用(Martinez-Becerra等人，2012)。然而，由于SFB已经具有很强的免疫刺激潜力，可以仅选择LT的无毒B亚基(LTB)，其本身可以引发对细胞质表达毒素或者由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表面定位的毒素的保护性抗体应答(Paccez等，2007)。对于EPEC抗原，可以选择粘附素紧密粘附素。紧密粘附素通过结合易位受体Tir介导了粘附及擦拭性(A/E)损伤的特征性形成(Kaper等人，2004)，并且发现于典型和非典型EPEC、肠出血性大肠杆菌和鼠EPEC样菌株雷登枸橼酸杆菌(C.rodentium)中。作为保护性免疫原的紧密粘附素已经在一些动物模型中被验证，所述动物模型感染有兔EPEC、EHEC和雷登枸橼酸杆菌(Ferreira等人，2011)。具体地，可以选择编码94kDaβ-紧密粘附素抗原的氨基酸363至808的片段，其是在人EPEC腹泻病例中最常见的EPEC紧密粘附素亚型并是存在于雷登枸橼酸杆菌的亚型。当作为皮下亚单位疫苗给药时，或当通过表达紧密粘附素片段的乳杆菌(Lactobacillus)菌株口服或舌下递送时，该片段可以引发保护性免疫，并且显示出诱导不依赖于紧密粘附素类型的免疫的希望(Ferreira等人，2008和2011，Ghaem-Maghami,M等人，2001)。

遗传修饰的SFB菌株可以通过如上所述的转化、转导或缀合获得，优选通过根据本发明的用于遗传修饰分节丝状菌菌株的方法获得。

本发明还提供了以上所限定的表达感兴趣的抗原的活的遗传修饰的SFB菌株，用作药物，特别是用于预防或治疗衍生所述抗原的微生物引起的疾病或癌症。

所述SFB菌株可以是细丝、细胞内后代或孢子的形式，优选孢子。

本发明还提供了一种治疗性免疫原性(或疫苗)组合物，其包含如上所限定的表达感兴趣的抗原的活的遗传修饰的SFB菌株。

所述SFB菌株可以是细丝、细胞内后代或孢子的形式，优选孢子。

术语“免疫原性组合物”和“疫苗组合物”在本文中可互换使用。

本发明还提供如上所述的免疫原性组合物，其用于预防或治疗由衍生所述抗原的微生物引起的疾病或癌症。

根据本发明的表达感兴趣的抗原的遗传修饰的SFB菌株和包含所述遗传修饰的SFB菌株的免疫原性组合物特别适合于在受试者中引发针对所述抗原的抗体。

有利的是，所述免疫原性组合物包含药学上可接受的载体。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括与药物施用相兼容的任何和所有溶剂、分散培养基、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载体在本领域的标准参考最新版本的Remington's Pharmaceutical Sciences中有描述。

将根据本发明的表达感兴趣的抗原的遗传修饰的SFB菌株和包含所述遗传修饰的SFB菌株的免疫原性组合物，以足以预防或减轻衍生所述抗原的微生物感染或癌症的严重程度、持续时间的量施用至哺乳动物受试者，优选人。

治疗有效量依据待治疗的受试者、待治疗的受试者年龄和一般状况、受试者合成抗体的免疫应答能力、所期望的保护程度、待治疗病症的严重程度、以及其施用模式等因素而变化。本领域技术人员可以容易地确定合适的有效量。治疗有效量将落在可以通过常规试验确定的相对宽的范围内。

在初次疫苗接种后，受试者可以以本领域技术人员确定的合适的间隔接收一次或两次加强注射。

通常，将免疫原性组合物制备成可注射形式(液体溶液或悬浮液)或作为在注射前适合于在液体载体中溶解或悬浮的固体形式。

一旦配制，免疫原性组合物可以肠胃外施用或通过粘膜途径施用，优选口服施用。

本发明还提供了如上所限定的表达感兴趣的抗原的遗传修饰的SFB菌株或免疫原性组合物在制备药物中的用途，优选所述药物是针对在受试者中衍生所述抗原的微生物或癌症的预防性或治疗性疫苗。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗由衍生所述抗原的微生物引起的感染或癌症的方法，其包括以有效抑制易感细胞的所述微生物感染或抑制癌细胞的生长的量向有需要的受试者施用如上所限定的表达感兴趣的抗原的遗传修饰的SFB菌株或免疫原性组合物，从而预防或治疗感染或预防或治疗癌症。

术语“治疗”包括向具有感染、感染症状或癌症的患者施用如上所限定的表达感兴趣的抗原的遗传修饰的SFB菌株或免疫原性组合物，其目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响感染和/或感染症状或癌症。

术语“预防”指感染的进程被减少和/或消除，或者感染或癌症的发作被延迟或消除。

本发明还提供了通过本发明的体外培养方法获得的SFB菌株作为益生菌的用途。

所述SFB菌株可以是活的或死亡的，优选活的。

所述SFB菌株可以是细丝、细胞内后代或孢子的形式，优选孢子。

本发明还提供了一种食品产品(例如，乳产品)，其包含通过本发明的体外培养方法获得的SFB菌株。

所述SFB菌株可以活的或死亡的，优选活的。

所述SFB菌株可以是细丝、细胞内后代或孢子的形式，优选孢子。

除了前述特征之外，参考证实本发明的实施例及附图，本发明还包括从以下描述中出现的其他特征。

附图说明

图1：SFB在体外的生长和生长需求。a、5-μm过滤前和过滤后的SFB革兰氏染色和长度；b、在所示条件下，在宿主细胞上SFB生长的qPCR；c、在小室上的TC7细胞上厌氧生长的4日龄SFB细丝的SEM图像；d-i、在低氧浓度下(d)，接种在小室上的所示细胞系上的SFB生长；e、在所示细胞汇合度的TC7细胞上的SFB生长；f、g、在多种情况下的SFB生长，b、i、h，使用双侧t检验的统计分析(*P＝<0.05，**P＝<0.01，***P＝<0.001)。

图2：体外生长期间SFB从细丝到细胞内后代的分化。A、SFB细丝的示意图，强调其生长和分化的阶段。B、在所示条件下培养的TC7细胞上生长4天后的SFB的革兰氏染色，以及C、在低氧下在小室上生长的TC7细胞上生长4天后的SFB的革兰氏染色。分析在1-2.5％O₂、在小室上的mICcl2细胞(D-G)和TC7细胞(H)上生长的SFB：代表性的2日龄SFB细丝的D、qPCR定量(一式三份的平均±s.d.)；E、各SFB的长度；F、革兰氏染色；以及G、分节长度分析。H、生长4天后SFB的SEM。B-H、以一式三份进行的三次实验之一的代表性图和值(D)(平均值±s.d)。

图3：体外生长的SFB的活力、定植、和免疫刺激潜力。a、在小室上的TC7细胞上生长后的SFB长度；b、定量和c、在5-μm过滤的3天亚培养之前和之后，在小室上的TC7细胞上的SFB生长的革兰氏染色；d-k、分析管饲细丝/细胞内后代混合物、细胞内后代、或SFB-单相关小鼠的排泄物(SFBVivo)的无菌C57BL/6小鼠；d、回肠相关SFB的定量；e、k、在回肠固有层中宿主基因的表达；所示标记物的B220+B细胞(f，g)和CD45+CD3+CD4+T细胞(i，j)频率的代表性流式细胞术图和定量；h、通过ELISA进行排泄物分泌型IgA定量。a-k、来自以一式两份进行的两次实验之一的代表性图和值(平均值±s.d.)(a-c)，或者每组4至6只小鼠进行的两次实验之一的代表性图和值(d–k)。使用双侧t检验的统计学分析(***P＝<0.001)。

图4：SFB-宿主细胞相互作用和宿主应答。在细胞内后代攻击2天后，SFB附着至亚汇合(A)和汇合(B)的mICcl2细胞的SEM。C、mICcl2细胞用细胞内后代攻击2天，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(D)和肌动蛋白(A)染色的合并(M)，显示共焦切片和Z-投影。D、附着于TC7细胞的3日龄SFB细丝的SEM。使用SFB(E-G)或各种MAMP(H)攻击后3天使用qPCR分析的mICcl2细胞(E、F、H)和TC7细胞(G)的宿主应答。NS、不显著；BDL、低于检测限。图和值是以一式三份进行的两次实验之一的代表(A-D)，或者以一式三份进行的四次实验的累计值，采用具有最小/最大丝的25-75％百分位数的箱形图(E–G)，或者平均值±s.e.m；(H)双侧t检验统计分析(*P＝<0.05，**P＝<0.01，***P＝<0.001)。

图5、体外生长的SFB的肠定植和宿主应答。a、b、用于管饲的体外生长的SFB的qPCR定量(a)和SEM(b)。c、排泄物样品中SFB的qPCR定量。d、采用SFBVivo或SFBVitro的C57BL/6小鼠管饲后25天，在体内SFB附着的SEM。e、SFB定植的无菌C3H/HeN小鼠回肠第21天的SEM显示空位附着位点。f、在用SFB或大肠杆菌定植21天的常规或无菌小鼠中的回肠固有层中的宿主基因表达。图和值是来自两次实验之一的代表(a-e)，或是总共七个无菌、四个SFB、五个大肠杆菌和四个常规小鼠(f)进行的两次实验的累积值，显示具有中位数和最小/最大丝的25-75％百分位数的箱形图。c、f、双侧t检验统计分析(*P＝<0.05，**P＝<0.01)。

具体实施方式

实施例1：小鼠分节丝状菌在体外的生长和宿主相互作用

材料和方法

细胞培养和SFB特异性培养基

将TC7、CMT93和HeLa细胞在具有10％灭活的胎牛血清(FCS；AbCys CVFSVF00-0U)和非必需氨基酸(Invitrogen 11140-035)的DMEM(Gibco 31885)中培养。将mICcl2维持在具有2％灭活的FCS和谷氨酰胺(Glutamax)(Gibco 35050)的DMEM/F12改进培养基(Gibco12634)中，并且补充有10nM hEGF(Sigma E9644)、50nM地塞米松(Sigma D4902)和1nM三碘甲状腺原氨酸(Sigma T5516)。HeLa细胞获自ATCC。所有细胞系每2周试验支原体，发现均为阴性。在实验前1至3天将细胞铺板在常规的12孔组织培养板上，或者铺板在具有0.4-μm过滤器的Costar小室板(Sigma CLS3460和Fisher Scientific W2127P)上，使得在实验开始时存在单层，并将其加入到低氧室中过夜，用以缓慢降低细胞培养基中的氧浓度。在SFB培养开始时，首先，在添加SFB(直接加入TC7细胞)之前，用(平衡的：1％氧)培养基替换TC7、CMT93、HeLa和mICcl2培养基。

SFB培养基如下制备：具有2％FCS、谷氨酰胺和12.5mM HEPES(Sigma H0887)的DMEM/F12改进培养基，其具有以下补充剂：1比100稀释的(1)5×浓缩的脑心浸液(BD Difco237500)、(2)10％蛋白胨/酵母(BBL Biosafe 211862)和5％酪蛋白氨基酸(DIFCO 0320-01-1)、(3)200mM的核糖/纤维二糖/甘露糖(Sigma：R9629、C7252、M6020)；1比1000稀释的(1)10mM的硫酸亚铁(Merck3965)、(2)12.5mM的枸橼酸铁铵(LabGuard 0658)、(3)在50％的具有1.4N NH4OH的乙醇中的1.5mM的血晶素(Sigma 51280)、(4)10mg ml^-1的抗坏血酸钠和500mM的1-抗坏血酸磷酸(Sigma：A4034、49752)；1比10,000稀释的在DMSO中的30mg ml^-1视黄酸(Sigma R2625)；1比500稀释的(1)10mg ml^-1的精子DNA(Life Technologies 15632-011)，其使用10μl DNA酶I(Roche 04 716728 001)在37℃消化1h并且在75℃热灭活30min、(2)10mg ml^-1未消化的RNA(Sigma R6750)。除了核苷酸和血晶素之外，SFB培养基特异性培养基补充剂每2周新鲜制备，否则在4℃保存，或者对于视黄酸和核苷酸-20℃保存。当使用mICcl2细胞时，SFB培养基进一步补充hEGF、地塞米松和三碘甲状腺原氨酸。值得注意的是，额外的补充0.2％的酵母提取物(BD 212750；20％的1/100)进一步改进了SFB的生长，并且不需要添加抗坏血酸盐、抗坏血酸磷酸或血晶素。

从SFB单相关小鼠纯化细胞内后代和感染方法

用于分离细胞内后代的所有液体在设定为0％氧的厌氧室中过夜预平衡。SFB-单相关的JH^-/-小鼠在组织培养罩中无菌处死，然后置于厌氧箱中解剖。将回肠、盲肠和结肠内容物重悬于50ml PBS中，并通过涡旋匀浆。匀浆物通过100-μm筛网以除去大的排泄物残渣。将过滤物以8,000g离心5分钟以沉淀细菌和不溶物质，并将每只处死的小鼠的沉淀重悬于3ml PBS中，在15ml Falcon管中，采用PBS制备分层的3ml 50％和2ml 30％Nycodenz(AbCYS1002424)溶液，并且以4,000g的离心10分钟。收集30％部分中的SFB，稀释于PBS，并且将细菌在8,500g沉淀10分钟。通过移液/涡旋将沉淀重悬于15ml预平衡的PBS中，并通过5-μm过滤器(Sigma Z612502)过滤。将过滤物再次以8,000g离心5分钟，将沉淀重悬于适量的预平衡培养基中。通常每四个12孔板使用一只处死的小鼠，每孔加入50μl细菌悬浮液。为了便于粘附，用SFB攻击的细胞密封在箱中的拉链袋中，从箱中取出，并以300g离心10分钟。

允许SFB在真核细胞存在下生长3天，期间氧浓度从第0天的1％递增地增加至第1天的1.5％、至第2天的2％、至第3天的2.5％。可以在第3天通过取培养上清液的等份来制备亚培养物，并使用它来对新鲜制备的真核细胞(如上所述在小室过滤器上和在低氧条件下制备)进行攻击。

SFB回收、以及SFB生长的定量和分析

为了回收SFB，收集培养上清液并以8,000g离心4分钟，将沉淀重悬于100μlPBS中，其中20μl点在载玻片上用于革兰氏染色，30μl与等体积50％甘油混合并在-80℃冷冻，以及剩余的50μl用于DNA提取。用Qiagen粪便试剂盒(51504；不使用抑制剂片剂)分离DNA，并以1比20稀释。使用以下引物对通过16S rRNA基因的qPCR分析计算SFB生长：SFB特异性F：5’-AGGAGGAGTCTGCGGCACATTAGC-3’(SEQ ID NO：1)；以及通用的R：5’-TCCCCACTGCTGCCTCCCGTAG-3’(SEQ ID NO：2)。对于qPCR，将6μl稀释的SFB DNA与1.5μl 4mM引物混合物和7.5μl Power SybrGreen Master混合物(Applied 4368708)混合，并在384孔板中在ABI 7900HT仪器上运行。统计分析采用双侧Student’s t-检验(*P＝<0.05，**P＝<0.01，***P＝<0.001)。使用ImageJ分析SFB分节长度。对于SEM分析，用PBS洗涤含有SFB的上清液并吸至0.1-μm过滤器(Watman 110405)上，并且在处理前，在含有2.5％戊二醛的0.1M二甲砷酸盐缓冲液中固定。用于SEM的细胞在含有4％蔗糖和2.5％戊二醛的PHEM缓冲液(每升含18.14g PIPES、6.5g HEPES、3.8g EGTA、0.99g MgSO4、用10M KOH至pH7.0)中固定，并用于SEM处理。对于荧光，将细胞在PBS/3.7％PFA中固定，用PBS/0.1％Triton X-100透化，用DAPI和A568-鬼笔环肽染色，并在Leica SP5共聚焦显微镜上拍摄堆叠的0.4-μm切片。

体外生长的SFB对无菌小鼠进行定植

该实验独立完成两次，结果相似；显示一个实验。在小室上的TC7和mICcl2细胞上在体外生长3天的SFB被分成等份，一半通过5-μm过滤器过滤以获得仅含有细胞内后代的部分。通过离心浓缩细菌，每只小鼠获得在PBS中0.25ml的细菌。所使用动物的数量依据动物的可用性、隔离器(isolators)、和投入量。不进行随机化或盲法。维持在无菌设备的两组四只11周龄的C57BL/6雄性和雌性小鼠被饥饿一夜，用0.25ml 400mM碳酸氢钠、随后0.25ml体外生长的SFB管饲。如下所述，年龄匹配的对照小鼠被体内衍生的SFB定植。在3周的时间期间，在不同时间收集每小鼠排泄物样品，使用Qiagen粪便试剂盒提取SFB DNA，基于16SrDNA的qPCR分析，并与通过Illumina测序确定的已知SFB基因组浓度的SFB DNA样品比较，而进行定量。为了监测与回肠相关的SFB，使用Godon等人，1997中的方法从冷冻回肠活检中提取DNA。

从C57BL/6小鼠的固有层淋巴细胞的分离和染色

如Ivanov等人，2009所述的，分析年龄匹配的无菌B6小鼠和定植有体外或体内生长的SFB 3周的小鼠的先天性和适应性免疫应答。简要地，在切除派伊尔斑后，将小鼠的小肠在PBS中洗涤，并将回肠样品置于RNAlater中进行RNA提取，互补DNA(cDNA)合成，并使用SYBR或Taqman技术(Applied Biosystems)和QuantStudio7qPCR仪进行qPCR分析。值以TfrC归一化。

如先前由Gaboriau-Routhiau等人，2009所述的制备固有层淋巴细胞(LPL)。将剩余的小肠在37℃下在60ml PBS-3mM EDTA(Sigma)中孵育10分钟，进行四次，在37℃下用60ml的含有20％FCS(Gibco)、100U ml^-1胶原酶(Sigma)和175U ml^-1DNA酶I(Sigma)的RPMI1640消化40分钟。然后将LPL在40-80％Percoll梯度上以2,000g进行纯化15分钟，并重悬于含有8％FCS、1mM HEPES、0.02mM叶酸、0.67mM L-精氨酸和0.27mM L-天冬酰胺的DMEMGlutamax(全部来自Sigma)。

如5所述，通过流式细胞术分析LPL的表面抗原和IL-17和IL-10的细胞内表达。简要地，在布雷菲德菌素A(Brefeldin A，10μg/ml)的存在下，将LPL采用100ng ml^-1佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和1μg ml^-1离子霉素(均来自Sigma)刺激4小时。用于表面分析的细胞未被刺激。对于表面染色，LPL在4℃下用以下抗体的混合物标记20分钟：FITC-抗-GL7(克隆GL7)、PerCP-抗-CD8a(克隆53-6.7)、APC-H7-抗CD4(克隆GK1.5)、AF647-抗-B220(克隆RA3-6B/2)(全部来自BD Pharmingen)、PE-抗-IgA(Southern Biotech)以及eFluor450-抗-CD45(克隆30-F11)和PECy7-抗-CD3(克隆145-2C11)(二者来自eBioscience)。

对于胞内细胞因子染色，细胞在室温(约24℃)下在2％PFA中进一步固定20分钟，并洗涤，以及在4℃下用在PBS-1％FCS-0.5％皂苷(Sigma)中稀释的PE-抗-IL-17(克隆TC11-18H10)和APC-抗-IL-10(克隆JES5-16E3)(BDPharmingen)染色过夜。用FACSCanto II和FACSDiva软件(BD Biosciences)分析标记的细胞。在Aqua活/死染色排除(Invitrogen)后，将门设置在活细胞。

对于qPCR分析，计算无菌小鼠的中值，并将其用作参考值1，用于比较测试样品的中值。

来自排泄物的SFB和大肠杆菌定植无菌小鼠

无菌雄性和雌性C3H/HeN小鼠从INRA(ANAXEM平台)无菌设备获得。将八至九周龄的无菌小鼠用0.5ml新鲜厌氧培养的大肠杆菌MG1655或来自SFB单相关小鼠的排泄物匀浆管饲(Ivanov等人，2009)。通过细菌DNA提取，并使用SFB特异性引物对通过qPCR对16S rDNA进行扩增，在排泄物中监测SFB的定植。将值以Ccl25归一化，Ccl25为组成型表达的上皮细胞标记物，并与来自无菌对照小鼠的中值进行比较。将无菌和限菌的(gnotobiotic)小鼠维持在塑料隔离器中，并且随意地进食通过γ-照射(40kGy)灭菌的商业饮食。使用的动物数量依据动物的可用性、隔离器，并从两个独立实验中获得。不进行随机化或盲法。在定植后第21天处死限菌的小鼠，以及年龄匹配的无菌对照。所有动物程序均按照实验动物护理和使用的法国法规和EEC规程进行，经当地道德委员会批准并经法国研究部授权。

宿主对SFB生长和MAMP刺激的体外应答

宿主对SFB和MAMP的应答包括具有三个技术样品的四个独立实验的合并结果。通常，最少使用一式三份的生物重复，如果趋势明确但不显著，则增加。在缺乏血晶素和抗坏血酸钠的SFB培养基中，在1-2.5％氧，在小室上的mICcl2或TC7细胞上的SFB体外生长3天后，裂解细胞，并使用Nucleospin RNA试剂盒(Macherey-Nagel)提取RNA。使用Schnupf等人，2012所述的方法，使用RNAsuperscript II、oligo dT、RNaseout和dNTP(Invitrogen)合成cDNA，并在ABI 7900HT和QuantStudio7(Life Technologies)qPCR仪上进行pPCR。根据供应商的建议进行TaqMan测定。将值以B2M归一化，由于缺乏转录本检测，在对照细胞中Reg3γ、Tnfα和Fabp2的Ct值设定为41。MAMP刺激使用供应商(Invivogen)推荐的最高浓度的以下激动剂：100ng ml^-1的Pam2CSK4(tlrlpm2s-1)、300ng ml^-1Pam3CSK4(tlrl-pms)，10μg ml^-1大肠杆菌K12的肽聚糖(Tlr-ksspgn)，10μg ml^-1MDP(tlrl-mdp)、3μg ml^-1的CpG(tlr-1584)、100ng ml^-1的鞭毛蛋白(tlrl-pstfla-5)。还试验了鞭毛蛋白(10×)的过量，发现是相似的。

所用的小鼠和人qPCR引物

小鼠

测定：

B2M Mm00437762_m1、TfrC Mm00441941_m1、Ccl25 Mm00436443_m1、Fabp2Mm00433188_m1、Reg3g Mm01181783_g1、Fut2 Mm00490152_S1、Aqp3 Mm01208559_m1、PigrMm00465049_m1、Ltf Mm00434787_m1、Tff3 Mm00495590_m1、Tnfa Mm00443258_m1、IL1aMm00439620_m1、IL1b Mm00434228_m1、IL6 Mm00446190_m1、IL15 Mm00434210_m1、IL18Mm00434225_m1、Cxcl2 Mm00436450_m1、Ccl2 Mm00436450_m1、Ccl5 Mm01302428_m1、Ccl7Mm01308393_g1、Ccl20 Mm01268754_m1、Ccl28 Mm00445039_m1、Csf2 Mm01290062_m1

鼠

引物

B2M：F：tcagtcgtcagcatggctcgc(SEQ ID NO：3)；R：tccggtgggtggcgtgagtatac(SEQ ID NO：4)

iNos：F：cagctgggctgtacaaacctt(SEQ ID NO：5)；R：cattggaagtgaagcgtttcg(SEQID NO：6)

Saa1：F：catttgttcacgaggctttcc(SEQ ID NO：7)；R：gtttttccagttagcttccttcatgt(SEQ ID NO：8)

Saa2：F：tgtgtatcccacaaggtttcaga(SEQ ID NO：9)；R：ttattaccctctcctcctcaagca(SEQ ID NO：10)

Saa3：F：cgcagcacgagcaggat(SEQ ID NO：11)；R：ccaggatcaagatgcaaagaatg(SEQID NO：12)

Cxc11：F：tggctgggattcacctcaag(SEQ ID NO：13)；R：caagcctcgcgaccattct(SEQID NO：14)

Cxc110：F：gccgtcattttctgcctcat(SEQ ID NO：15)；R：gcttccctatgcccctcatt(SEQ ID NO：16)

人

测定：

B2M Hs00984230_m1、Saa1 Hs00761940_s1、Saa2 Hs01667582_m1、IL6Hs00985639_m1、IL8 Hs99999034_m1、Ccl20 Hs01011368_m1、Reg3g Hs00417999_m1、iNosHs01075529_m1、Cxcl10 Hs00171042_m1、Fut2 Hs00382834_m1、IL15 Hs01003716_m1、IL18Hs01038788_m1、Ccl5 Hs00982282_m1

结果

SFB宿主细胞共培养系统

从单相关小鼠中分离的SFB菌株(Bolotin等人，2014)于2014年12月23日以保藏号CNCM I-4932保藏在CNCM(国家微生物保藏中心，Docteur Roux路25号，巴黎)(小鼠分节丝状菌(Arthromitus muris)菌株被称为SFB-小鼠-NL)。SFB与真核细胞一起培养，所述真核细胞在含有细菌培养基组分和额外的补充剂的丰富的组织培养基中，在低的但生理氧条件下生长(He等人，1999)。收集来自单相关小鼠的SFB，通过100-μm筛网过滤，使用Nycodenz柱并通过5-μm过滤器与大部分其他排泄物质分离，以获得单细胞细胞内后代的纯培养物(平均0.7μm)(图1a)。将在组织培养孔或小室上生长的真核细胞置于湿润的厌氧箱中，用细胞内后代攻击，并保持在密封箱内的严格厌氧条件下，或留在氧浓度维持在低水平(0.5-1.4％O2)厌氧箱。4天后，通过使用SFB特异性16S rDNA引物的定量PCR(qPCR)定量培养上清液中的细菌生长(图1b)，并使用扫描电子显微镜(SEM)确认(图1c)。在所有条件下对于大多数测定的细胞系观察到SFB生长，但是与组织培养孔相比，小室上的生长通常增强，并且在存在氧的情况下生长显著更好，显示SFB是相对耐氧的厌氧菌。人(TC7/HeLa)和小鼠(mICcl2/CMT93)细胞系支持生长，但是通常TC7是最有力支持SFB生长的最有复原力(resilient)的细胞系。基于时间分析，最高对数生长期发生在第1天至第3天，平均最大倍增时间为5.0小时(图1d)。

SFB的生长需求

SFB生长对宿主细胞数量具有显著的依赖性，随着细胞密度的降低而数量减少(图1e)。此外，在单独的培养基中、在补充有细胞裂解物的培养基中、或在SFB攻击前细胞固定时，发生可以忽略的生长(图1f)，表明活的宿主细胞是SFB增殖所需要的。SFB还需要紧密接触以有效生长，因为当在细胞内后代加入小室底部室，或当细菌置于在组织培养孔中的TC7细胞上方的小室中时，仅发生少量生长(0-6％)(图1f、g)。然而，由于宿主细胞接触不是绝对的需求，表明宿主细胞可能释放促进SFB生长的可溶性因子。为了处理对培养基补充剂的需求，在完全培养基或缺失个别添加剂的培养基中的TC7细胞上生长SFB。脑心浸液、酵母/蛋白胨/酪蛋白氨基酸混合物、以及特别是铁补充剂对SFB生长至关重要(图1h、i)。

在20世纪70年代，存在于鼠肠中的SFB的透射电子显微镜研究导致提出了生命周期：通过在细胞内后代顶端的吸盘(holdfast)附着于上皮细胞，导致细丝生长，并且之后是在顶端末端开始的复杂的发育进程，以及最终导致细胞内后代的形成和释放(图2A)(Chase等人，1976；Ferguson等人，1979)。根据该模型，当细丝生长长度超过50μm时，大的初级细丝分节开始进行对称分裂以形成较小的次级分节。这些通过不对称分裂形成母/子细胞分化。子细胞被吞噬，随后在周围的母细胞分节内分裂形成两个细胞内后代。然后通过细丝隔膜和细胞壁的分解将细胞内的后代从细丝中释放出来并重新附着到宿主上。

在体外，在TC7细胞上SFB的生长的通常产生相当数量的长的细丝，其以毛球样表型聚集在一起，用肉眼容易看到(图2B)。这些细丝大多数在4天后未分化，只有一些细丝显示出分化细丝的特征性异质染色(图2B，左侧栏，底部两个图)。可以看到细胞内后代位于细丝顶端或偶尔在细丝的中心部分(图2C)，类似于从SFB-单相关的小鼠中回收的细丝(数据未显示)。在试验的所有四种细胞系上发生SFB的分化，但是当使用较高的氧浓度(1-2.5％)时，我们注意到分化更为明显。在这种较高氧浓度的时程分析中(图2D)，攻击1天后仅检测到短的细菌(图2E、F)。2天后，仅存在长的细丝(图2E、F)，并且使用革兰氏染色可以很清楚地鉴定细菌隔膜(图2F)。发现三种类型的细丝(图2F、G)：约2.6μm的长的细胞内分节的短的细丝；具有约1.2μm的较小的细胞内分节的中等尺寸的细丝；和中等至长的细丝，其具有包括非常小的分节长度(图2F、G)和具有半圆形结构的罕见的分节(图2F，第2-3天，箭头)的更为异质的分布，这类似于母细胞吞噬子细胞。在生长3天后，大部分细丝至少部分地分化为最终的细胞内后代阶段，并且细胞内后代可以在细丝顶端的特征性双方向(doubletorientation)中看到，其中细丝细胞壁似乎已经失去其结构(图2F，最左栏)。不同长度的许多细胞内后代也不再与细丝相关。SEM证实在细胞内后代和细丝顶端存在针状吸盘结构(图2H，b-g)，并且可以清楚地区分未分化的细的和光滑的细丝(图2H，a、e-g)，以及对应于分化细丝的异质的和球形形态的更宽的那些(图2H，a、g、h)(Chase等人，1976；Ferguson等人，1979)。此外，细胞壁残留物可以在细胞内后代已被释放的分化细丝的远端顶端检测到(图2H，h和扩展的数据图1b)(Chase等人，1976)。总之，这些数据证实，SFB的体外培养支持体外生长的SFB细丝至细胞内后代阶段的完全分化，并证实了从体内观察结果推断的SFB生命周期。

体外形成的细胞内后代的活力和感染力

首先在需氧条件下，在TC7细胞上生长SFB(图3a)，直到出现许多细胞内后代。额外的一天后，细胞内后代不再存在，平均细菌长度显著更长，表明细胞内后代长出细丝。类似地，当体外生长的细胞内后代通过5-μm过滤器过滤，其从细丝中分离并添加到新铺板的细胞中时，SFB数量增加，并且新形成的细丝分化成在细丝顶端的细胞内后代(图3b、c)，证实体外形成的细胞内后代的细丝化和分化。为了评估体外生长的SFB是否保留其定植小鼠并刺激特征性先天性和获得性免疫应答的能力，将体外生长3天的SFB分成细丝/细胞内后代部分和纯细胞内后代部分(图5a、b)并管饲无菌小鼠。尽管细丝/细胞内后代和细胞内后代部分的投入差140倍，但在管饲后5天，这两种投入均稳定的确定了定植(图5c)。然而，与通常显示回肠良好定植的衍生自排泄物样品的SFB(SFBVivo)管饲的小鼠不同，用体外生长的SFB(SFBVitro)管饲的小鼠具有低得多的定植回肠的SFB数量(图3d和扩展的数据图1d)；相反，它们显示盲肠的大量定植(图5d)。因此，尽管SFBVitro显然可以附着于回肠，但这些结果表明回肠定植可能通过从排泄物投入中发现的孢子释放的细胞内后代更有效，这可能是因为在生命周期的这个特定阶段鞭毛的表达(Pamp等人，2012)。值得注意的是，先天性宿主应答(图3e)的量级与回肠的定植水平成正比(图3e)，而不是整体SFB排泄物负荷(扩展的数据图1c)，显示需要SFB的回肠附着以诱导先天性宿主应答。与SFBVivo类似，尽管效价较低，但SFBVitro也能够刺激派伊尔斑中的B细胞划分(图3f、g)，增强排泄物中的IgA分泌(图3h)，并增加小肠固有层中Th17细胞的数量和IL-17A信使RNA的水平(图3i-k)。

SFB-宿主相互作用以及宿主对SFB生长的应答。

尽管有效生长明显需求宿主细胞和SFB之间的密切接触，但是不容易观察到紧密的相互作用。然而，当通过将细胞内后代轻轻地离心到细胞上促进相互作用时，发现SFB细丝附着于mICcl2细胞(图4A-C)。这种稳定的相互作用伴随着围绕细丝顶端的肌动蛋白积累(图4C)，并且可以留下结构完整的空位附着位点(图4A，c)，类似于在小鼠回肠中观察到的那些(图5e)。附着的细丝包括未分化的细丝和已经达到最终细胞内后代阶段的那些。与体内结果相反(Tannock等，1984)，体外附着不是物种特异性的(图4D)。为了评估宿主在体外和体内对SFB的应答的相似性，分析了已知受SFB定植调节的上皮衍生的宿主因子的基因表达谱(Ivanov等人，2009；Gaboriau-Routhiau等人，2009；Goto等人，2014；Shima等人，2008；Lécuyer等人，2014)。发现体外基因调控接近重现体内基因调控(图4E)，从而进一步支持体外模型系统。除了先前涉及的上皮因子，试验了几种额外的细胞因子、趋化因子和宿主防御基因(图4F)。数据显示，SFB生长导致强的炎症宿主应答，诱导多效炎症调节子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1-α(IL1-α)和血清淀粉样蛋白A 1-3(Saa1-3)，诱导几种先天性宿主防御机制(Reg3γ、iNos、和乳铁蛋白)，以及有利于B细胞募集、IgA的迁移、T细胞的募集和激活、以及嗜中性粒细胞、树突状细胞和单核细胞募集的免疫环境。一致地，观察到在体外与mICcl2细胞共培养期间上调的大多数免疫基因的转录本水平在体内定植实验期间也被SFB增加，而不被大肠杆菌增加(图5f)。相反，人TC7细胞系中的转录应答与mICcl2细胞中观察到的相异，且与体内结果不一致(图4g)。最后，通过使用微生物相关分子模式(MAMP)的阵列，证实了体外对SFB的炎症应答可能是通过TLR2的激活而形成的(图4h)。

结论

这些数据证实SFB在体外成功培养，并提供SFB生长需求和宿主对SFB攻击的应答的新见解。这些数据表明，在体内SFB附着回肠表面是引发上皮细胞应答的重要特征，而在体外，附着仍然是不常见的，SFB和细胞的紧密接近在很大程度上似乎绕过附着的需要而递送刺激信号。这些结果强调了在回肠上皮表面的SFB复制性龛的优越位置在介导SFB的刺激潜力中的重要性。

实施例2：用于遗传修饰SFB菌株的方法

试验了一系列设计用于梭菌(Clostridia)物种的模块化穿梭载体(Heap等人，2009)，测试其在体外生长期间使用缀合和转化稳定地引入SFB中的能力。每种质粒含有不同的复制起点，具有可选择的抗生素抗性盒、多克隆位点和启动子。在SFB的体外生长期间进行缀合和转化。

缀合

使用需要向生长培养基中加入二氨基庚二酸的营养缺陷型大肠杆菌菌株作为供体菌株，因为该菌株可以在不存在二氨基庚二酸的丰富的培养基中容易被选择。

如上所述，从单相关小鼠中纯化SFB菌株，并且在以上对SFB的生长描述的条件下，在组织培养板或小室板上生长的宿主细胞(TC7细胞)中加入细胞内后代(IO)。

在大量生长发生后(2-4天)，加入二氨基庚二酸(100ug/ml)和供体大肠杆菌菌株(需要加入二氨基庚二酸(dap)用于生长并且携带质粒)并与细胞和SFB一起离心并维持给定时间(例如，4-8小时)。

或者，收集体外生长(培养)的SFB并与上述大肠杆菌菌株混合并沉淀(全部在低氧气下)，并维持在沉淀物中不同时间(例如，4-8小时)。

收集细菌，并用缺少二氨基庚二酸的常规的SFB生长培养基洗涤两次，然后置于具有常规的SFB培养基但补充有合适的抗生素的新鲜的真核细胞(总是在低氧下)上，所述抗生素是缀合质粒给予SFB抗性的抗生素。

在给定时间(0-24小时)后，收集SFV并将其管饲至无菌小鼠中。

通过抗生素处理的饮用水来选择重组SFB并维持。在处理SFB单相关小鼠免受SFB所需要的饮用水中使用抗生素的最佳和最小方案是之前确定的，并且用于选择重组SFB。

电穿孔转化

如上所述，将SFB在TC7细胞上体外生长(培养)2-4天。

收集SFB并放在冰上。在低氧条件下，采用置于冰上的溶液进行处理，用10％甘油/预先平衡的水将SFB洗涤6次，然后重悬并用10％甘油/H2O浓缩。

加入纯化的质粒DNA，电穿孔SFB(6.5kV.cm^-1至25kV.cm^-1)。

将SFB再次放置在常规SFB培养基中并旋转离心到新鲜细胞上。在加入选择性抗生素过夜之前，将SFB恢复3-24小时。

SFB被管饲到GF小鼠中。

通过抗生素处理的饮用水来选择重组SFB并维持重组SFB。

通过化学方法转化：氯化钙和热休克

如上所述，SFB在TC7细胞上体外生长2-4天。

收集SFB并放置在冰上。在低氧条件下，使用置于冰上的溶液进行处理，用0.1M氯化钙将SFB洗涤5次，然后重悬，并用10％甘油/0.1M氯化钙浓缩。

将纯化的质粒DNA加入到SFB中并孵育30分钟。

SFB在42℃下热休克30秒，然后再次放入常规SFB培养基中并旋转离心到新鲜细胞上。在加入选择性抗生素过夜之前，将SFB恢复3-24小时。

SFB被管饲到GF小鼠中。

或者，上述程序可以在室温下进行，除了热休克。

通过抗生素处理的饮用水来选择重组SFB并维持重组SFB。

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序列表

<110> 巴斯德研究所

联想基金会

法国公立援助医院

巴黎笛卡尔大学

国家健康科学研究所

G·埃贝尔

D·比卡尔

P·施努普夫

N·瑟夫邦苏桑

V·加博里欧-鲁蒂奥

P·圣索内蒂

<120> 在体外培养分节丝状菌的方法

<130> XRNcc-F226/207PCT2

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

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<212> DNA

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<223> 重组穿梭载体

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gcggccgctc atttggtttt tcaaatggct tttttgtttt tttaaaagtt aatgcagtgt 60

aacactttta tagttttatc ataattttat aaaaaatata acgcataaat agagaaataa 120

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<223> 重组穿梭载体 pMTL82151-ERM

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ctttttgctg ttggagcatg ggggttcagg gggtgcagta tctgacgtca atgccgagcg 540

aaagcgagcc gaagggtagc atttacgtta gataaccccc tgatatgctc cgacgcttta 600

tatagaaaag aagattcaac taggtaaaat cttaatatag gttgagatga taaggtttat 660

aaggaatttg tttgttctaa tttttcactc attttgttct aatttctttt aacaaatgtt 720

cttttttttt tagaacagtt atgatatagt tagaatagtt taaaataagg agtgagaaaa 780

agatgaaaga aagatatgga acagtctata aaggctctca gaggctcata gacgaagaaa 840

gtggagaagt catagaggta gacaagttat accgtaaaca aacgtctggt aacttcgtaa 900

aggcatatat agtgcaatta ataagtatgt tagatatgat tggcggaaaa aaacttaaaa 960

tcgttaacta tatcctagat aatgtccact taagtaacaa tacaatgata gctacaacaa 1020

gagaaatagc aaaagctaca ggaacaagtc tacaaacagt aataacaaca cttaaaatct 1080

tagaagaagg aaatattata aaaagaaaaa ctggagtatt aatgttaaac cctgaactac 1140

taatgagagg cgacgaccaa aaacaaaaat acctcttact cgaatttggg aactttgagc 1200

aagaggcaaa tgaaatagat tgacctccca ataacaccac gtagttattg ggaggtcaat 1260

ctatgaaatg cgattaaggg ccggccgaag caaacttaag agtgtgttga tagtgcagta 1320

tcttaaaatt ttgtataata ggaattgaag ttaaattaga tgctaaaaat ttgtaattaa 1380

gaaggagtga ttacatgaac aaaaatataa aatattctca aaacttttta acgagtgaaa 1440

aagtactcaa ccaaataata aaacaattga atttaaaaga aaccgatacc gtttacgaaa 1500

ttggaacagg taaagggcat ttaacgacga aactggctaa aataagtaaa caggtaacgt 1560

ctattgaatt agacagtcat ctattcaact tatcgtcaga aaaattaaaa ctgaatactc 1620

gtgtcacttt aattcaccaa gatattctac agtttcaatt ccctaacaaa cagaggtata 1680

aaattgttgg gagtattcct taccatttaa gcacacaaat tattaaaaaa gtggtttttg 1740

aaagccatgc gtctgacatc tatctgattg ttgaagaagg attctacaag cgtaccttgg 1800

atattcaccg aacactaggg ttgctcttgc acactcaagt ctcgattcag caattgctta 1860

agctgccagc ggaatgcttt catcctaaac caaaagtaaa cagtgtctta ataaaactta 1920

cccgccatac cacagatgtt ccagataaat attggaagct atatacgtac tttgtttcaa 1980

aatgggtcaa tcgagaatat cgtcaactgt ttactaaaaa tcagtttcat caagcaatga 2040

aacacgccaa agtaaacaat ttaagtaccg ttacttatga gcaagtattg tctattttta 2100

atagttatct attatttaac gggaggaaat aattctatga gtcgcttttg taaatttgga 2160

aagttacacg ttactaaagg gaatgtgttt aaactccttt ttgataatct catgaccaaa 2220

atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 2280

tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 2340

ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 2400

ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac 2460

cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 2520

gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 2580

gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 2640

acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 2700

gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 2760

agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 2820

tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 2880

agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt 2940

cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 3000

gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc 3060

ccaatacgca gggccccctg cttcggggtc attatagcga ttttttcggt atatccatcc 3120

tttttcgcac gatatacagg attttgccaa agggttcgtg tagactttcc ttggtgtatc 3180

caacggcgtc agccgggcag gataggtgaa gtaggcccac ccgcgagcgg gtgttccttc 3240

ttcactgtcc cttattcgca cctggcggtg ctcaacggga atcctgctct gcgaggctgg 3300

ccggctaccg ccggcgtaac agatgagggc aagcggatgg ctgatgaaac caagccaacc 3360

aggaagggca gcccacctat caaggtgtac tgccttccag acgaacgaag agcgattgag 3420

gaaaaggcgg cggcggccgg catgagcctg tcggcctacc tgctggccgt cggccagggc 3480

tacaaaatca cgggcgtcgt ggactatgag cacgtccgcg agctggcccg catcaatggc 3540

gacctgggcc gcctgggcgg cctgctgaaa ctctggctca ccgacgaccc gcgcacggcg 3600

cggttcggtg atgccacgat cctcgccctg ctggcgaaga tcgaagagaa gcaggacgag 3660

cttggcaagg tcatgatggg cgtggtccgc ccgagggcag agccatgact tttttagccg 3720

ctaaaacggc cggggggtgc gcgtgattgc caagcacgtc cccatgcgct ccatcaagaa 3780

gagcgacttc gcggagctgg tgaagtacat caccgacgag caaggcaaga ccgatcgggc 3840

cc 3842

Claims (52)

1.一种培养分节丝状菌(SFB)菌株的体外方法，其包括将宿主细胞与所述SFB菌株共培养，所述宿主细胞是人或小鼠结肠上皮细胞或小肠细胞，或人或小鼠腺癌细胞，其中在丰富的组织培养液体培养基中，在低于5％的O₂水平下进行培养，所述丰富的组织培养液体培养基含有包括浓度为0.015至0.05mM的铁的细菌培养基组分。

2.一种培养SFB菌株的体外方法，其包括以下步骤：

a)在固体培养基上生长宿主细胞，所述宿主细胞是人或小鼠结肠上皮细胞或小肠细胞，或人或小鼠腺癌细胞；

b)将在步骤a)中生长的宿主细胞浸入丰富的组织培养液体培养基中，所述丰富的组织培养液体培养基含有包括浓度为0.015至0.05mM的铁的细菌培养基组分；

c)用SFB菌株攻击步骤b)的细胞培养物；

d)在液体培养基中，在低于5％的O₂水平下，共培养活的宿主细胞和SFB菌株；和任选地

e)回收培养的SFB菌株。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中SFB菌株是野生型菌株或通过转化、转导或缀合从野生型SFB菌株获得的遗传修饰菌株。

4.根据权利要求3所述的方法，其中野生型SFB菌株从哺乳动物分离。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中宿主细胞选自人Caco-2、TC7或HeLa细胞系或小鼠mICcl2或CMT93细胞系。

6.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤a)中，宿主细胞在0.5至3％的O₂水平生长。

7.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤a)中，用于生长宿主细胞的温度是36℃至38℃。

8.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤a)中，使宿主细胞生长直到细胞汇合度至少为20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％。

9.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤a)中，使宿主细胞生长直到获得细胞单层。

10.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤a)中，宿主细胞的接种密度在每平方厘米1×10⁴至6×10⁴个细胞。

11.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤b)中，宿主细胞-SFB液体培养基是含有包括铁的细菌培养基组分的丰富的组织培养基。

12.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤b)中，宿主细胞-SFB液体培养基包含脑心浸液和酵母/蛋白胨/酪蛋白氨基酸混合物。

13.根据权利要求1或2所述的方法，其中液体培养基包含DMEM/F12改进培养基，所述DMEM/F12改进培养基补充有胎牛血清、非必需氨基酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、脑心浸液、酵母/蛋白胨/酪蛋白氨基酸混合物和铁。

14.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中，SFB菌株是细丝或细胞内后代的形式。

15.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤c)中，SFB菌株与宿主细胞紧密接触或直接接触。

16.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤c)中，宿主细胞的培养密度在每平方厘米0.5×10⁵至3×10⁵个细胞。

17.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤c)中，SFB的接种密度在每平方厘米0.2x10⁴至10.10⁴个细胞。

18.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤c)中，宿主细胞和SFB之间的比为0.1至100。

19.根据权利要求1或2所述的方法，其中宿主细胞和SFB的共培养在0.5至3％的O₂水平下进行。

20.根据权利要求1或2所述的方法，其中铁的浓度为0.02至0.04mM。

21.根据权利要求1或2所述的方法，其中铁是亚铁形式(Fe²⁺态)和/或三价铁(Fe³⁺态)形式。

22.根据权利要求2所述的方法，其中培养的SFB菌株以细丝、细胞内后代或孢子的形式回收。

23.通过根据权利要求1或2所述的体外培养方法获得的SFB菌株作为益生菌的用途。

24.根据权利要求23所述的用途，其中SFB菌株是活的或死亡的。

25.根据权利要求23所述的用途，其中SFB菌株为细丝、细胞内后代或孢子的形式。

26.一种通过缀合遗传修饰SFB菌株的方法，其包括以下步骤：

i)用包含待引入SFB菌株中的感兴趣的DNA序列的重组穿梭载体DNA对大肠杆菌菌株进行遗传修饰，其中所述穿梭载体DNA能够在大肠杆菌菌株和待遗传修饰靶向的SFB菌株中复制；

ii)根据权利要求2所述的培养的体外方法，将在步骤i)中获得的经遗传修饰的大肠杆菌菌株与待遗传修饰靶向的SFB菌株共培养，其中：

在所述培养方法的步骤c)中，步骤b)的细胞培养物用待遗传修饰靶向的SFB菌株和所述遗传修饰的大肠杆菌菌株进行攻击；和

在所述培养方法的步骤d)中，活的宿主细胞、SFB菌株和遗传修饰的大肠杆菌菌株在液体培养基中、在低于5％的O₂水平共培养；

iii)回收步骤ii)的遗传修饰的SFB菌株。

27.根据权利要求26所述的方法，其中大肠杆菌菌株的遗传修饰可以通过电穿孔、转导、热休克转化或原生质体融合进行。

28.根据权利要求26所述的方法，其中重组穿梭载体是包含感兴趣的DNA序列并且能够在大肠杆菌菌株和梭菌菌株中复制的重组梭菌穿梭载体DNA。

29.根据权利要求26所述的方法，其中重组穿梭载体包含一种或不同的可选抗生素标记物。

30.根据权利要求26所述的方法，其中感兴趣的DNA序列在SFB中功能性强启动子的控制下。

31.根据权利要求26所述的方法，其中感兴趣的DNA序列是编码抗原的DNA序列。

32.根据权利要求30所述的方法，其中感兴趣的DNA序列是SEQ ID NO：17。

33.一种通过电穿孔遗传修饰SFB菌株的方法，其包括以下步骤：

i)根据权利要求2所述的培养的体外方法培养和回收SFB菌株；

ii)将步骤i)中回收的SFB菌株与待转化的纯化质粒混合；

iii)向步骤ii)中获得的混合物施加电脉冲；

iv)回收遗传转化的SFB菌株。

34.根据权利要求33所述的方法，其中在步骤ii)中，纯化质粒选自SEQ ID NO：18所示的pMTL82151-ERM、SEQ ID NO：19所示的pMTL83151-ERM、SEQ ID NO：20所示的pMTL84151-ERM和SEQ ID NO：21所示的pMTL85151-ERM。

35.一种通过化学转化遗传修饰SFB菌株的方法，其包括以下步骤：

i)根据权利要求2所述的培养的体外方法培养和回收SFB菌株；

ii)将步骤i)中回收的SFB菌株与待转化的纯化质粒混合；

iii)孵育在步骤ii)中获得的混合物；

iv)任选地，对所述混合物施加热休克；

v)回收遗传转化的SFB菌株。

36.根据权利要求35所述的方法，其中纯化质粒包含抗生素抗性盒。

37.根据权利要求35或36所述的方法，其中在步骤iv)中，在41-43℃下、施加热休克15至45秒。

38.根据权利要求29、34或36所述的方法，所述方法还包括体内选择转化的SFB菌株的步骤，其通过向小鼠的肠施用体外选择的经包含抗生素抗性盒的质粒转化的SFB、然后向所述小鼠施用相应的抗生素标记物、然后从所述小鼠回收活的遗传转化的SFB菌株。

39.一种分离的遗传修饰的SFB菌株，其表达衍生自不同于SFB的微生物或细胞的感兴趣的抗原，所述分离的遗传修饰的SFB菌株通过根据权利要求26的缀合、根据权利要求33的电穿孔、或根据权利要求35的转化而获得。

40.一种活的遗传修饰的SFB菌株，口服摄取或肠胃外施用至受试者之后，用作抗原递送载体，所述活的遗传修饰的SFB菌株通过根据权利要求26的缀合、根据权利要求33的电穿孔、或根据权利要求35的转化而获得。

41.根据权利要求40所述的活的遗传修饰的SFB菌株，其中所述活的遗传修饰的SFB菌株为细丝、细胞内后代或孢子的形式。

42.一种表达衍生自不同于SFB的微生物或细胞的感兴趣的抗原的活的遗传修饰的SFB菌株，用作药物，所述活的遗传修饰的SFB菌株通过根据权利要求26的缀合、根据权利要求33的电穿孔、或根据权利要求35的转化而获得。

43.一种治疗性免疫原性组合物，其包含表达衍生自不同于SFB的微生物或细胞的感兴趣的抗原的活的遗传修饰的SFB菌株，所述活的遗传修饰的SFB菌株通过根据权利要求26的缀合、根据权利要求33的电穿孔、或根据权利要求35的转化而获得。

44.一种食品产品，其包含通过根据权利要求1或2所述的培养的体外方法获得的SFB菌株。

45.根据权利要求44所述的食品产品，其中SFB菌株为细丝、细胞内后代或孢子形式。

46.根据权利要求39所述的分离的遗传修饰的SFB菌株或根据权利要求43所述的治疗性免疫原性组合物，其中微生物是细菌、病毒或真菌生物体。

47.根据权利要求39所述的分离的遗传修饰的SFB菌株或根据权利要求43所述的治疗性免疫原性组合物，其中细胞是哺乳动物来源的。

48.根据权利要求39所述的分离的遗传修饰的SFB菌株或根据权利要求43所述的治疗性免疫原性组合物，其中抗原衍生自腹泻病原体志贺菌的表面蛋白。

49.根据权利要求39所述的分离的遗传修饰的SFB菌株或根据权利要求43所述的治疗性免疫原性组合物，其中抗原衍生自ETEC。

50.根据权利要求39所述的分离的遗传修饰的SFB菌株或根据权利要求43所述的治疗性免疫原性组合物，其中抗原衍生自EPEC。

51.根据权利要求39所述的分离的遗传修饰的SFB菌株或根据权利要求43所述的治疗性免疫原性组合物，其中热不稳定毒素是热不稳定毒素的无毒B亚基。

52.根据权利要求39所述的分离的遗传修饰的SFB菌株或权利要求43所述的治疗性免疫原性组合物，其中紧密粘附素是编码94kDaβ-紧密粘附素的氨基酸363至808的片段。

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