JPS63289A - バクテリアにおける新規リボゾ−ム結合部位を用いたタンパク生産の増強 - Google Patents
バクテリアにおける新規リボゾ−ム結合部位を用いたタンパク生産の増強Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
-
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- C07K14/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｅ、 Ｃｏ１１での遺伝子の発現を増強する
ことが出来る核酸配列に向けられたものである。
ことが出来る核酸配列に向けられたものである。
発明の背景
ＤＮＡ組み換え技術の分野は、酵母やバクテリアのよう
な微生物において、多様な天然物及び合成ポリペプチド
を生産する数多くの系への発展へと導いた。これらの発
展にもかかわらず、さらに能率的で経済的なポリペプチ
ド生産の方法を提供することが引き続き必要である。ポ
リペプチドの商業的生産のためのプロセスを開発する場
合、ポリペプチドの経済的及び効率的生産を最適化する
ための多くの要因がある。これらの要因のなかには、調
節シグナルがあり、それらは、遺伝子複製、翻訳転写に
関ちする核酸（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）配列である
。
な微生物において、多様な天然物及び合成ポリペプチド
を生産する数多くの系への発展へと導いた。これらの発
展にもかかわらず、さらに能率的で経済的なポリペプチ
ド生産の方法を提供することが引き続き必要である。ポ
リペプチドの商業的生産のためのプロセスを開発する場
合、ポリペプチドの経済的及び効率的生産を最適化する
ための多くの要因がある。これらの要因のなかには、調
節シグナルがあり、それらは、遺伝子複製、翻訳転写に
関ちする核酸（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）配列である
。
翻訳は、第一にメツセンジャーＲＮ Ａ（ｍＲＮＡ）が
リボゾームに結びつくことを含む多段階プロセスである
。翻訳［ｉ１始コドンで始まり、ｍＲＮＡ分子に沿って
リボゾームが動くにつれて、ｍＲＮＡコドンが次々と読
み取られる。次に、特定のアミノ酸は順番に・生長しつ
つあるポリペプチド鎖に加えら机で行き、ｍＲＮＡ中に
コードされているタンパクまたはポリペプチドを産生す
る。
リボゾームに結びつくことを含む多段階プロセスである
。翻訳［ｉ１始コドンで始まり、ｍＲＮＡ分子に沿って
リボゾームが動くにつれて、ｍＲＮＡコドンが次々と読
み取られる。次に、特定のアミノ酸は順番に・生長しつ
つあるポリペプチド鎖に加えら机で行き、ｍＲＮＡ中に
コードされているタンパクまたはポリペプチドを産生す
る。
既述のように、翻訳の最初の段階は、ｒｒｌＮＡ分子の
りボゾームへの結合である。この相互作用（すなわも結
合）は、部分的にしか解明されていない。バクテリアの
翻訳開始複合体から単離したりボヌクレアーゼ低抗性オ
リゴヌクレオチドの解析により、艮ざ約３０から４０の
塩基（ヌクレオチド）がこの最初のりボゾーム結合部位
を含むことがわかっている。大抵の場合、ＡＵＧである
が開始コドンはりボゾーム結合部位の中心のまわりに位
置している。それゆえ、以下ではりボゾーム結合部位（
Ｒ，Ｂ、Ｓ、）は、リボゾームの結合及び翻訳開始にあ
ずかっている翻訳開始コドンを取りまいているｍ−ＲＮ
△配列を含むものと理解する。
りボゾームへの結合である。この相互作用（すなわも結
合）は、部分的にしか解明されていない。バクテリアの
翻訳開始複合体から単離したりボヌクレアーゼ低抗性オ
リゴヌクレオチドの解析により、艮ざ約３０から４０の
塩基（ヌクレオチド）がこの最初のりボゾーム結合部位
を含むことがわかっている。大抵の場合、ＡＵＧである
が開始コドンはりボゾーム結合部位の中心のまわりに位
置している。それゆえ、以下ではりボゾーム結合部位（
Ｒ，Ｂ、Ｓ、）は、リボゾームの結合及び翻訳開始にあ
ずかっている翻訳開始コドンを取りまいているｍ−ＲＮ
△配列を含むものと理解する。
大抵の原核細胞のりボゾームの結合部情では、開始コド
ンは５から９塩基距てた上流にプリンに冨／Ｖだ領域が
ある。この、いわゆるシャインーダルガルノ配列（Ｓｈ
ｉｎ−Ｄａｌｇａｒｎｏ、 １９７４ ）は、１６８
リボゾームＲＮＡ （ｒＲＮＡ）の３′末端に近い領域
と相補的な可変領域を示す。この領域の重要性は、この
配列を変化させることによって直接的に、また数種の既
知シャインーダルガルノ配列を比較することによって間
接的に証明された。
ンは５から９塩基距てた上流にプリンに冨／Ｖだ領域が
ある。この、いわゆるシャインーダルガルノ配列（Ｓｈ
ｉｎ−Ｄａｌｇａｒｎｏ、 １９７４ ）は、１６８
リボゾームＲＮＡ （ｒＲＮＡ）の３′末端に近い領域
と相補的な可変領域を示す。この領域の重要性は、この
配列を変化させることによって直接的に、また数種の既
知シャインーダルガルノ配列を比較することによって間
接的に証明された。
シャインーダルガルノ配列も、１６ＳのｆｉＶｊ、もと
もに開始複合体からＲＮＡの二重構造体として共存した
形で単９１１することができる。したがって、シャイン
ーダルガルノ配列は、バクテリアの１６３リボゾームＲ
ＮＡの特定な配列と、１６３リボゾームの特定の領域内
で塩基対を作ることが見出された。シャインーダルガル
ノ領Ｒ＜ＳＤ−領域）またはＳ Ｉ）−配列は３０Ｓ粒
子が、ｍ ＲＮ Ａ上の開始コドンに対して自らを適切
な位置におくのを助けているものと考えられる。
もに開始複合体からＲＮＡの二重構造体として共存した
形で単９１１することができる。したがって、シャイン
ーダルガルノ配列は、バクテリアの１６３リボゾームＲ
ＮＡの特定な配列と、１６３リボゾームの特定の領域内
で塩基対を作ることが見出された。シャインーダルガル
ノ領Ｒ＜ＳＤ−領域）またはＳ Ｉ）−配列は３０Ｓ粒
子が、ｍ ＲＮ Ａ上の開始コドンに対して自らを適切
な位置におくのを助けているものと考えられる。
ＡＵＧとＳＤ〜領域間の距離及びこのスベー号−ｍＲＮ
Ａ配列の塩基組成の間の距離の変化は、翻訳■１始プロ
セスの効率化に影響することがわかった。それゆえ、Ｅ
、 Ｃｏ１１のようなバクテリアで、ｍ ＲＮ Ａの
翻訳効率を最適化する試みは、これまで３つの成分、す
なわち、開始／シグナルコドン（ＡＵＧ）、ＳＤ−領域
及びＡＵＧとｓＤ−領域の間のスペーサーの長さと、核
酸成分に集中していた。翻訳のレベルにおけるその他の
操作には、翻訳の開始点及びその廻りのｍＲＮＡの二次
的構造の除去、モして／または、例えばよそもののｍＲ
ＮＡ中の、さもないと比較的好ましくないコドンを、も
つと好ましいバクテリアのコドンと取換えることが含ま
れる。これらの後者の操作は、個々のｍＲＮＡに基いて
行なわれなければならず、したがって、一般的にそれに
よってポリペプチドの生産が増強されるような円遍的手
段は提供しない。
Ａ配列の塩基組成の間の距離の変化は、翻訳■１始プロ
セスの効率化に影響することがわかった。それゆえ、Ｅ
、 Ｃｏ１１のようなバクテリアで、ｍ ＲＮ Ａの
翻訳効率を最適化する試みは、これまで３つの成分、す
なわち、開始／シグナルコドン（ＡＵＧ）、ＳＤ−領域
及びＡＵＧとｓＤ−領域の間のスペーサーの長さと、核
酸成分に集中していた。翻訳のレベルにおけるその他の
操作には、翻訳の開始点及びその廻りのｍＲＮＡの二次
的構造の除去、モして／または、例えばよそもののｍＲ
ＮＡ中の、さもないと比較的好ましくないコドンを、も
つと好ましいバクテリアのコドンと取換えることが含ま
れる。これらの後者の操作は、個々のｍＲＮＡに基いて
行なわれなければならず、したがって、一般的にそれに
よってポリペプチドの生産が増強されるような円遍的手
段は提供しない。
加うるに、技術の状態は、Ｅ、 Ｃｏ１１のような微
生物において、よそものの遺伝子の産物を高い水準で発
現することが決まりきった仕事であり、予知できる操作
であるところまでは到達していない。ここで用いられる
”よそらの“という言葉は、通常では、特定の宿主細胞
に存在しない遺伝子、タンパク、そして／または核酸分
子を意味している。よそもの遺伝子、ｍＲＮＡ及びタン
パクの微妙な特徴は、すべて、微生物の発現機構に影響
することが出来、望む化合物の集積が減少することにな
る。詳しくいえば、既知の原核細胞の遺伝子の発現効率
は、約ｉ、ｏｏｏのファクターも変動する。（Ｇｏｌｄ
ら、１９８４）Ｅ、 Ｃｏ１１のような原核細胞宿主
において高い水準の遺伝子発現を達成するには、多量の
ｍＲＮＡを発生するために強力な転写プロモーターを用
いることが必要であるばかりでなく、ｍＲＮＡの効率よ
い翻訳を確保するりボゾームの結合部位を確認すること
が必要である。したがって、広く多様な遺伝子（例えば
原核１１Ｉ１１１性ならびに真核ＩＩｌ胞性速性遺伝子
対して、予知可能な、増加もしくは増強翻訳レベルと関
連づけられる結合位置を９１つ出す必要がある。
生物において、よそものの遺伝子の産物を高い水準で発
現することが決まりきった仕事であり、予知できる操作
であるところまでは到達していない。ここで用いられる
”よそらの“という言葉は、通常では、特定の宿主細胞
に存在しない遺伝子、タンパク、そして／または核酸分
子を意味している。よそもの遺伝子、ｍＲＮＡ及びタン
パクの微妙な特徴は、すべて、微生物の発現機構に影響
することが出来、望む化合物の集積が減少することにな
る。詳しくいえば、既知の原核細胞の遺伝子の発現効率
は、約ｉ、ｏｏｏのファクターも変動する。（Ｇｏｌｄ
ら、１９８４）Ｅ、 Ｃｏ１１のような原核細胞宿主
において高い水準の遺伝子発現を達成するには、多量の
ｍＲＮＡを発生するために強力な転写プロモーターを用
いることが必要であるばかりでなく、ｍＲＮＡの効率よ
い翻訳を確保するりボゾームの結合部位を確認すること
が必要である。したがって、広く多様な遺伝子（例えば
原核１１Ｉ１１１性ならびに真核ＩＩｌ胞性速性遺伝子
対して、予知可能な、増加もしくは増強翻訳レベルと関
連づけられる結合位置を９１つ出す必要がある。
Ｇｏｌｄら（１９８４）による１報告において、Ｅ、Ｃ
ｏ１１ ｍＲＮＡ中、Ｌ、−Ｃ工ｑ−Ｌｊ−１６Ｓリ
ボゾームＲＮＡと塩基対を形成できる非−８Ｄ−領域が
報告された。しかし、該ｍＲＮＡ分子はまた新規の翻訳
開始コドンＡｔＪＵを含／υでいることが見出され、こ
のコドンは、 旦エ Ｃｏ１１ ｍＲＮＡ中で特異なものである。
ｏ１１ ｍＲＮＡ中、Ｌ、−Ｃ工ｑ−Ｌｊ−１６Ｓリ
ボゾームＲＮＡと塩基対を形成できる非−８Ｄ−領域が
報告された。しかし、該ｍＲＮＡ分子はまた新規の翻訳
開始コドンＡｔＪＵを含／υでいることが見出され、こ
のコドンは、 旦エ Ｃｏ１１ ｍＲＮＡ中で特異なものである。
（Ｇｏｌｄら、１９８４）。
１監立１遣
本発明は、バクテリア中で、原核・真核両方の広（多様
な遺伝子の発現を増強するのに役立つ本質的に純粋な核
酸分子を提供する。１つの態様では、ＤＮＡ配列バタテ
リオファーヂＴ７遺伝子１０コード配列の翻訳開始コド
ンの５′末端に隣接する約１００ヌクレオチドを含む。
な遺伝子の発現を増強するのに役立つ本質的に純粋な核
酸分子を提供する。１つの態様では、ＤＮＡ配列バタテ
リオファーヂＴ７遺伝子１０コード配列の翻訳開始コド
ンの５′末端に隣接する約１００ヌクレオチドを含む。
現在の発明のもう１つの態様では、第１図中の配列を含
むヌクレオチド配列が提供されている。
むヌクレオチド配列が提供されている。
現在の発明のさらにもう１つの態様では、第２図に示さ
れている配列を含むヌクレオチド配列が提供される。
れている配列を含むヌクレオチド配列が提供される。
現在の発明のもう１つの態様では、１６８リボゾームＲ
ＮΔと塩基対を作ることができる約５から１０のヌクレ
オブトを含み、配列がＳＤ−配列とは異なるヌクレオチ
ド配列が提供される。
ＮΔと塩基対を作ることができる約５から１０のヌクレ
オブトを含み、配列がＳＤ−配列とは異なるヌクレオチ
ド配列が提供される。
さらにもう１つの態様では、ＳＤ−配列とは異なるバク
テリアの１６３リボゾームのＲＮ Ａ ｆｆｉ Ｒに相
補的な配列を含むリボゾーム結合部位を含む遺伝子が提
供されている。
テリアの１６３リボゾームのＲＮ Ａ ｆｆｉ Ｒに相
補的な配列を含むリボゾーム結合部位を含む遺伝子が提
供されている。
さらに、１つの態様では、旦エ Ｃｏ１１の１６８リボ
ゾームＲＮＡと塩基対を作ることができる、５’ −
ＵＬＪＡＡＣｔＪＵ −３’ 、５’−ＡＡＣＬＩＬＪ
ＵＡ−３’及び ５’ −ＬＩＵＡＡＣＬＪＬＪＵＡ−３’ からなる
グループから選ばれた配列を含むｍＲＮＡ分子中の新規
配列が提供されている。
ゾームＲＮＡと塩基対を作ることができる、５’ −
ＵＬＪＡＡＣｔＪＵ −３’ 、５’−ＡＡＣＬＩＬＪ
ＵＡ−３’及び ５’ −ＬＩＵＡＡＣＬＪＬＪＵＡ−３’ からなる
グループから選ばれた配列を含むｍＲＮＡ分子中の新規
配列が提供されている。
さらに、本発明のもう１つの態様では、バクテリアにお
けるｍＲＮＡの翻訳、したがってタンパクの生産を増強
１゛る１６３リボゾームＲＮＡとｍＲＮＡの間の新）々
な相７２作用が記述されている。
けるｍＲＮＡの翻訳、したがってタンパクの生産を増強
１゛る１６３リボゾームＲＮＡとｍＲＮＡの間の新）々
な相７２作用が記述されている。
本発明のざらにもう１つの態様では、本発明の新規配列
を含む分子及び宿主バクテリア細胞のゲル中に組みこむ
ことがでざる責質ポリペプチド産物の生産に関連した単
数または複数の遺伝子が提供されている。より好ましい
態様では、このような分子は哺乳類生長ホルモン、アト
リオペプチゲン及び植物及びバクテリアの酵素のような
タンパクのバクテリア中での生産増強をまかなう。
を含む分子及び宿主バクテリア細胞のゲル中に組みこむ
ことがでざる責質ポリペプチド産物の生産に関連した単
数または複数の遺伝子が提供されている。より好ましい
態様では、このような分子は哺乳類生長ホルモン、アト
リオペプチゲン及び植物及びバクテリアの酵素のような
タンパクのバクテリア中での生産増強をまかなう。
本発明のさらにもう１つの態様において、バクテリアに
おいて該ＤＮＡが新規のりボゾーム結合部位、翻訳開始
コドン、異質ポリペプチド、翻訳停止コドンを含むゲノ
ムＤＮＡの発現をひき起し、そのあと、そのようにして
生産した異質ポリペプチドを回収することを含むポリペ
プチドの増強生産を達成するための方法が提供されてい
る。
おいて該ＤＮＡが新規のりボゾーム結合部位、翻訳開始
コドン、異質ポリペプチド、翻訳停止コドンを含むゲノ
ムＤＮＡの発現をひき起し、そのあと、そのようにして
生産した異質ポリペプチドを回収することを含むポリペ
プチドの増強生産を達成するための方法が提供されてい
る。
他の態様には、上記の方法において有用な種々の遺伝子
、ＤＮＡベクター及び形質転換バクテリアが含まれ、ま
た該新規ＤＮＡ配列が含まれている。
、ＤＮＡベクター及び形質転換バクテリアが含まれ、ま
た該新規ＤＮＡ配列が含まれている。
図面の説明
以下の図式表示において、核酸配列は特にその他の指示
がない場合には、５′末端から３′末端の順序で提供さ
れている。そして、その中で、ヌクレオシド、アデノシ
ン、グアニン、シトシン、チミジン及びウリジンは、そ
れぞれＡ、Ｇ、Ｃ１Ｔ及びＵで表されている。方向を示
す矢印は、ＤＮＡコーディング配列の５′末端から３′
末端を表している。Ｑ ｒ ｉ ＬＪは、プラスミツド
ベクターＤＮＡについての？Ｓ２’ｌＪの起点を示す。
がない場合には、５′末端から３′末端の順序で提供さ
れている。そして、その中で、ヌクレオシド、アデノシ
ン、グアニン、シトシン、チミジン及びウリジンは、そ
れぞれＡ、Ｇ、Ｃ１Ｔ及びＵで表されている。方向を示
す矢印は、ＤＮＡコーディング配列の５′末端から３′
末端を表している。Ｑ ｒ ｉ ＬＪは、プラスミツド
ベクターＤＮＡについての？Ｓ２’ｌＪの起点を示す。
そしてｓ ａ ｍ ｐ ｒ ｎは、アンピシリン耐性の
遺伝子を意味する。Ｉｎ！制限エンドヌクレアーゼ切断
点ら示してある。以下に記述されているように、印をつ
けたＤＮＡの領域は、図式的な目的のためだけのもので
あり、その他の指示がない場合には、実際の寸法に則し
て描かれていない。
遺伝子を意味する。Ｉｎ！制限エンドヌクレアーゼ切断
点ら示してある。以下に記述されているように、印をつ
けたＤＮＡの領域は、図式的な目的のためだけのもので
あり、その他の指示がない場合には、実際の寸法に則し
て描かれていない。
第１図は、アンダーラインをひいたヌクレオチドが、天
然に存在するバタテリオファージＴ７ｍ伝子１０ヌクレ
オチドと異っているヌクレオチドを表す合成二重ラセン Ｇ１０Ｌ配列のＤＮＡ配列を表し、（）は、Ｅ、 Ｃ
ｏ１１ １６３ ｒＲＮＡに対し相補的なヌクレオチ
ド（すなわち塩基）廿ｔ を表し、（）は、ＳＤ−配列を表す。
然に存在するバタテリオファージＴ７ｍ伝子１０ヌクレ
オチドと異っているヌクレオチドを表す合成二重ラセン Ｇ１０Ｌ配列のＤＮＡ配列を表し、（）は、Ｅ、 Ｃ
ｏ１１ １６３ ｒＲＮＡに対し相補的なヌクレオチ
ド（すなわち塩基）廿ｔ を表し、（）は、ＳＤ−配列を表す。
（Ｎｄｅｔ）は、天然に存在するバクテリオファージＴ
７３！Ｉ伝子１０の］−ド配列中の制限エンドヌクレア
ーゼＮｄｅｌの切断部位を意味する。
７３！Ｉ伝子１０の］−ド配列中の制限エンドヌクレア
ーゼＮｄｅｌの切断部位を意味する。
第２図は、下線を引いたヌクレオチドが天然に存在する
バタテリオファージＴ７遺伝子１０ヌクレオチドと異な
るヌクレオチドを表す５０塩基対の合成ＧＩ ０１分子
のＤＮＡ配列を表す。（）はＥ、 Ｃｏ１１ １６３ ｒＲＮＡに相補的なヌクレオチドせ士 （すなわち塩基）を意味し、（）は ＳＤ−配列を示す。（Ｎｄｅｌ）は、 Ｎｄｅｌ制限エンドヌクレアーぜによる天然に存在する
バクテリオファージＴ７ｍ伝子１０コード配列中の切断
部位を示す。
バタテリオファージＴ７遺伝子１０ヌクレオチドと異な
るヌクレオチドを表す５０塩基対の合成ＧＩ ０１分子
のＤＮＡ配列を表す。（）はＥ、 Ｃｏ１１ １６３ ｒＲＮＡに相補的なヌクレオチドせ士 （すなわち塩基）を意味し、（）は ＳＤ−配列を示す。（Ｎｄｅｌ）は、 Ｎｄｅｌ制限エンドヌクレアーぜによる天然に存在する
バクテリオファージＴ７ｍ伝子１０コード配列中の切断
部位を示す。
第３図は、ヌクレオチド４４７からヌクレオチド４８７
までの旦エ Ｃｏ１１ １６Ｓ ｒＲＮＡの配列を示す。本発明のＧＩ ＯＬ配列中に見
出される９ヌクレオチド配列も示されている。この９ヌ
クレオチド配列は垂直線で示されたように１６８ ｒ
ＲＮＡと塩基対を作ることができる。
までの旦エ Ｃｏ１１ １６Ｓ ｒＲＮＡの配列を示す。本発明のＧＩ ＯＬ配列中に見
出される９ヌクレオチド配列も示されている。この９ヌ
クレオチド配列は垂直線で示されたように１６８ ｒ
ＲＮＡと塩基対を作ることができる。
第４図は、” ０１０ Ｌ“と示されているＧ１０Ｌ配
列を含む表現ベクターを示す。ｔｔ Ｐ ｒｒは、宿主
細胞中でＤＮＡ配列の転写を起すことができるプロモー
ターをコードするＤＮＡ配列を表す゛コード領域″はポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列を表し、 ”ａｍｐＲ′’はアンピシリン耐性遺伝子を表す。
列を含む表現ベクターを示す。ｔｔ Ｐ ｒｒは、宿主
細胞中でＤＮＡ配列の転写を起すことができるプロモー
ターをコードするＤＮＡ配列を表す゛コード領域″はポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列を表し、 ”ａｍｐＲ′’はアンピシリン耐性遺伝子を表す。
第５図は、第１図に示されている合成Ｇ１０Ｌ配列の構
築を示す。断片＃１−＃６は個々に合成されたオリゴヌ
クレオチドを示す。
築を示す。断片＃１−＃６は個々に合成されたオリゴヌ
クレオチドを示す。
第６図は、ｒｅｃＡプロモーター（ｐｒｅＣ）、Ｇ１０
Ｌ配列（Ｇ１０Ｌ）及び３−エノールビルビルツキメー
ト５−フォスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰ）ＤＮＡコ
ード配列を含むＰＭＯＮ５５３７発現ベクターの構造を
示す。
Ｌ配列（Ｇ１０Ｌ）及び３−エノールビルビルツキメー
ト５−フォスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰ）ＤＮＡコ
ード配列を含むＰＭＯＮ５５３７発現ベクターの構造を
示す。
第７図は、ｒｅｃＡプロモーター（Ｐｒｅｃ）、Ｇ１０
Ｌ配列（Ｇ１０Ｌ）及びアトリオペプチゲン（ΔＰＱｅ
ｎ）をコードする ＤＮＡ配列を含んでいるＰＭＯＮ５５１５発現ベクター
の構築を示す。
Ｌ配列（Ｇ１０Ｌ）及びアトリオペプチゲン（ΔＰＱｅ
ｎ）をコードする ＤＮＡ配列を含んでいるＰＭＯＮ５５１５発現ベクター
の構築を示す。
第８図は、ウシ生長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤ
ＮＡ配列を持っているＭ１３ｍｐ９の複製型（ＲＦ）Ｄ
ＮＡを含む Ｍｌ ３ｍｐ９／ＢＧＨの構築を示す。
ＮＡ配列を持っているＭ１３ｍｐ９の複製型（ＲＦ）Ｄ
ＮＡを含む Ｍｌ ３ｍｐ９／ＢＧＨの構築を示す。
第９図は、オリゴヌクレオチド志向位置特異的突然変異
誘発によるＢＧＨ（Ｐ）コード配列からＢＧＨ（Ａ）コ
ード配列を創り出すことを表している。
誘発によるＢＧＨ（Ｐ）コード配列からＢＧＨ（Ａ）コ
ード配列を創り出すことを表している。
第１０図は、ｒｅｃＡプロモーター（Ｐｒｅｃ）、Ｇ１
０Ｌ配列（０１０Ｌ）及びＢＧＨ（Ａ）をコードする配
列を含むＰＭＯＮ５５３９発現ベクターの構築を示す。
０Ｌ配列（０１０Ｌ）及びＢＧＨ（Ａ）をコードする配
列を含むＰＭＯＮ５５３９発現ベクターの構築を示す。
第１１図は、ｒｅｃＡプロモーター（ｐｒｅＣ）、コン
トロールＲ，Ｂ、Ｓ、（コントロールＳ、Ｏ，＞及びＡ
Ｐ ｇｅ ｎ ヲ−１−Ｆ ｔ ル配列を含むＰＭＯ
Ｎ５５１４発現ベクターの構築を示す。
トロールＲ，Ｂ、Ｓ、（コントロールＳ、Ｏ，＞及びＡ
Ｐ ｇｅ ｎ ヲ−１−Ｆ ｔ ル配列を含むＰＭＯ
Ｎ５５１４発現ベクターの構築を示す。
第１２図は、ｒｅｃＡプロモーター（ＰｒｅＣ）、コン
トロールＲ，Ｂ、Ｓ （コントロールＳ、Ｄ、）及びＢ
ＧＨ（Ａ）をコードする配列を含むＰＭＯＮ ５５５１
発現ベクターの構築を示す。
トロールＲ，Ｂ、Ｓ （コントロールＳ、Ｄ、）及びＢ
ＧＨ（Ａ）をコードする配列を含むＰＭＯＮ ５５５１
発現ベクターの構築を示す。
免ｉ塵ｌ皇皇スＪ
本発明は、■、 Ｃｏ１１のようなバクテリア中のタ
ンパクの生産を強化するのに役立つＤＮＡ配列を提供す
る。このような配列の発見とこれらの配列を含む発現ビ
ークルの使用の発見は、バクテリアの宿主細胞中にわず
かにしか発現されないか、モして／または蓄積されない
タンパクの著しい増強生産を達成するのと同様に、バク
テリアにおいて発現可能な内生及び異質のタンパクの増
強生産を達成するための価値ある手段を提供する。
ンパクの生産を強化するのに役立つＤＮＡ配列を提供す
る。このような配列の発見とこれらの配列を含む発現ビ
ークルの使用の発見は、バクテリアの宿主細胞中にわず
かにしか発現されないか、モして／または蓄積されない
タンパクの著しい増強生産を達成するのと同様に、バク
テリアにおいて発現可能な内生及び異質のタンパクの増
強生産を達成するための価値ある手段を提供する。
このようなタンパクには、ウシ生長ホルモンやブタ生長
ホルモン、アトリオペプチゲン、イソペンテニルトラン
スフェラーゼ■、ゲルタデオン−８−トランスフェラー
ゼ１１グルタチオン−８−トランスフェラーゼ■、β−
ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール７セチルトラ
ンスフエラーゼ、３−エノールビルビルツキメート５−
フオスフオシンターゼ、鉄摂取調節タンパク、インスリ
ン様生長囚子■、キメラ状融合タンパクなどが含まれる
が、これらに限られるものではない。
ホルモン、アトリオペプチゲン、イソペンテニルトラン
スフェラーゼ■、ゲルタデオン−８−トランスフェラー
ゼ１１グルタチオン−８−トランスフェラーゼ■、β−
ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール７セチルトラ
ンスフエラーゼ、３−エノールビルビルツキメート５−
フオスフオシンターゼ、鉄摂取調節タンパク、インスリ
ン様生長囚子■、キメラ状融合タンパクなどが含まれる
が、これらに限られるものではない。
本発明の１態様においては、バクテリア中のポリペプチ
ド生産を増強するのに役立つＤＮＡ配列は、バクテリオ
ファージＴ７Ｍ伝子１０のコード配列の翻訳開始コドン
の５′末端（つまり、上流）に隣接する、約１００ケの
ヌクレオチド中に見出される。完結した１００ケのヌク
レオチド配列には、バタテリオファージＴｌｌ伝子１０
タンパクに対するプロモーター及び遺伝子１０ｍＲＮΔ
の５′ −末端非−１Ｉｌ訳領戦が含まれる。該ＤＮＡ
または等価のＲＮΔ配列もしくはそれらの断片は、今後
はひとまとめにして’ Ｇ １０ Ｌ ”配列と呼ぶこ
とにする。遺伝子１０は、その豊富な供給がバクテリオ
ファージエフ感染を通じて必要となるコートタンパクを
コードする。
ド生産を増強するのに役立つＤＮＡ配列は、バクテリオ
ファージＴ７Ｍ伝子１０のコード配列の翻訳開始コドン
の５′末端（つまり、上流）に隣接する、約１００ケの
ヌクレオチド中に見出される。完結した１００ケのヌク
レオチド配列には、バタテリオファージＴｌｌ伝子１０
タンパクに対するプロモーター及び遺伝子１０ｍＲＮΔ
の５′ −末端非−１Ｉｌ訳領戦が含まれる。該ＤＮＡ
または等価のＲＮΔ配列もしくはそれらの断片は、今後
はひとまとめにして’ Ｇ １０ Ｌ ”配列と呼ぶこ
とにする。遺伝子１０は、その豊富な供給がバクテリオ
ファージエフ感染を通じて必要となるコートタンパクを
コードする。
バクテリオファージエフゲノムの仝Ｉ）ＮΔ配列は、Ｄ
ｕｎｎと５ｔｕｄｉｅｒ （１９８３）により報告さ
れており、ここに同定されたＧ１０しの配列を参考とし
てここにつけ加えておく。したがって、ここに同定また
Ｇ１０Ｌ配列は、バクテリオファージＴ７ＤＮＡゲノム
の単離、そしてそれから、その道に熟達した人々にとっ
て既知の技術による０１０Ｌ配列の分離、もう１つの方
法として、本発明のＧ１０Ｌ配列は、常法によって別途
合成することができる。ひと度、化学合成もしくは単離
が行なわれると、現在の発明のＧ１０Ｌ配列、もしくは
等価の核酸配列は、ここでさらに完全に記述される如く
、本質的に純粋な核酸配列または分子を表す。したがっ
て、本発明の核酸（すなわら、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配
列もしくは分子を記述するのに使用された場合、本質的
に純粋という言葉は、天然の場合、共存している核酸を
本質的に含まない核酸配列または分子を意味するものと
理解される。このような木質的に純粋な核酸配列もしく
は分子には、より大きな（天然由来の）酵素的に、また
は化学的にｌｆｆ１させた核酸配列、天然に存在する介
在または隣接配列を含まない化学合成核酸、及び天然で
は、−緒に存在したり、結合したりして見出されない核
酸配列または分子と結合した核酸配列が含まれるが、こ
れらに限られるものではない。したがって、本質的に純
粋な分子が創り出される方法により、それらはもう１つ
の呼び方として”合成″核酸配列または分子と呼ばれる
ことが時々ある。
ｕｎｎと５ｔｕｄｉｅｒ （１９８３）により報告さ
れており、ここに同定されたＧ１０しの配列を参考とし
てここにつけ加えておく。したがって、ここに同定また
Ｇ１０Ｌ配列は、バクテリオファージＴ７ＤＮＡゲノム
の単離、そしてそれから、その道に熟達した人々にとっ
て既知の技術による０１０Ｌ配列の分離、もう１つの方
法として、本発明のＧ１０Ｌ配列は、常法によって別途
合成することができる。ひと度、化学合成もしくは単離
が行なわれると、現在の発明のＧ１０Ｌ配列、もしくは
等価の核酸配列は、ここでさらに完全に記述される如く
、本質的に純粋な核酸配列または分子を表す。したがっ
て、本発明の核酸（すなわら、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配
列もしくは分子を記述するのに使用された場合、本質的
に純粋という言葉は、天然の場合、共存している核酸を
本質的に含まない核酸配列または分子を意味するものと
理解される。このような木質的に純粋な核酸配列もしく
は分子には、より大きな（天然由来の）酵素的に、また
は化学的にｌｆｆ１させた核酸配列、天然に存在する介
在または隣接配列を含まない化学合成核酸、及び天然で
は、−緒に存在したり、結合したりして見出されない核
酸配列または分子と結合した核酸配列が含まれるが、こ
れらに限られるものではない。したがって、本質的に純
粋な分子が創り出される方法により、それらはもう１つ
の呼び方として”合成″核酸配列または分子と呼ばれる
ことが時々ある。
ここに記述される方法にしたがって、そして常用の組換
えＤＮＡ技術（Ｈａｎｉａｔｉｓら、１９８２）を使用
することにより、合成Ｇ１０Ｌ配列を宿主細胞のゲノム
の中に挿入することができる。その上、このような挿入
は、用いられたＧ１０Ｌ配列及びその挿入位置に関して
、タンパク生産、そして／または蓄積の増強をもたらす
。ここで用いられる用語゛ゲノム″は、宿主細胞内に含
まれる全体のＤＮＡ （例えば、染色体の、及び染色体
外のＤＮＡ）を意味している。用語゛ジーン“は、その
中にコードされているタンパクの生産に備えているＤＮ
Ａをいう。典型的には、ジーンはプロモーター、５′
−非一翻訳領域、翻訳開始／シグナルコドン、タンパク
をコードするコドン、翻訳停止／シグナルコドン及び３
′ −非一翻訳ＤＮＡを含んでいる。
えＤＮＡ技術（Ｈａｎｉａｔｉｓら、１９８２）を使用
することにより、合成Ｇ１０Ｌ配列を宿主細胞のゲノム
の中に挿入することができる。その上、このような挿入
は、用いられたＧ１０Ｌ配列及びその挿入位置に関して
、タンパク生産、そして／または蓄積の増強をもたらす
。ここで用いられる用語゛ゲノム″は、宿主細胞内に含
まれる全体のＤＮＡ （例えば、染色体の、及び染色体
外のＤＮＡ）を意味している。用語゛ジーン“は、その
中にコードされているタンパクの生産に備えているＤＮ
Ａをいう。典型的には、ジーンはプロモーター、５′
−非一翻訳領域、翻訳開始／シグナルコドン、タンパク
をコードするコドン、翻訳停止／シグナルコドン及び３
′ −非一翻訳ＤＮＡを含んでいる。
より好ましい態様において、Ｌ−Ω−ｑ−Ｌ」−のよう
なバクテリアにおいて望む化合物の生産増強は、図１で
示される約１００ヌクレオチドＧＩ ＯＬ断片を含むジ
ーンを用いることによって達成された。
なバクテリアにおいて望む化合物の生産増強は、図１で
示される約１００ヌクレオチドＧＩ ＯＬ断片を含むジ
ーンを用いることによって達成された。
それに加えて、１００塩基対Ｇ１０Ｌ配列の断片は、Ｅ
、 Ｃｏ１１のようなバクテリア中でのタンパク生産を
増強することが示された。このような断片は、図２に示
してある５０のヌクレオチド断片及び長さ５から１０ケ
のヌクレオチドを含む選ばれた断片を含んでいる。その
上、１００塩基対の０１０Ｌ配列の選ばれた断片が、リ
ボゾーム結合部位（Ｒ，［３，Ｓ、）内の種々の位置を
とった場合、生産物（ＩＴＡえばタンパク）の生産を増
強できることを発見した。このような位置は、シャイン
ーダルガルノ配列から上流（５′末端）の位置（複数）
、ＳＤ−配列と翻訳開始／シグナルコドン（ＡＵＧ）及
び望む生産物をコードする配列内（例えばＡＵＧコドン
から３′末端、すなわち下流）を含む。
、 Ｃｏ１１のようなバクテリア中でのタンパク生産を
増強することが示された。このような断片は、図２に示
してある５０のヌクレオチド断片及び長さ５から１０ケ
のヌクレオチドを含む選ばれた断片を含んでいる。その
上、１００塩基対の０１０Ｌ配列の選ばれた断片が、リ
ボゾーム結合部位（Ｒ，［３，Ｓ、）内の種々の位置を
とった場合、生産物（ＩＴＡえばタンパク）の生産を増
強できることを発見した。このような位置は、シャイン
ーダルガルノ配列から上流（５′末端）の位置（複数）
、ＳＤ−配列と翻訳開始／シグナルコドン（ＡＵＧ）及
び望む生産物をコードする配列内（例えばＡＵＧコドン
から３′末端、すなわち下流）を含む。
かくして、ここに明らかにした教えにしたがうことによ
り、旦エ Ｃｏ１１のようなバクテリアにおいてタンパ
ク生産増強を最適化する厳密な、ヌクレオチド配列を決
定することは、その道の熟達技術者の能力内でできるこ
とである。例えば、ここで提供されるＧ１０Ｌ配列中の
ヌクレオチド、附加、置換及び／または潤去を０１り行
うことにより、そして／または、発現ベクターの内部で
該配列の位置を再配置することにより、そして／または
、該配列をＥ、 Ｃｏ１１のような宿主細胞のゲノム
内に位置させることににす、 旦ユ Ｃｏ１１及び／または、他のバクテリア宿主細胞
において、タンパク生産増強の原因となっている正確な
ヌクレオチド配列を決定することができる。
り、旦エ Ｃｏ１１のようなバクテリアにおいてタンパ
ク生産増強を最適化する厳密な、ヌクレオチド配列を決
定することは、その道の熟達技術者の能力内でできるこ
とである。例えば、ここで提供されるＧ１０Ｌ配列中の
ヌクレオチド、附加、置換及び／または潤去を０１り行
うことにより、そして／または、発現ベクターの内部で
該配列の位置を再配置することにより、そして／または
、該配列をＥ、 Ｃｏ１１のような宿主細胞のゲノム
内に位置させることににす、 旦ユ Ｃｏ１１及び／または、他のバクテリア宿主細胞
において、タンパク生産増強の原因となっている正確な
ヌクレオチド配列を決定することができる。
さらに、本発明のＧＩ ＯＬ配り１１を用いる旦エ Ｃ
ｏ１１における、望むタンパクを生産するシステムの解
析により、認められたタンパク生産と蓄積は、主として
Ｇｌ ＯＬ配列を含み、望みのタンパクを：１−ドして
いるｍＲＮＡ分子の強化された、そして／またはもつと
効果的な翻訳によって達成された。出願者は、別作につ
いての以下の理論で制限を受けることは望んでいないが
、Ｇ１０Ｌ配列は、Ｇ１０［−は該部位を含むｍ ＲＮ
Ａ分子の翻訳の効率上昇を促１μする新規のりボゾー
ム結合部位を提供していると信じられている。事実、Ｇ
１０Ｌ配列をＢｒｏｓｕｉｓら（１９７８）によって弁
表されている１６ＳリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮ△）配列
とコンピューターで比較解析を行ったところ、旦エ Ｃ
ｏ１１（図３をみよ）の１６８とＲＮＡの新規な領域と
相補的である（ＯｌＩら、塩基対を作ることができる）
約９ケのヌクレオブトが光児された。該相補的Ｇ １０
Ｌ配列、叩らホＵロジー領域は、図１において星（＾
）で示したヌクレオチド ５’ −ＴＴＡΔＣ’Ｉ−Ｔ Ｔ Ａ −３’ を含
／Ｖでいる。
ｏ１１における、望むタンパクを生産するシステムの解
析により、認められたタンパク生産と蓄積は、主として
Ｇｌ ＯＬ配列を含み、望みのタンパクを：１−ドして
いるｍＲＮＡ分子の強化された、そして／またはもつと
効果的な翻訳によって達成された。出願者は、別作につ
いての以下の理論で制限を受けることは望んでいないが
、Ｇ１０Ｌ配列は、Ｇ１０［−は該部位を含むｍ ＲＮ
Ａ分子の翻訳の効率上昇を促１μする新規のりボゾー
ム結合部位を提供していると信じられている。事実、Ｇ
１０Ｌ配列をＢｒｏｓｕｉｓら（１９７８）によって弁
表されている１６ＳリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮ△）配列
とコンピューターで比較解析を行ったところ、旦エ Ｃ
ｏ１１（図３をみよ）の１６８とＲＮＡの新規な領域と
相補的である（ＯｌＩら、塩基対を作ることができる）
約９ケのヌクレオブトが光児された。該相補的Ｇ １０
Ｌ配列、叩らホＵロジー領域は、図１において星（＾
）で示したヌクレオチド ５’ −ＴＴＡΔＣ’Ｉ−Ｔ Ｔ Ａ −３’ を含
／Ｖでいる。
この配＆ｌＩは、ｒηＩ−＜ Ｎ△配り１１５’ −
ｕｕＡＡｃｕｕｕ△−３′の配列に相当する。したがっ
て、先のＧ１０Ｌホモ０ジー領域、その機能的断面及び
相当するＲＮＡ配列は、今後まとめてＧ１０Ｌ １６
Ｓ ｒＲＮ△ボモロジー配列または領域という。９つ
のヌクレオチドの機能断片は、１６Ｓ ｒＲＮＡと塩
基対を作り、ぞして／またはＥ、 Ｃｏ１１のような
バクテリアに異質タンパク生産増強を行うことができる
、ヌクレオチドを含んでいると理解される。このような
機能的断片の例には、 ５′−八ＡＣＵｔＪＵＡ −３’と ５’ −ＵＵＡＡＣＵＵ−３’ からなる分子を含む
。
ｕｕＡＡｃｕｕｕ△−３′の配列に相当する。したがっ
て、先のＧ１０Ｌホモ０ジー領域、その機能的断面及び
相当するＲＮＡ配列は、今後まとめてＧ１０Ｌ １６
Ｓ ｒＲＮ△ボモロジー配列または領域という。９つ
のヌクレオチドの機能断片は、１６Ｓ ｒＲＮＡと塩
基対を作り、ぞして／またはＥ、 Ｃｏ１１のような
バクテリアに異質タンパク生産増強を行うことができる
、ヌクレオチドを含んでいると理解される。このような
機能的断片の例には、 ５′−八ＡＣＵｔＪＵＡ −３’と ５’ −ＵＵＡＡＣＵＵ−３’ からなる分子を含む
。
本発明のＧ１０Ｌ、 １６８ ｍＲＮＡのホモＯジ
ー配列のヌクレオチドの長さは、この配列のＥ、 Ｃ
ｏ１１ １６８ ｍＲＮＡのヌクレオチド４５８から
４６６への配列の相補性は、ランダムな出来ごとではな
いということを強く示唆している。実際、Ｅ、 Ｃｏ
１１の２３８ ｒＲＮＡか１６Ｓ ｍＲＮＡ中の何
処か別の場所で塩基対を作ることが出来る伯の９ケのヌ
クレオチド配列は見出されなかった。その上、Ｇ１０Ｌ
１６ＳｒＲＮＡホＩロジ一配列は、Ｅ、 ＣＯ１＋
１６８ ｒＲＮＡまたは、２３８ ｒＲＮＡにおい
て、ヌクレオチド４５８から４６６とのみ相補的であり
、伯の９つのヌクレオチド配列とは相補性がなかった。
ー配列のヌクレオチドの長さは、この配列のＥ、 Ｃ
ｏ１１ １６８ ｍＲＮＡのヌクレオチド４５８から
４６６への配列の相補性は、ランダムな出来ごとではな
いということを強く示唆している。実際、Ｅ、 Ｃｏ
１１の２３８ ｒＲＮＡか１６Ｓ ｍＲＮＡ中の何
処か別の場所で塩基対を作ることが出来る伯の９ケのヌ
クレオチド配列は見出されなかった。その上、Ｇ１０Ｌ
１６ＳｒＲＮＡホＩロジ一配列は、Ｅ、 ＣＯ１＋
１６８ ｒＲＮＡまたは、２３８ ｒＲＮＡにおい
て、ヌクレオチド４５８から４６６とのみ相補的であり
、伯の９つのヌクレオチド配列とは相補性がなかった。
かくして１６Ｓ ｍＲＮＡとＧ１０Ｌ １６３
ｒＲＮＡホモロジー配列及びその断片間の相互作用部位
は、特異な相互作用部位となっている。
ｒＲＮＡホモロジー配列及びその断片間の相互作用部位
は、特異な相互作用部位となっている。
さらに、Ｇ１０Ｌ １６８ ｒＲＮＡホモロジー配
列の厳！な相補性と長さから、この配列を保持している
ｍＲＮＡ分子は、１６８ ｒＲＮＡの４６０位の廻り
の新規な領域と塩基対を作り、１６Ｓ ｍＲＮＡ及び
ｍＲＮＡ分子との間に安定な相互作用を形成することが
わかる。この相互作用は、ＳＤ−領域と類似のやり方で
、直接翻訳の開始を刺戟することにより、ｍＲＮＡがリ
ボゾームの限られたプールへの結合を求めて競うことが
できるようにし、その際該配列を含むｍＲＮＡの翻訳の
確率、モして／もしくは、照度を増すことによってｍＲ
ＮＡの翻訳の開始を助１プるものと信じられている。実
際、ここで以後の例においてちつと完全に記述されるよ
うに、望む遺伝子のＲ，Ｂ、Ｓ、内へＧ１０Ｌ １６
８ ｒＲＮＡホモロシー配列を挿入することにより、
そこにコードされているタンパクの生産の増強が結果と
して得られる。
列の厳！な相補性と長さから、この配列を保持している
ｍＲＮＡ分子は、１６８ ｒＲＮＡの４６０位の廻り
の新規な領域と塩基対を作り、１６Ｓ ｍＲＮＡ及び
ｍＲＮＡ分子との間に安定な相互作用を形成することが
わかる。この相互作用は、ＳＤ−領域と類似のやり方で
、直接翻訳の開始を刺戟することにより、ｍＲＮＡがリ
ボゾームの限られたプールへの結合を求めて競うことが
できるようにし、その際該配列を含むｍＲＮＡの翻訳の
確率、モして／もしくは、照度を増すことによってｍＲ
ＮＡの翻訳の開始を助１プるものと信じられている。実
際、ここで以後の例においてちつと完全に記述されるよ
うに、望む遺伝子のＲ，Ｂ、Ｓ、内へＧ１０Ｌ １６
８ ｒＲＮＡホモロシー配列を挿入することにより、
そこにコードされているタンパクの生産の増強が結果と
して得られる。
このようなバタデリオファージでコートタンパクの翻訳
が短時間に多量に行われる必殻がら正常な翻訳とは異な
るやり方でリボゾームを利用するｍＲＮＡ配列の進化へ
と導いたのかもしれない。
が短時間に多量に行われる必殻がら正常な翻訳とは異な
るやり方でリボゾームを利用するｍＲＮＡ配列の進化へ
と導いたのかもしれない。
ここで示されるように、この理論は、調査したＥ、
Ｃｏ１１ ｍＲＮへのわずか２．３と比較した場合、
似たような配列が、いくつがのバクテリオファージコー
トタンパクメツセンジｐ −ＲＮＡのなかに見出される
ことにより支持される。
Ｃｏ１１ ｍＲＮへのわずか２．３と比較した場合、
似たような配列が、いくつがのバクテリオファージコー
トタンパクメツセンジｐ −ＲＮＡのなかに見出される
ことにより支持される。
詳しくは、Ｇｒｃｎ、 Ｅ、 Ｊ、 （１９８４）と
Ｐａｒｋｃｒう＜１９８４）によって発表された配列と
、全０１０ Ｌ配列を持つ高度に発現するタンパクをコ
ードするｍＲＮＡの分子を比較したところ、いくつかの
ｍＲＮＡ分子において、Ｇ１０Ｌ １６ＳｒＲＮＡホ
モロシ一等価物の存在が明らかになった。このような口
＋ＲＮＡ分子とそれらのそれぞれの１６８ ｒＲＮＡ
に相補性を右する配列は、次のものを含むが、これらに
限定されるものではない。
Ｐａｒｋｃｒう＜１９８４）によって発表された配列と
、全０１０ Ｌ配列を持つ高度に発現するタンパクをコ
ードするｍＲＮＡの分子を比較したところ、いくつかの
ｍＲＮＡ分子において、Ｇ１０Ｌ １６ＳｒＲＮＡホ
モロシ一等価物の存在が明らかになった。このような口
＋ＲＮＡ分子とそれらのそれぞれの１６８ ｒＲＮＡ
に相補性を右する配列は、次のものを含むが、これらに
限定されるものではない。
ｍＲＮＡ １６３ ｒｌｔＮＡ相補性配
列Ｔ７ ｇｅｎｅ ０．５Ａ Ａ
ＣＵＵＵＡＣＴ７ ｇｅｎｅ Ｏ，５Ｂ
ＡＣＵＵＵＡＣＵＵＴ７ ｇｅｎｅ ２
ＡＡＣＵＵＵＧＴ７ ｇｅｎｅ ３
．８ ＣＵＵＵＧＵＵＣＴ７ ｇ
ｅｎｅ ９ ＡＡＣＵＵＩＩ
ＡＴ７ ｇｅｎｅ １７
＾ＣＵＵＵ八ｌａｍへｄａ Ｅ ｇｅｎｅ
ｔｌＵＵＵＡｃ ｏｒ
ＧＧＣ口旧ＩＱ−ｂｅｔａ ｇｅｎｅ ＣＡＡＣＵ
ＵＵＧＤｈｉ−Ｘ１７４ ｇｅｎｅ ｒ 八
ＣＵＵＵＧ４ ｇｅｎｅ Ｊ
ＡＣＵＵＵｒ、 ｃｏｌｉ １）Ｖｒ Ｂ
ＵＵＵＵＡＣＥ、 ｃｏｌｉ ｅｎｃ
Ｃ八ＡＣＵＵＵＡｃｌｏｄｆ１３ｉｖ＋＋
ＣＩＩＵＵＡ丁４ ｇｅｎｅ
２３ ＡＡＣＵＵ
Ｕ８３２／旧７ ｇｅｎｅ ＣｔｌＡ＾ＣＵＵＵＡ
ＣＵＥ、 ｃｏｌｉ ｔｎａ＾
八＾ＣＵＵＵＡＴ７ ｇｅｎｅ １１
ＧΔｃｕｕｕＡＥ、 ｃｏｌｉ
ｅｆｔ Ａ ＵＡ八へＬＩ
Ｕｔｌ前述のｍＲＮＡ分子中に見出されたＧ１０Ｌ１６
３ ｒＲＮＡホモロジー配列をとり囲ｌνでいる１６
３ ｒＲＮＡホモＵジー配列及びその同等配列は、式
５’ −ＺｍＸＵＵ （Ｂ）ｎ −３’ を含む。但
しここで、ＸＵＣ又は，ｍとｎは少くともいずれか１と
いう条件でＯか１、Ｚｉ、ｔＡ、Ｇ。
列Ｔ７ ｇｅｎｅ ０．５Ａ Ａ
ＣＵＵＵＡＣＴ７ ｇｅｎｅ Ｏ，５Ｂ
ＡＣＵＵＵＡＣＵＵＴ７ ｇｅｎｅ ２
ＡＡＣＵＵＵＧＴ７ ｇｅｎｅ ３
．８ ＣＵＵＵＧＵＵＣＴ７ ｇ
ｅｎｅ ９ ＡＡＣＵＵＩＩ
ＡＴ７ ｇｅｎｅ １７
＾ＣＵＵＵ八ｌａｍへｄａ Ｅ ｇｅｎｅ
ｔｌＵＵＵＡｃ ｏｒ
ＧＧＣ口旧ＩＱ−ｂｅｔａ ｇｅｎｅ ＣＡＡＣＵ
ＵＵＧＤｈｉ−Ｘ１７４ ｇｅｎｅ ｒ 八
ＣＵＵＵＧ４ ｇｅｎｅ Ｊ
ＡＣＵＵＵｒ、 ｃｏｌｉ １）Ｖｒ Ｂ
ＵＵＵＵＡＣＥ、 ｃｏｌｉ ｅｎｃ
Ｃ八ＡＣＵＵＵＡｃｌｏｄｆ１３ｉｖ＋＋
ＣＩＩＵＵＡ丁４ ｇｅｎｅ
２３ ＡＡＣＵＵ
Ｕ８３２／旧７ ｇｅｎｅ ＣｔｌＡ＾ＣＵＵＵＡ
ＣＵＥ、 ｃｏｌｉ ｔｎａ＾
八＾ＣＵＵＵＡＴ７ ｇｅｎｅ １１
ＧΔｃｕｕｕＡＥ、 ｃｏｌｉ
ｅｆｔ Ａ ＵＡ八へＬＩ
Ｕｔｌ前述のｍＲＮＡ分子中に見出されたＧ１０Ｌ１６
３ ｒＲＮＡホモロジー配列をとり囲ｌνでいる１６
３ ｒＲＮＡホモＵジー配列及びその同等配列は、式
５’ −ＺｍＸＵＵ （Ｂ）ｎ −３’ を含む。但
しここで、ＸＵＣ又は，ｍとｎは少くともいずれか１と
いう条件でＯか１、Ｚｉ、ｔＡ、Ｇ。
△Ａ、ＧＧ、ＧΔ、ＵＡｌＵＡＡ及びｔＪｔＪＡＡから
なるグループから選ばれ、Ｂは、ＬＪ、ＵＡ、ＵＧ、Ｕ
ＡＣｌＵＡＣＵ、ＵＡＣＵＵ及びＵ Ｇ Ｕ Ｕ Ｃか
らなるグループから選ばれる。より好ましい１６３
ｒＲＮＡホモロジー配列においテハ、Ｘ４！ｃ、ｍとｎ
は共に１、ＺはＡ、Ａ△、ＵＡｌｔＪＡＡとＵＵＡＡか
らなるグループから選ばれ、ＢはＵＡ、ＵＡｃ及びＵＡ
ＣｔＪからなるグループから選ばれる。もう１つのより
好ましい１６８ ｒＲＮＡホモロジー配列では、×は
Ｃであり、ｍは１でｎは０１そしてＺはＵ Ｕ△△であ
る。
なるグループから選ばれ、Ｂは、ＬＪ、ＵＡ、ＵＧ、Ｕ
ＡＣｌＵＡＣＵ、ＵＡＣＵＵ及びＵ Ｇ Ｕ Ｕ Ｃか
らなるグループから選ばれる。より好ましい１６３
ｒＲＮＡホモロジー配列においテハ、Ｘ４！ｃ、ｍとｎ
は共に１、ＺはＡ、Ａ△、ＵＡｌｔＪＡＡとＵＵＡＡか
らなるグループから選ばれ、ＢはＵＡ、ＵＡｃ及びＵＡ
ＣｔＪからなるグループから選ばれる。もう１つのより
好ましい１６８ ｒＲＮＡホモロジー配列では、×は
Ｃであり、ｍは１でｎは０１そしてＺはＵ Ｕ△△であ
る。
したがって、バクテリア中でタンパクの生産を増強し、
発明のＧ１０Ｌ配列、そして／またはＧ１０Ｌ １６
３ ｒＲＮＡホモロジー配列と等価であると考えられ
る他の配列は、常法の技術によって構築することができ
る。例えば、多くのｍＲＮＡ分子において１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ相補的配列または、その断片は科学的に合成でき
る。同様に、ＧＩ ＯＬ中におけるヌクレオチドの附加
、置換、浦去及び／または逆転は、修正したＧ１０Ｌ配
列でタンパク生産において、木質的に同等な増強が達成
されるように常法の化学的、酵素的そして組換えＤＮＡ
技術によって行うことができる。
発明のＧ１０Ｌ配列、そして／またはＧ１０Ｌ １６
３ ｒＲＮＡホモロジー配列と等価であると考えられ
る他の配列は、常法の技術によって構築することができ
る。例えば、多くのｍＲＮＡ分子において１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ相補的配列または、その断片は科学的に合成でき
る。同様に、ＧＩ ＯＬ中におけるヌクレオチドの附加
、置換、浦去及び／または逆転は、修正したＧ１０Ｌ配
列でタンパク生産において、木質的に同等な増強が達成
されるように常法の化学的、酵素的そして組換えＤＮＡ
技術によって行うことができる。
驚くぺぎことに、これらｍＲＮＡ中の１６ＳｒＲＮＡホ
モロジーの領域は、ＳＤ領領域ら５′末端側（上流）か
、あるいは翻訳開始コードにむかって３′末端側（下流
）に位置していることが見出された。これらの知見は、
ｍＲＮＡ中のこの新規１６３ ｒＲＮＡホモｔ］ジー
配列の正確な位置は重要ではないかもしれないことを示
唆している。事実、下の例に示されているように、Ｇ１
０Ｌ １６８ ｒＲＮ△ホモロジー配列そして／ま
たは、その断片はＳＤ−領域から上流（５’）、ＳＤ−
配列と翻訳開始（ＡＵＧ＞コドンの間のスペーサー領域
にそして／または翻訳開始コドンに対して３′側（下流
）に位置することができる。
モロジーの領域は、ＳＤ領領域ら５′末端側（上流）か
、あるいは翻訳開始コードにむかって３′末端側（下流
）に位置していることが見出された。これらの知見は、
ｍＲＮＡ中のこの新規１６３ ｒＲＮＡホモｔ］ジー
配列の正確な位置は重要ではないかもしれないことを示
唆している。事実、下の例に示されているように、Ｇ１
０Ｌ １６８ ｒＲＮ△ホモロジー配列そして／ま
たは、その断片はＳＤ−領域から上流（５’）、ＳＤ−
配列と翻訳開始（ＡＵＧ＞コドンの間のスペーサー領域
にそして／または翻訳開始コドンに対して３′側（下流
）に位置することができる。
その上、２つ以上の１６Ｓ ｒＲＮＡＲＮＡホモ一配
列、モして／またｔよ、その同簀物が単−ｒｒｌＮＡ分
子中に存在し１ｎる。本発明のより好ましい態様におい
て、それが開始コドンに対して３′に位置寸れば、１６
８ ｒＲＮＡホモロジー配列中のコドンが生産される
べきタンパクに含まれるアミノ酸を特定化するというこ
とが要求されるであろうからである。少くとも、１つの
Ｇ１０Ｌ １６Ｓ ｒＲＮΔホモ［１ジ一配列が翻
訳開始コドンに対して５′ （上流）側に位置している
。
列、モして／またｔよ、その同簀物が単−ｒｒｌＮＡ分
子中に存在し１ｎる。本発明のより好ましい態様におい
て、それが開始コドンに対して３′に位置寸れば、１６
８ ｒＲＮＡホモロジー配列中のコドンが生産される
べきタンパクに含まれるアミノ酸を特定化するというこ
とが要求されるであろうからである。少くとも、１つの
Ｇ１０Ｌ １６Ｓ ｒＲＮΔホモ［１ジ一配列が翻
訳開始コドンに対して５′ （上流）側に位置している
。
もう１つの態様において、本発明のＧ１０Ｌ配列内のＧ
１０Ｌ １６８ ｍＲＮＡホモロジー領域の同定に
より、１６３ ｒＲＮＡ上におけるｍＲＮＡ分子との
相互作用の１つの新しい部位（例えば配列もしくは領域
）が明らかになった。
１０Ｌ １６８ ｍＲＮＡホモロジー領域の同定に
より、１６３ ｒＲＮＡ上におけるｍＲＮＡ分子との
相互作用の１つの新しい部位（例えば配列もしくは領域
）が明らかになった。
Ｅ、 Ｃｏ１１ １６Ｓ ｒＲＮＡの仝メクレオチ
ド配列は、Ｂｒｏｓｉｕｓら（１９７８）によって公表
された。そして該配列は、ここに、本特許に参照として
つけ加えである。１６３ ｒＲＮＡにおける新規の相
互作用の領域は、第３図に示してあるように約ヌクレオ
チド４４７から約４８７までの約４０のヌクレオチドを
含み、このうち、より好ましい相互作用を持つ、ヌクレ
オチド約４５８から約４６６への領域を含んでいる。こ
の１６８ ｍＲＮＡ中の相互作用の新規領域は、ＳＤ
−領域と相ｎに作用している１６８ｒＲＮΔ配列から約
１０００塩基離れている。今や１６３ ｒＲＮＡとｍ
ＲＮＡ分子の間の相互作用の新しい領域を発見したので
、該新規１６ＳｒＲＮＡヌクレオチド領域内で、１６Ｓ
ｒＲＮＡと結合することができる（例えば、塩基対形成
）ｍＲＮＡ配列をデザインすることが可能である。以前
に述べたように、１６３ ｒＲＮＡホモロジーのクラ
スに入る該配列は、２種の異なる核酸分子の間に安定な
相互作用を達成することができる少くとも十分な数のヌ
クレオゲートの非−８Ｄ−領域を含むであろう。より好
ましい配列は、少くとも５ケ、そして恐らく１０より少
いヌクレオチドを含むであろう。
ド配列は、Ｂｒｏｓｉｕｓら（１９７８）によって公表
された。そして該配列は、ここに、本特許に参照として
つけ加えである。１６３ ｒＲＮＡにおける新規の相
互作用の領域は、第３図に示してあるように約ヌクレオ
チド４４７から約４８７までの約４０のヌクレオチドを
含み、このうち、より好ましい相互作用を持つ、ヌクレ
オチド約４５８から約４６６への領域を含んでいる。こ
の１６８ ｍＲＮＡ中の相互作用の新規領域は、ＳＤ
−領域と相ｎに作用している１６８ｒＲＮΔ配列から約
１０００塩基離れている。今や１６３ ｒＲＮＡとｍ
ＲＮＡ分子の間の相互作用の新しい領域を発見したので
、該新規１６ＳｒＲＮＡヌクレオチド領域内で、１６Ｓ
ｒＲＮＡと結合することができる（例えば、塩基対形成
）ｍＲＮＡ配列をデザインすることが可能である。以前
に述べたように、１６３ ｒＲＮＡホモロジーのクラ
スに入る該配列は、２種の異なる核酸分子の間に安定な
相互作用を達成することができる少くとも十分な数のヌ
クレオゲートの非−８Ｄ−領域を含むであろう。より好
ましい配列は、少くとも５ケ、そして恐らく１０より少
いヌクレオチドを含むであろう。
１６Ｓ ｍＲＮＡ中のヌクレオチド約４４７から４８
７の第３図に示されているヌクレオチド配列に基いて、
技術の中の技の１つにより、１６３ｒＲＮΔのこの領ｊ
或と１！基対を作ることが出来る゛縮小したｍ ＲＮ
Ａを構築することが出来る。
７の第３図に示されているヌクレオチド配列に基いて、
技術の中の技の１つにより、１６３ｒＲＮΔのこの領ｊ
或と１！基対を作ることが出来る゛縮小したｍ ＲＮ
Ａを構築することが出来る。
゛縮重した″という語は、プリンアデノシン（Ａ）は、
ＤＮＡ中のビリミヂン（Ｔ＞及びＩ＜ Ｎ Ａ中のウリ
ジンと優先的に塩基対を作る。同様に、プリンのグアニ
ジン（Ｇ）は、優先的にピリミヂンシチジン（Ｃ）と塩
基対を作るが、安定であるが、より不利な塩基対形成が
Ｇとビリミヂンロとの間でも起りつる。このような縮重
した配列あるいは、それらの断片を含むＤＮＡ配列（例
えば遺伝子）そしてｍ ＲＮ Ａ配列が優先０１０ｍ配
列の同等物を構成すると考えられる。このような縮退配
列または１６３ ｒＲＮＡのこの領域に相補的な配列
の好ましい長さは、約５から約１０のヌクレオチドであ
って、一番好ましい長さは、７から９ケのヌクレオチド
である。
ＤＮＡ中のビリミヂン（Ｔ＞及びＩ＜ Ｎ Ａ中のウリ
ジンと優先的に塩基対を作る。同様に、プリンのグアニ
ジン（Ｇ）は、優先的にピリミヂンシチジン（Ｃ）と塩
基対を作るが、安定であるが、より不利な塩基対形成が
Ｇとビリミヂンロとの間でも起りつる。このような縮重
した配列あるいは、それらの断片を含むＤＮＡ配列（例
えば遺伝子）そしてｍ ＲＮ Ａ配列が優先０１０ｍ配
列の同等物を構成すると考えられる。このような縮退配
列または１６３ ｒＲＮＡのこの領域に相補的な配列
の好ましい長さは、約５から約１０のヌクレオチドであ
って、一番好ましい長さは、７から９ケのヌクレオチド
である。
かくして、Ｅ、 Ｃｏ１１以外のバクテリアにおいて
、タンパクの生産を増強することが出来る等価核酸配り
１１を今や決定することが出来るということが理解され
る。詳しくは、上述の方法を用いることによって、これ
らの等価配列は、このような伯のバクテリアに感染する
ことができるバクテリアファージの高度に発現したタン
パクのｍＲＮＡ配列の解析により、モして／または、こ
れらのバクテリアにおいて高度に発現したタンパクのｍ
ＲＮ△配列の解析より、そして／または、これらのバ
クテリアファージｒｒ＋ＲＮＡと１３ ｒＪ対を作るこ
とができる。このような他のバクテリアの１６３ ｒ
ＲＮＡに相補的な配列を構築することによって決定する
ことができる。もう１つの方法として、旦エ Ｃｏ１１
以外のバクテリアの１６８ ｒＲＮＡの装置１１は、
従来の手段によって決定することができ、２つの区別で
きる核酸分子の間に安定な相互作用（すなわち塩基対）
を達成できる十分な数のヌクレオチドを含む配列をつく
ることが出来る。詳しく述べれば、Ｗｏｃｓｅら（１９
８３）は、Ｅ、 Ｃｏ１１ １６３ ｒＲＮＡの二
次構造に対するモデルを導いた。この二次構造の全体の
構築様式は、種々の生物（Ｇｕｔｅｌ ｌら、１９８５
）からのさまざまな１６Ｓ様Ｆ＜ Ｎ Ａ Ｓ中に、広
く保存されている。ひとたび、−次構造が決定されると
、この構築の規則により他の生物からの１６８一様ＲＮ
Ａ５についておおよその二次構造を予知することが可能
になる。
、タンパクの生産を増強することが出来る等価核酸配り
１１を今や決定することが出来るということが理解され
る。詳しくは、上述の方法を用いることによって、これ
らの等価配列は、このような伯のバクテリアに感染する
ことができるバクテリアファージの高度に発現したタン
パクのｍＲＮＡ配列の解析により、モして／または、こ
れらのバクテリアにおいて高度に発現したタンパクのｍ
ＲＮ△配列の解析より、そして／または、これらのバ
クテリアファージｒｒ＋ＲＮＡと１３ ｒＪ対を作るこ
とができる。このような他のバクテリアの１６３ ｒ
ＲＮＡに相補的な配列を構築することによって決定する
ことができる。もう１つの方法として、旦エ Ｃｏ１１
以外のバクテリアの１６８ ｒＲＮＡの装置１１は、
従来の手段によって決定することができ、２つの区別で
きる核酸分子の間に安定な相互作用（すなわち塩基対）
を達成できる十分な数のヌクレオチドを含む配列をつく
ることが出来る。詳しく述べれば、Ｗｏｃｓｅら（１９
８３）は、Ｅ、 Ｃｏ１１ １６３ ｒＲＮＡの二
次構造に対するモデルを導いた。この二次構造の全体の
構築様式は、種々の生物（Ｇｕｔｅｌ ｌら、１９８５
）からのさまざまな１６Ｓ様Ｆ＜ Ｎ Ａ Ｓ中に、広
く保存されている。ひとたび、−次構造が決定されると
、この構築の規則により他の生物からの１６８一様ＲＮ
Ａ５についておおよその二次構造を予知することが可能
になる。
Ｅ、 Ｃｏ１１ １６の１つの構造的領域（よ、本発明
で同定されたヌクレオチド４４７から４８７（Ｗｏｅｓ
ｅら、１９８３）付近の１領戚から成立っている。した
がって、別の生物における１６８一様ＲＮへの等価構造
領域の部分と安定な塩）ｊ対を作り、それゆえ、その生
物において遺伝子発現を増強することができるｍＲＮＡ
配列を工夫することができる。配列は、その生物体にお
いて遺伝子操作を行ったｍＲＮへの翻訳を増強するよう
な生物体のｍＲＮＡの中に組み込むことができる。この
ような生物体の例にはｐｒｏｔｅｕｓ種（例えば鷺組肛
ｕ） 、５ｅｒｒａｔｉａ種（例えばＩａｒＣ（！５Ｃ
（ｉｎｓ ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば−ｓｕｂユ
±ｌｉｓ ｂｒｅｖｉｓ。
で同定されたヌクレオチド４４７から４８７（Ｗｏｅｓ
ｅら、１９８３）付近の１領戚から成立っている。した
がって、別の生物における１６８一様ＲＮへの等価構造
領域の部分と安定な塩）ｊ対を作り、それゆえ、その生
物において遺伝子発現を増強することができるｍＲＮＡ
配列を工夫することができる。配列は、その生物体にお
いて遺伝子操作を行ったｍＲＮへの翻訳を増強するよう
な生物体のｍＲＮＡの中に組み込むことができる。この
ような生物体の例にはｐｒｏｔｅｕｓ種（例えば鷺組肛
ｕ） 、５ｅｒｒａｔｉａ種（例えばＩａｒＣ（！５Ｃ
（ｉｎｓ ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば−ｓｕｂユ
±ｌｉｓ ｂｒｅｖｉｓ。
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ＋＋ｕｓ、 ｔｈＵｒ＋
ｎ １ｅｎｓｉｓ ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 株
（ｅ、 ｇ、 ａｅｒｕ＋コし１ｎｏｓａ
−１−一一−ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ） 、肛刈〔旦
ｒ種（例えばｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ） 、但すＳ工１０
」一種（例えばｎ１ｄｕｌａｎｓ）またはｓｔｒｅｏｔ
ｏｍｙｃｅｓ種が含まれるが、このような相補配列は、
５から１０ケのヌクレオブトの長さを有し、好ましくは
７乃至９のヌクレオチドを有するであろう。
ｎ １ｅｎｓｉｓ ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 株
（ｅ、 ｇ、 ａｅｒｕ＋コし１ｎｏｓａ
−１−一一−ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ） 、肛刈〔旦
ｒ種（例えばｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ） 、但すＳ工１０
」一種（例えばｎ１ｄｕｌａｎｓ）またはｓｔｒｅｏｔ
ｏｍｙｃｅｓ種が含まれるが、このような相補配列は、
５から１０ケのヌクレオブトの長さを有し、好ましくは
７乃至９のヌクレオチドを有するであろう。
本発明の１態様においては、本質的に純粋なまたは合成
Ｇ１０Ｌ配列は、生産物（例えばペプチドもしくはタン
パク）の生産と結びついた、少くとも１つの異質遺伝子
を含むＤＮＡ分子（例えば発現ビークルもしくは染色体
ＤＮＡ）に遺伝子操作で結合させた。異質という用語は
、ここで用いられる場合は、自然ではバクテリＡファー
ジＴ７ゲノムと結びついていないか、または、それによ
ってコードされていない遺伝子、Ｄ Ｎ Ａ Ｆｉｉｌ
！ ｕｌ、そしてもしくは生産物を意味する。゛生産物
″という用語は発現された遺伝子によって直接コードさ
れるか、遺伝子中にコードされているタンパクに関連し
て、またはタンパクによるある作用の結果として生産さ
れるタンパクの両方を含む。これら純粋な配列をＤＮＡ
分子に結びつける操作は、例えばリガーゼによる手段を
はじめとして、生物学的に、そして／または酵素的に、
そしてまたは化学的方法によって達成できる。その結果
できた合成りＮＡ分子、または遺伝子において、望むペ
プチドもしくはタンパクの生産と結びついたＧ１０Ｌ配
列、ＤＮＡコード配列そして／または遺伝子成分は隣接
していることも隣接していないことらでき、Ｇ１０Ｌ配
列が翻訳、したがって遺伝子（単数）もしくは遺伝子（
複数）の発現の増強を行う能力によってのみ制限される
。
Ｇ１０Ｌ配列は、生産物（例えばペプチドもしくはタン
パク）の生産と結びついた、少くとも１つの異質遺伝子
を含むＤＮＡ分子（例えば発現ビークルもしくは染色体
ＤＮＡ）に遺伝子操作で結合させた。異質という用語は
、ここで用いられる場合は、自然ではバクテリＡファー
ジＴ７ゲノムと結びついていないか、または、それによ
ってコードされていない遺伝子、Ｄ Ｎ Ａ Ｆｉｉｌ
！ ｕｌ、そしてもしくは生産物を意味する。゛生産物
″という用語は発現された遺伝子によって直接コードさ
れるか、遺伝子中にコードされているタンパクに関連し
て、またはタンパクによるある作用の結果として生産さ
れるタンパクの両方を含む。これら純粋な配列をＤＮＡ
分子に結びつける操作は、例えばリガーゼによる手段を
はじめとして、生物学的に、そして／または酵素的に、
そしてまたは化学的方法によって達成できる。その結果
できた合成りＮＡ分子、または遺伝子において、望むペ
プチドもしくはタンパクの生産と結びついたＧ１０Ｌ配
列、ＤＮＡコード配列そして／または遺伝子成分は隣接
していることも隣接していないことらでき、Ｇ１０Ｌ配
列が翻訳、したがって遺伝子（単数）もしくは遺伝子（
複数）の発現の増強を行う能力によってのみ制限される
。
１つの態様においては、１００ケの塩基対のＧｌ ＯＬ
配列を転写プロモーターをコードするＤＮＡ配列と図４
に示してあるように、望む生産物をコードするＤＮＡ配
列の翻訳開始コドンに隣接した配列との間の遺伝子に挿
入した。もう１つの態様では、１６８ ｒＲＮＡホモ
ロジー領域を含むＧ１０し配列もＧ１０Ｌ １６Ｓ
ｒＲＮＡホモロジー配列の５′末端がＳＤ−配列の３
′末端と隣接し、１６３ ＲＮＡボモロジー配列の３
′末端が翻訳開始（ＡＵＧ）コドンにＦＡＩ接するよう
に挿入した。
配列を転写プロモーターをコードするＤＮＡ配列と図４
に示してあるように、望む生産物をコードするＤＮＡ配
列の翻訳開始コドンに隣接した配列との間の遺伝子に挿
入した。もう１つの態様では、１６８ ｒＲＮＡホモ
ロジー領域を含むＧ１０し配列もＧ１０Ｌ １６Ｓ
ｒＲＮＡホモロジー配列の５′末端がＳＤ−配列の３
′末端と隣接し、１６３ ＲＮＡボモロジー配列の３
′末端が翻訳開始（ＡＵＧ）コドンにＦＡＩ接するよう
に挿入した。
Ｇ１０Ｌ配列を含む遺伝子（単数または複数）を構築す
る場合、バクテリアにおいて、このにうな遺伝子（単数
または複数）の転写をひき起すことができるプロモータ
ーは、すべて用いることができると予想される。このよ
うなプロモーターの例はよく知られており、イの技術に
習熟した人々が利用できる状態があるが、β−ガラクト
シダーぜ、ｒｅｃＡ１トリプトファン、ｔａＣ１テトラ
サイクリン抵抗、ｌａｍｂｄａ Ｐ［プロモーター
（’ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｃｏｎｒｔ、
１９７９ ）のような、バクテリア、ウィルス、プラス
ミツド由来のプロモーターが含まれるが、これらに制限
されるものではない。より好ましいプロモーターには、
！−９ゴしのエ ｌａｍｂｄａ Ｐ［及びトリプトフ
ァンプロモーターがある。これらのプロモーターのＤＮ
Ａ配列は公表されており、これらのプロモーター配列を
含むＤＮＡ分子は、望む領域のクローニングを行うか、
またはもっと便利な方法としては、化学的に合成するこ
とにより、串間することができる。直接合成は、例えば
図４に示す５ａｌＩ及び１３ａｍＨＩ制限酵素切断部位
をＤＮＡの両端に挿入できる利点がある。
る場合、バクテリアにおいて、このにうな遺伝子（単数
または複数）の転写をひき起すことができるプロモータ
ーは、すべて用いることができると予想される。このよ
うなプロモーターの例はよく知られており、イの技術に
習熟した人々が利用できる状態があるが、β−ガラクト
シダーぜ、ｒｅｃＡ１トリプトファン、ｔａＣ１テトラ
サイクリン抵抗、ｌａｍｂｄａ Ｐ［プロモーター
（’ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｃｏｎｒｔ、
１９７９ ）のような、バクテリア、ウィルス、プラス
ミツド由来のプロモーターが含まれるが、これらに制限
されるものではない。より好ましいプロモーターには、
！−９ゴしのエ ｌａｍｂｄａ Ｐ［及びトリプトフ
ァンプロモーターがある。これらのプロモーターのＤＮ
Ａ配列は公表されており、これらのプロモーター配列を
含むＤＮＡ分子は、望む領域のクローニングを行うか、
またはもっと便利な方法としては、化学的に合成するこ
とにより、串間することができる。直接合成は、例えば
図４に示す５ａｌＩ及び１３ａｍＨＩ制限酵素切断部位
をＤＮＡの両端に挿入できる利点がある。
同様に、バクテリアの宿主細胞中の生産に結びつく異質
遺伝子もしくはＤＮＡ配列をすべて用いることができる
。このような遺伝子もしくはＤＮＡ配列は、化学的に合
成でき、または適当な遺伝子らしくはＤＮＡライブラリ
ーそして／または従来法により、酵素的に？４ｖ５．す
ることができる。
遺伝子もしくはＤＮＡ配列をすべて用いることができる
。このような遺伝子もしくはＤＮＡ配列は、化学的に合
成でき、または適当な遺伝子らしくはＤＮＡライブラリ
ーそして／または従来法により、酵素的に？４ｖ５．す
ることができる。
このような遺伝子中にコードされているかまたはコード
されているタンパク（１１数または複数）ににって影響
される異質産物は、典型的な場合は、役に立つペプチド
らしくはポリペプチドである。
されているタンパク（１１数または複数）ににって影響
される異質産物は、典型的な場合は、役に立つペプチド
らしくはポリペプチドである。
このＪ、うな産物は、原核及び真核細胞起源のベブチド
もしくはタンパクを含むことができる。下の例において
詳述されるように、Ｅ、 ｃｏｌｉのようなバクテリ
ア中で、本発明を用いて増強された吊、生産できる異質
産物は、動物生長因子、アトリオペプチゲン、融合タン
パク、有用な原核及び真核性酵素であるがこれらに限ら
れているものではない。本発明の方法に従って、バクテ
リア中に生産されるこれらの、及びその他の異質タンパ
クは、この技術に悲運した人々に知られている手段によ
って、バクテリアから回収し、そして／もしくはそれぞ
れの自然のコンフォメーションに再構成することができ
る。
もしくはタンパクを含むことができる。下の例において
詳述されるように、Ｅ、 ｃｏｌｉのようなバクテリ
ア中で、本発明を用いて増強された吊、生産できる異質
産物は、動物生長因子、アトリオペプチゲン、融合タン
パク、有用な原核及び真核性酵素であるがこれらに限ら
れているものではない。本発明の方法に従って、バクテ
リア中に生産されるこれらの、及びその他の異質タンパ
クは、この技術に悲運した人々に知られている手段によ
って、バクテリアから回収し、そして／もしくはそれぞ
れの自然のコンフォメーションに再構成することができ
る。
もう１つの重要なｇ様において、本発明のＧ１０Ｌ配＆
＋１は、転写終結配列を含む遺伝子に操作によって結び
つけることができる。該配列の操作的結合により、バク
テリア中のタンパク生産モして／または蓄積はざらに与
えられた遺伝子中にＧ １０ Ｌと転写終結配列の存在
することによって増強することができるという発見へと
導かれた。
＋１は、転写終結配列を含む遺伝子に操作によって結び
つけることができる。該配列の操作的結合により、バク
テリア中のタンパク生産モして／または蓄積はざらに与
えられた遺伝子中にＧ １０ Ｌと転写終結配列の存在
することによって増強することができるという発見へと
導かれた。
詳しくいうと、１つの遺伝子に対して１つのＧ １０
ｔ−配列を遺伝子操作で結合させるとＧ１０Ｌ配列を欠
き、その他の点では同一の遺伝子とくらべてタンパク生
産において３００倍も増加した。Ｇ１０Ｌ配列を含む遺
伝子に転写終結配列を添加するか、遺伝子操作で結合さ
せると、タンパク生産がさらに２倍から４倍増加した。
ｔ−配列を遺伝子操作で結合させるとＧ１０Ｌ配列を欠
き、その他の点では同一の遺伝子とくらべてタンパク生
産において３００倍も増加した。Ｇ１０Ｌ配列を含む遺
伝子に転写終結配列を添加するか、遺伝子操作で結合さ
せると、タンパク生産がさらに２倍から４倍増加した。
現在の発明において、有用な転写終結配列は、バタテリ
オファージ及びバクテリアＤＮＡ（１１０１１＋１Ｓら
１９８３をみよ、、）中に見出されるものを含むが、そ
れらだけに限られない。より好ましい転写終結配列には
、Ｔ４ｑｅｎｅ２３ターミネータ−ＣＰａｒｋｅｒら、
１９８４）、ａＰ２２ｇ ｅ ｎ ｅ ａ ｎ ｔタ
ーミネータ−（ＢＯｒｌＪＯｔら、１９８３）、Ｃｏ１
Ｅ１ターミネータ−（Ｏｌｉｎｓら、１９８１）及びバ
クテリオファージＴ７１０ｆｆｌ伝子ターミネータ−（
Ｄｕｎｎと５ｔｕｄｉｅｒ 、 １９８３ ）に由来す
る下の例においてもつと完全に記述されている合成的終
結配列が含まれる。
オファージ及びバクテリアＤＮＡ（１１０１１＋１Ｓら
１９８３をみよ、、）中に見出されるものを含むが、そ
れらだけに限られない。より好ましい転写終結配列には
、Ｔ４ｑｅｎｅ２３ターミネータ−ＣＰａｒｋｅｒら、
１９８４）、ａＰ２２ｇ ｅ ｎ ｅ ａ ｎ ｔタ
ーミネータ−（ＢＯｒｌＪＯｔら、１９８３）、Ｃｏ１
Ｅ１ターミネータ−（Ｏｌｉｎｓら、１９８１）及びバ
クテリオファージＴ７１０ｆｆｌ伝子ターミネータ−（
Ｄｕｎｎと５ｔｕｄｉｅｒ 、 １９８３ ）に由来す
る下の例においてもつと完全に記述されている合成的終
結配列が含まれる。
転写ターミネータ−を用いる場合、バクテリア中で望む
タンパクの生産の増強に影響することが見出された因子
は、遺伝子中の転写ターミネータ−の装置、用いられる
ターミネータ−配列の数、そしてコード配列の３′末端
と転写ターミネータ−配列の５′末端との間に空間をと
るヌクレオチドの数を含む。これらの要因は用いられる
ＤＮＡコード配列によって変化し得るけれども、より好
ましい方向は、ＤＮＡコード配列の下流の最初のターミ
ネータ−がＤＮＡコード配列のものど同じ方向にあるも
のである。ターミネータ−のより好ましい数は２である
。
タンパクの生産の増強に影響することが見出された因子
は、遺伝子中の転写ターミネータ−の装置、用いられる
ターミネータ−配列の数、そしてコード配列の３′末端
と転写ターミネータ−配列の５′末端との間に空間をと
るヌクレオチドの数を含む。これらの要因は用いられる
ＤＮＡコード配列によって変化し得るけれども、より好
ましい方向は、ＤＮＡコード配列の下流の最初のターミ
ネータ−がＤＮＡコード配列のものど同じ方向にあるも
のである。ターミネータ−のより好ましい数は２である
。
本発明の１つの態様において、バクテリオファージエフ
遺伝子］Ｏにス・１するコード配列の上流に隣接Ｊる１
００ケの塩基対（６Ｐ）に相当するＤＮＡ断片が、バク
テリオファージエフゲノムのｏｕｎｎと５ｊｕｄｉｅｒ
（１９８３）によって発表された配列に阜いて化学
合成によって構築された。詳しくは、図１に示された該
Ｇ１０Ｌ配列は、天然に存在するＧ１０Ｌ配列に相当す
るよう次のような修正によって構築された。Ｂ Ｑ Ｉ
ＩＩ及びＡｐａＩυ１限エンドヌクレアーゼ切断部位
をＧ１０ＬＦｉｉｌ！シ１の５′末端に挿入し、Ｎｃｏ
Ｉ制限酵素切断部位をＧ１０し配列の３′末端に挿入し
た。これらの制限エンドヌクレアーゼの挿入の結果、図
１において下線によって示されたヌクレオチド置換を生
じた。Ｇ１０Ｌ配ダ１の両末端にお【プるこれら２つの
制限酵素部位の挿入は、あとでＧｌｏＬｆＩｒｉ片を或
存の発現ベクターもしくはビークルに挿入することを容
易にした。
遺伝子］Ｏにス・１するコード配列の上流に隣接Ｊる１
００ケの塩基対（６Ｐ）に相当するＤＮＡ断片が、バク
テリオファージエフゲノムのｏｕｎｎと５ｊｕｄｉｅｒ
（１９８３）によって発表された配列に阜いて化学
合成によって構築された。詳しくは、図１に示された該
Ｇ１０Ｌ配列は、天然に存在するＧ１０Ｌ配列に相当す
るよう次のような修正によって構築された。Ｂ Ｑ Ｉ
ＩＩ及びＡｐａＩυ１限エンドヌクレアーゼ切断部位
をＧ１０ＬＦｉｉｌ！シ１の５′末端に挿入し、Ｎｃｏ
Ｉ制限酵素切断部位をＧ１０し配列の３′末端に挿入し
た。これらの制限エンドヌクレアーゼの挿入の結果、図
１において下線によって示されたヌクレオチド置換を生
じた。Ｇ１０Ｌ配ダ１の両末端にお【プるこれら２つの
制限酵素部位の挿入は、あとでＧｌｏＬｆＩｒｉ片を或
存の発現ベクターもしくはビークルに挿入することを容
易にした。
かくして、ＢＱＩＴＩとＮＣ０Ｉ制限酵素切断部位は、
本発明のより好ましい発現ベクターの中に０１０Ｌ配列
を挿入する目的のためのより好ましい制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位となっているが、伯の従来のυ１限エン
ドヌクレアーゼｌ、ＩＩ断部位す代りに用いてもよい。
本発明のより好ましい発現ベクターの中に０１０Ｌ配列
を挿入する目的のためのより好ましい制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位となっているが、伯の従来のυ１限エン
ドヌクレアーゼｌ、ＩＩ断部位す代りに用いてもよい。
例えば、バクテフリオファージＴ７ゲノムからＮｄｅＩ
とＸｂａＩで切断ηることにより、自然のヌクレオチド
配列に何等ヌクレオチド置換を起すことなく、 Ｅ、 Ｃｏ１１でタンパク生産を増強できる５０塩基
対のＧ１０Ｌ配列を１りることができる。このにうにし
て得られた５０塩基対のＧ １０ Ｌ配列は、後でＤＮ
Ａゲノムの中に従来法で挿入することができる。その上
、ＩＢＭ分子を例えば手に入るどんなりローニングした
ＤＮＡ、または発現ビークル、また染色体ＤＮＡへの挿
入または結合させるために、この分野の技術をもった人
々にとって、知られている伯の方法も代りに用いること
ができる。
とＸｂａＩで切断ηることにより、自然のヌクレオチド
配列に何等ヌクレオチド置換を起すことなく、 Ｅ、 Ｃｏ１１でタンパク生産を増強できる５０塩基
対のＧ１０Ｌ配列を１りることができる。このにうにし
て得られた５０塩基対のＧ １０ Ｌ配列は、後でＤＮ
Ａゲノムの中に従来法で挿入することができる。その上
、ＩＢＭ分子を例えば手に入るどんなりローニングした
ＤＮＡ、または発現ビークル、また染色体ＤＮＡへの挿
入または結合させるために、この分野の技術をもった人
々にとって、知られている伯の方法も代りに用いること
ができる。
このような他の方法には、異質遺伝子＜Ｈａｎｉａｔｉ
Ｓら、１９Ｂ２）を含んだ本発明のＧｌｏＬｌ列を含む
核酸断片のプラント末９ａ１結反応または核酸断片の化
学合成があるが、それらに限られるものではない。
Ｓら、１９Ｂ２）を含んだ本発明のＧｌｏＬｌ列を含む
核酸断片のプラント末９ａ１結反応または核酸断片の化
学合成があるが、それらに限られるものではない。
１つの態様において、図１または２に示されているＧ１
０Ｌ配列を含むＤＮＡ分子をプロモークーと異質タンパ
クをコードしているＤＮＡ配列を含む発現ベクターに挿
入した。発現ベクターまたはビークルは、ここではＬＬ
ｌユのようなバクテリアの宿主細胞を形質変換し、該
宿主細胞中の望ましい遺伝子の発現を起すことができる
ファージ、プラスミド、もしくはコスミドのようなりＮ
Ａ分子を含むものと理解される。この技術に熟達した人
々にとって知られており、そしてまたは利用できるファ
ージ・プラスミドもしくはコスミドベクターなど、発現
ベクターは、１１べて用いることができる。より好まし
いベクターは、ＤＢＲ３２７，５ｏｂｅｒｏｎら（１９
８０）のようなｐＢＲプラスミドを含んでいる。第４図
は、本発明の０１０Ｌ配列を含んでいるより好ましいプ
ラスミド発現ベクターの一般例を図解している。
０Ｌ配列を含むＤＮＡ分子をプロモークーと異質タンパ
クをコードしているＤＮＡ配列を含む発現ベクターに挿
入した。発現ベクターまたはビークルは、ここではＬＬ
ｌユのようなバクテリアの宿主細胞を形質変換し、該
宿主細胞中の望ましい遺伝子の発現を起すことができる
ファージ、プラスミド、もしくはコスミドのようなりＮ
Ａ分子を含むものと理解される。この技術に熟達した人
々にとって知られており、そしてまたは利用できるファ
ージ・プラスミドもしくはコスミドベクターなど、発現
ベクターは、１１べて用いることができる。より好まし
いベクターは、ＤＢＲ３２７，５ｏｂｅｒｏｎら（１９
８０）のようなｐＢＲプラスミドを含んでいる。第４図
は、本発明の０１０Ｌ配列を含んでいるより好ましいプ
ラスミド発現ベクターの一般例を図解している。
ｐＢＲ３２７由来の最新の例では、このようなプラスミ
ド発現ベクターは、複製の起点（Ｑｒｉ）、プラスミド
及び様々な独特の制限エンドヌクレアーゼ切断位置をに
なっているバクテリア細胞の選択を出来るようにする薬
剤耐性マーカー（ａｍｐ ）を含んでおり、リボゾー
ム結合部位（すなわち１つの０１０し配列）及び興味の
あるタンパクもしくはペプチドのための［）ＮＡ：１−
ド領域を、プラスミドの中に挿入出来るにうにしている
。
ド発現ベクターは、複製の起点（Ｑｒｉ）、プラスミド
及び様々な独特の制限エンドヌクレアーゼ切断位置をに
なっているバクテリア細胞の選択を出来るようにする薬
剤耐性マーカー（ａｍｐ ）を含んでおり、リボゾー
ム結合部位（すなわち１つの０１０し配列）及び興味の
あるタンパクもしくはペプチドのための［）ＮＡ：１−
ド領域を、プラスミドの中に挿入出来るにうにしている
。
第４図に示してあるより好ましい発現ベクターにおいて
は、５ａｌＩの制限切断部位からＥＣｏＲｌの切断部位
（時計の針の方向）までのプラスミドＤＮＡは、ｐＢＲ
３２７に由来しており、Ｑｒｉとβ−ラクタマーゼ遺伝
子（ａｒｒｌ ）を侍っている。ａｍｐ’耐性遺伝子
は、アンピシリン含有培地にお４Ｊる形質転換した細胞
の生長によって選択ができるようにする。５ａｌＩυ１
限部位からＢａｍＨＩ （時計の針と反対方向）は、バ
クテリア中の転写のためのプロモークーとして作用する
Ｄ Ｎ Ａの断片を含んでいる。独特のＢＱ Ｉ Ｉ部
位からＮｃｏＩ部位（時計の針と反対方向）は、１つの
りボゾーム結合部位（即ちＧ１０し配列）を含んでいる
。そして、異質ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は
独特のＮｃｏＩ部位で始まり、ＥｃｏＲＩ部位（時訓の
釘と反対方向）の上流で終っている。Ｎ ＣＯＩ ｉ１
１限部位は、典型的には遺伝子に対する翻訳開始コドン
（例えばＡＴＧ）と重なり合っている。
は、５ａｌＩの制限切断部位からＥＣｏＲｌの切断部位
（時計の針の方向）までのプラスミドＤＮＡは、ｐＢＲ
３２７に由来しており、Ｑｒｉとβ−ラクタマーゼ遺伝
子（ａｒｒｌ ）を侍っている。ａｍｐ’耐性遺伝子
は、アンピシリン含有培地にお４Ｊる形質転換した細胞
の生長によって選択ができるようにする。５ａｌＩυ１
限部位からＢａｍＨＩ （時計の針と反対方向）は、バ
クテリア中の転写のためのプロモークーとして作用する
Ｄ Ｎ Ａの断片を含んでいる。独特のＢＱ Ｉ Ｉ部
位からＮｃｏＩ部位（時計の針と反対方向）は、１つの
りボゾーム結合部位（即ちＧ１０し配列）を含んでいる
。そして、異質ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は
独特のＮｃｏＩ部位で始まり、ＥｃｏＲＩ部位（時訓の
釘と反対方向）の上流で終っている。Ｎ ＣＯＩ ｉ１
１限部位は、典型的には遺伝子に対する翻訳開始コドン
（例えばＡＴＧ）と重なり合っている。
ひとたびこのようなベクターが構築されると、本質的な
成分は、従来法により代りの成分と容易に交換できる。
成分は、従来法により代りの成分と容易に交換できる。
例えば、プロモーター、Ｒ，Ｂ、Ｓ、（例えば、Ｇ１０
Ｌ配列もしくｔよＳＤ−領域）及びコード配列に隣り合
わせになっている示した制限酵素部位を用いることによ
って、附加的な、そして／または、代りのＤＮＡ配列を
酵素的または化学的結合によって挿入することかできる
。実際、他の抗生物質耐性遺伝子がアンピシリン耐性遺
伝子の代りに、（第４図中にａｍｐ を示してある）
形質転換マーカーとして置換できる。以前に述べた、そ
して／または、技術に熟達した人々にとって利用できる
プロモーター（単数または複数）は、以前に単列された
、または、化学的に合成されたＤＮＡコード配列、すべ
てと同様に挿入することができる。このように挿入され
たＤＮＡコード配列は、単一異質ポリペプチドもしくは
その断片ポリプロティンまたは融合タンパクをコードで
きる。
Ｌ配列もしくｔよＳＤ−領域）及びコード配列に隣り合
わせになっている示した制限酵素部位を用いることによ
って、附加的な、そして／または、代りのＤＮＡ配列を
酵素的または化学的結合によって挿入することかできる
。実際、他の抗生物質耐性遺伝子がアンピシリン耐性遺
伝子の代りに、（第４図中にａｍｐ を示してある）
形質転換マーカーとして置換できる。以前に述べた、そ
して／または、技術に熟達した人々にとって利用できる
プロモーター（単数または複数）は、以前に単列された
、または、化学的に合成されたＤＮＡコード配列、すべ
てと同様に挿入することができる。このように挿入され
たＤＮＡコード配列は、単一異質ポリペプチドもしくは
その断片ポリプロティンまたは融合タンパクをコードで
きる。
別法として、以前に示したように、バクテリアにおける
増強生産は、従来法によりＧ １０ ｔ−配列を、単独
また１、ｉ異質ポリペプチドの増強生産を達成するｔこ
めの異質遺伝子とｇ１用して、バクテリアの染色体に挿
入することによって達成できる。
増強生産は、従来法によりＧ １０ ｔ−配列を、単独
また１、ｉ異質ポリペプチドの増強生産を達成するｔこ
めの異質遺伝子とｇ１用して、バクテリアの染色体に挿
入することによって達成できる。
１つの態様において、Ｇ１０Ｌ配列を含む発現ベクター
がＥ、 Ｃｏ１１のようなバクテリアの宿主細胞を形質
転換するために用いられた。゛形質転換する″及び”形
質転換″なる用語は、ここでは、宿主の細胞のゲノムの
中に、外来のＤＮＡを導入する方法、すべてを含むもの
と理解される。
がＥ、 Ｃｏ１１のようなバクテリアの宿主細胞を形質
転換するために用いられた。゛形質転換する″及び”形
質転換″なる用語は、ここでは、宿主の細胞のゲノムの
中に、外来のＤＮＡを導入する方法、すべてを含むもの
と理解される。
このような方法は、形質転換、形質導入、トランスフェ
クション、染色体ＤＮＡへの組み込みを含むが、これら
に限られるものではない。
クション、染色体ＤＮＡへの組み込みを含むが、これら
に限られるものではない。
形質転換された宿主細胞を選び、（ＨａｎｉａｔｉＳら
、１９８２）そして異質タンパクの発現を起す条件下で
培養した。このようにして生産された異質タンパクは、
それから、その技術に熟達した人々に知られている技術
によって精製され、そして／もしくは、生産されるタン
パクに適した方法（例えば、ウェスターンプロット、ラ
ヂオインミュノアツセイ、タンパクゲルの染色、そして
／または、酵素活性〉で生産のために測定することがで
きる。
、１９８２）そして異質タンパクの発現を起す条件下で
培養した。このようにして生産された異質タンパクは、
それから、その技術に熟達した人々に知られている技術
によって精製され、そして／もしくは、生産されるタン
パクに適した方法（例えば、ウェスターンプロット、ラ
ヂオインミュノアツセイ、タンパクゲルの染色、そして
／または、酵素活性〉で生産のために測定することがで
きる。
このような精製及び／またはタンパク測定の方法論は、
タンパク生産のレベルをだしかめるためにも用いること
が出来る。
タンパク生産のレベルをだしかめるためにも用いること
が出来る。
１つの態様においては、本発明のＧ１０Ｌ配列を用いる
ことによって達成されるタンパク生産増強、そして／ま
たは蓄積の足囲が、Ｇ１０Ｌ配列が不在であるが、その
他の点では同等の発現システムを用いて生産されるタン
パクの量と比較して行われた。詳しくは、Ｇ１０Ｌ配列
か、または、対照ＳＤ−領域を含んだプラスミド発現ベ
クターを構築した。用いられた対照ＳＤ−領域は次の配
列を含んでいた。
ことによって達成されるタンパク生産増強、そして／ま
たは蓄積の足囲が、Ｇ１０Ｌ配列が不在であるが、その
他の点では同等の発現システムを用いて生産されるタン
パクの量と比較して行われた。詳しくは、Ｇ１０Ｌ配列
か、または、対照ＳＤ−領域を含んだプラスミド発現ベ
クターを構築した。用いられた対照ＳＤ−領域は次の配
列を含んでいた。
ＢｇＩＩＩ ｔ↑甘せｔ ＮＣ０Ｉ５°−ＡＧ＾丁
ＣｒＣｄＴＧＴＡＡＧＧＡＧＴＣＴ八ＧへＣＣ八ＴへＧ
−３゜ＴＣＴＡＧ八ＣＡＡへ八ＴＩＣへＴＣＡＧＡＴＣ
ＩＧＧＴ八Ｃにへで（廿ｔ）は、ＳＤ−配列を示し、全
体の配列は、いくつかの、以前に公表されたＳＤ−配列
（５ｃｈｅｒｅｒら、１９８０）に由来する合成配列を
表している。下の例においてみられるように、本発明の
Ｇ１０Ｌ配列が用いられ、対照、ＳＤ−配列（寸なわら
、Ｇ１０Ｌ配列を含まない）を含むその他の点では、同
等の発現システムと比較した場合、広くさまざまなタン
パク（例えば、哺乳類、植物、バクテリアの）に対する
タンパク生産の有意な増強が達成された。有意な増強と
いう用語は、少くともタンパク蓄ｆｆ１ｆｆｉが１．６
椙であることをいう。事実、Ｇ１０Ｌ配列が用いられ、
Ｇ１０Ｌを欠いている発現系と比較すると、３００倍以
上のタンパクの増加が生長ホルモンやイソペンテニルト
ランスフ１ラーげについて認められた。より好ましいＧ
１０し配列は、図１に示す配列である。
ＣｒＣｄＴＧＴＡＡＧＧＡＧＴＣＴ八ＧへＣＣ八ＴへＧ
−３゜ＴＣＴＡＧ八ＣＡＡへ八ＴＩＣへＴＣＡＧＡＴＣ
ＩＧＧＴ八Ｃにへで（廿ｔ）は、ＳＤ−配列を示し、全
体の配列は、いくつかの、以前に公表されたＳＤ−配列
（５ｃｈｅｒｅｒら、１９８０）に由来する合成配列を
表している。下の例においてみられるように、本発明の
Ｇ１０Ｌ配列が用いられ、対照、ＳＤ−配列（寸なわら
、Ｇ１０Ｌ配列を含まない）を含むその他の点では、同
等の発現システムと比較した場合、広くさまざまなタン
パク（例えば、哺乳類、植物、バクテリアの）に対する
タンパク生産の有意な増強が達成された。有意な増強と
いう用語は、少くともタンパク蓄ｆｆ１ｆｆｉが１．６
椙であることをいう。事実、Ｇ１０Ｌ配列が用いられ、
Ｇ１０Ｌを欠いている発現系と比較すると、３００倍以
上のタンパクの増加が生長ホルモンやイソペンテニルト
ランスフ１ラーげについて認められた。より好ましいＧ
１０し配列は、図１に示す配列である。
その上、下の例でもつと完全に示されるように、この有
意な増強は用いられたプロモーターに関係なく達成され
た。したがって、本発明のＧ１０Ｌ配列は、原核及び真
核細胞由来の異質ポリペプチドについて、タンパク生産
増強を達成するために選択された発現系のすべてに用い
ることが出来る。
意な増強は用いられたプロモーターに関係なく達成され
た。したがって、本発明のＧ１０Ｌ配列は、原核及び真
核細胞由来の異質ポリペプチドについて、タンパク生産
増強を達成するために選択された発現系のすべてに用い
ることが出来る。
より好ましいバクテリアは、１０二ｏｌｉ−である。
微生物とプラスミド
以下の微生物が＾ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ａ Ｔ ＣＣ） 、
１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ。
ｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ａ Ｔ ＣＣ） 、
１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ。
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｃ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ、 ２０８５
２． ｔｌ、ｓ、Ａ、に寄託された。
２． ｔｌ、ｓ、Ａ、に寄託された。
ＡｒＣＣ３９９３６−Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｗ３１１０八
ｒｃｃ ！１３４６９ − Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ ８Ｇ４０５八Ｉｃｃ ６７０４３ −
Ｅユ ９コｒｌｉ Ｈ！１２１９（ＤＨＯＮ５５１
０）八ＴＣＣ６７０４４−Ｅユ ９コニ＋ｌｉ Ｊ
Ｈｌｏｌ（ＤＨＯＮ６００２）八ＴＣＣ５３０２３−Ｅ
エ リロ」 賢３１１０（ＤＨＯＮ３２１３）これら
の寄託は、米国特許の認可により公共が利用できるが、
この特許出願の出願日の利点を持っている米国特許の有
効期間が続く限り利用出来るであろう。しかし、寄託が
利用できる状態にあるということは、政府の措置によっ
て認められた特許の権利を無視して、よ題の発明を実行
する許可を意味しているわけではないということを理解
するべきである。その上、本発明ｔよ、寄託した微生物
によってその範囲が限定されるべきものではなく、発明
の詳細な説明としてのみ意図されているものである。
ｒｃｃ ！１３４６９ − Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ ８Ｇ４０５八Ｉｃｃ ６７０４３ −
Ｅユ ９コｒｌｉ Ｈ！１２１９（ＤＨＯＮ５５１
０）八ＴＣＣ６７０４４−Ｅユ ９コニ＋ｌｉ Ｊ
Ｈｌｏｌ（ＤＨＯＮ６００２）八ＴＣＣ５３０２３−Ｅ
エ リロ」 賢３１１０（ＤＨＯＮ３２１３）これら
の寄託は、米国特許の認可により公共が利用できるが、
この特許出願の出願日の利点を持っている米国特許の有
効期間が続く限り利用出来るであろう。しかし、寄託が
利用できる状態にあるということは、政府の措置によっ
て認められた特許の権利を無視して、よ題の発明を実行
する許可を意味しているわけではないということを理解
するべきである。その上、本発明ｔよ、寄託した微生物
によってその範囲が限定されるべきものではなく、発明
の詳細な説明としてのみ意図されているものである。
及路１
材料と方法
オリゴヌクレオチドは、すべて、製造業者、八ｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｃｌ、 Ｉｎｃ、 Ｆｏｓ
ｔｅｒ Ｃ１ｔｙ。
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｃｌ、 Ｉｎｃ、 Ｆｏｓ
ｔｅｒ Ｃ１ｔｙ。
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａによって明らかにされている手順
にしたがってＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
Ｄ ＮＡシンセサイザーを用いて合成された。特に断わ
りのない場合には、スペシャルティーケミカル Ｓｉｇｍａ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｈｉｓｓｏｕ
ｒｉ ）から入手した。
にしたがってＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
Ｄ ＮＡシンセサイザーを用いて合成された。特に断わ
りのない場合には、スペシャルティーケミカル Ｓｉｇｍａ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｈｉｓｓｏｕ
ｒｉ ）から入手した。
制限酵素とＤＮＡｒｉ篩酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎａｌａｎ
ｄＢｉｏｌａｂｓ （Ｂｅｖｅｒｌｙ Ｍａｓｓａｃ
ｈｕｓｅｔｔｓ ）とＢｅｔｈｅｓｄａｌｔｅｓｃａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ Ｂ Ｒ Ｌ ）
（Ｇｏｒｉｔｈｃｒｓｂｕｒｇ， Ｍａｒｙｌａｎｄ
）から購入し、製造業者の仕様害に従って用いた。Ｔ４
［）ＮＡリガーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ（
Ｈａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ）から買い、
製造業者の使用に従って用いた。３２Ｐーラベルヌクレ
オチドは、＾ｍｃｒｓｈａｍから買った。
ｄＢｉｏｌａｂｓ （Ｂｅｖｅｒｌｙ Ｍａｓｓａｃ
ｈｕｓｅｔｔｓ ）とＢｅｔｈｅｓｄａｌｔｅｓｃａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ Ｂ Ｒ Ｌ ）
（Ｇｏｒｉｔｈｃｒｓｂｕｒｇ， Ｍａｒｙｌａｎｄ
）から購入し、製造業者の仕様害に従って用いた。Ｔ４
［）ＮＡリガーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ（
Ｈａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ）から買い、
製造業者の使用に従って用いた。３２Ｐーラベルヌクレ
オチドは、＾ｍｃｒｓｈａｍから買った。
（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ ｌｌｃｉｇｈｔｓ， Ｉｌｌｔ
ｎｏｉｓ ）、Ｅ． Ｃｏｌｉ ＪＭｌｏｌは、Ｏ
ｒ． Ｊ． Ｈａｓｉｎｇ。
ｎｏｉｓ ）、Ｅ． Ｃｏｌｉ ＪＭｌｏｌは、Ｏ
ｒ． Ｊ． Ｈａｓｉｎｇ。
ｔｌｎｉＶｅｒｓｉｔＶ ｏｆ ＨｉｎｅＳＯｔａ
（Ｓｔ． Ｐａｕｌ。
（Ｓｔ． Ｐａｕｌ。
Ｈｉｎｎｅｓｏｔａ ）から入手した。そしてＡＴＣＣ
寄託番号３９８７６の下にＡＴＣＣから得られるかもし
れない。Ｅ． Ｃｏｌｔ Ｗ３１１０は、ＡＴＣＣＷ
託番号３９９３６の下にＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
， Ｍａｒｙ−ｌａｎｄ）から（ｑることができる。
寄託番号３９８７６の下にＡＴＣＣから得られるかもし
れない。Ｅ． Ｃｏｌｔ Ｗ３１１０は、ＡＴＣＣＷ
託番号３９９３６の下にＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
， Ｍａｒｙ−ｌａｎｄ）から（ｑることができる。
Ｅ． Ｃｏｌｉ Ｎ６４０５は、Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｌｅａｌｔｈ （Ｂｅｔ
ｈｅｄａ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ）のＯｒ． Ｈ． Ｇ
Ｏｔｔｅｌａｎから入手した。そして、ＡＴＣＣからＡ
ＴＣＣ寄託番号５３４６９の下に、ＡＴＣＣから得るこ
とができる。Ｅ． Ｃｏｌｉ菌株ＢＷ３ １ ３は、
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｌｅａｌｔｈ （Ｂｅｔ
ｈｅｄａ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ）のＯｒ． Ｈ． Ｇ
Ｏｔｔｅｌａｎから入手した。そして、ＡＴＣＣからＡ
ＴＣＣ寄託番号５３４６９の下に、ＡＴＣＣから得るこ
とができる。Ｅ． Ｃｏｌｉ菌株ＢＷ３ １ ３は、
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｒ ［ｎｖ
ｉｒｏｎｇｅｎｔａｌ ｌｌｅａｌｔｈＳｃｉｅｎｃｅ
ｓ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ， Ｐａｒ
ｋ， ＮｏｒｔｈＣａｒｏｌｉｎａ， ２７７０９のＯ
ｒ． Ｔｈｏｍａｓ Ｋｕｎｋｅｌがら入手できる。Ｖ
ｅｃｔｏｒ ｐ．Ｂ Ｒ ３ ２ ７及びＭ １ ３
ｍ ｐ ９は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ （ Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ， Ｈｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から入手でき
る。プラスミドＯ Ｕ Ｃ １ ８ Ｙａｎｉｓｃｈ−
ＰｅｒｒＯｎら、１９８５によって記述されたプラスミ
ドｐＬＪＣ１８ファルマシア（ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ
， ＮｅｗＪｅｒＳ（！’Ｖ ）からも入手できるかも
しれない。ＶｅｃｔｏｒＭ１３ｍｐ１９は、Ｈｅｍ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ Ｂｃｒｅｒｌｙ，
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から入手した。
ｉｒｏｎｇｅｎｔａｌ ｌｌｅａｌｔｈＳｃｉｅｎｃｅ
ｓ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ， Ｐａｒ
ｋ， ＮｏｒｔｈＣａｒｏｌｉｎａ， ２７７０９のＯ
ｒ． Ｔｈｏｍａｓ Ｋｕｎｋｅｌがら入手できる。Ｖ
ｅｃｔｏｒ ｐ．Ｂ Ｒ ３ ２ ７及びＭ １ ３
ｍ ｐ ９は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ （ Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ， Ｈｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から入手でき
る。プラスミドＯ Ｕ Ｃ １ ８ Ｙａｎｉｓｃｈ−
ＰｅｒｒＯｎら、１９８５によって記述されたプラスミ
ドｐＬＪＣ１８ファルマシア（ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ
， ＮｅｗＪｅｒＳ（！’Ｖ ）からも入手できるかも
しれない。ＶｅｃｔｏｒＭ１３ｍｐ１９は、Ｈｅｍ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ Ｂｃｒｅｒｌｙ，
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から入手した。
すべての産物（即ち、ペプチドもしくはタンパク）に特
異的な抗体は、次の様にして得た。タンパクに特異的な
抗体の生産はｖａｔｕｋａｉｔｉｓ （ １ ９ ８１
）の方法に基いた。ウシの生長ホルモン用に（ＢＧ）Ｉ
） 、１１ニユーシーラント白ウサギを完全７０インド
アジユバント中の１０００ｕｇの遺伝子組み換えで作成
した生長ホルモン（ｒＢＧＨ）の筋肉注射を行って免疫
した。ウサギは４〜８週後、１０００μ９の不完全７０
インドアシユパン７ ト（ＦＩＡ）中のｒ Ｂ Ｇ Ｈ
からなる追加注射を行ない、１６週日日ＦＩＡ中の５０
０μりのｒ［３Ｇｔ−１の追加注射をざらに行った。ア
トリオペプヂゲンの検出には、アトリＡベブチゲン分子
のＣ末端に相当する心房ペプチドＩＩ （ＡＰ２）に対
して抗血清を産生させた。雌のＮＯＷ ２ｅａｌａｎｄ
白ウサギを完全フロインドアジュバント中の１００μり
のラットＡＰ２と１ ５０μｐのにｅｙｈｏｌｅＬｉｍ
ｐｅｔ Ｉｌｅｍｏｃｙａｎｉｎ （ Ｋ Ｌ ｌ−
１ ） （ Ｓｉｇｍａ， ｓｔ。
異的な抗体は、次の様にして得た。タンパクに特異的な
抗体の生産はｖａｔｕｋａｉｔｉｓ （ １ ９ ８１
）の方法に基いた。ウシの生長ホルモン用に（ＢＧ）Ｉ
） 、１１ニユーシーラント白ウサギを完全７０インド
アジユバント中の１０００ｕｇの遺伝子組み換えで作成
した生長ホルモン（ｒＢＧＨ）の筋肉注射を行って免疫
した。ウサギは４〜８週後、１０００μ９の不完全７０
インドアシユパン７ ト（ＦＩＡ）中のｒ Ｂ Ｇ Ｈ
からなる追加注射を行ない、１６週日日ＦＩＡ中の５０
０μりのｒ［３Ｇｔ−１の追加注射をざらに行った。ア
トリオペプヂゲンの検出には、アトリＡベブチゲン分子
のＣ末端に相当する心房ペプチドＩＩ （ＡＰ２）に対
して抗血清を産生させた。雌のＮＯＷ ２ｅａｌａｎｄ
白ウサギを完全フロインドアジュバント中の１００μり
のラットＡＰ２と１ ５０μｐのにｅｙｈｏｌｅＬｉｍ
ｐｅｔ Ｉｌｅｍｏｃｙａｎｉｎ （ Ｋ Ｌ ｌ−
１ ） （ Ｓｉｇｍａ， ｓｔ。
Ｌｏｕ ｉ Ｓ ）を含む溶液の複数回の皮肉注射で免
疫した。ウサギは、８週日に不完全フロインドアジュバ
ント中の１００μ９のラットＡＰ２と１５０μＪのＫＬ
Ｉ−１からなる追加注射を受けた。ウリ゛ギ１よＫ ｌ
− Ｈに対してＥＬ［ＳＡを行った場合に［＋１１１清
抗体力価を示した。
疫した。ウサギは、８週日に不完全フロインドアジュバ
ント中の１００μ９のラットＡＰ２と１５０μＪのＫＬ
Ｉ−１からなる追加注射を受けた。ウリ゛ギ１よＫ ｌ
− Ｈに対してＥＬ［ＳＡを行った場合に［＋１１１清
抗体力価を示した。
Ｅ． ｃｏｌｉに対する生長培地と用いられたアンピ
シリン耐性（ａｒｒｌ ）マーカーを含むプラスミド
を運ぶ細胞の選択の条件ｔよ、ＨａｎｉａｔｉＳら（
１ ９ ８２ ）において記述された如くであった。
シリン耐性（ａｒｒｌ ）マーカーを含むプラスミド
を運ぶ細胞の選択の条件ｔよ、ＨａｎｉａｔｉＳら（
１ ９ ８２ ）において記述された如くであった。
バクテリアの生育培地成分と抗生物質は、Ｓｉｇｍａ（
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， Ｈｉｓｓｏｕｒｉ ）または旧
ｆｃ。
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， Ｈｉｓｓｏｕｒｉ ）または旧
ｆｃ。
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ， Ｈｉｃ
ｈｉｇａｎ ）から得られた。訂しく述べれば、細胞は
２００μｇ／ ｊＲｅのアンピシリンの存在で生育ざＶ
１プラスミドＤＮＡの存在をスクリーニングした。用い
た生長培地は、０、２％（Ｗ／Ｖ）グルコース、Ｄｉｆ
ｃ。
ｈｉｇａｎ ）から得られた。訂しく述べれば、細胞は
２００μｇ／ ｊＲｅのアンピシリンの存在で生育ざＶ
１プラスミドＤＮＡの存在をスクリーニングした。用い
た生長培地は、０、２％（Ｗ／Ｖ）グルコース、Ｄｉｆ
ｃ。
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ Ｄｃｔｒｏｉｔ，旧ｃ
ｈｉｇａｎ ）から入手した力噌アアミノ酸及び５μｇ
／ｄのナイアミンを補強した２ Ｘ Ｙ Ｔ ｉ．”地
かＭ９最小培地が何れが＜Ｍａｎｉｊａｓら、１９８２
）であった。
ｈｉｇａｎ ）から入手した力噌アアミノ酸及び５μｇ
／ｄのナイアミンを補強した２ Ｘ Ｙ Ｔ ｉ．”地
かＭ９最小培地が何れが＜Ｍａｎｉｊａｓら、１９８２
）であった。
旦エ Ｃｏ１１宿主細胞の組み換えＤＮＡクローニング
と発現ベクターとでの形質転換は、Ｈａｎｉａｔｉｓら
（１９８２）に記述されているように行われた。（１９
８２） ｒｅｃＡプロモーターからの転写の誘導は手短かに述べ
れば次の如くであった。発現ブラスミドドをになってい
るＥ、 Ｃｏ１ｔ ＪＭｌｏｌもしくは、Ｗ３１１
０宿主細胞を上記補強Ｍ９最小培地中テ１５０ ｋｌｅ
ｔｔ単位（ｋｌｅｔｔ−３ＩＪｌ１０ｒＳＯ１１ｍｅｔ
ｅｒで測定、に１ｃｔｔ Ｈｆ（１，Ｃｏ、、 Ｎｅｖ
Ｙｏｒｋ、 ＨｅｍＹｏｒｋ ）になるまで生育させ
、次に１／２０容量のｎａｌｉｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ溶
液（１０ａ＋ｙ／ｄ１０．ＩＭＮａＯＨを加えた。誘導
後、５．６時間培養を続け、１時間毎に一定量をとり、
異質タンパクの生産ピークを決定した。望む遺伝子産物
の最大の生産を達成するため、十分用の空気の供給をＭ
侍した。培養温度は３７℃に保った。
と発現ベクターとでの形質転換は、Ｈａｎｉａｔｉｓら
（１９８２）に記述されているように行われた。（１９
８２） ｒｅｃＡプロモーターからの転写の誘導は手短かに述べ
れば次の如くであった。発現ブラスミドドをになってい
るＥ、 Ｃｏ１ｔ ＪＭｌｏｌもしくは、Ｗ３１１
０宿主細胞を上記補強Ｍ９最小培地中テ１５０ ｋｌｅ
ｔｔ単位（ｋｌｅｔｔ−３ＩＪｌ１０ｒＳＯ１１ｍｅｔ
ｅｒで測定、に１ｃｔｔ Ｈｆ（１，Ｃｏ、、 Ｎｅｖ
Ｙｏｒｋ、 ＨｅｍＹｏｒｋ ）になるまで生育させ
、次に１／２０容量のｎａｌｉｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ溶
液（１０ａ＋ｙ／ｄ１０．ＩＭＮａＯＨを加えた。誘導
後、５．６時間培養を続け、１時間毎に一定量をとり、
異質タンパクの生産ピークを決定した。望む遺伝子産物
の最大の生産を達成するため、十分用の空気の供給をＭ
侍した。培養温度は３７℃に保った。
トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターからの転写誘導
を簡単に述べれば、次のように行った。
を簡単に述べれば、次のように行った。
発現プラスミドをになっているＥ、 ＣＱＩｉＪＭ１
０ＩまたＷ３１１０宿主細胞を３７℃でアンピシリン１
００μｇ／Ｉｄを含むＬＢ培地（Ｈａｎｉａｔｉｓら、
１９８２）中で一夜培養した培地は、次に５μ９７ｄ’
ｒ−リブトファンを含む上記の補強Ｍ９培地で５０倍に
稀釈した。数時間培養を続け、１時間毎に一定量を取出
し、ｒＡ賀タンパクの生産のピークを決定した。
０ＩまたＷ３１１０宿主細胞を３７℃でアンピシリン１
００μｇ／Ｉｄを含むＬＢ培地（Ｈａｎｉａｔｉｓら、
１９８２）中で一夜培養した培地は、次に５μ９７ｄ’
ｒ−リブトファンを含む上記の補強Ｍ９培地で５０倍に
稀釈した。数時間培養を続け、１時間毎に一定量を取出
し、ｒＡ賀タンパクの生産のピークを決定した。
ｌａｍｂｄａ ｒ’Ｌプロモーターからの転写の誘導
は、手短に述べれば、次の様に行った。発現プラスミド
をになうＥ、 Ｃｏ１１ Ｎ６４０５宿主細胞を、
細胞密度が１５０にＩｅｔｔユニットに達する迄、培養
を３０℃で行ったことを除けば、上述の通り培養した。
は、手短に述べれば、次の様に行った。発現プラスミド
をになうＥ、 Ｃｏ１１ Ｎ６４０５宿主細胞を、
細胞密度が１５０にＩｅｔｔユニットに達する迄、培養
を３０℃で行ったことを除けば、上述の通り培養した。
その後は、培養は宿主細胞の染色体中に含まれる温度感
受性ラムダ−リブレフ１ナーを不活性化りる４２℃で行
った。リプレッサーの不活性化により、ＰＬプロモータ
ーからの転写が起ることが誘導後、一時間毎に一定量を
とり、異質タンパク生産のピークを決定した。
受性ラムダ−リブレフ１ナーを不活性化りる４２℃で行
った。リプレッサーの不活性化により、ＰＬプロモータ
ーからの転写が起ることが誘導後、一時間毎に一定量を
とり、異質タンパク生産のピークを決定した。
宿主細胞中に生産される異質タンパクのレベルは、酵素
活性、ウエスターンインムユノブロッテイング（Ｒｅｎ
ａｒｔら、１９７９）または、ＳＤＳ −ポリアクリル
アミドゲルのタンパクの染色（Ｌａｅｍｍｌｉ、 １
９７０ ）により決定された。例えば、β−ガラクター
ゼ（ｌ ａｃＺ）の水準は次の様に決定した。発現プラ
スミドを含む細胞は、２００Ｌｔｇ／Ｉｄのアンピシリ
ンを含む培地で６００履の波長において光学濃度が１．
０に達するまで培養する。１．０ｍの培養中の細胞を遠
心分離で集め、ベレットをＤ１１７．５の１０１８トリ
ス！！！ｉ液に再び懸濁させた。１１Ｉ胞を、超音波処
理で破壊し、不溶物は、すべて遠心分離で除いた。抽出
物は測定可能な濃度範囲を得るため、測定前に、Ｚ緩衝
液（１００ｒＲｆ！中に、１．６１９ Ｎａ ＨＰｏ ・７・Ｈ２Ｏ，０，５５！ＪＮａＨＰｏ
・７Ｈ２０１７ｂ、Ｏ’Ｆ ＫＣｌ１２５、Ｏ■
ＭｑＳＯ・７Ｈ２０、及び０．２７０ｎｅのβ−メル
カプｌ−Ｔタノールを含み、１１１１７．０に調節した
。）で２倍から１００倍に稀釈した。稀釈サンプル２５
−１００μｌＳを７・緩衝液に加え、最終容量１．０ｍ
とした。試験管を２８℃に保ち、０．２ｄのＯ−ｎ１ｔ
ｒｏｐｈｅｎｙｌ −β−ｇａｌａｃｔｏｐｙ−ｒａ
ｎｏｓｉｄｅ （０、１Ｍの燐酸緩衝液中４■／−１
Ｄ１１７．０＞を加えた。黄色の発色が認められる迄反
応を進行させた。その時、０、５ａｉ！Ｉ Ｍ Ｎ
ａ２ Ｃｏ３を加えることにより、反応を止め吸光度を
４２０ｎｍで測定した。
活性、ウエスターンインムユノブロッテイング（Ｒｅｎ
ａｒｔら、１９７９）または、ＳＤＳ −ポリアクリル
アミドゲルのタンパクの染色（Ｌａｅｍｍｌｉ、 １
９７０ ）により決定された。例えば、β−ガラクター
ゼ（ｌ ａｃＺ）の水準は次の様に決定した。発現プラ
スミドを含む細胞は、２００Ｌｔｇ／Ｉｄのアンピシリ
ンを含む培地で６００履の波長において光学濃度が１．
０に達するまで培養する。１．０ｍの培養中の細胞を遠
心分離で集め、ベレットをＤ１１７．５の１０１８トリ
ス！！！ｉ液に再び懸濁させた。１１Ｉ胞を、超音波処
理で破壊し、不溶物は、すべて遠心分離で除いた。抽出
物は測定可能な濃度範囲を得るため、測定前に、Ｚ緩衝
液（１００ｒＲｆ！中に、１．６１９ Ｎａ ＨＰｏ ・７・Ｈ２Ｏ，０，５５！ＪＮａＨＰｏ
・７Ｈ２０１７ｂ、Ｏ’Ｆ ＫＣｌ１２５、Ｏ■
ＭｑＳＯ・７Ｈ２０、及び０．２７０ｎｅのβ−メル
カプｌ−Ｔタノールを含み、１１１１７．０に調節した
。）で２倍から１００倍に稀釈した。稀釈サンプル２５
−１００μｌＳを７・緩衝液に加え、最終容量１．０ｍ
とした。試験管を２８℃に保ち、０．２ｄのＯ−ｎ１ｔ
ｒｏｐｈｅｎｙｌ −β−ｇａｌａｃｔｏｐｙ−ｒａ
ｎｏｓｉｄｅ （０、１Ｍの燐酸緩衝液中４■／−１
Ｄ１１７．０＞を加えた。黄色の発色が認められる迄反
応を進行させた。その時、０、５ａｉ！Ｉ Ｍ Ｎ
ａ２ Ｃｏ３を加えることにより、反応を止め吸光度を
４２０ｎｍで測定した。
ＬａＣＺのユニットは、１０００に４２０ ｎｍ１．：
お１）る吸光度を乗じ、分で表した反応時間で除し、ｄ
単位で表した使用サンプルの容量を乗Ｕ、６００ｎｍに
お４ノる培養原液の吸光度（ＯＤ）を乗じたものに等し
い。
お１）る吸光度を乗じ、分で表した反応時間で除し、ｄ
単位で表した使用サンプルの容量を乗Ｕ、６００ｎｍに
お４ノる培養原液の吸光度（ＯＤ）を乗じたものに等し
い。
グルタチオン−５−１−ランスフェラーゼ■（ＧＳＴＩ
）のレベルは、ＨａｂｉｇとＪａｋｏｂｙ （１９８１
）により記述されている手順に従って、手短かに述べれ
ば、次の様に行った。Ｇ５Ｔｌ遺伝子を含む発現プラス
ミドを含むＦ、 Ｃｏ１１Ｊ Ｍ １０１ ！Ｉｌｌ
胞を前述の補強Ｍ９培地でに１員ｔ１５０の密度迄生育
させ、前述のように、プロ［−ターを誘導した。誘導後
、ＩＩ Ｉｌｌは室温で３時間培養し、それから１＃ｌ
ｉ！を取り出した。その中の細胞を遠心で採取し、ペレ
ットを１蛇の水に再懸濁した。ガラス球とともに渦巻運
動をさせて、細胞融解物を調製した。そして、それから
上澄液をＧ５Ｔｉ活性につき測定した。次にガラス球と
細胞のかすを、遠心によって除去し、次の如くＧ５Ｔｌ
活性を測定した。１００１１１８ ＫＨＰＯ４、ｐＨ
６，５及び１ＱｎＨグルタチオンを含む１１Ｒ１の試薬
Ａとエタノール中の１００ｇ＋Ｈの Ｃｈｌｏｒｏｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎ エタノール
溶液を含む試薬Ｂ３３μｌを、１０から１００μｌの細
胞上澄液と混合した。波長３４０ｎｌにおける吸光度の
変化率を、ｔｌａｂｉｇとＪａｋｏｂＶ （１９８１）
によって記述したように測定した。活性は、すべて細胞
培養の最初の吸光度分につき補正を行った。
）のレベルは、ＨａｂｉｇとＪａｋｏｂｙ （１９８１
）により記述されている手順に従って、手短かに述べれ
ば、次の様に行った。Ｇ５Ｔｌ遺伝子を含む発現プラス
ミドを含むＦ、 Ｃｏ１１Ｊ Ｍ １０１ ！Ｉｌｌ
胞を前述の補強Ｍ９培地でに１員ｔ１５０の密度迄生育
させ、前述のように、プロ［−ターを誘導した。誘導後
、ＩＩ Ｉｌｌは室温で３時間培養し、それから１＃ｌ
ｉ！を取り出した。その中の細胞を遠心で採取し、ペレ
ットを１蛇の水に再懸濁した。ガラス球とともに渦巻運
動をさせて、細胞融解物を調製した。そして、それから
上澄液をＧ５Ｔｉ活性につき測定した。次にガラス球と
細胞のかすを、遠心によって除去し、次の如くＧ５Ｔｌ
活性を測定した。１００１１１８ ＫＨＰＯ４、ｐＨ
６，５及び１ＱｎＨグルタチオンを含む１１Ｒ１の試薬
Ａとエタノール中の１００ｇ＋Ｈの Ｃｈｌｏｒｏｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎ エタノール
溶液を含む試薬Ｂ３３μｌを、１０から１００μｌの細
胞上澄液と混合した。波長３４０ｎｌにおける吸光度の
変化率を、ｔｌａｂｉｇとＪａｋｏｂＶ （１９８１）
によって記述したように測定した。活性は、すべて細胞
培養の最初の吸光度分につき補正を行った。
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）のレベルは、次の如く酵素活性を測定することに
より定量した。プラスミドを含む旦エ Ｃｏ１１ Ｊ
Ｍ１０１細胞を補胞を補強Ｍ９培地において、約３００
ＫＩｅｔｔユニツトの密度まで培養した。培ａ液１．Ｏ
ｄ分の細胞を遠心で採取し、ベレッ１〜をｐＨ７，８の
Ｔｒｉｓ−１」Ｃ１緩衝液１１ｄに再懸濁させ、超音波
により破砕した。細胞のかすを遠心除去し、上澄を測定
に使用した。＠解反をｐｌ＋７．８のＴｒｉｓ−トＩＣ
Ｉ 。
ＡＴ）のレベルは、次の如く酵素活性を測定することに
より定量した。プラスミドを含む旦エ Ｃｏ１１ Ｊ
Ｍ１０１細胞を補胞を補強Ｍ９培地において、約３００
ＫＩｅｔｔユニツトの密度まで培養した。培ａ液１．Ｏ
ｄ分の細胞を遠心で採取し、ベレッ１〜をｐＨ７，８の
Ｔｒｉｓ−１」Ｃ１緩衝液１１ｄに再懸濁させ、超音波
により破砕した。細胞のかすを遠心除去し、上澄を測定
に使用した。＠解反をｐｌ＋７．８のＴｒｉｓ−トＩＣ
Ｉ 。
緩衝液により、サンプル中の活性が適当濃度になるよう
に稀釈した。５０μｌの稀釈融解物を、１ＱＣ）ＩＩＨ
Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ 、 ０．１ｍＨＡｃｃｔｙｌＣ
〇八、 ０．４■／！ｄ５． ５’ −ｄｉｔｈｉｏ
ｂｉｓ −２−ｎｔｔｒｏｂｅｎｚｏｎ；ｃ ａｃｉｄ
を含む１．０＃ｌｉ！の緩衝液に加え、クロラムフェニ
コールを最終ａｉｆ！Ｉｆｉ０．１ｍＨ迄加えて反応を
開始させた。ＣＡＴ活性ｍは、３７”Ｃで４１２ｍにＪ
３ける吸光度の変化を読むことにより決定した。分あた
りの吸光度の正味の変化を１３．６で割るとキュベツト
中の酵素（ＣＡＴ）の単位が得られる。活性は、すべて
細胞培養物の初朋吸光度分について補正を行った。
に稀釈した。５０μｌの稀釈融解物を、１ＱＣ）ＩＩＨ
Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ 、 ０．１ｍＨＡｃｃｔｙｌＣ
〇八、 ０．４■／！ｄ５． ５’ −ｄｉｔｈｉｏ
ｂｉｓ −２−ｎｔｔｒｏｂｅｎｚｏｎ；ｃ ａｃｉｄ
を含む１．０＃ｌｉ！の緩衝液に加え、クロラムフェニ
コールを最終ａｉｆ！Ｉｆｉ０．１ｍＨ迄加えて反応を
開始させた。ＣＡＴ活性ｍは、３７”Ｃで４１２ｍにＪ
３ける吸光度の変化を読むことにより決定した。分あた
りの吸光度の正味の変化を１３．６で割るとキュベツト
中の酵素（ＣＡＴ）の単位が得られる。活性は、すべて
細胞培養物の初朋吸光度分について補正を行った。
アトリオペプチゲン、ウシ生長ホルモン、ブタ生長ホル
モン（Ｐ Ｇ Ｈ）のレベルをＲｅｎａｒｔら（１９７
９）による方法に従って、ウェスターンイムノブロッテ
ィングにより、または、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル（Ｌａｅｍｍｌｉ、 １９７０ ）のタンパクの染
色（例えば、ＣｏｏＩＩｌａｓｓｉｅ Ｂｒ１ｌｌｉａ
ｎｔＢｌｕｅ）によって決定した。
モン（Ｐ Ｇ Ｈ）のレベルをＲｅｎａｒｔら（１９７
９）による方法に従って、ウェスターンイムノブロッテ
ィングにより、または、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル（Ｌａｅｍｍｌｉ、 １９７０ ）のタンパクの染
色（例えば、ＣｏｏＩＩｌａｓｓｉｅ Ｂｒ１ｌｌｉａ
ｎｔＢｌｕｅ）によって決定した。
３− ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌ ５ｈｉｋｉＩＩｌａｔ
ａ ５− ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ （Ｅ
Ｐ Ｓ Ｐ ）を次の如く決定した。
ａ ５− ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ （Ｅ
Ｐ Ｓ Ｐ ）を次の如く決定した。
ＥＰＳＰ発現ベクターをになっている細胞を中期対数明
透培養し、１！ｄ分を遠心によって採取した。
透培養し、１！ｄ分を遠心によって採取した。
ペレットを１０ｍＨトリスｐ１１８．１ ｍＭＮａ２Ｅ
ＤＴ△、０．ＩＨＮａＣＩＴ−洗い、ｐＨ５，２の５０
ａＨＩＩｉＭナトリウム１１衝液２ｄに再懸濁させた。
ＤＴ△、０．ＩＨＮａＣＩＴ−洗い、ｐＨ５，２の５０
ａＨＩＩｉＭナトリウム１１衝液２ｄに再懸濁させた。
操作はすべて０℃で行われた。ペレットを超音波処理で
融解し、細胞のかすを遠心で除去した。抽出物の１μｍ
の２サンプルについて、９８μｍの測定緩性ｉ液（５０
ｎ＋Ｈ醋酸すトリウム、ｐＨ５，２，８０ｍＨＮ ａ
Ｃｌ 、２’ｌＨＳｈｉｋｉｍａｔｅ−３−ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ及び２ ｍＷ Ｐｈ０３ＤｈＯｅｎＯＩＩ）Ｖ
ｒｔｌＶａｔｅを含む）を加え、３７°でインキュベー
トしてＥＰＳＰ活性を測定した。指定された時間の後、
１．６５ｍ１！の９色試薬（０，８７％（Ｗ／Ｖ ）ｓ
ｏｄｉｕｍ ａｓｃｏｒｂａｔｃ、 ０．２２％（Ｗ／
Ｖ ）ａｍｍｏｎｉｕｍ ｍｏｌｙｂｄａｔｅ）を加え
、反応を止め、４５℃で２０分間発色させ、７５０ｎｌ
ｌｌで吸光度を測定した。酵素活性を抽出物中のタンパ
ク■あたりにつき遊離するフォスフェートのナノモル（
１０’モル）として表現した。
融解し、細胞のかすを遠心で除去した。抽出物の１μｍ
の２サンプルについて、９８μｍの測定緩性ｉ液（５０
ｎ＋Ｈ醋酸すトリウム、ｐＨ５，２，８０ｍＨＮ ａ
Ｃｌ 、２’ｌＨＳｈｉｋｉｍａｔｅ−３−ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ及び２ ｍＷ Ｐｈ０３ＤｈＯｅｎＯＩＩ）Ｖ
ｒｔｌＶａｔｅを含む）を加え、３７°でインキュベー
トしてＥＰＳＰ活性を測定した。指定された時間の後、
１．６５ｍ１！の９色試薬（０，８７％（Ｗ／Ｖ ）ｓ
ｏｄｉｕｍ ａｓｃｏｒｂａｔｃ、 ０．２２％（Ｗ／
Ｖ ）ａｍｍｏｎｉｕｍ ｍｏｌｙｂｄａｔｅ）を加え
、反応を止め、４５℃で２０分間発色させ、７５０ｎｌ
ｌｌで吸光度を測定した。酵素活性を抽出物中のタンパ
ク■あたりにつき遊離するフォスフェートのナノモル（
１０’モル）として表現した。
イソペンテニルトランスフエラーｔ？Ｉ（ｒＰＴＩ）の
レベルは、次のように決定した、Ｉ Ｐ １’ Ｉ発現
プラスミドをになうＪＭ１０１！ＩＩ胞を補強Ｍ９培地
中で生育させ、ｒｅｃＡプロモーターを上述の如く誘導
した。誘導２時間後、１ｄの分間を複数とり、細胞を遠
心分離によって回収した。全細胞タンパクをＱ ’ Ｆ
ａｒｒｅｌ ｌら（１９７７）に従って非平衡２次元ポ
リアクリルアミドゲル電気泳ｖＪ法により分析した。そ
して、各タンパクをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒ１ｌｌｉ
ａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ２５０で染色して検出した。染色
したタンパクのスポットをＢｉｏ−ＩｍａｇｅＴＨ（Ａ
ｎｎ−＾ｒｂｏｒ、 Ｈｉｃｈｉｇａｎ ）礼のデンシ
トメーターを用いて定量した。
レベルは、次のように決定した、Ｉ Ｐ １’ Ｉ発現
プラスミドをになうＪＭ１０１！ＩＩ胞を補強Ｍ９培地
中で生育させ、ｒｅｃＡプロモーターを上述の如く誘導
した。誘導２時間後、１ｄの分間を複数とり、細胞を遠
心分離によって回収した。全細胞タンパクをＱ ’ Ｆ
ａｒｒｅｌ ｌら（１９７７）に従って非平衡２次元ポ
リアクリルアミドゲル電気泳ｖＪ法により分析した。そ
して、各タンパクをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒ１ｌｌｉ
ａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ２５０で染色して検出した。染色
したタンパクのスポットをＢｉｏ−ＩｍａｇｅＴＨ（Ａ
ｎｎ−＾ｒｂｏｒ、 Ｈｉｃｈｉｇａｎ ）礼のデンシ
トメーターを用いて定量した。
例１
この例では、１に示されている合成Ｇ１０Ｌ分子の構築
と組み立てについて述べる。合成二重鎖ＤＮＡ （ｄｓ
ＤＮＡ）ＧｌｏＬ分子は、バクテリオファージエフ遺伝
子１０のコード配列の翻訳開始コドン（ＡＴＧ＞の５′
未讃に隣接する約１００ケの塩す対（ｂｐ）を含む。そ
して、△ＴＧＩ７ｆｌ始コドンに直接にＧ−Ｃｂｐが続
いており、ｂｐ置換は、第１図中でアンダーラインで表
示されている。
と組み立てについて述べる。合成二重鎖ＤＮＡ （ｄｓ
ＤＮＡ）ＧｌｏＬ分子は、バクテリオファージエフ遺伝
子１０のコード配列の翻訳開始コドン（ＡＴＧ＞の５′
未讃に隣接する約１００ケの塩す対（ｂｐ）を含む。そ
して、△ＴＧＩ７ｆｌ始コドンに直接にＧ−Ｃｂｐが続
いており、ｂｐ置換は、第１図中でアンダーラインで表
示されている。
第１図に示されるｄ ５ＤＮＡ分子を生産するために、
６つの相補的な部分的に重なり合った合成オリゴヌクレ
オチドが、第５図で示されるように合成された。粗合成
オリゴヌクレオチドの一部が７Ｍ尿素中の１６％（Ｗ／
Ｖ ）のポリアクリルアミド−尿素ゲル（Ｈａｎｉａｔ
ｉｓら、１９８２）上電気泳動で精製された。各調製物
中の合成りＮＡの濃度は、比放射活性が、２２，０００
−２４．０００力ウント／ｍｉｎ（ｃｐｍ）／ｌｌ１ｏ
ｌｅ ＡＴＰの７Ｐ−ＡＴＰとＴ４ＤＮＡキナーゼを
用いた定量的な５′末端ラベリング反応によって決定さ
れた。
６つの相補的な部分的に重なり合った合成オリゴヌクレ
オチドが、第５図で示されるように合成された。粗合成
オリゴヌクレオチドの一部が７Ｍ尿素中の１６％（Ｗ／
Ｖ ）のポリアクリルアミド−尿素ゲル（Ｈａｎｉａｔ
ｉｓら、１９８２）上電気泳動で精製された。各調製物
中の合成りＮＡの濃度は、比放射活性が、２２，０００
−２４．０００力ウント／ｍｉｎ（ｃｐｍ）／ｌｌ１ｏ
ｌｅ ＡＴＰの７Ｐ−ＡＴＰとＴ４ＤＮＡキナーゼを
用いた定量的な５′末端ラベリング反応によって決定さ
れた。
合成りＮＡ断片１−６（第５図）の組み立ては、次の如
くに行った。６ケのオリゴヌクレオチドをすべて５′末
端において、ポリヌクレオチドキナーゼで燐酸化した。
くに行った。６ケのオリゴヌクレオチドをすべて５′末
端において、ポリヌクレオチドキナーゼで燐酸化した。
オリゴヌクレオチドの相補的対を（Ｔ／２．３／４及び
５／６）各５ＤＩ１０＋／μｐの濃度で一対ずつ製造業
者によって記述されたＴ４リガーゼ緩衝液中で混ぜ合せ
た。各ベアーはそれから７５℃で１５分間加熱し、混合
物を除徐に冷！Ｊ１シた。（すなわちアニール）次に、
オリゴヌクレオチドの３つの対を混ぜ合せ、１５℃で一
夜連結させた。混合物をＢＱＩＩＩ及びＮＣ０Ｉ！、Ｉ
Ｊ限ヌクレアーゼ酵素で処理して、生成したＧ１０Ｌの
ポリマーを除いた。そして、組み立てたＧ１０［断片は
、非変性１２％ポリアクリルアミドゲル（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、１９８２）上で電気泳動でｖｉ製した。
５／６）各５ＤＩ１０＋／μｐの濃度で一対ずつ製造業
者によって記述されたＴ４リガーゼ緩衝液中で混ぜ合せ
た。各ベアーはそれから７５℃で１５分間加熱し、混合
物を除徐に冷！Ｊ１シた。（すなわちアニール）次に、
オリゴヌクレオチドの３つの対を混ぜ合せ、１５℃で一
夜連結させた。混合物をＢＱＩＩＩ及びＮＣ０Ｉ！、Ｉ
Ｊ限ヌクレアーゼ酵素で処理して、生成したＧ１０Ｌの
ポリマーを除いた。そして、組み立てたＧ１０［断片は
、非変性１２％ポリアクリルアミドゲル（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、１９８２）上で電気泳動でｖｉ製した。
その結果得られて１０４ ｂｐＤＮＡ分子はゲルから電
気的に溶出して第１図中に示したＤＮＡ配列を持ってい
る分子を得た。
気的に溶出して第１図中に示したＤＮＡ配列を持ってい
る分子を得た。
例２
本例は、操作によって異質ＤＮＡコード配列に結合した
合成６１０し分子を含むさまざまな発現ビークルの構築
について述べべろ。詳しくは、以下のＤＮＡコード配列
に操作的に結合した合成Ｇ１０Ｌ分子を含んでいる表現
ベクターを記述する：即ら、Ｅ、 Ｃｏ１１ ３’−
ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ ５’
−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ｙｎｔｈａｓｅ（ＥＰＳ
Ｐ）：ラットアトリオペブヂゲン（ＡＰｇｅｎ）：ウシ
生長ホルモン（ＢＧＩ−１）：＾ｇｒｏｂａｃ＋、ｅｒ
ｉｕｍ ｔｌＪｔｌｌｏｒａｃｉｅｎｓ １ｓｏｐ
ｅｎｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｌ（ＩＰＴＩ）：Ｅ
、 Ｃｏ１１β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ （
ｌ ａ ｃ Ｚ ） ：Ｅ 、 ＣＯＩ ｉ ｃ
ｈｌｏｒａａ＋ｐｈａｎｉｃｏｌ ａｃｃｔｙｌｔｒａ
ｎｓｒｅｒａｓｃ （ＣΔＴ ） ： ｇｌｕｔａｔ
ｔ＋１ｏｎｅ −ｓ −ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｃ Ｉ
（Ｇ Ｓ Ｔ Ｉ ）とブタ生長ホルモン（Ｐ Ｇ Ｉ
−１）を］−ドするＤＮＡ配列である。以下の例ちＧ１
０Ｌ配列の代りに、対照りボゾーム結合部位（例えば、
ＳＤ−配列）を含むその伯の点では、同等の発現ベクタ
ーの構築について記述する。
合成６１０し分子を含むさまざまな発現ビークルの構築
について述べべろ。詳しくは、以下のＤＮＡコード配列
に操作的に結合した合成Ｇ１０Ｌ分子を含んでいる表現
ベクターを記述する：即ら、Ｅ、 Ｃｏ１１ ３’−
ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ ５’
−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５ｙｎｔｈａｓｅ（ＥＰＳ
Ｐ）：ラットアトリオペブヂゲン（ＡＰｇｅｎ）：ウシ
生長ホルモン（ＢＧＩ−１）：＾ｇｒｏｂａｃ＋、ｅｒ
ｉｕｍ ｔｌＪｔｌｌｏｒａｃｉｅｎｓ １ｓｏｐ
ｅｎｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｌ（ＩＰＴＩ）：Ｅ
、 Ｃｏ１１β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ （
ｌ ａ ｃ Ｚ ） ：Ｅ 、 ＣＯＩ ｉ ｃ
ｈｌｏｒａａ＋ｐｈａｎｉｃｏｌ ａｃｃｔｙｌｔｒａ
ｎｓｒｅｒａｓｃ （ＣΔＴ ） ： ｇｌｕｔａｔ
ｔ＋１ｏｎｅ −ｓ −ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｃ Ｉ
（Ｇ Ｓ Ｔ Ｉ ）とブタ生長ホルモン（Ｐ Ｇ Ｉ
−１）を］−ドするＤＮＡ配列である。以下の例ちＧ１
０Ｌ配列の代りに、対照りボゾーム結合部位（例えば、
ＳＤ−配列）を含むその伯の点では、同等の発現ベクタ
ーの構築について記述する。
ａ ＥＰＳＰ
第６図に示すように、ｒ ｅ ｃ Ａ ｐｒｏｍｏｔ
ｅｒ（ｐｒｅｃ）、対照ＳＤ−配列（ＳＤ）とＬエ Ｃ
ｏ１１ ＥＩＰＳＰ ＤＮＡコード配列（ＥＰＳＰ
）がそこに挿入されているプラスミドＤＢＲ３２７を含
む組み換え発現ベクターを制限エンドヌクレアーゼＢＯ
ＩＩＩとＮｃｏＩで消化（例えば、切る）した。そして
、大きなベクター断片をＮへＣ８樹脂（Ｂ Ｒｔ−１Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ（＋。
ｅｒ（ｐｒｅｃ）、対照ＳＤ−配列（ＳＤ）とＬエ Ｃ
ｏ１１ ＥＩＰＳＰ ＤＮＡコード配列（ＥＰＳＰ
）がそこに挿入されているプラスミドＤＢＲ３２７を含
む組み換え発現ベクターを制限エンドヌクレアーゼＢＯ
ＩＩＩとＮｃｏＩで消化（例えば、切る）した。そして
、大きなベクター断片をＮへＣ８樹脂（Ｂ Ｒｔ−１Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ（＋。
Ｈａｒｌ／Ｉａｎｄ）上で製造業者のインストラクショ
ンに従って精製した。その後、ベクター断片を以前に記
述され、第５図に示されているようにＴ４ＤＮＡリガー
ゼの存在において合成Ｇｌ ０１分子と混合した。プラ
スミドｐＭＯＮ、６００２は、Ａ Ｔ ＣＣ寄託番号６
７０４４の下に、ＡＴＣＣ（Ｉｔｏｃｋｖｉｌｌｅ、
Ｍａｒｙｌａｎｄ ）から得ることが出来る。
ンに従って精製した。その後、ベクター断片を以前に記
述され、第５図に示されているようにＴ４ＤＮＡリガー
ゼの存在において合成Ｇｌ ０１分子と混合した。プラ
スミドｐＭＯＮ、６００２は、Ａ Ｔ ＣＣ寄託番号６
７０４４の下に、ＡＴＣＣ（Ｉｔｏｃｋｖｉｌｌｅ、
Ｍａｒｙｌａｎｄ ）から得ることが出来る。
結束として得られたｐＭＯＮ ５５３７ベクターを、次
にＥ、 Ｃｏ１１ ＪＭ１０１細胞を転換するのに
用いた。Ｅ、 Ｃｏ１１宿主形質転換細胞を、アンピ
シリン２００μｇ／ｄを含むＪ８ＪＩｌ！ｌ中での生長
によって選ｌνだ。発現ベクター ｐＭＯＮ５５７３の創生は、形質変換した細胞から発現
ベクターを単離し、単離ベクターをＧ１０ＬとＥＰＳＰ
配列に特徴的な制限酵素で消化することによって確認し
た。
にＥ、 Ｃｏ１１ ＪＭ１０１細胞を転換するのに
用いた。Ｅ、 Ｃｏ１１宿主形質転換細胞を、アンピ
シリン２００μｇ／ｄを含むＪ８ＪＩｌ！ｌ中での生長
によって選ｌνだ。発現ベクター ｐＭＯＮ５５７３の創生は、形質変換した細胞から発現
ベクターを単離し、単離ベクターをＧ１０ＬとＥＰＳＰ
配列に特徴的な制限酵素で消化することによって確認し
た。
ｂ、 ＡＰＱｅｎ
第７図に示１ように、Ｐ プロモーター（Ｐ、）［
対照ＳＤ−配列（ＳＤ）及びラットアトリオベプチゲン
（ＡＰｇｅｎ）をコードするＤＮＡ配列の、−列に並ん
だ２つのコピーがそこに挿入されているｐＢＲ３２７を
含むＡＴＣＣ寄託番号６７０４３を持った発現ベクター
ｐＭＯＮ５５１０をＮＣ０ＩとＨｉｎｄｌｎで消化し、
アトリオペブチゲンをコードしている配列をＰＡＧＥに
よって単離した。（ＨａｎｉａｔｉＳら、１９８２）Ａ
Ｐａｃｎをコードする配列を、次にＴ４ＤＮＡリガーゼ
の存在下であらかじめＮｃｏ Ｉと）ｌｉｎｄＩ［［で
消化し、仔ウシの小腸のアルカリフォスファターゼ（Ｃ
ＩＡＰ）で処理しておいたｐＭＯＮ５５３７と混合した
。次に、ｐＭＯＮ５５１５ベクターを転換し、形質転換
細胞を、アンピシリンを含むＬ［３寒天平板培地上の生
育で選択した。
（ＡＰｇｅｎ）をコードするＤＮＡ配列の、−列に並ん
だ２つのコピーがそこに挿入されているｐＢＲ３２７を
含むＡＴＣＣ寄託番号６７０４３を持った発現ベクター
ｐＭＯＮ５５１０をＮＣ０ＩとＨｉｎｄｌｎで消化し、
アトリオペブチゲンをコードしている配列をＰＡＧＥに
よって単離した。（ＨａｎｉａｔｉＳら、１９８２）Ａ
Ｐａｃｎをコードする配列を、次にＴ４ＤＮＡリガーゼ
の存在下であらかじめＮｃｏ Ｉと）ｌｉｎｄＩ［［で
消化し、仔ウシの小腸のアルカリフォスファターゼ（Ｃ
ＩＡＰ）で処理しておいたｐＭＯＮ５５３７と混合した
。次に、ｐＭＯＮ５５１５ベクターを転換し、形質転換
細胞を、アンピシリンを含むＬ［３寒天平板培地上の生
育で選択した。
Δｐｇｅｎを］−ドしているＤＮＡが
０Ｍ０Ｎ５５１５ベクターに挿入されたことは、単離し
たベタターをＧ１０Ｌ及びＡＰｑｅｎ配列に対する特徴
的な制限酵素で消化することによってＴｉｌ１認した。
たベタターをＧ１０Ｌ及びＡＰｑｅｎ配列に対する特徴
的な制限酵素で消化することによってＴｉｌ１認した。
Ｇ１０Ｌの代りに対照りボゾーム結合部位（Ｒ，Ｂ、Ｓ
、）（即ち、ＳＤ配列）を含む、その他の点では、同一
のＡＰｏｅｎ発現ベクターは次のように構築した。第１
１図に示されているように、ｐＭＯＮ６００２とｐＭＯ
Ｎ５５１５を個個にＥ ｃ ｏ ＲＩとＮｃｏＩで消化
し、次にＴ４ＤＮＡリガーゼの存在で混合した。次に、
連絡した混合物を用いて、Ｅ、 ＣｏｌｉＣｏ１１Ｊ
細胞を形質転換し、形質転換細胞をアンピシリンを含む
培地中における生長により選択した。ＡＰ（ｌｅｎをコ
ードする配列に操作的に結合した対照Ｒ，Ｂ、Ｓ、（対
照ＳＤ配列）を含む選定された望むベクターは、制限エ
ンドメクレアーゼによる消化により、Ｇ１０Ｌ配列が存
在せず、ＡＰｇｅｎをコードする配列が存在することを
示して確認した。
、）（即ち、ＳＤ配列）を含む、その他の点では、同一
のＡＰｏｅｎ発現ベクターは次のように構築した。第１
１図に示されているように、ｐＭＯＮ６００２とｐＭＯ
Ｎ５５１５を個個にＥ ｃ ｏ ＲＩとＮｃｏＩで消化
し、次にＴ４ＤＮＡリガーゼの存在で混合した。次に、
連絡した混合物を用いて、Ｅ、 ＣｏｌｉＣｏ１１Ｊ
細胞を形質転換し、形質転換細胞をアンピシリンを含む
培地中における生長により選択した。ＡＰ（ｌｅｎをコ
ードする配列に操作的に結合した対照Ｒ，Ｂ、Ｓ、（対
照ＳＤ配列）を含む選定された望むベクターは、制限エ
ンドメクレアーゼによる消化により、Ｇ１０Ｌ配列が存
在せず、ＡＰｇｅｎをコードする配列が存在することを
示して確認した。
Ｃ，Ｂ、ＧＨ
ＢＧＨをコードしているＤＮＡ配列をもっているｐＢＧ
Ｈプラスミドは、ａｅｎａｎｔｅｃｈ。
Ｈプラスミドは、ａｅｎａｎｔｅｃｈ。
ｅｘ−１
１ｎｃ、、 ｓｏ、 ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから得た。
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから得た。
このプラスミドには、ヨーロッパの出願公告番号７５．
４４４ （１９８３年３ Ｊ［３０日発行）；５ｅｅｂ
ｕ ｒｇら（１９８３） 、Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９７
９） ；Ｄａ Ｂｏｅｒら（１９８２）：ＨｉＯＺｚａ
ｒｅとＹａｎｏｒｓｋｙ （１９７８） ：及びＲｏｓ
ｅｎｂｅｒｇとＣｏｕｒｔ （１９７９）に記述され
ているように調製することができる。ｐ Ｂ Ｇ Ｈｅ
ｘ−１発現ベクターは、そこにコードされているＢ Ｇ
’ ＨタンパクのＮ−末端アミノ酸が、ＮＨ−メヂ第二
ン（ｍｅ ｔ ）及びフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であ
るＢＧＨ［ＢＨＧ （Ｐ）］のための遺伝子をもってい
るｐＢＲ３２２バクテリアプラスミドである。遺伝子は
、順番にトリフ１−ファンプロモーター（Ｐｔｒ ｉ
ｐ）、５’非翻訳ｍＲＮ△の断片、８Ｇ目のＮ−末端ｐ
ｈｅ （ｐ）コドンに隣接する翻訳開始コドン、ＢＧＨ
をコードしている配列及び翻訳終結コドンを含ｌυでい
る。
４４４ （１９８３年３ Ｊ［３０日発行）；５ｅｅｂ
ｕ ｒｇら（１９８３） 、Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９７
９） ；Ｄａ Ｂｏｅｒら（１９８２）：ＨｉＯＺｚａ
ｒｅとＹａｎｏｒｓｋｙ （１９７８） ：及びＲｏｓ
ｅｎｂｅｒｇとＣｏｕｒｔ （１９７９）に記述され
ているように調製することができる。ｐ Ｂ Ｇ Ｈｅ
ｘ−１発現ベクターは、そこにコードされているＢ Ｇ
’ ＨタンパクのＮ−末端アミノ酸が、ＮＨ−メヂ第二
ン（ｍｅ ｔ ）及びフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であ
るＢＧＨ［ＢＨＧ （Ｐ）］のための遺伝子をもってい
るｐＢＲ３２２バクテリアプラスミドである。遺伝子は
、順番にトリフ１−ファンプロモーター（Ｐｔｒ ｉ
ｐ）、５’非翻訳ｍＲＮ△の断片、８Ｇ目のＮ−末端ｐ
ｈｅ （ｐ）コドンに隣接する翻訳開始コドン、ＢＧＨ
をコードしている配列及び翻訳終結コドンを含ｌυでい
る。
第８図と９図に示されるように、ＢＧＩ−１（Ｐ）をコ
ードする配列は、オリゴヌクレオチドにむ番」られた位
置特異的な突然変異誘起により、そのずぐ萌にＮ末端翻
訳開始（ＡＴＧ）メチオニンコドンがあるアラニン（ａ
ｌａ）コドン、及び翻訳開始（ＡＴＧ）コドンと重なり
合っているＮＣＯＩυ１限１ｌ）ｙ索部位を含むよう以
下の如く修飾されている。プラスミドＢ Ｇ Ｎ
からＢＧＭ（Ｐ）をコｘ−１ 一ドしているＤＮＡ配列をＨｉｎｄ［Ｉ／ＥＣ０ＲＩ断
片として切り出し、Ｍｌ ３ｍｐ９二ｌＮ０ＤＮＡ（Ｒ
ＦＤＮＡ）のｌ−１ｉ ｎ ｄ ■７ＥＣＯＲＩ部位に
りＯ−ンした。ＢＧＨ（Ｐ）をコードしているＩ） Ｎ
Δ配列をｌ−１ｉｎｄｌｌ［／ＥＣ０ＲＴＴ−分解した
ＲＦＭ１３ｍｐ９ＤＮＡに挿入し、図８に示す組み換え
ベクター Ｍ １３ ｍ ｐ ９ ／ Ｂ ＨＧがつくり出された
ことは、１０ａｅの１００ ｍＨＩ Ｐ Ｔ Ｇ （１
ｓｏｐｒｏｐｙｌ −β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔ
ｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ ）及び３ｍの上層寒天中に５
０１１１の２％（ｗ／ｖ ）Ｘ−ＧＡＬ （５−ｂｒｏ
ｍｏ −４−ｃｈｌｏｒｏ−３−１ｎｄｏｌｙｌ−β
−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ ）を含み
、Ｈａｎｉａｔｉｓら（１９８２）において記述されて
いるように、該組み換えベクターでトランスフェクトさ
れている）ｌａｎｉａｔｉｓら（１９８２）記）ホの軟
寒天重層法を用い、１ｘＹＴ培地中に生育したバクテリ
ア、Ｅ、 Ｃｏ１１ ＪＭｌｏｌのローン上の無色
のプラークによって、最初にＷ１認された。ＢＧＨをコ
ードする配列の挿入は、組み換えベクターの無色プラー
ク、Ｈａｎｉａｔｉｓら、（１９８２）、ＲＦＤＮＡを
ｌ−１ｉ ｎ ｄ Ｉ［ｌとＥｃｏＲＩで開裂すること
により、挿入配列を含む５９０６Ｄ断片を生ずることか
ら確認された。５９０塩基対（６ｐ）断片は、Ｈａｎｉ
ａｔｉｓらによって記述された１％（ｗ／ｖ ）アガロ
ースにおけるアガロースゲル電気泳動によって同定した
。随伴する制限酵素による断片は、すべてこの対照法に
よって同定した。
ードする配列は、オリゴヌクレオチドにむ番」られた位
置特異的な突然変異誘起により、そのずぐ萌にＮ末端翻
訳開始（ＡＴＧ）メチオニンコドンがあるアラニン（ａ
ｌａ）コドン、及び翻訳開始（ＡＴＧ）コドンと重なり
合っているＮＣＯＩυ１限１ｌ）ｙ索部位を含むよう以
下の如く修飾されている。プラスミドＢ Ｇ Ｎ
からＢＧＭ（Ｐ）をコｘ−１ 一ドしているＤＮＡ配列をＨｉｎｄ［Ｉ／ＥＣ０ＲＩ断
片として切り出し、Ｍｌ ３ｍｐ９二ｌＮ０ＤＮＡ（Ｒ
ＦＤＮＡ）のｌ−１ｉ ｎ ｄ ■７ＥＣＯＲＩ部位に
りＯ−ンした。ＢＧＨ（Ｐ）をコードしているＩ） Ｎ
Δ配列をｌ−１ｉｎｄｌｌ［／ＥＣ０ＲＴＴ−分解した
ＲＦＭ１３ｍｐ９ＤＮＡに挿入し、図８に示す組み換え
ベクター Ｍ １３ ｍ ｐ ９ ／ Ｂ ＨＧがつくり出された
ことは、１０ａｅの１００ ｍＨＩ Ｐ Ｔ Ｇ （１
ｓｏｐｒｏｐｙｌ −β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔ
ｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ ）及び３ｍの上層寒天中に５
０１１１の２％（ｗ／ｖ ）Ｘ−ＧＡＬ （５−ｂｒｏ
ｍｏ −４−ｃｈｌｏｒｏ−３−１ｎｄｏｌｙｌ−β
−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ ）を含み
、Ｈａｎｉａｔｉｓら（１９８２）において記述されて
いるように、該組み換えベクターでトランスフェクトさ
れている）ｌａｎｉａｔｉｓら（１９８２）記）ホの軟
寒天重層法を用い、１ｘＹＴ培地中に生育したバクテリ
ア、Ｅ、 Ｃｏ１１ ＪＭｌｏｌのローン上の無色
のプラークによって、最初にＷ１認された。ＢＧＨをコ
ードする配列の挿入は、組み換えベクターの無色プラー
ク、Ｈａｎｉａｔｉｓら、（１９８２）、ＲＦＤＮＡを
ｌ−１ｉ ｎ ｄ Ｉ［ｌとＥｃｏＲＩで開裂すること
により、挿入配列を含む５９０６Ｄ断片を生ずることか
ら確認された。５９０塩基対（６ｐ）断片は、Ｈａｎｉ
ａｔｉｓらによって記述された１％（ｗ／ｖ ）アガロ
ースにおけるアガロースゲル電気泳動によって同定した
。随伴する制限酵素による断片は、すべてこの対照法に
よって同定した。
単鎖（ｓｓ）のファージＤＮＡの単離は、Ｍｅｓｓｉｎ
ｇら（１９８２）の方法にしたがって行った。本質的に
ＺｏｌｌｃｒとＳｍ１ｔｈ （１９８２）、２ｏｌｌ
ｅｒとＳａ＋ｉｔｈ （１９８３） 、及びＮｏｒｒ
ｉｓら（１９８３）によって記述されているように、オ
リゴヌクレオチド志向突然変異誘光におけるテンプレー
トとして、Ｍｌ ３ｍｐ９８ＧＨベクターを、そのとき
用いた。彼等の文献の関係部分を参照としてここに加え
である。
ｇら（１９８２）の方法にしたがって行った。本質的に
ＺｏｌｌｃｒとＳｍ１ｔｈ （１９８２）、２ｏｌｌ
ｅｒとＳａ＋ｉｔｈ （１９８３） 、及びＮｏｒｒ
ｉｓら（１９８３）によって記述されているように、オ
リゴヌクレオチド志向突然変異誘光におけるテンプレー
トとして、Ｍｌ ３ｍｐ９８ＧＨベクターを、そのとき
用いた。彼等の文献の関係部分を参照としてここに加え
である。
図９は、すぐあとにフェニルアラニンコドンが続き、そ
してＮＣｏＩ部位が欠けているＮ末端メチオニンコドン
を持つＢＧＨを］−ドする配列［ＢＧＨ（Ｐ）］からＮ
末Ｎ末端メチオニンノド直接アラニンコドンとＮＣｏＩ
部位が続＜ＢＧＨをコードする配列［ＢＧＨ（Ａ）］を
ｆｇｌるための突然変異誘発の手順を図解している。手
短かに述べると、望む変異の配列を含むオリゴヌクレオ
チドを用いてＳＳＤＮＡＭｌ ３ｍ１）９／ＢＧＨテン
プレートの閉環状ＤＮＡＩビーの合成を始動した。
してＮＣｏＩ部位が欠けているＮ末端メチオニンコドン
を持つＢＧＨを］−ドする配列［ＢＧＨ（Ｐ）］からＮ
末Ｎ末端メチオニンノド直接アラニンコドンとＮＣｏＩ
部位が続＜ＢＧＨをコードする配列［ＢＧＨ（Ａ）］を
ｆｇｌるための突然変異誘発の手順を図解している。手
短かに述べると、望む変異の配列を含むオリゴヌクレオ
チドを用いてＳＳＤＮＡＭｌ ３ｍ１）９／ＢＧＨテン
プレートの閉環状ＤＮＡＩビーの合成を始動した。
このブライマーの配列を図９に示している。このように
して生成した開鎖状ｄｓＤＮＡ分子を、未完反応物及び
環状５ｓＤＮＡから、ＺｏｌｌｅｒとＳｍ１ｔｈ （
１９８３）によって記述されたように、アルカリ性シュ
ークロースグレーデイエント遠心分離により分離した。
して生成した開鎖状ｄｓＤＮＡ分子を、未完反応物及び
環状５ｓＤＮＡから、ＺｏｌｌｅｒとＳｍ１ｔｈ （
１９８３）によって記述されたように、アルカリ性シュ
ークロースグレーデイエント遠心分離により分離した。
次に閉環状ｄＳＤＮＡ分子を用い、Ｍｅｓｓｉｎｇら（
１９８２）によって記述されたＬエ Ｃｏ１１ ＪＭ
ｌｏｌを形質転換した。
１９８２）によって記述されたＬエ Ｃｏ１１ ＪＭ
ｌｏｌを形質転換した。
そして、その結果得られた無色のプラークをＰａ１ｌ，
ｔｒａｆｉｎｅ Ｆｉ目ｒａｔｉｏｎ ＣＯｒ＋） （
Ｇｌｅｎ ｃｏｖｅ、 ＮｅｗＹｏｒｋ ）から入手し
た ｎｙｌｏｎ Ｂｉｏｄｙｎｃ”フィルター上にもち
上げ、特定部位突然変異を発生するのに用いたオリゴヌ
クレオチドブライマーの３２Ｐ−ラベルをとのハイブリ
ッド形成についてスクリーニングした。該プラークのリ
フティングは、Ｐａ１ｌＦ ｉ ｌ ｔｅｒ製造業者に
よって記述された方法に従って行われた。ハイブリッド
形成スクリーニングは、Ｐａ１ｌ ＢｉｏｄｙｎｅＴＨ
Ｎｙｌｏｎ ＦｉｌｔｅｒへのＤＮＡトランスファーの
ためのプロトコールガイドにおいて、Ｐａ１ｌ旧ｔｒａ
ｆｉｎｃ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａ１ｌＤａｎｌ／
（ＧｌｅｎＣｏｖｅ、 Ｎ、Ｙ、 ）によって記述
されＩＣ方法に従ってナイロン Ｂｉｏｄｙｎｅフィル
ターを用いて行った。
ｔｒａｆｉｎｅ Ｆｉ目ｒａｔｉｏｎ ＣＯｒ＋） （
Ｇｌｅｎ ｃｏｖｅ、 ＮｅｗＹｏｒｋ ）から入手し
た ｎｙｌｏｎ Ｂｉｏｄｙｎｃ”フィルター上にもち
上げ、特定部位突然変異を発生するのに用いたオリゴヌ
クレオチドブライマーの３２Ｐ−ラベルをとのハイブリ
ッド形成についてスクリーニングした。該プラークのリ
フティングは、Ｐａ１ｌＦ ｉ ｌ ｔｅｒ製造業者に
よって記述された方法に従って行われた。ハイブリッド
形成スクリーニングは、Ｐａ１ｌ ＢｉｏｄｙｎｅＴＨ
Ｎｙｌｏｎ ＦｉｌｔｅｒへのＤＮＡトランスファーの
ためのプロトコールガイドにおいて、Ｐａ１ｌ旧ｔｒａ
ｆｉｎｃ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａ１ｌＤａｎｌ／
（ＧｌｅｎＣｏｖｅ、 Ｎ、Ｙ、 ）によって記述
されＩＣ方法に従ってナイロン Ｂｉｏｄｙｎｅフィル
ターを用いて行った。
フィルターを、温′度を上げつつＭｌ ３ｍｐ８／ｂ
Ｇ ｌ−１ファージで調製した対照放射性ラベｘ−１ ルシグナルが除去されるまで洗った。典型的なフィルタ
ー洗浄は、室温で６ｘＳＳＣ（０，９ＭＮａＣｌと０．
０９Ｍクエン酸プトリウム）で１０分間洗い、続いて、
５０℃で６ｘＳＳＣで５分間洗い、引続いて５ｍ湿度を
上昇させて洗浄した。
Ｇ ｌ−１ファージで調製した対照放射性ラベｘ−１ ルシグナルが除去されるまで洗った。典型的なフィルタ
ー洗浄は、室温で６ｘＳＳＣ（０，９ＭＮａＣｌと０．
０９Ｍクエン酸プトリウム）で１０分間洗い、続いて、
５０℃で６ｘＳＳＣで５分間洗い、引続いて５ｍ湿度を
上昇させて洗浄した。
コントロールファージよりも高い温度で、放射ラベルオ
リゴヌクレオチドブライマーとハイブリッド形成をした
プラークは、あらたに創られたＢＧＨ（△）を］−ドし
ている配列を持っており、ボデンシャルポジティブとい
う。もう１つの方法として、個々の無色のプラークを、 Ｅ、 Ｃｏ１１ ＪＭ１０１形質転換物から拾い上
げ、１．６％（ｗ／ｖ ） ｔ−リブトン、１．０％（
ｗ／ｖ）酵母エキス及び０．５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣｌを
含む５ｍの２ＸＹＴ培地で空気を送りＣｔ カラ３７℃
で１夜培養した。＋ｅｓｓ ｉｎｏら（１９８２）に従
って調製したファージＤＮＡを次に二トロセルローズ上
でスポットし、放射ラベルしたブライマーでハイブリッ
ド形成を行い、上述のように温度を上昇させて洗浄した
。
リゴヌクレオチドブライマーとハイブリッド形成をした
プラークは、あらたに創られたＢＧＨ（△）を］−ドし
ている配列を持っており、ボデンシャルポジティブとい
う。もう１つの方法として、個々の無色のプラークを、 Ｅ、 Ｃｏ１１ ＪＭ１０１形質転換物から拾い上
げ、１．６％（ｗ／ｖ ） ｔ−リブトン、１．０％（
ｗ／ｖ）酵母エキス及び０．５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣｌを
含む５ｍの２ＸＹＴ培地で空気を送りＣｔ カラ３７℃
で１夜培養した。＋ｅｓｓ ｉｎｏら（１９８２）に従
って調製したファージＤＮＡを次に二トロセルローズ上
でスポットし、放射ラベルしたブライマーでハイブリッ
ド形成を行い、上述のように温度を上昇させて洗浄した
。
Ｍｌ ３ｍｐ９８Ｇ）（コントロールプラークよりも高
い温度でハイブリッド温度を示したファージＤＮＡは、
同様にポテンシャルポジｉ′イヴと呼んだ。両方のスク
リーニング操作からの潜在陽性プラークは、上述の様に
培養し、ＳＳファージＤＮＡを作るのに使用した。３３
ｐ ｔｌ ａ Ｑ ｅＤＮＡを、次にｓａｎｇｅｒ
ら（１９７７）の方法によって配列決定を行った。ＢＧ
Ｍ （Ａ）をコードする配列及びＮＣ０Ｉ制限酵素部位
を含む得られた組み換えＭｌ ３ｍｐ９ファージＤＮＡ
をｏＮｃＤ８と表示した。（第９図をみよ。）第１０図
は、ＢＧＨ（Ａ）をコードする配列に操作的に結合させ
たＧ１０Ｌ配列を含むｐＢＲ３２７ブラスミドの構築を
示す。詳細には、ｐＮｃＤ８をト１ｉｎｄＩ［［及びＮ
ｃｏＩで消化し、ＢＧＨ（Ａ）をコードする配列を含む ｐＢＲ３２７ブラスミド５８０ｂｐのＤＮＡ断片を単離
した。５８０ｂｐＤＮ△断片は、次にＴ／ｌ ＤＮＡリ
ガーゼの存在で、あらかじめＮＣ０Ｉとｌ−１ｉｎｄ［
ｎで消化Ｌ／ ｆｃｐＭＯＮ５５１５と混合し、ＣＩＡ
Ｐで処理した。
い温度でハイブリッド温度を示したファージＤＮＡは、
同様にポテンシャルポジｉ′イヴと呼んだ。両方のスク
リーニング操作からの潜在陽性プラークは、上述の様に
培養し、ＳＳファージＤＮＡを作るのに使用した。３３
ｐ ｔｌ ａ Ｑ ｅＤＮＡを、次にｓａｎｇｅｒ
ら（１９７７）の方法によって配列決定を行った。ＢＧ
Ｍ （Ａ）をコードする配列及びＮＣ０Ｉ制限酵素部位
を含む得られた組み換えＭｌ ３ｍｐ９ファージＤＮＡ
をｏＮｃＤ８と表示した。（第９図をみよ。）第１０図
は、ＢＧＨ（Ａ）をコードする配列に操作的に結合させ
たＧ１０Ｌ配列を含むｐＢＲ３２７ブラスミドの構築を
示す。詳細には、ｐＮｃＤ８をト１ｉｎｄＩ［［及びＮ
ｃｏＩで消化し、ＢＧＨ（Ａ）をコードする配列を含む ｐＢＲ３２７ブラスミド５８０ｂｐのＤＮＡ断片を単離
した。５８０ｂｐＤＮ△断片は、次にＴ／ｌ ＤＮＡリ
ガーゼの存在で、あらかじめＮＣ０Ｉとｌ−１ｉｎｄ［
ｎで消化Ｌ／ ｆｃｐＭＯＮ５５１５と混合し、ＣＩＡ
Ｐで処理した。
混合物は、次にＥ、 Ｃｏ１１ ＪＭｌｏｌを形質
転換させるのに用い、形質転換細胞はアンピシリン含有
培地中の生長によって選択した。結果として得られたそ
の中に、ｐｒｅｃ配列、Ｇ１０Ｌ配置ｊ！ＩＢＧＨ（Ａ
）をコードするＤＮＡ配シ１が挿入されたプラスミドｐ
ＢＲ３２７を含む組み換えプラスミドをｐＭＯＮ５５３
９と称した。（第１０図を児よ。） Ｇ１０しの代りに、対照Ｒ，Ｂ、Ｓ、を含む、その他の
点では同一の、発現プラスミドの構築を図１２に示すよ
うに行った。プラスミドｏＮｃＤ８を、ＮＣＯＩ及びＨ
ｉｎｄｌｌｌＴ”消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーぜの存在下
で、あらかじめＮＣＯＩと、Ｉ−１ｉ ｎ ｄ Ｉ［［
で消化したｐＭＯＮ６００２と混合し、ＣＩＡＰで処理
した。
転換させるのに用い、形質転換細胞はアンピシリン含有
培地中の生長によって選択した。結果として得られたそ
の中に、ｐｒｅｃ配列、Ｇ１０Ｌ配置ｊ！ＩＢＧＨ（Ａ
）をコードするＤＮＡ配シ１が挿入されたプラスミドｐ
ＢＲ３２７を含む組み換えプラスミドをｐＭＯＮ５５３
９と称した。（第１０図を児よ。） Ｇ１０しの代りに、対照Ｒ，Ｂ、Ｓ、を含む、その他の
点では同一の、発現プラスミドの構築を図１２に示すよ
うに行った。プラスミドｏＮｃＤ８を、ＮＣＯＩ及びＨ
ｉｎｄｌｌｌＴ”消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーぜの存在下
で、あらかじめＮＣＯＩと、Ｉ−１ｉ ｎ ｄ Ｉ［［
で消化したｐＭＯＮ６００２と混合し、ＣＩＡＰで処理
した。
生じたプラスミドで形質転換し、形質転換細胞をアンピ
シリン含有培地にお番）る生育によりスクリーニングし
た。その結果得られた ｐＭＯＮ５５５１と名付けたＢＧＨ（Ａ＞をコードして
いる配列に操作的に結合した対照Ｓ、Ｏ。
シリン含有培地にお番）る生育によりスクリーニングし
た。その結果得られた ｐＭＯＮ５５５１と名付けたＢＧＨ（Ａ＞をコードして
いる配列に操作的に結合した対照Ｓ、Ｏ。
配列を含むプラスミドは、ＮｃｏＩと１１ｉｎｄｌｌで
消化し、５８０ｂｐ ＮｃｏＩ／Ｈｉｎｄ［Ｉ断片の
存在を決定することにより確かめた。
消化し、５８０ｂｐ ＮｃｏＩ／Ｈｉｎｄ［Ｉ断片の
存在を決定することにより確かめた。
以下の順番に操作的に結合したｒｅｃＡプロモーター、
Ｇ１０Ｌ配列、ＢＧＩ−１（Ａ）をコードする配列及び
゛翻訳 ターミネータ−断片“を含んでいるＢ Ｇ ＋
−１発現ベクターもここに記述した方法に従って構築し
た。ターミネータ−断ハについては、下の例２のｈ″の
項でより完全に記述する。
Ｇ１０Ｌ配列、ＢＧＩ−１（Ａ）をコードする配列及び
゛翻訳 ターミネータ−断片“を含んでいるＢ Ｇ ＋
−１発現ベクターもここに記述した方法に従って構築し
た。ターミネータ−断ハについては、下の例２のｈ″の
項でより完全に記述する。
このｐＭＯＮ５５５７と名付けたＢＧＨ発現ベクターは
、アンピシリン耐性マーカー、 ＤＢＲ３２７複装起点橢能も持っている。
、アンピシリン耐性マーカー、 ＤＢＲ３２７複装起点橢能も持っている。
ｄ、 ［ＰＴ（Ｉ）
ｒｅｃＡプロモーター、ＢｇｌＩＩ及び、Ｎ ｃ ｏ
Ｉ ｌｊｌ限部位が並列したＲ、Ｂ、Ｓ、（Ｉ！ｌｌち
、Ｇ１０Ｌ配列か対照Ｒ，Ｂ、Ｓ、）及びコード配列が
その出発点にＮｃｏＩ部位があり、ＩＰＴ（Ｉ）コード
配列の下流にト１ｉｎｄｌｕ部位を含むＩ ＰＴ Ｉ
（Ｇｏｌｄｂｅｒｑら、１９８４）をコードしているＤ
ＮＡ配列が挿入されているｐＢＲ３２７を含むＩＰ−ｒ
（Ｉ）のための発現ベクターが、ＡＰｇｅｎ発現ベクタ
ーと類似の方法で構築された。その結果１すられた一対
の表現ベクターは、一方がｐＭＯＮ２２２と名付けられ
、Ｇ１０Ｌ配列を含ｌυでおり、他方は、ｐＭＯＮ ５
５２５と名付けられ対照Ｒ，１３，Ｓ。
Ｉ ｌｊｌ限部位が並列したＲ、Ｂ、Ｓ、（Ｉ！ｌｌち
、Ｇ１０Ｌ配列か対照Ｒ，Ｂ、Ｓ、）及びコード配列が
その出発点にＮｃｏＩ部位があり、ＩＰＴ（Ｉ）コード
配列の下流にト１ｉｎｄｌｕ部位を含むＩ ＰＴ Ｉ
（Ｇｏｌｄｂｅｒｑら、１９８４）をコードしているＤ
ＮＡ配列が挿入されているｐＢＲ３２７を含むＩＰ−ｒ
（Ｉ）のための発現ベクターが、ＡＰｇｅｎ発現ベクタ
ーと類似の方法で構築された。その結果１すられた一対
の表現ベクターは、一方がｐＭＯＮ２２２と名付けられ
、Ｇ１０Ｌ配列を含ｌυでおり、他方は、ｐＭＯＮ ５
５２５と名付けられ対照Ｒ，１３，Ｓ。
（対照、Ｓ、Ｄ、）を含んでいた。
ｅ、 ＣＡＴ
Ｇ１０Ｌ配列及びＣＡＴをコードしている発現ベクター
の構築は、以下の通りである。ＣＡＴｍ伝子の配列は、
以前にＡｌｔｏｎ、 Ｎ、 Ｙ、及びＶａｐｎｃｋ。
の構築は、以下の通りである。ＣＡＴｍ伝子の配列は、
以前にＡｌｔｏｎ、 Ｎ、 Ｙ、及びＶａｐｎｃｋ。
Ｄ （１９７９）によって記述された。望むタンパク
を］−ドしているＤＮＡ配列の公表により、その技術を
もった人がこのようなコード配列を合成するか、従来の
技術によりＤＮＡライブラリーからコード配列を単離す
ることが十分可能となっている。この遺伝子を我々の標
準発現ベクターシステムに導入するために、オリゴヌク
レオチド志向位置特異性突然変異を用いて、ユニークな
制限酵素部位を遺伝子の出発点（ＮｃｏＩ）及び遺伝子
の下流（ＥｃｏＲＩ）に作った。これらの制限部位は、
２つの発現ベクターＤＭＯＮ５５１５及び５５１４（０
１０Ｌ及び対照Ｓ、Ｄ、をそれぞれ含んでいる）ＣＡＴ
ＤＮＡをコードする装置１１を含むＮｃｏＩ／ＥｃｏＲ
Ｉ断片は、ＡＰｇｅｎをコードするＤＮＡ配列のところ
で以前に述べたように、単離することができ、そして ｐＭＯＮ５５１５及びｐＭＯＮ５５１４の相当する制限
部位に挿入することができる。その結果得られる２つの
プラスミドは、ｒｅｃ△プロモーター、Ｒ，Ｂ、Ｓ、（
Ｇ１０Ｌか対照ＳＤ−配列）及びＣＡＴをコードするＤ
ＮＡ配９＋１が挿入されているプラスミドＤＢＲ３２７
からなり同一であろう。２つのＲ，Ｂ、Ｓ、配列の有効
性を比較するために使用した例は、それに加えてＣＡＴ
をコードする配列の下流に余分のＤＮＡ断片を持ってい
る。この断片は、複製の起点を含むＭ１３ファージの小
所片から成っている。この断片は、両方のＣＡＴのＤＮ
Ａを含んでいる構造体（０１０Ｌまたは対照ＳＤを含ん
でいる）に関して同じであり、２つのＲ，Ｂ、Ｓ、の相
対効率に影響しないはずである。
を］−ドしているＤＮＡ配列の公表により、その技術を
もった人がこのようなコード配列を合成するか、従来の
技術によりＤＮＡライブラリーからコード配列を単離す
ることが十分可能となっている。この遺伝子を我々の標
準発現ベクターシステムに導入するために、オリゴヌク
レオチド志向位置特異性突然変異を用いて、ユニークな
制限酵素部位を遺伝子の出発点（ＮｃｏＩ）及び遺伝子
の下流（ＥｃｏＲＩ）に作った。これらの制限部位は、
２つの発現ベクターＤＭＯＮ５５１５及び５５１４（０
１０Ｌ及び対照Ｓ、Ｄ、をそれぞれ含んでいる）ＣＡＴ
ＤＮＡをコードする装置１１を含むＮｃｏＩ／ＥｃｏＲ
Ｉ断片は、ＡＰｇｅｎをコードするＤＮＡ配列のところ
で以前に述べたように、単離することができ、そして ｐＭＯＮ５５１５及びｐＭＯＮ５５１４の相当する制限
部位に挿入することができる。その結果得られる２つの
プラスミドは、ｒｅｃ△プロモーター、Ｒ，Ｂ、Ｓ、（
Ｇ１０Ｌか対照ＳＤ−配列）及びＣＡＴをコードするＤ
ＮＡ配９＋１が挿入されているプラスミドＤＢＲ３２７
からなり同一であろう。２つのＲ，Ｂ、Ｓ、配列の有効
性を比較するために使用した例は、それに加えてＣＡＴ
をコードする配列の下流に余分のＤＮＡ断片を持ってい
る。この断片は、複製の起点を含むＭ１３ファージの小
所片から成っている。この断片は、両方のＣＡＴのＤＮ
Ａを含んでいる構造体（０１０Ｌまたは対照ＳＤを含ん
でいる）に関して同じであり、２つのＲ，Ｂ、Ｓ、の相
対効率に影響しないはずである。
ＣＡＴＤＮＡコード配列に操作によって結合した対照Ｓ
Ｄ配列を含む最終の構築した発現プラスミドをＤＭＯＮ
５６００と名付けた。
Ｄ配列を含む最終の構築した発現プラスミドをＤＭＯＮ
５６００と名付けた。
ＣＡ王ＯＮΔコード配列に操作によって結合したＧ１０
Ｌ配列を３む最終の構築した発現プラスミドをｐＭＯＮ
５５８２と名付けた。
Ｌ配列を３む最終の構築した発現プラスミドをｐＭＯＮ
５５８２と名付けた。
ｒ、 ＩａｃＺ
Ｉ ａｃＺをコードしているＤＮＡに、操作によって結
合しているＧ１０し配列を含む発現ベクターの構築は、
次の如くであった。プラスミドｐＮＭ４８０は、Ｎ、
Ｈｉｎｔｏｎ （Ｐｕｂｌｉｃ １ｌｅａｌｔｈＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ ５ｅｒｖｉｃｅ、 Ｐｏｒｔｏｎ Ｄ
ｏｗｎ、 ５ａｌｉｓｂｕｒｙ。
合しているＧ１０し配列を含む発現ベクターの構築は、
次の如くであった。プラスミドｐＮＭ４８０は、Ｎ、
Ｈｉｎｔｏｎ （Ｐｕｂｌｉｃ １ｌｅａｌｔｈＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ ５ｅｒｖｉｃｅ、 Ｐｏｒｔｏｎ Ｄ
ｏｗｎ、 ５ａｌｉｓｂｕｒｙ。
Ｕ、に、）から入手した。これは、旧１ｔｏｎ Ｎ、Ｐ
。
。
（１９８４）によって記述されている。手短かに述べる
と、ｐＮＭ４８０は、１ａｃＺ：］−ドｇＡｔｉｘの開
始点で始まるＥ、 Ｃｏ１１のＩａｃオペロンが挿入
されているＤＢＫ３２２誘導体のプラスミドを含んでい
る。ｐＮＭ４８０プラスミドを、ＮｃｏＩで消化し、ｌ
ａｃオペロンの３′の権限末端で切断した。次にこの端
をＤＮＡポリメラーゼ■のクレノーフラグメントで付着
端を埋め込むことによって破壊し、ＤＮＡを再結合した
。その結果生じたプラスミドは、Ｎｃｏ Ｉ部位の欠失
についてスクリーニングし、ＤＭＯＮ ５５２６と名付
けた。以前に述べたＤＭＯＮ５５１５プラスミドがｒＣ
ＣＡＣＣ上−ター及びＧ１０Ｌエレメンツの原料として
使用した。詳しくは、 ｐＭＯＮ５５１５をＡＶａＩとＮｃｏＩで消化し、プレ
バラテイヴアガロースゲル電気泳動によって比較的小さ
い断片をｌ離した。次に断片の端をＤＮＡポリメラーゼ
■のクレノ断）″ｉ処理によって、ブラント末端とした
。それからｐＭｏＮ５５２５をｌ ａｃＺコード領域の
開始点におｔプるマルチリンカに含まれるユニークなＳ
ｍａＩ部位で開裂ざぜ、ｐＭＯＮ５５１５から調整した
断片をそこにつないだ。出来上ったプラスミド ｐＭＯＮ ５５２７は、望みの位置、すなわち１ａＣＺ
コード領域の出発点にあるＮＣ０Ｉのすぐ上流に、ｒｅ
ｃ△プロモーターとＧ１０［を持っていた。
と、ｐＮＭ４８０は、１ａｃＺ：］−ドｇＡｔｉｘの開
始点で始まるＥ、 Ｃｏ１１のＩａｃオペロンが挿入
されているＤＢＫ３２２誘導体のプラスミドを含んでい
る。ｐＮＭ４８０プラスミドを、ＮｃｏＩで消化し、ｌ
ａｃオペロンの３′の権限末端で切断した。次にこの端
をＤＮＡポリメラーゼ■のクレノーフラグメントで付着
端を埋め込むことによって破壊し、ＤＮＡを再結合した
。その結果生じたプラスミドは、Ｎｃｏ Ｉ部位の欠失
についてスクリーニングし、ＤＭＯＮ ５５２６と名付
けた。以前に述べたＤＭＯＮ５５１５プラスミドがｒＣ
ＣＡＣＣ上−ター及びＧ１０Ｌエレメンツの原料として
使用した。詳しくは、 ｐＭＯＮ５５１５をＡＶａＩとＮｃｏＩで消化し、プレ
バラテイヴアガロースゲル電気泳動によって比較的小さ
い断片をｌ離した。次に断片の端をＤＮＡポリメラーゼ
■のクレノ断）″ｉ処理によって、ブラント末端とした
。それからｐＭｏＮ５５２５をｌ ａｃＺコード領域の
開始点におｔプるマルチリンカに含まれるユニークなＳ
ｍａＩ部位で開裂ざぜ、ｐＭＯＮ５５１５から調整した
断片をそこにつないだ。出来上ったプラスミド ｐＭＯＮ ５５２７は、望みの位置、すなわち１ａＣＺ
コード領域の出発点にあるＮＣ０Ｉのすぐ上流に、ｒｅ
ｃ△プロモーターとＧ１０［を持っていた。
Ｇｌ ｏｔ−配列の代りに、対照Ｒ，Ｂ、Ｓ、を含んで
いる、その曲の点では同一のプラスミドの建設は、以前
にＡｐｇｅｎ発現プラスミドについて記述したように行
われた。その結果得られた１）ＭＯＮ ５５ ’１０と
名付けたプラスミドは、ｒｅｃＡプロモーター、対照Ｒ
，Ｂ、Ｓ、及びｌ ａｃｌタンパクをコードするＤＮＡ
を含んでいる。
いる、その曲の点では同一のプラスミドの建設は、以前
にＡｐｇｅｎ発現プラスミドについて記述したように行
われた。その結果得られた１）ＭＯＮ ５５ ’１０と
名付けたプラスミドは、ｒｅｃＡプロモーター、対照Ｒ
，Ｂ、Ｓ、及びｌ ａｃｌタンパクをコードするＤＮＡ
を含んでいる。
（＋、 ＧＳ’Ｔ−Ｉ
ＧＳＴＩ発現ベクターは、△Ｐａｅｎのためのベクター
に類似の方法でｒｅｃＡプロモーター、ＢＱＩＩＩ及び
Ｎｃｏ Ｉ部位が隣接した、Ｒ，Ｂ、Ｓ、配列（即ち、
Ｇ１０［配列または対照Ｒ，Ｂ、Ｓ、配列）、Ｇ５Ｔｌ
をコードする領域の出発点にあるＮｅｏ １部位、Ｇ５
Ｔｌコード領域及びＧ５Ｔｌコード領域から下流の位置
にあるＥＣ０ＲＩが挿入されているＤＢＲ３２７ブラス
ミドを含むように構築された。６２４塩基対のトウモ〔
１コシ、Ｇ５Ｔｌコード配列は、次の部分的ＧＳＴペプ
チド配列に基いて、従来の手段によって単離することが
できる。
に類似の方法でｒｅｃＡプロモーター、ＢＱＩＩＩ及び
Ｎｃｏ Ｉ部位が隣接した、Ｒ，Ｂ、Ｓ、配列（即ち、
Ｇ１０［配列または対照Ｒ，Ｂ、Ｓ、配列）、Ｇ５Ｔｌ
をコードする領域の出発点にあるＮｅｏ １部位、Ｇ５
Ｔｌコード領域及びＧ５Ｔｌコード領域から下流の位置
にあるＥＣ０ＲＩが挿入されているＤＢＲ３２７ブラス
ミドを含むように構築された。６２４塩基対のトウモ〔
１コシ、Ｇ５Ｔｌコード配列は、次の部分的ＧＳＴペプ
チド配列に基いて、従来の手段によって単離することが
できる。
）牙
この式中、上に書いた数字は、２１４ケのアミノ酸から
なるＧ５Ｔｌタンパク中の、特定のアミノ酸の位置を示
す。その結果生じた一対のプラスミドは、対照Ｒ，Ｂ、
Ｓ、を含むものが、ＤＭＯＮ２０５４であり、Ｇ１０Ｌ
配列を含むものがｐＭＯＮ５５４１である。
なるＧ５Ｔｌタンパク中の、特定のアミノ酸の位置を示
す。その結果生じた一対のプラスミドは、対照Ｒ，Ｂ、
Ｓ、を含むものが、ＤＭＯＮ２０５４であり、Ｇ１０Ｌ
配列を含むものがｐＭＯＮ５５４１である。
ｈ、 ＰＧＨ
Ｇ１０Ｌまたは対照ＳＤ＝配列を含むＰＧＨに対する発
現ベクターは、次のように構築した。
現ベクターは、次のように構築した。
ＤｔＪＣ１８プラスミドを、ＥｃＯＲＩと５ａｌＩで開
裂し、次の配列を有するｐＵｃｌ ８ＤＮＡ断片を単離
した。
裂し、次の配列を有するｐＵｃｌ ８ＤＮＡ断片を単離
した。
Ｅｃｏｌｌ Ｓｍａｌ ５ａ
ｌ１５°−＾ΔｒＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧ
ＧＧ八ＴＣＣＴＣＴ八ＧＡＧ−３゜ＧＣＴＣＧＡＧへＣ
ＡＴＧＧＧへＣＣＣＴ八ＧＧＡＧ＾ＴＣＴＣ八ＧＣＴｐ
ＬＪｃへ８ＤＮ△を次に、次へ配列をもったＴ７遺伝子
１０ターミネータ−に連結した。
ｌ１５°−＾ΔｒＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧ
ＧＧ八ＴＣＣＴＣＴ八ＧＡＧ−３゜ＧＣＴＣＧＡＧへＣ
ＡＴＧＧＧへＣＣＣＴ八ＧＧＡＧ＾ＴＣＴＣ八ＧＣＴｐ
ＬＪｃへ８ＤＮ△を次に、次へ配列をもったＴ７遺伝子
１０ターミネータ−に連結した。
Ｘｈｏｌ ＥｃｏＲ
１５°−ＴＣＣＡＧＣ八■八ΔＣへＣへｒＴＧＧＧＧｃ
ｃＴｃｒ八ＡＡＣＧへＧＴＣＴＴＧＡＧＧＧＧＴｎＴＴ
ＴＧＣＴＧ−３゜ＣＧＴＡｒＴＧＧＧＧ＾＾ＣＣＣＣＧ
ＧＡＧＡＴＴＴＧＣＣＣＡＧＡＡ（ＪＣＣＣＣＡＡΔ八
品ＣＧＡＣｒへ＾＾ｐＵｃ１８ＤＮＡ断片の５ａｌＩ制
限酵素部位末端は、ターミネータ−配列のＸ ｈ ｏ
Ｉ ＩＩＩ限部位末端と塩基対を作ることができ、５ａ
ｌＩ及びＸｈｏＩ部位の両方を破壊する。かくして連結
の結果、その３′末端及び５′末端の両方に、ＥＣｏＲ
Ｉ部位を持った８６ｊ！２基対が生成する。
１５°−ＴＣＣＡＧＣ八■八ΔＣへＣへｒＴＧＧＧＧｃ
ｃＴｃｒ八ＡＡＣＧへＧＴＣＴＴＧＡＧＧＧＧＴｎＴＴ
ＴＧＣＴＧ−３゜ＣＧＴＡｒＴＧＧＧＧ＾＾ＣＣＣＣＧ
ＧＡＧＡＴＴＴＧＣＣＣＡＧＡＡ（ＪＣＣＣＣＡＡΔ八
品ＣＧＡＣｒへ＾＾ｐＵｃ１８ＤＮＡ断片の５ａｌＩ制
限酵素部位末端は、ターミネータ−配列のＸ ｈ ｏ
Ｉ ＩＩＩ限部位末端と塩基対を作ることができ、５ａ
ｌＩ及びＸｈｏＩ部位の両方を破壊する。かくして連結
の結果、その３′末端及び５′末端の両方に、ＥＣｏＲ
Ｉ部位を持った８６ｊ！２基対が生成する。
この８６ｂｐ［ｌＮＡ断片をパターミネータ−フラグメ
ント″と名付けた。
ント″と名付けた。
ターミネータ−断片の複数のコピーを、該断片をｐｔＪ
Ｃｌ ８プラスミドのＥｃｏＲＩ部位に導入１−ること
によって生成させ、ｐＭＯＮ２３１８と名付ｉ）だ組み
換えを作った。））ＭＯＮ２３１Ｂを、次に、前に記述
したように、アンピシリンを含む培地中で培養したＥ、
Ｃｏ１１ ＪＭ１０１中で増殖させた。
Ｃｌ ８プラスミドのＥｃｏＲＩ部位に導入１−ること
によって生成させ、ｐＭＯＮ２３１８と名付ｉ）だ組み
換えを作った。））ＭＯＮ２３１Ｂを、次に、前に記述
したように、アンピシリンを含む培地中で培養したＥ、
Ｃｏ１１ ＪＭ１０１中で増殖させた。
次に、ターミネータ−フラグメントを、以下のようにｐ
ＭＯＮ５５３９ （上記断片Ｃをみよ）に挿入した。Ｄ
ＭＯＮ２３１Ｂを単離し、ＥｃｏＲＩで消化し、８６塩
基対断片を、次にＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で、あら
かじめＥＣ０ＲＩで消化したｐＭＯＮ５５３９と混合し
、その結果、ｐＭＯＮ ５５５７というプラスミドを作
った。プラスミドｏＭＯＮ ５５５７は、以下の成分が
、順番に操作によって結合されている。即ち、ｒｅｃＡ
プロモーター、ＧＩ ＯＬ配列ＢＧＭ（Ａ）コード配列
、ターミネータ−フラグメン１〜を含んでいる。ｐＭＯ
Ｎ ５５５７は、アンピシリン耐性マーカーも含んでい
る。
ＭＯＮ５５３９ （上記断片Ｃをみよ）に挿入した。Ｄ
ＭＯＮ２３１Ｂを単離し、ＥｃｏＲＩで消化し、８６塩
基対断片を、次にＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で、あら
かじめＥＣ０ＲＩで消化したｐＭＯＮ５５３９と混合し
、その結果、ｐＭＯＮ ５５５７というプラスミドを作
った。プラスミドｏＭＯＮ ５５５７は、以下の成分が
、順番に操作によって結合されている。即ち、ｒｅｃＡ
プロモーター、ＧＩ ＯＬ配列ＢＧＭ（Ａ）コード配列
、ターミネータ−フラグメン１〜を含んでいる。ｐＭＯ
Ｎ ５５５７は、アンピシリン耐性マーカーも含んでい
る。
次に、ＰＧＨ（Ａ）タンパク（例えば、Ｎ末端アラニン
を含むブタ生長ホルモン）をコードするＤＮＡ配列を、
ＢＧＨ（Ａ＞コード配列の代りにＥ）ＭＯＮ５５５７に
、次の如く挿入した。
を含むブタ生長ホルモン）をコードするＤＮＡ配列を、
ＢＧＨ（Ａ＞コード配列の代りにＥ）ＭＯＮ５５５７に
、次の如く挿入した。
ＮｃｏＩ制限部位を、オリゴヌクレオチド志向位置特異
的突然変異誘発によってＤＭＯＮ３２１３に存在してい
る１）ＧＨ（Ａ）：］−ド配列の５′末端に導入した。
的突然変異誘発によってＤＭＯＮ３２１３に存在してい
る１）ＧＨ（Ａ）：］−ド配列の５′末端に導入した。
ｐＭＯＮ３２１３は、寄託番号５３０２３の下に、ＡＴ
ＣＣから入手できるが、ヨーロッパ特許出願公告ＩＪｎ
１９３．５１５ （１９８６年９月発行）に記されてお
り、本特許に参照としてつけ加えておく。詳しくいうと
、 ｐＭＯＮ３２１３をＥｃｏＲＩと）−１ｉｎｄＩＩで切
断し、生じた５９０ｂＤ断片を単離し、Ｍ１３ｆｆｌＤ
１９に挿入した。その結果生じた組み換え、Ｍ１３１１
１１）１９ＤＮＡを、組み換えＭ１３ｍｐ１９ＤＮ△中
のチミジンの位置の部分にウラシル残塁を導入するため
に、にｕｎｋｅｌ （１９８５）の操作に従って、旦−
Ｃ０１１菌株ＢＷ３１３中を２回継代させた。組み換え
Ｍ１３ｍｐ１９ＤＮＡの単鎖ＤＮＡを、＋ｅｓｓ ｒ
ｎｇら（１９８２）の方法に従って単離し、２ｏ１１ｅ
ｒとＳｍ１ｔｈ （１９８２，１９８３）及びＮｏｒ
ｒｉｓら（１９８３）に記述された如く、オリゴヌクレ
オチド志向位置特異的突然変異誘発において、テンプレ
ートとして用いた。相同ＤＮＡ鎖のｉｎ ｖｉｔｒｏ
合或は、以下の２７塩基のオリゴヌクレオチドブライマ
ー配列でプライムした。
ＣＣから入手できるが、ヨーロッパ特許出願公告ＩＪｎ
１９３．５１５ （１９８６年９月発行）に記されてお
り、本特許に参照としてつけ加えておく。詳しくいうと
、 ｐＭＯＮ３２１３をＥｃｏＲＩと）−１ｉｎｄＩＩで切
断し、生じた５９０ｂＤ断片を単離し、Ｍ１３ｆｆｌＤ
１９に挿入した。その結果生じた組み換え、Ｍ１３１１
１１）１９ＤＮＡを、組み換えＭ１３ｍｐ１９ＤＮ△中
のチミジンの位置の部分にウラシル残塁を導入するため
に、にｕｎｋｅｌ （１９８５）の操作に従って、旦−
Ｃ０１１菌株ＢＷ３１３中を２回継代させた。組み換え
Ｍ１３ｍｐ１９ＤＮＡの単鎖ＤＮＡを、＋ｅｓｓ ｒ
ｎｇら（１９８２）の方法に従って単離し、２ｏ１１ｅ
ｒとＳｍ１ｔｈ （１９８２，１９８３）及びＮｏｒ
ｒｉｓら（１９８３）に記述された如く、オリゴヌクレ
オチド志向位置特異的突然変異誘発において、テンプレ
ートとして用いた。相同ＤＮＡ鎖のｉｎ ｖｉｔｒｏ
合或は、以下の２７塩基のオリゴヌクレオチドブライマ
ー配列でプライムした。
ＥｃｏＲｌ Ｎｃａｌ
１０ｔａｌａｐｒ＋ｅｐｒ。
ＣへＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡ
ＧＣ２番目の（例えば相同な）ＤＮＡ鎖の合成に続いて
、そのＤＮＡを、野性型、旦エ Ｃｏ１１株ＪＭ１０１
に導入し、変異したＤＮＡを含んでいるプラークを強化
した。
ＧＣ２番目の（例えば相同な）ＤＮＡ鎖の合成に続いて
、そのＤＮＡを、野性型、旦エ Ｃｏ１１株ＪＭ１０１
に導入し、変異したＤＮＡを含んでいるプラークを強化
した。
野性型［−Ωユｏｌｉ−株ＪＭ１０１に変異したＤＮＡ
を挿入することにより、４つのはつきりしたプラークが
出した。プラークを選択し、３７℃で２ＸＹＴ培地中で
一夜生育させた。単鎖ＤＮＡを調製し、Ｓａｎｇｅｒら
（１９７７）のｄｉｄｉｏｘｙｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄにより配列を決定した。配列
を決めた４つのＤＮＡのうち２つが、ＮＣ０Ｉの部位を
含んでいた。さらに、υ１限酵素部位が存在することが
、Ｎｃｏ Ｉ分解によってまたｍａされた。Ｍ１３ｍｐ
１９にクローニングされた５′末端に、ＮｃｏＩを持っ
たＰＧＨ（Ａ）遺伝子をｐＭＯＮ ３２６７と名付けた
。
を挿入することにより、４つのはつきりしたプラークが
出した。プラークを選択し、３７℃で２ＸＹＴ培地中で
一夜生育させた。単鎖ＤＮＡを調製し、Ｓａｎｇｅｒら
（１９７７）のｄｉｄｉｏｘｙｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄにより配列を決定した。配列
を決めた４つのＤＮＡのうち２つが、ＮＣ０Ｉの部位を
含んでいた。さらに、υ１限酵素部位が存在することが
、Ｎｃｏ Ｉ分解によってまたｍａされた。Ｍ１３ｍｐ
１９にクローニングされた５′末端に、ＮｃｏＩを持っ
たＰＧＨ（Ａ）遺伝子をｐＭＯＮ ３２６７と名付けた
。
次にｐＭＯＮ３２６７を、ＮｃｏＩと
ト１ｉｎｄｌＩ［ｒ消化した後、ＰＧＩ−１（Ａ）をコ
ードするＤＮＡをＮｃｏＩ／Ｈｉ ｎｄｌｎとして単離
した。次に、Ｔ４ＤＮ△リガーぜの存在下ｐＧＨ（Ａ＞
をコードするＤＮＡ配列を、あらかじめＮｃｏＩと１１
ｉｎｄｌ［［で消化したＤＭＯＮ ５５５７８１合り、
ｔｃ。ｐＭＯＮ ５４６７と名付けた。次に、その結
果生じた ＤＭＯＮ５６４７を用いてＥ Ｃｏ１１
−ＪＭｌｏｌを形質転換し、アンピシリンを含む培地に
生長させ、形質転換細胞を選択した。
ードするＤＮＡをＮｃｏＩ／Ｈｉ ｎｄｌｎとして単離
した。次に、Ｔ４ＤＮ△リガーぜの存在下ｐＧＨ（Ａ＞
をコードするＤＮＡ配列を、あらかじめＮｃｏＩと１１
ｉｎｄｌ［［で消化したＤＭＯＮ ５５５７８１合り、
ｔｃ。ｐＭＯＮ ５４６７と名付けた。次に、その結
果生じた ＤＭＯＮ５６４７を用いてＥ Ｃｏ１１
−ＪＭｌｏｌを形質転換し、アンピシリンを含む培地に
生長させ、形質転換細胞を選択した。
ｐＭＯＮ５６４７は、順番に、操作的に結合した次のＤ
ＮＡ断片を含んでいた。即ち、ｒｅｃＡプロモーター、
Ｇ１０Ｌ（例えば１０４ ｂｐ）配列、ＰＧＩ−１（Ａ
）コード配列及びターミネータ−断片である。Ｇ１０Ｌ
配列の代りに、Ｒ，Ｂ、Ｓ。
ＮＡ断片を含んでいた。即ち、ｒｅｃＡプロモーター、
Ｇ１０Ｌ（例えば１０４ ｂｐ）配列、ＰＧＩ−１（Ａ
）コード配列及びターミネータ−断片である。Ｇ１０Ｌ
配列の代りに、Ｒ，Ｂ、Ｓ。
（例えば対照ＳＤ−配列）を含み、その他の点では同一
の、ＰＧＨ（Ａ）発現ベクターを次に構築した。以前に
記述し、第１２図に示してあるプラスミドｐＭＯＮ５５
５１をＮＣ０Ｉとｐｓｔｌで切断し、プラスミド複製起
点、ｒｅｃΔプロモーター（ＰｒｅＧ）及び対照ＳＤ−
配列を含むＤＮΔ断ハを精製し、Ｔ４ＤＮΔリガーゼの
存在でｐＧ！−１（Ａ）を侍っているＮｃｏＩ／Ｐｓｔ
Ｉ断片及び、あらかじめＮＣ０ＩとＰｓｔＩで消化した
ＤＭＯＮ５６４７ブラスミドから精製したり−ミネータ
ーと混同した。その結果、結合混合物から、以下の順番
に操作によって結合させたＤＮＡ断片を含んでいるｐＨ
０Ｎ５５１４と名付けた組み換えプラスミドが生成した
。即らｒｅｃＡプロモーター、対照Ｒ，１３，Ｓ、、Ｐ
ＧＨ（Ａ）］−ド配列及び転写終結配列が含まれている
。プラスミドｐＭＯＮ５７１５は、アンピシリン耐性と
プラスミドｐ Ｂ Ｒ３２７の増殖起点機能を含んでい
た。
の、ＰＧＨ（Ａ）発現ベクターを次に構築した。以前に
記述し、第１２図に示してあるプラスミドｐＭＯＮ５５
５１をＮＣ０Ｉとｐｓｔｌで切断し、プラスミド複製起
点、ｒｅｃΔプロモーター（ＰｒｅＧ）及び対照ＳＤ−
配列を含むＤＮΔ断ハを精製し、Ｔ４ＤＮΔリガーゼの
存在でｐＧ！−１（Ａ）を侍っているＮｃｏＩ／Ｐｓｔ
Ｉ断片及び、あらかじめＮＣ０ＩとＰｓｔＩで消化した
ＤＭＯＮ５６４７ブラスミドから精製したり−ミネータ
ーと混同した。その結果、結合混合物から、以下の順番
に操作によって結合させたＤＮＡ断片を含んでいるｐＨ
０Ｎ５５１４と名付けた組み換えプラスミドが生成した
。即らｒｅｃＡプロモーター、対照Ｒ，１３，Ｓ、、Ｐ
ＧＨ（Ａ）］−ド配列及び転写終結配列が含まれている
。プラスミドｐＭＯＮ５７１５は、アンピシリン耐性と
プラスミドｐ Ｂ Ｒ３２７の増殖起点機能を含んでい
た。
例３
本例では、Ｇ１０Ｌ配列か、もしくは対照Ｒ，Ｂ、 Ｓ
、（例えば、対照ＳＤ−配列）を用いて、ＥＬ Ｃｏ１
１中に生産された種々のタンパクの蓄積の比較について
述べる。
、（例えば、対照ＳＤ−配列）を用いて、ＥＬ Ｃｏ１
１中に生産された種々のタンパクの蓄積の比較について
述べる。
Ｅ、 Ｃｏ１１ ＪＭ１０ＩもしくはＷ３１１０＄
１ｌ１１１を次の表現ベクターの１つで形質転換した。
１ｌ１１１を次の表現ベクターの１つで形質転換した。
１］ＨＯＮ６００２． Ｉ）ＨＯＮ５５３７． ＦＩＨ
ＯＮ５り４０． ＤＨＯＮ５５２７゜ｐＨ０Ｎ５６００
． ｐＨ０Ｎ５５８２□１）８０８５５４１． ｐＨ０
Ｎ２０５４゜ｐＨ０Ｎ５５５１． ｐＨ０Ｎ５５３９．
ｐＨ０Ｎ５５１４． ｐＨ０Ｎ５５１５゜ｐＨ０８５
６４７，Ｏｒ ｐＨ０Ｎ５７１５゜これらの構造は、
上述の例に記述しである。タンパクの生産は次のように
測定した。タンパク特異的活性をＥＰＳＰ、Ｉ ａｃＺ
、ＣＡＴ及びＧ５Ｔｌについて、以前に記したように測
定した。
ＯＮ５り４０． ＤＨＯＮ５５２７゜ｐＨ０Ｎ５６００
． ｐＨ０Ｎ５５８２□１）８０８５５４１． ｐＨ０
Ｎ２０５４゜ｐＨ０Ｎ５５５１． ｐＨ０Ｎ５５３９．
ｐＨ０Ｎ５５１４． ｐＨ０Ｎ５５１５゜ｐＨ０８５
６４７，Ｏｒ ｐＨ０Ｎ５７１５゜これらの構造は、
上述の例に記述しである。タンパクの生産は次のように
測定した。タンパク特異的活性をＥＰＳＰ、Ｉ ａｃＺ
、ＣＡＴ及びＧ５Ｔｌについて、以前に記したように測
定した。
Ｂ Ｇ ＨとＡＰＱｅｎのタンパク蓄積は、以前に記述
したように、ウエスターンインムノブロツティングによ
って測定した。ＩＰＴＩの蓄積は、以前に記述したよう
に、染色タンパクグルのデンシトメトリーによって測定
した。ＰＧＨの蓄積は、１５％（ｗ／ｖ ） ｓｏｄｉ
ｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｅ ５ｕｌｐｈａｔｅｐｏｌｙａ
ｃｒｙ−１ａ１ｄｅ ｇｅｌ （Ｌａｅｍｍｌｉ、
１９７ Ｑを見よ。）上で分離した後、ＣＯＯ１ａＳ
Ｓｉｅ Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔＢｌｕｅで染めた全細胞タ
ンパクの可視的検査によって決定した。
したように、ウエスターンインムノブロツティングによ
って測定した。ＩＰＴＩの蓄積は、以前に記述したよう
に、染色タンパクグルのデンシトメトリーによって測定
した。ＰＧＨの蓄積は、１５％（ｗ／ｖ ） ｓｏｄｉ
ｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｅ ５ｕｌｐｈａｔｅｐｏｌｙａ
ｃｒｙ−１ａ１ｄｅ ｇｅｌ （Ｌａｅｍｍｌｉ、
１９７ Ｑを見よ。）上で分離した後、ＣＯＯ１ａＳ
Ｓｉｅ Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔＢｌｕｅで染めた全細胞タ
ンパクの可視的検査によって決定した。
下のＴａｂｌｅ Ｉ中に示してあるように、Ｇ１０Ｌ配
列を含む発現プラスミドは、生産されるタンパクすべて
に対し、タンパクの蓄積を有意に増強した。タンパク蓄
積のより好ましい増強は、Ｂ Ｇ Ｈ１ΔＰｇｅｎ、Ｉ
ＰＴＩ、Ｇ５Ｔｌ及び１ａｃＺについて達成され、最も
望ましい増強は、ＢＧＭとＩＰＴＩについて達成された
。
列を含む発現プラスミドは、生産されるタンパクすべて
に対し、タンパクの蓄積を有意に増強した。タンパク蓄
積のより好ましい増強は、Ｂ Ｇ Ｈ１ΔＰｇｅｎ、Ｉ
ＰＴＩ、Ｇ５Ｔｌ及び１ａｃＺについて達成され、最も
望ましい増強は、ＢＧＭとＩＰＴＩについて達成された
。
表 ■
タンパク蓄積相対偵
遺伝子 対照ＳＤ−配列 Ｇ１０Ｌ配列ＢＧＨ
１４００ ＡＰＱｅｎ １ ５０ＩＰＴ
Ｉ １ ３４０ＧＳＴ
Ｉ １ １００１ａｃ Ｚ
１ １００ＣＡＴ
１ １．６ＥＰＳＰ １
１２ＰＧＨ１７ 例４ この例は、Ｇ１０Ｌ配列を含む表現ベクターを用いたＥ
、 Ｃｏ１１宿主細胞中で生産されるタンパクの蓄積へ
の異なるプロモーターの効果を記述する。
１４００ ＡＰＱｅｎ １ ５０ＩＰＴ
Ｉ １ ３４０ＧＳＴ
Ｉ １ １００１ａｃ Ｚ
１ １００ＣＡＴ
１ １．６ＥＰＳＰ １
１２ＰＧＨ１７ 例４ この例は、Ｇ１０Ｌ配列を含む表現ベクターを用いたＥ
、 Ｃｏ１１宿主細胞中で生産されるタンパクの蓄積へ
の異なるプロモーターの効果を記述する。
操作的にｒｅｃ△トリプトファン（ｔｒｐ）もしくはＰ
、プロモーターに結合さゼた０１０Ｌ配列とＢ Ｇ Ｍ
もしくはＡＰＱｅｎコード配列を含む発現ベクターを構
築した。ｒｅｃＡプロモーター、Ｇ１０Ｌ配列及びＡＰ
ａｅｎもしくは両方のＤＮＡコード配列を含む発現ベク
ターの構築は、上記例２で記した通りである。ｒｅｃ△
プロモーターの代りにｔｒｐもしくはＰ、プロモーター
のいずれかを含む、その他の点では同等なベクターは、
手短かに述べれば次のように構築できる。
、プロモーターに結合さゼた０１０Ｌ配列とＢ Ｇ Ｍ
もしくはＡＰＱｅｎコード配列を含む発現ベクターを構
築した。ｒｅｃＡプロモーター、Ｇ１０Ｌ配列及びＡＰ
ａｅｎもしくは両方のＤＮＡコード配列を含む発現ベク
ターの構築は、上記例２で記した通りである。ｒｅｃ△
プロモーターの代りにｔｒｐもしくはＰ、プロモーター
のいずれかを含む、その他の点では同等なベクターは、
手短かに述べれば次のように構築できる。
ＲｏｓｃｎｂｅｒｇとＣｏｕｒｔ （１９７９）に記
述されたｔｒｐとＰ、プロモーターはともに、従来法で
化学的に合成することができる。別法として、ｔｒｐプ
ロモーターは、５ｅｃｂｕ ｒｇら（１９８３）によっ
て記されたように、プラスミド ｐ Ｂ ｌ−Ｉ Ｇ から単離することができる
。そし０Ｘ−１゜ て、ＰＬプロモーターは、ＡＴＣＣに寄託され、Ｎ（１
６７０４３が与えられているｐＭｏＮ５５１゜から単離
することができる。次に、３ａｌｉの部位は、従来法で
プロモーター配列の５′末端に挿入出来、Ｂ ａ ｍ
ｌ−Ｉ Ｉ部位は、同様にプロモーター配列の３′末端
に挿入できる。ｔｒｐもしくはＰ１プロモーター配列は
、次に、以前に記した方法に従って、ｒｅｃＡブＯモー
ターの代りに、ｐＭＯＮ５５１５またはｐＭＯＮ５５３
９プラスミドに挿入することができる。このような方法
で、ｔｒｐプロモーター、０１０Ｌ配列及びＢＧＨコー
ド配列を含む発現ベクター、ｔｒｐブＯモーター、Ｇ１
０Ｌ配列及びＡＰＱｅｎコード配列を含む発現ベクター
、または、ｌａｍｂｄａ Ｐ、プロモーター、Ｇ１０
し配列及びＢＧＨコード配列を含む発現ベクターもしく
はＰＬプロモーター、Ｇ１０Ｌ配列とＡＰ（ｊｅｎコー
ド配列を含む発現ベクターを構築した。旦＝ ＣＯＩ
ｉＣｏｌｌＪまたはＷ３１１０は、次にその発現ベクタ
ーの１つで形質転換し、ＢＧＨと、ＡＰＱｅｎの蓄積レ
ベルを、以前に記述したように測定した。
述されたｔｒｐとＰ、プロモーターはともに、従来法で
化学的に合成することができる。別法として、ｔｒｐプ
ロモーターは、５ｅｃｂｕ ｒｇら（１９８３）によっ
て記されたように、プラスミド ｐ Ｂ ｌ−Ｉ Ｇ から単離することができる
。そし０Ｘ−１゜ て、ＰＬプロモーターは、ＡＴＣＣに寄託され、Ｎ（１
６７０４３が与えられているｐＭｏＮ５５１゜から単離
することができる。次に、３ａｌｉの部位は、従来法で
プロモーター配列の５′末端に挿入出来、Ｂ ａ ｍ
ｌ−Ｉ Ｉ部位は、同様にプロモーター配列の３′末端
に挿入できる。ｔｒｐもしくはＰ１プロモーター配列は
、次に、以前に記した方法に従って、ｒｅｃＡブＯモー
ターの代りに、ｐＭＯＮ５５１５またはｐＭＯＮ５５３
９プラスミドに挿入することができる。このような方法
で、ｔｒｐプロモーター、０１０Ｌ配列及びＢＧＨコー
ド配列を含む発現ベクター、ｔｒｐブＯモーター、Ｇ１
０Ｌ配列及びＡＰＱｅｎコード配列を含む発現ベクター
、または、ｌａｍｂｄａ Ｐ、プロモーター、Ｇ１０
し配列及びＢＧＨコード配列を含む発現ベクターもしく
はＰＬプロモーター、Ｇ１０Ｌ配列とＡＰ（ｊｅｎコー
ド配列を含む発現ベクターを構築した。旦＝ ＣＯＩ
ｉＣｏｌｌＪまたはＷ３１１０は、次にその発現ベクタ
ーの１つで形質転換し、ＢＧＨと、ＡＰＱｅｎの蓄積レ
ベルを、以前に記述したように測定した。
下記の表■において示されているように、Ｇ１０Ｌ配列
とＢ Ｇ ＨまたはＡＰＱｅｎ＝＋−ド配列に操作によ
り結合させた種々のプロモーターに関して、本質的に同
等のタンパク蓄積の増強が達成された。ＥＬ Ｃｏ１１
において、ＢＧＨもしくはＡＰＱｅｎに用いられた発現
ベクターに対する、より好ましいプロモーターは、ｒｅ
ｃＡ及びｔｒｉｐプロモーターであると決定された。
とＢ Ｇ ＨまたはＡＰＱｅｎ＝＋−ド配列に操作によ
り結合させた種々のプロモーターに関して、本質的に同
等のタンパク蓄積の増強が達成された。ＥＬ Ｃｏ１１
において、ＢＧＨもしくはＡＰＱｅｎに用いられた発現
ベクターに対する、より好ましいプロモーターは、ｒｅ
ｃＡ及びｔｒｉｐプロモーターであると決定された。
ｒｅｃＡ
ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ
Ｌａｌｌｔｌｄａ Ｐ ＋＋＋
＋＋申プロモーターは、すべて、発現ベクターの中に含
まれるＧ１０Ｌ配列に、操作によって結合された。
＋＋申プロモーターは、すべて、発現ベクターの中に含
まれるＧ１０Ｌ配列に、操作によって結合された。
−（＋）は、以前に述べたように、５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルのタンパク染色によって測定した場合の、
タンパクの相対的蓄積レベルを表している。
ルアミドゲルのタンパク染色によって測定した場合の、
タンパクの相対的蓄積レベルを表している。
■１
この例は、バクテリアにおいて第１図に示したＧ１０Ｌ
を含む発現ベクターと木質的に同じレベルまでタンパク
生産を増強することが見出された、第２図に示されたＧ
１０Ｌ配列を含む発現ベクターの構築を示している。
を含む発現ベクターと木質的に同じレベルまでタンパク
生産を増強することが見出された、第２図に示されたＧ
１０Ｌ配列を含む発現ベクターの構築を示している。
発現ベクターｐＭＯＮ５５１５を、制限酵素ＡｐａＩ及
びＸｂａＩで消化した。プラスミドの末端を次にＥ、
Ｃｏ１１ ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレー断片と共
に、各２５０μＭの濃度で、すべての４つのヌクレオチ
ドトリフォスフニー１−（ｄＮＴＰＳ）の存在下でイン
キュベートすることにより、２本鎖に揃えた。室温で５
分間インキュベートした後、すべての酵素は、ｄｉｅｔ
ｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ （６０％（Ｖ／
Ｖ ）エタノール中の溶液）を、１／１０ｆｆｌ加えて
不活性化した。その後、ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａ
ｒｂｏｎａｔｅは、６５℃５分加熱して破壊した。プラ
スミドは、それからＴ４ＤＮＡリガーゼで再び結合させ
た。これらの手段により、Ａｐａ Ｉ部位からＸｂａＩ
部位内に含まれるＧ１０Ｌ配列の塩基８から５９（第１
図）が演去され、第２図に示されるＧＩ ＯＬを含むｐ
ＭＯＮ ５５２１と名付ｔノだ発現ベクターを生じた。
びＸｂａＩで消化した。プラスミドの末端を次にＥ、
Ｃｏ１１ ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレー断片と共
に、各２５０μＭの濃度で、すべての４つのヌクレオチ
ドトリフォスフニー１−（ｄＮＴＰＳ）の存在下でイン
キュベートすることにより、２本鎖に揃えた。室温で５
分間インキュベートした後、すべての酵素は、ｄｉｅｔ
ｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ （６０％（Ｖ／
Ｖ ）エタノール中の溶液）を、１／１０ｆｆｌ加えて
不活性化した。その後、ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａ
ｒｂｏｎａｔｅは、６５℃５分加熱して破壊した。プラ
スミドは、それからＴ４ＤＮＡリガーゼで再び結合させ
た。これらの手段により、Ａｐａ Ｉ部位からＸｂａＩ
部位内に含まれるＧ１０Ｌ配列の塩基８から５９（第１
図）が演去され、第２図に示されるＧＩ ＯＬを含むｐ
ＭＯＮ ５５２１と名付ｔノだ発現ベクターを生じた。
Ｅ、 Ｃｏ１１ ＪＭ１０１宿主細胞はｐＭＯＮ５
５１５かＤＭＯＮ ５５２１のいずれかで形質変換した
。このようにして形質変換したＥ、 Ｃｏ１１［ｌ胞
において生産された△Ｐｇｅｎのレベルを、次に、以前
に示したように決定し、第１図または第２図において示
されているＧ１０Ｌ配列のいずれかが用いられた場合、
本質的に同等であることが示された。
５１５かＤＭＯＮ ５５２１のいずれかで形質変換した
。このようにして形質変換したＥ、 Ｃｏ１１［ｌ胞
において生産された△Ｐｇｅｎのレベルを、次に、以前
に示したように決定し、第１図または第２図において示
されているＧ１０Ｌ配列のいずれかが用いられた場合、
本質的に同等であることが示された。
８に
の例は、Ｇ１０［配列の長さが、ヌクレオチド７から９
迄短かくなっても、バクテリア中に、タンパク生産増強
効果を上げることができるということを示す。さらに、
この例はＧ１０Ｌ配列が、遺伝子内のさまざまな位置に
おいて挿入され、それでも、バクテリア中において望む
貢質タンパクの生産増強を起Ｊことができることを示し
ている。
迄短かくなっても、バクテリア中に、タンパク生産増強
効果を上げることができるということを示す。さらに、
この例はＧ１０Ｌ配列が、遺伝子内のさまざまな位置に
おいて挿入され、それでも、バクテリア中において望む
貢質タンパクの生産増強を起Ｊことができることを示し
ている。
この例６で用いられるＧ１０Ｌ配列は、図３で同定され
たＧ１０Ｌ １６８ ｒＲＮＡボモロシ−配列のＤ
ＮＡ等価物を含んでいるか、またはその断片を含ｌυで
い°る。詳しくは、以下の配列のヌクレオチドの１つを
含むＧ１０Ｌ配列が用いられた。
たＧ１０Ｌ １６８ ｒＲＮＡボモロシ−配列のＤ
ＮＡ等価物を含んでいるか、またはその断片を含ｌυで
い°る。詳しくは、以下の配列のヌクレオチドの１つを
含むＧ１０Ｌ配列が用いられた。
５’−ＴＴＡＡＣＴＴＴ八−３°、 ０「５°−ＡＡＣ
ＴＴＴＡ−３°、０「 ５°−ＴＴＡＡＣＴＴ−３゜ ａ、 該配列が、バクテリアにおいて異質タンパクの生
産を増強できるかどうかを証明するために、Ｇ１０Ｌ配
列が存在するかしないかだけが違っている発現ベクター
を構築した。例えば、対照ＳＤ−配列を含むＧＳＴ ［
発現ベクターと、対照ＳＤ−配列からすぐ上流にＧ１０
Ｌ １６ＳｒＲＮＡホモロジ一配列を含む、その他の
点では同一のＧ５Ｔｌ発現ベクターとを、 旦エ Ｃ０１ｉにおいて、Ｇ５Ｔｌの生産を行うことが
できるそれぞれの能力について比較した。
ＴＴＴＡ−３°、０「 ５°−ＴＴＡＡＣＴＴ−３゜ ａ、 該配列が、バクテリアにおいて異質タンパクの生
産を増強できるかどうかを証明するために、Ｇ１０Ｌ配
列が存在するかしないかだけが違っている発現ベクター
を構築した。例えば、対照ＳＤ−配列を含むＧＳＴ ［
発現ベクターと、対照ＳＤ−配列からすぐ上流にＧ１０
Ｌ １６ＳｒＲＮＡホモロジ一配列を含む、その他の
点では同一のＧ５Ｔｌ発現ベクターとを、 旦エ Ｃ０１ｉにおいて、Ｇ５Ｔｌの生産を行うことが
できるそれぞれの能力について比較した。
Ｇ５Ｔｌベクターを含んでいる配列は、以下の合成配列
を含ｌυでいた。即ち、 峰峰峰峰＾ せせ材士 ５°−ＧＡｒＣＴＴＴＴＡＡＣＴＴＴ八Ｇ１＾ＡＧＧＡ
ＧＴＣＴＡへＡＣ−３゜ＡＡＡ八ＴへＧ八ＡへＴＣＡＴ
ＴＣＣＴＣＡＧ＾ＴＣＴＧＧＴＡにこで、星（勇）１ま
、Ｇ１０Ｌ １６ＳｒＲＮＡホ０モジ配列を表し、短
剣（↑）はＳＤ−配列を示し、ＡＴＧ開始コドンは、下
線を引いたヌクレオチドで示されている。上の合成二重
鎖ＤＮＡ配列は、該配列が、ここに以前に述べた方法に
従ってＧ５Ｔｌ遺伝子に挿入できるように、一方の端に
ＢＱＩＩＩ部位、そして、他方の端に、ＮＣＯＩ部位を
含むように、上記合成二重鎖ＤＮＡを構築した。これら
のＧ５Ｔｌ発現ベクターの１つで形質転換した旦エ Ｃ
ｏ１１を、次に、以前に述べた方法により、Ｇ Ｓ Ｔ
Ｉタンパク生産について測定を行った。Ｇ Ｓ Ｔ
Ｉ生産測定の結果、Ｇ１０Ｌ １６８ ｒＲＮＡホ
モ〔１ジ一配列を含むベクターで形質転換した旦エ Ｃ
ｏ１１中で生産されたＧ５Ｔｌが、Ｇ１０Ｌ １６Ｓ
ｒＲＮＡホモロジ一配列を欠いている、その他の点では
同一のＧ５Ｔｌ発現ベクターで形質変換した、Ｅ、 Ｃ
ｏ１１と比較して、２０ｇＩＪ増加していることがわか
った。
を含ｌυでいた。即ち、 峰峰峰峰＾ せせ材士 ５°−ＧＡｒＣＴＴＴＴＡＡＣＴＴＴ八Ｇ１＾ＡＧＧＡ
ＧＴＣＴＡへＡＣ−３゜ＡＡＡ八ＴへＧ八ＡへＴＣＡＴ
ＴＣＣＴＣＡＧ＾ＴＣＴＧＧＴＡにこで、星（勇）１ま
、Ｇ１０Ｌ １６ＳｒＲＮＡホ０モジ配列を表し、短
剣（↑）はＳＤ−配列を示し、ＡＴＧ開始コドンは、下
線を引いたヌクレオチドで示されている。上の合成二重
鎖ＤＮＡ配列は、該配列が、ここに以前に述べた方法に
従ってＧ５Ｔｌ遺伝子に挿入できるように、一方の端に
ＢＱＩＩＩ部位、そして、他方の端に、ＮＣＯＩ部位を
含むように、上記合成二重鎖ＤＮＡを構築した。これら
のＧ５Ｔｌ発現ベクターの１つで形質転換した旦エ Ｃ
ｏ１１を、次に、以前に述べた方法により、Ｇ Ｓ Ｔ
Ｉタンパク生産について測定を行った。Ｇ Ｓ Ｔ
Ｉ生産測定の結果、Ｇ１０Ｌ １６８ ｒＲＮＡホ
モ〔１ジ一配列を含むベクターで形質転換した旦エ Ｃ
ｏ１１中で生産されたＧ５Ｔｌが、Ｇ１０Ｌ １６Ｓ
ｒＲＮＡホモロジ一配列を欠いている、その他の点では
同一のＧ５Ｔｌ発現ベクターで形質変換した、Ｅ、 Ｃ
ｏ１１と比較して、２０ｇＩＪ増加していることがわか
った。
ｂ、対照ＳＤ−配列を含むＧ５Ｔｌ発現ベクターも、７
ケのヌクレオチド０１０Ｌ配列が、ＳＤ−配列とＡＴＧ
開始／シグナルコドンの間のスペーサー領域内に位置し
ていた場合、バクテリア中で異質タンパクを増強する能
力があることを証明するために用いられた。。詳しく述
べれば、対照ＳＤ−配列を含む発現ベクターを、スペー
サー領域に、次のＧＩ ＯＬ配列を含む、その他の点で
は同一のＧ５Ｔｌ発現ベクターと比較した。
ケのヌクレオチド０１０Ｌ配列が、ＳＤ−配列とＡＴＧ
開始／シグナルコドンの間のスペーサー領域内に位置し
ていた場合、バクテリア中で異質タンパクを増強する能
力があることを証明するために用いられた。。詳しく述
べれば、対照ＳＤ−配列を含む発現ベクターを、スペー
サー領域に、次のＧＩ ＯＬ配列を含む、その他の点で
は同一のＧ５Ｔｌ発現ベクターと比較した。
５°−ＡＡＣＴＴＴＡ−３゛
このＧ１０Ｌ配列は、Ｇ１０Ｌ １６ＳｒＲＮＡボモ
ロジ一配列の断片、または部分を代表している。先に述
べたＧ１０Ｌ配列のＧ５Ｔｌ発現ベクターへの挿入は、
次の合成ｄＳＤＮＡ１ｇｉ片を合成することによって達
成された。
ロジ一配列の断片、または部分を代表している。先に述
べたＧ１０Ｌ配列のＧ５Ｔｌ発現ベクターへの挿入は、
次の合成ｄＳＤＮＡ１ｇｉ片を合成することによって達
成された。
廿廿廿峰＾＾＾Ａ＾
５°−Ｇ＾ＴＣＴＴＧＴ八ＡＧＧＡＧＡへＣＴＴＴ＾−
３゜ＡＡＣ＾ＴＴＣＣＴＣＴＴＧＡＡＡＴＧＴＡにこで
は、短剣は対照ＳＤ−配列を表し、星はＧ１０Ｌ １
６８ ｒＲＮＡホモロジー断片を表し、下線を引いた
ヌクレオチドは、開始／シグナルコドンの翻訳を示した
。この合成的ｄｓＤＮＡ断片を、次に、以前に本特許中
で記述した方法に従って、断片のＢａ１ｌとＮＣ０Ｉの
両末端を利用してＧ５Ｔｌ発現ベクターに挿入した。
３゜ＡＡＣ＾ＴＴＣＣＴＣＴＴＧＡＡＡＴＧＴＡにこで
は、短剣は対照ＳＤ−配列を表し、星はＧ１０Ｌ １
６８ ｒＲＮＡホモロジー断片を表し、下線を引いた
ヌクレオチドは、開始／シグナルコドンの翻訳を示した
。この合成的ｄｓＤＮＡ断片を、次に、以前に本特許中
で記述した方法に従って、断片のＢａ１ｌとＮＣ０Ｉの
両末端を利用してＧ５Ｔｌ発現ベクターに挿入した。
Ｇ５Ｔｌ発現ベクターを含むＧ１０Ｌで形質変換した旦
エ Ｃｏ１１は、Ｇ１０Ｌ配列を欠いている、その他の
点では同一のＧ３Ｔｌ発現ベクターで形質転換した、旦
エ Ｃｏ１１の場合より６．２４０倍人きいＧＳ、ＴＩ
の蓄積を示した。
エ Ｃｏ１１は、Ｇ１０Ｌ配列を欠いている、その他の
点では同一のＧ３Ｔｌ発現ベクターで形質転換した、旦
エ Ｃｏ１１の場合より６．２４０倍人きいＧＳ、ＴＩ
の蓄積を示した。
ｃ、 １ａｃＺ発現ベクターがＧ１０Ｌ配列を異質プ
ロディンに対するコード配列（例えば、Ｒ，Ｂ、Ｓ、の
一部）内に挿入した場合、バクテリア中で、異色タンパ
クの生産を増強することができることを示すために用い
られた。前に述べた（上の例２を見よ）、１ａｃＺ発現
ベクターは、翻訳開始／シグナルＡＴＧコドンにおいて
、ユニークなＮｃｏＩ制限部位を、２．３塩基下流に（
例えば、Ｉ ａｃＺコード領域内に）ユニークなＨｉｎ
ｄＩ［［部位を持っている。この１ａｃＺ発現ベクター
のＮＣＯＩからＨｉ ｎｄＩ［［領域を除去して、Ｇ
１０ Ｌ配列を含む合成ｄｓＤＮＡ断片で置き換えた。
ロディンに対するコード配列（例えば、Ｒ，Ｂ、Ｓ、の
一部）内に挿入した場合、バクテリア中で、異色タンパ
クの生産を増強することができることを示すために用い
られた。前に述べた（上の例２を見よ）、１ａｃＺ発現
ベクターは、翻訳開始／シグナルＡＴＧコドンにおいて
、ユニークなＮｃｏＩ制限部位を、２．３塩基下流に（
例えば、Ｉ ａｃＺコード領域内に）ユニークなＨｉｎ
ｄＩ［［部位を持っている。この１ａｃＺ発現ベクター
のＮＣＯＩからＨｉ ｎｄＩ［［領域を除去して、Ｇ
１０ Ｌ配列を含む合成ｄｓＤＮＡ断片で置き換えた。
詳しくいえば、Ｇ１０Ｌ配列５’−ＴＴ八へＣＴ丁−３
゜ を、まず次の合成ｄｓＤＮΔ断片を作ることにより、以
前に述べた１ａＣＺ発現ベクターに挿入した。
゜ を、まず次の合成ｄｓＤＮΔ断片を作ることにより、以
前に述べた１ａＣＺ発現ベクターに挿入した。
Ｎｃｏ Ｉ ｌｌ１ｎｄＩ［１１
＾＾峰静＾ １ ５’−ＣＡＩＧＧＧＧＴＴ八Ａ ＣＴ ＴへＡＧＣＴＧ
ＣＡＧＣＣＡ−３゜ＣＣＣ＾＾ＴＩＧＡ八ＴＴＣＧＡＣ
ＧへＣＧＧＴＴＣＧＡここで、下線を引いたヌクレオチ
ドは、翻訳開始／シグナルコドンを表し、星は、Ｇ１０
Ｌ配列を表している。この合成ｄｓＤＮＡ Ｇ１０Ｌ
を含む断１１を、この中で、以前に述べた方法に従って
、ｌ ａｃＺ発現ベクターに挿入した。次に、Ｅ、
Ｃｏ１１は、以前に述べたように、Ｇ１０Ｌ配列を含む
合成ｄｓＤＮＡを含む１ａｃＺ発現ベクターか、Ｇ１０
し配列が欠けている、その他の点では同一の、ｌ ａｃ
Ｚ発現ベクターのいずれかで形質転換した。次に、該形
質転換Ｅエ Ｃｏ１１によるβ−ガラクトシダーゼ生産
を、以前に記述したように測定した。かくしてＧ１０Ｌ
配列を含むＩ ａｃＺ発現ベクターで形質転換したＥ、
Ｃｏ１１は、Ｇ１０Ｌ配列が欠けているｌ ａｃＺ
発現ベクターで変異したＥ、 Ｃｏ１１よりも５０倍高
いβ−ガラクトシダーゼ生産レベルを与えた。
＾＾峰静＾ １ ５’−ＣＡＩＧＧＧＧＴＴ八Ａ ＣＴ ＴへＡＧＣＴＧ
ＣＡＧＣＣＡ−３゜ＣＣＣ＾＾ＴＩＧＡ八ＴＴＣＧＡＣ
ＧへＣＧＧＴＴＣＧＡここで、下線を引いたヌクレオチ
ドは、翻訳開始／シグナルコドンを表し、星は、Ｇ１０
Ｌ配列を表している。この合成ｄｓＤＮＡ Ｇ１０Ｌ
を含む断１１を、この中で、以前に述べた方法に従って
、ｌ ａｃＺ発現ベクターに挿入した。次に、Ｅ、
Ｃｏ１１は、以前に述べたように、Ｇ１０Ｌ配列を含む
合成ｄｓＤＮＡを含む１ａｃＺ発現ベクターか、Ｇ１０
し配列が欠けている、その他の点では同一の、ｌ ａｃ
Ｚ発現ベクターのいずれかで形質転換した。次に、該形
質転換Ｅエ Ｃｏ１１によるβ−ガラクトシダーゼ生産
を、以前に記述したように測定した。かくしてＧ１０Ｌ
配列を含むＩ ａｃＺ発現ベクターで形質転換したＥ、
Ｃｏ１１は、Ｇ１０Ｌ配列が欠けているｌ ａｃＺ
発現ベクターで変異したＥ、 Ｃｏ１１よりも５０倍高
いβ−ガラクトシダーゼ生産レベルを与えた。
前述の比較は、明らかにＧ１０Ｌ配列は、Ｒ，Ｂ、Ｓ、
内の種々の領域に位置して、バクテリアで、効果的に異
質タンパク生産を増強することができることを証明して
いる。これらの例は、長さ７ヌクレオチドのＧ１０Ｌ配
列が、バクテリアで効果的に異質タンパク生産を増強す
ることが出来る。かくして、ここにおいて、以前に述べ
られた方法に従って、ｍＲＮＡ結合、あるいは１６８
ｒＲＮＡとの相互作用を促進することによって、タン
パク生産を増強する配列が構築された。
内の種々の領域に位置して、バクテリアで、効果的に異
質タンパク生産を増強することができることを証明して
いる。これらの例は、長さ７ヌクレオチドのＧ１０Ｌ配
列が、バクテリアで効果的に異質タンパク生産を増強す
ることが出来る。かくして、ここにおいて、以前に述べ
られた方法に従って、ｍＲＮＡ結合、あるいは１６８
ｒＲＮＡとの相互作用を促進することによって、タン
パク生産を増強する配列が構築された。
賎ユ
この例は、Ｇ１０Ｌ配列とともに、転写ターミネータ−
配列を用いることにより、異質タンパク生産を更に増強
することができることを示す。以前に示したように、翻
訳ターミネータ−配列は異質タンパクを生産するために
選ばれたバクテリアの宿主のＤＮＡ中に見出されたもの
から、そして／または、バク７リアの宿主細胞に感染す
ることができるバクテリオファージ中に見出される配列
の中から選ぶことができる。
配列を用いることにより、異質タンパク生産を更に増強
することができることを示す。以前に示したように、翻
訳ターミネータ−配列は異質タンパクを生産するために
選ばれたバクテリアの宿主のＤＮＡ中に見出されたもの
から、そして／または、バク７リアの宿主細胞に感染す
ることができるバクテリオファージ中に見出される配列
の中から選ぶことができる。
本例においては、４種の異なる転写ターミネータ−を合
成し、以前に述べたＧ１０Ｌ配列を含む発現ベクター中
に挿入した。転写ターミネータ−配列は、以下のものを
含む （１） 以下のヌクレオチド配列を含むＴ４ｍ伝子２
Ｓターミネータ− ５°−へＡｒＴＣＧへＴＡＴＣＡＡＡＣへＣＡＡＴＴＩ
へＧＧＧＡＡＣＣＴＴＣＧＧＧｒＴＣＣＣｍＴＴＣＴＡ
ＴＩＴＴＣ−３’（２） 以下のヌクレオチド配列を
含むＩ） Ｚ Ｚ遺伝子アントターミネータ− ５゛−へへＴＴＣＧＡＴＡＴＣへ＾ＣＧＣＭＣＧＡＣＣ
ＣへＧＣＴＴＣＧＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧへＣＣ
−３’（３） 以下のヌクレオチド配列を含むターミ
ネーター ５’ −ＡＡＴｒＣＧＡｒＡＴＣＧＡＧＣＴＴＴＡＡＣ
ＡＡＣＣＧＧＣＣ八ＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＴＴＴＴＴ
ＧｒＧｃｃｃ−３’（４へ 上の２（ｈ）の例中に述
べられたヌクレオチドを含むＴ−７遺伝子１０ターミネ
ータ−これらの転写ターミネータ−は、従来法で合成し
、そしてＰＧＨベクターＤＭＯＮ５６４７とＥ）ＭＯＮ
５７１５（実験例２を見よ）の構築の場合に述べた方法
に類似した従来の方法に従って、Ｂ Ｇ Ｈ発現ベクタ
ーである（上の例２を見よ）ｏＭＯＮ５５３９に挿入し
た。上に述べた転写ターミネーション配列と一緒に、Ｇ
１０Ｌ配列を含むＢ Ｇ Ｍ発現ベクターで形質転換し
た、Ｅ、 Ｃ０１ｉは、前に述べたように測定した、
［３Ｇｌ−１生産において、（転写ターミネータ−が欠
けている、その他の点では同一のＢＧＨ発現ベクターで
ある）Ｉ）ＭＯＮ５５３９で形質転換した、旦−Ω−ｏ
１＋１と比べて２〜４倍の範囲の増強を与えた。
成し、以前に述べたＧ１０Ｌ配列を含む発現ベクター中
に挿入した。転写ターミネータ−配列は、以下のものを
含む （１） 以下のヌクレオチド配列を含むＴ４ｍ伝子２
Ｓターミネータ− ５°−へＡｒＴＣＧへＴＡＴＣＡＡＡＣへＣＡＡＴＴＩ
へＧＧＧＡＡＣＣＴＴＣＧＧＧｒＴＣＣＣｍＴＴＣＴＡ
ＴＩＴＴＣ−３’（２） 以下のヌクレオチド配列を
含むＩ） Ｚ Ｚ遺伝子アントターミネータ− ５゛−へへＴＴＣＧＡＴＡＴＣへ＾ＣＧＣＭＣＧＡＣＣ
ＣへＧＣＴＴＣＧＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧへＣＣ
−３’（３） 以下のヌクレオチド配列を含むターミ
ネーター ５’ −ＡＡＴｒＣＧＡｒＡＴＣＧＡＧＣＴＴＴＡＡＣ
ＡＡＣＣＧＧＣＣ八ＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＴＴＴＴＴ
ＧｒＧｃｃｃ−３’（４へ 上の２（ｈ）の例中に述
べられたヌクレオチドを含むＴ−７遺伝子１０ターミネ
ータ−これらの転写ターミネータ−は、従来法で合成し
、そしてＰＧＨベクターＤＭＯＮ５６４７とＥ）ＭＯＮ
５７１５（実験例２を見よ）の構築の場合に述べた方法
に類似した従来の方法に従って、Ｂ Ｇ Ｈ発現ベクタ
ーである（上の例２を見よ）ｏＭＯＮ５５３９に挿入し
た。上に述べた転写ターミネーション配列と一緒に、Ｇ
１０Ｌ配列を含むＢ Ｇ Ｍ発現ベクターで形質転換し
た、Ｅ、 Ｃ０１ｉは、前に述べたように測定した、
［３Ｇｌ−１生産において、（転写ターミネータ−が欠
けている、その他の点では同一のＢＧＨ発現ベクターで
ある）Ｉ）ＭＯＮ５５３９で形質転換した、旦−Ω−ｏ
１＋１と比べて２〜４倍の範囲の増強を与えた。
もう１つの実験において、例２で明らかにした合成ター
ミネータ−配列を、従来法で、前に述べたＡＰｏｅｎ発
現ベクターｐＭＯＮ５５１５に挿入した。詳しくいうと
、合成ターミネータ−配列を、従来法で、ＡＰａｅｎを
コードする配列の下流に、クローニングした。そして、
その結果得られたベクターは、タンパクを染色した、５
ＱｄｉｕｌｄｏｄｅｃＶＩ ｓｕ＋ｒａｔｅポリアクリ
ルアミドゲルの可視的検査によって定量したＡＰａｅｎ
生産において、約２から３侶の増加をもたらすことがわ
かった。
ミネータ−配列を、従来法で、前に述べたＡＰｏｅｎ発
現ベクターｐＭＯＮ５５１５に挿入した。詳しくいうと
、合成ターミネータ−配列を、従来法で、ＡＰａｅｎを
コードする配列の下流に、クローニングした。そして、
その結果得られたベクターは、タンパクを染色した、５
ＱｄｉｕｌｄｏｄｅｃＶＩ ｓｕ＋ｒａｔｅポリアクリ
ルアミドゲルの可視的検査によって定量したＡＰａｅｎ
生産において、約２から３侶の増加をもたらすことがわ
かった。
かくして、Ｇ１０Ｌ配列を転写ターミネータ−と結合す
ることにより、バクテリア中の異質タンパクの生産は、
Ｇ １０ Ｌ配列のみの使用で達成されるタンパク生産
レベルより高いレベルに達することができる。
ることにより、バクテリア中の異質タンパクの生産は、
Ｇ １０ Ｌ配列のみの使用で達成されるタンパク生産
レベルより高いレベルに達することができる。
前述の例は、本発明のより好ましい態様をわかり易く説
明するものであって、いずれの方法にせよ、発明の範囲
をυ１限することを意図していない。
明するものであって、いずれの方法にせよ、発明の範囲
をυ１限することを意図していない。
本発明は、そのより好ましい態様に（！ｌｎｔ、て述べ
たが、この技術に熟達したものにとって、この適用をよ
むことにより、その様々な修飾が行い得ることは明白で
ある。
たが、この技術に熟達したものにとって、この適用をよ
むことにより、その様々な修飾が行い得ることは明白で
ある。
参考文献
１、 ＡｌｔＯｎ、 Ｎ、に、 ａｎ’ｄ Ｖａｐｎｅ
ｋ、 Ｄ、 （１９７９） ＮａｔＵｒｃ２８２：８６
４−８６９゜ ２、 Ｂｅｒａｅｔ、 Ｐ、 Ｂ、 ｅｔ ａｌ、、
（１９８３） Ｊ、 Ｍｏｌ。
ｋ、 Ｄ、 （１９７９） ＮａｔＵｒｃ２８２：８６
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Ｂ１１１．１６４：５Ｇ１−５７２゜
３、 Ｂｒｏｓｉｕｓ、 Ｊ、、 Ｐａｌｍｃｒ、 Ｈ
，Ｌ、にｃｎｎｅｄｙ、 Ｊ、Ｐ。
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ａｎｄ Ｎｏ１ｌｃｒ、 Ｈ，Ｆ、 （１９７８） Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔ’ｌ。
ｒｏｃ、 Ｎａｔ’ｌ。
八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 Ｉｌ、Ｓ、Ａ、 ７５
： ４Ｊ３０１−４８０５゜４、 ＤｃＢｏｅｒ ｅ
ｔ ａｌ、（１９８２） ｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ：
５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、 Ｃ
ｈａＩ！１ｂｅｒｌｉｎ、 ＬＪ、 ａｎｄ ＩｔＯｄ
ｒｉＯＩＩＱＺ、 Ｒ，ｅｄｓ、、 Ｃｈａｔ）ｔｅｒ
２９３゜ ５、 Ｄｕｎｎ、 Ｊ、Ｊ、 ａｎｄ ５ｔｕｄ
ｉｅｒ、 ｗ、ｒ、 （１９８３） Ｊ。
： ４Ｊ３０１−４８０５゜４、 ＤｃＢｏｅｒ ｅ
ｔ ａｌ、（１９８２） ｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ：
５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、 Ｃ
ｈａＩ！１ｂｅｒｌｉｎ、 ＬＪ、 ａｎｄ ＩｔＯｄ
ｒｉＯＩＩＱＺ、 Ｒ，ｅｄｓ、、 Ｃｈａｔ）ｔｅｒ
２９３゜ ５、 Ｄｕｎｎ、 Ｊ、Ｊ、 ａｎｄ ５ｔｕｄ
ｉｅｒ、 ｗ、ｒ、 （１９８３） Ｊ。
Ｈｏｔ、Ｂｉｏｌ、 １［３６： ４７７−５３５゜Ｇ
、 Ｇｏｃｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ、 （１９７９） Ｎ
ａｔｒｕｅ ２８１：５４４−５４８．１ ７、 Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ、 （１９８４）
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’１． 八ｃａｄ。
、 Ｇｏｃｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ、 （１９７９） Ｎ
ａｔｒｕｅ ２８１：５４４−５４８．１ ７、 Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ、 （１９８４）
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’１． 八ｃａｄ。
Ｓｃｉ、 Ｌｌ、Ｓ、八、 ８１： ７０６１
−７０６！ｉ。
−７０６！ｉ。
８、 Ｇｏｌｄｂｃｒｇ、 Ｓ、Ｄ、、 Ｎ１ｃｋ、
Ｊ、Ｓ、 ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ。
Ｊ、Ｓ、 ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ。
Ｓ、Ｇ、 （１９８４） Ｎｕｃｌｃｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、 １２：４６６５−４６７７゜ ９、 Ｇｒｅｎ、 Ｅ、Ｊ、 （１９８４） Ｂｉｏｃ
ｈｉｍｉｅ ６６： １−２９１０、Ｇｕｔａｌｌ、Ｒ
，ｌｌ、Ｗｉｅｓｅｒ、Ｂ、、Ｗｏｅｓｅ、Ｃ，Ｒ，ａ
ｎｄＮｏｌｌｅｒ、ｆｌ、ｒ、（１９８５）Ｐｒｏｇｒ
、Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 ＆ Ｍ
ｏ１． Ｂｉｏｌ、 ３２・ １５５−２１６゜１
１、 ｌｌｏｌｍｅｓ、 Ｈ，Ｗ、、 Ｐｌａｔ
ｔ、 Ｔ、 ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｃｒｏ。
Ｒｅｓ、 １２：４６６５−４６７７゜ ９、 Ｇｒｅｎ、 Ｅ、Ｊ、 （１９８４） Ｂｉｏｃ
ｈｉｍｉｅ ６６： １−２９１０、Ｇｕｔａｌｌ、Ｒ
，ｌｌ、Ｗｉｅｓｅｒ、Ｂ、、Ｗｏｅｓｅ、Ｃ，Ｒ，ａ
ｎｄＮｏｌｌｅｒ、ｆｌ、ｒ、（１９８５）Ｐｒｏｇｒ
、Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 ＆ Ｍ
ｏ１． Ｂｉｏｌ、 ３２・ １５５−２１６゜１
１、 ｌｌｏｌｍｅｓ、 Ｈ，Ｗ、、 Ｐｌａｔ
ｔ、 Ｔ、 ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｃｒｏ。
Ｈ，（１９８３）Ｃｅｌｌ ３２：１０２９−１０３
２゜ｔ２． Ｉｌａｂｉｇ、 Ｗ、Ｉｌ、 ＾ｎ
ｄ Ｊａｋｏｂｙ、Ｗ、８．、 （１９８１）Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｒ＋ ［ｎｚｙｍｏｌ、７７：
３９８゜１３、にａｌｎｉｎｓ、Ａ、、０ｔｔｏ、に、
、Ｒｕｅｔｈｃｒ、Ｕ、ａｎｄＨｕｅｌｌｅｒ−１１ｉ
１１．Ｂ、（１９８３）ＥＨＢＯＪ ２：５９３−５
９７゜ １４、にｕｎｋｅｌ （１９８５）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
’１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
２゜ｔ２． Ｉｌａｂｉｇ、 Ｗ、Ｉｌ、 ＾ｎ
ｄ Ｊａｋｏｂｙ、Ｗ、８．、 （１９８１）Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｒ＋ ［ｎｚｙｍｏｌ、７７：
３９８゜１３、にａｌｎｉｎｓ、Ａ、、０ｔｔｏ、に、
、Ｒｕｅｔｈｃｒ、Ｕ、ａｎｄＨｕｅｌｌｅｒ−１１ｉ
１１．Ｂ、（１９８３）ＥＨＢＯＪ ２：５９３−５
９７゜ １４、にｕｎｋｅｌ （１９８５）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
’１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳ八 ８２：４８８−４９２゜
１５、 Ｌａｃｎ＋ｍｌｉ、 ｔｌ、に、 （１
９７０） Ｍａｔｕｒｅ ２２７： （ｉ８０−６
８５゜１６、 ＨａｎｉａＬｉｓ、 ｒｒｉｔｓｃｈ
ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 ｃｄｓ。
９７０） Ｍａｔｕｒｅ ２２７： （ｉ８０−６
８５゜１６、 ＨａｎｉａＬｉｓ、 ｒｒｉｔｓｃｈ
ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 ｃｄｓ。
（１９８２） ）ｌｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏｎｉｒ＋
ｑ： ＾ｔａｂｏｒａｔｏｒＶ Ｍａｎｕａｌ、Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂ
ｏｒ。
ｑ： ＾ｔａｂｏｒａｔｏｒＶ Ｍａｎｕａｌ、Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂ
ｏｒ。
Ｎ、’／。
１７、 ８ｅＳＳｉｆｌ（］ ｅｔ ａｔ、 （１９
８２） Ｇｅｎ＋３１９：２６９゜１８． Ｈｉｎ
ｔｏｎ、 Ｎ、Ｐ、 （１９８４） Ｇｅｎｅ ３
１： ２６９−２７３゜１９、旧ｏｚｚａｒｉ ａｎｄ
Ｙａｎｏｒｓｋｙ （１９７８） Ｊ。
８２） Ｇｅｎ＋３１９：２６９゜１８． Ｈｉｎ
ｔｏｎ、 Ｎ、Ｐ、 （１９８４） Ｇｅｎｅ ３
１： ２６９−２７３゜１９、旧ｏｚｚａｒｉ ａｎｄ
Ｙａｎｏｒｓｋｙ （１９７８） Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １３３： １４５７−１４
６６゜２０、Ｎｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｔ、 （１
９８３）Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、１１：５１０３−
５１１２゜ ２１．０°Ｆａｒｒｅｌｌ、 Ｐ、１．、 Ｇｏｏ
ｄｍａｎ、 １１．）１． ａｎｄＯｏＦａｒｒｅ
ｌｌ、 Ｐ、Ｈ，（１９７７） Ｃｅ１ｌ １２
：１１３３−１１４２゜ ２２．０１ｉｎｓ、Ｐ、０．ａｔ ａｔ、 （１９
８１）Ｃｅｌ１２６：２０５−２１４゜ ２３、Ｐａｒｋｅｒ、Ｈ，Ｌ、、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｃ
ｎ、Ａ、Ｃ，。
６６゜２０、Ｎｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｔ、 （１
９８３）Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、１１：５１０３−
５１１２゜ ２１．０°Ｆａｒｒｅｌｌ、 Ｐ、１．、 Ｇｏｏ
ｄｍａｎ、 １１．）１． ａｎｄＯｏＦａｒｒｅ
ｌｌ、 Ｐ、Ｈ，（１９７７） Ｃｅ１ｌ １２
：１１３３−１１４２゜ ２２．０１ｉｎｓ、Ｐ、０．ａｔ ａｔ、 （１９
８１）Ｃｅｌ１２６：２０５−２１４゜ ２３、Ｐａｒｋｅｒ、Ｈ，Ｌ、、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｃ
ｎ、Ａ、Ｃ，。
Ｂｏｏｓｍａｎ、 ＾、、５ｔｏｃｋａｒｄ、Ｊ、、
Ｙｏｕｎｇ。
Ｙｏｕｎｇ。
［、Ｔ、 Ａｎｄ Ｄｏｅｒｍａｎｎ、 Ａ、１１
． （１９８４） Ｊ。
． （１９８４） Ｊ。
Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 １８０： ３９９
−１４６゜２４、Ｒｅｎａｒｔ、Ｊ、、Ｒｅ１ｓｅｒ、
Ｊ、ａｎｄ ５ｔａｒｋ、Ｇ、Ｒ。
−１４６゜２４、Ｒｅｎａｒｔ、Ｊ、、Ｒｅ１ｓｅｒ、
Ｊ、ａｎｄ ５ｔａｒｋ、Ｇ、Ｒ。
（１９７９） Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１． ＾ｃａｄ
、 Ｓｃｉ、、 ｔｌ、ｓ、Ａ２Ｂ： ３１１６
−３１２０゜ ２５、 Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇａｎｄ Ｃｏｕｒｔ
（１９７９） Ａｎｎ、 Ｒｅｖｉｅｗｏｆ Ｇ
ｅｎｃｔ、 １３： ３１９−３５３゜２６、
Ｓａｒｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ、 （１９７７）
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’１． ＾ｃａｄ。
、 Ｓｃｉ、、 ｔｌ、ｓ、Ａ２Ｂ： ３１１６
−３１２０゜ ２５、 Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇａｎｄ Ｃｏｕｒｔ
（１９７９） Ａｎｎ、 Ｒｅｖｉｅｗｏｆ Ｇ
ｅｎｃｔ、 １３： ３１９−３５３゜２６、
Ｓａｒｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ、 （１９７７）
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’１． ＾ｃａｄ。
Ｓｃｉ、、ｔｌ、ｓ、Ａ、７４： ５４６３゜２７、
５ｃｈｅｒｃｒ、 Ｇ、Ｆ、Ｅ、、 Ｗａｌｋｉ
ｎｓｈａｗ、 Ｈ，Ｄ、。
５ｃｈｅｒｃｒ、 Ｇ、Ｆ、Ｅ、、 Ｗａｌｋｉ
ｎｓｈａｗ、 Ｈ，Ｄ、。
Ａｒｎｏｔｔ、Ｓ、ａｎｄ Ｈｏｒｒｅ、Ｄ、Ｊ、
（１９８０）Ｎｕｃ ｌ 、 ＾ｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ、８： ３８９５−３９０５゜２８、 Ｓｅｅ
ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ、 （１９８３） ＤＮＡ ２
１： ３７−４５゜２９、 ５ｈｉｎｅ、 Ｊ、
ａｎｄ Ｄａｌｇａｒｎｏ （１９７４） Ｐｒ
ｏｃ。
（１９８０）Ｎｕｃ ｌ 、 ＾ｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ、８： ３８９５−３９０５゜２８、 Ｓｅｅ
ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ、 （１９８３） ＤＮＡ ２
１： ３７−４５゜２９、 ５ｈｉｎｅ、 Ｊ、
ａｎｄ Ｄａｌｇａｒｎｏ （１９７４） Ｐｒ
ｏｃ。
ＨａＬ’１． ＾Ｃａｄ、 ＳＣｉ、、 ｔｌ、
ｓ、７１． ７１：１３４２−１３４６゜ ３０．５ｏｂｅｒｏｎ、Ｘ、、Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ
、Ｘ、ａｎｄＢｏｌｉｖａｒ、 Ｆ、 （１９８０
） Ｇｅｎｅ ９： ２８７−３０５゜３１、Ｖａ
ｉｔｕｋａｉｔｉｓ、Ｊ、Ｌ、（１９８１）、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ［ｎハ１１０１０（１ｙ ７３： ４
６−５２゜３２、Ｖｏｎ ｔｌｉｐｐｅｌ、Ｐ、ｅｔ
ａｌ、、 （１９８４）Ａｎｎ、Ｒｅｖ。
ｓ、７１． ７１：１３４２−１３４６゜ ３０．５ｏｂｅｒｏｎ、Ｘ、、Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ
、Ｘ、ａｎｄＢｏｌｉｖａｒ、 Ｆ、 （１９８０
） Ｇｅｎｅ ９： ２８７−３０５゜３１、Ｖａ
ｉｔｕｋａｉｔｉｓ、Ｊ、Ｌ、（１９８１）、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ［ｎハ１１０１０（１ｙ ７３： ４
６−５２゜３２、Ｖｏｎ ｔｌｉｐｐｅｌ、Ｐ、ｅｔ
ａｌ、、 （１９８４）Ａｎｎ、Ｒｅｖ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ５３：３８９−４４６゜３３、Ｗ
ｏｅｓｅ、 Ｃ，Ｒ，、Ｇｕｔｃｌｌ、 Ｒ，Ｒ，
、Ｇｕｐｔａ、 Ｒ，ａｎｄＮｏｌｌｅｒ、 Ｈ，
Ｆ、 （１９８３） Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｒ
ｅｖ。
ｏｅｓｅ、 Ｃ，Ｒ，、Ｇｕｔｃｌｌ、 Ｒ，Ｒ，
、Ｇｕｐｔａ、 Ｒ，ａｎｄＮｏｌｌｅｒ、 Ｈ，
Ｆ、 （１９８３） Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｒ
ｅｖ。
４７： ６２１゜
３４、Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，、Ｖｉｅｒ
ａ、Ｊ、ａｎｄｏｅｓｓｉｎｏ、 Ｊ、 （１９８
５） Ｇｅｎｅ ３３： １０３−１１９゜３５、
７ｏ１１ｅｒ ａｎｄ Ｓｍ１ｔｈ （１９８２） Ｈ
ｕｃ、 ＾ｃｉｄｓ Ｒｅｓ。
ａ、Ｊ、ａｎｄｏｅｓｓｉｎｏ、 Ｊ、 （１９８
５） Ｇｅｎｅ ３３： １０３−１１９゜３５、
７ｏ１１ｅｒ ａｎｄ Ｓｍ１ｔｈ （１９８２） Ｈ
ｕｃ、 ＾ｃｉｄｓ Ｒｅｓ。
１０： ６４８７−６５００゜
３６、 Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍ１ｔｈ （１９８
３） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、 １０
０：４６８−５００゜
３） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、 １０
０：４６８−５００゜
第１図はアンダーラインをひいたヌクレオチドが、天然
に存在するバクテリオファージエフ遺伝子１０ヌクレオ
チドと異っているヌクレオチドを表す合成二重ラセンＧ
１０１−配列のＤＮＡ配列を表し、（）は、 Ｅ、 Ｃｏ１１ １６８ ｒＲＮΔに対し相補的な
ヌクレオチド（すなわち塩基）を廿を 表し、（）は、ＳＤ−配列を表す。 （ＮｄｅＩ）は、天然に存在するバクテリオファージＴ
７ｍ伝子１０のコード配列中の制限エンドヌクレアーゼ
ＮｄｅＩの切断部位を意味する。 第２図は、下線を引いたヌクレオチドが天然に存在する
バクテリオファージＴ７３ｍ伝子１０ヌクレオチドと異
なるヌクレオチドを表す５０塩塁対の合成Ｇ１０ｌ分子
のＤＮＡ配＾角 Ａ 列を表す。（）はＥ、 Ｃｏ１１ １６Ｓ ｒＲＮ△に相補的なヌクレオチド廿↑ （すなわち塩基）を意味し、（）は ＳＤ−配列を示す。（ＮｄｅＩ＞は、 Ｎ ｄ ｅ Ｉ ＩＩＩ限エンドヌクレアーゼによる天
然に存在するバクテリオファージエフ遺伝子１０コード
配列中の切断部位を示す。 第３図は、ヌクレオチド４４７からヌクレオチド４８７
までの旦エ Ｃｏ１１ １６Ｓ ｒＲＮＡの配列を示す。本発明のＧ１０Ｌ配列中に見出
される９ヌクレオチド配列も示されている。この９ヌク
レオチド配列は垂直線で示されたように１６Ｓ ｒＲ
ＮＡと塩基対を作ることができる。 第４図は、” Ｇ １０ Ｌ ”と示されているＧ１０
Ｌ配列を含む表現ベクターを示す。’Ｐ“は、宿主細胞
中でＤＮＡ配列の転写を起すことができるブロモ−ター
をコードするＤＮＡ配列を表す”コード領域“はポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列を表し、 ’ａｍｐＲ″はアンピシリン耐性遺伝子を表す。 第５図は、第１図に示されている合成Ｇ１０Ｌ配列の構
築を示す。断片＃１−＃６は個々に合成されたオリゴヌ
クレオチドを示す。 第６図は、ｒｅｃＡプロモーター（Ｐｒｅｃ）、Ｇ １
０ Ｌ、配列（Ｇ１０Ｌ＞及び３−エノールビルビルツ
キメート５−フォスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰ）Ｄ
ＮＡコード配列を含むＰＭＯＮ５５３７発現ベクターの
構造を示す。 第７図は、ｒｅｃＡプロモーター（Ｐｒｅｃ）、Ｇ１０
Ｌ配列（Ｇ１０Ｌ）及びアトリオペプチゲン（ＡＰｑｅ
ｎ）をコードする ＤＮＡ配列を含んでいるＰＭＯＮ５５１５発現ベクター
の構築を示す。 第８図は、ウシ生長ホルモン（Ｂ Ｇ Ｍ ）をコード
するＤＮＡ配列を持っているＭｌ ３ｍＤ９の複製型（
ＲＦ）ＤＮＡを含む Ｍｌ ３ｍｐ９／ＢＧＨの構築を示す。 第９図は、オリゴヌクレオチド志向位置特異的突然変異
誘発によるＢＧＨ（Ｐ）コード配列からＢＧＨ（Ａ）コ
ード配列を創り出すことを表している。 第１０図は、ｒｅｃＡプロモーター（Ｐｒｅｃ）、Ｇ１
０Ｌ配列（Ｇ１０Ｌ）及びＢＧＭ （Ａ）をコードする
配列を含むＰＭＯＮ５５３９発現ベクターの構築を示す
。 第１１図は、ｒｅｃＡブＯモーター（ＰｒｅＧ）、コン
トロールＲ，Ｂ、Ｓ、（コントロールＳ、Ｄ、）及びＡ
Ｐｇｅｎをコートすル配列を含むＰＭＯＮ５５１４発現
ベクターの構築を示す。 第１２図は、ｒｅｃＡプロモーター（Ｐｒｅｃ）、コン
トロールＲ，Ｂ、Ｓ （コントロールＳ、Ｏ，＞及びＢ
ＧＨ（Ａ）をコードする、 配列を含むＰＭＯＮ ５
５５１発現ベクターの構築を示す。
に存在するバクテリオファージエフ遺伝子１０ヌクレオ
チドと異っているヌクレオチドを表す合成二重ラセンＧ
１０１−配列のＤＮＡ配列を表し、（）は、 Ｅ、 Ｃｏ１１ １６８ ｒＲＮΔに対し相補的な
ヌクレオチド（すなわち塩基）を廿を 表し、（）は、ＳＤ−配列を表す。 （ＮｄｅＩ）は、天然に存在するバクテリオファージＴ
７ｍ伝子１０のコード配列中の制限エンドヌクレアーゼ
ＮｄｅＩの切断部位を意味する。 第２図は、下線を引いたヌクレオチドが天然に存在する
バクテリオファージＴ７３ｍ伝子１０ヌクレオチドと異
なるヌクレオチドを表す５０塩塁対の合成Ｇ１０ｌ分子
のＤＮＡ配＾角 Ａ 列を表す。（）はＥ、 Ｃｏ１１ １６Ｓ ｒＲＮ△に相補的なヌクレオチド廿↑ （すなわち塩基）を意味し、（）は ＳＤ−配列を示す。（ＮｄｅＩ＞は、 Ｎ ｄ ｅ Ｉ ＩＩＩ限エンドヌクレアーゼによる天
然に存在するバクテリオファージエフ遺伝子１０コード
配列中の切断部位を示す。 第３図は、ヌクレオチド４４７からヌクレオチド４８７
までの旦エ Ｃｏ１１ １６Ｓ ｒＲＮＡの配列を示す。本発明のＧ１０Ｌ配列中に見出
される９ヌクレオチド配列も示されている。この９ヌク
レオチド配列は垂直線で示されたように１６Ｓ ｒＲ
ＮＡと塩基対を作ることができる。 第４図は、” Ｇ １０ Ｌ ”と示されているＧ１０
Ｌ配列を含む表現ベクターを示す。’Ｐ“は、宿主細胞
中でＤＮＡ配列の転写を起すことができるブロモ−ター
をコードするＤＮＡ配列を表す”コード領域“はポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列を表し、 ’ａｍｐＲ″はアンピシリン耐性遺伝子を表す。 第５図は、第１図に示されている合成Ｇ１０Ｌ配列の構
築を示す。断片＃１−＃６は個々に合成されたオリゴヌ
クレオチドを示す。 第６図は、ｒｅｃＡプロモーター（Ｐｒｅｃ）、Ｇ １
０ Ｌ、配列（Ｇ１０Ｌ＞及び３−エノールビルビルツ
キメート５−フォスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰ）Ｄ
ＮＡコード配列を含むＰＭＯＮ５５３７発現ベクターの
構造を示す。 第７図は、ｒｅｃＡプロモーター（Ｐｒｅｃ）、Ｇ１０
Ｌ配列（Ｇ１０Ｌ）及びアトリオペプチゲン（ＡＰｑｅ
ｎ）をコードする ＤＮＡ配列を含んでいるＰＭＯＮ５５１５発現ベクター
の構築を示す。 第８図は、ウシ生長ホルモン（Ｂ Ｇ Ｍ ）をコード
するＤＮＡ配列を持っているＭｌ ３ｍＤ９の複製型（
ＲＦ）ＤＮＡを含む Ｍｌ ３ｍｐ９／ＢＧＨの構築を示す。 第９図は、オリゴヌクレオチド志向位置特異的突然変異
誘発によるＢＧＨ（Ｐ）コード配列からＢＧＨ（Ａ）コ
ード配列を創り出すことを表している。 第１０図は、ｒｅｃＡプロモーター（Ｐｒｅｃ）、Ｇ１
０Ｌ配列（Ｇ１０Ｌ）及びＢＧＭ （Ａ）をコードする
配列を含むＰＭＯＮ５５３９発現ベクターの構築を示す
。 第１１図は、ｒｅｃＡブＯモーター（ＰｒｅＧ）、コン
トロールＲ，Ｂ、Ｓ、（コントロールＳ、Ｄ、）及びＡ
Ｐｇｅｎをコートすル配列を含むＰＭＯＮ５５１４発現
ベクターの構築を示す。 第１２図は、ｒｅｃＡプロモーター（Ｐｒｅｃ）、コン
トロールＲ，Ｂ、Ｓ （コントロールＳ、Ｏ，＞及びＢ
ＧＨ（Ａ）をコードする、 配列を含むＰＭＯＮ ５
５５１発現ベクターの構築を示す。
Claims (43)
- （１）Ｇ１０Ｌ配列を含む本質的に純粋な核酸の分子。
- （２）Ｇ１０Ｌ配列がバクテリオファージＴ７遺伝子１
０のコード配列の翻訳開始コドンの５′側隣接約１００
ケのヌクレオチドを含む特許請求の範囲第１項の分子。 - （３）Ｇ１０Ｌ配列が第１図に示してあるヌクレオチド
を含む特許請求の範囲第１項の分子。 - （４）Ｇ１０Ｌ配列が第２図に示してあるヌクレオチド
を含む特許請求の範囲第１項の分子。 - （５）Ｇ１０Ｌ配列がバクテリアの１６ＳｒＲＮＡ配列
に対し、相補的な非−シヤイン−ダルガーノ配列を含む
特許請求範囲第２項の分子。 - （６）バクテリア１６ＳｒＲＮＡ配列が、 ￥Ｅ．￥￥Ｃｏｌｉ￥１６ＳｒＲＮΛ配列である特許請
求の範囲第５項の分子。 - （７）Ｅ．Ｃｏｌｉ１６ＳｒＲＮＡ配列が 約４４７から４８７のヌクレオチドを含む特許請求の範
囲の第６項の分子。 - （８）１６ＳｒＲＮＡ配列が以下の配列のヌクレオチド
を含む特許請求の範囲第６項の分子。 - （９）ＸがもしくはＵ、ｍとｎが０もしくは１で、少く
とも１方が１、ＺはＡ，Ｇ，ＡＡ，ＧＧＧＡ，ＵＡ，Ｕ
ＡＡ，ＵＵＡＡからなるグループから選ばれ、ＢはＵＡ
，ＵＧ，ＵＡＣ，ＵＡＣＣ、ＵＡＣＵＵ及びＵＧＵＵＣ
からなるグループより選ばれることを条件とする （Ｚ）ｍＸＵＵ（Ｂ）ｎ式で表わされる特許請求の範囲
第２項の分子。 - （１０）Ｇ１０Ｌ配列がバクテリア１６ＳｒＲＮＡ配列
に相補的な５から１０のヌクレオチドを含む特許請求の
範囲第９項の分子。 - （１１）ＸがＣである特許請求範囲第１０項の分子。
- （１２）ｍとｎが共に１である特許請求の範囲第１１項
の分子。 - （１３）ｍが１であり、ｎがゼロである特許請求の範囲
第１１項の分子。 - （１４）ＺがＵＵＡＡ及びＢがＵＡである特許請求の範
囲１２項の分子。 - （１５）ＺがＡＡで、ＢがＵＡである特許請求の範囲１
２項の分子。 - （１６）ＺがＵＵＡＡである特許請求の範囲第１３項の
分子。 - （１７）遺伝子操作によりＧ１０Ｌ配列に結合させた異
質ＤＮＡのコード配列をさらに含む特許請求の範囲の第
２項の分子。 - （１８）異質ＤＮＡのコード配列が、牛の生長ホルモン
、豚の生長ホルモン及びアトリオペプチゲンからなるグ
ループから選ばれたタンパクをコードする特許請求の範
囲第１７項の分子。 - （１９）Ｇ１０Ｌ配列に遺伝子操作で結合されたバクテ
リアにおいて、遺伝子の発現を惹き起す能力のあるプロ
モーターをさらに含む特許請求の範囲第１７項の分子。 - （２０）プロモーターが、￥ｒｅｃ￥Ａプロモーター、
トリプトファンプロモーター、テトラサイクリンプロモ
ーター及びＬａｍｂｄａＰ＿Ｌプロモーターからなるグ
ループから選ばれる特許請求の範囲第１９項の分子。 - （２１）Ｇ１０Ｌ配列に遺伝子操作で結合させた転写終
結配列をさらに含む特許請求の範囲第１９項の分子。 - （２２）転写終結配列が、Ｔ４遺伝子２３、ターミネー
ター、Ｐ２２遺伝子アントターミネーター、Ｃｏ１Ｅ１
ターミネーター並びにＴ７遺伝子１０ターミネーターか
らなるグループより選ばれる特許請求の範囲第２１項の
分子。 - （２３）プロモーターが￥ｒｅｃ￥Ａであり、異質ＤＮ
Ａコード配列がウシ生長ホルモンをコードする特許請求
の範囲第１９項の分子。 - （２４）プロモーターが￥ｒｅｃ￥Ａであり、異質ＤＮ
Ａのコード配列が、インスリン様生長因子 I をコード
する特許請求の範囲第１９項の分子。 - （２５）プロモーターがｒｅｃＡであり、異質ＤＮＡの
コード配列がブタ生長ホルモンをコードし、転写終結配
列がＴ７遺伝子１０ターミネーターである特許請求の範
囲第２１項の分子。 - （２６）プロモーターが￥ｒｅｃ￥Ａであり、異質ＤＮ
Ａのコード配列がウシ生長ホルモンをコードし、転写終
結配列がＴ７遺伝子１０ターミネーターである特許請求
の範囲第２１項の分子。 - （２７）異質タンパクをコードするＤＮＡ配列に遺伝子
操作で結合させたＧ１０Ｌ配列の発現を起すこと、そし
てその際異質タンパクを得ることを含むバクテリアによ
る異質タンパクを生産する方法。 - （２８）Ｇ１０Ｌ配列がバクテリオファージＴ７遺伝子
１０の翻訳開始コドンの５′側に隣接した約１００ケの
ヌクレオチドを含む特許請求の範囲第２７項の方法。 - （２９）Ｇ１０Ｌ配列が第１図に示されたヌクレオチド
配列を含む特許請求の範囲第２７項の方法。 - （３０）Ｇ１０Ｌ配列が第２図に示したヌクレオチド配
列を含む特許請求の範囲第２７項の方法。 - （３１）Ｇ１０Ｌが、Ｇ１０Ｌ１６ＳｒＲＮＡホモロジ
ー配列を含む特許請求の範囲第２７項の方法。 - （３２）Ｇ１０Ｌ配列が、ＸがＣもしくはＵであり、少
くとも一方が１であることを条件として、ＭとＮが０も
しくは１であり、ＺがＡ，Ｇ、ＡＡ、ＧＧ，ＧＡ，ＵＡ
，ＵＡＡ及びＵＵＡＡからなるグループから選ばれ、Ｂ
が、ＵＡ，ＵＧ，ＵＡＣ，ＵＡＣＵ，ＵＡＣＵＵ及びＵ
ＧＵＵＣからなるグループから選ばれる式（Ｚ）ｍＸＵ
Ｕ（Ｂ）ｎで示される特許請求の範囲第２８項の方法。 - （３３）Ｇ１０Ｌ配列が、バクテリアの１６ＳｒＲＮＡ
配列に相補的である５から１０ヌクレオチドを含む特許
請求の範囲第３２項の方法。 - （３４）ＸがＣである特許請求の範囲第３３項の方法。
- （３５）ｍとｎがともに１である特許請求の範囲第３４
項の方法 - （３６）ｍが１、ｎがゼロである特許請求の範囲第３４
項の方法 - （３７）ＺがＵＵＡＡでＢがＵＡである特許請求の範囲
第３５項の方法。 - （３８）ＺがＡＡであり、ＢがＵＡである特許請求の範
囲第３５項の方法、 - （３９）ＺがＵＵＡＡである特許請求の範囲第３６項の
方法 - （４０）異質タンパクが、ウシ生長ホルモン、ブタ生長
ホルモン、アトリオペプチゲンからなるグループから選
ばれる特許請求の範囲第２８項の方法 - （４１）遺伝子がプラスミツド上で運ばれる特許請求の
範囲第２８項の方法 - （４２）プラスミツドがｐＭＯＮ５５１５、ｐＭＯＮ５
５３９、ｐＭＯＮ５５５７及び ｐＭＯＮ５６４７からなるグループより選ばれるプラス
ミツドである特許請求の範囲第４１項の方法 - （４３）バクテリアがＥ．Ｃｏｌｉである特許請求の範
囲第４１項の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US84515986A | 1986-03-27 | 1986-03-27 | |
| US582187A | 1987-02-04 | 1987-02-04 | |
| US845159 | 1987-02-04 | ||
| US5821 | 1987-02-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63289A true JPS63289A (ja) | 1988-01-05 |
| JP2511948B2 JP2511948B2 (ja) | 1996-07-03 |
Family
ID=26674811
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62072974A Expired - Fee Related JP2511948B2 (ja) | 1986-03-27 | 1987-03-26 | バクテリアにおける新規リボゾ−ム結合部位を用いたタンパク生産の増強 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0241446B1 (ja) |
| JP (1) | JP2511948B2 (ja) |
| AT (1) | ATE119200T1 (ja) |
| AU (1) | AU597951B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340091C (ja) |
| DE (1) | DE3751100T2 (ja) |
| DK (1) | DK154487A (ja) |
| ES (1) | ES2070828T3 (ja) |
| HU (1) | HUT43625A (ja) |
| IE (1) | IE67890B1 (ja) |
| IL (1) | IL82017A (ja) |
| NZ (1) | NZ219789A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2005230001A (ja) * | 2004-01-20 | 2005-09-02 | Mariusu:Kk | リボソームｒｎａ塩基配列に相補的な１本鎖ｄｎａオリゴマーを用いたたんぱく質翻訳調節因子及びリボソームｒｎａ塩基配列に相補的な１本鎖ｄｎａオリゴマーを用いたイニシエーションファクター並びにリボソームｒｎａ塩基配列に相補的な１本鎖ｄｎａオリゴマーを用いたたんぱく質翻訳調節方法 |
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| US5268284A (en) * | 1988-03-11 | 1993-12-07 | The Upjohn Company | Ribosome binding site |
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Patent Citations (1)
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