KR101696986B1 - 변형된 보르데텔라 페르투씨스 균주 - Google Patents

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Abstract

모 균주 토하마로부터 기원한 재조합체 보르데텔라 페르투씨스 균주가 제공된다. 상기 신규 균주는 어떠한 보조 돌연변이를 남기지 않고 세균 염색체의 부분의 대체를 허용하는, 대립형질 교환 벡터 pSS4245를 사용한 동종 재조합에 의해 수득된다. PT 소단위 S1을 암호화하는 분절은 대체되어 PT의 독성 활성의 불활성화를 유발하는 2개의 돌연변이를 도입한다. 상기 균주는 추가로 변형되어 증가된 양들의 rPT 및/또는 PRN을 발현할 수 있다. 이들의 프로모터 및 ptl 종결인자를 지니고 상기 돌연변이를 함유하는 ptx - ptl 오페론의 5개의 PT 구조 유전자의 ptx 무리의 제2의 카피는 염색체의 어딘가에 삽입될 수 있다. 또한, PRN 유전자의 제2의 카피는 염색체 위에 삽입될 수 있다. 둘 다의 경우에서, 포기된 유전자 위치를 삽입 부위로서 선택하여 원치않는 유전적 변경의 도입을 방지한다.

Description

변형된 보르데텔라 페르투씨스 균주{MODIFIED BORDETELLA PERTUSSIS STRAINS}
발명의 분야
본 발명은 토하마(Tohama)로 지정된 모 균주(parent strain)로부터 기원하고 돌연변이 및 유전자의 추가의 카피를 통합하기 위한 벡터 pSS4245를 사용한 재조합체 보르데텔라 페르투씨스 균주(Bordetella pertussis strains)의 작제를 기술한다.
발명의 배경
백일해(pertussis 또는 whooping cough)는 상기도관(upper respiratory track)의 보르데텔라 페르투씨스 감염에 의해 유발된 심각한 유아 질병이다[1]. 백신이 수십년 동안 이용가능했으며, 이는 비. 페르투씨스(B. pertussis)의 사멸된 전체 세포로 이루어진다. 이들은 3가의 디프테리아-파상풍-백일해 조합으로 또는 B형 간염 및 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 제b형의 침습성 질병에 대해 또한 면역성을 제공하는 새로운 조합으로 투여된다[2]. 전체-세포 백신(whole-cell vaccine)의 사용은, 내독소 및 사멸된 전체 세포와 연합된 다른 세균 독소의 높은 수준에 기인하는, 이들의 의심스러운 안전성 프로파일들로 인하여 몇몇 국가에서 감소되거나, 반대되거나 심지어 금지되고 있다[3, 4].
전체 세포를 함유하지 않지만 단지 부분적으로 또는 완전히 정제된 세균 항원을 함유한다는 사실에 따라 명명된 무세포성 백신(acellular vaccine)은 1981년 일본에 도입되었다[5]. 무세포성 백신 속의 성분 항원의 보다 높은 순도는 개선된 임상적 안전성 프로파일로 전환되었다. 이들 백신은 이의 안전성 및 효능을 입증한 집중적인 필드 시험(field trial)들 후에 개발도상국에서 1990년대 중반에 도입되었다[6]. 그러나, 면역화의 확장된 프로그램으로의 WHO에 의한 보다 광범위한 도입은 무세포성 백신의 현저히 높은 비용으로 인해 저해되었다.
비. 페르투씨스의 주요 병독성 인자는 페르투씨스 독소(PT)이고[7, 8] 페르투씨스 변성독소(PTd)는 무세포성 백신에 있어 주요한 항원이다[8]. 포름알데하이드를 사용한 단순한 처리로 불활성화시킬 수 있는 디프테리아 및 파상풍 독소와는 달리, PT는 화학적 수단에 의해 불활성화시키기가 보다 어려운 것으로 입증되었다[9]. 현재 상이한 불활성화 공정이 상업적 생산을 위해 사용되고 있다. 모두는 공통적으로 화학적 처리에 의해 유발된 PT의 집중적인 변성을 갖는다. 2개의 후보 백신이 유전적으로 불활성화된 독소(rPT)를 사용하여 탐색되었고[10-12] 이들 후보들 중 하나가 필드 효능 시험(field efficacy trial)에 포함되었다[11-12].
그러나, rPT를 함유하는 백신들은 여전히 이용가능하지 않다.
발명의 요지
본 발명의 제1의 구현예에 따라서, 유전적으로 변형된 보르데텔라 페르투씨스 토하마 균주가 제공되며, ATCC 기탁번호가 제BAA-589호인 토하마 균주의 페르투씨스 독소 S1 유전자가 Arg9→Lys9 및 Glu129→Gly129 돌연변이를 갖고 상기 돌연변이의 결과로서 통합된 항생제 내성 유전자를 포함하지 않으며, 변형된 균주가 해독된 페르투씨스 독소(rPT)를 발현할 수 있다.
벡터 pSS4245를 사용하여 항생제 내성 유전자의 통합없이 S1 돌연변이를 도입시킬 수 있다.
균주는 ptx 오페론의 카피를 벡터 pSS4245를 사용하여 변형된 토하마 균주의 염색체의 비-기능성 영역 내로 통합시킴으로써 추가로 변형시킬 수 있으며, 통합된 ptx 오페론은 S2 - S5 유전자의 세트 및, 돌연변이 Arg9→Lys9 및 Glu129→Gly129를 포함하도록 변형됨으로써, 이에 의해 변형된 균주가 통합된 항생제 내성 유전자 없이 토하마 염색체 내에 떨어져서 위치하는 2개의 ptx 오페론을 가지고, 하나의 ptx 오페론만을 가진 균주와 비교하여 증강된 수준의 해독된 페르투씨스 독소를 발현할 수 있는 S1 유전자를 포함한다.
ptx 오페론의 카피는 비 기능성 위유전자(pseudogene)들 내에 또는 이들 사이에 통합될 수 있다.
ptx 오페론의 카피는 추정의 암모늄 전달체(transporter) 위유전자 amtB와 추정의 자동전달체(autotransporter) 위유전자 사이에 통합될 수 있다.
ptx 오페론의 통합된 카피는 ptx-ptl 오페론 프로모터의 조절 하에 존재할 수 있다.
ptl 오페론의 추가 카피는 균주 내로 통합되지 않을 수 있다.
균주는 변형된 ptx 오페론의 하나 이상의 삽입된 카피를 포함할 수 있다.
균주는 페르탁틴을 암호화하는 prn 유전자의 카피를 벡터 pSS4245를 사용하여 변형된 토하마 균주의 염색체의 비-기능성 영역 내로 통합시킴으로써 추가로 변형시킬 수 있으며, 이에 의해 변형된 토하마 균주는 항생제 내성 유전자의 통합없이 토하마 염색체 내에 떨어져서 위치하는 2개의 prn 유전자를 가지고, 변형된 토하마 균주는 하나의 prn 유전자만을 가진 균주와 비교하여 증강된 수준의 페르탁틴을 발현할 수 있다.
삽입된 prn 유전자는 비기능성 위유전자들 내에 또는 이들 사이에 위치할 수 있다.
prn 유전자의 카피는 위-추정의 글루타티온 S-트랜스퍼라제 유전자와 위 추정의 아스파테이트 라세마제 유전자 사이에 통합될 수 있다.
prn 유전자의 카피는 prn 프로모터의 조절 하에 존재할 수 있다.
균주는 prn 유전자의 하나 이상의 삽입된 카피를 포함할 수 있으며, 적어도 2개의 변형된 ptx 오페론 및 적어도 2개의 prn 유전자를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 야생형 토하마 균주의 기능성 유전자는 제거되거나, 대체되거나 불활성화되지 않았다.
본 발명의 제2의 양태에 따라서, 변형된 비. 페르투씨스 균주를 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 토하마로 지정되고, ATCC 기탁번호가 제BAA-589호인 비. 페르투씨스(B. pertussis) 균주 내 촉매 소단위 S1 유전자를 돌연변이 Arg9→Lys9 및 Glu129→Gly129를 포함하는 S1 유전자로 대체시키고, 여기서 변형되지 않은 S1 유전자를 변형된 S1 유전자로 대체하기 위해 벡터 pSS4245가 사용되고, 그로 인해 항생제 내성 유전자의 통합없이 변형된 유전자를 통합시켜 해독된 페르투씨스 독소(rPT)를 발현할 수 있는 균주를 생산하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 ptx 오페론의 카피를 벡터 pSS4245를 사용하여 변형된 토하마 균주의 염색체의 비-기능성 영역 내로 통합시키고, 여기서 통합된 ptx 오페론이 S2 - S5 유전자의 세트 및 돌연변이 Arg9→Lys9 및 Glu129→Gly129를 포함하도록 변형된 S1 유전자를 포함하고, 그로 인해 항생제 내성 유전자의 통합없이 토하마 염색체 내에 떨어져서 위치하는 2개의 ptx 오페론을 가지며, 하나의 ptx 오페론만을 가진 균주와 비교하여 증강된 수준의 해독된 페르투씨스 독소를 발현할 수 있는 변형된 토하마 균주를 생산하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 페르탁틴을 암호화하는 prn 유전자의 카피를 벡터 pSS4245를 사용하여 변형된 토하마 균주의 염색체의 비-기능성 영역 내로 통합시킴으로써, 항생제 내성 유전자의 통합없이 토하마 염색체 내에서 떨어져서 위치하는 2개의 prn 유전자를 가진 변형된 토하마 균주로서 하나의 prn 유전자만을 가진 균주와 비교하여 증강된 수준의 페르탁신을 발현할 수 있는 변형된 토하마 균주를 생산하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 변형된 토하마 균주는 하나의 prn 유전자만을 가진 균주와 비교하여 증강된 수준의 페르탁틴을 발현할 수 있다.
변형된 ptx 오페론 및/또는 prn 유전자의 하나 이상의 카피는 토하마 균주의 염색체 내로 삽입될 수 있다.
본 발명의 제3의 양태에 따라서, 상기 기술된 유전적으로 변형된 비. 페르투씨스 토하마 균주를 배양에서 배양하여, 상기 균주에 존재하는 유전자에 의해 암호화된 해독된 페르투씨스 독소(rPT), 페르탁틴 및 섬유상 헤마글루티닌(FHA)을 함유하는 항원의 발현을 실행하는 단계; 및 항원을 회수하는 단계를 포함하는, 보르데텔라 페르투씨스 항원을 생산하는 방법이 제공된다.
PT 및 FHA 항원은 배양 배지로부터 회수될 수 있는 반면, PRN 항원은 배양 배지로부터 일부 및 고온 처리와 같은 추출 과정에 의해 세포로부터 일부 회수될 수 있다.
응집원 2 및/또는 3이 또한 발현되어 회수될 수 있다.
본 발명의 제4의 양태에 따라서, 상기 기술된 방법으로 생산된 항원이 제공된다.
상기 항원은 피검자(subject)에서 페르투씨스 감염을 예방하고, 특히, 페르투씨스 감염을 예방하기 위한 무세포성 백신을 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 제4의 양태에 따라서, 상기 기술한 바와 같이 생산된 항원을 포함하는 무세포성 백신이 제공된다. 상기 항원은 해독된 페르투씨스 독소 및/또는 페르탁틴일 수 있다. 상기 백신은 FHA, 응집원 2 및/또는 응집원 3 및/또는 디프테리아, 파상풍, B형 간염, 소아마비 및 헤모필루스 인플루엔자(Hemophilus influenzae) 제b형 중 하나 이상을 포함하는, 다른 질병을 예방하거나 치료하기 위한 항원을 추가로 포함할 수 있다.
도 1: 대립형질 교환 벡터 pSS4245의 개략적인 구조
도 2: 변형된 S1 유전자를 대립형질 교환 벡터 pSS42455 내로 작제하기 위한 벡터. A: 클로람페니콜 내성 카세트에 의해 S1 유전자를 대체하기 위한 대립형질 교환 성분을 S1 플랭킹 영역 사이에 삽입하였다. B: 변형된 S1 유전자를 ptx - ptl 오페론 내에서 이의 정확한 위치로 되돌리기 위한 대립형질 교환 성분. 대립형질 교환을 수득하기 위해, 이들 벡터를 선형화하여 pSS4245 내로 삽입하고, 이후 이를 이. 콜라이(E. coli) SM10으로부터의 접합성 전달에 의해 비. 페르투씨스 내로 도입한다.
도 3: 대립형질 교환 과정. A: 클로람페니콜 내성 마커에 의한 S1 유전자의 대체를 유도하는 이중 재조합 현상. B: 이의 원래의 위치에서 변형된 S1 유전자의 재-삽입을 유도하는 이중 재조합 현상.
도 4: ptx 오페론의 제2의 카피를 비. 페르투씨스 염색체 내로 삽입시키기 위한 벡터 . A: ptx 오페론의 제2의 카피를 위한 삽입 부위를 각각의 2개의 프레임쉬프트 돌연변이(frameshift mutations)를 지니는 2개의 포기된 유전자 사이에서 선택하였다. B: 대립형질 교환 성분을 사용하여 선택된 부위에 클로람페니콜 마커를 삽입하였다. C: 이의 원래의 프로모터를 갖는 ptx 오페론의 개략적인 구조. ptx-ptl 종결인자(terminator)를 클로닝하여 S3 유전자를 지나서 삽입하였다.이 무리(cluster)를 SS4245 유도체 내로 최종적으로 통합하여 클로람페니콜 마커를 대체하고 제2의 대립형질 현상을 생성시켜 PT 구조적 유전자의 제2의 카피를 삽입하였다.
도 5: Bp - WWC 및 Bp - WWD 에서 R9K 및 E129G 돌연변이의 확인 . 돌연변이 주변의 미가공 서열 데이타를 균주 Bp-WWD에 대해 나타내며, 이는 PT 구조적 무리의 2개 카피를 갖는다. 상응하는 서열 정렬은 비. 페르투씨스 토하마(컨센서스 서열) 및 유도체 Bp-WWC 및 Bp-WWD에 대해 나타낸다.
도 6: prn 유전자의 제2의 카피를 비. 페르투씨스 염색체 내로 삽입하기 위한 벡터. A: prn 유전자의 제2의 카피를 위한 삽입 부위를 프레임쉬프트 돌연변이 및 결실을 지니는 2개의 포기된 유전자 사이에서 선택하였다. B: fha 프로모터의 조절 하에 있고 표적 통합 부위와 플랭킹(flanking)되는 prn 유전자의 개략적인 구조. C: 이의 자체의 프로모터의 조절 하에 있고 표적 통합 부위와 플랭킹되는 prn 유전자의 개략적인 구조.
도 7: CHO 세포 무리화 시험 . 세포를 거의 합치(confluence)까지 성장시킨 후 PT의 희석물을 첨가하고 무리화를 2일 후에 기록하였다. A: 800ng의 PT(균주 Bp-WWC). B: 대조군, PT는 첨가하지 않았음. C: 검출 한계에 상응하는 2.6pg의 야생형(wt) PT(토하마 균주). D. 43pg의 야생형 PT(토하마 균주).
발명의 상세한 설명
토하마로 지정된 모 균주로부터 기원한 재조합체 보르데텔라 페르투씨스 균주를 본원에 기술한다. 신규 균주는 대립형질 교환 벡터 pSS4245를 사용한 동종 재조합에 의해 수득한다[41]. 벡터는 임의의 보조적인 돌연변이를 남기지 않고 세균 염색체 부분의 대체를 허용한다.
PT, FHA 및 페르탁틴(PRN)에 대한 유전자를 클로닝하여 서열분석하였다[35-39]. 페르투씨스 독소는 단일의 프로모터로부터 발현된 5개의 상이한 구조 유전자에 의해 암호화된, 6개의 폴리펩타이드 소단위로 구성된 복합 단백질이다. 이의 효소 활성 및 이의 독성 활성 중 대부분은 이의 소단위 S1에 의해 매개되는 반면, 이의 세포-결합 및 유사분열촉진 특성은 B-소단위를 형성하는, 다른 소단위에 기인한다.
제1의 구현예에서, PT 소단위 S1을 암호화하는 분절(segment)을 대체하여 독성 활성의 불활성화를 유발하는 2개의 돌연변이를 도입하였다. 제2의 구현예에서, 이의 프로모터 및 ptl 종결인자를 지니고 상기 돌연변이를 함유하는 ptx - ptl 오페론의 5개의 PT 구조 유전자의 ptx 무리의 제2의 카피를 염색체의 다른 위치에 삽입하였다. ptx - ptl 오페론 내에 존재하는 ptl 보조 유전자의 조직화(organization)는 변형되지 않았다. 상기 균주는 증가된 양의 rPT를 생산하였다. 제3의 구현예에서, prn 유전자의 제2의 카피를 염색체 상에 삽입하였다. 각 경우에서, 포기된 유전자 위치를 삽입 부위로 선택하여 원치않는 유전적 변경의 도입을 피하고 항원 발현을 자가 프로모터로 구동시켜, 모 토하마 균주에서와 같이 동일한 조절 하에 있도록 했다.
PT 및 PRN 조차도 고-밀도 배양물에서 제한되는 항원인 반면, FHA는 이들 조건 하에서 비. 페르투씨스에 의해 천연적으로 과생산된다. 그러나, PRN은 재조합체 이. 콜라이 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)로부터 고 수율로 수득될 수 있던 반면[14, 15] PT 소단위 만이 이. 콜라이 내에서 발현될 수 있었고, 성숙한 독소로 조립되는데 실패하였으므로 잠재적인 백신 후보물로서 고려되기에는 불충분하게 면역원성이었다[16]. 성숙한 독소의 조립 및 분비는 ptx - ptl 오페론의 ptl 부분의 일부인, 이후의 단계에서 발견된 수개의 보조 유전자를 필요로 함이 현재 이해된다[17].
유전자 카피 수의 조작에 의한 증강된 생산이 세균 독소[18, 19], 특히 PT[20]의 생산을 증강시키는 것으로 보고되어 왔지만, 이는 대부분 다중-카피 플라스미드 벡터와 함께 사용되어 왔거나, 유전자가 나란히 반복되었다. 이는 특히 생산 세팅(production setting)에서 균주 유전적 안전성에 있어서의 결과를 가질 수 있다. 예를 들어, 리(Lee) 등에 의해[40] 다중-카피 플라스미드 벡터를 사용하여 생성된 비. 페르투씨스 균주는 PT 생산에 있어서 어떠한 증가도 나타내지 않았으며, 플라스미드는 재배열되었고, PT 오페론은 결실되거나 트랜스접합체(transconjugant)는 무독성 상(avirulent phase)으로의 전환을 겪었다.
비. 페르투씨스에서 이전에 사용된 대립형질 교환 벡터와는 대조적으로, pSS4245는 염색체 상에서 보조적 돌연변이, 특히 이전의 대립형질 교환 과정에서 요구되는 바와 같은 자발적인 스테렙토마이신 내성 돌연변이체의 선택으로부터 생성되는 rpsL에 영향을 미치는 돌연변이를 필요로 하지 않거나 이들을 남긴다.[22] 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)에 영향을 미치는 이러한 돌연변이는 병독성이 손상되고, 따라서 PT, FHA 및 PRN을 포함하는 병독성 인자의 발현을 손상시킬 수 있다. 본 발명의 균주는 변경되지 않은 수준의 다른 항원, 특히 FHA를 생성하며, 입수가능한 무세포성 페르투씨스 백신의 생산에 사용될 수 있다.
결과
비. 페르투씨스 염색체 내에서 S1 유전자의 돌연변이
2개의 돌연변이 R9K 및 E129G를 소단위 S1 내로 도입시키기 위하여, 2 단계 시도를 사용하여 돌연변이 중 하나의 손실을 유발할 수 있는, 2개의 돌연변이 사이의 영역내 재조합 가능성을 피했다. 상기 시도는 또한 선택 배지 상에 단순한 복제 평판(replica plating)으로 목적한 콜로니의 선택을 허용한다. 첫째로, 2개의 이. 콜라이 벡터를 pBluescript II SK+에서 작제하였으며, 여기서 야생형 S1 유전자는 클로람페니콜 내성 유전자(Cm R )(도 2a)에 의해 또는 목적한 돌연변이를 포함하는 변형된 S1 유전자(도 2b)에 의해 대체되었으며, 이들 둘다는 S1 상부 및 하부 영역의 1.2 내지 1.5 kB에 의해 플랭킹(flanking)되어 있다. 이후 이들 벡터를 가공하고 이들의 삽입체를 pSS4245 내로 도입시킨다. 이들 유도체를 접합성 전달을 위해 이. 콜라이 SM10 내로 이전하고 대립형질 교환을 비. 페르투씨스 토하마 균주 내로 이전하였다. 플라스미드 pSS5Cm3는 CmR 마커에 의한 S1 유전자의 대체를 생성하였다(도 3A). 플라스미드 pSS5S13-9K-129G는 S1 유전자를 이의 원래의 위치내로 회복시켜, 이제 2개의 목적한 돌연변이를 지녔다(도 3B). 선택 배지에서 분리체를 선택한 후, 예측된 위치에서 Cm R 및 변형된 S1 유전자의 통합은 PCR 증폭으로 확인하였다(데이타는 도시하지 않음). 예측된 위치에서 돌연변이된 S1 유전자의 통합은 상부 5' 및 3' 하부 플랭킹 영역 및 내부적으로 S1 유전자 내에 결합할 수 있는 특이적인 프라이머를 사용한 PCR로 확인한 바와 같이 명백하였다(데이타는 도시하지 않음). 추가의 정교화를 위해 선택된 클론의 S1 유전자내 돌연변이는 DNA 서열분석으로 확인하였다. 신규 균주는 Bp-WWC로 지정하였다.
PT 구조 유전자의 제2의 세트에 대한 제2의 통합 부위의 삽입
비. 페르투씨스와 혼용성인 다중카피 플라스미드 상의 전체 ptx-ptl 오페론을 삽입시킴으로써 PT 발현을 증가시키기 위한 초기 시도는 유용한 균주를 전달하는데 실패하였으며, 이는 PT의 과발현이 잠재적으로 독성이며 특정의 한계 내에서 잔존하여 생존가능한 균주를 수득하여야만 함을 제안한다. PT 독소 수율을 증가시키기 위하여, PT 구조 유전자의 제2 세트를 Bp-WWC 염색체 내로 도입하였다. 삽입 표적 부위를 확인하기 위하여, 비. 페르투씨스 토하마 게놈의 서열을 스캐닝하고 많은 위-유전자를 확인하였다. 추정의 암모늄 전달체 유전자와 추정의 자동-전달체 유전자 사이의 DNA 서열을 삽입을 위해 선택하였다(2,903,988 내지 2,905,228번 위치 및 2,905,291 내지 2,908,277번 위치). 이들 유전자는 각각 이들의 기능성을 파괴시키는 각각의 프레임쉬프트(frameshift) 돌연변이를 수반한다(도 4A). 선행 단락에서 요약된 일반적인 전략은 다음과 같다. 첫째로, 이. 콜라이 벡터 pSKPD5Cm3를, Cm R 유전자를 선택된 통합 부위를 플랭킹하는 영역 내에 삽입하여 작제하였다(도 4B). 목적한 서열을 pSS4245 내로 삽입한 후, 대립형질 교환을 Cm R 마커로 선택하였다. 지정된 위치에서 Cm R 유전자의 통합을 PCR로 확인하였다(데이타는 도시하지 않음). 제2의 벡터에서 5개의 PT 구조 유전자 S1 ... S3을 ptx 프로모터 및 ptl 종결인자와 함께 동일한 플랭킹 영역 내 S3 유전자에 이어서 삽입하여 S1 내에 2개의 돌연변이를 포함하는 벡터 pSKptxter을 생성하였다(도 4C). 표적 통합 부위 내로의 대립형질 교환은 PT 구조 유전자의 기능적 무리의 제2의 카피를 Bp-WWC 균주 내로 삽입시켰다. 신규 균주는 Bp-WWD로 지정하였다. 통합의 결과는 ptx 오페론의 상부 또는 하부 영역에 및 이의 내부에 결합하는 프라이머를 사용한 증폭으로 입증되었으며, 이는 재조합이 발생한 영역의 파괴없이 예측된 통합을 나타내었다.
S1 유전자의 서열분석 및 R9K 및 E129G 돌연변이의 확인
자동화된 서열분석을 적용시켜 목적한 돌연변이의 존재를 확인하였다. S1 유전자의 2개의 통합된 카피를 갖는 균주 Bp - WWD의 경우에, PCR 증폭은 원칙적으로 2개의 유전자의 카피들의 혼합물을 생성한다. 삽입체 중 하나에서 예측하지 않은 점 돌연변이는 상응하는 위치에서 이중 뉴클레오타이드 지정으로 여겨질 수 있다. R9K 및 E129G 위치에서 형광성 시그날의 단일 피크는 Bp-WWC의 정확한 서열을 나타내었으며, Bp-WWD 내 S1의 2개의 카피가 동일한 돌연변이를 가졌음을 나타내었다. 2개의 목적한 돌연변이 주변의 서열은 도 5에 보고되어 있으며, 이는 균주 Bp-WWD에 대한 서열분석 기록 및 야생형 토하마, Bp-WWC 및 Bp-WWD에 대한 서열 정렬을 나타낸다.
PRN 유전자의 제2의 카피의 Bp-WWD 균주 내로의 삽입
PRN 생산의 제한으로 인하여, fha 프로모터 및 이의 자체의 종결인자의 조절 하에서 prn 구조 유전자의 제2의 카피를 추정의 글루타티온 S-트랜스퍼라제 위유전자의 2개의 위유전자와 추정의 아스파르테이트 라세마제 사이의 Bp-WWD 염색체 내로 도입하였다(도 6A). pSKPD2Cm3 이. 콜라이 벡터를 작제하였으며, 여기서 Cm R 유전자는 선택된 삽입 부위를 플랭킹하는 상부 영역과 하부 영역 사이에 삽입하였다. 다른 벡터를 FHA 프로모터의 조절하에 동일한 플랭킹 영역과 prn 유전자를 사용하여 작제하였다(도 6B). 목적한 위치 내에 Cm R 마커를 삽입한 후, Cm R 유전자를 일반적인 대립형질 교환 선택 및 스크리닝 과정을 사용하여 prn 기능성 블록으로 대체하였다.
이 작제로부터 분리한 비. 페르투씨스 균주는 PRN을 발현하지 않았으며, 다른 항원의 수준은 궁극적으로 검출가능하지 않았다. PRN 생성물은 보다 강력한 FHA 프로모터의 조절 하에서 과생산되는 경우 독성이며 PRN을 생산하는 이의 능력을 상실한 단지 도주 돌연변이체(escape mutant)이거나 모든 병독성 인자가 생존가능하였던 것으로 잠정적으로 결론지어졌다. 따라서, 천연의 prn 프로모터를 fha 프로모터대신 도입하기로 결정하였다. pSKPD25FpPRN3을 사용하여 FHA 프로모터를 원래의 PRN 프로모터로 대체하여 이의 자체의 천연 프로모터 및 종결인자를 지닌 기능적 블록을 생성하였다(도 6C). 기능적 블록은 선택된 부위에서 일반적인 대립형질 교환 과정으로 삽입하여 이의 자체의 프로모터의 조절하의 prn 유전자의 제2의 나란하지않게 반복된 카피를 가진 균주를 수득하였다. 예측된 삽입은 플랭킹 영역에 결합하는 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 내부적으로 prn 유전자 내에서 확인하였다. 이 균주는 일반적으로 생존가능하며 Bp-WWE로 지정하였다.
PT 및 PRN 작제물의 유전적 안전성
균주 Bp-WWE를 배양하고 MSS 배지 속에 일련 계대배양(subculturing)하여 대략 총 50개 세대에 이르도록 하였다. 마지막 배양물을 희석시키고 MSS-아가(agar)상에 플레이팅하였다. 30개의 분리된 콜로니를 무작위적으로 채집하였다. 30개의 콜로니를이들의 S1 및 prn 유전자에 대해 PCR로 분석하였다(데이타는 도시하지 않음). 결과는, 모든 콜로니가 예측된 위치에서 S1 및 prn 유전자의 2개 카피를 함유하였음을 나타내었다.
진탕 플라스크 내에서 PT 및 FHA의 발현
진탕 플라스크 배양물에서 PT 및 FHA의 생산을 ELISA로 분석하였다. 진탕 플라스크들 배양물은 모두 헵타키스(2,6-O-디메틸)-β-사이클로덱스트린을 함유하는 변형된 슈타이너-스콜테 배지(Modified Stainer-Scholte medium: MSS) 내에 존재하였다[23, 24]. 균주 Bp-WWC 및 Bp-WWD의 결과는 표 1 및 2에 나타낸다. PT의 생산은 Bp-WWC 및 wt에 대해 비교한 것으로서 균주 Bp-WWD에서 약 2배이었다. 토하마는 발현 수준 및 구조 유전자 무리의 카피들의 수의 예측된 상관관계를 나타낸다.
[표 1]
균주 토하마, Bp - WWC 및 Bp - WWD 에 의한 PT 생산 . 세포를 진탕 플라스크들 속에서 48시간(실험 #1) 또는 20 내지 24시간(실험 #2) 동안 MSS 배지에서 성장시켰다. 2개의 독립된 플라스크의 결과를 실험 #2에 대해 나타낸다. 원심분리에 의해 수거한 후, 상층액을 토끼 폴리클로날 항체를 사용한 직접적인 ELISA에 의해(실험 #1) 또는 포획 시약으로서 토끼 폴리클로날 항체 및 검출용으로 S2-특이적인 모노클로날(제조원: Abcam)을 사용한 샌드위치 ELISA에 의해 검정하였다.
Figure 112014057681040-pct00001
[표 2]
균주 Bp - WWC 및 Bp - WWD abd Bp - WWE 에 의한 PT 및 FHA 생산 . 세포를 진탕 플라스크 속에서 24 또는 36시간 동안 MSS 배지에서 성장시켰다 원심분리로 수거한 후, 상층액을 PT 및 FHA에 대해 포획 시약으로서 토끼 폴리클로날 항체를 사용하고 검출용의 S2-특이적인 모노클로날(제조원: Abcam) 또는 FHA 모노클로날 시약(NIBSC)을 사용하는 샌드위치 ELISA에 의해 검정하였다.
Figure 112014057681040-pct00002
진탕 플라스크에서 PRN의 발현
MSS 배지에서 성장시킨 Bp-WWC, Bp-WWD 및 Bp-WWE의 진탕 플라스크 배양물 속에서 PRN의 생산. 이의 막-결합된 전구체로부터 PRN 방출은 확인되지 않은 프로테아제에 의한 정밀한 절단의 결과이므로[25], PRN 발현은 웨스턴 블롯 밀도계측 분석(western blot densitometric analysis)으로 측정하여 항원의 완전성도 평가하였다. 고-밀도 발효기 배양물에서, PRN의 유의적인 분획이 막-결합된 전구체(발표되지 않은 관찰)로부터의 배양 상층액 내로 자발적으로 방출된다. 따라서, 이 특성이 도입된 유전적 변형에 의해 변형되었는지의 여부를 시험하였다. PRN을 선명한 배양 상층액 상에서 및 분리된 세포의 60℃ 추출물 상에서 분석하였다. 결과는 표 3에 나타낸다. Bp-WWC 및 Bp-WWD에서 PRN 독소의 양은 유사하였다. 2배 증가가 Bp-WWE에서 발견되었으며, 이는 발현 수준과 유전자 카피 수의 양호한 상관관계를 다시 나타낸다. 그러나, Bp-WWE를 사용하는 경우, 배양 상층액 내에서 발견된 PRN의 분획은 비록 이들 플라스크 배양물 내에서라고 해도 증가하였고, 상층액 분획은 소량으로 또는 무시할 정도로 잔존하였다.
[표 3]
균주 Bp - WWC , Bp - WWD 및 Bp - WWE 에 의한 PRN 생산. 세포를 진탕 플라스크 내에서 48시간 동안 성장시켰다. 상층액 및 세포를 원심분리로 분리하였다. 세포를 원래의 배양 용적의 추출물 완충액 내로 현탁시키고 60℃로 30분 동안 가열한 후 다시 원심분리하여 추출물을 수집하였다. PRN을 분획 둘 다에서 웨스턴 블롯으로 검정하였다.
Figure 112014057681040-pct00003
모든 이들 플라스크 배양물 속에서 PRN의 수준은 유사한 조건에서 PT 및 FHA의 농도 이하이었다. PRN이 PT보다 덜 효율적으로 생산되지만, 결과는 고 밀도 발효기 배양물 내에서 일반적으로 이루어진 발견을 반영하지 않는다. 이러한 불일치는 PRN이 세포 표면 단백질인 반면 PT 및 FHA는 분비된다는 사실에 의해 설명되며, 진탕 플라스크 내에서의 필요성에 의해, 성장 시간은 세포 용해 및 항원 분해를 피하기 위해 제한되므로, 바이오매스(biomass) 성장 시간은 24 내지 36시간으로 제한되고 배양물은 PRN의 주요 공급원을 상응하게 제한하는, 1 내지 1.5의 최대 OD650에 도달할 수 있다.
PT 불활성화의 평가
PT는 오츠센기즈(Ozcengiz)의 공정을 변형시켜 배양 상층액으로부터 정제하였으며[26], 여기서 초기 황산암모늄 침전은 리간드 교환 크로마토그래피로 대체하였다[27, 28]. 야생형 비. 페르투씨스로부터의 PT 독소 및 Bp-WWC(일반적으로 불활성화된 PT)의 독성을 분석하고 CHO 세포 무리화 시험으로 비교하였다[29]. 이 시험은 PT에 대해 보고된 다른 기능성 검정보다 훨씬 더 높은 민감성을 갖는다. 균주 비. 페르투씨스 토하마로부터 정제된, 천연의 독소는, 웰당 2.6pg에서 무리화 종점(clustering endpoint)을 입증하였다. 유전적으로 불활성화된 PT는 이 시험에서 수득된 최대 농도, 즉, 시료당 0.8 내지 1.6 ㎍에서 무리화를 촉진하지 않았다(도 7). 따라서, 이 시험은 PT의 낮은 용해도에 의해 부과된 제한을 고려할 때, 5 x 105 내지 106의 인자의 독성의 감소를 입증한다. 이 결과는, Bp-WWC로부터의 PT 독소가 PT 소단위 S1 내에서 2개의 아미노산 치환을 생성하는 5개의 뉴클레오타이드 대체에 의해 성공적으로 불활성화되었음을 나타낸다.
토의
이들 실험들]에서 표시되지 않은 유전자 삽입 및 대체는 비. 페르투씨스에서 벡터로서 pSS4245를 사용함으로써 성공적이었다. 플라스미드의 절개를 유발하는 제2의 동종 재조합 후, 항생제 유전자 마커 또는 어떠한 반흔(scar)도 cre-lox 시스템[30] 또는 보르데텔라(Bordetella)에서 사용된 이잔의 대립형질 교환 과정[22]과 비교하는 경우 염색체 내에 잔류하였다. 유전적으로 불활성화된 PT 독소의 과생산은 1992년에 ptx 유전자의 나란한 반복물 또는 fha 유전자 내로 삽입된 다른 카피를 사용함에 의해 보고되었다[20]. 수득되는 균주는 PT를 80 mg/L까지 과생산하였다. 나란히 반복된 유전자는 유전적 불안전성의 공지된 잠재적 원인이다. 이러한 이유로, 비. 페르투씨스의 게놈 서열을 스캐닝하여 적합한 통합 부위를 발견하였다. 위-유전자의 2개의 종결인자 사이의 DNA 위치를 ptx 무리를 위한 통합 부위들로서 선택하였다. PT 구조적 무리에 대한 카피 수는 이들 병독성 인자의 과발현이 세포 대사시 부하(burden)를 일으켜, 예비 시도가 제안했던 바와 같이, 보다 느린 성장 속도 및 궁극적으로 유전적 불안전성을 생성할 수 있으므로, 2개로 제한되었다.
본 발명자들은, 보다 높은 발현이 일어나도록 하기 위한 fha 프로모터에 의한 prn 유전자의 과-발현이, 가능하게는 보다 높은 PT 발현과 함께, 비. 페르투씨스 세포에 대해 명백하게 독성이었음을 보고하였다. 이들의 발견은 PRN 프로모터를 보다 강력한 프로모터로 대체함에 의한 증가된 PRN 발현을 확인하지 않았다[21]. 따라서, 천연의 PRN 프로모터의 조절 하에서 유전자 카피 수를 증가시키는 것은 선택된 시도였다. 제2의 유전자 카피의 fha 프로모터를 천연의 prn 프로모터로 대체하여 PRN 유전자의 제2의 카피 및 염색체 상에서 다른 위치 내로 삽입된 이의 천연의 프로모터를 가진 균주를 생성하였다. 숙주 세포에 대한 PRN의 독성은 또한 이. 콜라이에서 보고되었다[31]. 이후에, fha 프로모터를 천연의 prn 프로모터로 대체하였으며, 수득되는 균주는 진탕 플라스크 내에서 정상의 성장을 나타내었고 상응하는 2배 양의 PRN을 생산하였다. 배양 상층액과 세포 추출물 사이의 PRN의 분포는, 진탕 플라스크 내에서 상층액 내로 자발적으로 방출된 양이 최소라고 해도 상층액 속의 총 PRN의 보다 큰 분획으로 어느 정도 변형되었다.
진탕 플라스크내 성장은 신속한 pH 상승 및 글루타메이트 탄소 공급원의 대사에 의한 암모니아의 방출로부터 생성되는 중독으로 인하여 제한되지만[32], 이는 최적화된 발효기 조건 하의 균주 잠재성의 유용한 지표를 제공한다. PT(Bp-WWD) 또는 2개의 제한된 항체 PT 및 PRN(Bp-WWE)의 발현이 증강된 안정한 균주의 작제를 입증하였다. PT만의 증강된 생산으로, Bp-WWD는 단지 불충분한 양의 PRN을 생성할 수 있으며 이 경우, 재조합체 이. 콜라이 또는 피. 파스토리스(P. pastoris)에서 PRN의 독립적인 공급의 사용이 나타날 수 있다. 2개 항원 PT 및 PRN의 수준은 Bp-WWE로 동일하게 증가하였지만, 2개의 항원의 일치량은 또한 고 밀도 배양물 중에서 수득될 것으로 예측되므로, 생산 공정이 단순화된다.
결론
PT의 유전적으로 불활성화된 S1::R9K-E129G 소단위를 함유하는 비. 페르투씨스 균주는 이들의 염색체 내에 어떠한 마커 또는 반흔없이 작제되었다. PT 독소의 2배 증가가 염색체 상의 2개의 위-유전자 사이의 ptx - ptl 오페론 프로모터와 ptl 종결인자의 조절 하에서 5개의 구조 유전자(S1 돌연변이된 ptx)의 통합에 의해 진탕 플라스크에서 발견되었다. PT의 불활성화는 CHO 세포 무리화 검정에 의해 확인되었다. 더욱이, PRN 생산은 염색체 상의 어딘가에 다른 위-유전자 사이의 prn 유전자의 제2의 카피의 통합으로 증가되었다. 균주는 큰 규모의(>1000L) 발효에서 필수적일 수 있는 것 보다 더 높은 수의 세대를 재생하는 진탕 플라스크 계대배양물 속에서 유전적으로 안정한 것으로 밝혀졌다. 이들 균주, 특히 PT 및 PRN 항원의 상대적인 양이 백신의 조성물과 일치하는 Bp-WWE는 입수가능한 무세포성 페르투씨스 백신의 생산을 가능하게 하여, 2개의 제한된 항원 PT 및 PRN에 대한 균주의 적절한 면역원성 및 보다 높은 생산성을 위해 천연의 항원이 요구하는 보다 낮은 용량에 의한 비용 감소에 기여하는데 유용한 것으로 입증될 수 있다.
방법
세균 균주, 플라스미드 및 배양 조건
연구에서 사용된 모든 화학물질 및 시약은 분자 생물학 또는 분석 등급이었다. 화학물질은 머크(Merck) 및 시그마(Sigma)에서 구입하였다. 세균 배양 배지는 디프코(Difco)(미국 소재) 및 머크(독일 소재)에서 입수하였다. 제한 및 변형 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)(미국 소재)에서 구입하였다.
이. 콜라이 DH5α[제조원: 인비트로겐(Invitrogen), 미국 소재]를 클로닝 숙주로서 사용하였다. 이 균주를 37℃에서 루리아 버타니 배지(Luria Bertani medium)(LB) 속에서 성장시켰다. 이. 콜라이 DH5α형질전환체를 적절한 항생제인 암피실린(50㎍/ml) 또는 클로람페니콜(15㎍/ml)이 보충된 LB 속에서 성장시켰다. 이. 콜라이 SM10은 얼 에스. 스티비츠(Earle S. Stibitz) 박사[미국 식품의약국의 생물학 평가 및 연구 센터, 세균, 기생충, 및 알레르기항원 제품 부서(Division of Bacterial, Parasitic, and Allergenic Products, Center for Biologics Evaluation and Research, Food and Drug Administration, USA)]로부터 입수하여 접합 공여체 균주로서 사용하였다. 이 균주를 37℃에서 가나마이신(50㎍/ml)이 보충된 LB 속에서 성장시켰다. 이. 콜라이 SM10 형질전환체를 가나마이신(50㎍/ml), 암피실린(50㎍/ml) 및 네오마이신(10㎍/ml)이 보충된 LB 속에서 성장시켰다. 비. 페르투씨스 토하마는 ATCC로부터 입수하였으며 ATCC 기탁번호는 BAA-589(보르데텔라 페르투씨스 토하마 Ph. I 염색체 기탁번호 제NC_002929호, EMBL/GenBank 기탁번호 제BX470248호, 웰컴 트러스트 생거 인스티튜트(Wellcome Trust Sanger Institute)(http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/bacteria/bordetella.html)로부터 이용가능한 서열] [42])이다.
비. 페르투씨스 균주를 35℃에서 보르데트-겐고우(Bordet-Gengou)(BG) 아가 또는 변형된 슈타이너 스콜테 배지(MSS) 상에서 성장시켰다. 플라스미드 pBluescript II SK+를 미국 소재의 스트라타젠(Stratagene)에서 입수하였고, pSS4245는 얼 에스. 스티비츠(Earle S. Stibitz) 박사에게서 입수하였으며 pACYC184는 뉴 잉글랜드 바이오랩스[New England Biolabs)(미국 소재)]에서 입수하였다.
[표 4]
프라이머
Figure 112014057681040-pct00004
Figure 112014057681040-pct00005
Figure 112014057681040-pct00006

S1 플랭킹 영역의 클로닝 및 클로람페니콜 유전자의 삽입
비. 페르투씨스 균주 토하마의 염색체 DNA를 공급원 물질로 사용하였다. S1 유전자의 상부 영역을 5'F-PT-SalI 및 5'R-PT-MCS 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 후자는 KpnI, XbaI, BglII 및 NotI 부위를 함유한다. 증폭, 생성물을 아가로즈 겔로부터 회수하여 QIAEX II 추출 키트[제조원: 퀴아겐(Qiagen)]로 정제하였다. 1287 bp 증폭 생성물을 SalI 및 NotI로 분해하고 동일한 효소로 분해한 이. 콜라이 벡터 pSK△KpnI 내로 클로닝하였다. pSK△KpnI는 pBluescript II SK+의 유도체이며, 여기서 KpnI 부위는 분해에 의해 제거되고, 클레노우(Klenow) 효소로 채워지며 재-환형화된다. 수득되는 작제물을 열 쇼크(heat shock)에 의해 이. 콜라이 DH5α의 적격 세포(competent cell) 내로 형질전환한 후 pSK5'로 지정하였다. 하부 영역은 3'F-PT-XbaI 및 3'R-PT-BglII 프라이머로 증폭시켜 유사하게 수득하였다. 1531 bp 생성물을 XbaI 및 BglII로 분해하고 회수된 단편을 동일한 효소로 분해한 pSK5'내로 삽입하여 pSK53을 수득하였다.
Cm R 유전자를 플라스미드 pACYC184로부터 수득하였다. 유전자를 프라이머 CmF-KpnI 및 CmR-XbaI를 사용하여 증폭시켰다. 1295 bp의 PCR 생성물을 정제하고 KpnI 및 XbaI으로 분해하고 동일한 효소로 절단한 pSK53 내로 삽입하였다. 수득되는 플라스미드를 pSK5Cm3으로 지정하였다. 상기 플라스미드는 S1 유전자의 5'-상부 및 3'-하부 영역들에 의해 플랭킹된 클로람페니콜 내성 유전자를 혼입한다(도 2A).
동종 재조합에 의한 S1 유전자의 교환
비. 페르투씨스 내로 대립형질 교환을 수행하기 위하여, 새로이 개발된 벡터pSS4245(도 1)를 사용하였다. 상기 벡터의 완전한 설명은 발표되어 있지 않으므로 본 발명자들은 이의 구조의 개관을 본원에서 보고한다. 상기 벡터는 보르데텔라(Bordetella) 종에서 대립형질 교환을 위해 특별하게 설계되었다. 이는 다중링커 클로닝 부위(여기에 염색체 상의 목적 유전자 및 이의 플랭킹 서열이 삽입될 수 있음), 이. 콜라이 내에서 벡터 및 이의 유도체를 선택하는데 사용된 암피실린을 포함하는 수개의 항생제 내성 유전자를 함유한다. 복제 오리진(origin of replication)은 pBR322로부터 기원하며, 이는, 상기 벡터가 이. 콜라이내에서 복제할 수 있지만 비. 페르투씨스 내에서 자멸함을 내포한다. 또한, Tn5로부터 기원한 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 존재하며: 상기 유전자는 비. 페르투씨스에 대해서 스트렙토마이신 내성을 부여하지만 이. 콜라이에 대해서는 그렇지 않다[33]. 이. 콜라이 공여체와 비. 페르투시스 수용체 사이의 접합적 전달은 플라스미드 RP4로부터 기원한 전달 오리진의 존재로 인하여 발생할 수 있다. 이는 공여체 균주로서 이. 콜라이 SM10의 사용을 필요로 하며, RP4로부터 기원한 필수적인 접합성 기능을 인트랜스(in trans)로 제공한다[22]. 접합은 수용체 비. 페르투씨스 및 공여체 이. 콜라이를 2개의 세균 성장을 지지하는 아가 플레이트 속에서 함께 스트라이킹(streaking)함으로써 단순히 발생한다. 벡터는 비. 페르투씨스 속에서 자멸되므로, 스트렙토마이신은, 목적한 유전자를 플랭킹하는 영역 중 하나 속에 동종 재조합에 의해 전체 벡터 및 이의 Str R 마커가 통합된 비. 페르투씨스 세포에 대해 선택하며 동시에 이. 콜라이 공여체를 제거한다. 이러한 동시-통합을 해결하고 제거하기 위해, 벡터의 대부분은 목적한 유전자를 저장하며, pSS4245는 I-SceI 메가뉴클레아제 유전자를 상응하는 절단 부위와 함께 혼입한다(도 1)[34]. 뉴클레아제는 ptx-ptl 오페론 프로모터의 조절 하에 위치시킨다. 비. 페르투씨스 염색체 상에 상응하는 절단 부위는 존재하지 않는다. 통합물(cointegrates)의 선택은 조절된 조건하에 수행되어야 하며, 여기서, PT를 포함하는 비. 페르투씨스의 병독성 인자 모두는 억제된다. 상기 조건은 20mM의 니코틴산을 교배 공정(mating process)에 사용된 MSS-아가 플레이트에 가하여 수득하였다. 접합완료체 혼합물을 니코틴산을 첨가하지 않고 MSS-아가에 전달하는 것은 ptx 프로모터 억압을 완화시키므로 I-SceI 뉴클레아제가 이후에 발현된다. 이는 통합된 벡터내 뉴클레아제 부위의 수준에서 세균 염색체내 이중 사슬 파괴(double strand break)를 유발한다. 이러한 현상은, 복구되지 않는 경우 치명적이다. DNA 손상은 또한 복구에 대한 SOS 반응을 활성화시키고; 재조합 빈도는 2 내지 3 log까지 증가하며 병변은 제2의 동종 재조합에 의해 궁극적으로 제거된다[34]. 어떠한 경우에도, 벡터의 대부분은 손실된다. 제2의 재조합이 동일한 플랭킹 영역에서 발생하는 경우, 원래의 균주가 재생되며, 이것이 다른 플랭킹 영역에서 발생하는 경우, 목적한 균주가 수득된다. 약간의 콜로니가 거의 동일한 크기인 플랭킹 영역과 함께 이들의 클로람페니콜 내성 상태에 대해 스크리닝될 필요가 있으며, 균주의 2개의 수득되는 유형, 즉 모 균주 및 재조합체는 거의 동등하게 분포된다.
플라스미드 pSK5Cm3를 SacI 및 BglII로 분해하고 회수된 단편을 SacI 및 BamHI으로 절단한 pSS4245내로 연결하였다. 이. 콜라이 SM10 내로 형질전환한 후 수득되는 플라스미드를 pSS5Cm3으로 지정하였다. 비. 페르투시스 균주 토하마(20mM 니코틴산이 첨가된 MSS-아가 상에서 4일) 및 벡터를 지닌 이. 콜라이 SM10(암피실린, 가나마이신 및 클로람페니콜이 들어있는 LB-아가 위에서 밤새)의 신선한 배양물을 긁어내어 LB:MSS(1:1)와 함께 20mM 니코틴산 및 10 mM MgCl2를 함유하는 아가 플레이트 상에서 혼합하였다. 35℃에서 3시간 후에, 혼합물을 MSS 위로 20mM 니코틴산, 50㎍/mL 스트렙토마이신 및 5㎍/mL 클로람페니콜과 함께 닦았다(swabbing). 닦은 성장물을 5㎍/mL 클로람페니콜이 들어있는 MSS-아가 상에 제2의 재조합 현상을 위해 스트라이킹하였다. 수득되는 단일 콜로니를 복제 평판으로 시험하여 SmS 및 CmR 표현형을 지닌 소수의 콜로니를 추가의 시험을 위해 보유하였다(도 3A). 콜로니는 비. 페르투씨스 특이적인 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 비. 페르투씨스로 확인되었다. 지정된 위치에서 Cm R 유전자의 통합은 상부 5'(5'F-int 및 5'RCM-int 프라이머) 및 3'(3'FCM-int 및 3'R-int 프라이머) 하부 플랭킹 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하고 내부적으로 Cm R 유전자 내에서 PCR로 확인하였다. PCR 분석으로부터, 5' 및 3' 플랭킹 영역이 존재하였으며, Cm R 유전자가 S1 유전자 대신 예측된 위치에 삽입되었음을 확인하였다. 이러한 입증은 또한, 대립형질 교환 과정이, 재조합이 일어난 S1 플랭킹 영역내 임의의 변경을 유발하지 않았음을 확인하였다.
변형된 S1 유전자의 작제
S1 유전자를 PCR 증폭으로 클로닝하여 부위-지시된 PCR 돌연변이유발로 돌연변이시켰다. 프라이머 S1F-PT-KpnI 및 S1R-PT-XbaI를 사용하여 염색체 DNA로부터 유전자를 증폭시켰다. 정제된 PCR 생성물을 XbaI 및 KpnI으로 분해하고 회수된 908bp 단편을 동일한 효소로 절단한 pSK53 내로 연결하였다. 형질전환 및 콜로니 선택 후 수득되는 플라스미드를 pSK5S13로 지정하였다.
부위-지시된 PCR 돌연변이유발은 R9K 치환을 유발하는 서열 미스매치 CGC→AAG를 지닌 내부 F-R9K 및 R-R9K 프라이머를 사용하였다. 이들 프라이머는 별도의 반응 사이클에서 사용하였다. 증폭 생성물을 이후에 합하고 증폭을 어닐링(annealing) 후 4 내지 5주기 동안 지속하였다. 이후에, 외부 프라이머를 반응물에 가하여 목적한 돌연변이를 함유하는 전체 S1 단편을 생성시켰다. 동일한 과정을 적용하여 내부 미스매치된 프라이머 F-E129G 및 R-E129G를 사용한 제2의 돌연변이를 생성시켜, E129G 치환을 유발하는, 서열 GAA→GGG를 생성하였다.
수득되는 단편을 XbaI 및 KpnI로 분해하여 동일한 효소들로 절단한 pSK53 내로 삽입시킴으로써 플라스미드 pSK5S13-9K-129G를 수득하였다(도 2B). 이를 SacI 및 BglII로 분해하고 회수된 단편을 SacI 및 BamHI로 절단한 pSS4245 내로 연결하였다. 이. 콜라이 SM10 내로 형질전환시킨 후 수득되는 플라스미드를 pSS5S13-9K-129G로 지정하였다.
변형된 S1 유전자를 비. 페르투씨스 염색체내 이의 원래의 위치 내로 다시 삽입시키기 위한 대립형질 교환을 위에서와 같으나 클로람페니콜에 의한 접합완료체의 선택없이 수행하였다. 상기 경우에 목적한 균주는 마커를 손실하므로 복제 평판에 의한 스크리닝이 목적한 표현형 CmS 및 SmS을 지닌 콜로니들를 확인하는데 필수적이었다. 수득되는 토하마 유도체를 Bp-WWC로 지정하였다(도 3B). 설계된 위치에서 S1 돌연변이된 유전자의 통합은 특이적인 프라이머를 사용한 PCR로 확인하였다. 상기 프라이머는 상부 5'(5'F-int 및 R-R9K 프라이머) 및 3'(F-E129G 및 3'R-int 프라이머) 하부 플랭킹 영역 및 S1 유전자 내부에 결합할 수 있었다.
5 PT 구조 유전자의 제2의 세트의 삽입
표적화된 삽입 부위를 플랭킹하는 서열(도 4A)을 우선 클로닝하여 pSKPD5Cm3를 수득하였다. 상부 1688 bp 단편을 프라이머 5'F-PD-ApaI 및 5'R-PD-MCS로 증폭시키고, ApaI 및 KpnI으로 분해하고 동일한 효소로 절단한 pSK5Cm3내로 연결시켜 pSKPD5'-Cm을 수득하였다. 하부 2980 bp 단편을 XbaI 및 BglII로 분해한 프라이머들 3'F-PD-MCS 및 3'R-PD-BglII로 증폭시키고 동일한 효소로 절단한 pSKPD5'-Cm내로 연결하였다. 수득되는 플라스미드는 pSKPD5Cm3로 지정하였다(도 4B).
접합성 작제물은 플라스미드를 NotI 및 BglII로 분해하고 NotI 및 BamHI로 분해한 pSS4245내로 연결시켜 수득하였다. 수득되는 플라스미드 pSSPD53-Cm. SmS 및 CmR에 대한 접합성 전달 및 선택으로 목적한 비. 페르투씨스 유도체 Bp-PD53-Cm이 제공되었으며, 여기서 완전한 상부, 하부 및 CmR 삽입체의 존재를 PCR 증폭으로 확인하였다. 프라이머는 상부 5'(5'FPD-int 및 5'RCM-int 프라이머) 및 3'(3'FCM-int 및 3'RPD-int 프라이머) 하부 플랭킹 영역 및 Cm R 유전자 내부에 결합할 수 있었다.
이의 프로모터를 지닌 ptx 오페론의 기능적 카피는 ptx-ptl 종결인자를 S3 유전자 다음에 삽입시켜 생성하였다. 이의 오페론 프로모터를 지닌 PT의 5개의 구조 유전자(변형된 S1, S2, S4, S5, S3)를 Bp-WWC DNA로부터 프라이머 PtxF-BamHI 및 PtxR-MCS를 사용하여 증폭시켰다. 3469 bp의 증폭된 생성물을 BamHI 및 SpeI로 분해하고 회수된 단편을 동일한 효소로 절단한 pSK□RI내로 연결시켜 pSKptx를 수득하였다. pSK□RI는 pBluescript II SK+의 변이체이며, 여기서 EcoRI 부위를 분해로 제거하고 클레노우 효소(Klenow enzyme)로 충전시키고 재-환형화시켰다.
이후에, ptx - ptl 오페론 종결인자를 TerF-EcoRI 및 TerR-SpeI 프라이머로 증폭시켰다. 223bp 생성물을 EcoRI 및 SpeI으로 이중 분해하고 동일한 효소로 절단한 pSKptx 내로 연결시켰다. 형질전환 및 콜로니 선택 후, 수득되는 플라스미드를 pSKptxter로 지정하였다(도 4C). 상기 플라스미드를 이어서 BamHI 및 SpeI 로 이중 분해하고 동일한 효소로 절단한 pSSPD5Cm3 내로 연결시켜 접합성 벡터 pSSPDptxter를 수득하였다. Bp-PD53Cm 내로의 대립형질 교환을 SmS 및 CmS 콜로니에 대한 레플리카 스크리닝을 사용하여 상기 기술한 바와 같이 수행하여 Bp-WWD로 지정된 균주를 수득하였다. 지정된 위치에서 S1 돌연변이된 유전자의 통합을 특이적인 프라이머를 사용한 PCR로 확인하였다. 프라이머는 상부 5'(5'FPD-int 및 R-R9K 프라이머) 및 3'(F-E129G 및 3'RPD-int 프라이머) 하부 플랭킹 영역 및 내부 S1 유전자에 결합할 수 있었다.
PRN 구조 유전자의 제2의 카피의 삽입
PRN 구조 유전자의 제2의 카피를 통합시키기 위해 선택된 표적 부위 내로 클로람페니콜 내성 유전자의 통합.
BamHI 부위를 결여하고 있는 pBluescript SK+의 유도체를 효소를 사용한 분해로 작제하고, 클레노우 효소로 충전하고 연결하였다. 수득되는 플라스미드를 이. 콜라이내로 형질감염시키고 pSK△H1으로 지정하였다.
비. 페르투씨스 토하마 균주의 서열을 스캐닝하고 위-유전자를 확인하였다. 추정의 글루타티온 S-트랜스퍼라제 위-유전자와 추정의 아스파르테이트 라세마제 위-유전자 사이의 DNA 서열을 삽입 위치(1,344,710 내지 1,345,685번 위치 및 1,345,693 내지 1,346049번 위치)로 선택하였다. 이들 유전자는 프레임쉬프트 돌연변이를 수반하며 기능성이지 않다(도 6A).
표적화된 삽입 부위에 대한 5'-상부 영역을 SpeI(5'F-PD2-SpeI)을 지니는 프라이머 및 BamHI 및 NotI(5'R-PD2-MCS) 제한 부위를 포함하는 멀티링커를 사용하여 증폭시켰다. 증폭된 생성물을 겔 전기영동으로 분리하고 SpeI 및 NotI로 이중 분해하였다. 수득되는 단편을 동일한 효소들로 분해한 pSK△H1의 단편내로 연결하였다. 수득되는 플라스미드를 이. 콜라이 내로 형질전환시키고 pSKPD25로 지정하였다. 3'-하부 단편을 XbaI(3'F-PD2-XbaI) 및 NotI(3'R-PD2-NotI) 제한 부위를 지니는 프라이머로 유사하게 증폭시켰다. 동일한 효소를 사용한 분해 후, 수득되는 단편을 동일한 효소로 분해한 pSKPD25의 단편 내로 연결시켰다. 수득되는 플라스미드를 이. 콜라이내로 형질전환시키고 pSKPD253으로 지정하였다.
클로람페니콜 내성 부위는 BamHI(CmF-BamHI) 및 XbaI(CmR-XbaI) 제한 부위를 지니는 프라이머를 사용하여 플라스미드 pACYC184로부터 PCR 증폭으로 수득하였다. PCR 생성물을 2개의 효소로 분해하고 동일한 효소로 절단한 pSKPD253 내로 클로닝하였다. 연결 후 수득되는 플라스미드를 이. 콜라이내로 형질전환시키고 제한 분석으로 검증하여 pSKPD25Cm3로 지정하였다.
제한 맵핑(restriction mapping)으로 검증한 후, 플라스미드를 NotI 및 SpeI로 분해하고 수득되는 단편을 동일한 효소로 이중 분해한 pSS4245 내로 연결시켰다. 수득되는 플라스미드를 pSSP2D5Cm3으로 지정하고 이. 콜라이 SM10 내로 형질전환시켰다.
접합을 수용체 비. 페르투씨스 균주로서 Bp-WWD를 사용하고 CmR 및 SmS 단일 콜로니의 선택을 사용하여, 상기와 같이 수행하였다. 설계된 위치에서 Cm R 유전자의 통합을 상부 5'(5'FPD2-int 및 5'RCM-int 프라이머) 및 3'(3'FCM-int 및 3'RPD2-int 프라이머) 하부 플랭킹 영역 및 Cm R 유전자의 내부에만 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용한 PCR로 확인하였다.
fha 프로모터의 조절 하에 prn 유전자의 통합
PRN의 구조 유전자를 비. 페르투씨스 DNA로부터 ATG 출발 코돈(F)에서 출발하는 프라이머 및 XbaI(R) 제한 부위를 지니는 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 암호화 영역 및 종결인자만을 함유하는 2,808bp의 증폭된 생성물을 'A' 테일링 프로토콜('A' tailing protocol)(공급원: Promega)로 처리하였다. 수득되는 단편을 pGEM-T 이지 벡터(easy vector) 내로 클로닝하였다. pGEM-TPRN으로 지정한 수득되는 플라스미드를 제한 분석으로 검증하였다. 보다 강력한 FHA 프로모터에 의해 구동된 PRN 유전자의 제2의 카피를 생성하기 위한 초기 정밀검사에서, FHA 프로모터를 비. 페르투씨스 DNA로부터 PCR 증폭에 의해 분리하여 PRN 유전자의 앞쪽에 삽입하였다. FHA 프로모터는 BamHI(FHAproF-BamHI)를 지니는 프라이머 및 NdeI-XbaI(FHAR-MCS)를 함유하는 폴리링커로 증폭시켰다. 정제된 생성물을 BamHI 및 XbaI으로 절단한 후 회수된 DNA 단편을 또한 동일한 효소들로 절단한 pSKPD253 내로 연결시켰다. pSKPD253Fp로 지정한 수득되는 플라스미드는 제한 분석으로 검증하였다. 상기 플라스미드를 NdeI 및 XbaI로 절단한 후 pGEMTPRN으로부터 PRNF-NdeI 및 PRNR-XbaI 프라이머에 의해 증폭시키고 동일한 효소로 절단한 prn 유전자의 PCR 생성물과 연결시켰다. 수득되는 플라스미드는 pSKPD25FpPRN3로 지정하였다(도 6B). 접합성 작제물은 상기 플라스미드를 NotI 및 SpeI으로 분해하고 동일한 효소로 분해한 pSS4245내로 연결시켜 수득하였다. 수득되는 플라스미드는 pSSPD2FpPRN로 지정하였다. 상기 작제물을 Bp-WWD 염색체의 선택된 위치에서 삽입하여 상기 기술한 바와 같은 일반적인 대립형질 교환 과정 및 스크리닝을 사용하여 도입된 클로람페니콜 내성 마커를 대체하였다.
prn 프로모터의 조절 하에서 prn 유전자의 발현
PRN 프로모터는 제한 부위 BamHI(PrnProF-BamHI) 및 NdeI(PRNProR-NdeI)를 갖는 프라이머를 사용하여 비. 페르투씨스 DNA의 PCR 증폭에 의해 클로닝하였다. 플라스미드 pSKPD25FpPRN3을 BamHI 및 NdeI로 절단하여 FHA 프로모터를 상실하고 있는 단편을 생성하였다. PRN 프로모터를 이의 위치 내에 연결하였다. 이. 콜라이 내로 형질전환시키고 제한 분석으로 검증한 후, 수득되는 플라스미드는 pSKPD25PRN3로 지정하였다(도 6C). 플라스미드를 NotI로 절단하고 동일한 효소로 절단한 pSS4245 내로 삽입하였다. 수득되는 작제물, pSSPD2prn을 이. 콜라이 SM10 내로 형질전달하여 대립형질 교환을 수행하였다. 수득되는 비. 페르투씨스 균주는 Bp-WWE로 지정하였다. 지정된 위치에서 prn 유전자의 통합은 상부 5'(5'FPD2-int 및 PRNProR-NdeI 프라이머) 및 3'(PRNF-int 및 3'RPD2-int 프라이머) 하부 플랭킹 영역들 및 prn 유전자의 내부에만 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용한 PCR로 확인하였다.
진탕 플라스크 배양물 내에서 PT, FHA 및 PRN 발현
Bp-WWC, Bp-WWD 및 Bp-WWE를 메틸화된 β-사이클로덱스트린이 보충된 100 ml의 MSS 배지가 들어있는 진탕 플라스크 속에서 35℃, 200rpm에서 성장시켰다. 32 내지 48시간 성장 후, 배양 상층액을 수집하고 ELISA로 분석하여 PT 및 FHA 발현 수준을 정량화하였다. PRN 발현은 웨스턴 블롯 밀도계 분석으로 측정하여 항원의 완전성을 평가하였다. 검정은 투명한 배양 상층액 상에서 및 등장성 완충액 중 60℃로 가열하여 수득한 세포 추출물 상에서 모두에서 수행하였다.
PT 및 FHA 를 위한 ELISA 검정
PT 또는 FHA에 대한 정제된 토끼 폴리클로날 항체(1:1000, 제조원: 태국 소재의 NLAC)를 96-웰 플레이트(제조원: NUNC Maxisorp) 속에서 탄산염/중탄산염 완충액(pH 9.6) 속에서 웰당 100μL로 피복시키고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 0.1% 트윈 20이 들어있는 인산염-완충된 염수 pH 7.4(PBST)로 3회 세척한 후, 3% 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 PBST의 웰당 100μl를 사용하여 차단을 수행하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 차단 완충액을 버리고 세척한 후, 표준 PT, FHA 또는 시료의 희석물을 로딩하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. PBST로 3회 세척한 후, 차단 완충액 중 100μL의 항-PT 소단위 S2 마우스 모노클로날 항체(1:30,000, 제조원: 미국 소재의 Abcam) 또는 항-FHA 마우스 모노클로날 항체(1:10,000, 제조원: 영국 소재의 NIBSC)를 가하고 동일한 조건 하에서 항온처리하였다. 웰을 PBST로 3회 세척한 후, 토끼 항-마우스(H + L) IgG-HRP 접합체(제조원: 미국 소재의 Abcam)의 차단 완충액 중 1:10,000 희석물 100μL를 제2의 항체로서 사용하여 37℃에서 1시간 동안 다시 항온처리하였다. PST로 세척한 후, 100μL의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(제조원: 미국 소재의 KPL)을 효소 기질로서 가하였다. 색상 반응을 웰당 100μL의 1N HCl을 사용하여 종결시켰다. 광학 밀도는 미세역가 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.
PRN 을 위한 웨스턴 블롯 검정
표준 PRN의 희석물 및 시료를 10% SDS-PAGE 겔 속에 용해한 후 반-건조 블롯팅 시스템을 사용하여 PVDF 막으로 이동시켰다. 막을 PBST 중 5% 탈지유로 1시간 동안 차단하였다. 차단 용액을 버리고, 막을 차단 완충액 중 20mL의 항-PRN 양 혈청(1:10,000, 제조원: 영국 소재의 NIBSC)과 함께 1시간 동안 항온처리한 후, PBST로 3회 세척하였다. 이후에, 막을 동일한 조건 하에서 20mL의 토끼 항-양 IgG-HRP 접합체(제조원: 미국 소재의 Santa Cruz Biotechnology)와 함께 동일한 조건 하에서 항온처리하고 다시 세척하였다. 이후에 막을 갈색이 현상될 때까지 3,3'-디아미노벤즈아미딘 속에 침지시켰다. 반응을 탈이온수로 2 내지 3회 세정하여 종결시킨 후 실온에서 두어 건조시켰다. 막을 스캐닝하고 사진 파일로 전환하였다. PRN 농도는 시료의 밀도계 분석 및 정밀한 소프트웨어를 사용한 참조 밴드로부터 기원하였다.
유전적 안전성
균주를 100ml의 MSS 배지에서 35℃ 및 200 rpm에서 48시간 동안 배양한 후, 0.1ml의 배양물을 100ml의 MSS 내로 이전시킨 후 동일한 조건하에 항온처리하고 단계를 4회 이상 반복하였다. 각각의 전달은 10 세대에 상응한다. 배양물을 희석시키고 MSS 아가 상에서 플레이팅하였다. 30개의 분리된 콜로니를 무작위적으로 골랐다. 선택된 30개의 콜로니에서 2개를 PCR로 분석하여 PT 및 PRN 삽입물의 예측된 존재를 검출하였다.
CHO 세포 무리화 검정
차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 무리화 활성을 헤울레트(Hewlett) 등의 방법[28]으로 측정하였다. 간단하게, CHO 세포를 10% 태아 소 혈청이 보충된 cRPMI 1640 배지에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2 대기 하에 항온처리할 것이다. 배양된 세포를 트립신처리하고 cRPMI 1640 배지를 사용하여 2 x 104개 세포/ml로 조절하여 96-웰 미세-배양 플레이트의 웰에 각각 200μl 부분을 분배시켰다. 시험 시료들 및 참조 PT 독소를 인산염 완충된 염수(PBS) pH 7.4 속에서 10배 간격으로 연속적으로 희석시키고 25μl의 용적의 희석액을 웰에 가하였다. 동일한 조건에서 48시간 동안 항온처리하여 최대 무리화를 허용한 후, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 사진촬영을 하였다.
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참조문헌
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<110> BioNet-Asia, Co. Ltd <120> Modified Bordetella Pertussis Strains <130> IPA140503-ZA <150> ZA 2011/09417 <151> 2011-12-21 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'F-PT-SalI <400> 1 gcggtcgacg gcgcgcaatg cggcgcggac 30 <210> 2 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'R-PT-MCS <400> 2 gggggcggcc gcgagatctc tctagacggt accatcgcgc gactttgcgc cgaagga 57 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'F-PT-XbaI <400> 3 cgttctagac ctggcccagc cccgcccaac 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'R-PT-BglII <400> 4 ggcagatctg cagttcgagc agatcgccgg 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmF-KpnI <400> 5 cgcggtacct gatgtccggc ggtgcttttg 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmR-XbaI <400> 6 aatctagata tcgtcaatta ttacctccac 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S1F-PT-KpnI <400> 7 gatggtaccg gtcaccgtcc ggaccgtgct 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S1R-PT-XbaI <400> 8 caggtctaga acgaatacgc gatgctttcg 30 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-R9K <400> 9 gggcgggagt catacttgta tacggtggcg g 31 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-R9K <400> 10 ccgccaccgt atacaagtat gactcccgcc c 31 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-E129G <400> 11 ccacctacca gagcgggtat ctggcacacc gg 32 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-E129G <400> 12 ccggtgtgcc agatacccgc tctggtaggt gg 32 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'F-PD-ApaI <400> 13 ggagggccca tgaaactcgt catcgccatc atcaagccc 39 <210> 14 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'R-PD-MCS <400> 14 tacggtaccg gatcccgcat cgcaacaacg gggtcatcgc gaccc 45 <210> 15 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'F-PD-MCS <400> 15 cgttctagaa ctagtccgct accaggtgta gcgatagccc aggtg 45 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'R-PD-BglII <400> 16 tgtagatctc ggcgagatac ttgcgtttcg gcgttgtcg 39 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PtxF-BamHI <400> 17 ttgggatccc agcgcagccc tccaacgcgc catcc 35 <210> 18 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PtxR-MCS <400> 18 tctactagta agaattctcg cggtatccgt caaggaaaaa catggac 47 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TerF-EcoRI <400> 19 gcggaattcc gcctgccgcc tgcacgcat 29 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TerR-SpeI <400> 20 tccactagtc aagggcatcg ggcgccggc 29 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'F-PD2-SpeI <400> 21 cgcactagtc tattccagcg gcgggtcgaa atggc 35 <210> 22 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'R-PD2-MCS <400> 22 ccccaggcgg ccgctgtcta gagtggatcc caggccgatg cgtccgccgt gcaggc 56 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'F-PD2-XbaI <400> 23 atctctagaa tgggcacctc ggccacgctg gcgctg 36 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'R-PD2-NotI <400> 24 aagtatcgcg gccgatgagc gaaaccctgt tgaaagtatc 40 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmF-BamHI <400> 25 cgcggatcct gatgtccggc ggtgcttttg 30 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FHAproF-BamHI <400> 26 tctggatccc tgcgctggca cccgcggcgg gccg 34 <210> 27 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FHAR-MCS <400> 27 gcctctagat tcatatgatt ccgaccagcg aagtgaagta at 42 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRNF-NdeI <400> 28 ctggtcggca tatgaacatg tctctgtcac gcattg 36 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRNR-XbaI <400> 29 gcctctagag cctggagact ggcaccggcc aagc 34 <210> 30 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PrnProF-BamHI <400> 30 cggggatccg caccctggcc tgcggggcgg gacc 34 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRNProR-NdeI <400> 31 agacatgttc atatggatgc caggtggaga gcaga 35 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'F-int <400> 32 ctagcgttcg cataccaaat ccttgc 26 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'RCM-int <400> 33 ccgtaatatc cagctgaacg gtctgg 26 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'FCM-int <400> 34 tctgtgatgg cttccatgtc ggcag 25 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'R-int <400> 35 agcatgttgc ggtgttcccg gaatg 25 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'FPD-int <400> 36 atgacggaaa gccgcatggg cattgggtcc 30 <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'RPD-int <400> 37 ttcgtacgtg ttcaggtgcc gattgccgg 29 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'FPD2-int <400> 38 tgggctggct gttctggcac gaaacg 26 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'RPD2-int <400> 39 ttcatcgaat cggcgctgat cctggc 26 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRNF-int <400> 40 aggtgcagcc atacatcaag gccagc 26 <210> 41 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R9K wild type <400> 41 tacaagta 8 <210> 42 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E129G wild type <400> 42 agcgggtat 9 <210> 43 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WWD (316) <400> 43 acgatcctcc cgccaccgta tacaagtatg actcccgccc gccggaggac gttt 54 <210> 44 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type (159) <400> 44 acgatcctcc cgccaccgta taccgctatg actcccgccc gccggaggac gttt 54 <210> 45 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus (316) <400> 45 acgatcctcc cgccaccgta tactatgact cccgcccgcc ggaggacgtt t 51 <210> 46 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WWD (334) <400> 46 ggcgcgctgg ccacctacca gagcgggtat ctggcacacc ggcgcattcc gccc 54 <210> 47 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type (415) <400> 47 ggcgcgctgg ccacctacca gagcgaatat ctggcacacc ggcgcattcc gccc 54 <210> 48 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus (415) <400> 48 ggcgcgctgg ccacctacca gagcgtatct ggcacaccgg cgcattccgc cc 52

Claims (39)

  1. 페르투씨스 독소 S1 유전자가 Arg9→Lys9 및 Glu129→Gly129 돌연변이를 갖고, 어떠한 통합된 항생제 내성 유전자 및 다른 반흔(scar)도 포함하지 않으며, 해독된 페르투씨스 독소(rPT)를 발현할 수 있고;
    I-SceI 뉴클레아제 유전자를 포함하는 벡터 pSS4245가 ptx 오페론, prn 유전자 또는 이둘 모두의 카피를 도입하는데 사용되어 어떠한 항생제 내성 유전자 또는 반흔도 도입되지 않는 것인,
    유전적으로 변형된 보르데텔라 페르투씨스(Bordetella pertussis) 균주.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 변형된 균주는 토하마 균주로부터 유래되는, 변형된 보르데텔라 페르투씨스 균주.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 변형된 균주는
    (a) ptx 오페론의 하나 이상의 카피를 상기 변형된 균주의 염색체의 비-기능성 영역 내로 통합하는 것으로, 여기서 통합된 ptx 오페론은 S2 내지 S5 유전자의 세트 및 Arg9→Lys9 및 Glu129→Gly129 돌연변이를 포함하도록 변형된 S1 유전자를 포함하며, 그로 의해 변형된 균주는 염색체 내에 떨어져서 위치하는 2개 이상의 ptx 오페론을 가지고, 하나의 ptx 오페론 만을 가진 균주와 비교하여 증강된 수준의 해독된 페르투씨스 독소를 발현할 수 있는 통합;
    (b) 천연의 PRN 프로모터의 조절 하에 있는 페르탁틴(pertactin)을 암호화하는 prn 유전자의 하나 이상의 카피를 상기 변형된 균주의 염색체의 비-기능성 영역 내로 통합하는 것으로, 그로 의해 변형된 균주는 염색체 내에서 떨어져서 위치하는 2개 이상의 prn 유전자를 가지고, 하나의 prn 유전자 만을 가진 균주와 비교하여 증강된 수준의 페르탁틴을 발현할 수 있는 통합; 또는
    (c) 상기 (a) 및 (b)의 통합 모두에 의해 추가로 변형되고,
    여기서, I-SceI 뉴클레아제 유전자를 포함하는 벡터 pSS4245가 ptx 오페론, prn 유전자 또는 이둘 모두의 카피의 도입에 사용됨으로써 상기 변형된 균주는 어떠한 통합된 항생제 내성 유전자 및 다른 반흔도 포함하지 않는 것인, 변형된 보르데텔라 페르투씨스 균주.
  5. 삭제
  6. 제4항에 있어서,
    ptx 오페론, prn 유전자 또는 이둘 모두의 카피가 비-기능성 위유전자들 내에 또는 이들 사이에 통합된, 변형된 보르데텔라 페르투씨스 균주.
  7. 제4항에 있어서,
    변형된 ptx 오페론의 하나 초과의 삽입 카피, prn 유전자의 하나 초과의 삽입 카피, 또는 이둘 모두를 포함하는, 변형된 보르데텔라 페르투씨스 균주.
  8. 제4항에 있어서,
    2개 이상의 변형된 ptx 오페론, 2개 이상의 prn 유전자, 또는 이둘 모두를 포함하는, 변형된 보르데텔라 페르투씨스 균주.
  9. ptx 오페론, prn 유전자 또는 이둘 모두의 카피의 도입에 I-SceI 뉴클레아제 유전자를 포함하는 벡터 pSS4245를 사용하여 보르데텔라 페르투씨스 균주의 S1 유전자에 Arg9→Lys9 및 Glu129→Gly129 돌연변이를 도입함으로써, 그로 인해 해독된 페르투씨스 독소(rPT)를 발현할 수 있으며 어떠한 통합된 항생제 내성 유전자 및 다른 반흔도 포함하지 않는 변형된 균주를 생산하는 단계를 포함하는,
    제1항의 변형된 보르데텔라 페르투씨스 균주를 생산하는 방법.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서,
    상기 보르데텔라 페르투씨스 균주가 토하마 균주인, 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 방법은
    (a) ptx 오페론의 하나 이상의 카피를 상기 변형된 균주의 염색체의 비-기능성 영역 내로 통합시키는 단계로서, 여기서 통합된 ptx 오페론은 S2 내지 S5 유전자의 세트 및 Arg9→Lys9 및 Glu129→Gly129 돌연변이를 포함하도록 변형된 S1 유전자를 포함하고, 그로 인해 염색체 내에 떨어져서 위치하는 2 이상의 ptx 오페론을 가지며, 하나의 ptx 오페론만을 가진 균주와 비교하여 증강된 수준의 해독된 페르투씨스 독소를 발현할 수 있는 변형된 균주를 생산하는 단계;
    (b) 천연의 PRN 프로모터의 조절 하에 있는 페르탁틴을 암호화하는 prn 유전자의 하나 이상의 카피를 변형된 균주의 염색체의 비-기능성 영역 내로 통합시키는 단계로서, 이로써 염색체 내에서 떨어져서 위치하는 2개 이상의 prn 유전자를 가지며, 하나의 prn 유전자만을 가진 균주와 비교하여 증강된 수준의 페르탁틴을 발현할 수 있는 변형된 균주를 생산하는 단계; 또는
    (c) 상기 (a) 및 (b)의 단계 모두를 추가로 포함하며;
    여기서 I-SceI 뉴클레아제 유전자를 포함하는 벡터 pSS4245가 상기 ptx 오페론, prn 유전자 또는 이둘 모두의 카피를 어떠한 항생제 내성 유전자 및 다른 반흔의 통합 없이 도입하는데 사용되는 것인, 방법.
  13. 삭제
  14. 제12항에 있어서,
    ptx 오페론, prn 유전자 또는 이둘 모두가 비-기능성 위유전자들 내에 또는 이들 사이에 통합되는, 방법.
  15. 제12항에 있어서,
    변형된 ptx 오페론의 카피 및 prn 유전자의 카피가 상기 균주의 염색체 내로 삽입되는, 방법.
  16. 제12항에 있어서,
    변형된 ptx 오페론의 하나 초과의 카피, prn 유전자의 하나 초과의 카피, 또는 이둘 모두가 상기 균주의 염색체 내로 삽입되는, 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
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  39. 삭제
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