ES2642138T3 - Cepas de Bordetella pertussis modificadas - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Cepas de Bordetella pertussis modificadas Campo de la invencion

La presente invencion describe la construccion de cepas de Bordetella pertussis recombinantes derivadas de una cepa original designada Tohama y usando el vector pSS4245 para la integracion de mutaciones y copias adicionales de genes.

Antecedentes de la invencion

Pertussis o tos ferina es una enfermedad de los lactantes grave provocada por la infeccion de Bordetella pertussis de las vfas respiratorias altas [1]. Durante decadas ha habido vacunas disponibles, que consisten en celulas completas inactivadas de B. pertussis. Se administran como combinacion trivalente de difteria-tetanos-pertussis o combinaciones mas nuevas que tambien proporcionan inmunidad frente a la hepatitis B y enfermedad invasiva por Haemophilus influenzae tipo b [2]. El uso de vacunas de celulas completas se ha reducido, disuadio o incluso prohibido en algunos pafses debido a su perfil de seguridad cuestionable, que se debe a altos niveles de endotoxina y otras toxinas bacterianas asociadas con las celulas completas inactivadas [3, 4].

Las vacunas acelulares, nombradas por el hecho de que no contienen celulas completas sino unicamente antigenos bacterianos parcial o extensamente purificados, se introdujeron en Japon en 1981 [5]. La mayor pureza de los antigenos de componente en las vacunas acelulares se tradujo en un perfil de seguridad clmico mejorado. Estas vacunas se introdujeron a mediados de los anos 90 en pafses industrializados despues de ensayos de campo extensos que demostraron su seguridad y eficacia [6]. Sin embargo, se obstaculizo una introduccion mas amplia por la OMS en el Programa Expandido de Inmunizacion debido al coste significativamente mas alto de las vacunas acelulares.

Un factor de virulencia principal de B. pertussis es la toxina pertussis (PT) [7, 8] y toxoide pertusico (PTd) es el principal antfgeno en vacunas acelulares [8]. Al contrario que las toxinas diftericas y tetanicas, que pueden inactivarse mediante tratamiento simple con formaldetndo, PT demostro ser mas diffcil de inactivar mediante medios qmmicos [9]. Actualmente, se usan diferentes procesos de inactivacion para produccion comercial. Todos tienen en comun desnaturalizacion extensa de PT provocada por el tratamiento qrnmico. Se exploraron dos vacunas candidatas usando una toxina geneticamente inactivada (rPT) [10-12] y uno de estos candidatos se incluyo en un ensayo de eficacia de campo [11-12].

Sin embargo, aun no estan disponibles vacunas que contienen rPT.

Sumario de la invencion

Segun una primera realizacion de la invencion, se proporciona una cepa de Bordetella pertussis geneticamente modificada, en la que el gen S1 de toxina pertussis tiene las mutaciones Arg9^Lys9 y Glu129^Gly129, no incluye ningun gen de resistencia a antibioticos y puede expresar toxina pertussis detoxificada (rPT).

Puede usarse el vector pSS4245 para introducir las mutaciones de S1 sin integracion de un gen de resistencia a antibioticos.

La cepa modificada puede ser una cepa Tohama.

La cepa puede haberse modificado adicionalmente mediante integracion de al menos una copia del operon ptx en una region no funcional del cromosoma de la cepa modificada, en la que el operon ptx integrado comprende un conjunto de genes S2 - S5 y un gen S1 que se ha modificado para incluir las mutaciones Arg9^Lys9 y Glu129^Gly129, teniendo de este modo la cepa modificada dos operones ptx que se ubican separados en el cromosoma, y pudiendo expresar niveles potenciados de toxina pertussis detoxificada en relacion con una cepa con solo un operon ptx; y/o mediante integracion de al menos una copia de un gen prn que codifica para pertactina en una region no funcional del cromosoma de la cepa modificada, teniendo de este modo la cepa modificada al menos dos genes prn que se ubican separados en el cromosoma y pudiendo expresar niveles potenciados de pertactina en relacion con una cepa con solo un gen prn; en la que la cepa modificada no incluye ningun gen de resistencia a antibioticos integrado.

Puede usarse el vector pSS4245 para introducir la copia del operon ptx y/o gen prn en la cepa modificada sin integracion de un gen de resistencia a antibioticos.

La copia del operon ptx y/o gen prn puede integrarse dentro de o entre pseudogenes no funcionales.

La cepa puede comprender al menos dos operones ptx modificados y/o al menos dos genes prn.

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Segun una segunda realizacion de la invencion, se proporciona un metodo de produccion de una cepa de B. pertussis modificada, comprendiendo el metodo la etapa de introducir las mutaciones Arg9^Lys9 y Glu129^Gly129 en el gen S1 de una cepa de B. pertussis, dando como resultado de este modo que se produzca una cepa modificada que puede expresar toxina pertussis detoxificada (rPT) y que no incluye ningun gen de resistencia a antibioticos.

Puede usarse el vector pSS4245 para introducir las mutaciones de S1 en la cepa modificada sin integracion de un gen de resistencia a antibioticos.

La cepa de B. pertussis usada puede ser una cepa Tohama.

El metodo puede incluir ademas la etapa de integrar al menos una copia del operon ptx en una region no funcional del cromosoma de la cepa modificada, en el que el operon ptx integrado comprende un conjunto de genes S2 - S5 y un gen S1 que se ha modificado para incluir las mutaciones Arg9^Lys9 y Glu129^Gly129, produciendo asf una cepa modificada que tiene al menos dos operones ptx que se ubican separados en el cromosoma y pudiendo expresar niveles potenciados de toxina pertussis detoxificada en relacion con una cepa con solo un operon ptx; y/o la etapa de integrar al menos una copia de un gen prn que codifica para pertactina en una region no funcional del cromosoma de la cepa modificada, produciendo asf una cepa modificada que tiene al menos dos genes prn que se ubican separados en el cromosoma y pudiendo expresar niveles potenciados de pertactina en relacion con una cepa con solo un gen prn; en el que el operon ptx y/o gen prn se integra sin integracion de ningun gen de resistencia a antibioticos.

Puede usarse el vector pSS4245 para introducir la copia del operon ptx y/o gen prn en la cepa modificada sin integracion de un gen de resistencia a antibioticos.

El operon ptx y/o el gen prn pueden integrarse en o entre pseudogenes no funcionales.

Puede insertarse una copia del operon ptx modificado y una copia del gen prn en el cromosoma de la cepa modificada.

Segun una tercera realizacion de la invencion, se proporciona un metodo de produccion de antfgenos de Bordetella pertussis que comprende las etapas de: cultivar una cepa de B. pertussis geneticamente modificada descrita anteriormente en un medio de cultivo para efectuar la expresion de los antfgenos, en el que los antfgenos incluyen toxina pertussis detoxificada (rPT), pertactina y hemaglutinina filamentosa (FHA) codificados por genes presentes en la cepa; y recuperar los antfgenos del medio de cultivo o extracto celular para su uso como vacuna.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1: Estructura esquematica del vector de intercambio alelico pSS4245

Figura 2: Vectores para la construccion de un gen S1 modificado en el vector de intercambio alelico pSS4245. A: Elemento de intercambio alelico para reemplazar el gen S1 por un casete de resistencia a cloramfenicol, insertado entre las regiones flanqueantes de S1. B: Elemento de intercambio alelico para devolver el gen S1 modificado a su ubicacion exacta en el operon ptx-ptl. Para obtener el intercambio alelico, estos vectores se linearizan y se insertan en pSS4245, que se introduce entonces en B. pertussis mediante transferencia conjugativa de E. coli SM10.

Figura 3: Procedimiento de intercambio alelico. A: Acontecimientos de recombinacion doble que conducen al reemplazo del gen S1 por un marcador de resistencia a cloramfenicol. B: Acontecimientos de recombinacion doble que conducen a la reinsercion del gen S1 modificado en su ubicacion original.

Figura 4: Vectores para la insercion de una segunda copia del operon ptx en el cromosoma de B. pertussis. A: El sitio de insercion para una segunda copia del operon ptx se selecciono entre dos genes abandonados que portaban cada uno dos mutaciones de desplazamiento del marco de lectura. B: Elementos de intercambio alelico usados para insertar un marcador de cloramfenicol en el sitio seleccionado. C: Estructura esquematica del operon ptx con su promotor original. Se clono el terminador ptx-ptl y se inserto pasado el gen S3. Esta agrupacion se integro finalmente en el derivado SS4245 para reemplazar el marcador de cloramfenicol y generar el segundo acontecimiento de intercambio alelico para insertar la segunda copia de los genes estructurales de PT.

Figura 5: Identificacion de las mutaciones R9K y E129G en Bp-WWC y Bp-WWD. Se muestran los datos de secuencias sin procesar alrededor de las mutaciones para la cepa Bp-WWD, que tiene dos copias de la agrupacion estructural de PT. Las alineaciones de secuencia correspondientes se muestran para B. pertussis Tohama (secuencia de consenso) y derivados Bp-WWC y Bp-WWD.

Figura 6: Vectores para la insercion de una segunda copia del gen prn en el cromosoma de B. pertussis. A: El sitio de insercion para una segunda copia del gen prn se selecciono entre dos genes abandonados que portaban mutaciones de desplazamiento del marco de lectura y una delecion. B: Estructura esquematica del gen prn bajo el

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control del promotor fha y flanqueante con el sitio de integracion diana. C: Estructura esquematica del gen prn bajo el control de su propio promotor y flanqueante con el sitio de integracion diana.

Figura 7: Prueba de agrupacion de celulas de CHO. Se crecieron las celulas hasta casi confluencia, luego se anadieron diluciones de PT y se puntuo la agrupacion despues de 2 dfas. A: 800 ng de PT (cepa Bp-WWC). B: Control, sin PT anadida. C: 2,6 pg de PT de tipo natural (cepa Tohama) correspondiente al umbral de deteccion. D. 43 pg de PT de tipo natural (cepa Tohama).

Descripcion detallada de la invencion

En el presente documento se describen cepas de Bordetella pertussis recombinantes derivadas de una cepa original designada Tohama. Las nuevas cepas se obtienen mediante recombinacion homologa usando un vector de intercambio alelico pSS4245 [41]. Este vector permite el reemplazo de secciones del cromosoma bacteriano sin dejar ninguna mutacion accesorio.

Los genes para PT, FHA y pertactina (PRN) se han clonado y secuenciado [35-39]. La toxina pertussis es una protema compleja compuesta por seis subunidades de polipeptido codificadas por cinco genes estructurales diferentes expresados a partir de un solo promotor. Sus actividades enzimaticas y la mayona de las toxicas estan mediadas por su subunidad S1, mientras que sus propiedades de union celular y mitogenicas se deben a otras subunidades que forman la subunidad B.

En una primera realizacion, el segmento que codifica para la subunidad S1 de PT se reemplazo para introducir dos mutaciones que provocan la inactivacion de la actividad toxica. En una segunda realizacion, una segunda copia de la agrupacion ptx de los cinco genes estructurales de PT del operon ptx-ptl con su promotor y el terminador ptl y que contema las mutaciones anteriores se inserto en otro sito en el cromosoma. La organizacion de genes auxiliares ptl presentes en el operon ptx-ptl no se modifico. Esta cepa produjo cantidades aumentadas de rPT. En una tercera realizacion, una segunda copia del gen prn se inserto en el cromosoma. En ambos casos, se seleccionaron loci de genes abandonados como sitio de insercion para evitar la introduccion de alteraciones geneticas no deseadas y la expresion de antfgeno se impulso por los promotores autologos, sujeta por tanto a la misma regulacion que en la cepa Tohama original.

PT e incluso mas PRN, son los antfgenos limitantes en cultivos de alta densidad, mientras que FHA se sobreproduce naturalmente por B. pertussis bajo estas condiciones. Sin embargo, pudo obtenerse PRN con alto rendimiento a partir de E. coli o Pichia pastoris recombinantes [14, 15] mientras que solo las subunidades de PT pudieron expresarse en E. coli pero no se ensamblaron para dar la toxina madura y fueron insuficientemente inmunogenicas para considerarse candidatos de vacuna potenciales [16]. Ahora se entiende que el ensamblaje y la secrecion de la toxina madura requieren varios genes auxiliares descubiertos en una fase mas tardfa, que forman parte de la seccion ptl del operon ptx-ptl [17].

Aunque se ha notificado que una produccion potenciada mediante la manipulacion del numero de copias de genes potencia la produccion de toxinas bacterianas [18, 19], en particular PT [20], esto se ha usado ampliamente con vectores de plasmido de multiples copias o se repitieron en tandem los genes. Esto puede tener consecuencias en la estabilidad genetica de la cepa, en particular en un entorno de produccion. Por ejemplo, las cepas de B. pertussis generadas por Lee et al. [40] que usan vectores de plasmido de multiples copias no mostraron ningun aumento en la produccion de PT, y el plasmido se reordeno, el operon de PT se deleciono o los transconjugantes experimentaron conversion a una fase avirulenta.

Contrario a los vectores de intercambio alelico usados anteriormente en B. pertussis, pSS4245 no requiere o deja mutaciones auxiliares en el cromosoma, en particular la mutacion que afecta a rpsL que resulta de la seleccion de mutantes resistentes a estroptomicina espontaneos tal como se requiere en procedimientos de intercambio alelico anteriores [22]. Tales mutaciones que afectan a los genes constitutivos pueden perjudicar la virulencia y, por tanto, la expresion de factores de virulencia incluyendo PT, FHA y PRN. Las cepas de la presente invencion producen niveles inalterados de los otros antfgenos, en particular FHA, y pueden usarse para la produccion de vacunas contra pertussis acelulares economicas.

Resultados

Mutacion del gen S1 en el cromosoma de B. pertussis

Para introducir las dos mutaciones R9K y E129G en la subunidad S1, se uso un enfoque de dos fases, para evitar la posibilidad de recombinacion en la region entre las dos mutaciones, que provocana la perdida de una de las mutaciones. Este enfoque tambien permite la seleccion de las colonias deseadas mediante siembra en placas de repeticion simple en medios selectivos. En primer lugar, se construyeron dos vectores de E. coli en pBluescript II SK+ donde el gen S1 de tipo natural se reemplazo por un gen de resistencia a cloramfenicol (CmR) (figura 2A) o por un gen S1 modificado que incluye las mutaciones deseadas (figura 2B), ambos flanqueados por 1,2-1,5 kB de las regiones de S1 hacia 5' y hacia 3'. Entonces estos vectores se procesaron y se introdujeron sus insertos en

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pSS4245. Estos derivados se transferieron al E. coli SM10 para transferencia conjugativa e intercambio alelico en la cepa B. pertussis Tohama. El plasmido pSS5Cm3 genero un reemplazo del gen S1 por el marcador CmR (figura 3A). El plasmido pSS5S13-9K-129G restablecio el gen S1 en su ubicacion original, ahora con las dos mutaciones deseadas (figura 3B). Despues de la seleccion de aislados en medios selectivos, se confirmo la integracion del CmR y genes S1 modificados en la posicion esperada mediante amplificacion por PCR (datos no mostrados). La integracion del gen S1 mutado en la ubicacion esperada fue evidente tal como se confirma mediante PCR con cebadores espedficos que podfan unirse a las regiones flanqueantes hacia 5' y hacia 3' e internamente en el gen S1 (datos no mostrados). Las mutaciones en el gen S1 del clon seleccionado para elaboracion adicional se confirmaron mediante secuenciacion de ADN. La nueva cepa se designo Bp-WWC.

Insercion de un segundo sitio de integracion para un segundo conjunto de genes estructurales de PT

Los intentos iniciales de aumentar la expresion de PT insertando el operon ptx-ptl completo en un plasmido de multiples copias compatible con B. pertussis no han podido proporcionar cepas utiles, lo que sugiere que la sobreexpresion de PT es potencialmente toxica y debe permanecer dentro de determinados lfmites para obtener cepas viables. Con el fin de aumentar el rendimiento de la toxina PT, se introdujo un segundo conjunto de genes estructurales de PT en el cromosoma de Bp-WWC. Para identificar un sitio de insercion diana, la secuencia del genoma de B. pertussis Tohama se examino y se identificaron muchos pseudogenes. Se selecciono la secuencia de ADN entre un gen transportador de amonio putativo y un gen autotransportador putativo para la insercion (posn. 2.903.988-2.905.228 y 2.905.291-2.908.277). Estos genes llevan cada uno mutaciones de desplazamiento del marco de lectura que estropean su funcionalidad (figura 4A). Se siguio la estrategia general senalada en la seccion anterior. En primer lugar, se construyo el vector pSKPD5Cm3 de E. coli insertando el gen CmR dentro de las regiones que flanquean el sito de integracion seleccionado (figura 4B). Despues de la insercion de las secuencias de interes en pSS4245, se selecciono intercambio alelico mediante el marcador CmR. La integracion del gen CmR en la posicion designada se confirmo mediante PCR (datos no mostrados). En el segundo vector, se insertaron los cinco genes estructuras de PT S1...S3 con el promotor ptx y el terminador ptl tras el S3 dentro de las mismas regiones flanqueantes para generar el vector pSKptxter que incluye las dos mutaciones en S1 (figura 4C). El intercambio alelico en el sitio de integracion diana inserto una segunda copia de la agrupacion funcional de los genes estructurales de PT en la cepa Bp-WWC. La nueva cepa se designo Bp-WWD. El resultado de integracion se verifico mediante amplificacion usando cebadores que se uman a regiones hacia 5' o hacia 3' y dentro del operon ptx, que mostro la integracion esperada sin interrupcion de las regiones en las que se habfa producido recombinacion.

Secuenciacion del gen S1 e identificacion de las mutaciones R9K y E129G

Se aplico secuenciacion automatica para confirmar la presencia de las mutaciones deseadas. En el caso de la cepa Bp-WWD que tiene dos copias integradas del gen S1, la amplificacion por PCR produce en principio una mezcla de las copias de los dos genes. Aparecena una mutacion puntual inesperada en uno de los insertos como doble asignacion de nucleotido en la posicion correspondiente. El unico pico de senal de fluorescencia en las posiciones R9K y E129G indico la secuencia correcta en Bp-WWC y que las dos copias de S1 en Bp-WWD teman mutaciones identicas. La secuencia alrededor de las dos mutaciones deseadas se notifica en la figura 5, que muestra los registros de secuenciacion para la cepa Bp-WWD y las alineaciones de secuencia para Tohama de tipo natural, Bp- WWC y Bp-WWD.

Insercion de una segunda copia de los genes PRN en la cepa Bp-WWD

Debido a la limitacion de la produccion de PRN, se introdujo una segunda copia de gen estructural prn bajo el control del promotor fha y su propio terminador en el cromosoma de Bp-WWD entre los dos pseudogenes de pseudogen de glutation S-transferasa putativo y de aspartato racemasa putativo (figura 6A). Se construyo el vector pSKPD2Cm3 de E. coli en el que se inserto el gen CmR entre las regiones hacia 5' y hacia 3' que flanquean el sitio de insercion seleccionado. Se construyo otro vector usando las mismas regiones flanqueantes y el gen prn bajo el control del promotor de FHA (figura 6B). Tras la insercion del marcador CmR en la ubicacion deseada, se reemplazo el gen CmR por el bloque funcional de prn usando los procedimientos de seleccion de intercambio alelico y deteccion usuales.

Las cepas de B. pertussis aisladas a partir de esta construccion no expresaron PRN y finalmente el nivel de los demas antfgenos no fue detectable. Se concluyo provisionalmente que el producto de PRN es toxico si se sobreproduce bajo el control del promotor de FHA mas fuerte y solo los mutantes de escape que habfan perdido la capacidad de producir PRN o todos los factores de virulencia fueron viables. Por tanto, se decidio introducir el promotor prn natural en lugar del promotor fha. Se uso pSKPD25FpPRN3 para reemplazar el promotor de FHA por el promotor de PRN original para generar un bloque funcional con su propio promotor y terminador natural (figura 6C). Se inserto este bloque funcional en el sitio seleccionado mediante el procedimiento habitual de intercambio alelico para obtener una cepa con una segunda copia no repetida en tandem del gen prn bajo el control de su propio promotor. La insercion esperada se confirmo mediante amplificacion por PCR con cebadores que se uman a las regiones flanqueantes e internamente en el gen prn. Esta cepa era normalmente viable y se designo Bp-WWE.

Estabilidad genetica de constructos de PTy PRN

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La cepa Bp-WWE se cultivo y se subcultivo en serie en medio MSS para alcanzar aproximadamente un total de 50 generaciones. El ultimo cultivo se diluyo y se sembro en placa en MSS-agar. Se seleccionaron aleatoriamente treinta colonias aisladas. Se analizaron treinta colonias para determinar sus genes S1 y prn mediante PCR (datos no mostrados). El resultado mostro que todas las colonias conteman dos copias de genes S1 y prn en las posiciones esperadas.

Expresion de PT y FHA en frasco de agitacion

Se analizo la produccion de PT y FHA en cultivos de frascos de agitacion mediante ELISA. Los cultivos de frascos de agitacion estaban en medio modificado Stainer-Scholte (MSS) que contema heptakis(2,6-O-dimetil)-p- ciclodextrina [23, 24]. Los resultados de las cepas Bp-WWC y Bp-WWD se muestran en las tablas 1 y 2. La produccion de PT se duplico aproximadamente en la cepa Bp-WWD en comparacion con Bp-WWC y wt. Tohama mostraba la correlacion esperada del nivel de expresion y el numero de copias de la agrupacion de genes estructurales.

Tabla 1: Produccion de PTpor las cepas Tohama, Bp-WWC y Bp-WWD. Se hicieron crecer celulas en frascos de agitacion durante 48 h (expt. n.° 1) o 20-24 h (expt. n.° 2) en medio MSS. Se muestran los resultados de dos frascos independientes para el expt. n.° 2. Despues de recoger mediante centrifugacion, se sometieron a ensayo los sobrenadantes mediante un ELISA directo con un anticuerpo policlonal de conejo (expt. n.° 1) o mediante un ELISA tipo sandwich usando un anticuerpo policlonal de conejo como reactivo de captura y un anticuerpo monoclonal espedfico de S2 (Abcam) para la deteccion.

Cepa

Medio PT, ug/ml

Expt. n.° 1

Expt. n.° 2

Tohama de

MSS 2,24 nd

tipo natural

Bp-WWC

MSS 2,64 2,1-2,6

Bp-WWD

MSS 5,25 4,5-5,3

Tabla 2: Produccion de PT y FHA por las cepas Bp-WWC y Bp-WWD y Bp-WWE. Se hicieron crecer celulas en frascos de agitacion durante 24 o 36 h en medio MSS. Despues de recoger mediante centrifugacion, se sometieron a ensayo los sobrenadantes para determinar PT y FHA mediante un ELISA tipo sandwich usando un anticuerpo policlonal de conejo como reactivo de captura y un anticuerpo monoclonal espedfico de S2 (Abcam) o un reactivo monoclonal de FHA (NIBSC) para la deteccion.

Cepa

Medio PT, ug/ml FHA, ug/ml

24 h

36 h 24 h 36 h

Bp-WWC

MSS 3,16 2,96 10,9 20,5

Bp-WWD

MSS 4,21 4,03 5,7 12,8

Bp-WWE

MSS 4,63 4,97 11,4 18,9

Expresion de PRN en frasco de agitacion

La produccion de PRN en cultivos de frascos de agitacion de Bp-WWC, Bp-WWD y Bp-WWE crecidos en medio MSS. Puesto que la liberacion de PRN de su precursor unido a membrana es el resultado de una escision imprecisa por proteasas no identificadas [25], se determino la expresion de PRN mediante analisis densitometrico de inmunotransferencia de tipo Western para evaluar tambien la integridad del antfgeno. Tambien se hallo que en cultivos de fermentacion de alta densidad, se libera espontaneamente una fraccion significativa de PRN en el sobrenadante de cultivo a partir del precursor unido a membrana (observaciones no publicadas). Por tanto, se investigo si esta propiedad se modifico mediante las modificaciones geneticas introducidas. Se evaluo la PRN en los sobrenadantes de cultivo clarificados y en el extracto a 60°C de las celulas separadas. Los resultados se muestran en la tabla 3. La cantidad de toxina pRn en Bp-WWC y Bp-WWD fue similar. Se hallo un aumento de dos veces en Bp-WWE mostrando de nuevo una buena correlacion del nivel de expresion y el numero de copias del gen. Sin embargo, con Bp-WWE, se aumento la fraccion de PRN hallada en el sobrenadante de cultivo aunque en estos cultivos de frascos, la fraccion de sobrenadante permanecio pequena o despreciable.

Tabla 3: Produccion de PRN por las cepas Bp-WWC, Bp-WWD y Bp-WWE. Se hicieron crecer celulas en frascos de agitacion durante 48 h. Se separaron el sobrenadante y las celulas mediante centrifugacion. Se suspendieron las celulas en el volumen de cultivo original de tampon de extraccion y se calentaron hasta 60°C durante 30 min, luego se centrifugaron de nuevo para recoger el extracto. Se evaluo la PRN en ambas fracciones mediante inmunotransferencia de tipo Western.

________________PRN, ug/ml______________________

Cepa_______Extracto, ug/ml_____Sobrenadante, ug/ml_____Total

Bp-WWC 3,34 0,08 (2,3%) 3,42

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Bp-WWD 3,04 0,04 (1,3%) 3,08

Bp-WWE_________6,77______________0,60 (8,2%)_________7,37

El nivel de PRN en todos estos cultivos de frascos estaba bien por debajo de la concentracion de PT y FHA en condiciones similares y aunque se produce PRN de manera menos eficiente que PT, este resultado no refleja los hallazgos realizados generalmente en cultivos de fermentacion de alta densidad. Esta discrepancia puede explicarse por el hecho de que PRN es una protema de la superficie celular mientras que PT y FHA se secretan y, por necesidad, en frascos de agitacion, el tiempo de crecimiento esta limitado para evitar la lisis celular y la degradacion de antfgeno, por tanto el tiempo de crecimiento de la biomasa esta limitado a 24-36 h y los cultivos pueden alcanzar una DO650 maxima de 1-1,5, que limita de manera correspondiente la fuente primaria de PRN.

Evaluacion de la inactivacion de PT

Se purifico PT a partir de sobrenadantes de cultivo mediante una modificacion del proceso de Ozcengiz [26] en el que se reemplazo la precipitacion de sulfato de amonio inicial por cromatograffa de intercambio de ligandos [27, 28]. La toxicidad de la toxina PT de B. pertussis de tipo natural y Bp-WWC (PT geneticamente inactivada) se analizo y se comparo mediante agrupacion de celulas de CHO [29]. Esta prueba tiene una sensibilidad mucho mayor que otros ensayos funcionales notificados para PT. La toxina nativa, purificada a partir de la cepa de B. pertussis Tohama demostro un punto final de agrupacion a 2,6 pg por pocillo. La PT geneticamente inactiva no promovio la agrupacion en sus concentraciones mas altas obtenidas en esta prueba, concretamente 0,8-1,6 |ig por muestra (figura 7). Esta prueba puede, por tanto, demostrar una reduccion de la toxicidad por un factor de 5 x 105 a 106, considerando las limitaciones impuestas por la baja solubilidad de PT. El resultado muestra que la toxina PT de Bp-WWC se inactivo satisfactoriamente mediante cinco reemplazos de nucleotidos dando como resultado dos sustituciones de aminoacido en la subunidad S1 de PT.

Discusion

La insercion y reemplazo de genes no marcados en estos experimentos fue satisfactoria usando pSS4245 como vector en B. pertussis. Tras la segunda recombinacion homologa que provocaba la escision del plasmido, no se dejo ningun marcador de genes de antibiotico o ninguna marca en el cromosoma en comparacion con el sistema con cre- lox [30] o los procedimientos de intercambio alelico anteriores usados en Bordetella [22]. Se notifico la sobreproduccion de toxina PT geneticamente desactivada en 1992 [20] usando repeticiones en tandem de genes ptx u otra copia insertada en el gen fha. La cepa resultante sobreprodujo PT hasta 80 mg/l. Se sabe que los genes repetidos en tandem son una causa potencial de inestabilidad genetica. Por esta razon, se examino la secuencia genomica de B. pertussis para encontrar sitios de integracion adecuados. La posicion de ADN entre dos terminadores de pseudogenes se selecciono como sitios de integracion para la agrupacion de ptx. El numero de copias para la agrupacion estructural de PT se limito a dos, ya que la sobreproduccion de estos factores de virulencia impone una carga en el metabolismo celular, que puede dar como resultado una tasa de crecimiento mas lenta y finalmente inestabilidad genetica, como habfan sugerido los intentos preliminares.

Los inventores notificaron que la sobreexpresion del gen prn por el promotor fha para impulsar una expresion mayor fue aparentemente toxica para la celula de B. pertussis, posiblemente en asociacion con una expresion mayor de PT. Sus hallazgos no confirmaron el aumento de expresion de PRN mediante el reemplazo del promotor de pRn por un promotor mas fuerte [21]. Por tanto, aumentar el numero de copias del gen bajo el control del promotor de PRN nativo fue el enfoque seleccionado. El promotor fha de la segunda copia del gen se reemplazo por el promotor prn nativo para generar una cepa con una segunda copia del gen de PRN y se inserto su promotor nativo en otra ubicacion en el cromosoma. La toxicidad de PRN con respecto a la celula huesped tambien se notifico en E. coli [31]. Entonces se reemplazo el promotor fha por el promotor prn nativo, la cepa resultante presento crecimiento normal frascos de agitacion y produjo de manera correspondiente cantidades dobles de PRN. La distribucion de PRN entre el sobrenadante del cultivo y el extracto celular estaba modificada en cierta medida con una mayor fraccion de la PRN total en el sobrenadante aunque, en frascos de agitacion, las cantidades que se liberaron de manera espontanea en el sobrenadante son mmimas.

Aunque el crecimiento en frasco de agitacion esta limitado debido al rapido aumento de pH y la intoxicacion que resulta de la liberacion de amoniaco por el metabolismo de la fuente de carbono glutamato [32], proporciona un indicio util del potencial de la cepa en condiciones de fermentacion optimizadas. Se demostro la construccion de cepas estables con expresion potenciada de PT (Bp-WWD) o de los dos antfgenos limitantes PT y PRN (Bp-WWE). Con produccion potenciada de PT sola, Bp- WWD solamente puede generar cantidades insuficientes de PRN y en este caso, se indicana el uso de un suministro independiente de PRN en E. coli o P. pastoris recombinantes. Como el nivel de los dos antfgenos PT y PRN se ha aumentado por igual con Bp-WWE, se espera que se obtengan cantidades coincidentes de los dos antfgenos tambien en cultivos de alta densidad, simplificando asf las operaciones de produccion.

Conclusiones

Las cepas de B. pertussis que contiene una subunidad S1::R9K-E129G geneticamente modificada de PT se construyeron sin dejar ningun marcador o ninguna marca en su cromosoma. Se hallo un aumento de dos veces de la

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toxina PT en frascos de agitacion mediante integracion de 5 genes estructurales (ptx con S1 mutado) bajo el control del promotor del operon ptx-ptl y terminador ptl entre dos pseudogenes en el cromosoma. La inactivacion de PT se confirmo mediante ensayo de agrupacion de celulas de cHo. Ademas, se aumento la produccion de PRN mediante integracion de una segunda copia del gen prn entre otros pseudogenes en otro sitio en el cromosoma. Las cepas se hallaron geneticamente estables en subcultivos de frascos de agitacion reproduciendo un mayor numero de generaciones que sena necesario en fermentacion a gran escala (>1000 l). Estas cepas, en particular Bp-WWE, en la que las cantidades relativas de los antfgenos PT y PRN coinciden con la composicion de vacunas, van a ser utiles para permitir la produccion de vacunas acelulares contra pertussis economicas, contribuyendo a la reduccion del coste mediante dosis menores requeridas por antfgenos nativos para una inmunogenicidad adecuada y la mayor productividad de la cepa para los dos antfgenos limitantes PT y PRN.

Metodos

Cepas bacterianas, plasmidos y condiciones de cultivo

Todos los productos qrnmicos y reactivos usados en este estudios fueron o bien de calidad analftica o bien de calidad bioiogfa molecular. Los productos qrnmicos se adquirieron de Merck y Sigma. Se obtuvieron medios de cultivo bacterianos de Difco (EE.UU) y Merck (Alemania). Las enzimas de restriccion y de modificacion se adquirieron de New England Biolabs (EE.UU).

Se uso E. coli DH5a (Invitrogen, EE.UU) como huesped de clonacion. Se hizo crecer esta cepa a 37°C en medio Luria Bertani (LB). Los transformantes de E. coli DH5a se hicieron crecer en LB complementado con antibioticos adecuados: ampicilina (50 |ig/ml) o cloramfenicol (15 |ig/ml). Se obtuvo E. coli SM10 de Dr. Earle S. Stibitz (Division de Productos Bacterianos, Parasfticos y Alergenicos, Centro para la Evaluacion e Investigacion de Productos Biologicos, Administracion de Alimentos y Medicamentos, EE.UU), y se usaron como cepa donante de conjugacion. Esta cepa se hizo crecer a 37°C en LB complementado con kanamicina (50 |ig/ml). Los transformantes de E. coli SM10 se hicieron crecer en LB complementado con kanamicina (50 |ig/ml), ampicilina (50 mg/ml) y neomicina (10 |ig/ml). Se obtuvo B. pertussis Tohama de ATCC y tiene el numero de registro ATCC BAA-589 (Bordetella pertussis Tohama Ph. I cromosoma n.° de registro NC_002929, EMBL/GenBank n.° de registro BX470248, secuencia disponible del Wellcome Trust Sanger Institute

(
http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/bacteria/bordetella.html) [42]).

Las cepas de B. pertussis se hicieron crecer a 35°C en agar Bordet-Gengou (BG) o medio Stainer-Scholte modificado (MSS). Se obtuvo el plasmido pBluescript II SK+ de Stratagene, EE.UU, se obtuvo pSS4245 de Dr. Earle S. Stibitz y se obtuvo pACYC184 de New England Biolabs (EE.UU).

Tabla 4: Cebadores

Nombre________

5’F-PT-Sall

5’R-PT-MCS 3'F-PT-Xbal

______________________Secuencia______

GCGGTCGACGGCGCGCAATGCGGCGCGGAC GGGGGCGGCCGCGAGATCTCTCTAGACGGTACCATCGC GCGACTTTOCGCCG A AGG A

3’R-PT-Bglll

CmF-Kpnl

CmR-Xbal

S1 F-PT-Kpnl

S1R-PT-Xbal

R-R9K

F-R9K

F-E129G

R-E129G

CGTTCT AG ACCTGGCCC AGCCCCGCCC A AC

GGC AGAT CTGC AGTT CGAG CAGAT CGCCGG

CGCGGTACCTGATGTCCGGCGGTGCTTTTG

AATCTAGATATCGTCAATTATTACCTCCAC

GATGGTACCGGTCACCGTCCGGACCGTGCT

CAGGTCTAGAACGAATACGCGATGCTTTCG

GGGCGGGAGTCATACTTGTATACGGTGGCGG

CCGCCACCGTATACAAGTATGACTCCCGCCC

CCACCT ACCAG AGCGGGTAT CT GGCACACCGG

CCGGTGTGCCAGATACCCGCTCTGGTAGGTGG

GGAGGGCCCATGAAACTCGTCATCGCCATCATCAAGCC

5’F-PD-Apal Q

TACGGTACCGGATCCCGCATCGCAACAACGGGGTCATC

5’R-PD-MCS

GCGACCC

CGTTCTAGAACTAGTCCGCTACCAGGTGTAGCGATAGCC

3’F-PD-MCS

3’R-PD-Bglll

PtxF-BamHI

CAGGTG

TGTAG ATCTCGG CG AGATACTTGCGTTTCG GCGTTGTCG

TTGGGATCCCAGCGCAGCCCTCCAACGCGCCATCC

TCTACTAGTAAGAATTCTCGCGGTATCCGTCAAGGAAA

PtxR-MCS

TerF-EcoRI

TerR-Spel

5’F-PD2-Spel

AACATGGAC

GCGGAATTCCGCCTGCCGCCTGCACGCAT T CCACT AGT CAAGGGCATCGGGCGCCGGC CG C ACTAGTCTATTCC AGCGG CGG GTCG AAATG GC

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ID No: 1

Seq

ID No:2

Seq

ID No:3

Seq

ID No:4

Seq

ID No:5

Seq

ID No:6

Seq

ID No:7

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ID No:8

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ID No:9

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ID No:10

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ID No: 11

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ID No:12

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ID No:13

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ID No:14

Seq

ID No: 15

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ID No:16

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ID No:17

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ID No:20

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5’R-PD2-MCS

3’F-PD2-Xbal

3'R-PD2-Notl

CmF-BamHI

FHAproF-BamHI

FHAR-MCS

PRNF-Ndel

PRNR-Xbal

PrnProF-BamHI

PRNProR-Ndel

5:F-int

5’RCM-int

3’FCM-int

3’R-inl

5’FPD-int

3’RPD-int

5’FPD2-int

3’RP02-int

PRNF-int

CCCCAGGCGGCCGCTGTCTAGAGTGGATCCCAGGCCGA

TGCGTCCGCCGTGCAGGC

ATCTCTAG AATG GGC AC CTCG GC CACGCTGGC GCTG

AAGTATCGCGGCCGATGAGCGAAACCCTGTTGAAAGTA

TC

CGCGGATCCTGATGTCCGGCGGTGCTTTTG

TCTGGATCCCTGCGCTGGCACCCGCGGCGGGCCG

GCCTCTAGATTCATATGATTCCGACCAGCGAAGTGAAGT

AAT

CTG GTCG GC ATATG AAC ATG TCTCTGTC ACGC ATTG

GCCTCTAGAGCCTGGAGACTGGCACCGGCCAAGC

CGGGGATCCGCACCCTGGCCTGCGGGGCGGGACC

AG ACAT GTT CAT ATGG AT GCC AGGT G G AGAGC AGA

CTAGCGTT CGCATACCAAAT CCTTGC

CCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGG

TCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAG

AGC AT GTTGCG GTGTTC CC GGAATG

ATGACGGAAAGCCGCATGGGCATTGGGTCC

TTCGTACGTGTTCAGGTGCCGATTGCCGG

TGGGCTGGCTGTTCTGGCACGAAACG

TTCATCG AATCG GCG CTG ATCCTG GC

AGGTGCAGCCATACATCAAGGCCAGC

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ID No:22

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ID No:23

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ID No:37

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ID No: 38

Seq

ID No:39

Seq

ID No:40

Clonacion de regiones flanqueantes de S1 e insercion de un gen de cloramfenicol

Se uso el ADN cromosomico de la cepa de B. pertussis Tohama como material de fuente. La region hacia 5' del gen S1 se amplifico mediante PCR usando los cebadores 5'F-PT-SalI y 5'R-PT-MCS. El ultimo contiene los sitios Kpnl, Xbal, BglII y Notl. Se recupero el producto de amplificacion a partir del gel de agarosa y se purifico mediante el kit de extraccion QIAEX II (Qiagen). Se digirio el producto de amplificacion de 1287 pb con Sail y Notl y se clono en el vector de E. coli pSKAKpnl digerido con las mismas enzimas. pSKAKpnl es un derivado de pBluescript II SK+ en el que el sitio KpnI se ha eliminado mediante digestion, llenado con la enzima Klenow y recircularizacion. Se transformo el constructo resultante mediante choque termico en celulas competentes de E. coli DH5a y se designo pSK5'. La region hacia 3' se obtuvo del mismo modo mediante amplificacion con los cebadores 3'F-PT-XbaI y 3'R- PT-BglII. El producto de 1531 pb se digirio con XbaI y BglII y se inserto el fragmento recuperado en pSK5' digerido con las mismas enzimas para obtener pSK53.

Se obtuvo el gen CmR a partir del plasmido pACYC184. Se amplifico el gen usando los cebadores CmF-KpnI y CmR- XbaI. Se purifico el producto de PCR de 1295 pb y se digirio con KpnI y XbaI y se inserto en pSK53 cortado con las mismas enzimas. El plasmido resultante se designo pSK5Cm3. Este plasmido incorpora el gen de resistencia a cloramfenicol flanqueado por las regiones hacia 5' y hacia 3' del gen S1 (figura 2A).

Intercambio del gen S1 mediante recombinacion homologa

Para realizar el intercambio alelico en B. pertussis, se uso el vector recien desarrollado pSS4245 (figura 1). No se ha publicado una descripcion completa de este vector y, por tanto, en el presente documento se notifica una perspectiva general de esta estructura. Este vector se diseno espedficamente para intercambio alelico en especies de Bordetella. Contiene un sitio de clonacion de multiples ligadores en el que pueden insertarse el gen de interes y sus secuencias flanqueantes en el cromosoma, varios genes de resistencia a antibioticos, incluyendo ampicilina, usados para seleccionar el vector y sus derivados en E. coli. El origen de replicacion se deriva de pBR322, que implica que el vector puede replicarse en E. coli pero es suicida en B. pertussis. Tambien existe un gen de estreptomicina fosfotransferasa derivado de Tn5: este gen confiere resistencia a estreptomicina a B. pertussis pero no a E. coli [33]. La transferencia conjugativa entre un E. coli donante y un B. pertussis receptor puede ocurrir debido a la presencia de un origen de transferencia derivado del plasmido Rp4. Esto requiere el uso de E. coli SM10 como cepa donante, que proporciona en trans las funciones conjugativas necesarias derivadas de RP4 [22]. La conjugacion ocurre meramente cultivando juntos en lmea el B. pertussis receptor y el E. coli donante sobre placas de agar que soportan el crecimiento de las dos bacterias. Puesto que el vector es suicida en B. pertussis, la estreptomicina selecciona celulas de B. pertussis que han integrado todo el vector y su marcador StrR mediante recombinacion homologa en una de las regiones que flanquean el gen de interes y al mismo tiempo elimina el E. coli donante. Para resolver esto, cointegrar y eliminar la mayor parte del vector salvo el gen de interes, pSS4245 incorpora el gen I-SceI meganucleasa junto con el sitio de escision correspondiente (figura 1) [34]. La nucleasa se ubica bajo el control del promotor del operon ptx-ptl. No hay sitio de escision correspondiente en el cromosoma de B. pertussis. La seleccion de cointegrados ha de llevarse a cabo en condiciones de modulacion, donde todos los factores de virulencia de B. pertussis incluyendo PT estan suprimidos. Esta condicion se obtuvo anadiendo acido nicotmico 20 mM a las placas de MSS-agar usadas en el proceso de emparejamiento. La transferencia de la mezcla de exconjugantes a MSS-agar sin acido nicotmico anadido libera la represion del promotor ptx y, por tanto, la I-SceI

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nucleasa se expresa entonces. Esto provoca una rotura de dobles cadenas en el cromosoma bacteriano al nivel del sitio de nucleasa en el vector integrado. Este acontecimiento es letal si no se repara. El dano al ADN tambien activa la respuesta SOS para la reparacion: la frecuencia de recombinacion se aumenta en 2-3 log y la lesion se elimina finalmente mediante una segunda recombinacion homologa [34]. En cualquier caso, se pierde la mayor parte del vector. Si ocurre la segunda recombinacion en la misma region flanqueante, la cepa original se regenera, si ocurre en la otra region flanqueante, se obtiene la cepa deseada. Necesitan examinarse algunas colonias para determinar su estado de resistencia a cloramfenicol como con las regiones flanqueantes que son de aproximadamente el mismo tamano, los dos tipos de cepas resultantes, concretamente original y recombinante, se distribuyen aproximadamente por igual.

Se digirio el plasmido pSK5Cm3 con Sad y BglII y se ligo el fragmento recuperado en pSS4245 cortado con Sad y BamHI. Tras la transformacion en E. coli SM10, el plasmido resultante se designo pSS5Cm3. Se rasparon cultivos nuevos de la cepa de B. pertussis Tohama (4 dfas en MSS-agar con acido nicotmico 20 mM) y de E. coli SM10 que alberga el vector (durante la noche en LB-agar con ampicilina, kanamicina y cloramfenicol) y se mezclaron en placas de agar que conteman LB:MSS (1:1) con acido nicotmico 20 mM y MgCh 10 mM. Despues de 3 h a 35°C, la mezcla se aplico con hisopo en MSS con acido nicotmico 20 mM, estreptomicina 50 |ig/ml y cloramfenicol 5 |ig/ml. El crecimiento del hisopo se cultivo en lmea en MSS-agar con cloramfenicol 5 |ig/ml para el segundo acontecimiento de recombinacion. Las colonias individuales resultantes se sometieron a prueba mediante siembra en placas de repeticion y algunas colonias con el fenotipo SmS y CmR se retuvieron para pruebas adicionales (figura 3A). Las colonias se confirmaron como B. pertussis mediante amplificacion por PCR con cebadores espedficos de B. pertussis. La integracion del gen CmR en la posicion designada se confirmo mediante PCR con los cebadores que se uman espedficamente a las regiones flanqueantes hacia 5' (cebadores 5'F-int y 5'RCMint) y hacia 3' (cebadores 3'FCM-int y 3'R-int) e internamente en el gen CmR. A partir del analisis por PCR, se confirmo que las regiones flanqueantes 5' y 3' estaban presentes y que el gen CmR se habfa insertado en la ubicacion esperada en lugar del gen S1. Estas verificaciones tambien confirmaron que el proceso de intercambio alelico no habfa provocado ninguna alteracion en las regiones flanqueantes de S1 en las que habfa tenido lugar la recombinacion.

Construccion de un gen S1 modificado

El gen S1 se clono mediante amplificacion por PCR y se muto mediante mutagenesis de sitio dirigido por PCR. Los cebadores S1F-PT-KpnI y SIR-PT-Xbal se usaron para amplificar el gen del ADN cromosomico. El producto de PCR purificado se digirio con Xbal y Kpnl y el fragmento de 908 pb recuperado se ligo en pSK53 cortado con las mismas enzimas. Tras la transformacion y seleccion de colonias, el plasmido resultante se designo pSK5S13.

La mutagenesis de sitio dirigido por PCR uso los cebadores F-R9K y R-R9K internos con el apareamiento erroneo de la secuencia CGC^AAG, provocando la sustitucion R9K. Estos cebadores se usaron en ciclos de reaccion separados. Entonces, se combinaron los productos de amplificacion y se continuo la amplificacion durante 4-5 ciclos tras la hibridacion. Los cebadores externos se anadieron entonces a la reaccion para generar el fragmento de S1 entero que contema la mutacion deseada. Se aplico el mismo procedimiento para generar la segunda mutacion usando los cebadores de apareamiento erroneo internos F-E129G y RE129G, para la generar la secuencia GAA^GGG, provocando la sustitucion E129G.

Se digirio el fragmento resultante con Xbal y Kpnl y se inserto en pSK53 cortado con las mismas enzimas para obtener el plasmido pSK5S13-9K-129G (figura 2B). Esto se digirio con Sacl y BglII y se ligo el fragmento recuperado en pSS4245 cortado con Sacl y BamHI. Tras la transformacion en E. coli SM10, el plasmido resultante se designo pSS5S13-9K-129G.

Se realizo intercambio alelico para insertar el gen S1 modificado de nuevo en su ubicacion original en el cromosoma de B. pertussis tal como se describio anteriormente pero sin seleccion de los exconjugantes mediante cloramfenicol. Las cepas deseadas en este caso han perdido este marcador y, por tanto, fue necesario examinar mediante siembra en placas de repeticion para identificar colonias con el fenotipo deseado CmS y SmS. El derivado de Tohama resultante se designo Bp-WWC (figura 3B). La integracion del gen S1 mutado en la posicion designada se confirmo mediante PCR con los cebadores espedficos. Los cebadores podfan unirse a las regiones flanqueantes hacia 5' (cebadores 5'F-int y R-R9K) y hacia 3' (cebadores F-E129G y 3'R-int) y dentro del gen S1.

Insercion de un segundo conjunto de los cinco genes estructurales de PT

En primer lugar, se clonaron las secuencias que flanquean el sito de insercion diana (figura 4A) para obtener pSKPD5Cm3. El fragmento de 1688 pb hacia 5' se amplifico con los cebadores 5'F-PD-ApaI y 5'R-PD-MCS, se digirio con ApaI y KpnI y se ligo en pSK5Cm3 cortado con las mismas enzimas para dar pSKPD5'-Cm. El fragmento de 2980 pb hacia 3' se amplifico con los cebadores 3'F-PD-MCS y 3'R-PD-BglII, se digirio con XbaI y BglII y se ligo en pSKPD5'-Cm cortado con las mismas enzimas. El plasmido resultante se designo pSKPD5Cm3 (figura 4B).

Se obtuvo el constructo conjugativo mediante digestion de este plasmido con NotI y BglII y ligacion en pSS4245 digerido con NotI y BamHI. El plasmido resultante pSSPD53-Cm. La transferencia conjugativa y seleccion de SmS y CmR proporciono el derivado de B. pertussis deseado Bp-PD53-Cm, en el que se confirmo la presencia del inserto

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Se genero una copia funcional del operon ptx con su promotor mediante insercion del terminador ptx-ptl al lado del gen S3. Se amplificaron los cinco genes estructurales de PT (S1, S2, S4, S5, S3 modificados) con su promotor de operon a partir de ADN de Bp-WWC usando los cebadores PtxF-BamHI y PtxR-MCS. El producto de amplificacion de 3469 pb se digirio con BamHI y SpeI y el fragmento recuperado se ligo en pSKhRI cortado con las mismas enzimas para dar pSKptx. pSKhRI es una variante de pBluescript II SK+ en donde se ha eliminado el sitio EcoRI mediante digestion y llenado con la enzima Klenow y recircularizacion.

El terminador de operon ptx-ptl se amplifico entonces con los cebadores TerF-EcoRI y TerR-SpeI. El producto de 223 pb se digirio doblemente con EcoRI y SpeI y se ligo en pSKptx cortado con las mismas enzimas. Tras la transformacion y seleccion de colonias, el plasmido resultante se designo pSKptxter (figura 4C). Este plasmido se digirio doblemente con BamHI y SpeI y se ligo en pSSPD5Cm3 cortado con las mismas enzimas para dar el vector conjugativo pSSPDptxter. Se realizo intercambio alelico en Bp-PD53Cm tal como se describio anteriormente con seleccion de replicas para las colonias SmS y CmS para obtener la cepa designada Bp-WWD. La integracion del gen S1 mutado en la posicion designada se confirmo mediante PCR con cebadores espedficos. Los cebadores podfan unirse a las regiones flanqueantes hacia 5' (cebadores 5'FPD-int y R-R9K) y hacia 3' (cebadores F-E129G y 3'RPD- int) y dentro del gen S1.

Insercion de una segunda copia del gen estructural de PRN

Integracion de un gen de resistencia a cloramfenicol en el sitio diana seleccionado para integrar una segunda copia del gen estructural de PRN.

Se construyo un derivado de pBluescript SK+ que careda del sitio BamHI mediante digestion con la enzima, llenado con la enzima Klenow y ligacion. El plasmido resultante se transformo en E. coli y se designo pSKAHI.

La secuencia de la cepa de B. pertussis Tohama se examino y se identificaron pseudogenes. Se selecciono la secuencia de ADN entre un pseudogen de glutation S-transferasa putativo y un pseudogen de aspartato racemasa putativo como sitio de insercion (posn. 1.344.710-1.345.685 y 1.345.693-1.346049). Estos genes portan mutaciones de desplazamiento del marco de lectura y no son funcionales (figura 6A).

Se amplifico la region hacia 5' con respecto al sito de insercion seleccionado como diana usando cebadores que portaban SpeI (5'F-PD2-SpeI) y un ligador multiple incluyendo los sitios de restriccion BamHI y NotI (5'R-PD2-MCS). Se aislo el producto amplificado mediante electroforesis en gel y se digirio doblemente con SpeI y NotI. Se ligo el fragmento resultante en un fragmento de pSKAH1 digerido con las mismas enzimas. El plasmido resultante se transformo en E. coli y se designo pSKPD25. El fragmento hacia 3' se amplifico de manera similar con cebadores que portaba los sitios de restriccion XbaI(3'F-PD2-XbaI) y NotI (3'R-PD2-NotI). Tras la digestion con las mismas enzimas, se ligo el fragmento resultante en un fragmento de pSKPD25 digerido con las mismas enzimas. El plasmido resultante se transformo en E. coli y se designo pSKPD253.

El sitio de resistencia a cloramfenicol se obtuvo mediante amplificacion por PCR a partir del plasmido pACYC184 usando cebadores que portaban sitios de restriccion BamHI(CmF-BamHI) y XbaI (CmR-XbaI). Se digirio el producto de PCR con las dos enzimas y se clono en pSKPD253 cortado con las mismas enzimas. Tras la ligacion, el plasmido resultante se transformo en E coli, se verifico mediante analisis de restriccion y se designo pSKPD25Cm3.

Tras la verificacion mediante mapeo de restriccion, se digirio el plasmido con NotI y SpeI y se ligo el fragmento resultante en pSS4245 digerido doblemente con las mismas enzimas. El plasmido resultante se designo pSSP2D5Cm3 y se transformo en E. coli SM10.

Se llevo a cabo la conjugacion tal como se describio anteriomente, usando Bp-WWD como la cepa de B. pertussis receptora, con seleccion de colonias individuales de CmR y SmS. La integracion del gen CmR en la posicion designada se confirmo mediante PCR con los cebadores que se uman espedficamente a solo las regiones flanqueantes hacia 5' (cebadores 5'FPD2-int y 5'RCM-int) y hacia 3' (cebadores 3'FCM-int y 3'RPD2-int) y dentro del gen CmR.

Integracion del gen prn bajo el control del promotor fha

Se amplifico el gen estructural de PRN a partir de ADN de B. pertussis usando un cebador que empezo en el codon de inicio ATG (F) y un cebador que portaba un sitio de restriccion XbaI (R). El producto amplificado de 2808 pb que contema solo la region codificante y el terminador se trataron mediante un protocolo de resolucion “A” (Promega). El fragmento resultante se clono en el vector pGEM-T Easy. El plasmido resultante designado pGEM-TPRN se verifico mediante analisis de restriccion. En un proceso de elaboracion inicial para crear una segunda copia del gen prn impulsado por el promotor de FHA mas fuerte, se aislo el promotor de fHa a partir de ADN de B. pertussis mediante

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amplificacion por PCR y se inserto por delante del gen PRN. El promotor de FHA se amplifico mediante cebadores que portaban BamHI (FHAproF-BamHI) y un poliligador que contema Ndel-Xbal (FHAR-MCS). Se corto el producto purificado con BamHI y XbaI, luego se ligo el fragmento de ADN recuperado en pSKPD253 tambien cortado con las mismas enzimas. El plasmido resultante designado pSKPD253Fp se verifico mediante analisis de restriccion. Este plasmido se corto con Ndel y XbaI, luego se ligo con el producto de PCR del gen prn que se amplifico de pGEMTPRN mediante los cebadores PRNF-Ndel y PRNRXbal y cortado con las mismas enzimas. El plasmido resultante se designo pSKPD25FpPRN3 (figura 6B). El constructo conjugativo se obtuvo mediante digestion de este plasmido con Notl y SpeI y ligacion en pSS4245 digerido con las mismas enzimas. El plasmido resultante se designo pSSPD2FpPRN. Este constructo se inserto en la ubicacion seleccionada del cromosoma de Bp-WWD para reemplazar el marcador de resistencia a cloramfenicol introducido mediante el uso del procedimiento habitual de intercambio alelicos y examinacion tal como se describio anteriormente.

Expresion del gen prn bajo el control del promotor prn

Se clono el promotor de PRN mediante amplificacion por PCR del ADN de B. pertussis usando cebadores con los sitios de restriccion BamHI (PrnProF-BamHl) y Ndel (pRNProR-Ndel). Se corto el plasmido pSKPD25FpPRN3 con BamHI y NdeI para generar un fragmento que habfa perdido el promotor de FHA. El promotor de PRN se ligo en su lugar. Tras la transformacion en E. coli y verificacion mediante analisis de restriccion, el plasmido resultante se designo pSKPD25PRN3 (figura 6C). El plasmido se corto con NotI y se inserto en pSS4245 cortado con la misma enzima. El constructo resultante, pSSPD2prn, se transfirio en E. coli SM10 para llevar a cabo el intercambio alelico. La cepa de B. pertussis resultante se designo Bp-WWE. La integracion del gen prn en la posicion designada se confirmo mediante PCR con los cebadores que se uman espedficamente a solo las regiones flanqueantes hacia 5' (cebadores 5'FPD2-int y PRNProR-NdeI) y hacia 3' (cebadores PRNF-int y 3'RPD2-int) y dentro del gen prn.

Expresion de PT, FHA y PRN en cultivo de frasco de agitacion

Se hicieron crecer Bp-WWC, Bp-WWD y Bp-WWE en frascos de agitacion con 100 ml de medio MSS complementado con p-ciclodextrina metilada a 35°C, 200 rpm. Despues de 32-48 h de crecimiento, se recogieron los sobrenadantes de cultivo y se sometieron a ensayo mediante ELISA para cuantificar el nivel de expresion de PT y FHA. La expresion de PRN se determino mediante analisis densitometrico de inmunotransferencia de tipo Western para evaluar tambien la integridad del antfgeno. Este ensayo se llevo a cabo tanto en el sobrenadante de cultivo clarificado como en el extracto celular obtenido calentando a 60°C en tampon isotonico.

Ensayo ELISA para PT y FHA

Se recubrieron anticuerpos policlonales de conejo purificados frente a PT o FHA (1:1000, NLAC, Tailandia) en placas de 96 pocillos (NUNC Maxisorp) con 100 |il por pocillo en tampon carbonato/bicarbonato (pH 9,6) y se incubaron durante la noche a 4°C. Despues de lavar 3 veces con solucion salina tamponada con fosfato pH 7,4 con Tween 20 (PBST) al 0,1%, se realizo bloqueo con 100 |il por pocillo de PBST que incluyo albumina serica bovina (BSA) al 3% y despues se incubaron a 37°C durante 1 h. Despues de descartar el tampon de bloqueo y lavado, se cargaron las diluciones de las muestras, FHA o PT patron y se incubaron a 37°C durante 1 h. Despues de lavar 3 veces con PBST, se anadieron 100 |il de anticuerpo monoclonal de raton anti-subunidad S2 de PT (1:30,000, Abcam, EE.UU)) o anticuerpo monoclonal de raton anti-FHA (1:10,000, NIBSC, R.U) en tampon de bloqueo y se incubaron en las mismas condiciones. Despues de lavar el pocillo 3 veces con PBST, se usaron 100 |il de dilucion 1:10.000 en tampon de bloqueo de conjugado de HRP-IgG de conejo anti-raton (H + L) (Abcam, EE.UU) como anticuerpo secundario y se incubo de nuevo a 37°C durante 1 h. Despues de lavar con PST, se anadieron 100 |il de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (KPL, EE.UU) como sustrato enzimatico. Se termino la reaccion de color con 100 |il de HCl 1 N por pocillo. Se midio la densidad optica a 450 nm usando un lector de placas de microtitulacion.

Ensayo de inmunotransferencia de tipo Western para PRN

Se resolvieron diluciones de muestras y PRN patron en un gel SDS-PAGE al 10%, luego se transfirieron a una membrana de PVDF usando un sistema de inmunotransferencia semiseco. Se bloqueo la membrana con el 5% de leche desnatada en PBST durante 1 h. Despues de descartar esta disolucion de bloqueo, se incubo la membrana con 20 ml de suero de oveja anti-PRN (1:10,000, NIBSC, R.U) en tampon de bloqueo durante 1 h, luego se lavo 3 veces con PBST. Entonces se incubo la membrana en las mismas condiciones con 20 ml de conjugado de HRP-IgG de conejo anti-oveja (Santa Cruz Biotechnology, EE.UU) y se lavo de nuevo. Entonces se sumergieron las membranas en 3,3'-diaminobenzamidina hasta que se desarrollo el color marron. Se termino la reaccion aclarando 2-3 veces con agua desionizada, luego se dejo secar a temperatura ambiente. Se examino la membrana y se convirtio a un archivo de imagen. Las concentraciones de PRN se derivaron mediante analisis densitometrico de la muestra y bandas de referencia usando un software especializado.

Estabilidad genetica

Se cultivaron las cepas en 100 ml de medio MSS a 35°C y 200 rpm durante 48 h, luego se transfirieron 0,1 ml de

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cultivo en 100 ml de MSS y se incubaron en la misma condicion y esta etapa se repitio 4 veces mas. Cada transferencia se corresponde a 10 generaciones. Se diluyo el cultivo y se sembro en placa en MSS agar. Se escogieron aleatoriamente treinta colonias aisladas. De las treinta colonias seleccionadas, dos se analizaron mediante PCR para detectar la presencia esperada de los insertos de PT y PRN.

Ensayo de agrupacion de celulas de CHO

Se determino la actividad de agrupacion de celulas de ovario de hamster chino (CHO) mediante el metodo de Hewlett et al. [28] En resumen, se cultivaron celulas de CHO en el medio cRPMI 1640 complementado con suero bovino fetal al 10%. Se incubaron las celulas a 37 °C bajo una atmosfera del 5% de CO2. Se tripsinizaron las celulas cultivadas y se ajustaron a 2 x 104 celulas/ml con medio cRPMI 1640 para distribuir una porcion de 200 |il a cada pocillo de una microplaca de cultivo de 96 pocillos. Se diluyeron en serie las muestras de prueba y la toxina PT de referencia en intervalos de diez veces en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 y se anadio un volumen de 25 |il de las diluciones a los pocillos. Tras la incubacion durante 48 h en la misma condicion para permitir la agrupacion maxima, las celulas se tineron con violeta cristal y se fotografiaron.

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Claims (12)

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    REIVINDICACIONES

    Cepa de Bordetella pertussis geneticamente modificada, en la que el gen S1 de la toxina pertussis tiene las mutaciones Arg9^Lys9 y Glu129^Gly129, no incluye ningun gen de resistencia a antibioticos y puede expresar toxina pertussis detoxificada (rPT).

    Cepa modificada segun la reivindicacion 1, en la que se uso el vector pSS4245 para introducir las mutaciones de S1 sin integracion de un gen de resistencia a antibioticos.

    Cepa modificada segun la reivindicacion 1 o 2, que es una cepa Tohama.

    Cepa modificada segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se ha modificado adicionalmente mediante:

    (a) integracion de al menos una copia del operon ptx en una region no funcional del cromosoma de la cepa modificada, en la que el operon ptx integrado comprende un conjunto de genes S2 - S5 y un gen S1 que se ha modificado para incluir las mutaciones Arg9^Lys9 y Glu129^Gly129, teniendo asf la cepa modificada dos operones ptx que se ubican separados en el cromosoma y pudiendo expresar niveles potenciados de toxina pertussis detoxificada en relacion con una cepa con solo un operon ptx; y/o

    (b) integracion de al menos una copia de un gen prn que codifica para pertactina en una region no funcional del cromosoma de la cepa modificada, teniendo asf la cepa modificada al menos dos genes prn que se ubican separados en el cromosoma y pudiendo expresar niveles potenciados de pertactina en relacion con una cepa con solo un gen prn;

    en la que la cepa modificada no incluye ningun gen de resistencia a antibioticos integrado.

    Cepa modificada segun la reivindicacion 4, en la que se uso el vector pSS4245 para introducir la copia del operon ptx y/o gen prn sin integracion de un gen de resistencia a antibioticos.

    Cepa modificada segun la reivindicacion 4 o 5, en la que la copia del operon ptx y/o gen prn se integra dentro de o entre pseudogenes no funcionales.

    Cepa modificada segun una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que comprende al menos dos operones ptx modificados y/o al menos dos genes prn.

    Metodo de produccion de una cepa de Bordetella pertussis modificada, comprendiendo el metodo la etapa de introducir las mutaciones Arg9^Lys9 y Glu129^Gly129 en el gen S1 de una cepa de B. pertussis, dando como resultado de este modo que se produzca una cepa modificada que puede expresar toxina pertussis detoxificada (rPT) y que no incluye ningun gen de resistencia a antibioticos.

    Metodo segun la reivindicacion 8, en el que se usa el vector pSS4245 para introducir las mutaciones de S1 sin integracion de un gen de resistencia a antibioticos.

    Metodo segun la reivindicacion 8 o 9, en el que la cepa de B. pertussis es una cepa Tohama.

    Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende ademas la etapa de:

    (a) integrar al menos una copia del operon ptx en una region no funcional del cromosoma de la cepa

    modificada, en el que el operon ptx integrado comprende un conjunto de genes S2 - S5 y un gen S1 que se

    ha modificado para incluir las mutaciones Arg9^Lys9 y Glu129^Gly129, produciendo asf una cepa

    modificada que tiene al menos dos operones ptx que se ubican separados en el cromosoma y pudiendo expresar niveles potenciados de toxina pertussis detoxificada en relacion con una cepa con solo un operon ptx; y/o

    (b) integrar al menos una copia de un gen prn que codifica para pertactina en una region no funcional del cromosoma de la cepa modificada, produciendo asf una cepa modificada que tiene al menos dos genes prn que se ubican separados en el cromosoma y pudiendo expresar niveles potenciados de pertactina en relacion con una cepa con solo un gen prn;

    en el que el operon ptx y/o gen prn se integra sin integracion de ningun gen de resistencia a antibioticos.

    Metodo segun la reivindicacion 11, en el que se usa el vector pSS4245 para introducir la copia del operon ptx y/o gen prn sin integracion de un gen de resistencia a antibioticos.

    Metodo segun la reivindicacion 11 o 12, en el que el operon ptx y/o el gen prn se integran en o entre

    pseudogenes no funcionales.
11. 14. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que se inserta una copia del operon ptx modificado y una copia del gen prn en el cromosoma de la cepa.

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12. 15. Metodo de produccion de antigenos de Bordetella pertussis que comprende las etapas de:

    (i) cultivar una cepa de B. pertussis geneticamente modificada segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o producida segun el metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14 en un medio de

    10 cultivo para efectuar la expresion de los antfgenos, en el que los antigenos incluyen toxina pertussis

    detoxificada (rPT), pertactina y hemaglutinina filamentosa (FHA) codificados por genes presentes en la cepa; y

    (ii) recuperar los antfgenos del medio de cultivo o extracto celular para su uso como vacuna.

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