JPWO2005090576A1 - 百日咳感染症予防用ｄｎａ構築物 - Google Patents

Abstract

１８０アミノ酸からなる百日咳毒素Ｓ１サブユニットのアミノ酸配列において、（ａ）第９番目のアルギニン残基のリジン残基への変異、および（ｂ）第１２９番目のグルタミン酸残基のグリシン残基への変異からなる群から選択される少なくとも一つの変異を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが開示されている。さらに、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現しうる形で含んでなる、ＤＮＡ構築物が開示されている。

Description

発明の背景

発明の分野
本発明は百日咳感染症の予防に用いる、ポリヌクレオチドおよびこれを発現するＤＮＡ構築物に関する。

背景技術
百日咳は、百日咳菌（Bordetella pertussis）の感染によって引き起こされる小児の急性呼吸器感染症であり、この感染症対策としては、ワクチン接種による予防が最も効果的である。現在、日本国で接種されている百日咳ワクチンは、百日咳毒素および繊維状赤血球凝集素を主要防御抗原とする無細胞ワクチンである。そして、この無細胞ワクチンに用いられる防御抗原は、百日咳菌の培養上清から分画された後、ホルマリンで無毒化されたものである。この無細胞ワクチンの製造には、百日咳菌の大量培養が必須であり、費用面およびバイオセーフティーといった安全性の面から、より安価で安全に製造できる新規ワクチンの開発が望まれている。

１９８８年には、百日咳毒素遺伝子の全塩基配列が決定され、それ以降、各国の研究グループにより遺伝子レベルでの新規百日咳ワクチンの研究開発が盛んに行われている。

例えば、新規百日咳ワクチンの候補物質として、リコンビナント蛋白質として発現させた毒素抗原を挙げることができるが、これらのリコンビナント抗原によって予防上有効な毒素中和抗体を誘導することは困難である。

一方、ＤＮＡワクチン技術は、ワクチン抗原遺伝子を直接生体内で発現させることによって免疫応答を誘導する技術であり、従来のワクチンに比較して安価にワクチン製造が行えるものと期待されている。そして、近年、多くの感染症に対し、その防御抗原遺伝子を用いたＤＮＡワクチンの有効性が検討されている。

例えば、K. Kamachi et al., Vaccine, 21, 4609-4615, 2003には、百日咳毒素のＳ１サブユニットを発現するプラスミドＤＮＡをマウスに接種すると、百日咳毒素中和活性が誘導されることが開示されている。

また、Castro MG, et al., Cell micorbiol, 3, 45-54, 2001には、ＣＨＯ細胞において発現させた百日咳毒素のＳ１サブユニットは、毒性活性（ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性）を示すことが開示されている。

また、Pizza M., et al., Science, 246, 497-500, 1989には、百日咳毒素Ｓ１サブユニットの毒性活性発現に関与するアミノ酸は同定されており、その第９番目のアルギニン残基のリジン残基への変異および第１２９番目のグルタミン酸残基のグリシン残基への変異を導入することにより、その毒素活性が消失することが開示されている。

発明の概要

本発明者らは、今般、百日咳毒素Ｓ１サブユニットにおける第１〜１８０番のアミノ酸からなるペプチド断片において、その第９番目のアルギニン残基のリジン残基への変異および／または第１２９番目のグルタミン酸残基のグリシン残基への変異を有するペプチド断片を発現させることにより、その毒性活性を抑制しつつ、百日咳菌に対する顕著な免疫防御効果を誘導することが可能であるとの知見を得た。本発明はこれらの知見に基づくものである。

従って、本発明は、百日咳感染症の予防または治療に用いるポリペプチド、これを発現しうるＤＮＡ構築物ならびにこれらを含んでなる医薬組成物を提供することを目的とする。

そして、本発明によるポリペプチドは、１８０アミノ酸からなる百日咳毒素Ｓ１サブユニットのアミノ酸配列において、
（ａ）第９番目のアルギニン残基のリジン残基への変異、および
（ｂ）第１２９番目のグルタミン酸残基のグリシン残基への変異
からなる群から選択される少なくとも一つの変異を有するアミノ酸配列を有するものである。

また、本発明によるＤＮＡ構築物は、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現しうる形で含んでなるものである。

また、本発明による医薬組成物は、前記ポリぺプチドまたは前記ＤＮＡ構築物を含んでなるものである。

本発明によれば、毒性の消失したポリペプチドまたはこのポリペプチド遺伝子を組み込んだＤＮＡ構築物を免疫原とすることから、それらの製造において、バイオセーフティーレベル２の百日咳菌を大量培養する必要は無く、例えば、バイオセーフティーレベル１の大腸菌を取り扱えばよいため、安全に百日咳予防用組成物を製造することが可能となる。さらに、本発明によれば、ポリペプチドまたはＤＮＡ構築物を直接生体内に接種しても、宿主細胞内で毒素活性を生じることがなく、宿主に対する安全性の高い百日咳感染症の予防が可能となる。

は、Ｃ１８０−９Ｋ／１２９Ｇ遺伝子が挿入されたプラスミド（ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−９Ｋ／１２９Ｇ）の構築を示す図である。 は、百日咳毒素Ｓ１サブユニットのＮ末端またはＣ末端を欠損するＣ２００遺伝子、Ｃ１８０遺伝子、Ｃ１６０遺伝子、およびＮ４０遺伝子の模式図である。 は、Ｓ１遺伝子、Ｃ２００遺伝子、Ｃ１８０遺伝子、Ｃ１６０遺伝子、またはＮ４０遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞におけるノーザンブロット解析の結果を示す。 は、Ｓ１遺伝子、Ｃ２００遺伝子、Ｃ１８０遺伝子、Ｃ１６０遺伝子、またはＮ４０遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞におけるウェスタンブロット解析の結果を示す。 は、末端切断型Ｓ１遺伝子（Ｃ２００遺伝子、Ｃ１８０遺伝子、Ｃ１６０遺伝子、またはＮ４０遺伝子）を接種したマウス血清中の抗百日咳毒素抗体の濃度を示す。 は、末端切断型Ｓ１遺伝子を接種したマウスに百日咳毒素を投与した場合の末梢血白血球数を示す。 は、変異Ｃ１８０遺伝子（Ｃ１８０−９Ｋ遺伝子、Ｃ１８０−１２９Ｇ遺伝子、Ｃ１８０−９Ｋ／１２９Ｇ遺伝子）の模式図および上記変異Ｃ１８０遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞におけるウェスタンブロット解析の結果を示す。 は、変異Ｃ１８０遺伝子（Ｃ１８０−９Ｋ遺伝子、Ｃ１８０−１２９Ｇ遺伝子、またはＣ１８０−９Ｋ／１２９Ｇ遺伝子）を接種したマウス血清中の抗百日咳毒素抗体の濃度を示す。 は、変異Ｃ１８０遺伝子（Ｃ１８０−９Ｋ遺伝子、Ｃ１８０−１２９Ｇ遺伝子、またはＣ１８０−９Ｋ／１２９Ｇ遺伝子）を接種したマウスに百日咳毒素を投与した場合の末梢血白血球数を示す。 は、ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−９Ｋ、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−１２９Ｇ、またはｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−９Ｋ／１２９ＧをＣＨＯ細胞に遺伝子導入して得た安定発現株の写真である。

発明の具体的説明

本発明の一つの態様によれば、本発明によるポリペプチドをコードするアミノ酸配列は、百日咳毒素Ｓ１サブユニットにおける第１〜１８０アミノ酸（以下「Ｃ１８０」という）からなり、さらに（ａ）第９番目のアルギニン残基のリジン残基への変異（以下「Ｒ９Ｋ変異」という）および（ｂ）第１２９番目のグルタミン酸残基のグリシン残基への変異（以下「Ｅ１２９Ｇ変異」という）からなる群より選択される少なくとも一つの変異を有するものである。そして、本発明の好ましい態様によれば、本発明によるポリペプチドは、Ｒ９Ｋ変異を有するものである（以下「Ｃ１８０−９Ｋ」という）。また、本発明の別の好ましい態様によれば、本発明によるポリペプチドはＥ１２９Ｇ変異を有するものである（以下「Ｃ１８０−１２９Ｇ」という）。さらに、本発明の別の好ましい態様によれば、Ｒ９Ｋ変異およびＥ１２９Ｇ変異を有するものである（以下「Ｃ１８０−９Ｋ／１２９Ｇ」という）。

そして、変異を有さないＣ１８０のアミノ酸配列としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の第２〜１８１アミノ酸を有するものが挙げられる。配列番号２中の第１番目のメチオニン残基は、翻訳後に脱離するものである。そして、本発明の好ましい態様によれば、変異を有さないＣ１８０のアミノ酸配列は、配列番号２における第２〜１８１番で表されるアミノ酸配列において、Ｒ９Ｋ変異および／またはＥ１２９Ｇ変異以外の部位において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したものである。この変異を有さないＣ１８０のアミノ酸配列によって表される、本発明によるポリペプチドもまた、百日咳感染症に対する予防または治療に利用することが可能な免疫誘導活性を有する。ここで、「１もしくは数個」の範囲は、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個程度を意味する。

また、本発明の別の好ましい態様によれば、変異を有さないＣ１８０のアミノ酸配列は、配列番号２における第２〜１８１番で表されるアミノ酸配列の部分配列であってＲ９Ｋ変異および／またはＥ１２９Ｇ変異の部位を含む部分配列を含んでなるものである。このような部分配列によって表される、本発明によるポリペプチドもまた、百日咳感染症に対する予防または治療に利用することが可能な免疫誘導活性を有する。そして、上記部分配列としては、好ましくは配列番号２における第３〜１８０番で表される部分配列が挙げられる。

また、本発明によれば、本発明によるポリペプチドをコードするＤＮＡが提供される。そして、本発明の好ましい態様によれば、本発明によるＤＮＡは、配列番号１における第１０〜５４９番で表されるヌクレオチド配列において、第３４〜３６番残基がリジン残基をコードするコドンへ置換されたヌクレオチド配列を有するものである。このような置換としては、好ましくは第３４〜３６番残基のアデニン残基（Ａ）、アデニン残基（Ａ）、およびグアニン残基（Ｇ）への置換が挙げられる。また、本発明の別の好ましい態様によれば、本発明によるＤＮＡは、配列番号１における第１０〜５４９番で表されるヌクレオチド配列において、第３９４〜３９６番残基がグリシン残基をコードするコドンへ置換されたヌクレオチド配列を有するものである。このような置換としては、好ましくは第３９５〜３９６番残基のグアニン残基（Ｇ）およびシトシン残基（Ｃ）への変異が挙げられる。また、本発明の別の好ましい態様によれば、本発明によるＤＮＡは、配列番号１における第１０〜５４９番で表されるヌクレオチド配列において、第３４〜３６番残基がリジン残基をコードするコドンへ置換され、かつ第３９４〜３９６番残基がグリシン残基をコードするコドンへ置換されたヌクレオチド配列を有するものである。このような置換としては、好ましくは第３４〜３６番残基のＡＡＧへの置換および第３９５〜３９６番残基のＧＣへの置換が挙げられる。

そして、本発明によるＤＮＡ構築物は、本発明によるポリペプチドをコードするＤＮＡを発現しうる形で含んでなり、これにより本発明によるポリペプチドを発現することができる。ここで「発現しうる形で含んでなる」とは、適切な調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーターなど）の制御下に、導入遺伝子（ＤＮＡ）の発現を可能にする様式で、そのＤＮＡ構築物中に該導入遺伝子が挿入されていることを意味する。

Ｃ１８０をコードするＤＮＡは、既に公知のBordetella pertussis遺伝子の配列情報に基づいてＰＣＲプライマーを調製し、Bordetella pertussisゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行うことなどによりクローニングすることができる。これらのクローニングは、例えばMolecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等の文献に従い、当業者ならば容易に行うことができる。そして、本発明において、Ｃ１８０−９Ｋ、Ｃ１８０−１２９Ｇ、またはＣ１８０−９Ｋ／１２９ＧをコードするＤＮＡは、Ｃ１８０をコードするＤＮＡに対して、例えば、ＰＣＲを用いた変異導入法、部位特異的突然変異誘発法などを適用することにより容易に得ることができ、具体的には上記Molecular Cloning等の文献を参考にして容易に行うことができる。

本発明によるＤＮＡ構築物は、非ウイルスベクターあるいはウイルスベクターに発現可能なように挿入された形態で用いることができる。したがって、本発明によれば、本発明によるＤＮＡ構築物を含んでなるベクターが提供される。これらの非ウイルスベクターおよびウイルスベクターの調製法、投与法などは既に当業者に公知であり、例えば、別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、1996；別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社、1997；遺伝子治療開発研究ハンドブック、日本遺伝子治療学会編、エヌ・ティー・エス、1999などが参考とされる。非ウイルスベクターとしては、哺乳動物の生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれば特に限定されず、好ましくはプラスミドとされる。非ウイルスベクターとしては、例えば、pcDNA3.1、pZeoSV、pBK-CMV（Invitrogen社、Stratagene社）やpCAGGS（Gene 108,193-200(1991)）などが挙げられ、好ましくはpcDNA3.1とされる。これらの発現ベクターのプロモーターの下流域に発現可能なように上記遺伝子を挿入することにより、本発明によるベクターを調製することができる。また、本発明に用いることのできるウイルスベクターの例としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、SV４０、免疫不全症ウイルス（HIV）等を挙げることができるが、これらに限定されない。

そして、本発明によるポリペプチドは、例えば、上述のベクターを好適な宿主に導入し、この宿主を培養し、培養物中に本発明によるポリペプチドを生成蓄積させ、その培養物より本発明によるポリペプチドを単離し、精製することにより得ることができる。上記宿主としては、大腸菌、昆虫細胞または哺乳類細胞などが挙げられるが、好ましくは哺乳類細胞である。また宿主へのベクターの導入方法、宿主の培養条件等は、当業者により適宜選択される。また、本発明によるポリペプチドの単離精製については、公知手法を用いることができる。

Ｃ１８０には、百日咳毒素に対する免疫惹起部位のみならず、毒性活性部位も含まれるが、本発明によるポリペプチドは、主に抗体産生を効率よく誘導し、毒性活性はほとんど発現しない。よって、本発明によるポリぺプチドは、哺乳動物における百日咳感染症の予防に好適に用いることができる。したがって、本発明によれば、予防上有効量の本発明によるポリペプチドを被験者に投与することを含んでなる、百日咳感染症の予防方法が提供される。また、本発明によるポリペプチドは、百日咳感染症の治療に用いることも可能である。したがって、本発明によれば、治療上有効量の本発明によるポリペプチドを被検者に投与することを含んでなる、百日咳感染症の治療方法が提供される。本明細書において、「治療」とは、確立された病態を改善することを意味し、「予防」とは、将来における病態の確立を防止することを意味する。被験者は、通常ヒトであり、好ましくは乳幼児とされる。

本発明によるポリペプチドを被験者に投与する方法としては、免疫を誘導する公知の方法を用いることが可能であり、例えば、所望により公知のアジュバントとともに、液剤、懸濁剤などに調製し、皮下注射、筋肉注射または経口などにより投与することができる。

投与される本発明によるポリペプチドの量は予防上または治療上有効量であればよいが、具体的な量は当業者により決定される。また、投与量は、被検者の年齢、体重等によって調整することが好ましいが、このような投与量の調整は、医師によって適宜行なわれる。例えば、投与量は、通常１〜１０μｇ／体重ｋｇであり、好ましくは２〜５μｇ／体重ｋｇとされる。本発明によるポリペプチドは上記の投与量の範囲内において、医薬上安全である。

さらに、本発明によるポリペプチドを発現しうる、本発明によるＤＮＡ構築物もまた、ＤＮＡワクチンとして、哺乳動物における百日咳感染症の予防に好適に用いることができる。したがって、本発明によれば、予防上有効量の本発明によるＤＮＡ構築物またはベクターを被験者に投与することを含んでなる、百日咳感染症の予防方法が提供される。また、本発明によるＤＮＡ構築物は、百日咳感染症の治療に用いることも可能である。したがって、本発明によれば、治療上有効量の本発明によるＤＮＡ構築物またはベクターを被検者に投与することを含んでなる、百日咳感染症の治療方法が提供される。

また、本発明によるＤＮＡ構築物を被験者に導入する方法としては、例えば、ＤＮＡ構築物を直接体内に導入するin vivo法、被験者からある種の細胞を取り出して体外でＤＮＡ構築物を細胞に導入し、その細胞を体内に戻すex vivo法などがある（遺伝子治療開発研究ハンドブック、日本遺伝子治療学会編、エヌ・ティー・エス、１９９９）。in vivo法としては、例えば、本発明によるＤＮＡ構築物を適当な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水など）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填して注射剤を調製して、被験者へ注射することにより投与することができる。この注射剤は、被験者の筋肉または他の組織に、皮下、皮内、静脈内、または脊髄液に直接注射することができる。注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えてもよい。また、本発明によるＤＮＡ構築物は、経口および経鼻的に呼吸器粘膜細胞に投与することができる。また、脂質二重膜で作られたリポソーム中に本発明によるＤＮＡ構築物を封入し、さらにこのリポソームと不活化したセンダイウイルス（Hemagglutinating virus of Japan : HVJ）とを融合させ、HVJ−リポソームとして投与することもできる（実験医学別冊、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、1996；遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社、1994)。また、本発明によるＤＮＡ構築物を金微小粒子にコーティングして、粒子衝突装置、または「遺伝子銃」によって経皮輸送してもよい（Tang、1992、Nature 356：152〜154）。ex vivo法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、リン酸−カルシウム共沈法、DEAE−デキストラン法、微小ガラス管などを用いて細胞内へ本発明によるＤＮＡ構築物を直接注入する方法などが挙げられる。

投与される本発明によるＤＮＡ構築物の量は予防上または治療上有効量であればよいが、具体的な量は遺伝子治療分野の当業者により決定される。また、投与量は、被検者の年齢、体重等によって調整することが好ましいが、このような投与量の調整は、医師によって適宜行なわれる。例えば、投与量は、通常２〜４０μｇ／体重ｋｇであり、好ましくは４〜３６μｇ／体重ｋｇとされる。本発明によるＤＮＡ構築物は上記の投与量の範囲内において、医薬上安全である。

また、本発明による、ポリぺプチドまたはＤＮＡ構築物もしくはベクターは、医薬組成物として被験者に投与することができる。したがって、本発明の一つの態様によれば、本発明によるポリペプチドを含んでなる、医薬組成物が提供される。さらに、本発明の別の態様によれば、本発明によるＤＮＡ構築物または本発明によるベクターを含んでなる、医薬組成物が提供される。そして、上記の医薬組成物は、百日咳感染症の予防、さらには治療に用いることができる。したがって、本発明の一つの態様によれば、百日咳感染症の予防剤または治療剤の製造における、本発明によるポリペプチドの使用が提供される。さらに、本発明の別の態様によれば、百日咳感染症の予防剤または治療剤の製造における、本発明によるＤＮＡ構築物またはベクターの使用が提供される。

本発明による医薬組成物は、医薬上許容される担体をさらに含むことができる。このような医薬上許容される担体、例えば、ベヒクル、賦形剤、希釈液、アジュバント等は、投与経路などに応じて、当業者により適宜選択される。

以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

参考例１
百日咳毒素Ｓ１サブユニット（ＰＴ−Ｓ１）を発現するプラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ／Ｓ１）の構築
百日咳毒素Ｓ１サブユニットのＤＮＡは、Bordetella pertussis Tohama由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーを用いるＰＣＲにて増幅した。ここで、下記のプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩの制限部位（下線部）をそれぞれ含んでいる。

プライマー
ｍＳ１−Ｆ:フォワード:5'-CCCAAGCTTGCCACCATGGACGATCCTCCCGCCACC-3'（配列番号３)；
ｍＳ１−Ｒ:リバース :5'-CGGGATCCTTACTAGAACGAATACGCGAT-3'（配列番号４）。

このＰＣＲによる増幅は、Takara PCR thermal cycler MP（登録商標：宝酒造株式会社製）を用いて行った。サイクル反応の温度条件は、９４℃で２０秒間、６８℃で３分間、および７２℃で１０分間を１サイクルとし、これを３０サイクルとした。ＰＣＲ生成物は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩにて処理し、真核細胞発現ベクター（ｐｃＤＮＡ．３．１（＋）；Invitrogen社製）に組み込んだ。こうして得たｐｃＤＮＡ／Ｓ１プラスミドは、end-free plasmid preparation kits(Qiagen社製)を用いて、大腸菌(E. coli) JM109株から精製した。

参考例２
プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０）の構築
百日咳毒素Ｓ１サブユニットのＮ末端１８０アミノ酸残基をコードするＣ１８０遺伝子およびそのプラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０）は、以下のプライマーを用いて、参考例１と同様の方法により製造した。

プライマー
ｍＳ１−Ｆ：フォワード:5'-CCCAAGCTTGCCACCATGGACGATCCTCCCGCCACC-3'（配列番号３)；
Ｃ１８０−Ｒ：リバース :5'-CGGGATCCTTACTACGATGTGTAGGGGTTGGG-3'（配列番号５）。

参考例３
プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ／Ｃ２００）の構築
百日咳毒素Ｓ１サブユニットのＮ末端２００アミノ酸残基をコードするＣ２００遺伝子およびそのプラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ／Ｃ２００）は、以下のプライマーを用いて、参考例１と同様の方法により製造した。

プライマー
ｍＳ１−Ｆ：フォワード:5'-CCCAAGCTTGCCACCATGGACGATCCTCCCGCCACC-3'（配列番号３)；
Ｃ２００−Ｒ：リバース :5'-CGGGATCCTTACTAAGCGCCTATCACCGGCGC-3'（配列番号６）。

参考例４
プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ／Ｃ１６０）の構築
百日咳毒素Ｓ１サブユニットのＮ末端１６０アミノ酸残基をコードするＣ１６０遺伝子およびそのプラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ／Ｃ１６０）は、以下のプライマーを用いて、参考例１と同様の方法により製造した。

プライマー
ｍＳ１−Ｆ：フォワード:5'-CCCAAGCTTGCCACCATGGACGATCCTCCCGCCACC-3'（配列番号３)；
Ｃ１６０−Ｒ：リバース :5'-CGGGATCCTTACTACTCCGTGGTCGTGGTCTC-3'（配列番号７）。

参考例５
プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ／Ｎ４０）の構築
百日咳毒素Ｓ１サブユニットのＮ末端４０アミノ酸残基が欠損するＮ４０遺伝子およびこれを組み込んだプラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ／Ｎ４０）は、以下のプライマーを用いて、参考例１と同様の方法により製造した。

プライマー
Ｎ４０−Ｆ：フォワード:5'-CCCAAGCTTGCCACCATGTCCTGCCAGGTCGGCAGC-3'（配列番号８)；
ｍＳ１−Ｒ：リバース :5'-CGGGATCCTTACTAGAACGAATACGCGAT-3'（配列番号４）。

実施例１
プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−９Ｋ／１２９Ｇ）の構築
Ｒ９Ｋ変異およびＥ１２９Ｇ変異を有するＣ１８０遺伝子は、Ｓ１遺伝子を鋳型として、下記のプライマー（ｍＳ１−９Ｋ／Ｆ、Ｅ１２９Ｇ／Ｒ、Ｅ１２９Ｇ／ＦおよびＣ１８０Ｒ）の組み合わせを用いたＰＣＲ法により製造した。具体的には、ｍＳ１−９Ｋ／ＦおよびＥ１２９Ｇ／Ｒ、またはＥ１２９Ｇ／ＦおよびＣ１８０Ｒのプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲ法により、２種のＰＣＲ産物を得た。次に、この２種のＰＣＲ産物を常法に従って精製し、ｍＳ１−９Ｋ／ＦおよびＣ１８０Ｒプライマーを用いたＰＣＲ法にて処理し、Ｒ９Ｋ変異およびＥ１２９Ｇ変異を有するＣ１８０遺伝子を得た。さらに、このようにして得た遺伝子を組み込んだプラスミドベクター（pｃＤＮＡ／Ｃ１８０−９Ｋ／１２９Ｇ）を、参考例１と同様の方法により製造した。ここで、下記のプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩの制限酵素部位（下線部）ならびにＲ９Ｋおよび Ｅ１２９Ｇの遺伝子変異（かっこ内）をそれぞれ含んでいる。
ｍＳ１−９Ｋ／Ｆ: 5’-CCCAAGCTTGCCACCATGGACGATCCTCCCGCCACCGTATAC[AAG]TATGACTCCCGCCCGCCG-3’（配列番号９）；
Ｅ１２９Ｇ／Ｆ: 5’-CTGGCCACCTACCAGAGC[GGC]TATCTGGCACACCGGCGC-3’（配列番号１０）；
Ｅ１２９Ｇ／Ｒ: 5’-GCGCCGGTGTGCCAGATA[GCC]GCTCTGGTAGGTGGCCAG-3’（配列番号１１）；
Ｃ１８０Ｒ: 5’-CGGGATCCTTACTACGATGTGTAGGGGTTGGG-3’（配列番号５）。
構築したｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−９Ｋ／１２９Ｇは図１の通りである。

実施例２
プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−９Ｋ）の構築
Ｒ９Ｋ変異を有するＣ１８０遺伝子は、Ｓ１遺伝子を鋳型として以下のプライマーを用いて、参考例1と同様の方法により製造した。また、Ｒ９Ｋ変異を有するＣ１８０遺伝子を組み込んだプラスミドベクター（pｃＤＮＡ／Ｃ１８０−９Ｋ／１２９Ｇ）は、参考例１と同様の方法により製造した。ここで下記のプライマーはＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩの制限酵素部位（下線部）およびＲ９Ｋ変異（かっこ内）をそれぞれ含んでいる。
ｍＳ１−９Ｋ／Ｆ: フォワード：5’-CCCAAGCTTGCCACCATGGACGATCCTCCCGCCACCGTATAC[AAG]TATGACTCCCGCCCGCCG-3’（配列番号９）；
Ｃ１８０Ｒ: リバース：5’-CGGGATCCTTACTACGATGTGTAGGGGTTGGG-3’（配列番号５）。

実施例３
プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−１２９Ｇ）の構築
Ｅ１２９Ｇ変異を有するＣ１８０遺伝子は、Ｓ１遺伝子を鋳型として、下記のプライマー（ｍＳ１−Ｆ、Ｅ１２９Ｇ／Ｒ、Ｅ１２９Ｇ／Ｆ、およびＣ１８０Ｒ）の組み合わせを用いたＰＣＲ法により製造した。具体的には、ｍＳ１−ＦおよびＥ１２９Ｇ／Ｒ、またはＥ１２９Ｇ／ＦおよびＣ１８０Ｒのプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲ法により、２種のＰＣＲ産物を得た。次に、この２種のＰＣＲ産物を常法に従って精製し、ｍＳ１−ＦおよびＣ１８０Ｒプライマーを用いたＰＣＲ法にて処理し、Ｅ１２９Ｇ変異を有するＣ１８０遺伝子を得た。さらに、このようにして得た遺伝子を組み込んだプラスミドベクター（pｃＤＮＡ／Ｃ１８０−１２９Ｇ）を、参考例１と同様の方法により製造した。ここで、下記のプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩの制限酵素部位（下線部）ならびにＥ１２９Ｇの遺伝子変異（かっこ内）をそれぞれ含んでいる。
ｍＳ１−Ｆ: 5’- CCCAAGCTTGCCACCATGGACGATCCTCCCGCCACC-3’（配列番号３）；
Ｅ１２９Ｇ／Ｆ: 5’-CTGGCCACCTACCAGAGC[GGC]TATCTGGCACACCGGCGC-3’（配列番号１０）；
Ｅ１２９Ｇ／Ｒ: 5’-GCGCCGGTGTGCCAGATA[GCC]GCTCTGGTAGGTGGCCAG-3’（ 配列番号１１）；
Ｃ１８０Ｒ: 5’-CGGGATCCTTACTACGATGTGTAGGGGTTGGG-3’（ 配列番号５）

試験例１
百日咳毒素Ｓ１サブユニットのＮ末端またはＣ末端を欠損する末端切断型Ｓ１遺伝子の発現解析
ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ／Ｓ１、ｐｃＤＮＡ／Ｃ２００、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１６０、およびｐｃＤＮＡ／Ｎ４０を用いて以下の発現解析を行った。ここで、上記プラスミドの発現するペプチド断片は、図２の模式図の通りである。

ノーザンブロット解析
ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ／Ｓ１、ｐｃＤＮＡ／Ｃ２００、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１６０、およびｐｃＤＮＡ／Ｎ４０をそれぞれ、Superfect Transfection Reagent（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＣＯＳ−７細胞へ遺伝子導入し、２４時間後、細胞を回収した。回収した細胞から、常法に従って全ＲＮＡ画分を分離精製した。そして、５μgの全ＲＮＡを１％アガロースゲル電気泳動に供試した。百日咳毒素Ｓ１ ｍＲＮＡの検出は、ECL direct nucleic acid labelling and detection system (Amersham Pharmacia Bioteck)により、標識された百日咳毒素Ｓ１遺伝子を用いて常法に従って行った。結果は図３の通りであった。

ウェスタンブロット解析
ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ／Ｓ１、ｐｃＤＮＡ／Ｃ２００、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１６０、およびｐｃＤＮＡ／Ｎ４０をそれぞれ、SuperFect Transfection Reagent(Ｑｉａｇｅｎ社製)を用いてＣＯＳ−７細胞へ導入し、４８時間６０ｍｍ皿に静置し、回収した。この回収した細胞は、SDS lysis buffer（１００μＬ）に再懸濁した。こうして得たサンプルを３分間加熱後、遠心分離した。この上清を14% SDS-PAGEゲルにて電気泳動した。そして、ニトロセルロース膜（Nippon Bio-Rad Laboratories製）に蛋白を転写した。このニトロセルロース膜を、マウス抗百日咳毒素ポリクローナル抗血清とともにインキュベートし、さらに、ヤギ抗マウスＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Bio-RadLab.製）およびECL Western blotting detection reagents(Amersham Biosciences製）にて処理し、抗原タンパク質の発現を解析した。この結果は図４の通りであった。Ｃ１８０およびＣ２００は、ＣＯＳ−７細胞にて強く発現することが確認された。

試験例２
ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ／Ｓ１、ｐｃＤＮＡ／Ｃ２００、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１６０、およびｐｃＤＮＡ／Ｎ４０をそれぞれ、遺伝子銃（Heilio Gene Gun；Bio-Rad Lab.社製；ヘリウムガス圧４００ｐｓｉ）を用いてBalb/cマウス（５週齢；５匹／群）に１４日間隔で計３回皮内接種した。１回の接種には２μｇのプラスミドＤＮＡおよび０．５ｍｇのgold particle（Bio-Rad Lab.社製）を使用した。そして、試験開始から、１７、２５、３３、および４１日目にマウスの尾静脈よりそれぞれ採血し、マウス血清を得た。

マウス血清中の抗百日咳毒素ＩｇＧ抗体の検出
マウス血清中の抗百日咳毒素ＩｇＧ抗体（以下「抗ＰＴ−ＩｇＧ抗体」という。）は、２次抗体としてアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, AL)を用い、ＥＬＩＳＡによって測定した。
その結果を図５の通りであった。マウス血清中の抗体価については、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０がより高い値を示した。

試験例３
Ｃ１８０遺伝子接種マウスの百日咳毒素攻撃に対する防御能
試験例２と同様の方法により、ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ／Ｓ１、ｐｃＤＮＡ／Ｃ２００、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１６０、およびｐｃＤＮＡ／Ｎ４０を接種したマウスに、百日咳毒素（２μｇ：生化学工業社製）のＰＢＳ（０．５ｍＬ）溶液を腹腔内投与し、３日後に尾静脈から採血した。この血液における末梢血白血球数（ＷＢＣ）をコールターカウンター（Beckman Coultor K.K.製）を用いて測定した。その結果は図６の通りであった。

試験例４
変異導入した百日咳毒素Ｃ１８０遺伝子の発現解析
ＰＴ−Ｓ１、Ｃ１８０−９Ｋ、Ｃ１８０−１２９Ｇ、およびＣ１８０−９Ｋ／１２９Ｇを用いて、試験１と同様の方法により、ＣＯＳ−７細胞におけるタンパク質の発現についてウエスタンブロット解析した。結果は図７の通りであった。Ｃ１８０−９Ｋ、Ｃ１８０−１２９Ｇ、およびＣ１８０−９Ｋ／１２９Ｇはいずれも、変異Ｃ１８０抗原を発現することが確認された。

試験例５
変異Ｃ１８０遺伝子接種による抗百日咳毒素抗体の誘導
ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−９Ｋ、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−１２９Ｇ、およびＣ１８０−９Ｋ／１２９Ｇを用いて、試験例２と同様の試験を行った。その結果は、図８の通りであった。ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−９Ｋ、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−１２９Ｇ、およびＣ１８０−９Ｋ／１２９Ｇはいずれも、マウスに抗ＰＴ−ＩｇＧ抗体を誘導することが確認された。

試験例６
ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−９Ｋ、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−１２９Ｇ、およびｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−９Ｋ／１２９Ｇを用いて、試験例３と同様の試験を行った。その結果は、図９の通りであった。ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−９Ｋ、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−１２９Ｇ、およびｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−９Ｋ／１２９Ｇはいずれも、マウスにおいて百日咳毒素の攻撃に対する中和活性を誘導することを示している。

試験例７
変異Ｃ１８０遺伝子の安定発現株の形態
ｐｃＤＮＡ（コントロール）、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−９Ｋ、ｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−１２９Ｇ、およびｐｃＤＮＡ／Ｃ１８０−９Ｋ／１２９Ｇをそれぞれ、SuperFect Transfection Reagent（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、ＣＯＳ−７細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入された細胞については、５００μｇ／ｍＬ Geneticin（Sigma社製）を用いて、安定発現株の選択およびクローン化を行った。結果は図１０に示す通りであった。Ｃ１８０−９Ｋ／１２９Ｇを発現する細胞株はＣ１８０−９ＫおよびＣ１８０−１２９Ｇを発現する細胞株よりも死細胞が少なく、ＣＨＯ細胞に対する細胞毒性が顕著に低いことが示された。

Claims (28)

1. １８０アミノ酸からなる百日咳毒素Ｓ１サブユニットのアミノ酸配列において、
   （ａ）第９番目のアルギニン残基のリジン残基への変異、および
   （ｂ）第１２９番目のグルタミン酸残基のグリシン残基への変異
   からなる群から選択される少なくとも一つの変異を有するアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
2. 変異を有さない、前記１８０アミノ酸からなる百日咳毒素Ｓ１サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号２における第２〜１８１番で表されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において、前記（ａ）および／または（ｂ）の変異以外の部位において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したものである、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 変異を有さない、前記１８０アミノ酸からなる百日咳毒素Ｓ１サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号２における第２〜１８１番で表されるアミノ酸配列の部分配列であって前記（ａ）および／または（ｂ）の変異の部位を含む部分配列、を含んでなるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
4. 前記（ａ）の変異を有するものである、請求項１に記載のポリペプチド。
5. 前記（ｂ）の変異を有するものである、請求項１に記載のポリペプチド。
6. 前記（ａ）および前記（ｂ）の変異を有するものである、請求項１に記載のポリペプチド。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ＤＮＡ。
8. 配列番号１における第１０〜５４９番で表されるヌクレオチド配列において、第３４〜３６番残基がＡＡＧへ置換されたヌクレオチド配列を有するものである、請求項７に記載のＤＮＡ。
9. 配列番号１における第１０〜５４９番で表されるヌクレオチド配列において、第３９５〜３９６番残基がＧＣへ置換されたヌクレオチド配列を有するものである、請求項７に記載のＤＮＡ。
10. 配列番号１における第１０〜５４９番で表されるヌクレオチド配列において、第３４〜３６番残基がＡＡＧへ置換され、かつ第３９５〜３９６番残基がＧＣへ置換されたヌクレオチド配列を有するものである、請求項７に記載のＤＮＡ。
11. １８０アミノ酸からなる百日咳毒素Ｓ１サブユニットのアミノ酸配列において、
    （ａ）第９番目のアルギニン残基のリジン残基への変異、および
    （ｂ）第１２９番目のグルタミン酸残基のグリシン残基への変異
    からなる群から選択される少なくとも一つの変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを発現しうる形で含んでなる、ＤＮＡ構築物。
12. 変異を有さない、前記１８０アミノ酸からなる百日咳毒素Ｓ１サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号２における第２〜１８１番で表されるアミノ酸配列である、請求項１１に記載のＤＮＡ構築物。
13. 変異を有さない、前記１８０アミノ酸からなる百日咳毒素Ｓ１サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号２における第２〜１８１番で表されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において、前記（ａ）および／または（ｂ）の変異以外の部位において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したものである、請求項１１に記載のＤＮＡ構築物。
14. 変異を有さない、前記１８０アミノ酸からなる百日咳毒素Ｓ１サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号２における第２〜１８１番で表されるアミノ酸配列の部分配列であって前記（ａ）および／または（ｂ）の変異の部位を含む部分配列、を含んでなるものである、請求項１１に記載のＤＮＡ構築物。
15. 前記ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列が、前記（ａ）の変異を有するものである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
16. 前記ＤＮＡが、配列番号１における第１０〜５４９番で表されるヌクレオチド配列において、第３４〜３６番残基がＡＡＧへ置換されたヌクレオチド配列を有するものである、請求項１５に記載のＤＮＡ構築物。
17. 前記ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列が、前記（ｂ）の変異を有するものである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
18. 前記ＤＮＡが、配列番号１における第１０〜５４９番で表されるヌクレオチド配列において、第３９５〜３９６番残基がＧＣへ置換されたヌクレオチド配列を有するものである、請求項１７に記載のＤＮＡ構築物。
19. 前記アミノ酸配列が、前記（ａ）および前記（ｂ）の変異を有するものである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
20. 前記ＤＮＡが、配列番号１における第１０〜５４９番で表されるヌクレオチド配列において、第３４〜３６番残基がＡＡＧへ置換され、かつ第３９５〜３９６番残基がＧＣへ置換されたヌクレオチド配列を有するものである、請求項１９に記載のＤＮＡ構築物。
21. 請求項１１〜２０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含んでなる、ベクター。
22. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含んでなる、医薬組成物。
23. 請求項１１〜２０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または請求項２１に記載のベクターを含んでなる、医薬組成物。
24. 百日咳感染症の予防または治療に用いられるものである、請求項２２または２３に記載の医薬組成物。
25. 百日咳感染症の予防剤または治療剤の製造における、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
26. 百日咳感染症の予防剤または治療剤の製造における、請求項１１〜２０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または請求項２１に記載のベクターの使用。
27. 予防または治療上有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドを被検者に投与することを含んでなる、百日咳感染症の予防または治療する方法。
28. 予防または治療上有効量の請求項１１〜２０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物または請求項２１に記載のベクターを被検者に投与することを含んでなる、百日咳感染症の予防または治療する方法。