JP2002114708A - Ｄｎａワチンに対するアジュバント剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＤＮＡワクチンのアジュバント剤を提供する
ことを目的とする。 【解決手段】 抗酸菌由来のα抗原をコードする遺伝子
を、ＤＮＡワクチンと共に投与した場合には、ＤＮＡワ
クチンの細胞性免疫誘導効果、特に細胞障害性Ｔ細胞の
誘導効果が強力に増強される。α抗原をコードする遺伝
子中に、免疫原性ペプチドをコードする遺伝子が挿入さ
れた遺伝子からなるキメラＤＮＡワクチンの細胞性免疫
誘導効果、特に細胞障害性Ｔ細胞の誘導効果は強力に増
強される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗酸菌由来のα抗原遺
伝子を有効成分とする、ＤＮＡワチンに対するアジュバ
ント剤に関する。更に詳細には、ＤＮＡワクチンである
免疫原性ペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクタ
ーからなるＤＮＡワクチンと共に投与するためのアジュ
バント剤であって、抗酸菌由来のα抗原をコードする遺
伝子を含む発現ベクターを有効成分とするアジュバント
剤、並びに抗酸菌由来のα抗原をコードする遺伝子中
に、ＤＮＡワクチンとして用いる免疫原性ペプチドをコ
ードする遺伝子が挿入されている、ＤＮＡワクチンと一
体化したキメラＤＮＡワクチンの形態にあるアジュバン
ト剤に関する。本発明のアジュバント剤は、ＤＮＡワク
チンによる細胞性免疫応答、特に抗原に対する細胞障害
性Ｔ細胞の惹起・誘導を効率的に高めることができ、ま
たＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞へのシフトを強
力に促進することができる。

【０００２】

【従来の技術】抗原蛋白遺伝子を組み込んだプラスミド
ＤＮＡを筋肉や皮膚に注射することにより細胞中にプラ
スミドＤＮＡが取り込まれて抗原蛋白が発現し、発現蛋
白に対して免疫を誘導する、いわゆるＤＮＡワクチンの
研究が最近注目されている。ＤＮＡワクチンは細胞性免
疫及び液性免疫の両方を誘導できること、また大量生産
が容易であり、安全性も高いことから近年臨床への適用
が期待されている。しかしながら、ＤＮＡワクチンは、
すべての抗原に対して充分な免疫反応を誘導できるわけ
ではない。例えばエイズウイルスのｅｎｖ／ｒｅｖ遺伝
子をレトロルウイルスベクターに挿入し得られる組換え
ベクターを能動免疫するＤＮＡワクチン療法が提案され
ている（Chadas, et al., J. Virol., 67: 3409-3417,
1993）が、このようなワクチン療法の場合には、更に種
々のサイトカイン遺伝子、あるいは組換え蛋白などを併
用することが必要とされている。

【０００３】他方、ＢＣＧワクチンは、牛型結核菌の弱
毒株を用いたワクチンであり、ヒトに対するワクチンと
して唯一認められている生菌ワクチンである。ＢＣＧワ
クチンは、アジュバント活性が強く副作用が非常に少な
いため、安全なワクチンとして、今日世界中で多くの人
々に使用されている。現在では、ＢＣＧワクチンは、Ｃ
Ｄ４⁺ヘルパ-Ｔ細胞を、インターフェロン-γやインタ
ーロイキン-２を産生し細胞性免疫に関与するＴｈ１細
胞にシフトさせる効果があることが報告されている（Mc
Maveny, K.M. et al., Camcer Immunol. Immunother. 3
9: 401-406, 1994; Thanhauser, A. et al., ibid., 4
0: 103-108, 1995）。更に現在では、結核菌の培養上精
よりツベルクリン反応性蛋白質として、α抗原が分離・
精製され、その分子中に抗原決定基が存在することが明
らかにされ（Am. Rev. Respir.Dis., 130, 647(1984),
ibid., 132, 173(1985)、このα抗原が上記したＴｈ１
細胞にシフトさせる効果を引き起こすものであることが
報告されている（Wiker, H.G.et al., Microbiological
Reviews, 56: 648-661, 1992; Aung, H. et al., J.Cl
in. Invest., 98:1261-1268, 1996)。また、ＢＣＧ菌を
組換えＤＮＡ技術を利用して改良し、これを種々の病原
体に対するワクチンに利用する試みも行われている。例
えば、α抗原をコードする遺伝子中にエイズウイルス表
面抗原をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを
構築し、このベクターでＢＣＧ菌を形質転換し、この形
質転換体をＢＣＧワクチンとして用いることが報告され
ている（ＷＯ９６／４００９号公報)。しかしながら、
今日まで、α抗原をコードする遺伝子そのものをワクチ
ンあるいはアジュバントに利用する試みはなされていな
い。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ＢＣＧ菌などの抗酸菌由来のα抗原をコードする遺
伝子を用いた、ＤＮＡワクチンに対するアジュバント剤
を提供することにある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、抗酸菌由
来のα抗原遺伝子を、例えばエイズウイルス、Ｃ型肝炎
ウイルスなどに対するＤＮＡワクチンと併用した場合の
有効性について鋭意研究した結果、エイズウイルスの免
疫原性ペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクター
からなるＤＮＡワクチンと共に、α抗原をコードする遺
伝子を含む発現ベクターを投与して免疫した場合、及び
α抗原をコードする遺伝子中に、Ｃ型肝炎ウイルスの免
疫原性ペプチドをコードする遺伝子が挿入された発現ベ
クターを投与して免疫した場合に、エイズウイルスある
いはＣ型肝炎ウイルスの抗原性ペプチドをコードする遺
伝子のＤＮＡワクチンとしての細胞性免疫誘導効果、特
に細胞障害性Ｔ細胞の誘導効果を強力に増強することが
でき、従ってこれらの発現ベクターがＤＮＡワクチンの
アジュバントとして極めて有効であることを見出し、本
発明を完成させた。

【０００６】従って、本発明は、抗酸菌由来のα抗原遺
伝子を有効成分とするＤＮＡワクチンに対するアジュバ
ント剤に関する。好ましい態様としては、本発明は、抗
酸菌由来のα抗原をコードする遺伝子を含む発現ベクタ
ーを有効成分とする、ＤＮＡワクチンに対するアジュバ
ント剤であって、免疫原性ペプチドをコードする遺伝子
を含む発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチンと
共に投与するためのアジュバント剤に関する。好ましい
他の態様としては、本発明は、抗酸菌由来のα抗原をコ
ードする遺伝子中に、ＤＮＡワクチンとして用いる免疫
原性ペプチドをコードする遺伝子が挿入されている、Ｄ
ＮＡワクチンと一体化したキメラＤＮＡワクチンの形態
にあるアジュバント剤に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明のアジュバント剤の有効成
分として用いる抗酸菌由来のα抗原遺伝子とは、α抗原
蛋白を発現可能な遺伝子を指す。具体的には、α抗原を
コードする遺伝子を含む発現ベクターの形態にある遺伝
子が挙げられる。α抗原をコードする遺伝子としては、
マイコバクテリウム・カンサシ（Infect. Immun., 58,
550, 1990）、マイコバクテリウム・アビウム（Infect.
Immun., 61, 1173, 1993）、マイコバクテリウム・イ
ントラセルラーレ（Biochem. Biophys. Res. Commun.,1
96, 1466, 1993）、マイコバクテリウム・レプラエ（Mo
l. Microbiol. 6, 153,1992）などの抗酸菌由来のα抗
原をコードする遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子の
いずれも本発明に用いることができ、例えばマイコバク
テリウム・カンサシ由来のα抗原をコードする遺伝子と
して、配列番号１に示す３９０番目〜１２４４番目まで
の塩基配列を有するＤＮＡがある。このＤＮＡ以外に
も、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするＤＮＡや、このＤＮＡによりコードされる蛋
白質のアミノ酸配列に対して１若しくは複数（好ましく
は数個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加された
アミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡであっ
て、α抗原と同様の機能を有する蛋白質をコードする変
異体であってもよい。マイコバクテリウム・カンサシ以
外の抗酸菌由来のα抗原をコードする遺伝子の場合に
も、同様にそれらの変異体であってもよい。

【０００８】これらのＤＮＡは、前記文献に記載されて
いる配列情報、Genbank等の配列情報等に基づき適当な
ＤＮＡ部分をＰＣＲのプライマーとして用い、抗酸菌由
来のｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことなど
により、クローニングすることができる。また、アミノ
酸配列情報に基づき化学的に合成することも可能であ
る。また上記したＤＮＡの変異体は、例えば部位特異的
突然変異誘発法、ＰＣＲ法、又は通常のハイブリダイゼ
ーション法などにより容易に得ることができる。

【０００９】本発明のアジュバント剤は、抗酸菌由来の
α抗原遺伝子を有効成分とするものであり、具体的に
は、抗酸菌由来のα抗原をコードする遺伝子を含む発現
ベクターを有効成分とするものが挙げられる。そして、
本発明のアジュバント剤は、α抗原をコードする遺伝子
を含む発現ベクターを有効成分とするアジュバント剤で
あって、ＤＮＡワクチンと共に投与するためのアジュバ
ント剤と、α抗原をコードする遺伝子中に、ＤＮＡワク
チンとして用いる抗原性ペプチドをコードする遺伝子が
挿入されている、ＤＮＡワクチンと一体化したキメラＤ
ＮＡワクチンの形態にあるアジュバント剤とに大別でき
る。以下に、これらのアジュバント剤について説明す
る。

【００１０】ＤＮＡワクチンと共に投与するためのアジ
ュバント剤について ＤＮＡワクチンと共に投与するためのアジュバント剤の
有効成分である、α抗原をコードする遺伝子を含む発現
ベクターとしては、非ウイルスベクターを用いた場合
と、ウイルスベクターを用いた場合の二つに大別され
る。非ウイルスベクターとしては、生体内でα抗原をコ
ードする遺伝子を発現させ分泌させることのできるベク
ターであれば如何なる発現ベクターであっても良いが、
例えばｐＣＡＧＧＳ（Gene 108,193-200(1991)）や、ｐ
ＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（イン
ビトロゲン社、ストラタジーン社）などの発現ベクター
が挙げられる。ウイルスベクターとしては、組換えアデ
ノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターが代
表的なものである。より具体的には、例えば、無毒化し
たレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイル
ス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックス
ウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダ
イウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）
等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスが挙げられ
る。これらのベクターに、α抗原をコードする遺伝子を
発現可能なように導入にすることにより、発現ベクター
が構築できる。

【００１１】これらの発現ベクターは、生体内への導入
法にもよるが、通常、注射剤の形態としてヒトに投与さ
れる。なお、ウイルスベクターの場合にはそのままの形
態で投与することもできる。注射剤は常法により調製す
ることができ、例えば適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、
生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフ
ィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填す
ることにより調製することができる。注射剤には必要に
応じて慣用の担体等を加えても良い。また、後述するよ
うにリポソーム製剤の形態とすることもできる。

【００１２】かくして得られるアジュバント剤は、ＤＮ
Ａワクチンと共にヒトに投与されて、ＤＮＡワクチンの
免疫誘導効果、特に細胞性免疫誘導効果を増強すること
ができる。ＤＮＡワクチンとしては、例えば、エイズウ
イルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルスな
どのウイルスのエンべロープ蛋白、核蛋白等から得られ
る免疫原性ペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベク
ターからなる、通常よく知られたＤＮＡワクチン（Chad
as, et al,. J. Virol., 67: 3409-3417, 1993; Ulrik
e, H. M. et al., AIDS, 9: 43-50, 1995; Ulmer J. B.
et al., Science 259: 1745- 1749, 1993）などが挙げ
られる。また、ＭＡＧＥファミリー、ＭＡＲＴ−１、チ
ロシナーゼ、ｇｐ１００などの腫瘍特異抗原をコードす
る遺伝子を発現ベクターに組み込んで得られる、腫瘍免
疫療法用ＤＮＡワクチンでもよい（Parker, J.H. et a
l., Mol. Cells 1999. 9: 384-391; Durrant L. G. et
al., Anticancer Drugs. 1997. 727-733; Stevenson,
F. K. et al., Hematologica1999. 84: 11-13; Lee, S.
W. et al., J. Immunother. 23: 379-386; Stevenson,
F. K. et al., Immunol. Today 21: 170-171; Brinker
hoff, L. H. et al.,Curr. Opin. Oncol, 2000. 12: 16
3-173; Stevenson, F. K. et al., Ann. Oncol. 10: 14
13-1418）。

【００１３】本発明のアジュバント剤は、ＤＮＡワクチ
ンと共に投与される。実際に投与する際には、アジュバ
ント剤とＤＮＡワクチンとを混合した後に投与してもよ
く、あるいは両者を別々に同一部位に投与してもよい。
投与方法、即ち、細胞への遺伝子導入法としては、アジ
ュバント剤あるいはＤＮＡワクチンが非ウイルスベクタ
ーの場合には、リポフェクション法、リン酸−カルシウ
ム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレ
ーション法、微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法
などが挙げられる。また、組織への遺伝子導入法として
は、内包型リポソーム（internal type liposome）によ
る遺伝子導入法、静電気型リポソーム（electrostatic
type liposome）による遺伝子導入法、ＨＶＪ−リポソ
ーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（HVJ-AVEリポソ
ーム法）、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティク
ル銃で担体（金属粒子）とともにＤＮＡ分子を細胞に移
入する方法、ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーション法
などが挙げられる。また、非ウイルスベクターである発
現プラスミドを生理食塩水に溶解してそのまま投与す
る、いわゆるｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷
ポリマーによる導入法等の方法を採用することもでき
る。

【００１４】アジュバント剤あるいはＤＮＡワクチンが
ウイルスベクターである場合には、そのまま投与するこ
ともでき、また、前記した注射剤の形態にして投与する
こともできる。本発明のアジュバント剤及びＤＮＡワク
チンは、通常ヒトの皮膚、筋肉等に投与される。投与量
としては、アジュバント剤及びＤＮＡワクチンの種類、
投与形態、投与方法、対象患者、疾患の種類などにより
変動しうるが、通常、それぞれ発現ベクターとして、
０．１〜２ｍｇ、好ましくは０．５〜１ｍｇであり、こ
れをそれぞれ数日ないし数ヶ月に亘って１日１回、合計
２〜３回投与するのが好ましい。また、対象とする患者
は、ＢＣＧ接種により、あらかじめα抗原に対する感受
性を有している患者が、本発明のアジュバント剤として
の効果がより有効に発揮されるので好ましい。

【００１５】ＤＮＡワクチンと一体化したキメラＤＮＡ
ワクチンの形態にあるアジュバント剤について ＤＮＡワクチンと一体化したキメラＤＮＡワクチンの形
態にある本発明のアジュバント剤は、α抗原をコードす
る遺伝子中に、ＤＮＡワクチンとして用いる免疫原性ペ
プチドをコードする遺伝子が挿入されており、α抗原蛋
白と免疫原性ペプチドを融合蛋白として発現分泌する発
現ベクターを有効成分とする。α抗原をコードする遺伝
子中に挿入する免疫原性ペプチドとしては、前記したエ
イズウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイ
ルスなどのウイルスのエンべロープ蛋白、核蛋白等から
得られる免疫原性ペプチド、あるいは、ＭＡＧＥファミ
リー、ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ｇｐ１００などの
腫瘍特異抗原などが挙げられる。より具体的には、例え
ば、エイズウイルスのエンベロープ蛋白のｇｐ１２０や
ｇｐ１６０中のペプチド部分であって細胞障害性Ｔ細胞
エピトープペプチド、Ｃ型肝炎ウイルスの非構造蛋白領
域内のペプチド部分であって細胞障害性Ｔ細胞エピトー
プペプチド、例えば、配列番号２及び３に示したアミノ
酸配列からなるペプチドなどが挙げれる。これら以外に
も、各種ウイルスのエンベロープ蛋白、核蛋白由来の細
胞障害性Ｔ細胞エピトープも、免疫原性ペプチドとして
好ましいものである。

【００１６】免疫原性ペプチドをコードする遺伝子をα
抗原をコードする遺伝子中に挿入する際の挿入部位は、
α抗原の親水性領域内が好ましい。具体的には、α抗原
の１８４番目のＳｅｒ残基と１８５番目のＡｓｐ残基に
対応する遺伝子のＸｈｏＩ部位が挙げられる。免疫原性
ペプチドをコードする遺伝子が挿入された発現ベクター
としては、前記したと同様の非ウイルスベクター及びウ
イルスベクターから構築される発現ベクターが挙げられ
る。また、これらの発現ベクターの投与形態、投与方法
も前記したと同様の例が挙げられる。投与量としては、
通常、発現ベクターとして、０．１〜２ｍｇ、好ましく
は０．５〜１ｍｇであり、これを数日ないし数ヶ月に亘
って１日１回、合計２〜３回投与するのが好ましい。ま
た、対象とする患者は、ＢＣＧ接種により、あらかじめ
α抗原に対する感受性を有している患者が、本発明のア
ジュバント剤としての効果がより有効に発揮されるので
好ましい。

【００１７】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定される
ものではない。 実施例１ＤＮＡワクチンと共に投与するためのアジュバント剤 （１）発現ベクターの構築 配列番号１に示した３９０番目〜１２４４番目の塩基配
列からなるマイコバクテリウム・カンサシのα抗原遺伝
子（α−K）を、ｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen CA）の
ＫｐｎＩ−ＡｐａＩ部位に挿入して、ＭＣＶプロモータ
ー及びＴＰＡシグナルペプチドの下流に組み込んだ、図
１に示した構成を有する発現ベクターｐｃＤＮＡ−α−
Ｋを、本発明のアジュバント剤として構築した（Matsu
o, K. etal., Infect. Immun. 58: 550-556, 1996）。
また、ｐＮＬ４３２のＨＩＶ-1 IIIBのエンベロープタ
ンパクｇｐ１２０遺伝子（Starich, B.R. et al., Cell
1986. 45: 637-648）のシグナル配列の３’末端及びｇ
ｐ１２０とｇｐ４１の開列部位にそれぞれＮｈｅＩ部位
とＢａｍＨＩｂ部位をＰＣＲを使って導入した後、ｐＪ
Ｗ−４３０３（Edomons, P.F. et al.,Nucleic Acids R
es. 20: 4933. 1992）のＴＰＡリーダー配列下流に挿入
して、ＭＣＶプロモーター及びＴＰＡリーダーの下流に
ｇｐ１２０を組み込んだ、図１に示した構成を有する発
現べクターｐＪＷ−ＨＩＶｅｎｖをＤＮＡワクチンとし
て構築した。

【００１８】（２）マウスに対する免疫 ｉ）方法 マウスにはＢＣＧに耐性（ｂｇｃｒ）な系統と感受性
（ｂｃｇｓ）な系統があり、耐性のものはＢＣＧ感作
後、ＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞はＴｈ１細胞に、感受性の
ものはＴｈ２細胞に移行する傾向があることが知られて
いる。そこで、ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ エンベロープ蛋
白の細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープが明らかに
なっているＢＡＬＢ／ｃとＢＣＧに耐性なＣ３Ｈ／Ｈｅ
ＮのＦ１であるＣＣ３Ｈ(Schurr, E. et al., J. Immun
ol. 142: 4507-4513)を用い、図２に示したように、こ
のマウスをＢＣＧ感作群、未感作群に分け、上記（１）
で構築したアジュバント剤とＤＮＡワクチンの両方をそ
れぞれ１００μｇずつ、あるいはＤＮＡワクチン単独を
１００μｇ、筋肉内にエレクトロポレーション法により
三週間隔で三回免疫を行った。免疫により、ＨＩＶに対
するＣＴＬが誘導されているかを確かめるため、最終免
疫より３週後の脾細胞を取り出し、配列番号２に示した
アミノ酸配列からなるＨＩＶ ＣＴＬエピトープペプチ
ド(Takahashi, H. et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA
85: 3105-3109)をラベルした同種マウスの脾細胞と混
合し、5日間培養した後⁵¹Ｃｒ ｒｅｌｅａｓｅａｓｓ
ａｙ（Pro. Natl. Acad. Sci. USA 85,3105, 1988）に
よりＨＩＶ ＣＴＬエピトープに特異的な細胞障害性反
応を測定した。

【００１９】ｉｉ）結果 得られた結果を図３に示した。図３の結果から判るよう
に、ＢＣＧ非感作群やＤＮＡワクチン単独（ＨＩＶｅｎ
ｖ）で免疫したものに比べ、ＢＣＧ感作群、さらにＤＮ
Ａワクチンとアジュバント剤免疫群（ＨＩＶｅｎｖ＋α
−Ｋ）において、ＨＩＶに対する強い細胞障害活性がみ
られた。 （３）Ｔｈ１細胞へのシフトの検証 ｉ）方法 また、ＢＣＧ、アジュバント剤によりＣＤ４⁺ヘルパーT
細胞がＴｈ１細胞にシフトしていることを証明するため
に、次の実験を行った。免疫後のマウスの脾細胞を、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏにおいてＨＩＶ ＣＴＬエピトープペプ
チドで再刺激を行い、3日後の培養上清中に産生され
る、Ｔｈ１細胞の指標でもあるＩＦＮ−γの濃度をＥＬ
ＩＳＡにて測定した。 ｉｉ）結果 得られた結果を図４に示した。この結果よりＢＣＧ感作
によりＩＦＮ-γの産生が増加していること、さらにそ
れはＤＮＡワクチン（ＨＩＶ）とアジュバント剤（α−
Ｋ）とを免疫することによりさらに増強していることが
わかった。

【００２０】（４）ｉｎ ｖｉｖｏでの検証 ｉ）方法 さら目に、これらの反応をｉｎ ｖｉｖｏで検証するた
め、免疫後のマウスのｆｏｏｔｐａｄにＨＩＶエンベロ
ープ蛋白ｇｐ１２０もしくはＨＩＶ ＣＴＬエピトープ
ペプチドを接種し、２４時間後のＤＴＨ反応を測定し
た。 ｉｉ）結果 得られた結果を図５に示した。この結果から判るよう
に、エンベロープ蛋白、ＣＴＬエピトープペプチドのい
ずれに対しても、ＢＣＧ感作、さらにＤＮＡワクチン
（ＨＩＶ）とアジュバント剤（α−Ｋ）との免疫によ
り、その反応が増強されていることがわかった。これら
の結果より、図３でみられた細胞障害性反応の増強は、
α抗原によりＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞がＴｈ１細胞に強
くシフトした結果であることが考えられ、さらにその作
用はあらかじめＢＣＧを感作された個体において非常に
顕著であることがわかった。

【００２１】（５）ワクシニアウイルスに対する排除能 ｉ）方法 またこれらＤＮＡワクチン及びアジュバント剤接種によ
り誘導された免疫反応がウイルスの排除にも効果的であ
るかを確かめるために次の実験をおこなった。まずワク
シニアウイルスは卵巣で非常に高率に増殖し、分離され
るということが明らかになっている。そこでＨＩＶ−１
IIIＢエンベロープ蛋白ｇｐ１２０を発現するリコン
ビナントワクシニアウイルス(Takahashi, H. et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3105-3109)を、免疫後
のマウスの腹腔内に接種し、5日後のそれぞれの卵巣に
おけるウイルスの量を測定した。 ｉｉ）結果 得られた結果を図６に示した。その結果から、非免疫群
に比べＤＮＡワクチン（ＨＩＶ）を免疫したものでは、
卵巣より分離されるウイルス量が少なく、これらの免疫
反応はウイルスの排除にも有効であることがわかった。
さらにその効果はＢＣＧ感作群、さらにＤＮＡワクチン
とアジュバント剤免疫群（ＨＩＶ＋α−Ｋ）において顕
著であることがわかった。

【００２２】（６）まとめ 以上の結果より、世界中の多くの人々がＢＣＧの感作を
受けていることを考慮すると、本発明のアジュバント剤
とその他のＤＮＡワクチンと併用することは、そのＤＮ
Ａワクチンによる細胞性免疫誘導効果の増強に非常に有
効であることが示された。

【００２３】実施例２ＤＮＡワクチンと一体化したキメラＤＮＡワクチンの形
態にあるアジュバント剤 （１）キメラＤＮＡワクチンの構築 α抗原をコードする遺伝子にＣＴＬエピトープペプチド
をコードするＤＮＡを挿入した、ＤＮＡワクチンと一体
化したキメラＤＮＡワクチンの形態にあるアジュバント
剤を以下のようにして構築した。α抗原をコードするＤ
ＮＡのＸｈｏＩ部位にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の非
構造蛋白(ＮＳ５)領域内のＣＴＬエピトープペプチドで
ある配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチドを
挿入し、図７に示したキメラＤＮＡワクチンを構築し
た。コントロールとしてＮＳＳ ＣＴＬエピトープペプ
チドを含む配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプ
チドを用いて図７に示すコントロールＤＮＡワクチンを
構築した。

【００２４】（２）マウスへの免疫 ｉ）方法 ＣＣ３ＨＦ１マウスを用いＢＣＧ感作群、非感作群を作
製しキメラＤＮＡワクチンおよびコントロールＤＮＡワ
クチンをエレクトロポレーション法にて図８に示したプ
ロトコールで免疫した。ＤＮＡワクチンの免疫により、
ＨＩＶに対する細胞障害性Ｔ細胞が誘導されているかを
確かめるため、最終免疫より３週後の脾細胞を取り出
し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるＨＣＶ Ｃ
ＴＬエピトープペプチドをラベルした同種マウスの脾細
胞と混合し、5日間培養した後⁵¹Ｃｒ ｒｅｌａｅｓｅ
ａｓｓａｙによりＨＣＶ ＣＴＬエピトープペプチド
(Shirai, M. et al., J. Virol. 1992. 66: 4908-4104)
に特異的な細胞障害性反応を測定した。 ｉｉ）結果 得られた結果を図９に示した。この結果から判るよう
に、ＢＣＧ非感作群やコントロールＤＮＡワクチン単独
（ＢＣＧ（−）−ＮＳ）で免疫したものに比べ、ＢＣＧ
感作キメラＤＮＡワクチン（ＢＣＧ（＋）−ＮＳα）免
疫群において、ＨＩＶに対する強い細胞障害活性がみら
れた。

【００２５】

【発明の効果】以上の実施例から明らかなように、本発
明のα抗原をコードする遺伝子からなるアジュバント剤
は、ＤＮＡワクチンの細胞性免疫誘導効果、特に細胞障
害性Ｔ細胞の誘導効果を強力に増強することができ、ま
た、ＣＤ４⁺ヘルパーT細胞をＴｈ−１細胞に強力にシフ
トさせることができる。また、α抗原をコードする遺伝
子中に、免疫原性ペプチドをコードする遺伝子が挿入さ
れた遺伝子からなる、ＤＮＡワクチンと一体化されたキ
メラＤＮＡワクチンの形態にある本発明のアジュバント
剤も、本来のＤＮＡワクチンの細胞性免疫誘導効果、特
に細胞障害性Ｔ細胞の誘導効果を強力に増強することが
できる。従って、本発明のアジュバント剤によって、様
々なウイルス、細菌、寄生虫などの感染を防御するため
に必要なＤＮＡワクチンの免疫誘導能を強力に増強する
ことができる。また、腫瘍免疫療法に用いるＤＮＡワク
チンの免疫誘導能も増強することができる。

【００２６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Primmune Cooperation Inc. <120> Ajuvant for DNA Vaccine <130> DA-02999 <160> 4 <210> 1 <211> 1396 <212> DNA <213> Mycobacterium kansassi <400> gttaactatt ctttgtaccg ctccccgcct gccgccttct gccctgctcc gggtgcatag 60 cacccgtttg cgctccggat tatccgggcc gcaacggggc aacgggggaa gcggtggagt 120 ccgtcgccga ctcgcatagc accgttgctg tgttggcggg ggtaaccgat atcgaaatgg 180 aatgacttcg cgtcccgatc gacatttgcc ctactcacac ggtaagttct gccgggagca 240 cgcgagcaca tacggacaag gggcagggta tgacagacgt gagcgggaag attcgggcgt 300 ggggccgacg ccttctggtc ggcgcggccg ctgctgcggc ccttcctggc ctggtcggac 360 tcgccggcgg agcggcgacc gcgggagcgt tctcccgtcc cggcctgccg gtggagtacc 420 tccaggtgcc gtcggctgcg atgggtcgca gtatcaaggt tcaattccaa agtggcgggg 480 acaactcgcc ggcggtgtac ctgctcgacg gtctccgcgc tcaagacgac tacaacggct 540 gggacatcaa caccccggcc ttcgagtggt actaccaatc gggcctgtcg gtcatcatgc 600 cggtcggcgg acagtccagt ttctacagtg actggtacag cccggcctgc ggcaaggccg 660 gctgcacgac ctacaagtgg gagaccttcc tgaccagcga gctgccgcaa tggctgtccg 720 cgaaccggag tgtcaagccc accggaagcg ccgcggtcgg catctcgatg gccggctcgt 780 cggccctgat cctgtccgtc taccacccgc agcagttcat ctacgcgggt tcgttgtcgg 840 ccctgatgga cccctcccag gggatggggc cgtctctgat cggcttggcg atgggtgacg 900 ccggtggtta caaggcctcg gacatgtggg gaccctcgag tgacccagcc tggcagcgta 960 acgacccgtc gctgcacatt ccggagctgg tcgccaacaa cacccgcctg tggatctact 1020 gcggcaacgg caccccgtcc gagttgggcg gtgccaatgt tccggccgaa ttcctggaga 1080 acttcgttcg cagcagcaac ctgaaattcc aggacgccta caacgccgcg ggcggccaca 1140 acgccgtgtt caatttggac gccaacggaa cgcacagctg ggagtactgg ggcgcgcag 1200 tcaacgccat gaagggtgac ctgcaggcca gcctgggcgc ccgctgatcg cgcaacggtt 1260 gccgctactg ggcttgacgg caagacgccg tcaagccagt agtgtgttcg gcaccttga 1320 cgctggtccg ccatgttcaa cgagccggtc tacctgcccg caccgaacaa gctggtgaca 1380 tcgacccatg cggtgc 1396 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HIV CTL epitope peptide <400> Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HCV NS5 CTL epitope peptide <400> Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Leu Tyr Thr Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HCV NS5 CTL epitope peptide <400> Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Leu Tyr Thr Pro Cys Ala Ala Glu 1 5 10 15 Glu

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１で構築した、本発明のアジュ
バント剤として用いる発現ベクター、及びＤＮＡワクチ
ンとして用いる発現ベクターの構成を示す。

【図２】図２は、ＤＮＡワクチン単独で、あるいは本発
明のアジュバント剤と共に、マウスを免疫した実施例１
のプロトコールを示す。

【図３】実施例１で実施した、本発明のアジュバント剤
と共に、あるいはＤＮＡワクチン単独で免疫した場合の
ＨＩＶに対する細胞障害活性の測定結果を示す。

【図４】図４は、実施例１で実施した、本発明のアジュ
バント剤と共に、あるいはＤＮＡワクチン単独で免疫し
た場合のＩＦＮ−γ産生誘導能の測定結果を示す。

【図５】図５は、実施例１で実施した、本発明のアジュ
バント剤と共に、あるいはＤＮＡワクチン単独で免疫し
た場合のＤＴＨ反応の測定結果を示す。

【図６】図６は、実施例１で実施した、本発明のアジュ
バント剤と共に、あるいはＤＮＡワクチン単独で免疫し
た場合のワクシニアウイルスに対する排除能の測定結果
を示す。

【図７】図７は、実施例２で構築した、ＤＮＡワクチン
と一体化したキメラＤＮＡワクチンの形態にある本発明
のアジュバント剤として用いられる発現ベクター、及び
コントロールベクターの構成を示す。

【図８】図８は、キメラＤＮＡワクチン、あるいはコン
トロールＤＮＡワクチンでマウスを免疫した実施例２の
プロトコールを示す。

【図９】図９は、実施例２で実施した、キメラＤＮＡワ
クチン、あるいはコントロールＤＮＡワクチンでマウス
を免疫した場合の細胞障害活性の測定結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/195 Ｃ０７Ｋ 14/195 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 BA80 CA02 CA07 DA02 EA04 FA02 FA18 HA01 4C076 CC06 CC31 EE30 4C084 AA13 MA66 ZB351 ZB352 4C085 AA02 AA38 BA09 BA69 BA92 CC08 EE06 FF18 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA41 CA02 CA03 CA11 DA86 EA31 EA53 FA71

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗酸菌由来のα抗原遺伝子を有効成分と
   するＤＮＡワクチンに対するアジュバント剤。
2. 【請求項２】 抗酸菌由来のα抗原をコードする遺伝子
   を含む発現ベクターを有効成分とする請求項１のアジュ
   バント剤。
3. 【請求項３】 ＤＮＡワクチンが、免疫原性ペプチドを
   コードする遺伝子を含む発現ベクターを有効成分とする
   請求項１又は２のアジュバント剤。
4. 【請求項４】 ＤＮＡワクチンと共に投与するための請
   求項１から３のいずれかのアジュバント剤。
5. 【請求項５】 抗酸菌由来のα抗原をコードする遺伝子
   中に、ＤＮＡワクチンとして用いる抗原性ペプチドをコ
   ードする遺伝子が挿入されている、ＤＮＡワクチンと一
   体化したキメラＤＮＡワクチンの形態にある請求項１又
   は２のアジュバント剤。
6. 【請求項６】 抗酸菌由来のα抗原をコードする遺伝子
   が、マイコバクテリウム・カンサシ由来の遺伝子又はそ
   れと同様の機能を有するその変異体である請求項１から
   ５のいずれかのアジュバント剤。
7. 【請求項７】 ＤＮＡワクチンとして、エイズウイルス
   又はＣ型肝炎ウイルス由来の免疫原性ペプチドをコード
   する遺伝子を用いる請求項１から６のいずれかのアジュ
   バント剤。