ES2326146T3 - Peptidos de union a hla y sus usos. - Google Patents
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Abstract
Péptido inmunogénico aislado constituido por la secuencia de p53 SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 4).
Description
Péptidos de unión a HLA y sus usos.
La presente invención se refiere a composiciones
y procedimientos para prevenir, tratar o diagnosticar una serie de
estados patológicos tales como enfermedades víricas y cánceres. En
particular, proporciona péptidos novedosos capaces de unirse a
moléculas de complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) y de
inducir una respuesta inmunitaria.
Las moléculas de MHC se clasifican como
moléculas de clase I o clase II. Las moléculas de MHC de clase II
se expresan principalmente en células implicadas en la iniciación y
el sostenimiento de respuestas inmunitarias, tales como linfocitos
T, linfocitos B, macrófagos, etc. Las moléculas de MHC de clase II
se reconocen por los linfocitos T cooperadores e inducen la
proliferación de linfocitos T cooperadores y la amplificación de la
respuesta inmunitaria al péptido inmunogénico particular que se
exhibe. Las moléculas de MHC de clase I se expresan en casi todas
las células nucleadas y se reconocen por linfocitos T citotóxicos
(CTL), que destruyen entonces las células portadoras de antígeno.
Los CTL son particularmente importantes en el rechazo de tumores y
en el combate de infecciones víricas.
Los CTL reconocen el antígeno en forma de un
fragmento peptídico unido a moléculas de MHC de clase I en lugar
del mismo antígeno extraño intacto. El antígeno debe sintetizarse
normalmente de forma endógena por la célula y se degrada una
porción del antígeno proteico en fragmentos peptídicos pequeños en
el citoplasma. Algunos de estos péptidos pequeños se trasladan a un
compartimento pre-Golgi e interactúan con cadenas
pesadas de clase I para facilitar un plegamiento apropiado y la
asociación con la subunidad \beta2 de microglobulina. El complejo
peptídico MHC de clase I se orienta entonces a la superficie celular
para la expresión y el reconocimiento potenciales por CTL
específicos.
Las investigaciones de la estructura cristalina
de la molécula de MHC de clase I humana HLA-A2.1
indican que se crea un surco de unión peptídica mediante el
plegamiento de los dominios \alpha1 y \alpha2 de la cadena
pesada de clase I (Bjorkman y col., Nature 329: 506 (1987).
Sin embargo, en estas investigaciones no se determinó la identidad
de los péptidos unidos al surco.
Buus y col., Science 242: 1065 (1988)
describieron por primera vez un procedimiento para la elución ácida
de péptidos unidos a MHC. Posteriormente, Rammensee y sus
colaboradores (Falk y col., Nature 351: 290 (1991) han
desarrollado un enfoque para caracterizar a péptidos procesados
naturalmente unidos a moléculas de clase I. Otros investigadores
han conseguido exitosamente la secuenciación directa de aminoácidos
de los péptidos más abundantes en diversas fracciones de HPLC
mediante la secuenciación automatizada convencional de péptidos
eluidos a partir de moléculas de clase I de tipo B (Jardetzky, y
col., Nature 353: 326 (1991) y de tipo A2.1 mediante
espectrometría de masas (Hunt, y col., Science 225: 1261
(1992). Se ha presentado una revisión de la caracterización de
péptidos procesados naturalmente en MHC de clase I por Rötzschke y
Falk (Rötzschke y Falk, Immunol. Today 12: 447 (1991).
Sette y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86: 3296 (1989) mostraron que podían usarse motivos específicos de
alelo de MHC para predecir la capacidad de unión a MHC. Schaeffer y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4649 (1989) mostraron
que la unión a MHC estaba relacionada con la inmunogenicidad. Varios
autores (De Bruijn y col., Eur. J. Immunol., 21:
2963-2970 (1991); Pamer y col., Nature 353:
852-955 (1991)) han proporcionado pruebas
preliminares de que los motivos de unión de clase I pueden aplicarse
a la identificación de péptidos inmunogénicos potenciales en
modelos animales. Los motivos de clase I específicos de una serie de
alelos humanos de una clase dada de isotipo I están todavía por
describir. Es deseable que las frecuencias combinadas de estos
diferentes alelos sean suficientemente altas para cubrir una gran
fracción o quizás la mayoría de la población cruzada humana.
A pesar de los desarrollos de la técnica, la
técnica anterior tiene que proporcionar todavía una vacuna o agente
terapéutico basado en péptido humano útil basado en este trabajo. La
presente invención proporciona estas y otras ventajas.
La presente invención proporciona un péptido
inmunogénico aislado que consiste en la secuencia de p53 SMPPPGTRV
(SEQ ID NO: 4). Se describen también en la presente memoria péptidos
inmunogénicos que tienen motivos de unión específicos de alelo,
tales como motivos de unión a moléculas HLA-A2.1.
Los péptidos inmunogénicos que se unen al alelo de MHC apropiado
son preferiblemente de 9 a 10 residuos de longitud y comprenden
residuos conservados en ciertas posiciones tales como las
posiciones 2 y 9. Además, los péptidos no comprenden residuos de
unión negativa como se definen en la presente memoria en otras
posiciones tales como las posiciones 1, 3, 6 y/o 7 en el caso de
péptidos de 9 aminoácidos de longitud y en las posiciones 1, 3, 4,
5, 7, 8 y/o 9 en el caso de péptidos de 10 aminoácidos de longitud.
La presente invención define las posiciones en un motivo que
posibilitan la selección de péptidos que se unirán eficazmente a
HLA A2.1.
Los motivos de los péptidos descritos en la
presente memoria incluyen péptidos de 9 aminoácidos que tienen un
primer residuo conservado en la segunda posición desde el extremo N
seleccionado del grupo constituido por L, M, I, V, A, T y Q y un
segundo residuo conservado en la posición C-terminal
seleccionado del grupo constituido por V, L, I, A, M y T. En una
realización preferida, el péptido puede tener un primer residuo
conservado en la segunda posición desde el extremo N seleccionado
del grupo constituido por V, A, T o Q; y un segundo residuo
conservado en la posición C-terminal seleccionado
del grupo constituido por L, M, I, V, A y T. Si el péptido tiene 10
residuos, contendrá un primer residuo conservado en la segunda
posición desde el extremo N seleccionado del grupo constituido por
L, M, I, V, A, T y Q; y un segundo residuo conservado en la
posición C-terminal seleccionado del grupo
constituido por V, I, L, A, T y M; estando separados por 7 residuos
los primer y segundo residuos conservados.
La presente invención proporciona también
composiciones que comprenden el péptido inmunogénico constituido
por la secuencia de p53 SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 4). La composición
puede comprender adicionalmente un péptido inmunogénico adicional.
Los péptidos inmunogénicos son típicamente de entre aproximadamente
8 y aproximadamente 11 residuos y comprenden residuos conservados
implicados en la unión a proteínas codificadas por el alelo de MHC
apropiado. Se han identificado una serie de motivos específicos de
alelo.
Por ejemplo, el motivo de
HLA-A3.2 comprende desde el extremo N al extremo C
un primer residuo conservado de L, M, I, V, S, A, T, F, C, G o D en
posición 2 y un segundo residuo conservado de K, R, Y, H, F o A en
el extremo C-terminal. Los primer y segundo residuos
conservados están preferiblemente separados por 6 a 7 residuos.
El motivo de HLA-A1 comprende
desde el extremo N al extremo C un primer residuo conservado en
posición 2 respecto al extremo N de T, S o M, y un segundo residuo
conservado de Y en el extremo C. Como alternativa, el péptido puede
tener un residuo conservado de D, E, A, S o T en posición 3 respecto
al extremo N y un residuo conservado de Y en el extremo C.
El motivo de HLA-A11 comprende
desde el extremo N al extremo C un primer residuo conservado de T,
V, M, L, I, S, A, G, N, C D o F en posición 2 y un residuo
conservado C-terminal de K, R, Y o H. El primer y
segundo residuos conservados están preferiblemente separados por 6
ó 7 residuos.
El motivo de HLA-A24.1 comprende
desde el extremo N al extremo C un primer residuo conservado de Y,
F, W o M en posición 2 y un residuo conservado
C-terminal de F, I, W o L. El primer y segundo
residuos conservados están preferiblemente separados por 6 a 7
residuos.
Pueden identificarse los epítopos de una serie
de proteínas diana inmunogénicas usando los péptidos de la
invención. Los ejemplos de antígenos adecuados incluyen antígeno
específico de cáncer de próstata (PSA), antígenos de núcleo y
superficie de hepatitis B (HBVc, HBVs), antígenos de hepatitis C,
antígenos de virus de Epstein-Barr, antígenos de
virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1),
herpesvirus de sarcoma de Kaposi (KSHV), papilomavirus humano
(HPV), antígenos de virus Lassa, Mycobacterium tuberculosis
(MT), p53, CEA, antígeno de superficie de tripanosoma (TSA) y
Her2/neu. Por tanto, los péptidos son útiles en composiciones
farmacéuticas para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico tanto
in vivo como ex vivo.
No aplicable.
El término "péptido" se usa
intercambiablemente con "oligopéptido" en la presente memoria
descriptiva para designar una serie de residuos, típicamente
L-aminoácidos, conectados entre sí típicamente
mediante enlaces peptídicos entre los grupos
alfa-amino y carbonilo de aminoácidos adyacentes.
Los oligopéptidos de la invención son de menos de aproximadamente
15 residuos de longitud y consisten habitualmente en entre
aproximadamente 8 y aproximadamente 11 residuos, preferiblemente 9
ó 10 residuos.
Un "péptido inmunogénico" es un péptido que
comprende un motivo específico de alelo tal que el péptido se unirá
a una molécula de MHC e inducirá una respuesta de CTL. Los péptidos
inmunogénicos de la invención son capaces de unirse a una molécula
de HLA-A2.1 apropiada e inducir una respuesta de
linfocitos T citotóxicos contra el antígeno del que deriva el
péptido inmunogénico.
Los péptidos inmunogénicos se identifican
convenientemente usando los algoritmos descritos en la presente
memoria. Los algoritmos son procedimientos matemáticos que producen
una puntuación que posibilita la selección de péptidos
inmunogénicos. Típicamente, se usa la puntuación algorítmica con un
"umbral de unión" para posibilitar la selección de péptidos
que tienen una alta probabilidad de unirse con una cierta afinidad y
que serán a su vez inmunogénicos. El algoritmo está basado en los
efectos sobre la unión a MHC de un aminoácido particular en una
posición particular de un péptido o en los efectos sobre la unión de
una sustitución particular en un péptido que contiene un
motivo.
Un "residuo conservado" es un aminoácido
que aparece con una frecuencia significativamente mayor de lo que
se esperaría por una distribución aleatoria en una posición
particular en un péptido. Típicamente, un residuo conservado es
aquel en que la estructura de MHC puede proporcionar un punto de
contacto con el péptido inmunogénico. Al menos uno a tres o más,
preferiblemente dos, residuos conservados en un péptido de longitud
definida definen un motivo de un péptido inmunogénico. Estos
residuos están típicamente en estrecho contacto con el surco de
unión peptídica, con sus cadenas laterales enterradas en bolsillos
específicos del surco mismo. Típicamente, un péptido inmunogénico
comprenderá hasta tres residuos conservados, más habitualmente dos
residuos conservados.
Como se usa en la presente memoria, "residuos
de unión negativa" son aminoácidos que si están presentes en
ciertas posiciones (por ejemplo, las posiciones 1, 3 y/o 7 de un
péptido de 9 unidades) darán como resultado un péptido que no se
une o se une mal y a su vez no consigue ser inmunogénico,
concretamente, inducir una respuesta de CTL.
El término "motivo" designa el patrón de
residuos en un péptido de longitud definida, habitualmente de
aproximadamente 8 a aproximadamente 11 aminoácidos, que se reconoce
por un alelo de MHC particular. Los motivos peptídicos son
típicamente diferentes para cada alelo de MHC humano y difieren en
el patrón de residuos altamente conservados y residuos
negativos.
El motivo de unión de un alelo puede definirse
con grados crecientes de precisión. En un caso, están presentes
todos los residuos conservados en las posiciones correctas en un
péptido y no hay residuos negativos en las posiciones 1,3 y/o
7.
Las frases "aislado" o "biológicamente
puro" designan material que está sustancial o esencialmente
exento de componentes que lo acompañan normalmente cuando se
encuentra en su estado nativo. Por tanto, los péptidos de esta
invención no contienen materiales asociados normalmente con su
entorno in situ, por ejemplo, moléculas de MHC I sobre
células presentadoras de antígeno. Incluso cuando se ha aislado una
proteína en una banda homogénea o dominante, hay trazas de
contaminantes en el intervalo de 5-10% de la
proteína nativa que se copurifican con la proteína deseada. Los
péptidos aislados de esta invención no contienen dicha proteína
copurificada endógena.
El término "residuo" designa un aminoácido
o mimético aminoacídico incorporado a un oligopéptido mediante un
enlace amida o mimético de enlace amida.
La presente invención se refiere a la
determinación de motivos peptídicos específicos de alelo para
subtipos alélicos de MHC de clase I humano (a veces designados como
HLA). Estos motivos se usan entonces para definir epítopos de
linfocitos T de cualquier antígeno deseado, particularmente aquellos
asociados a enfermedades víricas, cánceres o enfermedades
autoinmunitarias humanos, para los que es conocida la secuencia
aminoacídica del antígeno potencial o dianas autoantigénicas.
Pueden identificarse de esta manera epítopos en
una serie de proteínas diana potenciales. Los ejemplos de antígenos
adecuados incluyen antígeno específico de próstata (PSA), antígenos
de núcleo y superficie de hepatitis B (HBVc, HBVs), antígenos de
hepatitis C, antígenos de virus de Epstein-Barr,
antígenos de melanoma (por ejemplo, MAGE-1),
antígenos de virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), antígenos
de papilomavirus humano (HPV), de virus Lassa, de Mycobacterium
tuberculosis (MT), p53, CEA, antígeno de superficie de
tripanosoma (TSA) y Her2/neu.
Se sintetizan péptidos que comprenden los
epítopos de estos antígenos y se ensaya entonces su capacidad de
unirse a moléculas de MHC apropiadas en ensayos que usan, por
ejemplo, moléculas de clase I purificadas y péptidos radioyodados
y/o células que expresan moléculas de clase I vacías, por ejemplo,
mediante tinción inmunofluorescente y microfluorometría de flujo,
ensayos de ensamblaje de clase I dependientes de péptido e
inhibición del reconocimiento de CTL mediante competición peptídica.
En aquellos péptidos que se unen a la molécula de clase I, se
evalúa adicionalmente su capacidad de servir como dianas para CTL
derivados de individuos infectados o inmunizados, así como su
capacidad de inducir respuestas de CTL primarias in vitro o
in vivo que puedan dar lugar a poblaciones de CTL capaces de
reaccionar con células diana infectadas víricamente o células
tumorales como agentes terapéuticos potenciales.
Los antígenos de MHC de clase I están
codificados por los loci HLA-A, B y C. Los antígenos
de HLA-A y B se expresan en la superficie celular a
densidades aproximadamente iguales, mientras que la expresión de
HLA-C es significativamente menor (quizás como
máximo 10 veces menor). Cada uno de estos loci tiene una serie de
alelos. Los motivos de unión a péptido de la invención son
relativamente específicos de cada subtipo alélico.
Para vacunas basadas en péptido, los péptidos
comprenden preferiblemente un motivo reconocido por una molécula de
MHC I que tiene una amplia distribución en la población humana.
Puesto que los alelos de MHC aparecen con diferentes frecuencias en
diferentes grupos étnicos y razas, la elección del alelo de MHC
diana puede depender de la población diana. La Tabla 1 muestra la
frecuencia de diversos alelos en los productos del locus
HLA-A entre diferentes razas. Por ejemplo, la
mayoría de la población caucásica puede estar cubierta por péptidos
que se unen a cuatro subtipos alélicos de HLA-A,
específicamente HLA-A2.1, A1, A3.2 y A24.1. De forma
similar, la mayoría de la población asiática está comprendida con
la adición de péptidos que se unen a un quinto alelo de
HLA-A11.2.
Tabla recopilada a partir de DuPont,
"Immunobiology of HLA", Vol. 1, "Histocompatibility
Testing" 1987, Springer-Verlag, Nueva York
1989.
* N - negroide; A = asiático; C = caucásico. Los
números entre paréntesis representan el número de individuos
incluidos en el análisis.
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La nomenclatura usada para describir compuestos
peptídicos sigue la práctica convencional en la que el grupo amino
se presenta a la izquierda (extremo N) y el grupo carboxilo a la
derecha (extremo C) de cada residuo aminoacídico. En las fórmulas
que representan realizaciones específicas seleccionadas de la
presente invención, los grupos amino- y carboxiterminales, aunque
no mostrados específicamente, están en la forma que asumirían a
valores de pH fisiológicos, a menos que se especifique otra cosa. En
las fórmulas estructurales aminoacídicas, cada residuo se
representa generalmente por las designaciones estándar de tres o una
letra. La forma L de un residuo aminoacídico se representa mediante
una sola letra mayúscula o una primera letra mayúscula de un
símbolo de tres letras, y la forma D de aquellos aminoácidos que
tienen formas D se representa por una sola letra minúscula o un
símbolo de tres letras minúsculas. La glicina no tiene átomo de
carbono asimétrico y se designa simplemente como "Gly" o
G.
Los procedimientos usados para identificar
péptidos de la presente invención siguen generalmente los
procedimientos dados a conocer en Falk y col., Nature 351:
290 (1991). Brevemente, los procedimientos implican el aislamiento
a gran escala de moléculas de MHC de clase I, típicamente mediante
inmunoprecipitación o cromatografía de afinidad, a partir de la
célula o línea celular apropiada. Los ejemplos de otros
procedimientos para el aislamiento de la molécula de MHC deseada
igualmente conocidos por el experto incluyen cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía en lectina, exclusión por tamaño,
cromatografía de ligando de alta resolución y una combinación de
todas las técnicas anteriores.
En el caso típico, se usa la inmunoprecipitación
para aislar el alelo deseado. Pueden usarse una serie de protocolos
dependiendo de la especificidad de los anticuerpos usados. Por
ejemplo, los reactivos de mAb específicos de alelo pueden usarse
para la purificación por afinidad de las moléculas de
HLA-A, HLA-B1 y
HLA-C. Están disponibles varios reactivos de mAb
para el aislamiento de moléculas de HLA-A (véase la
Tabla 2). Por tanto, para cada uno de los alelos de
HLA-A orientados, están disponibles reactivos que
pueden usarse para el aislamiento directo de las moléculas de
HLA-A. Se usan exitosamente columnas de afinidad
preparadas con estos mAb usando técnicas estándar para purificar
los productos alélicos de HLA-A respectivos.
Además de mAb específicos de alelo, podrían
usarse mAb anti-HLA-A, B y C
ampliamente reactivos tales como W6/32 y B9.12.1, y un mAb
anti-HLA-B, C, B 1.23.2, en
protocolos de purificación por afinidad alternativos como se
describen en aplicaciones anteriores.
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\newpage
Los péptidos unidos al surco de unión peptídica
de las moléculas de MHC aisladas se eluyen típicamente usando
tratamiento ácido. Los péptidos pueden disociarse también de
moléculas de clase I mediante una variedad de medios
desnaturalizantes estándar tales como calor, pH, detergentes, sales,
agentes caotrópicos o una combinación de los mismos.
Se separan adicionalmente las fracciones
peptídicas de las moléculas de MHC mediante cromatografía líquida
de alta resolución (HPLC) en fase inversa y se secuencian. Los
péptidos pueden separarse mediante una variedad de otros medios
estándar bien conocidos por el experto, incluyendo filtración y
ultrafiltración, electroforesis, cromatografía por tamaño,
precipitación con anticuerpos específicos, cromatografía de
intercambio iónico, isoelectroenfoque y
similares.
similares.
La secuenciación de los péptidos aislados puede
efectuarse según técnicas estándar tales como degradación de Edman
(Hunkapiller, y col., Methods Enzymol. 91, 399 (1983)). Otros
procedimientos adecuados para secuenciar incluyen secuenciación por
espectrometría de masas de péptidos individuales como se describe
anteriormente (Hunt, y col., Science 225: 1261 (1992)). La
secuenciación aminoacídica de péptidos heterogéneos brutos (por
ejemplo, fracciones de HPLC combinadas) de diferentes moléculas de
clase I revela típicamente un motivo de secuencia característico
para cada alelo de clase I.
La definición de motivos específicos de
diferentes alelos de clase I permite la identificación de epítopos
peptídicos potenciales de una proteína antigénica cuya secuencia
aminoacídica es conocida. Típicamente, la identificación de
epítopos peptídicos potenciales se lleva a cabo inicialmente usando
un ordenador para explorar en la secuencia aminoacídica de un
antígeno deseado la presencia de motivos. Se sintetizan entonces las
secuencias epitópicas. Se mide la capacidad de unirse a moléculas
de MHC de clase I con una variedad de modos diferentes. Un modo es
un ensayo de unión a molécula de clase I como se describe en las
solicitudes relacionadas, observadas anteriormente. Otras
alternativas descritas en la bibliografía incluyen la inhibición de
la presentación de antígeno (Sette, y col., J. Immunol. 141:
3893 (1991), ensayos de ensamblaje in vitro (Townsend, y col.
Cell 62: 285 (1990) y ensayos basados en FACS que usan
células mutadas tales como RMA-S (Melief, y col.,
Eur. J. Immunol. 21: 2963
(1991)).
(1991)).
A continuación, se ensaya en los péptidos que se
muestran positivos en el ensayo de unión a MHC de clase I la
capacidad de los péptidos de inducir respuestas de CTL específicas
in vitro. Por ejemplo, puede ensayarse en células
presentadoras de antígeno que se han incubado con un péptido la
capacidad de inducir respuestas de CTL en poblaciones celulares
sensibles. Las células presentadoras de antígeno pueden ser células
normales tales como células mononucleares de sangre periférica o
células dendríticas (Inaba, y col., J. Exp. Med. 166: 182
(1987); Boog, Eur. J. Immunol. 18: 219 (1988)).
Como alternativa, se usan convenientemente
líneas celulares mamíferas mutantes que son deficientes en su
capacidad de cargar moléculas de clase I con péptidos procesados
internamente, tales como las líneas celulares de ratón
RMA-S (Kärre, y col. Nature, 319: 675 (1986);
Ljunggren, y col., Eur. J. Immunol. 21:
2963-2970 (1991)) y el híbrido de linfocitos T
somáticos humanos T-2 (Cerundolo, y col.,
Nature 345: 449-452 (1990)), y que se han
transfectado con los genes de clase I humanos apropiados, cuando se
añade péptido a los mismos, para ensayar la capacidad del péptido
de inducir respuestas primarias de CTL. Otras líneas celulares
eucarióticas que podrían usarse incluyen diversas líneas celulares
de insecto tales como de larvas de mosquito (líneas celulares ATCC
CCL 125, 126, 1660, 1591, 6585, 6586), gusano de seda (ATTC CRL
8851), gusano cogollero (TCC CRL 1711), polilla (ATCC CCL 80) y
líneas celulares de Drosophila tales como la línea celular
Schneider (véase Schneider, J. Embryol. Exp. Morphol. 27:
353-365
(1927)).
(1927)).
Se aíslan convenientemente linfocitos de sangre
periférica después de una sencilla venopunción o leucocitaféresis
de donantes normales o pacientes y se usan como fuentes de células
sensibles de precursores de CTL. En una realización, se incuban las
células presentadoras de antígeno apropiadas con
10-100 \muM de péptido en medio exento de suero
durante 4 horas en condiciones de cultivo apropiadas. Se incuban
entonces in vitro las células presentadoras de antígeno
cargadas con péptido con las poblaciones de células sensibles
durante 7 a 10 días en condiciones de cultivo optimizadas. Puede
determinarse la activación positiva de CTL ensayando en los
cultivos la presencia de CTL que matan las células diana
radiomarcadas, tanto dianas con pulsos de péptido específico como
células diana que expresan la forma procesada endógenamente del
antígeno vírico o tumoral relevante del que derivaba la
secuencia
peptídica.
peptídica.
Se determinan la especificidad y restricción de
MHC de los CTL ensayando frente a diferentes péptidos células diana
que expresan MHC de clase I humano apropiado o inapropiado. Los
péptidos que se muestran positivos en los ensayos de unión a MHC y
dan lugar a respuestas de CTL específicas se designan en la presente
memoria como péptidos inmunogénicos.
Los péptidos inmunogénicos pueden prepararse
sintéticamente o mediante tecnología de ADN recombinante o a partir
de fuentes naturales tales como virus o tumores enteros. Aunque el
péptido estará preferiblemente exento de otras proteínas de célula
hospedadora de origen natural y fragmentos de las mismas, en algunas
realizaciones los péptidos pueden estar conjugados sintéticamente
con fragmentos o partículas nativos.
\newpage
Los polipéptidos o péptidos pueden ser de una
variedad de longitudes, en su forma neutra (no cargada) o en formas
que son sales, y exentas de modificaciones tales como glucosilación,
oxidación de cadena lateral o fosforilación, o conteniendo estas
modificaciones, sujetos a la condición de que la modificación no
destruya la actividad biológica de los polipéptidos como se
describen en la presente memoria.
Deseablemente, el péptido será lo menor posible
manteniendo sustancialmente toda la actividad biológica del péptido
grande. Cuando sea posible, puede ser deseable optimizar los
péptidos de la invención a una longitud de 9 a 10 residuos
aminoacídicos, proporcionados en tamaño con péptidos víricos
procesados endógenamente o péptidos de célula tumoral que están
unidos a moléculas de MHC de clase I sobre la superficie
celular.
Los péptidos que tienen la actividad deseada
pueden modificarse según sea necesario para proporcionar ciertos
atributos deseados, por ejemplo características farmacológicas
mejoradas, aumentando o al menos reteniendo sustancialmente toda la
actividad biológica del péptido no modificado de unirse a la
molécula de MHC deseada y activar el linfocito T apropiado. Por
ejemplo, los péptidos pueden someterse a diversos cambios, tales
como sustituciones, conservativas o no conservativas, pudiendo
proporcionar dichos cambios ciertas ventajas en su uso, tales como
una unión a MHC mejorada. Por sustituciones conservativas se
entiende reemplazar un residuo aminoacídico por otro que sea
biológica y/o químicamente similar, por ejemplo, un residuo
hidrófobo por otro, o un residuo polar por otro. Las sustituciones
incluyen combinaciones tales como Gly, Ala; Val, Ile, Leu, Met;
Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg y Phe, Tyr. El efecto de
sustituciones aminoacídicas individuales puede sondearse también
usando D-aminoácidos. Dichas modificaciones pueden
hacerse usando procedimientos de síntesis peptídica bien conocidos
como se describen, por ejemplo, en Merrifield, Science 232:
341-347 (1986), Barany & Merrifield, "The
Peptides", Gross & Meienhofer, ed. (N.Y., Academic Press),
pág. 1-284 (1979); y Stewart & Young, "Solid
Phase Peptide Síntesis", (Rockford, III., Pierce), 2ª Ed.
(1984).
Los péptidos pueden modificarse también
extendiendo o reduciendo la secuencia aminoacídica del compuesto,
por ejemplo, mediante la adición o deleción de aminoácidos. Los
péptidos o análogos pueden modificarse también alterando el orden o
la composición de ciertos residuos, apreciándose fácilmente que
ciertos residuos aminoacídicos esenciales para la actividad
biológica, por ejemplo aquellos en sitios de contacto críticos o
residuos conservados, generalmente no pueden alterarse sin un
efecto adverso sobre la actividad biológica. Los aminoácidos no
críticos no tienen que limitarse a los de origen natural en
proteínas, tales como
L-\alpha-aminácidos o sus
D-isómeros, sino que pueden incluir aminoácidos no
naturales también tales como \beta- y
-\delta-aminoácidos, así como muchos derivados de
L-\alpha-aminoácidos.
Típicamente, se emplea una serie de péptidos con
sustituciones aminoacídicas individuales para determinar el efecto
de la carga electrostática, hidrofobicidad, etc. sobre la unión. Por
ejemplo, se prepara una serie de sustituciones aminoacídicas
cargadas positivamente (por ejemplo, Lys o Arg) o cargadas
negativamente (por ejemplo, Glu) a lo largo del péptido, revelando
diferentes patrones de sensibilidad frente a diversas moléculas de
MHC y receptores de linfocitos T. Además, pueden emplearse
sustituciones múltiples que usan restos pequeños relativamente
neutros tales como Ala, Gly, Pro o residuos similares. Las
sustituciones pueden ser homoligoméricas o heteroligoméricas. El
número y tipo de residuos que se sustituyen o añaden dependen del
espaciado necesario entre los puntos de contacto esenciales y
ciertos atributos funcionales que son buscados (por ejemplo,
hidrofobicidad frente a hidrofilicidad). Puede conseguirse también
una afinidad de unión aumentada por una molécula de MHC o receptor
de linfocito T mediante dichas sustituciones, en comparación con la
afinidad del péptido original. En cualquier caso, dichas
sustituciones deben emplear residuos aminoacídicos u otros
fragmentos moleculares elegidos para evitar, por ejemplo, la
interferencia estérica y de carga que podría desestabilizar la
unión.
Las sustituciones aminoacídicas son típicamente
de residuos individuales. Las sustituciones, deleciones, inserciones
o cualquier combinación de las mismas pueden combinarse para llegar
a un péptido final. Las variantes de sustitución son aquellas en
las que se ha retirado al menos un residuo de un péptido y se ha
insertado en su lugar un residuo diferente. Dichas sustituciones se
preparan generalmente según la siguiente Tabla 3 cuando se desea
modular finamente las características del péptido.
Se hacen cambios sustanciales en la función (por
ejemplo, afinidad por moléculas de MHC o receptores de linfocitos
T) seleccionando sustituciones que sean menos conservativas que las
de la Tabla 3, concretamente, seleccionando residuos que difieran
más significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la
estructura de la cadena principal peptídica en la zona de
sustitución, por ejemplo, en conformación de lámina o hélice, (b)
la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el
volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que se espera que
produzcan en general mayores cambios en las propiedades del péptido
serán aquellas en que (a) un residuo hidrófilo, por ejemplo serilo,
se sustituye por (o mediante) un residuo hidrófobo, por ejemplo
leucilo, isoleucilo, fenlalanilo, valilo o alanilo; (b) un residuo
que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo lisilo,
arginilo o histidilo, se sustituye por (o mediante) un residuo
electronegativo, por ejemplo glutamilo o aspartilo; o (c) un
residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo
fenilalanina, se sustituye por (o mediante) una que no tiene cadena
lateral, por ejemplo glicina.
Los péptidos pueden comprender también
isoésteres de dos o más residuos en el péptido inmunogénico. Un
isoéster como se define en la presente memoria es una secuencia de
dos o más residuos que pueden estar sustituidos por una segunda
secuencia porque la conformación estérica de la primera secuencia se
ajusta a un sitio de unión específico de la segunda secuencia. El
término incluye específicamente modificaciones de la cadena
principal peptídica bien conocidas por los expertos en la materia.
Dichas modificaciones incluyen modificaciones del nitrógeno de
amida, el carbono \alpha o el carbonilo de amida, el reemplazo
completo del enlace amida, extensiones, deleciones o reticulaciones
de la cadena principal. Véase, en general, Spatola, "Chemistry and
Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins", Vol. VII
(Weinstein ed., 1983).
Las modificaciones de péptidos con diversos
miméticos de aminoácidos o aminoácidos no naturales son
particularmente útiles para aumentar la estabilidad del péptido
in vivo. La estabilidad puede ensayarse de una serie de
modos. Por ejemplo, se han usado para ensayar la estabilidad
peptidasas y diversos medios biológicos, tales como plasma y suero
humano. Véase, por ejemplo, Verhoef y col., Eur. J. Drug Metab.
Pharmacokin. 11: 291-302 (1986). Se determina
convenientemente la semivida de los péptidos de la presente
invención usando un ensayo de suero humano al 25% (v/v). El
protocolo es generalmente el siguiente. Se deslipida suero humano
combinado (tipo AB, no termoinactivado) mediante centrifugación
antes del uso. Se diluye entonces el suero al 25% con medio de
cultivo de tejido RPMI y se usa para ensayar la estabilidad del
péptido. Se retira una pequeña cantidad de disolución de reacción a
intervalos de tiempo predeterminados y se añade ácido
tricloroacético acuoso al 6% o etanol. Se enfría la muestra de
reacción turbia (4ºC) durante 15 minutos y se centrifuga entonces
para sedimentar las proteínas séricas precipitadas. Se determina
entonces la presencia de los péptidos mediante HPLC en fase inversa
usando condiciones de cromatografía específicas de estabilidad.
Son conocidas y están fácilmente disponibles un
gran número de células con moléculas de MHC definidas,
particularmente moléculas de MHC de clase I. Por ejemplo, las
líneas de linfocitos B transformadas con EBV humanas se ha mostrado
que son fuentes excelentes para el aislamiento preparativo de
moléculas de MHC de clase I y clase II. Están disponibles líneas
celulares bien caracterizadas a partir de fuentes privadas y
comerciales, tales como American Type Culture Collection
("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas," 6ª edición (1988)
Rockville, Maryland, EE.UU.); National Institute of General Medical
Sciences 1990/1991 Catalog of Cell Lines (NIGMS) Human Genetic
Mutant Cell Repository, Camden, NJ; y ASHI Repository, Brigham and
Women's Hospital, 75 Francis Street, Boston, MA 02115. La Tabla 4
enumera algunas líneas de linfocitos B adecuadas para uso como
fuentes de alelos de HLA-A. Todas estas líneas
celulares pueden cultivarse en grandes lotes y son por lo tanto
útiles para la producción a gran escala de moléculas de MHC. Un
experto reconocerá que éstas son simplemente líneas celulares
ejemplares y que pueden emplearse muchas otras fuentes celulares.
Las líneas de linfocitos B EBV homocigóticas de
HLA-B y HLA-C similares podrían
servir como fuentes de alelos de HLA-B y
HLA-C, respectivamente.
Los péptidos o análogos de los mismos que tienen
actividad estimulante de CTL pueden modificarse para proporcionar
atributos deseados distintos de una semivida sérica mejorada. Por
ejemplo, puede potenciarse la capacidad de los péptidos de inducir
actividad de CTL mediante ligamiento a una secuencia que contiene al
menos un epítopo que es capaz de inducir una respuesta de linfocito
T cooperador. Los conjugados de péptidos inmunogénicos/cooperadores
T inmunogénicos particularmente preferidos se ligan mediante una
molécula espaciadora. El espaciador comprende típicamente moléculas
neutras relativamente pequeñas, tales como aminoácidos o miméticos
aminoacídicos, que están sustancialmente no cargadas en condiciones
fisiológicas. Los espaciadores se seleccionan típicamente, por
ejemplo, de Ala, Gly u otros espaciadores neutros de aminoácidos no
polares o aminoácidos polares neutros. Se entenderá que el
espaciador opcionalmente presente no tiene que comprender los mismos
residuos y por tanto puede ser un hetero- u homoligómero. Cuando
está presente, el espaciador será habitualmente de al menos 1 ó 2
residuos, más habitualmente 3 a 6 residuos. Como alternativa, el
péptido de CTL puede estar ligado al péptido cooperador T sin un
espaciador.
El péptido inmunogénico puede estar ligado al
péptido cooperador T directamente o mediante un espaciador en el
extremo amino o carboxi del péptido CTL. El extremo amino del
péptido inmunogénico o del péptido cooperador T puede estar
acilado. Los péptidos cooperadores T ejemplares incluyen toxoide del
tétanos 830-843, gripe 307-319,
circunsporozoíto de malaria 382-398 y
378-389.
En algunas realizaciones, puede ser deseable
incluir en las composiciones farmacéuticas de la invención al menos
un componente que ayude a cebar CTL. Los lípidos se han identificado
como agentes capaces de ayudar a cebar CTL in vivo frente a
antígenos víricos. Por ejemplo, pueden fijarse residuos de ácido
palmítico a los grupos amino alfa y épsilon de un residuo de Lys y
ligarse después, por ejemplo mediante uno o más residuos de
ligamiento tales como Gly, Gly-Gly-, Ser,
Ser-Ser o similares, con un péptido inmunogénico. El
péptido lipidado puede inyectarse entonces directamente en forma
micelar, incorporarse a un liposoma o emulsionarse en un
coadyuvante, por ejemplo, coadyuvante incompleto de Freund. En una
realización preferida, un inmunógeno particularmente eficaz
comprende ácido palmítico fijado a los grupos amino alfa y épsilon
de Lys, que está fijado mediante ligador, por ejemplo
Ser-Ser, con el extremo amino del péptido
inmunogénico.
Como otro ejemplo de cebado lípídico de
respuestas de CTL, pueden usarse lipoproteínas de E. coli
tales como
tripalmitoil-S-glicerilcisteinilserilserina
(P3CSS) para cebar CTL específicos de virus cuando están fijados
covalentemente a un péptido apropiado. Véase Deres y col.,
Nature 342: 561-564 (1989). Los péptidos
pueden acoplarse con P3CSS, por ejemplo, y administrarse el
lipopéptido a un individuo para cebar específicamente una respuesta
de CTL al antígeno diana. Adicionalmente, ya que la inducción de
anticuerpos neutralizantes puede cebarse también con P3CSS
conjugada con un péptido que exhibe un epítopo apropiado, pueden
combinarse las dos composiciones para desencadenar más eficazmente
respuestas a la infección tanto humorales como mediadas por
célula.
Además, pueden añadirse aminoácidos adicionales
a los extremos de un péptido para proporcionar un fácil ligamiento
de péptidos entre sí, para acoplar a un soporte portador o péptido
mayor, para modificar las propiedades físicas o químicas del
péptido u oligopéptido, o similares. Pueden introducirse aminoácidos
tales como tirosina, cisteína, lisina, ácido glutámico o aspártico
o similares en el extremo C o N del péptido u oligopéptido. La
modificación en el extremo C puede alterar en algunos casos las
características de unión del péptido. Además, las secuencias
peptídicas u oligopeptídicas pueden diferir de la secuencia natural
modificándose mediante acilación NH_{2} terminal, por ejemplo,
mediante acetilación con alcanoílo C_{1}-C_{20}
o tioglicol, amidación carboxiterminal, por ejemplo con amoniaco,
metilamina, etc. En algunos casos, estas modificaciones pueden
proporcionar sitios para ligar a un soporte u otra molécula.
Pueden prepararse péptidos que incluyen
SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 14) en una amplia variedad de modos. Debido a
su tamaño relativamente corto, los péptidos pueden sintetizarse en
disolución o sobre un soporte sólido según técnicas convencionales.
Están disponibles comercialmente diversos sintetizadores automáticos
y pueden usarse según protocolos conocidos. Véase, por ejemplo,
Stewart & Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2ª. ed.,
Pierce Chemical Co. (1984).
Como alternativa, puede emplearse la tecnología
de ADN recombinante, en la que se inserta una secuencia nucleotídica
que codifica un péptido inmunogénico de interés en un vector de
expresión, se transforma o se transfecta en una célula hospedadora
apropiada y se cultiva en condiciones adecuadas para expresión.
Estos procedimientos son generalmente conocidos en la técnica, como
se describen en general en Sambrook y col., "Molecular Cloning, A
Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,
Nueva York (1982). Por tanto, pueden usarse proteínas de fusión que
comprenden una o más secuencias peptídicas de la invención para
presentar el epítopo de linfocito T apropiado.
Ya que la secuencia de codificación de péptidos
de la longitud contemplada en la presente memoria puede sintetizarse
mediante técnicas químicas, por ejemplo, el procedimiento de
fosfotriéster de Matteucci y col., J. Am. Chem. Soc. 103:
3185 (1981), puede hacerse la modificación sustituyendo simplemente
la(s) base(s) apropiada(s) por aquellas que
codifican la secuencia peptídica nativa. Pueden proporcionarse
entonces a la secuencia de codificación ligadores apropiados y
ligarse a vectores de expresión disponibles normalmente en la
técnica, y usarse los vectores para transformar hospedadores
adecuados para producir la proteína de fusión deseada. Están ahora
disponibles una serie de dichos vectores y sistemas hospedadores
adecuados. Para la expresión de proteínas de fusión, se
proporcionarán a la secuencia de codificación codones de inicio y
terminación ligados operativamente, regiones promotoras y
terminadoras y habitualmente un sistema de replicación para
proporcionar un vector de expresión para la expresión en el
hospedador celular deseado. Por ejemplo, se proporcionan secuencias
promotoras compatibles con hospedadores bacterianos en plásmidos
que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción
de la secuencia de codificación deseada. Los vectores de expresión
resultantes se transforman en hospedadores bacterianos adecuados.
Por supuesto, pueden usarse también hospedadores celulares de
levadura o mamífero, empleando vectores y secuencias de control
adecuados.
El péptido de la presente invención y las
composiciones farmacéuticas y de vacuna que comprenden dicho péptido
son útiles para administración a mamíferos, particularmente seres
humanos, para tratar y/o prevenir infección vírica y cáncer. Los
ejemplos de enfermedades que pueden tratarse o prevenirse usando los
péptidos inmunogénicos de la invención incluyen cáncer de próstata,
hepatitis B, hepatitis C, infección por HPV, SIDA, carcinoma renal,
carcinoma de cuello uterino, linfoma, CMV, malaria y condiloma
acuminado.
Las vacunas que contienen un cantidad
inmunogénicamente eficaz del péptido de la invención y opcionalmente
otros péptidos como se describen en la presente memoria son una
realización adición de la invención. Una vez se han definido
apropiadamente los epítopos inmunogénicos, pueden clasificarse y
suministrarse por diversos medios, designados en la presente
memoria como composiciones "de vacuna". Dichas composiciones de
vacuna pueden incluir, por ejemplo, lipopéptidos (Vitiello, A. y
col., J. Clin. Invest. 95: 341, 1995), composiciones
peptídicas encapsuladas en microesferas de
poli(DL-lactida-co-glicolida)
("PLG") (véanse, por ejemplo, Eldridge, y col., Molec.
Immunol. 28: 287-294 (1991); Alonso y col.,
Vaccine 12: 299-306, 1994; Jones y col.,
Vaccine 13: 675-681 (1995)), composiciones
peptídicas contenidas en complejos inmunoestimulantes (ISCOMS)
(véanse, por ejemplo, Takahashi y col., Nature 344:
873-875 (1990); Hu y col., Clin. Exp.
Immunol. 113: 235-243 (1998)), sistemas
peptídicos de múltiples antígenos (MAP) (véanse, por ejemplo, Tarn,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5409-5413
(1988); Tam, J. Immunol. Methods 196: 17-32
(1996)), vectores de suministro vírico (Perkus, y col., en:
"Concepts in vaccine development", Kaufmann, ed., pág. 379
(1996); Chakrabarti, y col., Nature 320: 535 (1986); Hu, y
col., Nature 320: 537 (1986); Kieny, y col., AIDS
Bio/Technology 4: 790 (1986); Top y col., J. Infect. Dis.
124: 148 (1971); Chanda, y col., Virology 175: 535 (1990)),
partículas de origen vírico o sintético (Kofler, y col., J.
Immunol. Methods 192: 25 (1996); Eldridge, y col., Sem.
Hematol. 30: 16 (1993); Falo y col., Nature Med. 7: 649
(1995)), coadyuvantes (Warren, y col., Annu. Rev. Immunol. 4:
369 (1986); Gupta y col., Vaccine 11: 293 (1993)), liposomas
(Reddy y col., J. Immunol. 148: 1585 (1992); Rock,
Immunol. Today 17; 131 (1996)) o ADNc desnudo o absorbido en
partículas (Ulmer y col., Science 59: 1745 (1993); Robinson
I., Vaccine 11: 957 (1993); Shiver y col., en: "Concepts
in vaccine development", Kaufmann, ed., pág. 423, (1996); Cease
& Berzofsky, Annu. Rev. Immunol. 12: 923 (1994) y
Eldridge y col., Sem, Hematol. 30:16 (1993)). Pueden usarse
también tecnologías de suministro orientadas a toxina, también
conocidas como orientación mediada por receptor, tales como las de
Avant Immunotherapeutics. Inc. (Needham, Massachusetts).
Además, las vacunas según la invención
comprenden composiciones que comprenden el péptido reivindicado. El
péptido puede estar ligado individualmente a su propio portador;
como alternativa, el péptido puede existir en forma de un
homopolímero o heteropolímero de unidades peptídicas activas. Dicho
polímero tiene la ventaja de una reacción inmunológica aumentada y,
cuando se usan diferentes epítopos peptídicos para configurar el
polímero, la capacidad adicional de inducir anticuerpos y/o CTL que
reaccionan con diferentes determinantes antigénicos de una o
múltiples proteínas del organismo patogénico o péptido relacionado
con tumor orientado a una respuesta inmunitaria.
Los portadores útiles que pueden usarse con
vacunas de la invención son bien conocidos en la técnica e incluyen,
por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como seroalbúmina
humana, toxoide del tétanos, poliaminoácidos tales como
poli-L-lisina, poli(ácido
glutámico), gripe, proteína de núcleo del virus de la hepatitis B y
similares. Las vacunas pueden contener un diluyente
fisiológicamente tolerable (concretamente aceptable) tal como agua
o disolución salina, preferiblemente disolución salina tamponada con
fosfato. Las vacunas incluyen típicamente también un coadyuvante.
Los coadyuvantes tales como coadyuvante incompleto de Freund,
fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alúmina son ejemplos
de materiales bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, como se
da a conocer en la presente memoria, las respuestas de CTL pueden
cebarse conjugando péptidos de la invención con lípidos tales como
tripalmitoil-S-glicerilcisteinilserilserina
(P3CSS).
Como se da a conocer con mayor detalle en la
presente memoria, tras la inmunización con una composición peptídica
según la invención, mediante inyección, aerosol, vía oral,
transdérmica, transmucosa, intrapleural, intratecal u otra
adecuada, el sistema inmunitario del hospedador responde a la vacuna
produciendo grandes cantidades de CTL específicos del antígeno
deseado. En consecuencia, el hospedador se convierte en al menos
parcialmente inmune a una infección posterior, o al menos
parcialmente resistente al desarrollo de una infección crónica
continua, o deriva al menos algún beneficio terapéutico cuando el
antígeno estaba asociado a tumor.
En algunos casos, puede ser deseable combinar
las vacunas de péptido de clase I con vacunas que inducen o
facilitan respuestas de anticuerpos neutralizantes al antígeno diana
de interés, particularmente a antígenos de cubierta vírica. Una
composición preferida comprende epítopos de clase I y II según la
invención. Una alternativa de dicha composición comprende un
epítopo de clase I y/o II según la invención junto con una molécula
PADRE^{TM} (Epimmune, San Diego, CA) (descrita en la patente de
EE.UU. nº 5.736.142). Adicionalmente, puede administrarse
cualquiera de éstas en una modalidad mediada por ácido nucleico.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
el péptido inmunogénico de la invención pueden administrarse a un
individuo que padece ya un cáncer o está infectado por el virus de
interés. Aquellos en la fase de incubación o la fase aguda de la
infección pueden tratarse con los péptidos inmunogénicos
separadamente o en combinación con otros tratamientos, según sea
apropiado. En aplicaciones terapéuticas, se administran las
composiciones a un paciente en una cantidad suficiente para
desencadenar una respuesta de CTL eficaz al antígeno vírico o
tumoral y para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas
y/o complicaciones. Se define una cantidad adecuada para conseguir
esto como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades
eficaces para este uso dependerán, por ejemplo, de la composición
peptídica, del modo de administración, de la etapa y gravedad de la
enfermedad que se esté tratando, del peso y estado general de salud
del paciente y del criterio del médico a cargo, pero generalmente
están en el intervalo para inmunización inicial (es decir, para
administración terapéutica o profiláctica) de aproximadamente 1,0
\mug a aproximadamente 50.000 \mug de péptido para un paciente
de 70 kg, seguido de dosificaciones de recuerdo de aproximadamente
1,0 \mug a aproximadamente 10.000 \mug de péptido de acuerdo
con un régimen de recuerdo durante semanas a meses, dependiendo de
la respuesta y condición del paciente, midiendo la actividad de CTL
específica en la sangre del paciente. Debe recordarse que el
péptido y las composiciones de la presente invención pueden
emplearse generalmente en estados patológicos graves, es decir,
situaciones de peligro de muerte o peligro de muerte potencial. En
dichos casos, con vistas a la minimización de sustancias extrañas y
a la naturaleza relativamente no tóxica del péptido, es posible y
puede parecer deseable para el médico a cargo administrar excesos
sustanciales de estas composiciones peptídicas.
Para uso terapéutico, la administración debería
empezar a la primera señal de infección vírica o la detección o
retirada quirúrgica de tumores o poco después del diagnóstico en el
caso de infección aguda. Esto es seguido por dosis de recuerdo al
menos hasta que los síntomas remitan sustancialmente y durante un
periodo después de ello. En infección crónica, pueden requerirse
dosis de carga seguidas de dosis de recuerdo.
El tratamiento de un individuo afectado con las
composiciones de la invención puede acelerar la resolución de la
infección en individuos afectados agudamente. Para aquellos
individuos propensos (o predispuestos) a desarrollar infección
crónica, las composiciones son particularmente útiles en
procedimientos para prevenir la evolución desde infección aguda a
crónica. Cuando los individuos propensos se identifican antes o
durante la infección, por ejemplo como se describe en la presente
memoria, la composición puede orientarse a ellos, minimizando la
necesidad de administración a una población mayor.
Las composiciones peptídicas pueden usarse
también para el tratamiento de infección crónica y para estimular
el sistema inmunitario para eliminar células infectadas por virus en
portadores. Es importantes proporcionar una cantidad de péptido
inmunopotenciadora en una formulación y con un modo de
administración suficiente para estimular eficazmente una respuesta
de linfocitos T citotóxicos. Por tanto, para el tratamiento de
infección crónica, una dosis representativa está en el intervalo de
aproximadamente 1,0 \mug a aproximadamente 50.000 \mug,
preferiblemente de aproximadamente 5 \mug a 10.000 \mug para un
paciente de 70 kg por dosis. Pueden requerirse dosis inmunizadoras
seguidas de dosis de recuerdo a intervalos establecidos, por ejemplo
de una a cuatro semanas, posiblemente durante un periodo de tiempo
prolongado para inmunizar eficazmente un individuo. En caso de
infección crónica, la administración debe continuar hasta que al
menos los síntomas clínicos o ensayos de laboratorio indiquen que
la infección vírica se ha eliminado o ha remitido sustancialmente y
durante un periodo después de ello.
Las composiciones farmacéuticas para tratamiento
terapéutico se pretenden para administración parenteral, tópica,
oral o local. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se
administran por vía parenteral, por ejemplo, intravenosa,
subcutánea, intradérmica o intramuscular. Por tanto, la invención
proporciona composiciones para administración parenteral que
comprenden una disolución de péptidos inmunogénicos disueltos o
suspendidos en un portador aceptable, preferiblemente un portador
acuoso. Puede usarse una variedad de portadores acuosos, por
ejemplo, agua, agua tamponada, disolución salina al 0,9%, glicina al
0,3%, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden
esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales
bien conocidas, o pueden esterilizarse por filtración. Las
disoluciones acuosas resultantes pueden envasarse para uso como
tales o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con
una disolución estéril antes de la administración. Las
composiciones pueden contener sustancias auxiliares
farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse a
las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y
tamponadores, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes
humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de
sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio,
monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc.
La concentración de péptidos estimulantes de CTL
de la invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar
ampliamente, concretamente, de menos de aproximadamente 0,1%,
habitualmente de o al menos aproximadamente 2% hasta 20% a 50% o
más en peso, y se seleccionará principalmente por volúmenes de
fluido, viscosidades, etc., según el modo de administración
particular seleccionado.
El péptido de la invención puede administrarse
también mediante liposomas, que orientan los péptidos a un tejido
celular particular tal como tejido linfoide. Los liposomas son
también útiles para aumentar la semivida de los péptidos. Los
liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas
insolubles, cristales líquidos, dispersiones fosfolipídicas, capas
lamelares y similares. En estas preparaciones, se incorpora el
péptido a suministrar como parte de un liposoma, solo o en
combinación con una molécula que se une, por ejemplo, a un receptor
prevalente entre células linfoides tal como anticuerpos monoclonales
que se unen al antígeno CD45, o con otras composiciones
terapéuticas o inmunogénicas. Por tanto, los liposomas rellenos con
un péptido de la invención deseado pueden dirigirse al sitio de
células linfoides, donde los liposomas suministran entonces las
composiciones de péptido terapéutico/inmunogénico seleccionadas. Los
liposomas para uso en la invención se forman a partir de lípidos
formadores de vesícula estándar, que incluyen generalmente
fosfolípidos neutros y cargados negativamente y un esterol tal como
colesterol. La selección del lípido está guiada generalmente por la
consideración, por ejemplo, del tamaño del liposoma, la labilidad
ácida y la estabilidad de los liposomas en la corriente sanguínea.
Están disponibles una variedad de procedimientos para preparar
liposomas, como se describe, por ejemplo, en Szoka y col., Ann.
Rev. Biophys. Bioeng. 9; 467 (1980), patentes de EE.UU. nº
4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.
Para orientar a células inmunitarias, un ligando
a incorporar al liposoma puede incluir, por ejemplo, anticuerpos o
fragmentos de los mismos específicos de determinantes de la
superficie celular de las células del sistema inmunitario deseadas.
Una suspensión de liposoma que contiene un péptido puede
administrarse por vía intravenosa, local, tópica, etc. en una dosis
que varía según, entre otras cosas, el modo de administración, el
péptido que se esté suministrando y la etapa de la enfermedad que
se esté tratando.
Para composiciones sólidas, pueden usarse
portadores sólidos no tóxicos convencionales que incluyen, por
ejemplo, purezas farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón,
estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa,
sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Para administración
oral, se forma una composición no tóxica farmacéuticamente
aceptable incorporando cualquiera de los excipientes empleados
normalmente, tales como aquellos portadores enumerados
anteriormente, y generalmente 10-95% del ingrediente
activo, es decir, uno o más péptidos de la invención, y más
preferiblemente a una concentración de 25-75%.
Para administración en aerosol, los péptidos
inmunogénicos se suministran preferiblemente en forma finamente
dividida junto con un tensioactivo y propelente. Los porcentajes
típicos de péptidos son de 0,01%-20% en peso, preferiblemente
1%-10%. El tensioactivo, por supuesto, debe ser no tóxico y
preferiblemente soluble en el propelente. Son representativos de
dichos agentes los ésteres o ésteres parciales de ácidos grasos que
contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como ácidos caproico,
octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico,
olestérico y oleico con un alcohol alifático polihidroxílico o su
anhídrido cíclico. Pueden emplearse ésteres mixtos, tales como
glicéridos mixtos o naturales. El tensioactivo puede constituir
0,1%-20% en peso de la composición, preferiblemente
0,25-5%. El resto de la composición es normalmente
propelente. Puede incluirse también un portador, según se desee,
como, por ejemplo, lecitina para suministro intranasal.
Tras la inmunización con una composición
peptídica como se describe en la presente memoria mediante
inyección, aerosol, vía oral, transdérmica u otra, el sistema
inmunitario del hospedador responde a la vacuna produciendo grandes
cantidades de CTL específicos del antígeno deseado, y el hospedador
se vuelve al menos parcialmente inmune a una infección posterior, o
resistente al desarrollo de infección crónica.
Las composiciones de vacuna que contienen el
péptido de la invención se administran a un paciente propenso o con
riesgo de otro modo de infección vírica o cáncer para desencadenar
una respuesta inmunitaria contra el antígeno y potenciar así las
capacidades de respuesta inmunitaria propias del paciente. Dicha
cantidad se define como una "dosis inmunogénicamente eficaz".
En este uso, las cantidades precisas dependen de nuevo del estado
de salud del paciente y el peso, del modo de administración, de la
naturaleza de la formulación, etc., pero generalmente están en el
intervalo de aproximadamente 1,0 \mug a aproximadamente 50.000
\mug por paciente de 70 kg, más habitualmente de aproximadamente
10 \mug a aproximadamente 10.000 \mug por 70 kg de peso
corporal.
En algunos casos, puede ser deseable combinar
las vacunas peptídicas de la invención con vacunas que inducen
respuestas de anticuerpo neutralizante frente al virus de interés,
particularmente antígenos de cubierta vírica.
Con fines terapéuticos o de inmunización, pueden
administrarse también al paciente ácidos nucleicos que codifican el
péptido de la invención y opcionalmente uno o más de los péptidos
descritos en la presente memoria. Se usan convenientemente una
serie de procedimientos para suministrar los ácidos nucleicos al
paciente. Por ejemplo, el ácido nucleico puede suministrarse
directamente, en forma de "ADN desnudo". Este enfoque se
describe, por ejemplo, en Wolff y col., Science 247:
1465-1468 (1990), así como en las patentes de EE.UU.
nº 5.580.859 y 5.589.466. Los ácidos nucleicos pueden administrarse
también usando suministro balístico como se describe, por ejemplo,
en la patente de EE.UU. nº 5.204.253. Pueden administrarse
partículas que comprenden solamente ADN. Como alternativa, el ADN
puede estar adherido a partículas tales como partículas de oro.
Los ácidos nucleicos pueden suministrarse
también complejados a compuestos catiónicos, tales como lípidos
catiónicos. Se describen procedimientos de suministro génico mediado
por lípido, por ejemplo, en los documentos WO 96/18372; WO
93/24640; Mannino & Gould-Fogerite,
BioTechniques 6(7): 682-691 (1988);
Rose, patente de EE.UU. nº 5.279.833; WO 91/06309 y Felgner y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414
(1987).
El péptido de la invención puede expresarse
también mediante hospedadores víricos atenuados tales como virus
Vaccinia o de viruela aviar. Este enfoque implica el uso de virus
Vaccinia como vector para expresar secuencias nucleotídicas que
codifican el péptido de la invención. Tras la introducción en un
hospedador infectado aguda o crónicamente o en un hospedador no
infectado, el virus Vaccinia recombinante expresa el péptido
inmunogénico y desencadena así una respuesta de CTL del hospedador.
Se describen vectores de Vaccinia y procedimientos útiles en
protocolos de inmunización, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº
4.722.848. Es otro vector el de BCG (bacilo de
Calmette-Guerin). Los vectores de BCG se describen
en Stover y col. (Nature 351: 456-460
(1991)). Resultarán evidentes una amplia variedad de otros vectores
útiles para administración terapéutica o inmunización de los
péptidos de la invención, por ejemplo, vectores de Salmonella
typhi y similares, a partir de la descripción de la presente
memoria.
Un medio preferido de administración de ácidos
nucleicos que codifican el péptido de la invención usa constructos
minigénicos que codifican múltiples epítopos. Para crear una
secuencia de ADN que codifica los epítopos de CTL seleccionados
(minigen) para expresión en células humanas, se traducen de forma
inversa las secuencias aminoacídicas de los epítopos. Se usa una
tabla de uso de codón humano para guiar la elección de codón para
cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codifica epítopo se
añaden directamente, creando una secuencia polipeptídica continua.
Para optimizar la expresión y/o inmunogenicidad, pueden incorporarse
elementos adicionales al diseño de minigen. Los ejemplos de
secuencia aminoacídica que podrían traducirse de forma inversa e
incluirse en la secuencia minigenica incluyen: linfocito T
cooperador, epítopos, una secuencia líder (señal) y una señal de
retención de retículo endoplasmático. Además, la presentación en MHC
de epítopos de CTL puede mejorarse incluyen secuencias flanqueantes
sintéticas (por ejemplo polialanina) o de origen natural adyacentes
a los epítopos de CTL.
Se convierte la secuencia minigenica en ADN
ensamblando oligonucleótidos que codifican las cadenas codificante
y no codificante del minigen. Se sintetizan oligonucleótidos
superpuestos (30-100 bases de longitud), se
fosforilan, se purifican y se asocian en condiciones apropiadas
usando técnicas bien conocidas. Se unen los extremos de los
oligonucleótidos usando ADN ligasa T4. Este minigen sintético, que
codifica el polipéptido epitópico de CTL, puede clonarse entonces
en un vector de expresión deseado.
Se incluyen secuencias reguladoras estándar bien
conocidas por los expertos en la materia para asegurar la expresión
en las células diana. Son necesarios varios elementos vectoriales:
un promotor con un sitio de clonación cadena abajo para la
inserción del minigen, una señal de poliadenilación para una
terminación eficaz de la transcripción, un origen de replicación de
E. coli y un marcador seleccionable de E. coli (por
ejemplo, resistencia a ampicilina o kanamicina). Pueden usarse con
este fin numerosos promotores, por ejemplo, el promotor de
citomegalovirus humano (hCMV). Véanse las patentes de EE.UU. nº
5.580.859 y 5.589.466 para otras secuencias promotoras
adecuadas.
Pueden desearse modificaciones vectoriales
adicionales para optimizar la expresión e inmunogenicidad del
minigen. En algunos casos, se requieren intrones para una expresión
génica eficaz, y podrían incorporarse uno o más intrones sintéticos
o de origen natural a la región transcrita del minigen. La inclusión
de secuencias de estabilización del ARNm puede considerarse también
para aumentar la expresión del minigen. Se ha propuesto
recientemente que las secuencias inmunoestimulantes (ISS o CpG)
desempeñan un papel en la inmunogenicidad de vacunas de ADN. Estas
secuencias podrían incluirse en el vector, fuera de la secuencia de
codificación del minigen, si se encontrara que potencian la
inmunogenicidad.
En algunas realizaciones, puede usarse un vector
de expresión bicistrónico para permitir la producción de epítopos
codificados por el minigen e incluirse una segunda proteína para
potenciar o reducir la inmunogenicidad. Los ejemplos de proteínas o
polipéptidos que podrían potenciar beneficiosamente la respuesta
inmunitaria si se coexpresan incluyen citocinas (por ejemplo, IL2,
IL12, GM-CSF), moléculas inductoras de citocinas
(por ejemplo, LeIF) o moléculas coestimulantes. Podrían unirse
epítopos cooperadores (HTL) a señales de orientación intracelular y
expresarse separadamente de los epítopos de CTL. Esto permitiría
dirigir los epítopos de HTL a un compartimento celular diferente de
los epítopos de CTL. En caso necesario, esto podría facilitar una
entrada más eficaz de los epítopos de HTL en la ruta de MHC de clase
II, mejorando la inducción de CTL. En contraposición con la
inducción de CTL, reducir específicamente la respuesta inmunitaria
mediante la coexpresión de moléculas inmunosupresoras (por ejemplo,
TGF-\beta) puede ser beneficioso en ciertas
enfermedades.
Una vez se selecciona el vector de expresión, se
clona el minigen en la región de poliligador cadena abajo del
promotor. Se transforma este plásmido en una cepa de E. coli
apropiada y se prepara el ADN usando técnicas estándar. La
orientación y secuencia del ADN del minigen, así como todos los
demás elementos incluidos en el vector, se confirman usando
cartografía de restricción y análisis de secuencia de ADN. Las
células bacterianas que albergan el plásmido correcto pueden
almacenarse en forma de banco de células maestras y banco de células
de trabajo.
Se producen cantidades terapéuticas de ADN de
plásmido mediante fermentación en E. coli, seguida de
purificación. Se usan alícuotas del banco de células de trabajo
para inocular medio de fermentación (tal como caldo Terrific) y se
cultivan hasta saturación en matraces agitados o un biorreactor
según técnicas bien conocidas. El ADN de plásmido puede purificarse
usando tecnologías de bioseparación estándar tales como resinas de
intercambio aniónico en fase sólida suministradas por Qiagen. En
caso necesario, puede aislarse ADN superenrrollado a partir de las
formas circular abierta y lineal usando electroforesis en gel u
otros procedimientos.
Puede prepararse para inyección ADN de plásmido
purificado usando una variedad de formulaciones. La más simple de
éstas es la reconstitución de ADN liofilizado en disolución salina
tamponada con fosfato (PBS). Se han descrito una variedad de
procedimientos y pueden ponerse a disposición nuevas técnicas. Como
se observa anteriormente, los ácidos nucleicos se formulan
convenientemente con lípidos catiónicos. Además, podrían complejarse
también con ADN de plásmido purificado glicolípidos, liposomas
fusogénicos, péptidos y compuestos designados colectivamente como
protectores interactivos no condensadores (PINC), para influir en
variables tales como estabilidad, dispersión intramuscular o
tráfico a órganos o tipos celulares específicos.
Puede usarse la sensibilización de células diana
como ensayo funcional para la expresión y presentación en MHC de
clase I de epítopos de CTL codificados por el minigen. Se introduce
el ADN de plásmido en una línea celular mamífera que sea adecuada
como diana para ensayos de liberación de cromo por CTL estándar. El
procedimiento de transfección usado dependerá de la formulación
final. Puede usarse electroporación para ADN "desnudo",
mientras que los lípidos catiónicos permiten dirigir la transfección
in vitro. Puede cotransfectarse un plásmido que expresa la
proteína fluorescente verde (GFP) para permitir el enriquecimiento
de células transfectadas usando clasificación celular activada por
fluorescencia (FACS). Se marcan entonces estas células con
cromo-51 y se usan como células diana para líneas
de CTL específicas de epítopo. La citólisis, detectada mediante la
liberación de ^{51}Cr, indica la producción de presentación en MHC
de epítopos de CTL codificados por el minigen.
La inmunogenicidad in vivo es un segundo
enfoque para el ensayo funcional de formulaciones de ADN de minigen.
Se inmunizan ratones transgénicos que expresan moléculas de MHC
humanas apropiadas con el producto de ADN. La dosis y vía de
administración dependen de la formulación (por ejemplo, IM para ADN
en PBS, IP para ADN complejado con lípido). 24 horas después de la
inmunización, se recogen los esplenocitos y se reestimulan durante
1 semana en presencia de péptidos que codifican cada epítopo que se
está ensayando. Se ensaya en estas células efectoras (CTL) la
citólisis de células diana marcadas con cromo-51
cargadas con péptido usando técnicas estándar. La lisis de células
diana sensibilizadas mediante la carga en MHC de péptidos
correspondientes a epítopos codificados por el minigen demuestra la
función de vacuna de ADN para la inducción in vivo de
CTL.
Pueden usarse péptidos antigénicos para
desencadenar CTL ex vivo también. Los CTL resultantes pueden
usarse para tratar infecciones crónicas (víricas o bacterianas) o
tumores en pacientes que no responden a otras formas convencionales
de terapia, o que no responderán a un enfoque de terapia de vacuna
peptídica. Las respuestas de CTL ex vivo ante un patógeno
particular (agente infeccioso o antígeno tumoral) se inducen
incubando el cultivo de tejido células precursoras de CTL del
paciente (CTLp) junto con una fuente de células presentadoras de
antígeno (APC) y el péptido inmunogénico apropiado. Después de un
tiempo de incubación apropiado (típicamente 1-4
semanas), en el que se activan las CTLp, maduran y se expanden a CTL
efectoras, se introducen por infusión de nuevo al paciente, en el
que destruirán su célula diana específica (una célula infectada o
célula tumoral). Para optimizar las condiciones in vitro
para la generación de linfocitos T citotóxicos, se mantiene el
cultivo de células estimulantes en un medio exento de suero
apropiado.
Antes de la incubación de las células
estimulantes con las células a activar, por ejemplo células CD8+
precursoras, se añade una cantidad de péptido antigénico al cultivo
de células estimulantes, en cantidad suficiente para cargarse en
moléculas de clase I humanas para expresar sobre la superficie de
las células estimulantes. En la presente invención, una cantidad
suficiente de péptido es una cantidad que permitirá que
aproximadamente 200 o más moléculas de MHC de clase I humanas se
carguen con el péptido a expresar sobre la superficie de cada
célula estimulante. Preferiblemente, las células estimulantes de
incuban con >20 \mug/ml de péptido.
Se incuban entonces células CD8+ en reposo o
precursoras en cultivo con células estimulantes apropiadas durante
un periodo de tiempo suficiente para activar las células CD8+.
Preferiblemente, las células CD8+ se activan de manera específica
de antígeno. La relación de células CD8+ en reposo o precursoras
(efectoras) a células estimulantes puede variar de individuo a
individuo y puede depender adicionalmente de variables tales como
la sensibilidad de los linfocitos de un individuo a las condiciones
de cultivo y la naturaleza y gravedad de la afección patológica u
otra afección para la que se use la modalidad de tratamiento aquí
descrita. Preferiblemente, sin embargo, la relación de
linfocitos:células estimulantes está en el intervalo de
aproximadamente 30:1 a 300:1. El cultivo de efectores/estimulantes
puede mantenerse durante todo el tiempo necesario para estimular un
número utilizable o eficaz terapéuticamente de células CD8+.
La inducción de CTL in vitro requiere el
reconocimiento específico de péptidos que están unidos a moléculas
de MHC de clase I específicos de alelo sobre APC. El número de
complejos de MHC/péptido específicos por APC es crucial para la
estimulación de CTL, particularmente en respuestas inmunitarias
primarias. Aunque son suficientes pequeñas cantidades de complejos
de péptido/MHC por célula para volver a una célula susceptible a la
lisis por CTL, o para estimular una respuesta de CTL secundaria, la
activación exitosa de un precursor de CTL (pCTL) durante la
respuesta primaria requiere un número significativamente alto de
complejos de MHC/péptido. La carga peptídica de moléculas de
complejo de histocompatibilidad mayor vacías sobre células permite
la inducción de respuestas de linfocitos T citotóxicos
primarios.
Puesto que no existen líneas celulares mutantes
para cada alelo de MHC humano, es ventajoso usar una técnica para
retirar péptidos asociados a MHC endógenos de la superficie de APC,
seguido de la carga de las moléculas de MHC vacías resultantes con
los péptidos inmunogénicos de interés. El uso de células no
transformadas (no tumorigénicas) no infectadas y preferiblemente
autólogas de pacientes como APC es deseable para el diseño de
protocolos de inducción de CTL dirigidos hacia el desarrollo de
terapias de CTL ex vivo. Esta solicitud da a conocer
procedimientos para extraer los péptidos asociados a MHC endógenos
de la superficie de APC seguido de la carga de péptidos
deseados.
deseados.
Es una molécula de MHC de clase I estable un
complejo trimérico formado por los siguientes elementos: 1) un
péptido de habitualmente 8-10 residuos, 2) una
proteína polimórfica pesada transmembrana que porta el sitio de
unión a péptido en sus dominios \alpha1 y \alpha2, y 3) una
cadena ligera no polimórfica no covalentemente asociada de
\beta2-microglobulina. Retirar los péptidos unidos
y/o disociar la \beta2-microglobulina del
complejo vuelve a las moléculas de MHC de clase I no funcionales e
inestables, dando como resultado una degradación rápida. Todas las
moléculas de MHC de clase I aisladas a partir de PBMC tienen
péptidos endógenos unidos a las mismas. Por lo tanto, la primera
etapa es retirar todos los péptidos endógenos unidos a moléculas de
MHC de clase I sobre las APC sin causar su degradación antes de que
puedan añadirse a las mismas péptidos exógenos.
Dos posibles modos de liberar a moléculas de MHC
de clase I de los péptidos unidos incluyen reducir la temperatura
de cultivo de 37ºC a 26ºC durante una noche para desestabilizar la
\beta2-microglobulina y extraer los péptidos
endógenos de la célula usando un tratamiento ácido suave. Los
procedimientos liberan los péptidos unidos anteriormente al entorno
extracelular, permitiendo a nuevos péptidos exógenos unirse a las
moléculas de clase I vacías. El procedimiento de incubación a
temperatura fría posibilita que los péptidos exógenos se unan
eficazmente al complejo de MHC, pero requiere una incubación de una
noche a 26ºC que puede retardar la tasa metabólica celular. También
es probable que las células que no sintetizan activamente moléculas
de MHC (por ejemplo, PBMC en reposo) no produzcan altas cantidades
de moléculas de MHC de superficie vacías mediante el procedimiento
a temperatura fría.
La extracción ácida fuerte implica la extracción
de los péptidos con ácido trifluoroacético, pH 2, o la
desnaturalización ácida de los complejos de clase
I-péptido purificados por inmunoafinidad. Estos
procedimientos no son factibles para la inducción de CTL, puesto
que es importante retirar los péptidos endógenos conservando la
viabilidad de APC y un estado metabólico óptimo que es crítico para
la presentación de antígeno. Se han usado disoluciones ácidas
débiles de pH 3 tales como tampones de glicina o
citrato-fosfato para identificar péptidos endógenos
y para identificar epítopos de linfocitos T asociados a tumor. El
tratamiento es especialmente eficaz porque sólo se desestabilizan
las moléculas de MHC de clase I (y péptidos asociados liberados)
mientras que otros antígenos de superficie permanecen intactos,
incluyendo moléculas de MHC de clase II. Lo más importante, el
tratamiento de células con las disoluciones ácidas débiles no afecta
a la viabilidad de la célula ni al estado metabólico. El
tratamiento ácido débil es rápido, puesto que la extracción de los
péptidos endógenos ocurre en 2 minutos a 4ºC y los APC están listos
para efectuar su función después de cargar los péptidos apropiados.
La técnica se utiliza en la presente memoria para preparar APC
específicas de péptido para la generación de CTL específicos de
antígeno primarios. Las APC resultantes son eficaces para la
inducción de CTL CD8+ específicos de péptido.
Las células CD8+ activadas puede separarse
eficazmente de las células estimulantes usando una variedad de
procedimientos conocidos. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos
monoclonales específicos de células estimulantes para los péptidos
cargados en las células estimulantes o para las células CD8+ (o un
segmento de las mismas) para unir su ligando complementario
apropiado. Pueden extraerse entonces las moléculas marcadas con
anticuerpo de la mezcla de células
estimulantes-efectoras mediante medios apropiados,
por ejemplo, mediante procedimientos bien conocidos de
inmunoprecipitación o inmunoensayo.
Las cantidades citotóxicas eficaces de células
CD8+ activadas pueden variar entre los usos in vitro e in
vivo, así como con la cantidad y tipo de células que son la
diana última de estas células destructoras. La cantidad variará
también dependiendo de la afección del paciente y deberá
determinarse mediante la consideración de todos los factores
apropiados por el facultativo. Preferiblemente, sin embargo, se
utilizan aproximadamente 1 X 10^{6} a aproximadamente 1 X
10^{12}, más preferiblemente aproximadamente 1 X 10^{8} a
aproximadamente 1 X 10^{11}, y aún más preferiblemente
aproximadamente 1 X 10^{9} a aproximadamente 1 X 10^{10} células
CD8+ activadas para adultos humanos, en comparación con
aproximadamente 5 X 10^{6} - 5 X 10^{7} células usadas en
ratones.
Preferiblemente, como se expone anteriormente,
las células CD8+ activadas se recogen del cultivo celular antes de
la administración de las células CD8+ al individuo que se esté
tratando. Sin embargo, es importante observar que, al contrario que
otras modalidades de tratamiento presentes y propuestas, el presente
procedimiento usa un sistema de cultivo celular que es no
tumorigénico. Por lo tanto, si no se consigue la separación completa
de células estimulantes y células CD8+ activadas, no se conoce un
riesgo inherente asociado a la administración de un pequeño número
de células estimulantes, mientras que la administración de células
promotoras de tumores en mamíferos puede ser extremadamente
peligrosa.
Son conocidos en la técnica procedimientos para
reintroducir componentes celulares e incluyen procedimientos tales
como los ejemplificados en la patente de EE.UU. nº 4.844.893 de
Honsik, y col. y la patente de EE.UU. nº 4.690.915 de Rosenberg.
Por ejemplo, es apropiada la administración de células CD8+
activadas mediante infusión intravenosa.
El péptido inmunogénico de esta invención puede
usarse también para preparar anticuerpos monoclonales. Dichos
anticuerpos pueden ser útiles como agentes de diagnóstico o
terapéuticos potenciales.
El péptido puede encontrar uso también como
reactivo de diagnóstico. Por ejemplo, puede usarse un péptido para
determinar la sensibilidad de un individuo particular a un régimen
de tratamiento que emplea el péptido o péptidos relacionados, y por
tanto puede ser útil para modificar un protocolo de tratamiento
existente o para determinar el pronóstico para un individuo
afectado. Además, los péptidos pueden usarse también para predecir
cuáles individuos tendrán un riesgo sustancial de desarrollar
infección crónica.
Los siguientes ejemplos se proporcionan sólo a
modo de ilustración y no a modo de limitación. Los expertos en la
materia reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no
críticos que podrían cambiarse o modificarse proporcionando
resultados esencialmente similares.
Se llevó a cabo el aislamiento de antígeno de
clase I como se describe en las solicitudes relacionadas observadas
anteriormente. Se aislaron entonces péptidos procesados naturalmente
y se secuenciaron como se describe allí. Se determinaron un motivo
específico de alelo y algoritmos y se llevaron a cabo ensayos de
unión cuantitativos.
Usando los motivos identificados anteriormente
para HLA-2.1, se analizó en las secuencias
aminoacídicas alélicas de una serie de antígenos la presencia de
estos motivos. La Tabla 5 proporciona los resultados de estas
búsquedas.
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\vskip1.000000\baselineskip
Para identificar péptidos, se llevó a cabo el
aislamiento de antígeno de clase I y el aislamiento y secuenciación
de péptidos procesados naturalmente como se describe en las
solicitudes relacionadas. Se usaron entonces estos péptidos para
definir motivos de unión específica para cada uno de los siguientes
alelos A3.2, A1, A11 y A24.1. Se describen estos motivos
anteriormente. Los motivos descritos en las Tablas
6-9 siguientes se definen a partir de los datos de
secuenciación combinados de péptidos procesados naturalmente como se
describe en las solicitudes relacionadas.
\vskip1.000000\baselineskip
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Usando los motivos identificados anteriormente,
se analizó la presencia de estos motivos en diversas secuencias
aminoacídicas alélicas de MHC de clase I de diversos patógenos y
proteínas relacionadas con tumores. Se llevó a cabo el examen
descrito en las solicitudes relacionadas. La Tabla 10 proporciona
los resultados de búsqueda de los antígenos.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
- \bullet US 5736142 A [0068]
- \bullet WO 9618372 A [0083]
- \bullet WO 9324640 A [0083]
- \bullet US 4235871 A [0075]
- \bullet US 5279833 A, Rose [0083]
- \bullet US 4501728 A [0075]
- \bullet WO 9106309 A [0083]
- \bullet US 4837028 A [0075]
- \bullet US 4722848 A [0084]
- \bullet US 5019369 A [0075]
- \bullet US 4844893 A, Honsik [0106]
- \bullet US 5580859 A [0082]
\hskip0.2cm[0087]
- \bullet US 4690915 A, Rosenberg [0106]
- \bullet US 5589466 A [0082]
\hskip0.2cm[0087]
\bullet US 5204253 A [0082]
\bulletBJORKMAN et al. Nature,
1987, vol. 329, 506 [0004]
\bulletBUUS et al. Science,
1988, vol. 242, 1065 [0005]
\bulletFALK et al. Nature,
1991, vol. 351, 290 [0005] [0033]
\bulletJARDETZKY et al. Nature,
1991, vol. 353, 326 [0005]
\bulletHUNT et al. Science,
1992, vol. 225, 1261 [0005] [0038]
\bulletRÖTZSCHKE; FALK.
Immunol. Today, 1991, vol. 12, 447 [0005]
\bulletSETTE et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1989, vol. 86, 3296 [0006]
\bulletSCHAEFFER et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1989, vol. 86, 4649 [0006]
\bullet DE BRUIJN et al. Eur. J.
Immunol., 1991, vol. 21, 2963-2970
[0006]
\bulletPAMER et al. Nature,
1991, vol. 353, 852-955 [0006]
\bullet Istocompatibility Testing.
DUPONT. Immunobiology of HLA.
Springer-Verlag, 1987, vol. 1
[0031]
\bulletHUNKAPILLER et al. Methods
Enzymol., 1983, vol. 91, 399 [0038]
\bulletSETTE et al. J.
Immunol., 1991, vol. 141, 3893 [0039]
\bulletTOWNSEND et al. Cell,
1990, vol. 62, 285 [0039]
\bulletMELIEF et al. Eur. J.
Immunol., 1991, vol. 21, 2963 [0039]
\bulletINABA et al. J. Exp.
Med., 1987, vol. 166, 182 [0040]
\bulletBOOG. Eur. J. Immunol,
1988, vol. 18, 219 [0040]
\bulletKÄRRE et al. Nature,
1986, vol. 319, 675 [0041]
\bulletLJUNGGREN et al. Eur. J.
Immunol., 1991, vol. 21, 2963-2970
[0041]
\bulletCERUNDOLO et al. Nature,
1990, vol. 345, 449-452 [0041]
\bulletSCHNEIDER. J. Embryol. Exp.
Morphol., 1927, vol. 27, 353-365
[0041]
\bulletMERRIFIELD. Science,
1986, vol. 232, 341-347 [0047]
\bulletBARANY; MERRIFIELD. The
Peptides. Academic Press, 1979, 1-284
[0047]
\bulletSTEWART; YOUNG;
ROCKFORD, III. Solid Phase Peptide Synthesis.
1984 [0047]
\bulletSPATOLA. Chemistry and
Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins.
1983, vol. VII [0052]
\bulletVERHOEF et al. Eur. J. Drug
Metab Pharmacokin., 1986, vol. 11,
291-302 [0053]
\bulletCatalogue of Cell Lines and
Hybridomas. 1988 [0054]
\bulletDERES et al. Nature,
1989, vol. 342, 561-564 [0058]
\bulletSTEWART; YOUNG. Solid
Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co, 1984
[0060]
\bulletSAMBROOK et al.
Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Press, 1982 [0061]
\bulletMATTEUCCI et al. J. Am.
Chem. Soc., 1981, vol. 103, 3185 [0062]
\bulletVITIELLO, A. et al. J. Clin.
Invest., 1995, vol. 95, 341 [0064]
\bulletELDRIDGE et al. Molec.
Immunol., 1991, vol. 28, 287-294
[0064]
\bulletALONSO et al. Vaccine,
1994, vol. 12, 299-306 [0064]
\bulletJONES et al. Vaccine,
1995, vol. 13, 675-681 [0064]
\bulletTAKAHASHI et al. Nature,
1990, vol. 344, 873-875 [0064]
\bulletHU et al. Clin Exp
Immunol., 1998, vol. 113, 235-243
[0064]
\bulletTARN. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 1988, vol. 85, 5409-5413
[0064]
\bulletTAM. J. Immunol.
Methods, 1996, vol. 196, 17-32 [0064]
\bulletPERKUS et al. Concepts in
vaccine development. 1996, 379 [0064]
\bulletCHAKRABARTI et al.
Nature, 1986, vol. 320, 535 [0064]
\bulletHU et al. Nature,
1986, vol. 320, 537 [0064]
Claims (25)
1. Péptido inmunogénico aislado constituido por
la secuencia de p53 SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 4).
2. Composición que comprende el péptido de la
reivindicación 1.
3. Composición de la reivindicación 2, que
comprende un péptido inmunogénico adicional que tiene un motivo de
unión específico de alelo, seleccionándose dicho péptido
inmunogénico del grupo constituido por los péptidos enumerados en
la Tabla 5 y la Tabla 10.
4. Composición de la reivindicación 2, en la
que el péptido inmunogénico está ligado a un péptido cooperador
T.
5. Composición de la reivindicación 2, que
comprende adicionalmente una molécula de PADRE.
6. Composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 2-5, que comprende adicionalmente
un lípido.
7. Composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 2-5, que comprende adicionalmente
un liposoma.
8. Composición de la reivindicación 2, en la que
dicho péptido está ligado a una molécula espaciadora.
9. Composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 2-5, que comprende adicionalmente
un portador.
10. Composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 2-5, que comprende adicionalmente
una célula presentadora de antígeno.
11. Ácido nucleico aislado que codifica el
péptido de la reivindicación 1.
12. Ácido nucleico aislado de la reivindicación
1, en el que dicho ácido nucleico codifica adicionalmente un
péptido inmunogénico que tiene un motivo de unión específico de
alelo HLA, seleccionándose dicho péptido inmunogénico del grupo
constituido por los péptidos enumerados en la Tabla 5 y la Tabla
10.
13. Ácido nucleico aislado de la reivindicación
11, en el que dicho ácido nucleico codifica adicionalmente un
péptido cooperador T.
14. Ácido nucleico aislado de la reivindicación
11, en el que dicho ácido nucleico codifica adicionalmente una
molécula de PADRE.
15. Ácido nucleico aislado de la reivindicación
12, que comprende un constructo minigénico que codifica el péptido
de la reivindicación 1 y que codifica adicionalmente un péptido
inmunogénico que tiene un motivo de unión específico de alelo HLA,
seleccionándose dicho péptido inmunogénico del grupo constituido por
los péptidos enumerados en la Tabla 5 y la Tabla 10.
16. Ácido nucleico aislado de la reivindicación
15, en el que dicho constructo minigénico comprende un epítopo de
linfocito T cooperador, una secuencia señal y/o una señal de
retención de retículo endoplasmático.
17. Un vector de expresión bicistrónico que
comprende el minigen de la reivindicación 15 y una secuencia que
codifica al menos una proteína o polipéptido incluido para potenciar
o reducir la inmunogenicidad.
18. Composición que comprende el ácido nucleico
de una cualquiera de las reivindicaciones 11-16 o el
vector de la reivindicación 17.
19. Composición de la reivindicación 18, que
comprende adicionalmente un lípido catiónico.
20. Composición de la reivindicación 18, que
comprende adicionalmente un portador.
21. Uso del péptido de la reivindicación 1 en la
fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento
de cáncer.
22. Uso según la reivindicación 21, en el que se
generan células CTL ex vivo usando dicho péptido en
combinación con células precursoras de CTL del paciente.
23. Uso del ácido nucleico de cualquiera de las
reivindicaciones 11-16 o del vector de la
reivindicación 18 en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento del cáncer.
24. Péptido según la reivindicación 1 para uso
en la prevención o el tratamiento del cáncer.
25. Ácido nucleico según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 16 o un vector según la reivindicación 17
para uso en la prevención o tratamiento del cáncer.
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US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
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US5279833A (en) | 1990-04-04 | 1994-01-18 | Yale University | Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells |
US5204253A (en) | 1990-05-29 | 1993-04-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method and apparatus for introducing biological substances into living cells |
US5972351A (en) * | 1992-04-03 | 1999-10-26 | Isis Innovation Limited | Plasmodium falciparum MHC class I-restricted CTL epitopes derived from pre-erythrocytic stage antigens |
ES2139012T3 (es) * | 1992-05-26 | 2000-02-01 | Univ Leiden | Peptidos de la proteina p53 humana destinados para ser utilizados en composiciones que inducen una reaccion en los linfocitos t humanos, y linfocitos t citotoxicos especificos de la proteina p53 humana. |
AU4528493A (en) | 1992-06-04 | 1994-01-04 | Regents Of The University Of California, The | In vivo gene therapy with intron-free sequence of interest |
EP0656788B1 (en) * | 1992-08-07 | 2006-10-18 | Pharmexa Inc. | Hla binding peptides and their uses |
KR960700739A (ko) * | 1993-03-05 | 1996-02-24 | 카린 이스텀 | Hla-a2. 1 결합 펩티드 및 그의 용도(hla-a2. 1 binding peptides and their uses) |
CN1135181A (zh) | 1993-09-14 | 1996-11-06 | Cytel有限公司 | 使用泛dr结合肽改变免疫应答 |
US5686068A (en) * | 1994-03-24 | 1997-11-11 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated peptides derived from MAGE-2, cytolytic T cells specific to complexes of peptide and HLA-A2 molecules, and uses thereof |
US6071890A (en) | 1994-12-09 | 2000-06-06 | Genzyme Corporation | Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy |
CA2207736A1 (en) * | 1994-12-14 | 1996-06-20 | The Scripps Research Institute | In vivo activation of tumor-specific cytotoxic t cells |
US5840839A (en) * | 1996-02-09 | 1998-11-24 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Alternative open reading frame DNA of a normal gene and a novel human cancer antigen encoded therein |
DE69723434T2 (de) * | 1996-04-26 | 2004-05-19 | Rijksuniversiteit Te Leiden | Verfahren zur selektion und produktion von t-zell-peptide epitope und vakzine mit diese epitope |
-
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