MXPA98007706A - Peptidos de union a locus a de leucocitos humanosy sus usos - Google Patents

Abstract

La presente invención provee composiciones de péptido capaz de unirse específicamente a alelos seleccionados de MHC a inducir activación de células T, en células T restringidas por el alelo de MHC;los péptidos sonútiles para evocar una respuesta inmune contra unantígeno deseado.

Description

PEPTIDOS DE UNION A LOCUS A DE LEUCOCITOS HUMANOS Y SUS USOS La presente sol citud es una continuación en parte de USSN 60/013,833» relacionada con USSN 08/589»107 y USSN 5 OB/451.913 y con USSN 08/347 »G10» que es una continuación en parte de USSN 08/159.339» continuación en parte de USSN 08/103,396» que es una continuación en parte de USSN 08/027» 746» a su vez continuación en parte de USSN 07/926»666. También está relacionada con USSN 08/186,266. Todas las 10 solicitudes anteriores se incorporan por referencia en la presente.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se ref ere a composiciones y V métodos para prevenir, tratar o diagnosticar varios estados r patológicos, tales como enfermedades virales y cánceres. En particular» provee péptidos novedosos capaces de unirse con moléculas seleccionadas del complejo de histocompat bi 1 idad mayor (MHC) e i ducir una respuesta inmune.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las moléculas del MHC se clasifican como moléculas clase I o clase II. Las moléculas de MHC clase II se expresan principalmente sobre células implicadas en la iniciación y sostenimiento de respuestas inmunes, tales como linfocitos T» linfocitos B» macrófagos y similares. Las moléculas de MHC clase II son reconocidas por linfocitos T auxiliares e inducen la proliferación de linfocitos T auxil ares y la amplif cación de la respuesta inmune hacia el péptido inmunogénico particular que se despliega. Las moléculas de MHC clase I se expresan en casi todas las células nucleadas y son reconocidas por l n ocitos T citotóxicos (CTL) que entonces destruyen a las células que llevan el antígeno. Los CTL son particularmente importantes en el rechazo de tumores y en el combate contra infecciones virales. Los CTL reconocen al antígeno en la forma de un fragmento de péptido unido a las moléculas MHC clase I, más bien que al antígeno extraño intacto por si solo. El antígeno deber ser normalmente sintetizado endógenamente por la célula» y una porción la proteína antigénica es degradada en fragmentos pequeños de péptido en el citoplasma. Algunos de estos péptidos pequeños se trasladan hacia un compartimiento pre-Qolgi» e interaccionan con cadenas pesadas clase I para facilitar el pliegue y la asociación apropiados con la subunidad (32 de microglobul ina. Entonces el complejo péptido-MHC clase I es dirigido hacia la superficie celular para expresión y reconocimiento potencial por CTL específicos. Las investigaciones de la estructura de cristal de la molécula de MHC clase I humana, HLA-A2.1» indican que se crea una ranura de unión de péptido mediante el pliegue de los dominios al y 2 de la cadena pesada clase I (BjorKman y otros., Nature 329:506 (1987). Sin embargo, en estas investigaciones no fue determinada la identidad de los péptidos enlazados a la ranura. Buss y otros, Science 242:1065 (1988) describieron primero un método para elución acida de péptidos unidos al MHC. Subsecuentemente, Ra mensee y sus colaboradores (Falk y otros.» Nature 351:290 (1991) han desarrollado un enfoque para caracterizar péptidos procesados naturalmente. unidos a moléculas clase I. Otros i vestigadores han logrado acertadamente dirigir la secuenciación de aminoácidos de los péptidos más abundantes en varias fracciones de HPLC mediante secuenciación automática convencional de péptidos eluidos de moléculas clase I del tipo B (JardetzKy, y otros., Nature 353:326 (1991) y del tipo A2.1» por medio de espectrometría de masas (Hunt. y otros.» Science 225:1261 (1992). Ha sido presentada una revisión de la caracterización de péptidos procesados naturalmente en MHC clase I» por parte de Rbtzschke y FalK (Rbtzschke y FalK» I unol » Today 12:447 (1991). Sette y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:3296 (1989) mostraron que pueden usarse motivos específicos de alelo de MHC para predec la capacidad de unión a MHC. Schaeffer y otros., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:4649 (1989) mostraron que la unión a MHC estaba relacionada con la inmunogenicí ad. Varios autores (De Bruijin y otros, Eur. J. Im unol . » 21:2963-2970 (1991); Pamer y otros., 991 Nature 353:952-955 (1991)) han provisto evidencia preliminar de que motivos de unión de clase I pueden aplicarse a la identificación de peptidos inmunogénicos potenciales en modelos de animal. Aun no se han descrito motivos de clase I específicos para varios alelos de humano de un isotipo dado de clase I. Es conveniente que las frecuencias combinadas de estos alelos diferentes deban ser lo suficientemente altas para cubir una gran fracción» o quizás la mayor parte, de la población humana de razas mixtas. A pesar de los desarrollos en la técnica, la técnica anterior aún no ha provisto una vacuna ni agente terapéutico a base de péptidos que sea útil para el humano, en base a este trabajo. La presente invención provee estas y otras ventajas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee péptidos inmunogénicos que tienen motivos de unión a moléculas de MHC clase I. Los péptidos inmunogénicos son típicamente de entre aproximadamente 8 y apro imadamente 11 residuos» y comprenden residuos conservados implicados en proteínas de unión codificadas por el alelo de MHC apropiado. Se han identificado varios motivos específicos de alelo. Por ejemplo, el motivo para HLA-A3.2 comprende del extremo N al extremo C, un primer residuo conservado de L, M, I, V, S, A, T y F en la posición 2 y un segundo residuo conservado de K» R o Y en el extremo C-ter i al. Otros primeros residuos conservados son C, G o D y alternativamente E. Otros segundos residuos conservados son H o F. El primero y segundo residuos conservados están separados preferiblemente por 6 a 7 residuos. El motivo para HLA—Al comprende del extremo N al extremo C un primer residuo conservado de T» S o M, un segundo residuo conservado de D o E, y un tercer residuo conservado de Y. Otros segundos residuos conservados son A, S o T. El primero y segundo residuo conservados son adyacentes y están separados prefe lemente del tercer residuo conservado por 6 a 7 residuos. Un segundo motivo consiste de un primer residuo conservado de E o D, y un segundo residuo conservado de Y, en donde el primero y segundo residuos conservados están separados por 5 a 6 residuos. El motivo para HLA—All comprende del extremo N al extremo C, un primer residuo conservado de T o V en la posición 2 y un residuo conservado C—terminal de K, El primero y segundo residuos conservados de preferencia están separados por 6 o 7 residuos. El motivo para HLA-A24.1 comprende del extremo N al extremo C, un primer residuo conservado de Y, F o W en la posición 2 y un residuo conservado C—terminal de F» I, W» M o L. El primero y segundo residuos conservados están separados preferi lemente por 6 a 7 residuos. De esta forma, se pueden identificar epítopes sobre un número de proteínas blanco potenciales. Los péptidos pueden prepararse en base a secuencias de proteínas antigénicas provenientes de patógenos (por ejemplo, patógenos virales» patógenos fungióos» patógenos bacterianos» patógenos de protozoarios» y similares)» o de antígenos asociados con cáncer. Los ejemplos de antígenos adecuados incluyen antígeno específico de próstata (PSA)» antígenos de superficie y de núcleo de hepatitis B (HAVc, HBVs ) , antígenos de hepatitis C, antígeno de melanoma mal gno (MAGE-1), antígeno del virus Epstein—Barr , y antígenos de virus de inmunode iciencia humana tipo 1 (HIV1) y del virus de papiloma. Los péptidos, o ácidos nucleicos que los codifican» son útiles en composiciones farmacéuticas para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas tanto i vi o como ex v vo.

Definiciones El término "péptido" se usa i tercambiablemente con "ol gopéptido" en la presente especificación para designar una serie de residuos, típicamente L—am oácidos, unidos uno al otro típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-a no y carbonilo de aminoácidos adyacentes. Los ol gopéptidos de la invención son de menos de aproximadamente residuos de longitud y usualmente consisten de entre aproximadamente 9 y aprox adamente 11, de preferencia 9 o 10 residuos. Un "péptido i unogénico" es un péptido que comprende un motivo o supermotivo específico de alelo, de tal manera que el péptido se unirá a una molécula de MHC e inducirá una respuesta de CTL. Asi, los peptidos inmunogenicos de la invención son capaces de unirse a una molécula apropiada de MHC clase I, e inducir una repuesta de células T c totó icas contra el antígeno del cual se deriva el péptido inmunogém'co. La relación entre la afinidad de unión a moléculas de MHC clase I y la i munogen cidad de epítopes discretos de péptido ha sido analizada en dos diferentes enfoques experimentales (Sette y otros, J. I munol . , 153:5586-5592 (1994)). En el primer enfoque, se analizó la inmunogenicidad de epítopes potenciales que varían en afinidad de unión a MHC sobre una escala de 10,000 veces en ratones transgénicos HLA-A*0201. En el segundo enfoque, se determinó la antigenicidad de aproximadamente lOO diferentes epítopes potenciales derivados del virus de la hepatitis B (HBV), llevando todos ellos motivos de unión A 02Q1, util zando PBL de pacientes con hepatitis aguda. En ambos casos, se encontró que un umbral de afinidad de aproximadamente 500 nM (de preferencia 500 nM o menos) determina la capacidad de un epítope de péptido para evocar una. respuesta de CTL. Estos datos se correlación bien con las mediciones de afinidad de unión de la clase I, ya sea de péptidos procesados naturalmente o de los epítopes de células T previamente descritos. Estos datos indican la importante función de la selección de determinantes en la conformación de respuestas de células T. Un "residuo conservado" es un aminoácido que se presenta en una frecuencia significativamente más alta de la que podría esperarse por distribución aleatoria en una posición particular en un motivo de péptido. Típicamente, un residuo conservado es uno en el cual el péptido in unogénico puede proveer un punto de contacto con la molécula de MHC. De 1 a 3, preferiblemente 2, residuos conservados dentro de un péptido de longitud definida, definen un motivo para un péptido inmunogénico. Estos residuos están típicamente en estrecho contacto con la ranura de unión de péptido, con sus cadenas laterales enterradas en cavidades específicas de la ranura misma. Típicamente, un péptido inmunogénico comprenderá hasta 3 residuos conservados, más usualmente 2 residuos conservados. Como se usa en la presente, "residuos negativos de unión" son aminoácidos que si están presentes en ciertas posiciones, darán como resultado un péptido que es un no enlazador o un enlazador deficiente, y a su vez no inducirá una respuesta de CTL a pesar de la presencia de los residuos conservados apropiados dentro del péptido. El término "motivo" se refiere al patrón de residuos en un péptido de longitud definida, usualmente de alrededor de 8 a aproximadamente 11 aminoácidos, que es reconocido por un alalo particular de MHC. Los motivos de péptido son típicamente diferentes para cada alelo del MHC humano y difieren en el patrón de los residuos altamente conservados. El motivo de unión para un alelo puede definirse con grados crecientes de precisión. En un caso, todos los residuos conservados están presentes en las posiciones correctas en un peptido y no hay presentes residuos negativos de unión. Las frases "aislado" o "biológicamente puro" se refieren a material que está substancialmente o esencialmente libre de los componentes que normalmente son acompañantes como se encuentra en su estado natural. De esta manera» los péptidos de esta invención no contienen materiales asociados normalmente con su medio ±n situ» por ejemplo» moléculas I de MHC sobre células que presentan el antígeno. Aun cuando una proteína ha sido aislada hasta una banda homogénea o dominante» existen trazas de contami antes en la escala de 5 a 1054 de proteína natural que se purifican junto con la proteína deseada. Los péptidos aislados de esta invención no contienen esta proteína endógena purificada conjuntamente. El término "residuo" se refiere a un aminoácido o un imitador de aminoácido incorporado en un oligopéptido por medio de un enlace amido o enlace similar a amido.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención se refiere a la determinación de motivos de péptido específicos de alelo» para subtipos de alelos humanos de MHC clase I (algunas veces referidos como locus A de leucocitos humanos» "HLA"). Estos motivos se usan para definir epítopes de células T de cualquier antígeno deseado» particularmente los asociados con enfermedades virales humanas» cánceres o enfermedades autoinmunes, para los cuales lO se conoce la secuencia de aminoácidos de los blancos potenciales de antígeno o autoantígeno. De esta manera pueden identificarse epítopes de varias proteínas blanco potenciales. Los ejemplos de antígenos adecuados incluyen antígeno específico de próstata (PSA), antígenos de superficie y de núcleo de hepatitis B (HBVc, HBVs), antígeno de hepatitis C, antígenos del virus Epstein-Barr, antígenos de melanoma (v.gr. MAGE—1) , antígenos del virus de inmunodefi ciencia humana (VIH) y antígenos del virus de pap loma humano (HPV). Los trastornos autoin unes asociados, para los cuales puede emplearse los péptidos de la invención para aliviar los síntomas y tratar o prevenir la ocurrencia o recurrencia, incluyen por ejemplo esclerosis múltiple (MS), artritis reumatoide (RA), síndrome de Sjogren, escleroderma, pol imiositis, dermato iosi tis, lupus eritematoso general, artritis reumatoide juvenil, espondilitis anquilosante, iastemia gravis (MG)» pénfigo buloso (anticuerpos contra la membrana basa! en la unión de dermis-epidermis), pénfigo (anticuerpos contra el complejo de proteína y ucopol isacárido o substancia de cemento intracelular), glomerulonefri tis (anticuerpos contra la membrana basal glomerular), síndrome de Goodpasture» anemia hemolítica autoinmune (anticuerpos contra eritroci os), enfermedad de Hashimoto (anticuerpos contra la tiroides), anemia perniciosa (anticuerpos contra el factor intrínseco)» púrpura tromboc topén ca idiopát?ca (anticuerpos contra plaquetas)» enfermedad de Grave» y enfermedad de Addison (anticuerpos contra tiroglobul ina) » y similares. Se han identificado los autoantígenos asociados con varias de estas enfermedades. Por ejemplo» en enfermedades autoin unes inducidas experimental ente» se han caracterizado antígenos implicados en la patogénesis: en artritis de rata y ratón es identificado colágeno natural tipo II en artritis inducida por colágeno» y proteína de choque cardiaco micobacteriano en artritis adyuvante; se ha identificado tiroglobul ina en tiroiditis alérgica experimental (EAT) en ratón; receptor de aceti Icol na (AChR) en iastenia gravis alérgica experimental (EAMG); y proteína básica de miel ina (MBP) y proteína proteo! ípida (PLP) en encefal o iel i tis alérgica experimental (EAE) en ratón y rata. Además, se han identificado antígenos blanco en humanos: colágeno tipo II en artritis reumatoide humana; y receptor de acetilcolina en miastenia gravis. Sin desear limitarse por teoría, se cree que la presentación de antígeno por HLA clase I, media la supresión de células T autorreacti vas por células T supresaras CD8+ (véase v.gr., Jiang y otros» Science 256:1213 (1992)). Dichas células T supresoras liberan citocinas tales como el factor beta de crecimiento de transformación (TGF-ß), que inhibe específicamente las células T autorreacti vas. Miller y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:421-425 (1992). Se sintetizan péptidos que comprenden los epítopes de estos antigenos, y después se prueban para determinar su capacidad de unión a las moléculas de MHC apropiadas en análisis que utilizan, por ejemplo, moléculas clase I purificadas y péptidos radioyodados y/o células que expresan moléculas vacías en clase I, por ejemplo, tinción inmunof luorescente y microfluoro etría de flujo, pruebas de ensamble de clase I dependientes de péptido» e inhibición del reconocimiento de CTL por competencia de péptido. Aquéllos péptidos que se unen a la molécula clase I son evaluados adicionalmente para determinar su capacidad para servir como blancos para CTL derivados de individuos infectados o inmunizados» así como para determinar su capacidad para inducir respuestas primarias de CTL in vitro o in vivo que puedan producir poblaciones de CTL capaces de reaccionar con células blanco infectadas viralmente o células de tumor, como agentes terapéuticos potenciales. Los antígenos de MHC clase I son codificados por los locus HLA-A, B, y C. Los antígenos de HLA—A y B son expresados en la superficie de la célula a densidades aproximadamente iguales, mientras que la expresión de HLA-C es significativamente inferior (probablemente hasta 10 veces inferior). Cada uno de estos locus tiene un número de alelos. Los motivos de unión de péptidos de la invención son relativamente específicos para cada subtipo de alelo. Para vacunas basadas en péptidos» los péptidos de la presente invención comprenden de preferencia un motivo reconocido por una molécula MHC I que tiene una amplia distribución en la población humana. Puesto que los alelos de MHC están presentes en frecuencias diferentes dentro de diferentes grupos étnicos y razas, la elección del alelo de MHC blanco puede depender de la población blanco. El cuadro I muestra la secuencia de varios alelos en los productos del locus HLA-A entre diferentes razas. Por ejemplo, la mayoría de la población caucásica puede ser cubierta por péptidos que se unan a cuatro subtipos del alelo HLA-A, específicamente HLA-A2.1, Al, A3.2, y A24.1. De manera similar, la mayoría de la población asiática es abarcada con la adición de péptidos que se unan a un quinto alelo HLA-A11.2.

CUADRO 1 Alelo A/Subtipo N(69)* A(54) C(502) Al 10.1(7) 1.8(1) 27.4(133) A2.1 11.5(8) 37.0 ( 20 ) 39.8 ( 199 ) A2.2 10.1(7) 0 3.3(17) A2.3 1.4(1) 5.5(3) O.8(4) A2.4 A2.5 A3.1 1.4(1) O 0.2(0) A3.2 5.7(4) 5.5(3) 21.5(108) All.l O 5.5(3) 0 All.2 5.7(4) 31.4(17) 8.7(44) CUADRO 1 (CONTINUACIÓN) All.3 O 3.7(2) O A23 4.3(3) - 3.9(20) A24 2.9(2) 27.7(15) 15.3(77) A24.2 - - A24.3 - A25 1.4(1) - 6.9(35) A26.1 4.3(3) 9.2(5) 5.9(30) A26.2 7.2(5) - 1.0(5) A26V - 3.7(2) - A28.1 10.1(7) - 1.6(8) A28.2 1.4(1) - 7.5(38) A29.1 1.4(1) - 1.4(7) A29.2 10.1(7) 1.8(1) 5.3(27) A30.1 8.6(6) - 4.9(25) A30.2 1.4(1) - 0.2(1) A30.3 7.2(5) - 3.9(20) A31 4.3(3) 7.4(4) 6.9(35) A32 2.B(2) - 7.1(36) AW33.1 8.6(6) - 2.5(13) A 33.2 2.8(2) 16.6(9) 1.2(6) A 34.1 1.4(1) AW34.2 14.5(10) - 0.8(4) A 36 5.9(4) Cuadro compilado de B. DuPont, I munobiology of HLA, Vol. I» Histoco patibil i ty Testing 19878» Springer—Verlag» New York 1989. *N - Negroide; A = Asiático; C = Caucásico. Los números entre paréntesis representan el número de individuos incluidos en el análisis.

La nomenclatura usada para describir compuestos de péptido sigue la práctica convencional» en la que el grupo amino es presentado a la izquierda (el extremo N) y el grupo carboxilo a la derecha (el extremo O de cada residuo de aminoácido. En las fórmulas que representan modalidades específicas seleccionadas de la presente invención, los grupos terminales amino y carbox lo, aunque no se muestra específicamente, están en la forma que asumirían a valores de pH fisiológico, a menos que se especifique de otra manera. En las fórmulas de estructura de aminoácido, cada residuo está representado generalmente por designaciones estándar de tres letras o de una sola letra. La forma L de un residuo de aminoácido está representado por una sola letra mayúscula o una primera letra mayúscula de un símbolo de tres letras, y la forma D- para aquellos aminoácidos que tienen formas D, está representada por una sola letra minúscula o un símbolo de tres letras minúsculas. La glicina no tiene átomo de carbono • asimétrico y es referida simplemente como "Gly" o G. Los procedimientos usados para identificar los pep idos de la presente invención, por lo general siguen los métodos descritos en FalK y otros, Nature 351:290 (1991), que se incorporan en la presente por referencia. Brevemente, los métodos incluyen aislamiento a gran escala de moléculas MHC clase I, típicamente por medio de in unoprecipi tación o cromatografía de afinidad» a partir de la célula o línea celular apropiada. Ejemplos de otros métodos de aislamiento de la molécula de MHC deseada» igualmente conocidos para el técnico» incluyen cromatografía de intercambio iónico. cromatografía de lectina» exclusión de tamaño» cromatografía de ligando de alto rendimiento» y una combinación de todas las técnica anteriores. Se conoce y se tiene fácilmente disponible un gran número de células con moléculas definidas de MHC» particularmente moléculas de MHC clase I. Por ejemplo» se ha visto que las líneas de células B humanas transformadas con EBV, son excelentes fuentes para el aislamiento preparativo de moléculas de MHC clase I y clase II. Se tienen disponibles líneas de células bien caracterizadas, de fuentes privadas y comerciales, tales como American Type Cultre Collection ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas," 6a- edición (1988) RocKville, Maryland, E.U.A.); National Institute of General Medical Sciences 1990/1991 Catalog of Cell Lines (NIGMS) Human Genetic Mutant Cell Repository, Camden, New Jersey E.U.A.); y ASHI Repository, Bingham and Women's Hospital, 75 Francis Street, Boston, Massachusetts 02115, E.U.A.. El cuadro 2 lista algunas líneas de células B adecuadas para usarse co o fuentes de alelos HLA-A. Todas estas líneas de células pueden desarrollarse en grandes lotes y por lo tanto son útiles para la producción a gran escala de moléculas de MHC. Un experto reconocerá que estas son solamente líneas de células ejemplares y que pueden emplearse muchas otras fuentes de células. Líneas sim lares de células B EBV homoc góticas para HLA-B y HLA-C, pueden servir como fuentes de alelos HLA-B y HLA-C, respecti va ente .

CUADRO 2 LINEAS CELULARES HUMANAS (FUENTES DE HLA-A) Alelo HLA-A Linea de c lulas Al MAT COX (9022) STEINLIN (9087) A2.1 JY A3.2 EHM (9080) H03O1 (9055)GM3107 A24.1 KT3(9017),TISI (9042) All BVR (GM682SA) WT100 (GM8602)WT52 (GM8603) En el caso típico, se usa i unoprecipi tacion para aislar el alelo deseado. Puede usarse varios protocolos, dependiendo de la especi icidad de los anticuerpos usados. Por ejemplo» pueden usarse reactivos de mAb específicos de alelo para la purificación por afinidad de las moléculas de HLA-A» HLA-B y HLA-C. Se tienen disponibles varios reactivos de mAb para el aislamiento de moléculas HLA-A (cuadro 3). De esta manera» para cada uno de los alelos de HLA-A blanco» se tienen reactivos disponibles que pueden usarse para el aislamiento directo de moléculas de HLA-A. Se usan» con buen éxito, las columnas de afinidad preparadas con estos Abs utilizando técnicas estándar, para purificar los respectivos productos del alelo HLA-A. Además de los mAbs específicos de alelo, pueden usarse mAbs anti-HLA-A, B, C, ampliamente reactivos» tales como W6/32 y B9.12.1, y un mAb ant -HLA-A-B»C,B1.23.2» en protocolos de purificación de afinidad al ernativos, como se describe en la sección de ejemplo más adelante.

CUADRO 3 REACTIVOS DE ANTICUERPO anti-HLA Nombre HLA-A1 12/18 HLA-A3 GAPA3 (ATCC, HB122) HLA-11,24.1 A11.1M (ATCC.HB164) HLA-A,B,C 6/32 (ATCC, HB95) ono órf i co B9.12.1 (INSERM-CNRS) CUADRO 3 (CONTINUACIÓN) HLA-B,C B.1.23.2 ( INSERM-CNRS ) momonórfico Los péptidos unidos a la ranura de unión de péptido de las moléculas de MHC aisladas, son eluidos típicamente usando tratamiento con ácido. También pueden disociarse los péptidos de las moléculas clase I mediante una variedad de medios desnatural zantes estándar tales como calor, pH, detergentes, sales, agentes caotrópicos, o una combinación de los mismos. Las fracciones de péptido se separan adicionalmente de las moléculas de MHC mediante cromatograf a de líquidos de alto rendimiento (CLAR) de fase inversa y se determina su secuencia. Los péptidos pueden separarse mediante una variedad de otros medios estándar bien conocidos par el técnico, incluyendo filtración, ul trafi 1 ración, electrofóresis, cromatogra ía de tamaño, precipitación con anticuerpos específicos, cromatogra ía de intercambio iónico, isoelectroenfoque y similares. La secuenciación de los péptidos aislados puede realizarse de acuerdo con las técnicas estándar tales como degradación de Edman (Hunkapi 1 le , M. ., y otros, Methods Enzymol , 91, 399 C1993D). Otros métodos adecuados para secuenciación incluyen secuenciación de espectrometría de masas de péptidos individuales, como se describió anteriormente (Hunt, y otros, Science 225:1261 (1992), que se incorpora en la presente como referencia. La secuenciación de aminoácidos de péptidos heterogéneos voluminosos (por ejemplo fracciones recolectadas de CLAR) de diferentes moléculas clase I, revela típicamente un motivo de secuencia característico para cada alelo de clase I. La definición de motivos específicos para diferentes alelos de clase I, permite la identi icación de epítopes potenciales de péptido de una proteína antigénica cuya secuencia de aminoácidos se conoce. Típicamente, la identificación de epítopes potenciales de péptido se lleva a cabo inicialmente usando una computadora para escudriñar la secuencia de aminoácidos de un antígeno deseado en relación a la presencia de motivos. Entonces se sintetizan secuencias epitópicas. La capacidad de unirse a moléculas MHC clase I se mide en una variedad de formas diferentes. Un medio es una prueba de unión molecular clase I, como se describe por ejemplo en las Solicitudes relacionadas» indicadas anteriormente. Otras alternativas descritas en la literatura incluyen inhibición de presentación de antígeno (Sette y otros.» J. Immunol , 141:3893 819919, pruebas de ensamble in vitro ((Townsend y otros.» Cell 62:285 (1990) y pruebas a base de FACS usando células mutadas, tales como RMA.S (Melief, y otros., Eur. J. Inmmunol . 21:2963 C19913) . Después, los péptidos que resultaron positivos en la prueba de unión a MHC clase I, se prueban para determinar la capacidad de los peptidos para inducir respuestas especificas de CTL in vitro. Por ejemplo, pueden analizarse células que presentan antígeno que han sido incubadas con un péptido, para determinar la capacidad de inducir respuestas de CTL en poblaciones de células respondedoras. Las células que presentan antígeno pueden ser células normales tales como las células mononucleares de sangre periférica o células dendríticas ( Inaba y otros, J. Exp. Med.. 166:182 (1987); Boog, Eur. J. In ol . 18:219 C1988D). Alternativamente, se usan convenientemente líneas celulares mutantes de mamífero que son deficientes en su capacidad para cargar moléculas clase I con péptidos procesados internamente, tales como las líneas de células de ratón RMA-S * (Karre y otros» Nature» 319:675 (1986); Ljunggren y otros» Eur. J. Inmmol. 21:2963-2970 (1991)). y el hibridoma de células T somático humano, T-2 (Cerundolo y otros» Nature 345:449-452 (1990)), que han sido transfectadas con los genes apropiados de clase I humana, cuando el péptido se agrega a ellas, para probar la capacidad del péptido para inducir respuestas primarias de CTL in vitro. Otras líneas de células eucarióticas que pueden usase incluyen varias líneas de células de insecto tales como larvas de mosquito (líneas de células ATCC CC1 125, 126, 1660, 1591, 6585, 6586), de gusano de seda (ATCC CRL 8851)» de gusano de esci aria (ATCC CRL 1711)» polilla (ATCC CCL 80) y líneas de células de Drosophi la » tal como una línea de células Schneider (véase Schneider J. Embryol » Exp. Morphol » 27:353-365 C19273). Esas han sido transfectadas con los genes apropiados que codifican el alelo de MHC clase I y los genes de microglobul ina B2 humana. Los linfocitos de sangre periférica se aislan convenientemente después de venipunción simple o leucaferesis de donadores normales o pacientes y se usan como las fuentes de células respondedoras de precursores de CTL. En una modalidad» las células apropiadas que presentan antígeno se incuban con 10-100 µM de péptido en medio libre del suero durante 4 horas bajo condiciones de cultivo apropiadas. Las células que presentan antígeno cargadas con el péptido se incuban después con las poblaciones de células respondedoras in vitro durante 7 a 10 días bajo condiciones de cultivo optimizadas. La activación positiva de CTL puede determinarse probando los cultivos para determinar la presencia de CTL que destruyen a células blanco radio arcadas» tanto blancos impulsados por péptidos específicos como células blanco que expresan la forma endógenamente procesada del antígeno relevante de virus o tumor a partir de la cual se deriva la secuencia del péptido. La especificidad y restricción de MHC de los CTL se determina probando contra diferentes células blanco de péptido que expresan MHC clase I humana apropiadas o i apropiadas. Los péptidos que resultan positivos en las pruebas de unión de MHC y producen respuestas específicas de CTL, son referidos en la presente como péptidos inmunogénicos. Los péptidos inmunogénicos pueden prepararse sintéticamente, o por medio de tecnología de ADN recombinante, o a partir de fuentes naturales tales como virus completos o tumores. Aunque el péptido preferiblemente estará substancialmente libre de otras proteínas y fragmentos de proteínas de la célula huésped que se presentan naturalmente» en algunas modalidades los péptidos pueden ser conjugados sintéticamente con fragmentos o partículas naturales. Los polipéptidos o péptidos pueden ser de una variedad de longitudes, ya sea en sus formas neutras (sin carga) o en formas que son sales, y libres de modificaciones tales como glicosilación» oxidación de cadena lateral o fosforilación, o bien conteniendo estas modificaciones» siempre que la modificación no destruya la actividad biológica de los polipéptidos como se describe en la presente. Convenientemente» el péptido será tan pequeño como sea posible» mientras que mantenga substancialmente toda la actividad biológica del péptido grande. Cuando sea posible» puede ser conveniente optimizar los péptidos de la invención hasta una longitud de 9 a 10 residuos de aminoácidos» conmensuradamente en tamaño con pépt?dos virales procesados endógenamente o péptidos de células de tumor que se unen a moléculas de MHC clase I sobre la superficie de la célula. Los péptidos que tienen la actividad deseada pueden modificarse conforme sea necesario para proveer ciertos atributos deseados» por ejemplo, características farmacológicas mejoradas» siempre que aumente o por lo menos retenga substancialmente toda la actividad biológica del peptido no modificado para unirse a la molécula de MHC deseada y activar la célula T apropiada. Por ejemplo» los péptidos pueden ser sometidos a varios cambios» tales como substituciones» ya sea conservativas o no conservativas» en donde dichos cambios pueden proveer ciertas ventajas en su uso» tal como unión mejorada de MHC. Por substituciones conservati as se entiende el reemplazo de un residuo de aminoácido con otro que es biológicamente y/o químicamente sim lar, por ejemplo, un residuo hidrofóbico por otro» o un residuo polar por otro. Las substituciones incluyen combinaciones tales como Gly, Ala; Val, lie, Leu» Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. El efecto de subst tuciones de un solo aminoácido puede ser sondeado también util zando D-aminoácidos. Dichas modificaciones pueden hacerse usando procedimientos bien conocidos de síntesis de péptidos, como se describe por ejemplo en Merr field» Science 232:341-347 (19SS). Barany y Merrifield» The peptides. Gross y Meienhofer, eds. (N.Y. Academic Press) p. 1-284 (1979); y Stewart y Young» Sol id Phase Peptide Synthesis» (Rockford» Illinois, Pierce)» 2§ Ed. (1984)» incorporadas aquí por referencia. Los péptidos también pueden ser modificados extendiendo o reduciendo la secuencia de aminoácidos del compuesto» por ejemplo» mediante la adición o supresión de aminoácidos. Los péptidos o análogos de la invención también pueden ser modificados alterando el orden o composición de ciertos residuos» apreciándose fácilmente que ciertos residuos aminoácidos esenciales para la actividad biológica» por ejemplo» aquellos en los sitios de contacto críticos o residuos conservados» no pueden ser alterados generalmente sin un efecto adverso sobre la actividad biológica. Los aminoácidos no críticos no necesitan ser limitados a los que ocurren naturalmente en las proteínas» tales como L—oc—aminoácidos» o sus isómeros D— » pero pueden incluir también aminoácidos no naturales» tales como ß— —<_$—aminoácidos » así como muchos derivados de L—a—a i oácidos. Típicamente» se emplea una serie de péptidos con substituciones de un solo aminoácido para determinar el efecto de la carga electrostática» carácter hidrofóbico, etc., sobre la unión. Por ejemplo» se hace una serie de substi uciones de aminoácidos cargados positivamente (v.gr.» Lys o Arg) o cargados negativamente (v.gr.» Glu) a lo largo de la longitud del péptido» revelando diferentes patrones de sensibilidad hacia varias moléculas MHC y receptores de células T. Además» puede emplearse substituciones múltiples usando entidades pequeñas relativamente neutras tales como Ala» Gly. Pro. o residuos similares. Las substi uciones pueden ser de homo— oligómeros o hetero-ol i gomeros. El número y tipos de residuos que son substituidos o agregados depende de la separación necesaria entre los puntos de contacto esenciales y ciertos atributos funcionales que se buscan (por ejemplo carácter hidrofóbico contra carácter hidrofílico). La afinidad de unión incrementada para una molécula de MHC o un receptor de células T puede lograrse también mediante tales substituciones» en comparación con la afinidad del péptido original. En cualquier caso, dichas substituciones deben emplear residuos de aminoácidos u otros fragmentos moleculares elegidos para evitar, por ejemplo, interferencia estérica y de carga que pudiera romper el enlace. Las subst uciones de aminoácidos son típicamente de residuos indi iduales. Pueden combinarse substituciones, supresiones, inserciones o cualquier combinación de las mismas para llegar a un péptido final. Las variantes substi tucionales son aquellas en las cuales por lo menos un residuo de un péptido ha sido removido y un residuo diferente ha sido insertado en su lugar. Dichas subst uciones generalmente se hacen de conformidad con el siguiente Cuadro 4, cuando se desea modular finamente las características del péptido.

CUADRO 4 Residuo Original Substitución Ejemplar Ala Ser Arg Lys Asn G1 n; His Asp Glu Cys Ser G n Asn CUADRO 4 (CONTINUACIÓN) Glu Asp Gly Pro His Asn; Gln He Leu; Val Leu lie; Val Lys Arg Met Leu; He Phe Met; Leu; Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp; Phe Val lie; Leu Pueden hacerse cambios substanciales en función (por ejemplo» afinidad por moléculas de MHC o receptores de células T)» seleccionando substituciones que son menos conservativas que las del Cuadro 4» es decir» seleccionando residuos que difieran más signi icativamente en su efecto en el mantenimiento (a) de la estructura del esqueleto del péptido en el área de substitución» por ejemplo como una conformación laminar o helicoidal» (b) la carga o carácter hidrofóbico de la molécula en el sitio blanco o (c) el volumen de la cadena lateral . Las substituciones que en general se espera que produzcan los cambios mayores en las propiedades del peptido. serán aquellas en las cuales (a) un residuo hidrofílico» por ejemplo serilo» substituya a (o sea substituido por) un residuo hidrofóbico, por ejemplo leucilo, isoleucilo, feni lalam" lo, valilo o alanilo; (b) un residuo que tiene una cadena lateral electroposi iva» por ejemplo, lis lo, argi ilo, o histidilo, substituya a (o sea substituido por) un residuo electronegativo, por ejemplo glutamilo o aspartilo; o (c) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, feni lalam" na, substituya a (o sea substituido por) uno que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina. Los péptidos también pueden comprender i sesteros de dos o más residuos en el péptido nmunogénico. Un i sestero como se define en la presente, es una secuencia de dos o más residuos de aminoácidos que pueden substituir a una segunda secuencia, porque la conformación estérica de la primera secuencia se ajusta a un sitio de unión específico para la segunda secuencia. El término incluye específicamente modificaciones en el esqueleto del péptido bien conocidas para el experto en la materia. Tales modi icaciones incluyen modificaciones en el nitrógeno de amida, el carbono a, amidacarbo i lo, reemplazo completo del enlace amido, extensiones, supresiones o entrelazamientos del esqueleto. Ver» en general» Spatola» Chemistry and Biochemistry of Amino Acids» Peptides and Protein» Vol. VII (Weinstein ed. » 1983). Las modificaciones de péptidos con varios imitadores de aminoácidos o aminoácidos no naturales» son particularmente útiles para aumentar la estabilidad del péptido ±n vivo. La estabil dad puede determinarse en diferentes formas. Por ejemplo» se han usado peptidasas y varios medios biológicos tales como plasma y suero humano para probar la estabilidad. Ver» por ejemplo» Verhoef y otros. Eur. J. Drug Metab. Pharmacoki 11:291—302 (19BS). La vida media de los péptidos de la presente invención se determina convenientemente utilizando una prueba con suero humano al 255í (v/v). En términos generales, el protocolo es como sigue. Suero humano recolectado (tipo AB, no inactivado con calor) es des! ipidizado mediante centrifugación antes de su uso. Después» el suero se diluye hasta 2554 con medio de cultivo de tejidos RPMI» y se utiliza para probar la estabil dad del pépt do. A intervalos predetermi ados» se retira una pequeña cantidad de la solución de reacción y se agrega a ácido tricloroacético acuoso al 6% o bien a etanol . La muestra de reacción turbia se enfría (4°C) durante 15 minutos y después se hace girar para hacer pella las proteínas séricas precipitadas. Después se determina la presencia de los péptidos mediante HPLC de fase inversa usando condiciones de cromatografía específicas para estabilidad. Los péptidos de la presente invención o análogos de los mismos que tienen actividad estimuladora de CTL, pueden ser modificados para proveer atributos deseados» aparte del mejoramiento de la vida media en suero. Por ejemplo» puede incrementarse la capacidad de los péptidos para inducir actividad de CTL mediante su unión a una secuencia que contiene por lo menos un epítope que es capaz de inducir una respuesta de células T auxiliares. Los conjugados inmunogénicos particularmente preferidos de péptidos/auxi 1 iares T están ligados por una molécula separadora. El separador está comprendido típicamente de moléculas neutras relativamente pequeñas» tales como aminoácidos o imitadores de aminoácidos» que substancialmente no tiene carga bajo condiciones f siol gicas. Los separadores se seleccionan típicamente de, por ejemplo, Ala; Gly, u otros separadores neutros de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutros. Se entenderá que el separador presente opcionalmente no necesita estar comprendido de los mismos residuos y por lo tanto puede ser un hetero—ol i gomero o un ho o-ol igomero. Cuando está presente, el separador será usualmente de por lo menos uno o dos residuos, usualmente tres a seis residuos. Alternativamente, el péptido de CTL puede ser unido al péptido de auxiliar T sin un separador. El péptido inmunogénico puede estar ligado al péptido auxiliador T, ya sea directamente o mediante un separador en el extremo amino o carboxilo del péptido de CTL. El extremo amino ya sea del péptido inmunogénico o del péptido de auxiliador T, puede estar acilado. En algunas modalidades, puede ser conveniente incluir en las composiciones farmacéuticas de la invención, por lo menos un componente que prepare CTL. Se han identificado lipidos como agentes capaces de preparar CTL in vivo contra antígenos virales. Por ejemplo» pueden fijarse residuos de ácido palmítico a los grupos alfa y épsilon amino de un residuo de Lys» y después ligarse» por ejemplo» mediante uno o más residuos de unión tales como Gly» Gly-Gly-» Ser» Ser-Ser» o similares» con un péptido inmunogénico. El péptido unido con lípido puede entonces ser inyectado directamente en una forma micelar, incorporado en un liposoma o emulsionado en un adyuvante» por ejemplo» adyuvante incompleto de Freund. En una modalidad preferida» un in unógeno particularmente efectivo comprende ácido palmítico unido a grupos amino alfa y épsilon de Lys» que es unido mediante enlace, por ejemplo v.gr. Sei— Ser» al extremo amino del péptido inmunogénico. Como otro ejemplo de preparación de respuestas de CTL por lípido» pueden usarse 1 ipoproteínas de E. coli tales como tri lpal itoi 1-S-gl iceri Icistei l iseri 1-seri a (P.:i,CSS) » para preparar CTL específicos de virus cuando se les une covalentemente a un péptido apropiado, véase» Deres y otros» Nature 342:561-564 (1989). incorporada en la presente como referencia. Los péptidos de la invención pueden acoplarse con P3CSS. por ejemplo» y el lipopéptido administrarse a un individuo para preparar específicamente una respuesta de CTL para el antígeno blanco. Además» como la inducción de anticuerpos neutralizantes puede ser preparada también con P3CSS conjugado con un péptido que exhibe un epítope apropiado» las dos composic ones pueden combinarse para evocar más efectivamente respuestas tanto humorales como mediadas por célula contra la infección. Además» pueden añadirse aminoácidos adicionales a los extremos de un péptido para proveer facilidad de unión de péptidos uno con el otro» para acoplar a un • soporte de vehículo» o un péptido más grande» para modificar las propiedades físicas o químicas del péptido y ol igopéptido, o similares. Pueden introducirse aminoácidos tales como tirosina» cisteína» lisina, ácido glutámico o aspártico, o similares, en el extremo C- o N— del péptido u ol igopéptido . La modificación en el extremo C, en algunos casos, puede alterar las características de unión del péptido. Además, las secuencias del péptido u ol igopéptido pueden diferir de la secuencia natural al ser modificadas por acilación NH2-term nal , por ejemplo» mediante alcanoil (CA—C20) o tioglicolil aceti lación» ami dación de carbox lo terminal» por ejemplo» amoniaco» eti lamina» etc. En algunos casos» estas modificaciones pueden proveer sitios de unión para un soporte u otra molécula. Los péptidos de la invención pueden prepararse en una amplia variedad de formas. Debido a su tamaño relat vamente corto» los péptidos pueden sintetizarse en solución o sobre un soporte sólido de conformidad con las técnicas convencionales. Se tienen disponibles varios sintetizadores automáticos y pueden utilizarse de conformidad con los protocolos conocidos. Véase» por ejemplo» Stewart y Young» Sol id Phase Peptide Synthesis» 2a- ed.» Pierce Chemical Co. (1984), véase anteriormente . Alternativamente» puede emplearse tecnología de ADN recombinante, en donde una secuencia de nucleótido que codifica un péptido inmunogénico de interés es insertada en un vector de expresión, transformada o transfectada en una célula huésped apropiada y cultivada bajo condiciones adecuadas para su expresión. Estos procedimientos son conocidos generalmente en la técnica, co o se describe, en términos generales, en SambrooK y otros, Molecular Cloning» a Laboratory Manual» Cold Spring Harbor Press» Cold Spring Harbor, New York (1982), que se incorpora en la presente como referencia. De esta manera» pueden usarse proteínas de fusión que comprenden una o más secuencias de péptido de la invención para presentar el epítope apropiado de células T. Como la secuencia codificadora para los péptidos de la longitud contemplada en la presente, puede sintetizarse por medio de técnicas químicas, por ejemplo, el método de fosfotriéster de Matteucci y otros, J. Am. Chem, Soc. 103:3185 (1981), puede hacerse modificación simplemente substituyendo la base o bases apropiadas por aquéllas que codifican la secuencia del péptido natural. Puede proveerse entonces la secuencia codificadora con ligadores apropiados y ligarse en vectores de expresión disponibles comunmente en la técnica» y los vectores usarse para transformar huéspedes adecuados para producir la proteína de fusión deseada. Actualmente se tienen disponibles varios de estos vectores y sistemas de huésped adecuados. Para la expresión de las proteínas de fusión» la secuencia codificadora será provista con codones de iniciación y paro ligados operativamente» regiones de promotor y terminador y usualmente un sistema de replicación para proveer un vector de expresión para la expresión en el huésped celular deseado. Por ejemplo, se proveen secuencias promotoras compatibles con los huéspedes bacterianos en plásmidos que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción de la secuencia codificadora deseada. Los vectores de expresión resultantes son transformados en huéspedes bacterianos adecuados. Desde luego, pueden usarse también huéspedes de levadura o células de mamífero, empleando vectores y secuencias de control adecuados. Los péptidos de la presente invención y las composiciones armacéuticas y de vacuna de la invención son útiles para su administración a mamíferos, particularmente a humanos» para tratar y/o prevenir infección viral y cáncer. Los ejemplos de enfermedades que pueden tratarse utilizando los péptidos inmunogénicos de la invención incluyen cáncer de próstata, hepatitis B, hepatitis C, SIDA» carcinoma renal» carcinoma cervical» li oma CMV y cond loma acuminado. Para composiciones farmacéuticas» los péptidos inmunogénicos de la invención se administran a un individuo que ya sufre de cáncer o está infectado con el virus de interés. Pueden tratarse aquéllos en la fase de incubación o en la fase aguda de infección con los péptidos inmunogénicos, separadamente o en conjunto con otros tratamientos, según sea apropiado. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente en una cantidad suficiente para evocar una respuesta efectiva de CTL contra el antígeno del virus o de tumor y para curar o por lo menos impedir parcialmente 16s síntomas y/o complicaciones. Una cantidad adecuada para realizar esto, se define como "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para este uso dependerán por ejemplo» de la composición particular administrada» el modo de administración» la etapa y severidad de la enfermedad tratada» el peso y estado general de salud del paciente» y el juicio del médico que prescribe, pero generalmente varía para la inmunización inicial (esto es» para administración terapéutica o profiláctica) de aproximadamente l.O µg a apro i adamente 5OO0 µg de péptido para un paciente de 70 Kg» seguido por dosificaciones de refuerzo de aproximadamente l.O µg a aproximadamente lOOO µg de péptido en cumplimiento con un régimen de refuerzo por semanas a meses» dependiendo de la respuesta y condición del paciente, midiendo la actividad específica de CTL en la sangre del paciente. Debe tenerse en cuenta que los péptidos y las composiciones de la presente invención pueden emplearse generalmente en estados patológicos serios, es decir, situaciones que ponen en peligro la vida, o que potencialmente pueden poner en peligro la vida. En tales casos, en vista de la reducción al mínimo de substancias extrañas y la naturaleza relativa no tóxica de los péptidos, es posible, y puede ser conveniente, que el médico tratante administre un exceso substancial de estas composiciones de péptido. Para uso terapéutico, la admi istración debe comenzar al primer síntoma de infección viral» o a la detección o remoción quirúrgica de tumores, o recién después del diagnóstico en el caso de infección aguda. Esto es seguido por dosis de refuerzo hasta que por lo menos los síntomas sean substancialmente abatidos, y durante un período posterior. En infección crónica» pueden requerirse dosis de carga seguidas por dosis de refuerzo. El tratamiento de un individuo infectado con las composiciones de la invención puede acelerar la resolución de la infección de individuos infectados agudamente. Para aquellos individuos susceptibles (o predispuestos) a desarrollar infección crónica» las composiciones son particularmente útiles en métodos de prevenc ón de la evolución de la infección aguda a la crónica. Cuando los individuos susceptibles son identi cados antes o durante la infección» por ejemplo» como se describe en la presente» la composición puede ser dirigida a ellos» reduciendo al mínimo la necesidad de administración a una población más grande. Las composiciones de péptido pueden usarse también para tratamiento de infección crónica y para estimular el sistema inmune para eliminar células infectadas con patógeno en portadores. Es importante proveer una cantidad de péptido in unopotenciador en una formulación y modo de administración que sea suficiente para estimular efectivamente una respuesta citotóxica de células T. De esta manera» para el tratamiento de infección crónica» una dosis representativa está en la escala de aproximadamente 1.0 µg a aprox madamente 5000 µg» de preferencia aproximadamente 5 µg a 1000 µg» para un paciente de 70 Kg por dosis. Puede requerirse dosis inmunizantes seguidas por dosis de refuerzo a intervalos establecidos» por ejemplo de 1 a 4 semanas» posiblemente durante un período prolongado para inmunizar e ecti amente a un individuo. En el caso de infección crónica» la admin straci n debe continuar hasta que por lo menos los síntomas clínicos o las pruebas de laboratorio indiquen que ha sido eliminada» o substancialmente abatida, la infección viral y durante un período posterior. Las composiciones farmacéuticas para tratamiento terapéutico están destinadas para administración parenteral » tópica» oral o local. De preferencia» las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente» por ejemplo» intravenosamente» subcutáneamente» i tradérmicamente o intramusculármente. De esta manera, la invención provee composiciones para administración parenteral que comprenden una solución de los péptidos inmunogénicos disueltos o suspendidos en un vehículo aceptable, de preferencia un vehículo acuoso. Puede usarse una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua amortiguada, solución salina al O.BJí, solución de glicina al 0.3%, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden ser esteril zadas por medio de técnicas de esterilización convencionales bien conocidas, o pueden filtrarse de manera estéril. Las soluciones acuosas resultantes pueden empacarse para usarse como tales o 1 iofi 1 izarse, siendo combinada la preparación liofi Tizada con una solución estéril antes de su administración. Las composiciones pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, según sea requerido, para aproximarse a las condiciones fisiológicas» tales como agentes ajustadores y amortiguadores de pH» agentes ajustadores de tonicidad» agentes humectantes y similares» por ejemplo» acetato de sodio» lactato de sodio» cloruro de sodio» cloruro de potasio» cloruro de calcio» monolaurato de sorbitán» oleato de tríetanolami a, etc. La concentración de péptidos estimuladores de CTL de la invención en las composiciones farmacéuticas puede variar ampliamente» es decir» de menos de aproximadamente 0.1%. usualmente a» o por lo menos aprox madamente 2%, hasta 20 a 50% o más en peso» y serán seleccionadas principalmente por los volúmenes de fluido» viscosidades» etc.» de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Los péptidos de la invención pueden ser administrados también mediante liposomas» que dirigen los péptidos hacia un tejido celular particular, tal como tejido linfoide. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, mi celas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fos olípido, capas laminares y similares. En estas preparaciones, el péptido a liberar es incorporado como parte de un liposoma» solo o en conjunto con una molécula que se une por ejemplo a un receptor prevaleciente entre células linfoides» tales como anticuerpos monoclonales que se unen al antígeno CD45 o con otras composiciones terapéuticas o in unogénicas. De esta manera» los liposomas llenos con un péptido deseado de la invención» pueden ser dirigidos al sitio de las células linfoides» en donde los liposomas liberan entonces las composiciones seleccionadas de péptido terapéutico/inmunogénico. Los liposomas para utilizarse en la invención se forman de lípidos normales formadores de vesícula» que incluyen generalmente fosfol pidos neutros y cargados negativamente» y un estero! tal como colesterol. La selección de lípidos es guiada generalmente por la consideración de, por ejemplo, el tamaño del liposoma, la sensibilidad al ácido y la estabilidad de los liposomas en la corriente sanguínea. Se tienen una variedad de métodos para preparar liposomas, como se describe por ejemplo en SzoKa y otros, An. Rev. B ophys, Bioeng. 9:467 (1989)» patentes de los E.U.A. Nos. 4, 235 ,871, 4,501,728» 4» 837» 028» y 5»019»369» incorporadas en la presente como referencia. Para dirigirlo a las células inmunes» un ligando por incorporar en el liposoma puede incluir» por ejemplo» anticuerpos o fragmentos de los mismos» específicos para determinantes de la superficie celular de las células del sistema inmune deseado. Puede administrarse una suspensión de liposoma que contiene un péptido ntravenosamente» localmente» tópicamente» etc.» en una dosis que varía de acuerdo a, entre otras cosas, la manera de administración, el péptido por liberar y la etapa de enfermedad por tratar. Para composiciones sólidas» pueden usarse vehículos sólidos no tóxicos convencionales que incluyen» por ejemplo» grados farmacéuticos de manitol» lactosa, almidón» estearato de magnesio» sacarina de sodio» talco» celulosa» glucosa, sacarosa» carbonato de magnesio y similares. Para administración oral» una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable se forma incorporando cualquiera de los excipientes empleados normalmente, tales como los vehículos enlistados anteriormente» y por lo general 10 a 95% del ingrediente activo» esto es, uno o más péptidos de la invención» y muy preferiblemente en una concentración de 25 a 75%. Para administración en aerosol» los péptidos inmunogénicos se surten preferiblemente en forma finamente dividida junto con un agente tensioactivo y propulsor. Los porcentajes típicos de los péptidos son 0.01% - 20% en peso» de preferencia 1% - 10%. Por supuesto» el agente tensioactivo debe ser no tóxico y de preferencia soluble en el propulsor. Representativos de tales agentes son los esteres o esteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono» tales como ácidos caproica» octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. Pueden emplearse esteres mixtos tales co o glicéridos mixtos o naturales. El agente tensioactivo puede constituir 0.1% - 20% en peso de la composición» de preferencia 0.25 - 5%. El resto de la composición es» ordinariamente» propulsor. Puede incluirse también un vehículo según se desee como con» por ejemplo» lecitina para liberación intranasal. En otro aspecto» la presente invención está dirigida a vacunas que contienen como ingrediente activo una cantidad inmunológ camente efectiva de un péptido inmunogénico como se describe en la presente. El péptido o péptidos pueden ser introducidos en un huésped» incluyendo humanos» ligarse a su propio vehículo o como un homopolímero o heteropol ímero de unidades de péptido activo. Dicho polímero tiene la ventaja de reacción inmunológica incrementada y. cuando se usan diferentes péptidos para hacer el polímero» la capacidad adicional de inducir anticuerpos y/o CTL que reaccionan con diferentes determinantes antigénicos de los virus o las células de tumor. Los vehículos útiles son bien conocidos en la técnica e incluyen» por ejemplo» ti oglobul ina» albúminas tales como seroalbú ina humana, toxoide del tétanos, poliaminoácidos tales como pol i ( 1 isina: ácido glutámico), proteína de núcleo de los virus de influenza» hepatitis B» vacuna recombinante del virus de la hepatitis B y similares. Las vacunas pueden contener también un diluyente fisiológicamente tolerable (aceptable) tal como agua» solución salina amortiguada de fosfato» o solución salina» y típicamente incluyen además un adyuvante. Son bien conocidos en !a técnica materiales adyuvantes tales como adyuvante incompleto de Freund» fosfato de aluminio» hidróxido de aluminio o alumbre. Y» como se mencionó anteriormente» las respuestas de CTL pueden ser preparadas conjugando péptidos de la invención con lípidos» tales como P3CSS. Después de inmunización con una composición de péptido como se describe en la presente, mediante inyección» aerosol» administración oral, transdérmica u otra vía» el sistema inmune del huésped responde a la vacuna produciendo grandes cantidades de CTL específicos para el antígeno deseado, y el huésped se hace por lo menos parcialmente inmune a infección posterior» o resistente para desarrollar infección crónica. Las composiciones de vacuna que contienen los péptidos de la invención se administran a un paciente susceptible o en riesgo de infección viral o cáncer para evocar una respuesta inmune contra el antígeno y así incrementar las capacidades de respuesta inmune del propio paciente. Dicha cantidad está definida como una "dosis i munogém'camente efectiva". En este uso» las cantidades precisas nuevamente dependen del estado de salud y peso del paciente, del modo de administración» la naturaleza de la formulación» etc.» pero por lo general varían de aproximadamente 1.0 µg a apro i adamente 5000 µg por paciente de 70 kg» más comúnmente de aproximadamente 10 µg a aproximadamente 500 µg mg por 70 kg de peso corporal . En algunos casos» puede ser conveniente combinar las vacunas de péptido de la invención con vacunas que induzcan respuestas de anticuerpo neutralizante para el virus de interés» particularmente para antígenos de envoltura virales. Para propósitos terapéuticos o de inmunización» los péptidos de !a invención pueden expresarse también por medio de huéspedes virales atenuados, tales como vacci ia o epitelioma contagioso. Este enfoque implica el uso de virus de vacuna como un vector para expresar secuencias de nucleótido que codifican los péptidos de la invención. Después de la introducción en un huésped infectado agudamente o crónicamente o en un huésped infectado, el virus de vacuna recombinante expresa el péptido inmunogénico, y con ello evoca una respuesta de CTL en e! huésped. Los vectores de vacuna y los métodos útiles en los protocolos de inmunización se describen por ejemplo en la Patente de los E.U.A. No. 4,722,848» incorporada en la presente como referencia. Otro vector es BCB (Bacilo Calmette Guerin). Se describen vectores de BCG en Stover y otros (Nature 351:456— 460 (1991)) que se incorpora en la presente como referencia. Serán evidentes para el experto en la materia una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración terapéutica o inmunización de los péptidos de la invención» por ejemplo» vectores de Salmonella Typhi y similares» a partir de la descripción presente. También puedenadmin strarse al paciente ácidos nucleicos que codifican uno o más de los péptidos de la invención. Este enfoque se describe por ejemplo en Wolff y otros» Science 247: 1465-1468 (1990)» así como las patentes de los E.U.A. Nos. 5.5B0»859 y 5,589,466. Un medio preferido de administrar ácidos nucleicos que codifican los péptídos de la invención, utiliza construcciones de minigen que codifican epítopes múltiples de la invención. Para crear una secuencia de ADN que codifica los epítopes de CTL seleccionados (minigen) para la expresión en células humanas, las secuencias de aminoácidos de los epítopes son traducidas inversamente. Se usa una tabla de uso de codón humano para guiar la elección de codón para cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codifican el epítope son asociadas directamente, creando una secuencia continua de polipéptido. Para optimizar la expresión y/o inmunogenicidad, pueden incorporarse elementos adicionales en el diseño del minigen. Ejemplos de secuencias de aminoácidos que podrían ser traducidas inversamente e incluidas en la secuencia del minigen incluyen: epítopes de linfocitos T auxiliares, una secuencia guía (señal), y una señal de retención en retículo endopl ásmico. Además, la presentación de epítopes de CTL a MHC puede ser mejorada incluyendo secuencias flanqueadoras de origen natural o sintético (por ejemplo polialanina) adyacentes a los epítopes de CTL. La secuencia de minigen es convertida a ADN ensamblando o! igonucleótidos que codifican las cadenas más y menos del minigen. Se sintetizan» fos orilan» purifican y fijan bajo las condiciones apropiadas» ol igonucléotidos de traslape (30 a 100 bases de largo) usando técnicas bien conocidas. Los extremos de los ol igonucleotidos se unen usando ADN ligasa T4. Este minigen sintético» que codifica el polipéptido de epítope de CTL» puede ser clonado después en un vector de expresión deseado. Secuencias reguladoras estándar bien conocidas para el experto en la materia son incluidas en el vector para asegurar la expresión en las células blanco. Se requieren varios elementos de vector: un promotor con un sitio de clonación hacia el extremo 3* para inserción del minigen; una señal de pol iadel inación para terminación de transcripción eficiente; un origen de replicacion de E. col i; y un marcador seleccionable de E. coli (por ejemplo» resistencia a ampicilina o kana icina). Para este propósito» pueden usarse varios promotores» por ejemplo» el promotor de citomegalovirus humano (hCMV). Véase» las patentes de los Estados Unidos Nos. 5»580.859 y 5,589,466 para otras secuencias de promotor adecuadas. Pueden ser convenientes modificaciones adicionales de vector para optimizar la expresión del minigen y su inmunogenicidad. En algunos casos se requieren intrones para expresión eficiente del gen» y pueden incorporarse uno o más intrones de origen natural o sintético en la región transcrita del minigen. Puede considerarse también la inclusión de secuencias de estabil zación de ARNm para aumentar la expresión del minigen. Se ha propuesto recientemente que las secuencias in unoesti uladoras ( ISSs o CpGs) desempeñan una función en la inmunogenicidad de vacunas de ADN. Pueden incluirse estas secuencias en el vector, fuera de la secuencia modificadora del minigen, si se encuentra que incrementa la inmunogenicidad. En algunas modalidades, puede usarse un vector de expresión bicistrónico, para permitir la producción de los epítopes codificados por el minigen y una segunda proteína incluida para incrementar o reducir la inmunogenicidad. Los ejemplos de proteínas o polipéptidos que pueden incrementar benéficamente la respuesta i mune si son coexpresadas, incluyen citocinas (v.gr., IL-2, IL12, GM-CSF) » moléculas inductoras de citocinas (v.gr.» LelF) o moléculas coestimuladoras. Los epítopes de auxiliares (HTL) pueden unirse a señales de dirección intracelular y expresarse separadamente de los epítopes de CTL. Esto podría permitir la dirección de los epítopes de HTL hacia un compartimiento celular diferente al de los epítopes de CTL. Si se requiere» esto podría facilitar la entrada más eficiente de epítopes de HTL en la ruta de MHC clase II, mejorando con ello la inducción de CTL. En contraste con la inducción de CTL, en ciertas enfermedades puede ser benéfico reducir específicamente la respuesta inmune mediante coexpresión de moléculas i munosupresoras (v.gr. TGF-ß). Una vez seleccionado el vector de expresión, el minigen es clonado en la región pol iadaptadora hacia el extremo 3T del promotor. Este plásmido es transformado en una cepa apropiada de E. col i , y se prepara ADN utilizando técnicas estándar. La orientación y la secuencia de ADN del minigen, así como de todos los elementos incluidos en el vector, son confirmadas utilizando mapeo de restricción y análisis de secuencia de ADN. Pueden almacenarse células bacterianas que hospedan en plásmido correcto como un banco maestro de células y un banco de células de trabajo. Se producen cantidades terapéuticas de ADN plasmídico mediante fermentación en E. coli, seguido por purificación. Se utilizan alícuotas del banco de células de trabajo para inocular el medio de fermentación (tal como el caldo Terrific) y desarrollarlas hasta la saturación en matraces agitados o un biorreactor de acuerdo con técnicas bien conocidas. Puede purificarse el ADN plasmídico utilizando tecnologías estándar de bioseparación, tales como las resinas de intercambio aniónico en fase sólida provistas por Quiagen. Si se requiere, puede aislarse ADN super-enrol lado de las formas circular abierta y lineal utilizando electrofóresis en gel u otros métodos . Puede preparase ADN plasmídico purificado para inyección, utilizando una variedad de formulaciones. La más simple de estas es la reconstitución de ADN liofilizado en solución salina amortiguada con fosfato (PBS). Este enfoque, conocido como "ADN descubierto" se usa actualmente para administración intramuscular (IM) en pruebas clínicas. Para aumentar al máximo los efectos n unoterapéuticos de las vacunas de ADN de minigen, puede ser conveniente un método alternativo para formular ADN plasmídico purificado. Se han descrito una variedad de métodos, y se han hecho disponibles técnicas nuevas. Pueden usarse también lípidos catiónicos en la formulación (véase, por ejemplo, como se describe en Debs y Zhu (1993) WO 93/24640; Manninoy Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose» Patente de E.U.A. No. 5,279,833; B igham (1991) WO 91/06309; y Felger y otros (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 84:7413-7414). Además, también se pueden formar complejos con gl icol ípidos» liposomas fusogénicos» péptidos y compuestos referidos colectivamente como protectores» interactivos» no condensantes (PINO» con el ADN plasmídico purificado para afectar las variables tales como estabilidad» dispersión i tramuscular» o tráfico hacia órganos o tipos celulares específicos. Los ácidos nucleicos pueden administrarse también utilizando liberación balística como se describe por ejemplo en la Patente de los Estados Unidos No. 5,204,253. Pueden administrarse partículas comprendidas únicamente de ADN. Al erna ivamente» el ADN puede ser adherido a partículas, tales como partículas de oro. Puede usarse sensibilización de células objetivo como una prueba funcional para expresión y presentación de los epítopes de CTL codificados por el minigen para MHC clase I. El ADN plasmídico es introducido en una línea celular de mamífero que es adecuada como el blanco para pruebas estándar de liberación de cromo de CTL. El método de transfección usado dependerá de la formulación final. Puede utilizarse electroporac ón para ADN "descubierto", mientras que los lípidos catiónicos permiten la transfección directa i vitro. Puede co-transfectarse un plásm do que expresa proteína fluorescente verde (GFP) para permitir el enriquecimiento de células transfectadas utilizando clasificación de células activadas con fluorescencia (FACS). Estas células son marcadas después con cromo 51 y usadas como células blanco para líneas de CTL específicas de epítope. La citólis s» detectada mediante liberación de 51Cr» indica la producción de presentación de MHC de epítopes de CTL codificados por el minigen. La inmunogenicidad j n vivo es un segundo enfoque para la prueba funcional de formulaciones de ADN del minigen. Ratones transgénicos que expresan moléculas apropiadas de MHC humano son inmunizados con el producto de ADN. La dosis y la vía de admi istración dependen de la formulación (por ejemplo IM para ADN en PBS» IP para ADN en complejo con lípido). Veintiún días después de la i munización, se recolectan esplenocitos y se rees imuían durante una semana en presencia de péptidos que codifican cada epítope por probar. Estas células efectoras (CTL) son analizadas para determinar la citólisis de las células objetivo marcadas con cromo 51, cargadas con el péptido» utilizando técnicas estándar. La lisis de las células blanco sens bilizadas por MHC que cargan los péptidos correspondientes a los epítopes codificados por el minigen» demuestra que la vacuna de ADN funciona para inducción de CTL in vi vo.

Pueden usarse peptidos antigenicos para evocar también CTL ex vi o. Los CTL resultantes pueden usarse para tratar infecciones crónicas (virales o bacterianas) o tumores en pacientes que no responden a otras formas convencionales de terapia» o que no responden a un enfoque de terapia con vacuna de péptido. Las respuestas de CTL ex vivo hacia un patógeno particular (agente infeccioso o antígeno de tumor) son inducidas incubando en cultivo de tejidos las células precursoras de CTL del paciente (CTLp) junto con una fuente de células que presentan el antígeno (APC) y el péptido inmunogénico apropiado. Después de un tiempo de incubación apropiado (típicamente una a cuatro semanas)» en el cual las CTLp son activadas y maduran y se expanden en CTL efectores» las células son infundidas de regreso hacia el paciente» en donde el mismo destruye su célula blanco específica (una célula infectada o una célula de tumor). Para optimizar las condiciones i vitro para la generación de células citotóxicas específicas» el cultivo de células estimuladoras se mantiene en un medio apropiado libre de suero. Antes de incubación de las células estimuladoras con las células por activar» v.gr.» células CD8+ precursoras, se agrega una cantidad de péptido antigénico al cultivo de células estimuladoras, suficiente para ser cargadas sobre las moléculas clase I humanas por expresar sobre la superficie de las células estimuladoras. En la presente invención, una cantidad suficiente de péptido es una cantidad que permite que aproximadamente 200, y de preferencia 200 o mas moléculas de MHC clase I humana cargadas con péptido, se expresen sobre la superficie de cada célula estimuladora. De preferencia, las células estimuladoras se incuban con >20µg/ml de péptido. Después, las células CDB+ precursoras o inactivas» se incuban en un cultivo con las células estimuladoras apropiadas durante un período suficiente para activar las células CD8+. De preferencia, las células CD8+ son activadas en una manera específica de antígeno. La proporción de células (efectoras) CD8+ precursoras o inactivas a células estimuladoras, puede variar de individuo a individuo y puede depender además de variables tales como la susceptibilidad de los linfocitos de un individuo a las condiciones de cultivo» y la naturaleza y severi'dad de la condición patológica u otra condición para la cual se usa la modalidad de tratamiento descrita. Sin embargo» de preferencia la proporción de linfocito a estimulador está en la escala de aproxi adamente 3?:i a 300:1. El cultivo efector/estimulador puede mantenerse tanto tiempo como sea necesario para estimular un número terapéuticamente utilizable o efectivo de células CD8+. La inducción de CTL i vi tro requiere el reconocimiento específico de péptidos que se unen a moléculas de MHC clase I específicas de alelo sobre APC. El número de complejos específicos de MHC/péptido por APC, es crucial para la estimulación de CTL, particularmente en respuestas inmunes primarias. Aunque cantidades pequeñas de complejos de péptido/MHC por célula son suficientes para hacer a una célula susceptible a lisis por CTL» o para estimular una respuesta secundaria de CTL, la activación acertada de un precursor de CTL (pCTL) durante la respuesta primaria, requiere un número signif cativamente más alto de complejos MHC/péptido. La carga de péptido de moléculas vacías de complejo de histocompatibi 1 idad mayor sobre las células permite la inducción de respuestas primarias de linfoc tos T citotóxicos. Puesto que no existen líneas de células mutantes para cada alelo de MHC humano, es ventajoso utilizar una técnica para remover los péptidos endógenos asociados con MHC de la superficie de APC, seguido por la carga de las moléculas vacías de MHC con los péptidos inmunogénicos de interés. El uso como APC de células no transformadas (no tumorigenicas ) , células no infectadas, y de preferencia, células autónomas de pacientes, es conveniente para diseñar el protocolo de inducción de CTL dirigidos hacia el desarrollo de terapias ex vi vo de CTL. Esta Solicitud describe métodos para arrastrar los péptidos endógenos asociados con MHC desde la superficie de APC, seguido por la carga de los péptidos deseados. Una molécula de MHC clase I estable es un complejo trimérico formado de los siguientes elementos: 1) un péptido usualmente de 8 a 10 residuos, 2) una cadena de proteína poli órf ca pesada de transmembrana que lleva el sitio de unión de péptido en sus dominios al y OÍ2, 3) una cadena ligera no pol mórfica asociada no covalentemente, ßß icroglobu! ina . La remoción de los péptidos unidos y/o la disociación de la microglobul ina S-. del complejo, hace a las moléculas de MHC clase I. no funcionales e inestables. dando como resultado degradación rápida. Todas las moléculas de MHC clase I aisladas de PBMCs tienen pépt dos endógenos unidos a ellas. Por lo tanto, el primer paso es remover todos los péptidos endógenos unidos a las moléculas de MHC clase I sobre el APC» sin causar su degradación antes de que los péptidos exógenos puedan agregarse a ellas. Dos formas posibles de liberar a las moléculas de MHC clase I de los péptidos unidos» incluye la reducción de la temperatura del cultivo de 37°C a 26°C durante la noche para desestabilizar la microglobul ina S.-, y arrastrar los péptidos endógenos de la célula utilizando un tratamiento ligeramente ácido. Estos métodos liberan péptidos unidos anteriormente en el medio e?tracelular» permitiendo que nuevos péptidos exógenos se unan a las moléculas vacías de clase I, El método de incubación a temperatura fría permite que los péptidos exógenos se unan eficientemente al complejo de MHC» pero requiere una incubación durante la noche a 26°C que puede demorar la velocidad metabólica de la célula. También es probable que células que no sintetizan activamente moléculas de MHC (por ejemplo PBMC inactivas) no produzcan cantidades altas de moléculas vacías de MHC de superficie por medio del procedimiento de temperatura fría. El arrastre con ácido implica la extracción de los péptidos con ácido trifluoroacético» pH 2» o desnaturalización con ácido de los complejos clase I-péptido purificados por inmunoafin dad. Estos métodos no son factibles para inducción de CTL, ya que es importante remover los péptidos endógenos conservando al mismo tiempo la viabilidad de APC y un estado metabólico óptimo» que es crítico para la presentación de antígeno. Se han usado soluciones l geramente acidas de pH 3 tales como glicina o amortiguadores de citrato-fosfato para identificar péptidos endógenos y para identificar epítopes de células T asociados con tumor. El tratamiento es especialmente efectivo» ya que solamente las moléculas de MHC clase I son desestabilizadas (y los péptidos asociados» liberados)» mientras que otros ant genos de superficie permanecen intactos» incluyendo las moléculas de MHC clase II. Más importantemente» e! tratamiento de células con las soluciones ligeramente acidas no afecta la viabilidad ni el estado metabólico de la célula. El tratamiento ligeramente ácido es rápido» ya que el arrastre de los péptidos endógenos ocurre en dos minutos a 4°C y el APC está listo para desarrollar su función después de cargar los péptidos apropiados. La técnica se utiliza en la presente para hacer APCs específicos de péptido para la generación de CTL primarios específicos de antígeno. Los APC resultantes son eficientes para inducir CTL CD8+ específicos de péptido. Las células CD8+ activadas pueden separarse efectivamente de las células estimuladoras usando uno de una variedad de métodos conocidos. Por ejemplo» pueden utilizarse anticuerpos monoclonales específicos para las células estimuladoras» para los péptidos cargados sobre las células estimuladoras» o para las células CD8-t- (o un segmento de las mismas) para unir su ligando complementario apropiado. Las moléculas marcadas con anticuerpo pueden ser extraídas entonces de la mezcla estimulador-célula efectora por medios apropiados» - por ejemplo mediante métodos bien conocidos de inmunoprecipi tación o inmunoensayo. Las cantidades citotóxicas efectivas de las células CD8+ activadas puede variar entre usos in vitro e in vivo» así como con la cantidad y tipo de células que son el blanco final de estas células destructoras. La cantidad también varía dependiendo de la condición del paciente y debe ser determinada por e! técnico mediante la consideración de todos Tos factores apropiados. Sin embargo» de preferencia se ut lizan 1 x lO3 a aproximadamente 1 x 10 aí» de preferencia 1 x 10T a aproximadamente 1 x 10ia-» y muy preferiblemente 1 x lO® a aproximadamente 1 x 10a-0 células CD8+ activadas para adultos humanos» en comparación con 5 x 10^ - 5 x 10*7 células usadas en ratones. De preferencia» como se discutió anteriormente» las células de CD8+ activadas son cosechadas del cultivo celular antes de administraci n de las células CD8+ a los individuos por tratar. Sin embargo, es importante observar que, a diferencia de otras modalidades de tratamiento presentes y propuestas» el presente método utiliza un sistema de cultivo celular que no es tumorigénico. Por lo tanto» si no se logra la completa separación de células estimuladoras y células CD8+ activadas» no hay el peligro inherente conocido que está asociado con la administración de un pequeño número de células estimuladoras, mientras que la administración de células promotoras de tumor de mamífero puede ser extremadamente peí igroso. Los métodos de re-introducción de componentes celulares son conocidos en la técnica, e incluyen procedimientos tales como los ejemplificados en la patente de los E.U.A. No. 4,844,893 para Honsik, y otros, y la patente de los E.U.A. No. 4,690,915 para Rosenberg. Por ejemplo» es apropiada la administración de células CDB-í- activadas mediante infusión intravenosa. Los péptidos inmunogénicos de esta invención pueden usarse también para hacer anticuerpos monoclonales. Estos anticuerpos pueden ser útiles como agentes potenciales de diagnostico o terapéuticos. Los péptidos de la invención pueden usarse también como reactivos de diagnóstico. Por ejemplo, un péptido de la invención puede usarse para determinar la susceptibilidad de un individuo particular a un régimen de tratamiento que emplea el péptido o los péptidos relacionados, y así puede ser de ayuda para modificar un protocolo de tratamiento existente o para determinar un pronóstico para un individuo afectado. Además» los péptidos pueden usarse también para predecir qué individuos estaran en riesgo substancial de desarrollar infección crónica. Para identificar los péptidos de la invención» se llevó a cabo aislamiento de antígeno clase I» y aislamiento y secuenciación de péptidos procesados naturalmente como se describe en las solicitudes relacionadas. Estos péptidos se usaron posteriormente para definir motivos de unión específicos para cada uno de los siguientes alelos A3.2» Al» All y A24.1. Estos motivos se describen en las solicitudes relacionadas y se resumen en los cuadros 5-8 siguientes.

CUADRO 5 Motivo específico del alelo HLA-A3.2 Posición Residuos conservados 1 2 V,L»M 3 Y»D 4 5 6 7 I 8 Q»N 9 K lO K CUADRO 6 Motivo específico del alelo HLA-Al Posición Residuos conservados 1 2 S,T 3 D»E 4 P 5 6 7 L 8 9 Y CUADRO 7 Motivo específico del alelo HLA-All Posición Residuos conservados 1 2 T ,V 3 M,F 4 5 6 7 8 Q CUADRO 7 ( CONTINUACIÓN ) 9 K 10 K CUADRO 8 Motivo específico del alelo HLA-A24.1 Posición .--:•: Residuos conservado; 1 2 Y 3 I.M 4 D,E»G,K,P 5 L,M,N 6 V 7 N,V 8 A,E,K,Q,S 9 F,L 10 F,A EJEMPLO 1 Identificación de péptidos inmunogénicos Usando los motivos identificados anteriormente para varios alelos de MHC clase I» se analizaron las secuencias de aminoácidos de varias proteínas virales y relacionadas con tumor» para detectar la presencia de estos motivos. La selección se llevó a cabo en la forma descrita en las solicitudes relacionadas. El cuadro 9 provee los resultados de las búsquedas de los antígenos. La descripción anterior se provee para ilustrar la invención» pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente evidentes para el experto en la materia y están abarcadas por las reivindicaciones anexas. Todas Tas pubT icaciones» patentes y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan aquí por referencia.

CD «09 OB3-3E O ENTE SEO ID No AA SECUENCIA FU MHGV? 1 9 HSNLNDTTY FLU A NP 140 1 A03 p 0 FVEALFOEY 1 P fnlcinaru CSP 1 A03/A1I 3 u AADAAAAAY Al nolv-A 1 A0I 4 ß DADAAAAAY 1 AI nolv-A A0I •i . 9 AADSAAAAY 1 Al poiv-A A0I 6 i, AADAPAAAY 1 Al pnlv-A I AOI 7 9 AADAAAOAY A 1 polv-A A0I 8 9 OADAAAAAY Al nolv-A A01 9 9 AADADAAAY A ! nolv-A AOI 1. AADAGAAAY I Al nnlv-A A0I 1) i. AADAAKAAY Al nolv-A 1 AOI 12 9 AADAAAPAY A 1 polv-A AOI 13 9 AADAAAAPY A 1 nolv-A A01 14 9 ATAAAAAAY Al nolv-A A0I 9 DTAAAAAAY Al nolv-A AOI 16 9 ATASAAAAY Al polv-A A0I 17 9 ATAAPAAAY AI nolv-A AOI ,. 9 ATAAAAOAY Al polv-A A01 19 9 ATAAAAAKY A 1 nolv-A A0I 9 OTAAAAAAY Al nolv-A AOI 3. 1 ATAADAAAY 1 A 1 nolv-A AOI 22 9 ATAAGAAAY A 1 nolv-A A01 23 9 ATAAAKAAY 1 A 1 nolv-A A0I 24 9 ATAAAAPAY Al nolv-A A0I 2S 9 ATAAAAAPY A 1 polv-A A01 26 9 TYLISSIPL GCDFP-I'? 70 A24 •p 9 FYTNRTVOI scDFP-i'; 102 A24 1 10 PLOGAFNYKY 1 scDFp-i'¡ t> AOI 29 10 CDDNPKTFY GCDFP-IS 90 A0I T 9 TTN RPTTY GAD 2! A0I 1 0 CLE AEY Y GAD 4ü-> A01 32! 1 9 SPRPISY HCV NS3 W>? AOI 1 1 LLSPRPVSY 1 HCV NS3 115'' A0I 34 1 TVTVFHVV 1 HSV-I POL 142 1 A01 1 I ETAGRHVGY 1 HSV-t p^L KK 1 A0I 1 1 : 1 1 GSGPEL FV 1 HSV.i TER *'" 1 CUADRO 9 ( wriNoacioN) CQZVDRO 9 (CX»pTNDACION) CDGADRO 9 ((X»TI U?CI0N) CKIGGNO .SBQ. T N3. | AA tJHIH A HE?E MJI.Ü 111 AYGLDFYIL nl5 A24

Claims (19)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES l.— Un método de inducción de una respuesta de células T citotóxicas contra un antígeno preseleccionado en un paciente» el método comprende poner en contacto células T citotóxicas del paciente con un péptido inmunogénico que se une a un producto de MHC de HLA-A3.2 con una constante de disociación de menos de aproximadamente 5 x 10-"1* M» e induce una respuesta de células T citotóxicas»" este péptido inmunogénico tiene entre aproximadamente 9 y aproximadamente 10 residuos y los siguientes residuos» del extremo N al extremo C: un primer residuo conservado seleccionado del grupo que consiste de L» M» I» V» S» A» T» F» C» G» D y E; y un segundo residuo conservado de K» R» Y, H y F» en donde el primero y el segundo residuos conservados están separados por 6 a 7 residuos. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1» caracterizado porque el primer residuo conservado está en la segunda posición desde el extremo N. 3.- Un método de inducción de una respuesta de células T citotóxicas contra un antígeno preseleccionado en un paciente» el método comprende poner en contacto células T citotóxicas del paciente con un péptido inmunogénico que se une a un producto de MHC de HLA—Al con una constante de disociación de menos de aproximadamente 5 x lO-"7 M» e induce una respuesta de células T citotóxicas; este péptido inmunogénico tiene entre aproximadamente 9 y aproxi adamente lO residuos y los siguientes residuos, del extremo N al extremo c: un primer residuo conservado de T , S y M» y un segundo residuo conservado de D» E» A» S y T» un tercer residuo conservado de Y; en donde el primero y el segundo residuos conservados son adyacentes» y el segundo y tercer residuos conservados están separados por 5 o 6 residuos. 4.— El método de conformidad con la reivindicación 3» caracterizado porque el primer residuo conservado está en la segunda posición desde el extremo N. 5.- Un método de inducción de una respuesta de células T citotóxicas contra un antígeno preseleccionado en un paciente» el método comprende poner en contacto células T citotóxicas del paciente con un péptido inmunogénico que se une a un producto de MHC de HLA-Al con una constante de disociación de menos de aproximadamente 5 x 10- ~* M» e induce una respuesta de células T citotóxicas» este péptido in unogém'co tiene entre aproximadamente 9 y aproximadamente 10 residuos y los siguientes residuos» del extremo N al extremo c: un primer residuo conservado de T » S y M; y un segundo residuo conservado de Y» en donde el primero y el segundo residuos conservados están separados por 6 a 7 residuos. 6.- El método de conformidad con la reivi dicación 5, caracterizado porque el primer residuo conservado está en la segunda posición desde el extremo N y el segundo residuo conservado está en la novena o décima posición desde el extremo N. 7.- Un método de inducción de una respuesta de células T citotóxicas contra un antígeno preseleccionado en un paciente» el método comprende poner en contacto células T citotóxicas del paciente con un péptido inmunogénico que se une a un producto de MHC de HLA—Al con una constante de disociación de menos de aproxi adamente 5 x lO— ^ M» e induce una respuesta de células T citotóxicas; este péptido inmunogénico tiene entre aproximadamente 9 y aproximadamente lO residuos» y los siguientes residuos, del e?tremo N a! extremo c: un primer residuo conservado de D» E» A. S y T» y un segundo residuo conservado de Y; en donde el primero y el segundo residuos conservados están separados por 5 a 6 residuos. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 7» caracterizado porque el primer residuo conservado está en la tercera posición desde el extremo N y el segundo residuo conservado está en la novena o décima posición desde el extremo N. 9.- Un método de inducción de una respuesta de células T citotóxicas contra un antígeno preseleccionado en un paciente» el método comprende poner en contacto células T citotóxicas del paciente con un péptido inmunogénico que se une a un producto de MHC de HLA-All con una constante de disociación de menos de aproxi adamente 5 x 10— ~* M, e induce una respuesta de células T citotoxicas; este peptido inmunogénico tiene entre aproximadamente 9 y aproximadamente 10 residuos y los siguientes residuos, del extremo N al extremo c: un primer residuo conservado de L» M, I, V, A, S, T, G, N» Q» C» F» D y E; y un segundo residuo conservado de » R» H; en donde el primero y el segundo residuos conservados están separados por 6 a 7 residuos. lO.- El método de conformidad con la rei indicación 9» caracterizado porque el primer residuo conservado está en la segunda posición desde el extremo N. 11.- Un método de inducción de una respuesta de células T citotóxicas contra un antígeno preseleccionado en un paciente» el método comprende poner en contacto células T citotóxicas del paciente con un péptido inmunogénico que se une a un producto de MHC de HLA-A24.1 con una constante de disociación de menos de aproximadamente 5 x 10—"' M» e induce una respuesta de células T citotóxicas» este péptido inmunogénico tiene entre aproximadamente 9 y aproxi adamente 10 residuos y los siguientes residuos» del extremo N al extremo C: un primer residuo conservado de Y» F» W; y un segundo residuo conservado de F» I» L» » M» en donde el primero y el segundo residuos conservados están separados por 6 a 7 residuos. 12.- El método de conformidad con la re vindicación 11, caracterizado porque el primer residuo conservado está en la segunda posición desde el extremo N. 13.- Un método de inducción de una respuesta de células T citotoxicas contra un antígeno preseleccionado en un paciente» el método comprende poner en contacto células T citotóxicas del paciente con un péptido inmunogénico que se une a un producto de MHC de HLA-A3.2 con una constante de disociación de menos de aproxi adamente 5 x 10—^ M» e induce una respuesta de células T citotóxicas; este péptido inmunogénico tiene entre aproximadamente 9 y aproximadamente 10 residuos y los siguientes residuos» del e?tremo N al extremo C: un primer residuo conservado en la segunda posición» seleccionado de! grupo que consiste de A» I, L, M, T y V; y un segundo residuo conservado en la posición C—terminal , seleccionado del grupo que consiste de K y R; en donde el primero y el segundo residuos conservados están separados por 6 a 7 residuos. 14.— Un método de inducción de una respuesta de células T citotóxicas contra un antígeno preseleccionado en un paciente, el método comprende poner en contacto células T citotó? cas del paciente con un péptido inmunogénico que se une a un producto de MHC de HLA-A3.2 con una constante de disociación de menos de aproximadamente 5 x 10—v M» e induce una respuesta de células T citotóxicas; este péptido inmunogénico tiene entre aproximadamente 9 y aproximadamente 10 residuos y los siguientes residuos» del extremo N al extremo C: un primer residuo conservado en la segunda posición desde el extremo N, seleccionado del grupo que consiste de A, I, L, M, T y V; y un segundo residuo conservado en la posición C-terminal, seleccionado del grupo que consiste de K; en donde el primero y el segundo residuos conservados están separados por 6 a 7 residuos. 15.- El método de conformidad con las reivindicaciones 1, 3» 5» 7» 11» 13 ó 14» caracterizado porque el péptido inmunogénico se pone en contacto con las células T citotóxicas in vitro. 16.- El método de conformidad con las rei indicaciones 1, 3» 5» 7» 11» 13 ó 14, caracterizado porque el paso de poner en contacto células T citotóxicas con el péptido ín unogénico» se lleva a cabo administrando al paciente un ácido nucleico que codifica al péptido. 17.- El método de conformidad con las reivindicaciones 1» 3» 5» 7, 11, 13 ó 14, caracterizado porque el péptido inmunogénico es de un antígeno viral . 18.- El método de conformidad con las reivindicaciones 1, 3» 5» 7» 11» 13 ó 14» caracterizado porque el péptido inmunogénico es de un antígeno de cáncer. 19.- Una composición que comprende un péptido inmunogénico» en donde el péptido inmunogénico se selecciona de! grupo que consiste de SEQ. ID. Nos. 1-111.