ES2473605T3 - ClyA no hemol�tica para la excreci�n de proteínas - Google Patents

Abstract

Un método para producir una proteína de fusión, que comprende: (a) transformar una población de bacterias con un vector de expresión que codifica una proteína de fusión, en el que dicha proteína de fusión comprende una proteína de interés unida al extremo carboxi-terminal de una proteína de exportación, en el que dicha proteína de exportación es una proteína citolisina A (ClyA) de Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) que tiene una actividad hemolítica sustancialmente reducida en comparación con la proteína ClyA de SEQ ID NO:2, teniendo dicha proteína de exportación la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2 y teniendo una mutación seleccionada del grupo que consiste en una mutación S195N, una mutación I198N, una mutación A199D, una mutación E204K y una mutación C285W, y (b) cultivar las bacterias transformadas de (a) en un medio de cultivo bajo condiciones en las que dicha proteína de fusión se expresa y se exporta hacia el medio de cultivo.

Description

ClyA no hemol�tica para la excreci�n de proteínas

Apoyo estatal

El sistema de exportación de proteínas definido en la presente se desarroll� gracias a la subvención n.� MARCE US4 A1057168 de the National Institutes of Health. La administración de EEUU tiene ciertos derechos sobre esta invención.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La siguiente descripción se refiere al uso de un sistema de exportación de proteínas. El sistema descrito proporciona métodos eficaces y composiciones útiles para la producción de proteínas recombinantes.

Descripci�n de la técnica relacionada

Los sistemas de expresión de proteínas han utilizado durante mucho tiempo vectores de expresión o pl�smidos de expresión de alto número de copias para intentar aumentar los rendimientos de proteínas recombinantes de interés. Los pl�smidos de expresión de alto número de copias y las proteínas de interés que codifican pueden ejercer un efecto negativo sobre la aptitud de un hospedante que contiene un pl�smido de expresión. La carga notable a la que se someten las células hospedantes procariotas que portan pl�smidos de múltiples copias es el resultado acumulado de una cascada metabólica activada por dos procesos: 1) la replicaci�n y el mantenimiento de los pl�smidos de expresión, y 2) la transcripción y la traducción de las diversas funciones codificadas por el pl�smido que incluye el gen de interés. Estos mecanismos pueden explicar la observación de que las bacterias que portan pl�smidos crecen con más lentitud que las bacterias que no tienen pl�smidos. Esta carga también puede explicar la observación de que la velocidad de crecimiento disminuye a medida que aumenta el número de copias.

A medida que se expresa el gen de interés, disminuye la velocidad de crecimiento de la célula hospedante recombinante. La disminución en la velocidad de crecimiento puede activar la inducción de diversas proteasas celulares que pueden degradar la proteína producida de modo recombinante presente en el citoplasma de la célula hospedante. Por tanto, una menor velocidad de crecimiento es la consecuencia inevitable de la carga metabólica que, a su vez, es el resultado acumulado de una serie de perturbaciones fisiológicas. Debido a que esta reducción en la velocidad de crecimiento crea una presión selectiva sobre la pérdida de los pl�smidos residentes en ausencia de selección, puede producirse una pérdida significativa de los pl�smidos de expresión desde la célula hospedante que porta un vector de expresión después de la transformación de la célula hospedante.

Las células hospedantes con menores velocidades de crecimiento pueden expulsar espontáneamente un pl�smido de expresión para eliminar de la célula hospedante una carga metabólica innecesaria y permitir que las células hospedantes sin pl�smidos sobrepasen con rapidez a la población de células hospedantes que portan pl�smidos. Se supone que este desplazamiento en la expresión de proteínas dentro de una población de células hospedantes reduciría la producción de proteínas.

Por consiguiente, sería deseable preparar un sistema de expresión de proteínas que optimice la expresión de proteínas del vector de expresión, mientras que al mismo tiempo minimice la carga metabólica sobre la célula hospedante generada por el vector de expresión.

El documento WO 2002/083890 describe un sistema de exportación de proteínas para producir proteínas recombinantes desde una célula hospedante. En una realización preferida, el sistema de exportación de proteínas utiliza la maquinaria de exportación de proteínas end�gena de la bacteria hospedante en la que se introduce el vector del sistema de exportación de proteínas. Este documento describe la secuencia de la proteína ClyA de Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi). Este documento describe una proteína de fusión que comprende al menos una porción de la proteína ClyA de S. Typhi y otra proteína de interés.

Galen et al. (2004), "Adaptation of the Endogenous Salmonella enterica Serovar Typhi clyA-Encoded Hemolysin for Antigen Export Enhances the Immunogenicity of Anthrax Protective Antigen Domain 4 Expressed by the Attenuated Live-Vector Vaccine Strain CVD 9098-htrA", Infection and Immunity, 72(12):7096-7106, describen proteínas de fusión de ClyA de S. Typhi condensadas con el dominio 4 de protección del ant�geno del ántrax, y su uso para la vacunación.

Sumario de la invención

El material descrito se refiere al uso de una proteína de exportación para facilitar la exportación de una proteína de fusión hacia el exterior de una célula hospedante. Una realización descrita proporciona un método para expresar un gen en una célula bacteriana, que comprende proporcionar un vector de expresión a una población de células hospedantes bacterianas no transformadas, en el que el vector de expresión comprende un módulo de expresión

que comprende una secuencia codificadora de una proteína de exportación condensada genéticamente con una secuencia codificadora de una proteína de interés, expresar el módulo de expresión de modo que se produce una proteína de fusión de la proteína de exportación::proteína de interés y se exporta o se transporta hacia el medio de cultivo.

Otra realización descrita se refiere a un método para inducir una respuesta inmunol�gica en un animal, que comprende proporcionar a un animal una población de células hospedantes bacterianas transformadas con un vector de expresión que comprende un módulo de expresión que comprende una secuencia codificadora de una proteína de exportación condensada genéticamente con una secuencia codificadora de una proteína de interés, expresar el módulo de expresión de modo que se produce una proteína de fusión de la proteína de exportación::proteína de interés y se exporta o se transporta hacia el animal, e inducir una respuesta inmunol�gica en el animal contra la proteína de fusión.

Otra realización descrita se refiere a un sistema para expresar una proteína de interés que comprende: un vector de expresión que comprende un módulo de expresión, en el que el módulo de expresión comprende una secuencia codificadora de una proteína de exportación condensada genéticamente con una secuencia codificadora de una proteína de interés, una célula hospedante transformada con el vector de expresión, y un entorno de cultivo para la célula hospedante transformada, en el que el módulo de expresión expresa una proteína de fusión de la proteína de exportación::proteína de interés, que se exporta hacia el exterior de la célula hospedante transformada.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una proteína de fusión, que comprende

(a) transformar una población de bacterias con un vector de expresión que codifica una proteína de fusión, en el que la proteína de fusión comprende una proteína de interés unida al extremo carboxi terminal de una proteína de exportación, en el que dicha proteína de exportación es una proteína citolisina A (ClyA) de Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) que tiene una actividad hemol�tica sustancialmente reducida en comparación con la proteína ClyA de SEQ ID NO:2, teniendo dicha proteína de exportación la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y teniendo una mutación seleccionada del grupo que consiste en una mutación S195N, una mutación I198N, una mutación A199D, una mutación E204K y una mutación C285W, y (b) cultivar las bacterias transformadas de (a) en un medio de cultivo bajo condiciones en las que dicha proteína de fusión se expresa y se exporta hacia el medio de cultivo. La bacteria puede ser Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio spp., o E. coli. Los ejemplos no limitantes de realizaciones incluyen, pero no se limitan a S. Typhi, tal como S. Typhi CVD 908 que tiene una mutación htrA, E. coli, tal como E. coli enterotoxig�nica (ETEC) o E. coli enteroagregativa (EAEC), Vibrio cholerae, y Shigella flexneri 2a. Además, la proteína de interés es un ant�geno. El método puede incluir la etapa adicional de recolectar la proteína de fusión del medio de cultivo.

En otras realizaciones igualmente preferidas de este método, la proteína citolisina A (ClyA) de S. Typhi tiene la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y una mutación individual seleccionada del grupo que consiste en una mutación S195N, una mutación I198N, una mutación A199D, una mutación E204K y una mutación C285W; una mutación doble I198N, C285W; y una mutación triple I198N, A199D, E204K. La proteína citolisina A (ClyA) de S. Typhi también puede tener la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y una mutación C285W, as� como una mutación adicional seleccionada del grupo que consiste en una mutación I198N, una mutación A199D, y una mutación E204K. Se describen métodos en los que la proteína citolisina A (ClyA) de S. Typhi tiene la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y la proteína de interés es la proteína de la toxina del ántrax PA83.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una población de bacterias para su uso para inducir una respuesta inmunol�gica contra una proteína de fusión en un sujeto, en la que dicha población de bacterias produce y exporta una proteína de fusión en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunol�gica en dicho sujeto contra dicha proteína de fusión, en la que dichas bacterias comprenden un vector de expresión que codifica dicha proteína de fusión, en la que la proteína de fusión comprende una proteína de interés unida al extremo carboxi terminal de una proteína de exportación, y en la que dicha proteína de exportación es una proteína citolisina A (ClyA) de Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) que tiene una actividad hemol�tica sustancialmente reducida en comparación con la proteína ClyA de SEQ ID NO:2, teniendo dicha proteína de exportación la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y teniendo una mutación seleccionada del grupo que consiste en una mutación S195N, una mutación I198N, una mutación A199D, una mutación E204K y una mutación C285W. Preferiblemente, el sujeto es un animal, más preferiblemente un ser humano. La bacteria puede ser Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio spp., o E. coli. Los ejemplos no limitantes de realizaciones incluyen, pero no se limitan a S. Typhi, tal como S. Typhi CVD 908 que tiene una mutación htrA, E. coli, tal como E. coli enterotoxig�nica (ETEC) o

E. coli enteroagregativa (EAEC), Vibrio cholerae, y Shigella flexneri 2a. Además, la proteína de interés es un ant�geno.

En otras realizaciones igualmente preferidas de este método, la proteína citolisina A (ClyA) de S. Typhi tiene la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y una mutación individual seleccionada del grupo que consiste en una mutación S195N, una mutación I198N, una mutación A199D, una mutación E204K y una mutación C285W; una mutación doble I198N, C285W; y una mutación triple I198N, A199D, E204K. La proteína citolisina A (ClyA) de S. Typhi también puede tener la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y una mutación C285W, as� como una mutación adicional seleccionada del grupo que consiste en una mutación I198N, una mutación A199D, y

una mutación E204K. Se describen usos en los que la proteína citolisina A (ClyA) de S. Typhi tiene la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y la proteína de interés es la toxina del ántrax PA83.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un módulo de expresión, en el que el módulo de expresión comprende una secuencia codificadora de una proteína de exportación unida a una secuencia codificadora de una proteína de interés en una disposición 5' a 3', en el que dicha proteína de exportación es una proteína citolisina A (ClyA) de Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) que tiene una actividad hemol�tica sustancialmente reducida en comparación con la proteína ClyA de SEQ ID NO:2, teniendo dicha proteína de exportación la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y teniendo una mutación seleccionada del grupo que consiste en una mutación S195N, una mutación I198N, una mutación A199D, una mutación E204K y una mutación C285W.

En otras realizaciones igualmente preferidas del vector de expresión, la proteína citolisina A (ClyA) de S. Typhi tiene la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y una mutación individual seleccionada del grupo que consiste en una mutación S195N, una mutación I198N, una mutación A199D, una mutación E204K y una mutación C285W; una mutación doble I198N, C285W; y una mutación triple I198N, A199D, E204K. La proteína citolisina A (ClyA) de S. Typhi también puede tener la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y una mutación C285W, as� como una mutación adicional seleccionada del grupo que consiste en una mutación I198N, una mutación A199D, y una mutación E204K. Se describen vectores en los que la proteína citolisina A (ClyA) de S. Typhi tiene la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y la proteína de interés es la toxina de ántrax PA83.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 proporciona ejemplos de los vectores de expresión de esta invención. La figtura 1A ilustra el vector de expresión pSEC84. La figura 1B ilustra el vector de expresión pSEC84bla. La figura1C ilustra pSEC84sacB. La figura 1D ilustra pSEC84gfpuv.

La figura 2 ilustra la exportación de la proteína de fusión de ClyA-SacB que se produce en el metabolismo de la sacarosa en el medio de crecimiento sólido. Las cepas se cultivaron en medio que contenía sacarosa al 8% (2A y 2B), sacarosa al 16% (2C y 2D), o sacarosa al 8% + L-arabinosa al 8% (2E y 2F). Las figuras 2A, 2C, y 2E muestran el crecimiento de CVD 908-htrA que expresa ClyA. Las figuras 2B, 2D, y 2F muestran el crecimiento de CVD 908htrA que expresa ClyA-SacB.

La figura 3 ilustra el crecimiento de CVD 908-htrA que expresa ClyA (pSEC84) o ClyA-SacB (pSEC84sacB), cultivado en caldo 2XLB50 suplementado con DHB y sacarosa al 10% o glucosa al 10%.

La figura 4 ilustra un análisis de la inmunotransferencia Western de fracciones de células bacterianas de CVD 908htrA (carriles 1-3) o CVD 908-htrA(pSEC84gfpuv) (carriles 4-8). Las fracciones celulares se cargan como sigue: sobrenadantes, carriles 1 y 4; citopl�smica, carriles 2 y 6; peripl�smica, carril 5; insoluble, carril 7; célula entera, carriles 3 y 8; y 50 ng de GFPuv, carril 9. Las membranas con muestras idénticas se sondaron con anticuerpos específicos para GFPuv (panel A) o GroEL de E. coli (panel B).

La figura 5 muestra el pl�smido de expresión pSEC92gfpuv. El pSEC92gfpuv tiene una inserción de una secuencia de clyA de Salmonella Typhi con optimización de codones. En otra derivación de este pl�smido de expresión, pSEC93gfp tiene la misma estructura genética que pSEC92gfpuv, excepto que tiene tres mutaciones puntuales, I198!N, A199!D, E204!K en la secuencia de clyA.

La figura 6 muestra inmunotransferencias de mutantes de clyA no hemol�ticos. La ClyA de tipo salvaje ("wt-clyA", hemol�tica) y los mutantes no hemol�ticos se expresan como proteínas de fusión de ClyA fusionada con la proteína fluorescente indicadora GFPuv expresada de pl�smidos derivados de pSEC92gfpuv en DH5∀. A. Detección de las proteínas de fusión de ClyA::GFPuv en los sobrenadantes del cultivo de wt clyA (hemol�tica) o los mutantes de clyA (no hemol�ticos). B. Detección de GroEL en los sobrenadantes del cultivo.

La figura 7 muestra la actividad hemol�tica cuantificada de los mutantes de un solo amino�cido de ClyA. ClyA y sus mutantes no hemol�ticos se expresan desde pl�smidos derivados de pSEC92gfpuv en E. coli DH5∀.

La figura 8 muestra inmunotransferencias de mutantes de ClyA no hemol�ticos. La wt ClyA (hemol�tica) y los mutantes no hemol�ticos se expresan en Salmonella Typhi CVD 908-htrA como proteínas de fusión codificadas por pl�smidos derivados de pSEC92gfpuv. A. Detección de GFPuv en los sobrenadantes del cultivo de wt ClyA o los mutantes de ClyA no hemol�ticos. B. Detección de GroEL en los sobrenadantes del cultivo. 1, mutante de clyA no hemol�tico que porta la mutación I198!N. 2, wt ClyA. 3, mutante triple de ClyA no hemol�tico que porta I198!N, A199!D, E204!K. 4, extracto de células enteras de Salmonella Typhi CVD 908-htrA sin pl�smido.

La figura 9 muestra la actividad hemol�tica del mutante triple de clyA no hemol�tico (I198!N, A199!D y E204!K) expresado en Salmonella Typhi CVD 908-htrA desde el pl�smido pSEC93gfp.

La figura 10 muestra los resultados de un experimento de inmunogenicidad en el que se inmunizaron ratones por vía intranasal con dos dosis (109 unidades formadoras de colonias (CFU) por dosis) de cepas de vectores vivos atenuados CVD 908-htrA que portan pl�smidos derivados de pSEC92gfpuv que expresan proteínas variantes de fusión de ClyA no hemol�tica::GFPuv. Todos los ratones recibieron un refuerzo intramuscular con GFPuv purificada en el día 42. Los resultados se indican como la media geométrica de las titulaciones (en unidades de ELISA (EU)) de IgG s�rica frente al dominio GFPuv de ClyA::GFPuv.

La figura 11 proporciona un alineamiento de una porción de la secuencia de amino�cidos de ClyA de S. Typhi de tipo salvaje ("wt ClyA"), la secuencia del variante I198N, y la secuencia del variante I198N, A199D, E204K.

La figura 12 muestra inmunotransferencias de mutantes de clyA no hemol�ticos. Carril 1 - marcador de proteínas caleiodosc�pico; carril 2 - CVD908htrA; carril 3 - CVD908htrA(pSEC91-83); carril 4 - CVD908-htrAssb(pS-CPA83-I198N) - mutante individual 1; carril 5 - CVD908-htrAssb(pS-CPA83-C285W) - mutante individual 2; carril 6 -CVD908-htrAssb(pS-CPA83-DM) - mutante doble; carril 7 - proteína purificada PA83 (250 ng).

La figura 13 muestra la actividad hemol�tica cuantificada de los mutantes de un solo amino�cido y de dos amino�cidos de ClyA. ClyA y sus mutantes no hemol�ticos se expresan desde diferentes pl�smidos en CVD908htrA y CVD908htrA-ssb.

La figura 14 muestra los resultados de un experimento de inmunogenicidad en el que se inmunizaron ratones por vía intranasal con dos dosis (109 unidades formadoras de colonias (CFU) por dosis) de cepas de vectores vivos atenuados CVD 908-htrA que portan pl�smidos derivados de pGEN222A3s que expresan proteínas variantes de fusión de ClyA no hemol�tica::PA83. Todos los ratones recibieron un refuerzo intramuscular con la proteína PA83 más alhidrogel. Los resultados se indican como la media geométrica de las titulaciones (en unidades de ELISA (EU)) de IgG s�rica frente al dominio PA83 de ClyA::PA83.

La figura 15 muestra los resultados de la comparación del porcentaje de ratones con seroconversi�n y GMT después de una vacunación con vectores vivos CVD908htrA que portan pl�smidos con sistemas de exportación de ClyA de tipo salvaje y mutantes de ClyA no hemol�ticos.

Descripci�n detallada de la realización preferida

La siguiente descripción proporciona un sistema de exportación de proteínas para producir, de forma eficaz, proteínas recombinantes desde un organismo hospedante. En una realización preferida, el sistema de exportación de proteínas utiliza la maquinaria de exportación de proteínas end�gena del organismo hospedante en el que se introduce el vector del sistema de exportación de proteínas. El organismo hospedante puede ser un procariota, tal como una bacteria, o un virus.

El sistema de exportación de proteínas tiene una serie de aplicaciones útiles. El sistema puede utilizarse para producir, de forma eficaz, proteínas recombinantes de interés dentro de un organismo hospedante y exportar la proteína de interés recombinante desde el organismo hospedante. Por ejemplo, el sistema descrito puede utilizarse para producir, de forma eficaz, proteínas de interés recombinantes en un biorreactor.

El sistema de exportación de proteínas también puede utilizarse para proporcionar a un animal un material antig�nico contra el cual puede organizarse una respuesta inmunol�gica. Por ejemplo, en una realización, una bacteria atenuada, tal como Salmonella, Escherichia, Shigella, Vibrio o Clostridium spp., se transforma con los componentes del sistema de exportación de proteínas. Las bacterias recombinantes después pueden utilizarse como una composición inmunog�nica de vectores vivos capaz de facilitar la generación de una respuesta inmunol�gica en un animal. El sistema de exportación de proteínas puede utilizarse con una diversidad de ant�genos de interés. Las realizaciones específicas incluyen composiciones inmunog�nicas dirigidas contra la fiebre tifoidea, el ántrax, la peste, la colitis pseudomembranosa y otras enfermedades. También se describen composiciones inmunog�nicas que expresan ant�genos que son exportados desde un organismo hospedante recombinante con un mínimo de lisis.

A. Sistema de exportación de proteínas de la familia HlyE

La siguiente descripción se refiere al uso de los miembros de la familia HlyE en un sistema de exportación de proteínas para facilitar la expresión de proteínas. Los miembros de la familia HlyE pueden utilizarse para facilitar la exportación de proteínas producidas de modo recombinante desde sus hospedantes bacterianos. Se cree que los sistemas de expresión que exportan proteínas producidas de modo recombinante facilitan una mayor producción de proteínas. El sistema de exportación de proteínas descrito también puede utilizarse para preparar composiciones inmunol�gicas con las que vacunar a animales.

Se ha observado que las velocidades de crecimiento de organismos recombinantes que contienen vectores de expresión disminuyen a medida que aumenta el nivel de expresión de un gen de interés. La disminución en el crecimiento puede activar la inducción de diversas proteasas celulares que pueden degradar la proteína recombinante expresada. Por tanto, una menor velocidad de crecimiento es la consecuencia inevitable de la carga metabólica que, a su vez, es el resultado acumulado de una serie de perturbaciones fisiológicas. Por ejemplo, se

producen perturbaciones fisiológicas debido a la expresión y la acumulación de la proteína de interés dentro de la bacteria hospedante. Esta acumulación puede ser perjudicial para la viabilidad de la bacteria hospedante y, as�, constituir una presión de selección negativa.

Debido a que las cargas metabólicas, tales como las analizadas arriba, crean una presión selectiva sobre la pérdida de los vectores de expresión residentes en ausencia de selección, puede producirse una pérdida significativa de los vectores de expresión desde la bacteria hospedante después de que la bacteria hospedante haya sido transformada con el vector de expresión que contiene el gen de interés. La pérdida espontánea del pl�smido elimina cualquier carga metabólica de la bacteria hospedante y permite que las bacterias sin pl�smidos sobrepasen con rapidez a la población de bacterias que portan pl�smidos. La mayor cantidad de células bacterianas que no contienen el vector de expresión y, por tanto, que no expresan la proteína de interés reduce los niveles de producción de proteínas en su conjunto. Por tanto, las bacterias hospedantes que no est�n genéticamente constre�idas para mantener vectores de expresión que dirigen la síntesis de altos niveles de una proteína de interés concreta pueden producir una cantidad significativamente menor de proteínas.

Una realización preferida para exportar la proteína de interés expresada de modo recombinante comprende aprovechar un sistema de exportación end�geno en la bacteria hospedante que contiene el vector de expresión. El aprovechamiento de un sistema de exportación end�geno resulta ventajoso en parte debido a que evita la necesidad de grandes cantidades de ADN heter�logo que codifica proteínas exóticas para suministrar un sistema de exportación ex�geno. No obstante, los sistemas de exportación de proteínas que utilizan sistemas de exportación exígenos también se incluyen en la presente descripción.

Un candidato a sistema de exportación end�geno atractivo es la hemolisina críptica (ClyA), codificada por el gen de citolisina A (clyA) dentro del cromosoma de Salmonella enterica serovar Typhi (en lo sucesivo "S. Typhi"), un miembro de la familia de proteínas HlyE. La familia HlyE consiste en homólogos cercanos de E. coli, Shigella flexneri y S. Typhi y otras bacterias.

Para fines ilustrativos, se analiza la estructura de las proteínas de los miembros de la familia HlyE, haciendo referencia a la proteína HlyE de E. coli. La proteína de E. coli es una hemolisina bien caracterizada desde el punto de vista funcional, que forma poros y est� codificada cromos�micamente denominada HlyE (también conocida como ClyA y hemolisina A silenciosa (SheA)). Consiste en 303 restos amino�cidos (34 kDa). Su transcripción est� positivamente controlada por SlyA, un regulador que se encuentra en varias bacterias ent�ricas. HlyE forma poros transmembrana estables moderadamente selectivos para cationes con un diámetro de 2,5-3,0 nm en las bicapas lip�dicas. La proteína se une al colesterol, y la formación de poros en una membrana es estimulada si la membrana contiene colesterol. La estructura cristalina de HlyE de E. coli se ha resuelto hasta una resolución de 2,0 �, y se ha logrado la visualización de la forma asociada a lípidos de la toxina a baja resolución mediante microscop�a electrónica. La estructura muestra un complejo haz helicoidal con una longitud de aproximadamente 100 �. Oligomeriza en presencia de lípidos para formar poros transmembrana.

HlyE es una molécula con forma de bastoncillo ondulado con una región transmembrana de 27 restos hidrófoba. Esta región comprende un terminal de la molécula plegada y se ha propuesto que forma un poro dentro de una membrana diana. La formación del poro conduce, en último término, a la lisis de la célula diana. En elegantes estudios de microscop�a electrónica, Wallace et al. han demostrado que HlyE se inserta en vesículas lip�dicas para formar poros formados por 8 mon�meros de HlyE.

Aunque se ha aclarado la formación de poros facilitada por HlyE, el mecanismo mediante el cual HlyE y los homólogos de HlyE son exportados hacia el exterior de la bacteria sigue sin estar claro. Además, la manera en que la hemolisina se inserta en las membranas diana para ensamblarse en poros tampoco se entiende por completo. Del Castillo et al. describen la secreción dependiente de la fase de crecimiento de actividad hemol�tica, que alcanza su máximo durante la fase semilogar�tmica y desaparece al principio de la fase estacionaria (Del Castillo, F.J., S.C. Leal, F. Moreno, e I. del Castillo, 1997, The Escherichia coli K-12 sheA gene encodes a 34-kDa secreted haemolysin, Mol. Microbiol., 25:107-115). Ludwig et al. han indicado que la secreción de esta hemolisina críptica viene acompañada por la pérdida de proteínas peripl�smicamente confinadas, pero no viene acompañada por la pérdida de proteínas citopl�smicas, lo cual es una prueba en contra de la lisis celular completa para liberar HlyE (Ludwig, A., S. Bauer, R. Benz, B. Bergmann, y W. Goebel, 1999, Analysis of the SlyA-controlled expression, subcellular localization and pore-forming activity of a 34 kDa haemolysin (ClyA) from Escherichia coli K-12, Mol. Microbiol., 31:557-567).

Adem�s, cuando se compara con la secuencia codificada por hlyE, la secuenciaci�n N-terminal de HlyE segregada revela que HlyE no se procesa N-terminalmente durante el transporte. Oscarsson et al. han indicado que HlyE se une al colesterol y que la presencia de colesterol en las membranas diana estimula la formación de poros y la lisis (Oscarsson, J., Y. Mizunoe, L. Li, X. Lai, A. Wieslander, y B.E. Uhlin, 1999, Molecular analysis of the cytolytic protein ClyA (SheA) from Escherichia coli, Mol. Microbiol., 32:1226-1238). Se ha calculado que aproximadamente 103 moléculas de HlyE son necesarias para la lisis de un eritrocito diana, lo cual sugiere una significativa acumulación de HlyE antes de la detección de la lisis celular. HlyE es muy estable dentro de un intervalo de valores de pH entre 3,0 y 9,0, y es resistente a la ruptura por proteasas, incluyendo la tripsina y la pepsina (Atkins, A., N.R. Wybom, A.J. Wallace, T.J. Stillman, L.K. Black, A.B. Fielding, M. Hisakado, P.J. Artymiuk, y J. Green, 2000,

Structure-function relationships of a novel bacterial toxin, hemolysin E. The role of ∀G, J. Biol. Chem., 275:41150-41155).

La familia de proteínas HlyE generalmente provoca hemolisis en las células diana. Los miembros de la familia de HlyE hemol�ticamente activos o inactivos pueden utilizarse con las indicaciones descritas. Por ejemplo, se sabe que una mutación del gen hlyE puede reducir o eliminar la actividad hemol�tica. Por ejemplo, se ha indicado la pérdida de la actividad hemol�tica cuando hlyE est� mutado de tal forma que aparecen sustituciones de amino�cidos en las posiciones 180, 185, 187 y 193. De modo específico, G180V, V185S, A187S y I193S dan como resultado la pérdida de la actividad hemol�tica de una proteína HlyE expresada a partir de un gen hlyE mutado.

La presente descripción utiliza las características de exportación de la familia de proteínas HlyE para producir un sistema de exportación de proteínas. Por ejemplo, se describen proteínas de fusión que comprenden cualquier miembro de la familia HlyE y una proteína de interés. De modo más específico, se describen proteínas de fusión que comprenden ClyA de S. Typhi y una proteína de interés. Tal como se analiza a continuación, las proteínas de fusión que contienen ClyA se exportan desde la célula hospedante bacteriana y hacia el medio circundante. Esta característica del sistema de expresión comprende un componente de proteína de fusión de una proteína de exportación::proteína de interés que facilita la producción de la proteína de interés y la exportación de la proteína de fusión de una proteína de exportación::proteína de interés. En realizaciones preferidas, se emplean variantes de miembros de la familia HlyE que carecen de actividad hemol�tica o que tienen una actividad hemol�tica reducida como proteínas de exportación.

B. Sistema de exportación de la proteína citolisina A (ClyA)

Una realización preferida de la presente descripción se refiere al uso de la proteína citolisina A (ClyA) de S. Typhi en un sistema de exportación de proteínas. ClyA de S. Typhi fue descrita por primera vez por Wallace et al., que también indicaron la estructura cristalina para la hemolisina homóloga de E. coli ((Wallace, A.J., T.J. Stillman, A. Atkins, S.J. Jamieson, P.A. Bullough, J. Green, y P.J. Artymiuk, 2000, E. coli hemolysin E (HlyE, ClyA, SheA): X-ray crystal structure of the toxin and observation of membrane pores by electron microscopy, Cell, 100:265-276). Esta hemolisina ha sido descrita previamente y se ha denominado de forma diversa como ClyA, HlyE, o SheA. Para evitar confusiones, la hemolisina de E. coli se denomina en la presente HlyE y es codificada por hlyE. También por claridad, la hemolisina de S. Typhi se denomina en la presente ClyA y es codificada por clyA.

Se ha resuelto la estructura cristalina de ClyA en E. coli (Wallace et al., 2000). La estructura exclusiva puede dividirse en líneas generales en varios dominios, un dominio de cabeza, un dominio de cuerpo y un dominio de cola. El dominio de cuerpo consiste en un haz de hélices (A, B, C, D, F). El dominio de cola es una hélice G que se extiende hasta la mitad de la longitud del cuerpo. El dominio de cabeza consiste en una horquilla # corta (lengua-#) y dos pequeñas hélices (D y E), que flanquean cada una a la lengua-#. Wallace et al. sugieren que la lengua-# puede ser fundamental para la formación de poros y, por tanto, para la actividad hemol�tica (Wallace et al., 2000). A través de mutag�nesis específica dirigida a sitio, Oscarsson et al. han descubierto muchas regiones de ClyA que son importantes para la actividad hemol�tica (Oscarsson et al., 1999). Pero su estrategia de mutag�nesis puede haber distorsionado la estructura de ClyA y haber afectado a la exportación de ClyA sin abolir realmente la actividad hemol�tica per se.

Un gen clyA de aproximadamente 1 kb ha sido clonado de S. Typhi CVD 908-htrA para su uso en un sistema de exportación de proteínas. La proteína ClyA se exporta de E. coli y S. Typhi y es capaz de exportar proteínas pasajeras que han sido genéticamente condensadas con el extremo 3'-terminal del marco de lectura abierto de clyA. La proteína pasajera indicada en la presente también se denomina proteína de interés. Se ha demostrado que el plegamiento apropiado de estas proteínas de fusión se produce de tal forma que se mantiene la actividad biológica inherente de los dominios implicados.

La secuencia de nucleótidos y de amino�cidos para el gen clyA de S. Typhi y la proteína ClyA aisladas se proporcionan en SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:21 es la secuencia de nucleótidos de tipo salvaje recuperada de Salmonella serovar Typhi cepa Ty2. En SEQ ID NO:33 se proporciona una versión sintética con optimización de codones del gen clyA de S. Typhi, según se describe y se utiliza en la presente. Otros miembros de la familia HlyE que pueden utilizarse como proteínas de exportación en la presente también est�n disponibles y son conocidos por los expertos en la técnica. Los miembros de la familia incluyen una segunda citolisina A de S. Typhi (el gen clyA se indica en SEQ ID NO:22 y est� disponible en GENBANK n.� de registro AJ313034); citolisina A de Salmonella paratyphi (la secuencia del gen clyA para la citolisina A se indica en SEQ ID NO:23 y est� disponible en GENBANK n.� de registro AJ313033); HlyE truncada de Shigella flexneri (la secuencia del gen hlyE se indica en SEQ ID NO:24 y est� disponible en GENBANK n.� de registro AF200955); HlyE de Escherichia coli (la secuencia del gen hlyE se indica en SEQ ID NO:25 y est� disponible en GENBANK n.� de registro AJ001829).

C. Variantes no hemol�ticos de los miembros de la familia HlyE

Tal como se indicó anteriormente, la familia de proteínas HlyE generalmente provoca la citolisis de las células diana, que incluye la hemolisis de eritrocitos. Debido a que puede considerarse que las citolisinas/hemolisinas son factores

de virulencia, la presente invención utiliza variantes de los miembros de la familia HlyE que han sido mutados de modo que carecen de actividad hemol�tica o tienen actividad hemol�tica reducida. La capacidad de estos variantes para ser exportados desde una célula bacteriana que los produce, solos o en el contexto de una fusión con una proteína de interés, se mantiene. As�, los variantes no hemol�ticos de los miembros de la familia HlyE tienen actividad hemol�tica reducida o no tienen actividad hemol�tica, pero siguen siendo totalmente funcionales en los sistemas de exportación de proteínas de la presente invención.

Los variantes no hemol�ticos de los miembros de la familia HlyE pueden tener una serie de mutaciones genéticas en la secuencia polinucleot�dica que los codifica, de modo que la actividad hemol�tica del variante se reduce o se abole completamente. Para conservar otras actividades y funciones de los variantes, resulta preferible que se realice el menor número de mutaciones en la secuencia codificadora de los variantes. En particular, pueden realizarse mutaciones en la secuencia codificadora de un miembro de la familia HlyE de modo que solo se produzcan 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más cambios de amino�cidos. Los cambios de amino�cidos incluyen deleciones, adiciones y sustituciones. Las sustituciones de amino�cidos pueden ser sustituciones de amino�cidos conservativas o no conservativas. Las mutaciones pueden realizarse en cualquier región del polinucle�tido que codifica el variante, pero en realizaciones preferidas, la mutación o mutaciones producen sustituciones de amino�cidos en la lengua-beta o la hélice pequeña E.

Tal como se indicó anteriormente, la actividad hemol�tica de los variantes no hemol�ticos de los miembros de la familia HlyE de la presente invención puede estar reducida o completamente abolida. Cuando la actividad hemol�tica est� reducida, la reducción es de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de reducción en la actividad, comparado con el miembro de la familia de tipo salvaje a partir del cual se deriva el variante. Tal como se emplea en la presente, un variante no hemol�tico de un miembro de la familia HlyE de la presente invención que tienen una actividad hemol�tica "sustancialmente reducida" es un variante que muestra una reducción de al menos aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de la actividad hemol�tica de la proteína de tipo salvaje de la cual se deriva. La actividad hemol�tica específica puede medirse cuantificando la liberación de hemoglobina desde los eritrocitos, según se describe en Sansonetti et al., 1986, Infect. Immun., 51: 461-469.

Los expertos en la técnica entenderán que, aunque cada uno de los variantes de la presente invención mantiene la capacidad para ser exportado desde la célula en que se produce, solo o como una fusión con una proteína de interés, puede ser aceptable una pequeña reducción en la capacidad del variante para ser exportado. Por tanto, la presente invención también incluye los variantes que tienen una actividad hemol�tica reducida o abolida, junto con una reducción en la capacidad para ser exportados de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50% en comparación con el miembro de la familia de tipo salvaje del cual se deriva el variante.

El variante no hemol�tico de un miembro de la familia HlyE para su uso en la presente invención es un variante no hemol�tico de la proteína ClyA de S. Typhi. Estos variantes de ClyA de S. Typhi incluyen los que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más cambios de amino�cidos. Además, estos variantes de ClyA de S. Typhi tienen una reducción en la actividad hemol�tica de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% comparado con la proteína ClyA de S. Typhi de tipo salvaje. Además, estos variantes de ClyA de S. Typhi pueden presentar una reducción en la capacidad para ser exportados de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50% en comparación con la proteína ClyA de S. Typhi de tipo salvaje.

Los expertos en la técnica entenderán que las mutaciones pueden introducirse en la secuencia que codifica ClyA de

S. Typhi utilizando una diversidad de técnicas, que incluyen kits disponibles en el mercado para la mutag�nesis específica dirigida a sitio. Los variantes para su uso en la presente invención pueden producirse introduciendo mutaciones solo en la secuencia que codifica ClyA de S. Typhi, o en una secuencia que codifica una proteína de fusión que comprende ClyA de S. Typhi genéticamente condensada con una secuencia que codifica una proteína de interés o una proteína indicadora. En una realización, la secuencia que codifica ClyA de S. Typhi est� condensada con una secuencia que codifica la proteína fluorescente verde (GFPuv) para producir una fusión genética clyA::gfpuv. Se sabe que GFPuv no fluoresce si est� condensada con dominios cadena arriba que no se pliegan de forma correcta. Por tanto, una fusión genética clyA::gfpuv puede utilizarse para seleccionar los mutantes no hemol�ticos, fluorescentes y con un plegamiento correcto, que es probable que sean exportados correctamente.

Adem�s, de los variantes no hemol�ticos de los miembros de la familia HlyE, se describen proteínas de fusión que comprende un miembro de la familia HlyE de tipo salvaje unido a una proteína de interés. Debido a las características innatas de algunas proteínas de interés, simplemente la creación de una proteína de fusión que comprenda un miembro de la familia HlyE de tipo salvaje y una proteína de interés puede dar como resultado la producción de una proteína de fusión que sea exportada desde la célula en la que se produce, pero que tiene actividad hemol�tica reducida o abolida. Un ejemplo de dicha proteína de fusión comprende la proteína ClyA de S. Typhi unida a la proteína de la toxina del ántrax PA83. La fusión de proteínas ClyA::PA83 conserva la capacidad de ser exportada desde la célula en que se produce, pero tiene actividad hemol�tica reducida.

Los variantes no hemol�ticos de la proteína ClyA de S. Typhi incluyen los variantes mostrados en la tabla 1 que tienen una mutación individual en la posición indicada. La "posición" y la secuencia de tipo salvaje ("wt") indicadas en la tabla 1 se corresponden con la secuencia de amino�cidos del polip�ptido de ClyA de S. Typhi que aparece en SEQ ID NO:2. El "dominio" es el dominio particular del polip�ptido de ClyA de S. Typhi. Las sustituciones de amino�cidos de una sola letra en la tabla 1, y tal como se emplean en la presente, son: Alanina - A; Arginina - R; Asparagina - N; ácido asp�rtico - D; Ciste�na - C; ácido glut�mico -E; Glutamina -Q; Glicina -G; Histidina - H; Isoleucina - I; Leucina - L; Lisina - K; Metionina -M; Fenilalanina - F; Prolina - P; Serina - S; Treonina - T; Tript�fano -W; Tirosina - Y; Valina -V.

Tabla 1

Clon

Posición wt Mutación Dominio SEQ ID NO:

M133

109 A T ∀C

M165

109 A V ∀C

M188

116 L Q ∀C

M187

148 L P ∀C

M179

163 S C vuelta entre ∀C y ∀D

M103

195 S N lengua-#

M30

198 I N ∀E 30

M128

199 A D ∀E

M135

204 E K ∀E

M182

204 E D ∀E

M109

205 G D ∀E

M64

207 L R ∀F

M185

215 L P ∀F

M163

225 L S ∀F

M176

229 V L ∀F

M150

281 M K ∀G

M171

284 T P ∀G

M148

285 C W ∀G

La mutación C285W de ClyA de S. Typhi altera un puente de ciste�na intramolecular natural que evita la 10 oligomerizaci�n de ClyA necesaria para la formación de poros citol�tica.

Vectores de expresión de proteínas de exportación

El sistema de exportación de proteínas descrito en la presente puede utilizarse para expresar y exportar una amplia variedad de proteínas de fusión que comprenden una proteína de exportación y una proteína de interés. En una realización, la proteína de interés es codificada por un gen de interés. El gen de interés puede ser extraño a la

15 bacteria que contiene el sistema de exportación de proteínas o puede ser un gen que es end�geno de la bacteria. Generalmente, una construcción de prote�n de fusión de una proteína de exportación::proteína de interés est� presente en el módulo de expresión que, a su vez, est� presente en un vector de expresión. Cada una de estas unidades se analiza a continuación.

Vectores de expresión

20 El sistema de exportación de proteínas utiliza un vector de expresión para facilitar la producción recombinante de la proteína de interés. Generalmente, el vector de expresión comprender� un origen de la replicaci�n y otras características estructurales que controlan y regulan el mantenimiento del vector de expresión en la célula hospedante. Por definición, la expresión "vector de expresión" se refiere a un pl�smido, un virus u otro vehículo

conocido en la técnica que ha sido manipulado mediante la inserción o la incorporación del módulo de expresión que comprende la proteína de fusión de la proteína de exportación::proteína de interés. Un ejemplo de un sistema de vector de expresión que describe vectores de expresión que confieren estabilidad al pl�smido en dos niveles independientes se describe en Galen, et al., Immun., 67:6424-6433 (1999), y en la solicitud de patente de EEUU n.� de serie 09/204.117, presentada el 2 de diciembre, 1998, ahora patente de EEUU n.� 6.413.768, y n.� de serie 09/453.313, presentada el 2 de diciembre, 1999, ahora patente de EEUU n.� 6.703.233.

Los ejemplos de vectores de expresión que pueden utilizarse incluyen los que aparecen en la figura 1, que incluyen pSEC84, pSEC84bla, pSEC84sacB, pSEC84toxC, pSECgfpuv, pSEC92gfpuv, pSEC93gfpuv, pSEC92M30gfpuv, pGEN222A3S, y pGEN222A3S-ClyA-PA83. Otros vectores incluyen los pl�smidos de bajo número de copias derivados de pSC101, que incluyen pGEN206 y pSEC10, y sus fusiones, tales como pSEC91-83 y pSEC10-83S (Galen et al., Immunol. Cell Biol., 5 de mayo, 2009, pp. 1-13; Galen et al., J. Infect. Dis., 119:326-335 (2009)). La tecnología de los módulos permite adaptar cualquier replic�n para la expresión de variantes de ClyA porque el módulo de fusión de clyA (que comprende el promotor ompC, clyA, y un compañero de fusión cadena abajo) est� completamente autoconstre�ido y requiere solo un replic�n plasm�dico para poder utilizarse con éxito en cualquier entorno bacteriano permisivo. As�, puede utilizarse cualquiera de los vectores descritos en la presente y cualquier otro vector conocido en la técnica por ser útil para los objetivos contemplados en la presente. Además, cada uno de los vectores de expresión descritos en la presente puede utilizarse según se proporciona. Sin embargo, los expertos en la técnica comprenderán que estos vectores de expresión también pueden utilizarse como un vector de esqueleto a partir del cual puede retirarse la secuencia que codifica la proteína de exportación, la secuencia que codifica la proteína de interés, o la secuencia que codifica la proteína de fusión de la proteína de exportación::proteína de interés (cuando est�n presentes) y reemplazarse por una secuencia diferente que codifique estos elementos. Por ejemplo, la secuencia que codifica GFPuv en pSEC93gfpuv puede retirarse y reemplazarse por una secuencia que codifique un ant�geno de interés.

M�dulos de expresión de proteína de fusión-proteína de exportación

El sistema de exportación de proteínas descrito en la presente puede utilizarse para expresar y exportar una amplia variedad de proteínas de fusión que comprenden una proteína de exportación y una proteína de interés. La proteína de interés es codificada por la secuencia codificadora de la proteína de interés, que también es el gen de interés. El gen de interés puede ser extraño a la bacteria que contiene el sistema de exportación de proteínas o puede ser un gen que es end�geno de la bacteria. La proteína de interés puede variar desde un único amino�cido a proteínas que tienen varias veces el tamaño de la molécula de la proteína de exportación. Más preferiblemente, la proteína de interés puede variar desde diez amino�cidos a dos veces el tamaño de la proteína de exportación. Resulta preferible que el tamaño de la proteína de interés sea tal que no interfiera con la capacidad de la proteína de exportación para ser exportada enteramente hacia el exterior de la bacteria. Los ejemplos de proteínas de interés tienen de 0 kDa hasta al menos 50 kDa de masa. También pueden utilizarse masas mayores, y as� proteínas más largas, como proteínas de interés. Por ejemplo, las proteínas de interés peuden tener una masa de 55 kDa, 60 kDa, 65 kDa, 70 kDa, 75 kDa, 80 kDa, 85 kDa, 90 kDa, 95 kDa, 100 kDa, o mayor.

Como alternativa, la proteína de interés puede consistir en 1 a 1000 amino�cidos o más. Por ejemplo, la proteína de interés puede tener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 amino�cidos o más.

Generalmente, el gen de interés que se va a expresar est� presente en un módulo de expresión. Un módulo de expresión generalmente contendr� características estructurales adecuadas, tales como un promotor, un terminador, etc., para permitir la transcripción del gen de interés.

Las secuencias polinucleot�dicas que codifican una proteína de fusión de una proteína de exportación::proteína de interés (también conocidas como "secuencias codificadoras de la proteína de fusión de una proteína de exportación::proteína de interés") pueden estar unidas operativamente a secuencias de control de la expresión para formar un módulo de expresión. La expresión "unido operativamente" se refiere a una juxtaposici�n en la que los componentes descritos est�n en una relación que les permite funcionar según su manera prevista. Una secuencia de control de la expresión unida operativamente a una secuencia codificadora est� acoplada de modo que se logra la expresión de la secuencia codificadora bajo condiciones compatibles con las secuencias de control de la expresión. Tal como se emplea en la presente, la expresión "secuencias de control de la expresión" se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que regulan la expresión de una secuencia de ácido nucleico al cual est�n unidas operativamente. Las secuencias de control de la expresión est�n unidas operativamente a una secuencia de ácido nucleico cuando las secuencias de control de la expresión controlan y regulan la transcripción y, según sea apropiado, la traducción de la secuencia del ácido nucleico. As�, las secuencias de control de la expresión pueden incluir promotores apropiados, terminadores de la transcripción, secuencias de unión a ribosomas optimizadas, un cod�n de inicio (es decir, ATG) delante de un gen codificador de proteína, el marco de lectura correcto de ese gen para permitir la traducción apropiada del ARNm, y codones de fin. La expresión "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, los componentes cuya presencia pueden influir en la expresión, y también puede incluir otros componentes cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias conductoras. Las secuencias de control de la expresión pueden incluir un promotor.

Un "promotor" es la secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción. También incluye los elementos promotores que son suficientes para hacer que la expresión del gen dependiente del promotor sea controlable por agentes o señales externos específicos del tipo celular, específicos del tejido, o sea inducible por agentes o señales externos; estos elementos pueden estar localizados en las regiones 5' o 3' de la secuencia codificadora de la proteína de fusión de la proteína de exportación::prote�n� de interés. Tanto los promotores constitutivos como los promotores inducibles son útiles con los métodos descritos. La expresión de las secuencias codificadoras de proteínas de fusión de una proteína de exportación::proteína de interés puede ser dirigida por una serie de promotores. Aunque puede utilizarse el promotor end�geno de una proteína de exportación para la regulaci�n transcripcional del módulo de expresión, preferiblemente el promotor es una secuencia reguladora extra�a. Un ejemplo de un promotor end�geno inducible es el promotor ompC que puede utilizarse para dirigir la transcripción del módulo de expresión.

Los promotores útiles en la invención incluyen promotores naturales constitutivos e inducibles, as� como promotores modificados. Un promotor inducible preferido debería 1) proporcionar una baja expresión en ausencia del inductor; 2) proporcionar una alta expresión en presencia del inductor; 3) utilizar un esquema de inducción que no interfiera con la fisiología normal de la célula hospedante; y 4) tener poco o ningún efecto sobre la expresión de otros genes. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen los inducidos por medios químicos. Los expertos en la técnica conocerán otros promotores, tanto constitutivos como inducibles.

El promotor concreto seleccionado debe ser capaz de provocar una expresión suficiente como para dar como resultado la expresión de una cantidad eficaz de la proteína de fusión de una proteína de exportación::proteína de interés. La cantidad eficaz de la proteína de fusión de una proteína de exportación::proteína de interés puede variar dependiendo del objetivo de la expresión. Los promotores utilizados en las construcciones de vectores de la presente descripción pueden modificarse, si se desea, para afectar a sus características de control.

La proteína de fusión de una proteína de exportación::proteína de interés que comprende la proteína de exportación y la proteína de interés también puede comprender marcadores de purificación introducidos en el módulo de expresión para ser expresados como parte de la proteína de fusión de una proteína de exportación::proteína de interés. El marcador se elige para facilitar la purificación de la proteína de fusión de una proteína de exportación::proteína de interés y/o la proteína de interés producida por los métodos descritos. Por ejemplo, puede introducirse una pluralidad de restos histidina en la porción C-terminal o la porción N-terminal de la proteína de interés para facilitar la purificación de las proteínas. Resulta preferible que la introducción del marcador minimice los plegamientos incorrectos de la proteína de interés.

Adem�s del marcador de polihistidina, existe una serie de otros marcadores de proteínas que pueden utilizarse para facilitar la purificación de las proteínas. Por ejemplo, con el sistema descrito pueden utilizarse marcadores antig�nicos, tales como el marcador de proteína de unión a la maltosa, un marcador de epitopo c-myc, un marcador de proteína fluorescente verde, un marcador de luciferasa, un marcador de beta-galactosidasa, un marcador de polihistidina o cualquier otro marcador de expresión de proteínas adecuado.

La proteína de fusión de una proteína de exportación::proteína de interés que comprende la proteína de exportación y la proteína de interés también puede comprender otras características para facilitar el uso de la proteína expresada y exportada. Por ejemplo, pueden introducirse sitios de reconocimiento de proteasas entre diversos componentes de la proteína de fusión de una proteína de exportación::proteína de interés, que incluyen, si resulta aplicable, los marcadores descritos anteriormente, para estimular la separación de los componentes de la proteína de fusión de una proteína de exportación::proteína de interés. Por ejemplo, puede introducirse un sitio de reconocimiento de proteasas entre las secuencias de la proteína de exportación y la proteína de interés en el módulo de expresión. Además, puede introducirse un sitio de reconocimiento de proteasas entre el marcador y las secuencias de la proteína de interés en el módulo de expresión. Estos sitios de reconocimiento de proteasas facilitan la separación de la proteína de exportación de la proteína de interés.

La proteína de fusión de una proteína de exportación::proteína de interés generalmente est� dispuesta de modo que la proteína de interés est� conectada al extremo carboxi-terminal de la proteína de exportación. Sin embargo, los expertos en la técnica comprenderán que, dependiendo de la identidad de la proteína de exportación y la proteína de interés, la proteína de fusión puede construirse de modo que la proteína de exportación est� conectada al extremo carboxi-terminal de la proteína de interés.

Opcionalmente, un marcador seleccionable puede estar asociado con el módulo de expresión. Tal como se emplea en la presente, el término "marcador" se refiere a un gen que codifica un rasgo o un fenotipo que permite la selección o la búsqueda de una célula hospedante que contiene el marcador. El gen marcador puede ser un gen de resistencia a antibióticos, con lo cual puede utilizarse el antibiótico apropiado para seleccionar las células hospedantes transformadas entre las otras células que no est�n transformadas, o el gen marcador puede ser cualquier otro gen de resistencia a fármacos. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados incluyen la adenosina desaminasa, dihidrofolato reeductasa, higromicina-B-fosfotransferasa, timidina quinasa, xantina-guanina fosforribosiltransferasa, resistencia a glifosfato y glufosinato, y amino-glic�sido 3'-O-fosfotransferasa II (resistencia a kanamicina, neomicina y G418). Los expertos en la técnica conocerán otros marcadores adecuados que pueden emplearse con las indicacaciones descritas.

Un ejemplo de un vector de expresión se muestra en la figura 1. En la figura 1A se muestra el vector de expresión pSEC84. La secuencia de nucleótidos del vector pSEC84 aparece en SEQ ID NO:1. La secuencia de amino�cidos de ClyA codificado por el gen clyA aparece en SEQ ID NO:2.

Cada vector que aparece en las figuras 1A-D comprende un promotor (PompC, un promotor ompC modificado controlado osm�ticamente de E. coli), una proteína de exportación (clyA), un origen de la replicaci�n, un terminador de la transcripción (T1), una función de reparto pasivo (par), la resistencia a kanamicina (aph), un sistema de muerte postsegregacional (hok-sok), y un sistema de reparto activo (parA). Debe advertirse que estos componentes del vector son solo ejemplos de una única realización del sistema descrito.

La figura 1B ilustra el vector de expresión pSEC84bla. Este vector de expresión contiene las mismas características que el vector pSEC84 y comprende además una construcción de proteína de fusión de una proteína de exportación::proteína de interés. De modo específico, el gen bla que codifica la #-lactamasa se clon� en el vector pSEC84 en el sitio Nhe I en la posición 1426 del vector de origen. Otras construcciones de fusión se muestran en la figura 1C (pSEC84sacB) y la figura 1D (pSEC84gfpuv).

La figura 5 ilustra otro vector, pSEC92gfpuv, que contiene la secuencia codificadora de ClyA de S. Typhi, en la que los codones han sido optimizados para la expresión en procariotas que incluyen, pero no se limitan a los géneros Salmonella y Escherichia. Los expertos en la técnica apreciarán que la optimización de codones de genes extraños introducidos en un hospedante bacteriano permite una alto nivel de expresión de la proteína extra�a codificada de interés. La presente invención describe la fusión genética de clyA con optimización de codones a gfpuv que codifica la proteína fluorescente verde GFPuv, codificada por el pl�smido de expresión pSEC92gfpuv. La secuencia de nucleótidos de clyA con optimización de codones se indica en SEQ ID NO:33. El pSEC92gfpuv es particularmente útil para la generación y el ensayo de diferentes mutaciones puntuales dentro del gen clyA. Se sabe que GFPuv no fluoresce si est� condensada a dominios cadena arriba que no se pliegan correctamente. Por tanto, una fusión ge�ntica clyA::gfpuv puede utilizarse para seleccionar mutaciones puntuales en la región codificadora de clyA que producen mutantes plegados correctamente fluorescentes no hemol�ticos, que es probable que sean exportados correctamente. El pSEC93gfpuv se deriva de pSEC92gfpuv, y codifica ClyA de S. Typhi con optimización de codones con la adición de tres mutaciones puntuales insertadas en la región codificadora de clyA: I198N, A199D y E204K, condensadas en la región codificadora de la proteína fluorescente verde (gfpuv).

Genes de interés

El sistema de exportación de proteínas descrito en la presente puede utilizarse con una diversidad de genes de interés. En una realización, el gen de interés codifica una proteína deseada. Cualquier proteína susceptible a la expresión bacteriana recombinante puede utilizarse con el sistema de exportación descritos. El gen de interés puede codificar cualquier polip�ptido tal como, por ejemplo, un polip�ptido de mamífero, tal como una enzima, un inhibidor de enzimas, una hormona, una linfoquina, un activador del plasmin�geno o cualquier otra proteína de interés. El gen de interés puede codificar un gen eucariota, un gen procariota, un gen vegetal o un gen v�rico de interés.

Una ventaja del sistema descrito es que proporciona un método mediante el cual proteínas que son tóxicas para la bacteria hospedante ahora pueden expresarse. Por ejemplo, la expresión recombinante de ciertas proteínas es complicada o imposible cuando la proteína expresada no se exporta desde la célula bacteriana hospedante. Con los métodos descritos en la presente, los expertos en la técnica pueden expresar una proteína previamente inexpresable o infraexpresada para producir la proteína deseada en cantidades que se puedan utilizar.

En otra realización, el gen de interés es un gen que codifica un ant�geno inmunog�nico, y la proteína de interés es un ant�geno puede ser ser una proteína o uno de sus fragmentos antig�nicos procedente de cualquier pat�geno, tal como pat�genos v�ricos, pat�genos bacterianos y pat�genos parasitarios. Como alternativa, el gen de interés puede ser un gen sintético, construido utilizando métodos de ADN recombinante, que codifican ant�genos o una de sus parte procedentes de pat�genos v�ricos, bacterianos o parasitarios u otro ant�geno de interés. Estos pat�genos pueden ser infecciosos en hospedantes humanos, animales domésticos o animales salvajes.

Los ejemplos de pat�genos v�ricos concretos a partir de los cuales se derivan los ant�genos v�ricos incluyen, pero no se limitan a Ortomixovirus, tales como el virus de la gripe; Retrovirus, tales como el virus del sarcoma de Rous (RSV) y el virus de la inmunodeficiencia de simios (SIV); Herpesvirus, tal como el virus de Epstein Barr (EBV), citomegalovirus (CMV) o virus del herpes simplex virus; Lentivirus, tal como el virus de la inmunodeficiencia humana; Rhabdovirus, tal como el virus de la rabia; Picomovirus, tal como el poliovirus; Poxvirus, tal como el virus de vaccinia; Rotavirus; y Parvovirus.

Los ejemplos de ant�genos inmunog�nicos procedentes de pat�genos v�ricos incluyen los ant�genos del virus de la inmunodeficiencia humana Nef, p24, gp120, gp41, Tat, Rev, y Pol. Otros ejemplos de ant�genos incluyen los epitopos de células T y células B de gp120, el ant�geno de la superficie de la hepatitis B, ant�genos de rotavirus, tales como VP4, VP6, y VP7, ant�genos del virus de la gripe, tales como hemaglutinina o nucleoprote�na, y timidina quinasa del virus del herpes simplex. Las secuencias de los ácidos nucleicos y de amino�cidos de cada uno de estos ant�genos v�ricos son muy conocidas en la técnica y pueden obtenerse con facilidad.

Los pat�genos bacterianos a partir de los cuales pueden derivarse ant�genos bacterianos incluyen, pero no se limitan a Mycobacterium spp., Helicobacter pylori, Salmonella spp., Shigella spp., E. coli, Rickettsia spp., Listeria spp., Legionella pneumoniae, Pseudomonas spp., Vibrio spp., Clostridium spp., Yersinia spp., y Borellia burgdorferi.

Los ejemplos de ant�genos inmunog�nicos de pat�genos bacterianos incluyen, pero no se limitan a ant�geno de Shigella sonnei de forma I, el O-ant�geno de V. cholerae Inaba cepa 569B, los ant�genos inmunog�nicos de E. coli enterotoxig�nica, tal como el ant�geno fimbrial CFA/I, y la subunidad B no tóxica de la toxina termol�bil, pertactina de Bordetella pertussis, la adenilato ciclasa-hemolisina de B. pertussis, el ant�geno protector (PA83) de la toxina del ántrax de Bacillus anthracis y el fragmento C de la toxina del tétanos de Clostridium tetani, el ant�geno F1 y/o V de Yersinia pestis, las enterotoxinas 1 y 2 de Shigella (es decir, ShET1, ShET2) de Shigella spp., las proteínas EAEC descritas en el documento U.S. 7.090.850, las fimbrias de Escherichia coli enterotoxig�nica, y los ant�genos de la superficie de E. coli (CS) o los ant�genos del factor de colonización (CFA), las fimbrias de Escherichia coli enterotoxig�nica (ETEC), que incluyen las fimbrias CS4 de Escherichia coli enterotoxig�nica (ETEC) (de modo específico , cualquiera de csaA, csaB, csaC, csaE y/o csaD, que se describen más a fondo en el documento U.S. 6.902.736).

Los ejemplos de ant�genos inmunog�nicos de pat�genos parasitarios a partir de los cuales pueden derivarse ant�genos parasitarios incluyen, pero no se limitan a Plasmodium spp., Trypanosome spp., Giardia spp., Boophilus spp., Babesia spp., Entamoeba spp., Eimeria spp., Leishmania spp., Schistosome spp., Brugia spp., Fascida spp., Dirofilaria spp., Wuchereria spp., y Onchocerea spp.

Los ejemplos de ant�genos inmunog�nicos de pat�genos parasitarios incluyen, pero no se limitan a los ant�genos del circumesporozo�to de Plasmodium spp., tal como el ant�geno del circumesporozo�to de P. bergerii o el ant�geno del circumesporozo�to de P. falciparum; el ant�geno de la superficie del merozo�to de Plasmodium spp.; la lectina específica de galactosa de Entamoeba histolytica, gp63 de Leishmania spp., paramiosina de Brugia malayi, la triosa-fosfato isomerasa de Schistosoma mansoni; la proteína similar a globina segregada de Trichostrongylus colubriformis; la glutati�n-S-transferasa de Frasciola hepatica, Schistosoma bovis y

S. japonicum; y KLH de Schistosoma bovis y S. japonicum.

En otra realización, el gen de interés puede codificar un agente terapéutico tal como, pero sin limitarse a ant�genos específicos de tumores, de transplantes o autoinmunol�gicos o sus partes. Como alternativa, el gen de interés puede codificar genes sintéticos, que codifican ant�genos específicos de tumores, de transplantes o autoinmunol�gicos o sus partes.

Los ejemplos de ant�genos específicos de tumores incluyen el ant�geno específico de la pr�stata, TAG-72 y CEA, MAGE-1 y tirosinasa. En fechas recientes se ha demostrado en ratones que la inmunizaci�n con células no malignas que expresan un ant�geno tumoral proporciona un efecto de tipo vacuna, y también ayuda al animal a montar una respuesta inmunol�gica para eliminar las células del tumor maligno que muestran el mismo ant�geno.

Los ejemplos de ant�genos de transplante incluyen el receptor CD3 sobre células T. El tratamiento con un anticuerpo contra un receptor CD3 ha demostrado que elimina con rapidez las células T en la circulación y que revierte la mayoría de los episodios de rechazo.

Los ejemplos de ant�genos autoinmunol�gicos incluyen la cadena IAS. La vacunación de ratones con un p�ptido de 18 amino�cidos de la cadena IAS ha demostrado proporcionar protección y tratamiento a ratones con encefalomielitis autoinmunol�gica experimental.

Como alternativa, el gen de interés puede codificar moléculas inmunorreguladoras. Estas moléculas inmunorreguladoras incluyen, pero no se limitan a factores del crecimiento, tales como M-CSF, GM-CSF; y citoquinas, tales como IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 o IFN-gamma. En fechas recientes, el transporte dirigido localizado de citoquinas a tejidos tumorales ha demostrado estimular una potente inmunidad sist�mica y potenciar la presentación de ant�genos tumorales sin producir una toxicidad de citoquinas sist�mica.

Sistemas de expresión basados en pl�smidos estabilizados

Los sistemas de expresión bacterianos, por diseño, generalmente utilizan vectores de expresión para controlar y aprovechar la maquinaria de síntesis de proteínas de una célula hospedante bacteriana para producir una proteína de interés. Los niveles de expresión de proteínas a menudo pueden aumentarse utilizando pl�smidos de alto número de copias o vectores de expresión de alto número de copias, con las células hospedantes. Sin embargo, tal como se analizó anteriormente, la introducción de un vector de expresión de alto número de copias en una célula hospedante bacteriana imprime ciertos estreses metabólicos sobre la célula hospedante que pueden provocar que la célula hospedante expulse el vector de expresión y, as�, reducen los niveles de expresión de proteínas.

En la ingeniería de los vectores de expresión, a menudo no se tiene en cuenta el efecto que ejercen los vectores de expresión de alto número de copias sobre la aptitud de la célula hospedante en la que se introduce el vector de expresión. La carga impuesta sobre las células bacterianas hospedantes que portan pl�smidos de multiples copias es el resultado acumulado de una cascada metabólica. La cascada es activada por la replicaci�n y el mantenimiento

de vectores de expresión (véase Bailey, J.E., Host-vector interactions in Escherichia coli, p. 29-77, en A. Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering, Biotechnology, Springer-Verlag, Berlín (1993); Glick, B.R., Biotechnol. Adv., 13:247-261 (1995); y Smith y Bidochka, Can. J. Microbiol, 44:351-355 (1998)). La cascada también es activada por la transcripción y la traducción de las diversas funciones codificadas por el vector de expresión que incluye la proteína de interés. Este tipo de mecanismos, tales como los descritos anteriormente, explican la observación de que las bacterias que portan pl�smidos crecen con más lentitud que las bacterias sin pl�smidos. Estos mecanismos también pueden explicar la observación de que la velocidad de crecimiento disminuye a medida que aumenta el número de copias.

Se ha observado que las velocidades de crecimiento de los organismos recombinantes que contienen vectores de expresión disminuyen a medida que aumenta la expresión de un gen de interés. La disminución en el crecimiento puede activar la inducción de diversas proteasas celulares que pueden degradar la proteína recombinante expresada de interés. Por tanto, una menor velocidad de crecimiento es la consecuencia inevitable de la carga metabólica que, a su vez, es el resultado acumulado de una serie de perturbaciones fisiológicas. Por ejemplo, se producen pertubarciones fisiológicas como resultado de la expresión y la acumulación de la proteína de interés dentro de la bacteria hospedante. Esta acumulación puede ser perjudicial para la viabilidad del organismo hospedante y, por tanto, es una presión de selección negativa.

Debido a que las cargas metabólicas, tales como las analizadas arriba, crean una presión selectiva sobre la pérdida de los vectores de expresión residentes en ausencia de selección, puede producirse una pérdida significativa de los vectores de expresión desde la célula hospedante después de que la célula hospedante haya sido transformada con el vector de expresión que contiene el gen de interés. La pérdida espontánea del pl�smido elimina cualquier carga metabólica de la célula hospedante y permite que las células hospedantes sin pl�smidos sobrepasen con rapidez a la población de células hospedantes que portan pl�smidos. La mayor cantidad de células hospedantes que no contienen, y por tanto, que no expresan la proteína de interés reduce los niveles de producción de proteínas en su conjunto. Por tanto, las células hospedantes que no est�n genéticamente constre�idas para mantener vectores de expresión que dirigen la síntesis de altos niveles de una proteína de interés concreta pueden producir una cantidad significativamente menor de proteínas.

Existe una serie de medios mediante los cuales el estr�s metabólico puede reducirse. La expresión controlada de una proteína de interés desde vectores de expresión de múltiples copias representa una solución para la síntesis de altos niveles de la proteína de interés dentro de células hospedantes. Esta solución es una realización con la que practicar los métodos descritos. La utilización de promotores inducibles, por ejemplo, es un método mediante el cual puede controlarse la expresión desde un vector de expresión. Estos promotores inducibles se analizan en la sección de módulos de expresión de esta descripción.

Otra realización de los métodos descritos en la presente se refiere a un sistema de expresión basado en pl�smidos modificado para permitir la expresión estable de altos niveles de una o más proteínas en una población creciente de células. Preferiblemente, un vector de expresión estable es un vector que perpetúa el vector de expresión a medida que la célula hospedante se replica. Los vectores de expresión que confieren estabilidad al pl�smido a dos niveles independientes se han descrito recientemente en Galen, et al., Immun., 67:6424-6433 (1999), y en la solicitud de patente de EEUU n.� de serie 09/204.117, presentada el 2 de diciembre, 1998, ahora patente de EEUU n.� 6.413.768, y n.� de serie 09/453.313, presentada el 2 de diciembre, 1999, ahora patente de EEUU n.� 6.703.233.

En esta realización, pueden incorporarse funciones de reparto en un vector de expresión para potenciar la herencia del pl�smido a medida que una célula hospedante o bacteria concretas crecen y posteriormente se dividen. En los casos raros en que una célula hija no hereda al menos una copia del vector de expresión, se activa un sistema de muerte postsegregacional latente y elimina esta bacteria o célula hospedante de la población en crecimiento mediante lisis celular.

D. Organismos hospedantes

Una serie de especies de bacterias son adecuadas para su uso con las indicaciones descritas en la presente. Preferiblemente, una especie de bacteria adecuada ser� capaz de exportar proteínas, de forma que el gen de interés pueda ser transcrito de modo adecuado de manera que la proteína de interés sea traducida y exportada hacia el exterior de la bacteria. En una realización de la invención, la bacteria se administra a un animal y, por tanto, la proteína de interés debe exportarse hacia el exterior de la bacteria hacia el animal. Pueden utilizarse bacterias invasivas y no invasivas. Los ejemplos de algunas bacterias invasivas incluyen Clostridium spp. (tal como C. difficile), Shigella spp., Listeria spp., Rickettsia spp., y Escherichia coli enteroinvasiva. Las realizaciones específicas utilizan especies de Vibrio, Salmonella, Shigella y/o Clostridium. Los ejemplos de realizaciones no limitantes incluyen, pero no se limitan a S. Typhi, tal como S. Typhi CVD 908 que tiene una mutación htrA, E. coli, tal como E. coli enterotoxig�nica (ETEC) o E. coli enteroagregativa (EAEC), Vibrio cholerae, Shigella flexneri 2a, y Clostridium difficile.

La cepa de Salmonella concreta empleada con la siguiente descripción no es crítica. Los ejemplos de cepas de Salmonella que pueden emplearse en la presente invención incluyen S. Typhi (ATCC n.� 7251) y S. typhimurium (ATCC n.� 13311). En la presente invención se emplean preferiblemente cepas de Salmonella atenuadas e incluyen

S. Typhi aroAaroD (Hone et al., Vacc., 9:810-816 (1991)), S. Typhi CVD 908-htrA y el mutante de S. typhimurium aroA (Mastroeni et al., Micro. Pathol., 13:477-491 (1992))). Como alternativa, pueden construirse nuevas cepas de Salmonella atenuadas introduciendo una o más mutaciones atenuantes según se ha descrito anteriormente para Salmonella spp.

El organismo hospedante también puede ser un virus, tal como: (i) un fago; (ii) un virus de ADN bicatenario, tal como un adenovirus, un herpesvirus, o un poxvirus; (iii) un virus de ADN monocatenario, tal como un parvovirus; (iv) un virus de ARN bicatenario, tal como un reovirus; (v) un virus de ARN monocatenario, tal como un picornavirus, un togavirus, un ortomixovirus, o un rhabdovirus, (vi) un retrovirus; o (vii) un virus del mosaico del tabaco.

E. Biorreactores

El sistema de exportación de proteínas descrito en la presente es adecuado para su uso con biorreactores y dispositivos similares que facilitan el crecimiento de bacterias y la recolección o el uso de un producto deseado o proteína de interés. Tradicionalmente, existen cinco etapas para la recuperación de biomol�culas de los biorreactores de la técnica anterior: pretratamiento, separación sólidos/líquidos, concentración, purificación, y formulación. Puede haber una amplia gama de operaciones disponibles dentro de cada etapa. Estos intervalos de operaciones para cada etapa son los siguientes: pretratamiento: rotura de las células, estabilizaci�n, esterilización, pasteurización, y floculaci�n; separación sólidos/líquidos: filtración, sedimentación, y centrifugaci�n; concentración: membranas, precipitación, evaporación, extracción, y concentración con congelación; purificación: precipitación, extracción, diafiltraci�n, absorción, y cromatograf�a; y formulación: secado, elaboración de aglomerados, extrusi�n, granulación, y formación de comprimidos.

En biorreactores en los que las bacterias no exportan el producto deseado hacia el exterior de la bacteria, se debe ampliar el número de bacterias, inducir a las bacterias para que produzcan el producto deseado, y después lisar las bacterias para liberar los contenidos. Generalmente, esta rotura se realiza en el mismo medio en el que se cultivan las bacterias. Se puede utilizar un homogeneizador o un molino de esferas para romper mecánicamente las bacterias. Para una rotura no mecánica se puede utilizar un choque térmico (que puede destruir las proteínas), detergentes, disolventes, secuestrantes y enzimas (Krijgsman, "Releases of Intracellular Components", pp. 27-42, en Product Recovery in Bioprocess Technology, editorial Butterworth-Heinemann Ltd., Oxford, Reino Unido, 1992).

Despu�s de que las bacterias se hayan roto se separan las partículas sólidas de los fluidos (separación sólidos/líquidos). El producto deseado generalmente est� en el líquido, que después hay que concentrar. Después se extrae el producto deseado del líquido concentrado.

Los factores que afectan a la separación del producto deseado de los sólidos o líquidos no deseados son el tamaño, la difusividad, la carga iónica, la solubilidad y la densidad. Para una separación dependiente del tamaño, se pueden utilizar microfiltros, filtros de tejidos y fibras, ultrafiltraci�n, tamices/coladores, y cromatograf�a en gel. Para la separación dependiente de la difusividad se puede utilizar la ósmosis inversa y la di�lisis. Se emplea la cromatograf�a de intercambio iónico para la separación dependiente de la carga iónica. Para separar el producto deseado basándose en su solubilidad se pueden utilizar extracciones con disolventes. Para la separación dependiente de la densidad se pueden utilizar ultracentr�fugas, centrífugas, y sedimentación por gravedad (Krijgsman, "Downstream Processing in Biotechnology", pp. 2-12, en Product Recovery in Bioprocess Technology, editorial Butterworth-Heinemann Ltd., Oxford, Reino Unido, 1992).

Una ventaja de utilizar el sistema descrito es que una población de células hospedantes bacterianas recombinantes puede ser transformada con un vector de expresión que comprende el sistema de exportación de proteínas descrito y que la población de células hospedantes bacterianas puede mantenerse en cultivo y utilizarse para producir proteínas sin tener que recolectar y lisar las células hospedantes bacterianas. El cultivo de células hospedantes bacterianas y la recolección del medio de cultivo que contiene la proteína de interés expresada de modo recombinante puede realizarse en cualquier tipo de biorreactor.

Existen diversos tipos de biorreactores, pero la familia de dispositivos puede dividirse en dos categorías principales, los biorreactores de "flotación libre" y de "lecho". En los biorreactores de "flotación libre", las bacterias est�n flotando libremente en el medio. Los ejemplos de boiorreactores de "flotación libre" son biorreactores de tanque con agitaci�n convencionales, columnas de burbujas, circuitos aerotransportadores, biorreactores de torre de múltiples fines, biorreactores de circuitos impulsados por líquidos, y biorreactores de circuitos de torre bombeada. Un ejemplo de biorreactor de tipo de "lecho" es el biorreactor de lecho cargado. En un biorreactor de tipo de "lecho", las bacterias est�n unidas a esferas, a una membrana o a otro soporte sólido. Puede producirse un tipo de biorreactor híbrido utilizando un biorreactor de lecho fluido en el que las bacterias est�n unidas a esferas u otro soporte pero pueden flotar en el medio (Mijnbeek, "The Conventional Stirrer Tank Reactor", pp. 39-74; Mijnbeek, "Bubble Column, Airlift Reactors, and Other Reactor Designs", pp. 75-114; Geraats, "An Introduction to Immobilized Systems", pp. 115-124; todos en "Operational Modes of Bioreactors", editorial Butterworth-Heinemann Ltd, Oxford, Reino Unido, 1992).

La utilización del sistema de exportación de proteínas descrito en la presente con un biorreactor de "lecho" evita la etapa de pretratamiento y de separación de sólidos/líquidos porque la proteína de interés deseada se exporta hacia el exterior de la bacteria hacia el medio. Solo es necesario retirar el medio del lecho antes de intentar aislar el

producto deseado. Para los biorreactores de "flotación libre", se puede centrifugar la mezcla de líquido/bacterias para sedimentar las bacterias. Después se retira el líquido que contiene la proteína de interés deseada de las bacterias sedimentadas. Después se aisla la proteína de interés deseada del medio. Otra ventaja del sistema descrito es que el medio contendr� menos proteínas no deseadas que las que est�n presentes en el medio en el que las bacterias se rompen; todos los componentes intracelulares de las bacterias rotas est�n ausentes del medio en la presente invención. As�, es más fácil la purificación de la proteína de interés deseada. Además, la presencia de marcadores y sitios de ruptura de proteasas dentro de la proteína de fusión de la proteína de exportación::proteína de interés facilita aún más el aislamiento y la purificación de la proteína de interés.

Un ejemplo de un biorreactor es el aparato que aparece en la patente de EEUU n.� 5.635.368, "Biorreactor con bacterias de ácido l�ctico inmovilizadas y su uso", de Lommi et al., 3 de junio, 1997. El aparato de Lommi se refiere a un biorreactor con bacterias inmovilizadas, que se caracteriza por que las bacterias est�n fijadas sobre la superficie de un vehículo sustancialmente no comprimible. Otro ejemplo de un biorreactor se encuentra en la patente de EEUU n.� 4.910.139, "Método para la producción continua de ácido cítrico mediante un biorreactor de membrana de fibras huecas dual", de Chang et al., 20 de marzo, 1990. Esta invención se refiere al cultivo de bacterias inmovilizadas para producir ácido cítrico de modo continuo.

Otro aparato biorreactor se describe en la patente de EEUU n.� 5.585.266, "Biorreactor de células inmovilizadas", de Plitt et al., 17 de diciembre, 1996. El dispositivo de Plitt descrito se refiere a un biorreactor de células inmovilizadas en el que las células son portadas dentro o sobre una matriz de inmovilización que incluye láminas de soporte de células formadas por tejido textil común. Las patentes de EEUU n.os 4.665.027 y 5.512.480 describen otras realizaciones de biorreactores.

F. Vacunas

El sistema de exportación de proteínas descrito en la presente tiene utilidad para la producción de vacunas. Por ejemplo, puede lograrse la producción de vacunas de subunidades utilizando el sistema de exportación de proteínas puesto que el sistema facilita la recolección de proteínas recombinantes y reduce la presencia de proteínas contaminantes del medio de crecimiento en el que se propagan las células hospedantes recombinantes. Las vacunas de células hospedantes recombinantes también pueden utilizarse para generar composiciones inmunog�nicas en las que se proporciona la célula hospedante recombinante a un sujeto, y el sistema inmunol�gico del sujeto genera una respuesta inmunol�gica contra las proteínas exportadas desde la célula hospedante recombinante. As�, se describen vacunas de subunidades que comprenden proteínas producidas utilizando los sistemas de exportación de proteínas de la presente invención, as� como vacunas de vectores de bacterias vivas que comprenden células hospedantes recombinantes transformadas con un sistema de exportación de proteínas de la presente invención.

El sistema de exportación de proteínas descrito en la presente puede utilizarse con cualquier ant�geno para preparar una vacuna a partir de él, en la que el ant�geno es la proteína de interés según se describió anteriormente. La preparación de la vacuna se describe en general en New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Md., EEUU, 1978. La encapsulaci�n dentro de liposomas se describe, por ejemplo, en Fullerton, patente de EEUU n.� 4.235.877. La conjugación de proteínas a macromoléculas se describe, por ejemplo, en Likhite, patente de EEUU n.� 4.372.945, y en Armor et al., patente de EEUU n.� 4.474.757.

La cantidad de ant�geno en cada dosis de vacuna se selecciona como la cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin los efectos secundarios adversos significativos de las vacunas típicas. Una respuesta inmunoprotectora es la que confiere una mayor capacidad para prevenir, retrasar o reducir la gravedad de la aparición de una enfermedad, comparado con estas capacidades en ausencia de la vacunación. Esta cantidad variar� dependiendo de los ant�genos específicos que se est�n empleando y de la tecnología de administración empleada (solo como ejemplo, proteínas purificadas o bacterias vivas), as� como de factores tales como el peso, la edad y la salud del receptor. En general, se espera que las dosis que comprenden proteínas purificadas en vacunas de subunidades comprenderán 1-1000 ∃g de ant�geno total, preferiblemente 2-200 ∃g. En general, se espera que las dosis que comprenden bacterias vivas que transportan proteínas de interés (vacunas de vectores de bacterias vivas) comprenderán 1-1000 ng del ant�geno total de interés. Puede determinarse una cantidad óptima para una vacuna concreta mediante estudios convencionales que implican la observación de las titulaciones de anticuerpos y otras respuestas en sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos (animales o seres humanos) pueden recibir una o más dosis de refuerzo, por ejemplo después de 1 y 6 meses.

El sistema de exportación de proteínas también puede utilizarse con una vacuna de vectores de bacterias vivas para aumentar la eficacia de la preparación. Por ejemplo, la patente de EEUU n.� 5.387.744, de Curtiss et al., titulada "Microbios avirulentes y sus usos: Salmonella typhi", proporciona una vacuna de vectores de bacterias vivas contra

S. Typhi. De forma más específica, la patente de Curtiss proporciona composiciones inmunog�nicas para la inmunizaci�n de un vertebrado o un invertebrado que comprende un derivado avirulento de S. Typhi. Los derivados tienen una mutación de los genes cya y/o crp y/o cdt.

Los derivados avirulentos descritos por Curtiss et al. pueden transformarse con el sistema de exportación de proteínas descrito en la presente para permitir que el organismo recombinante resultante actúe como una

composici�n inmunog�nica contra S. Typhi, as� como cualquier otro ant�geno o ant�genos que est�n acoplados con la proteína de exportación del sistema descrito.

Se contempla que las vacunas de subunidades y las vacunas de vectores de bacterias vivas de la presente solicitud se administren en formulaciones farmacéuticas para su uso en la vacunación de individuos, preferiblemente seres humanos. Estas formulaciones farmacéuticas pueden incluir vehículos farmac�uticamente eficaces y, opcionalmente, pueden incluir otros ingredientes terapéuticos, tales como diversos adyuvantes conocidos en la técnica.

El vehículo o los vehículos deben ser farmac�uticamente aceptables en el sentido de que sean compatibles con los componentes de la vacuna y no sean excesivamente perjudiciales para el receptor de la misma. Los vehículos adecuados pueden incluir agua o una disolución salina, con o sin un agente estabilizante, disoluciones tamponadas, medios de dispersi�n, revestimientos, preparaciones isot�nicas.

Los modos de administración pueden comprender el uso de cualquier medio y/o método adecuado para administrar las vacunas de subunidades y las vacunas de vectores de bacterias vivas a un locus corpóreo del animal hospedante, por lo cual las vacunas de subunidades y las vacunas de vectores de bacterias vivas son inmunog�nicas y generan unos niveles protectores de respuestas inmunol�gicas pertinentes y deseadas. Los modos de administración pueden incluir, sin limitación, métodos de administración parenteral, tales como inyección subcutánea (SC), inyección intravenosa (IV), transd�rmica, intramuscular (IM), intrad�rmica (ID), as� como no parenteral, por ejemplo, administración oral, nasal, intravaginal, pulmonar, oft�lmica y/o rectal.

Las vacunas de vectores de bacterias vivas de la presente solicitud pueden administrarse de forma útil al animal hospedante con cualquier otro agente farmacol�gica o fisiológicamente activo adecuado, por ejemplo, sustancias antig�nicas y/u otras sustancias biol�gicamente activas. Los animales a los cuales se les pueden administrar las proteínas de fusión y las vacunas de la presente invención incluyen especies de mamíferos, tales como seres humanos, primates no humanos (por ejemplo, monos, babuinos y chimpancés), caballos, animales bovinos (por ejemplo, toros, vacas o bueyes), cerdos, cabras, ovejas, perros, gatos, conejos, jerbos, h�msters, ratas y ratones, y otras especies no mamíferas, tales como aves (por ejemplo, pollos, pavos y patos) y peces.

Las formulaciones farmacéuticas descritas en la presente pueden presentarse, por ejemplo, como unidades discretas, tales como cápsulas, sellos, comprimidos o pastillas, que contienen cada una una cantidad predeterminada de la estructura de administración del vector; o como una suspensión.

C. Utilidad adicional

Adem�s de los ant�genos y las proteínas terapéuticas que son útiles para la industria farmacéutica, el gen de interés puede codificar enzimas, polip�ptidos, proteínas o amino�cidos que pueden ser útiles, y solo como ejemplo, para la industria alimentaria, la industria de los suplementos nutricionales, la industria de piensos para animales, la industria de la biomediaci�n, la industria de las aguas residuales, y la industria del tratamiento de aguas. Para estas industrias, puede que no sea necesario aislar la proteína de interés codificada por el gen de interés del medio de un biorreactor para que la proteína de interés haga su función. La proteína de interés puede ser un catalizador para una reacción deseada o puede actuar como un componente precursor para una reacción deseada.

Los siguientes ejemplos se proporcionan solo con fines ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Clonaci�n y mutag�nesis de clyA de S. Typhi

La identificación de clyA se realizó mediante una análisis BLASTN de la secuencia del genoma de S. Typhi recientemente completado disponible en the Sanger Center (Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge, CB10 1SA, Reino Unido) (véase el sitio web que tiene la dirección sanger.ac.uk/Projects/S_typhi/blast_server.shtml), utilizando la secuencia de ADN de hlyE de E. coli (GenBank n.� de registro U57430).

El marco de lectura abierto de clyA se identificó como una secuencia de 912 pb que se predice que codifica una proteína de 304 restos con una masa molecular de 33,8 kDa que es 89,4% idéntica a HlyE de E. coli. Aunque clyA es 85,3% idéntica al marco de lectura abierto de hlyE de E. coli de 915 pb, la región de control de la transcripción cadena arriba est� relacionada ligeramente solo con 33,6% de bases idénticas dentro de una región de 250 pb.

Bas�ndose en este análisis se diseñaron cebadores para la amplificación mediante PCR de un módulo genético sin promotores que codifica ClyA en el que el sitio de unión a ribosomas optimizado se modificó de forma 5'-proximal al cod�n de inicio ATG. Las secuencias de cebadores se listan en la tabla 2.

Tabla 2: Cebadores utilizados en la construcción y el análisis de la secuencia de los módulos de pl�smidos

n.� de cebador

Secuenciaa Módulo creado Molde

1

5'GGATCCAAAATAAGGAGGAAAAAAAAATGACTAGTATTT TTGCAGAACAAACTGTAGAGGTAGTTAAAAGCGCGATCGA AACCGC AGATGGGGCATTAGATC-3' (SEQ ID NO:3) clyA-tetA CVD 908-htrA

2

5'CCTAGGTTATCAGCTAGCGACGTCAGGAACCTCGAAAAG CGTCTTCTTACCATGACGTTGTTGGTATTCATTACAGGTGTT AATCAT TTTCTTTGCAGCTC-3' (SEQ ID NO:4) " "

3

5'CACGGTAAGAAGACGCTTTTCGAGGTTCCTGACGTCGCTA GCTGATAACCTAGGTCATGTTAGACAGCTTATCATCGATA AGCTTT AATGCGGTAGT-3' (SEQ ID NO:5) " pBR322

4

5'AGATCTACTAGTGTCGACGCTAGCTATCAGGTCGAGGTG GCCCGGCTCCATGCACCGCGACGCAACGCG-3' (SEQ ID NO:6) " "

5

5'ACTAGTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCT GAA GATCAGTTGGGTGCACGA-3' (SEQ ID NO:7) bla-tetA pGEM-T

6

5'CATTAAAGGTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGCT AGCCTAGGTCATTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTAT CTCAGC GATCTGTCTATTTCG-3' (SEQ ID NO:8) " "

7

5'CGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTA AGCATTGGTAATGACCTAGGCTAGCTCATGTTTGACAGCT TATCAT CGATAACCTTTAATG-3' (SEQ ID NO:9) " pBR322

8

5'GCGCACTAGTAAAGAAACGAACCAAAAGCCATATAAGG AAA CATACGGCATTTCCCATATTACACGCCATG-3' (SEQ ID NO:10) sacB-tetA pIB279

9

5'TAAACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAA ACATGACCCGGGTCACTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCTT GTTCAA GGATGCTGTCTTTGAC-3' (SEQ ID NO:11) " "

10

5'TCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGT AGT TTA-3' (SEQ ID NO:12) " pBR322

11

5'GCGCAGATCTTAATCATCCACAGGAGGCGCTAGCATGAG TAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTG3' (SEQ ID NO:13) gfpuv-tetA pGEN84

12

5'GTGATAAACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTG TCAAACATGAGCGCTCTAGAACTAGTTCATTATTTGTAGA GCTCATCCATGCCATGTGTAATCCCAGCAG-3' (SEQ ID NO:14) " "

a Los sitios de restricción pertinentes se indican en negrita, subrayados; los sitios de unión a ribosomas y los codones de inicio se indican en cursiva.

Para facilitar la recuperación, se emplearon técnicas de PCR solapante para crear un módulo genético clyA-tetA de 2252 pares de bases sin promotores, sintetizado mediante PCR solapante tal como se ha descrito previamente,

5 utilizando los cebadores 1 y 2 con ADN de molde cromos�mico procedente de CVD 908-htrA, y los cebadores 3 y 4 con un molde derivado de pBR322, y recuperado en pGEM-T (Promega, Madison, Wis.) transformado en E. coli DH5∀.

Se seleccionaron los clones recombinantes sobre un medio de agar sólido que contenía eritrocitos de oveja. De modo específico, la selección para la actividad hemol�tica se realizó sobre un medio de agar 1XLB recién preparado

10 que contenía una selección apropiada de antibióticos y sangre de oveja al 5%. Después las placas se incubaron a 37 �C durante 24 horas para detectar las zonas de hemolisis de eritrocitos ("red blood cells", RBC). Se identificaron inmediatamente varias colonias que producían halos transparentes de hemolisis. Esta observación sugiere que si clyA require proteínas accesorias para la translocaci�n hacia el exterior de la bacteria, estas proteínas parecen ser comunes a S. Typhi y E. coli. Se eligió un aislado positivo, denominado pGEM-TclyA, para su uso posterior.

15 Se estudiaron los papeles funcionales de diversas regiones de ClyA para proporcionar información para la

modificaci�n adecuada de las proteínas de fusión recombinantes que codifican un ant�geno unido a ClyA. De modo específico, se estudi� el papel desempeñado por el extremo amino-terminal, el extremo carboxilo-terminal, o ambos, en la exportación de la hemolisina hacia el exterior de la bacteria.

Para lograr esto, clyA se sometió a mutag�nesis aleatoria utilizando el transpos�n TnphoA. El "phoA" de "TnphoA" codifica la fosfatasa alcalina (véase Manoil y Bechwith, PNAS, vol, 82, pp. 8129-8133, 1985). La transposición de TnphoA permite la formación aleatoria de fusiones dentro de marco del N-terminal de PhoA sobre una proteína diana concreta. La mutag�nesis de TnphoA se realizó después de la electroporaci�n de pGEM-TclyA, que expresa la hemolisina ClyA de S. Typhi funcional, en DH5∀ para producir DH5∀ (pGEM-TclyA). Entonces se realizó un apareamiento por estría cruzada entre DH5∀ (pGEM-TclyA) y la cepa donante de TnphoA SM10(pRT733), y seleccionando los transconjugantes sobre 2XLB50 suplementado con tetraciclina, carbenicilina y kanamicina a 10 ∃g/ml, 50 ∃g/ml y 10 ∃g/ml, respectivamente (2XLB50+T10C50K10). Después la bacterias se reunieron y se cultivaron en caldos de cultivo para la purificación de los pl�smidos, y los pl�smidos purificados se retransformaron en la cepa de E. coli phoA%20 mutante CC118 para la selección de los transformantes Pho+ sobre 2XLB50+T10C50K10 suplementado con 200 ∃g/ml del sustrato de la fosfatasa alcalina 5-bromo-4-cloro-3indolilfosfato (BCIP, Sigma, St. Louis, MO). Las fusiones de la proteína diana que son segregadas N-terminalmente hacia el periplasma, son expuestas sobre la superficie, o son exportadas totalmente hacia el exterior de la bacteria pueden ser seleccionadas con facilidad utilizando el sustrato cromog�nico BCIP para detectar los halos de color azul oscuro de la hidrólisis; las proteínas que son segregadas C-terminalmente no pueden detectarse utilizando este método.

Utilizando la mutag�nesis de TnphoA, se identificaron 4 de 621 colonias PhoA+ que ya no muestran actividad hemol�tica. La secuenciaci�n de un aislado confirma la inserción dentro de marco de PhoA después del resto 179 (Ala) de ClyA. Esta inserción trunca ClyA en la región transmembrana hidrófoba propuesta y elimina el resto de los 125 restos caboxilo-terminales. Por tanto, se concluye que el extremo carboxilo-terminal de ClyA de S. Typhi no es necesario para el transporte del citoplasma de E. coli (y probablemente también de S. Typhi), y que debe realizarse la fusión genética de genes heter�logos que potencialmente codifican fusiones de proteínas exportadas en el extremo 3'-terminal de clyA.

Ejemplo 2: Construcción de fusiones carboxilo-terminales de los ant�genos de ensayo con ClyA

Para ensayar la capacidad para exportar proteínas pasajeras unidas al extremo carboxilo-terminal de ClyA, se eligió el gen bla que codifica la proteína de #-lactamasa RTEM-1, que confiere resistencia a la ampicilina y a la carbenicilina, para la experimentación.

Esta fusión de proteínas se introdujo como una fusión genética de un módulo SpeI insertado dentro de marco en el sitio NheI adyacente al t�ndem de codones de fin en el extremo 3'-terminal de clyA de pSEC84. Al principio, se sintetizó un fragmento SpeI-NheI de 807 pb que codifica la #-lactamasa de 268 amino�cidos madura sin la secuencia señal de 23 restos, a partir de un derivado de pBR322 mediante PCR. El fragmento purificado después se insert� dentro de marco en el sitio NheI carboxi-terminal introducido de clyA para crear una fusión genética clyA-bla de 1742 pb que codifica una proteína de fusión de 62,9 kDa predicha. La construcción de pl�smido deseada se recuper� con facilidad en colonias aisladas a partir de cultivos cultivados en presencia de carbenicilina 5 ∃g/ml, pero los pl�smidos recuperados después de la selección con carbenicilina 50 ∃g/ml parecen ser inestables y estar genéticamente reordenados.

Fusi�n bla-tetA

Debido al problema con la estabilidad del pl�smido y la reordenación genética de la construcción clyA-bla descrita anteriormente, se sintetizó la fusión bla-tetA como un módulo SpeI de 2111 pb mediante PCR solapante utilizando los cebadores 5 y 6 con el molde pGEM-T, y los cebadores 7 y 4 con el molde derivado de pBR322; la inserción de este módulo en pSEC84 roto con NheI produce pSEC84bla (véase la figura 1B).

Despu�s de la introducción en CVD 908-htrA, las colonias se seleccionaron para la conservación de actividad hemol�tica, y después se seleccionaron para la actividad #-lactamasa utilizando el sustrato cromog�nico nitrocefina a una concentración de 100 ∃g/ml en 2XLA50+DHB+T10; las placas se incubaron a 30 �C durante al menos 16 horas y se estudiaron para la presencia de halos rojos alrededor de las colonias que indican la ruptura de la nitrocefina. Se observaron halos rojos alrededor de CVD 908-htrA(pSEC84bla), que indican la ruptura de la nitrocefina y confirman la presencia de #-lactamas enzim�ticamente activa. Se concluye que una duplicación aproximada de la masa molecular de ClyA desde 34 kDa a 63 kDa produce una proteína de fusión de 2 dominios en la que ambos dominios parecen plegarse correctamente para mantener la actividad biológica esperada de cada dominio.

Fusion sacB-tetA

Para investigar la versatilidad de ClyA como compañero de fusión para exportar ant�genos heter�logos fuera de S. Typhi, se estudi� la eficacia de ClyA para exporta la levansacarasa, potencialmente letal, codificada por sacB de Bacillus subtilis. La expresión del gen sacB es letal cuando se expresa dentro del citoplasma de bacterias ent�ticas,

que incluyen S. Typhi, cultivadas en presencia de sacarosa. Se intent� la construcción de una fusión de proteínas ClyA-SacB con una masa molecular predicha de 83,9 kDa, para su introducción en CVD 908-htrA. Esta fusión se introdujo como un módulo SpeI sacB-tetA que codifica la levansacarasa de 50,0 kDa de 445 restos madura, sin la secuencia señal de 29 amino�cidos, y se insert� dentro de marco en el sitio NheI carboxilo-terminal modificado de ClyA en pSEC84. Se seleccion� el CVD 908-htrA que porta la construcción deseada utilizando tetraciclina y se seleccion� en presencia de sacarosa para la supervivencia. Si ClyA-SacB no ha podido ser exportada hacia el exterior del citoplasma, no se recuperarán aislados, pero para las fusiones que se expresan sobre la superficie o que son totalmente exportadas hacia el exterior de la bacteria hacia el medio circundante, puede esperarse que un resto SacB enzim�ticamente activo rompa la sacarosa para liberar glucosa, que inmediatamente ser� transportada hacia el interior de la bacteria y metabolizada.

Se sintetizó el módulo sacB-tetA utilizando los cebadores 8 y 9 con el molde pIB279 y los cebadores 10 y 4, igual que anteriormente, para crear un módulo SpeI de 2653 pb inserado en pSEC84 que genera la fusión clyA::sacB de pSEC84sacB (SEQ ID NO:18) (véase la figura 1C). Después de la introducción en CVD 908-htrA, las colonias de nuevo se seleccionaron para la conservación de la actividad hemol�tica, y después se estudiaron para la actividad levansacarasa mediante cultivo en medio con base de agar MacConkey (Difco) suplementado con DHB y sacarosa (al 8% o al 16% en p/v) o sacarosa al 8%+arabinosa al 8% como única fuente de carbohidratos. Las placas se incubaron a 30 �C durante 16-24 horas para recuperar los cfu aislados y determinar la fermentación del carbohidrato; se requirió más incubaci�n a temperatura ambiente durante varios días para observar la formación de cúpulas de tipo polisacar�dico sobre las colonias.

Tal como se muestra en las figura 2B y 2D, el crecimiento de CVD 908-htrA(pSEC84sacB) fue excelente cuando se cultiva en el medio indicador que contiene sacarosa al 8% o sacarosa al 16% como única fuente de carbohidratos (cuando se cultiva en el medio con base de agar MacConkey). En efecto, se observ� una c�pula de tipo polisacar�dico sobre las colonias de CVD 908-htrA(pSEC84sacB) aisladas, que no se observa para CVD 908-htrA (figuras 2A y 2C), y que se intensifica con concentraciones mayores de sacarosa. Estableciendo como hipótesis que este material de tipo polisacar�dico es levano, formado por la polimerizaci�n catalizada por levansacarasa de la fructosa liberada a partir de la hidrólisis de la sacarosa, se intent� bloquear esta polimerizaci�n introduciendo Larabinosa al 8%, que se sabe que inhibe la levansacarasa. Tal como se muestra en la figura 2F, ya no se observan cúpulas, siendo ahora similares las colonias de CVD 908-htrA y CVD 908-htrA(pSEC84sacB).

Si las fusiones de proteínas ClyA-SacB en efecto son exportadas hacia el exterior de CVD 908-htrA(pSEC84sacB) , entonces la ruptura de la sacarosa por el dominio SacB para liberar glucosa libre debería proporcionar una ventaja metabólica comparado con CVD 908-htrA cuando estas cepas se cultivan como cultivos en caldo en presencia de sacarosa. Para ensayar esta hipótesis, se establecieron 100 ml de cultivos en caldo de CVD 908-htrA(pSEC84) o CVD 908-htrA(pSEC84sacB) en matraces con pantalla de 1 litro que contenían 2XLB50+DHB+K10 más sacarosa al 10%, y el crecimiento se compar� con cultivos de CVD 908-htrA(pSEC84) cultivados en presencia de glucosa al 10% como control positivo. Tal como se muestra en la figura 3, se observ� que CVD 908-htrA(pSEC84sacB) crece con más rapidez en presencia de sacarosa que CVD 908-htrA(pSEC84) cultivado con glucosa o con sacarosa, una observación confirmada con los recuentos viables. Cuando se toman conjuntamente con los resultados observados anteriormente para ClyA-Bla, los datos sugieren claramente que ClyA es un compañero de fusión versátil para la exportación hacia el exterior de la bacteria de proteínas de fusión correctamente plegadas en las que se conserva la actividad biológica de los dominios fusionados.

Fusi�n clyA::gfpuv

Para definir aún más las propiedades de exportación de ClyA y, de forma específica, verificar la presencia de productos de fusión de ClyA en el sobrenadante de CVD 908-htrA en crecimiento exponencial, se construyó una fusión genética en la que clyA se fusiona con la proteína fluorescente verde indicadora (GFPuv), creando el módulo clyA::gfpuv de pSEC84gfpuv (véase la figura 1D), e isog�nica con pSEC84bla y pSEC84sacB. De nuevo, CVD 908htrA(pSEC84gfpuv) sigue siendo hemol�tica pero con una fluorescencia reducida cuando se compara con GFPuv expresada citopl�smicamente. Empleando un anticuerpo policlonal GFP (BD Biosciencies Clontech, Palo Alto, California), se estudi� la exportación de ClyA-GFPuv hacia el sobrenadante del cultivo utilizando un análisis de inmunotransferencia Western, tal como se muestra en la figura 4. La figura 4 ilustra un conjunto de inmunotransferencias Western que analizan fracciones de células bacterianas de CVD 908-htrA (carriles 1-3) o CVD 908-htrA(pSEC84gfpuv) (carriles 4-8). Las fracciones celulares se cargan como sigue: sobrenadantes, carriles 1 y 4; citopl�smica, carriles 2 y 6; peripl�smica, carril 5; insoluble, carril 7; célula entera, carriles 3 y 8; y 50 ng de GFPuv, carril 9. Las membranas con muestras idénticas se sondaron con anticuerpos específicos para GFPuv (panel A) o GroEL de E. coli (panel B). Como puede observarse en esta figura, se detecta una cantidad significativa de la proteína de fusión de 61 kDa esperada en 0,5 ml del sobrenadante precipitado con TCA de CVD 908htrA(pSEC84gfpuv) (carril 4); también se detecta una especie de reacción cruzada irrelevante de aproximadamente 45 kdA en el citoplasma de CVD 908-htrA (carril 2), y en las fracciones de células enteras, insoluble, y citopl�smica de CVD 908-htrA(pSEC84gfpuv); de modo interesante, el carril 5 sugiere que muy poco ClyA-GFPuv se recupera del espacio peripl�smico.

Conclusi�n

Los resultados de este trabajo apoyan claramente la conclusión de que la hemolisina críptica ClyA de S. Typhi puede utilizarse para facilitar la exportación de dominios de ant�genos heter�logos hacia el exterior de la cepa de vacuna atenuada CVD 908-htrA y hacia el medio circundante. Además, este trabajo demuestra que ClyA puede utilizarse para facilitar la exportación de una proteína de fusión hacia el exterior de la bacteria hacia el medio circundante. Tal como se ilustr� anteriormente, se demostr� la capacidad para exportar proteínas de interés plegadas correctamente fusionadas al extremo carboxilo-terminal de ClyA utilizando el gen bla que codifica la proteína de #-lactamasa RTEM-1 que confiere resistencia a la ampicilina y la carbenicilina. El gen bla de pBR322 tiene una longitud de 861 pb y codifica una proteína de 31,5 kDa con una secuencia señal de 23 amino�cidos que dirige la secreción N-terminal de la #-lactamasa hacia el espacio peripl�smico. El anterior trabajo indica la modificación correcta de una fusión g�nica que codifica una fusión de proteína ClyA-#-lactamasa funcional que conserva la actividad hemol�tica y la capacidad para romper el sustrato de #-lactamasa cromog�nico nitrocefina para producir halos rojos sobre un fondo amarillo de nitrocefina no rota.

De manera interesante, los intentos para seleccionar estos vectores de expresión cuando se cultivan transformantes en un medio rico suplementado con 50 ∃g/ml de carbenicilina o ampicilina no tuvieron éxito y solo se recuperaron pl�smidos muy reordenados, según se resuelve mediante cartografiado de restricción. Se ha demostrado concluyentemente que la #-lactamasa citopl�smicamente expresada confiere resistencia a aproximadamente 5 ∃g/ml de ampicilina, mientras que la #-lactamasa peripl�smica expresada confiere resistencia a >4000 ∃g/ml de ampicilina. Sin embargo, la presentación sobre la superficie de fusiones de proteínas de #-lactamasa ha demostrado conferir resistencia a aproximadamente 100 ∃g/ml de ampicilina. En efecto, Chervaux et al. han indicado que la secreción mediada por HlyA de fusiones de #-lactamasa hacia el exterior de E. coli de nuevo confiere una resistencia de nivel bajo a aproximadamente 5 ∃g/ml de ampicilina. Han demostrado que aunque la actividad específica del dominio de #-lactamasa intacto de la fusión de la superficie sigue siendo similar a la de la #-lactamasa sin modificar, no se observa resistencia a altos niveles de ampicilina, y concluyen que la resistencia bacteriana a antibióticos de #lactama requiere concentraciones significativas de #-lactamasa dentro del espacio peripl�smico cercano a las dianas asesinas. Basándose en estas observaciones, se concluye que las fusiones de proteínas ClyA-#-lactamasa correctamente plegadas son sintetizadas dentro de CVD 908-htrA(pSEC84bla) y exportadas para conferir un fenotipo hemol�tico, as� como la hidrólisis mediada por #-lactamasa de la cefalosporina cromog�nica nitrocefina, sin conferir resistencia a ampicilina o carbenicilina.

Para definir con más claridad la naturaleza de la exportación mediada por ClyA de dominios de ant�genos heter�logos hacia el exterior de CVD 908-htrA, y quizás descartar la implicación de los intermedios peripl�smicos, se estudiaron fusiones de sacB que codifican la levansacarasa potencialmente letal de B. subtilis. La levansacarasa es una exoenzima de un único polip�ptido de 50 kDa que cataliza la hidrólisis de la sacarosa para producir fructosa y glucosa libre y, a su vez, cataliza la polimerizaci�n de la fructosa en pol�meros largo denominados levano. La secreción de levansacarasa desde B. subtilis cutlivado sobre un medio que contiene sacarosa da como resultado el crecimiento de colonias aisladas cubiertas por una impresionante c�pula de levano viscoso después de una prolongada incubaci�n a temperatura ambiente.

Se ha establecido que la expresión citopl�smica y peripl�smica de levansacarasa codificada por sacB es letal para una diversidad de bacterias que crecen en presencia de sacarosa. En fechas recientes se ha demostrado, utilizando mutaciones de p�ptidos señal, que la levansacarasa se convierte en letal dentro del citoplasma de B. subtilis cultivado en presencia de sacarosa, y que la inactivaci�n de la actividad fructosa polimerasa es fundamental para la eliminación de la letalidad inducida por sacarosa. Por tanto, se ha razonado que el fracaso de las fusiones ClyA-SacB para ser exportadas hacia el exterior del citoplasma y del espacio peripl�smico de CVD 908-htrA debería producir una significativa acumulación intracelular de la proteína de fusión que resulta en letalidad para CVD 908htrA(pSEC84sacB) cultivado en presencia de sacarosa.

Sin embargo, tal como se muestra en la figura 2B, se ha observado que CVD 908-htrA(pSEC84sacB) no solo crece en presencia de sacarosa al 8%, sino que fermenta el azúcar, un fenotipo no observado para CVD 908-htrA(pSEC84) cultivado bajo condiciones idénticas. A medida que la concentración de sacarosa aumenta desde 8% al 16% de sacarosa, la fermentación de la sacarosa también aumenta con la acumulación de impresionantes cúpulas de material similar al levano que desaparecen en presencia del inhibidor de levansacarasa arabinosa. Jung et al. han indicado observaciones similares de actividad levansacarasa para un dominio de levansacarasa expresado sobre la superficie fusionado con el extremo carboxilo-terminal de la proteína de nucleaci�n de hielo de Pseudomonas syringae y expresado dentro de E. coli. A la vista de estos resultados, se concluye que CVD 908htrA(pSEC84sabB) modificado tiene la capacidad de utilizar la sacarosa como fuente de carbono en experimentos de cultivos de caldo en los que se observa que CVD 908-htrA(pSEC84sacB) crece con más rapidez que CVD 908-htrA(pSEC84) cultivado en presencia de sacarosa o glucosa pura. De nuevo se concluye que, al igual que las fusiones de proteínas ClyA-#-lactamasa descritas anteriormente, se sintetizan fusiones de proteínas ClyA-SacB correctamente plegadas dentro de CVD 908-htrA y se exportan para conferir el fenotipo hemol�tico esperado, as� como la actividad levansacarasa que permite el catabolismo extracelular de una fuente de carbohidratos alternativa no utilizada por la cepa hospedante sin pl�smido.

Ejemplo 3: Expresión de proteínas en biorreactor de una fusión ClyA-SacB

Se prepara un biorreactor según las indicaciones de la patente de EEUU n.� 5.635.368. Brevemente, se fabrica una celulosa derivatizada granular según la patente de EEUU n.� 4.355.117 como sigue: se mezclan 25 partes de celulosa fibrosa con 25 partes de di�xido de titanio, y la mezcla se mezcla con 50 partes de poliestireno de alto impacto utilizando un extrusor de doble huso. El extrusionado se enfría en agua, y se tamiza hasta un tamaño de partícula de 0,35-0,85 mm. Las partículas de celulosa aglomeradas granular tamizadas se derivatizan para formar DEAE-celulosa según se describe en la anterior patente de EEUU.

Despu�s, se reducen diez (10) gramos de la DEAE-celulosa granular a una suspensión en agua destilada y se dejan en remojo durante 5 horas agitando de vez en cuando. Después, el vehículo hidratado se decanta con el agua destilda y se traslada a una columna de vidrio con un diámetro interno de 15 mm, en donde forma un lecho con una altura de 145 mm.

Las bacterias transformadas con pSEC84sacB (ve�se el ejemplo 2) se cultivan durante 48 horas a 30 �C. Se bombean cincuenta (50) mililitros de la suspensión celular a través del lecho de vehículo a una velocidad de flujo de 25 ml/hora. Después, se bombea más cantidad de medio de cultivo a través del lecho de vehículo. Se recoge el flujo de salida de la columna y se aisla la proteína de fusión ClyA-SacB (codificada por SEQ ID NO:19) expresada de modo recombinante y se purifica del flujo de salida. La ruptura de SacB proporcionar� grandes cantidades comerciales de levansacarasa para la generación de levano.

Ejemplo 4: Purificación de la proteína marcada con His bajo condiciones desnaturalizantes

Un cultivo bacteriano se transforma con un vector de expresión que contiene un módulo de expresión que comprende la secuencia codificadora para una proteína ClyA atenuada fusionada con un gen sacB, que est� fusionado con una secuencia codificadora que codifica un sitio de reconocimiento de proteasas, que est� fusionado con una secuencia que codifica un marcador de polihistidina. El cultivo bacteriano se introduce en un biorreactor como el descrito en el ejemplo 3.

El cultivo se coloca bajo condiciones que estimulan la expresión de la proteína de fusión recombinante, que se exporta hacia el medio de cultivo. El medio de cultivo se recoge y se aplica a una columna de Ni (HISTRAP, Pharmacia) equilibrada con un tampón que contiene urea a una concentración lo suficientemente alta como para desnaturalizar la proteína. Después la columna se lava y se eluye. El eluato se analiza mediante una electroforesis en gel para determinar la presencia de la proteína purificada.

Las fracciones que contienen la proteína purificada se dializan contra un tampón de digestión enzim�tica. Las muestras dializadas después se reúnen y se someten a una proteolisis catalizada por la enzima apropiada. La muestra proteolizada se purifica para eliminar el marcador de polihistidina delecionado, dejando la proteína purificada aislada.

Ejemplo 5: Construcción de CVD 908-htrA atenuado que expresa Frag C y que genera una respuesta inmunol�gica contra él

Se genera una proteína de fusión ClyA-Frag C en CVD 908-htrA según las etapas analizadas en el ejemplo 1. La estrategia de los inventores consiste en expresar un marco de lectura abierto de toxC con optimización de codones que codifica el fragmento C de la toxina del tétanos insertado en ClyA expresada desde el vector de expresión descrito en la presente. La exportación del fragmento C se consigue mediante una fusión genética dentro de marco de toxC con el extremo 3'-terminal de clyA y portado sobre el replic�n oriE1 de pSEC84 como un módulo PompC-clyA EcoRI-NheI de 1426 pb. El toxC que codifica el fragmento C se vuelve a modificar a partir de construcciones de la técnica anterior utilizando el cebador directo 5'-GCGCACTAGTAAAAACCTTGATTGTTGGGTCGACAACGAAGAAGACATCGATGTTATCCTGAAAAAGTCTACCAT TCTGAACTTGGACATCAAC-3' (SEQ ID NO:15) y el cebador inverso 5'-AACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGCTAGCCTAGGTCATTAGTCGTTGGTCCAAC CTTCATCGGTCGGAACGAAGTA-3' (SEQ ID NO:16) para generar el producto de la PCR deseado (1424 pb). Después el módulo toxC se subclona en pSEC84 digerido con NheI para construir pSEC84toxC. La secuencia de ADN de la unión de fusión clyA-toxC prevista se confirma utilizando el cebador de secuenciaci�n 5'-CGATGCGGCAAAATTGAAATTAGCCACTGA-3' (SEQ ID NO:17) que se hibrida 172 bases cadena arriba del sitio NheI modificado en el extremo 3'-terminal de clyA. Las construcciones se seleccionan para la conservación de la actividad hemol�tica y se confirma que exportan ClyA-Frag C hacia el sobrenadante mediante un análisis de inmunotransferencia Western.

Grupos de diez ratones Balb/c de 6 semanas se inmunizan por vía intranasal con 1,0 x 1010 cfu de la cepa CVD 908htrA que expresa la proteína de fusión ClyA-Frag C. Los ratones se sangran antes y 30 días después de la inmunizaci�n, y su suero se conserva a -20 �C hasta su uso. Los anticuerpos presentes en el suero contra los ant�genos de ClyA y Frag C se determinan mediante ELISA. Los resultados indican que la inmunizaci�n con la cepa CVD 908-htrA que expresa la proteína de fusión ClyA-Frag C induce niveles de anticuerpos contra el ant�geno de Frag C que son significativamente mayores que los obtenidos con la cepa 908-htrA que no expresa la proteína de fusión ClyA-Frag C. Los resultados demuestran que la expresión del ant�geno de Frag C como una proteína de fusión con ClyA potencia la respuesta inmunol�gica contra este ant�geno. Se confirma una inmunidad protectora

contra la toxina del tétanos mediante la exposición de ratones inmunizados a unas dosis, que en un caso normal sería letales, de la toxina del tétanos natural.

Ejemplo 6: Construcción y análisis de variantes no hemol�ticos de ClyA de S. Typhi

Aunque, tal como se demuestra en la presente, ClyA puede ser adaptada para su uso en un sistema de exportación para ant�genos extraños, dado que ClyA es un factor de virulencia teórico, representa un problema potencial en aplicaciones de vacunas. Por tanto, se produjeron variantes de ClyA de S. Typhi mediante mutación, en los que se mantiene la actividad de exportación de los variantes, pero se abole su actividad hemol�tica.

Materiales y métodos

Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

Todas las contrucciones de pl�smidos se recuperaron en E. coli cepa DH5∀ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Calif.). El vector vivo de Salmonella serovar Typhi CVD-908-htrA es un derivado auxotr�fico de la cepa de tipo salvaje Ty2 con deleciones en aroC, aroD y htrA (Tacket et al., 1997). Las ceptas de Salmonella enterica serovar Typhi utilizadas en este trabajo se cultivaron en medio suplementado con ácido 2,3-dihidroxibenzoico (DHB) (Sigma, St. Louis, Mo.) (Galen et al., 1997; Hone et al., 1991). Las cepas que portan pl�smidos de CVD-908-htrA se cultivaron en estr�as a partir de disoluciones madre congeladas (-70 �C) sobre 2x agar Luria-Bertani (medio sólido) que contenía 20 g de triptona Bacto, 10 g de extracto de levadura Bacto, y NaCl 50 mM (2x agar LB50) más kanamicina a 15 mg/ml. Las placas se incubaron a 30 �C durante 24 a 36 h para obtener colonias aisladas con un diámetro de 2 mm y para minimizar cualquier toxicidad de la expresión de ant�genos heter�logos en CVD-908-htrA.

Mutaci�n del gen clyA

Se realizó una motag�nesis aleatoria utilizando el kit de mutag�nesis aleatoria GeneMorph II (Stratagene, La Jolla, CA) siguiendo las intrucciones del fabricante. Para generar bajas frecuencias de mutación, se emplearon 700 ng de pSEC92gfpuv como molde, y la PCR de mutación se realizó con 25 ciclos. Para generar altas frecuencias de mutación, se utilizaron 10 ng de pSEC92gfpuv como molde, y la PCR de mutación se realizó durante 2 rondas, cada una con 30 ciclos. Se emplearon los cebadores G751 (CTTCTCCTTTACTCATGCTAGCCACA; SEQ ID NO:26)) y G755 (AAATGGTACCTCCAAAATAAGGAGGAAAAAAAAATG; SEQ ID NO:27)) para amplificar la longitud completa de clyA. Después de la PCR, la reacción se digirió con DpnI para eliminar el pl�smido molde. Después de la purificación, los productos de la PCR se digirieron con PvuI y NheI y se volvieron a clonar en pSEC92gfpuv, que también había sido digerido con las mismas enzimas de restricción, para regenerar un marco de lectura abierto de ClyA intacto. Los clones se recuperaron en E. coli cepa DH5∀ sobre agar TSA que contenía sangre de oveja al 5% y se incubaron a 37 �C durante 24 a 48 horas para detectar las zonas de hemolisis. La expresión de la proteína fluorescente verde se visualizó mediante subiluminaci�n ultravioleta. Después de identificar las mutaciones específicas que abolen la actividad hemol�tica, las mutaciones seleccionadas se ensamblaron en un único marco de lectura abierto de ClyA mediante mutag�nesis específica dirigida a sitio utilizando el kit de mutag�nesis específica dirigida a sitio QuikChange II-E (Stratagene, la Jolla, CA) y las instrucciones del fabricante. Se emplearon los cebadores G835 (AGCTATAGCAATGACGCGGGCGTTATTAAAGGCAAACTGA; SEQ ID NO:28)) y G836 (TCAGTTTGCCTTTAATAACGCCCGCGTCATTGCTATAGCT; SEQ ID NO:29)) para construir el mutante triple de clyA codificado por pSEC93gfpuv.

Ensayo hemol�tico

La medición de la liberación de hemoglobina de los eritrocitos se realizó como se ha descrito (Sansonetti et al., 1986, Infect. Immun., 51: 461-469), con varias modificaciones. Las bacterias se cultivaron hasta la fase logarítmica tardía (DO600 a 0,9-1,0) y se recolectaron. Se mezclaron 1 x 109 células en 50 ul de PBS con un volumen igual de eritrocitos de oveja lavados (Lampire Biological, Pipersville, PA) a la concentración de 4 x 109/ml. La mezcla se centrifug� a 2.200 x g durante 15 min a 30 �C y después se incub� a 37 �C durante dos horas. La reacción se resuspendi� añadiendo 150 ul de PBS frío y después se centrifug� a 2.200 x g durante 15 min a 4 �C. Al final de la reacción, se trasladaron 100 ∃l del sobrenadante a una placa de microtitulaci�n de fondo plano. Se midió la actividad hemol�tica mediante la lectura de la densidad óptica a 545 nm en un lector de microplacas Versamax (Molecular Devices, Toronto, Canadá).

An�lisis de inmunotransferencia

Se realizó un análisis de inmunotransferencia Western como se ha descrito (Galen et al., 2004, Infect. Immun., 72(12):7096-7106), teniendo cuidado de analizar las muestras de los cultivos cultivados a 30 �C hasta unas densidades ópticas a 600 nm (DO600) no mayores que 1,0. Las proteínas en el sobrenadante del cultivo se precipitaron con TCA enfriado en hielo al 10% y se lavaron dos veces con acetona enfriada en hielo. El sedimento se secó, se resuspendi� en Tris-Cl 100 mM, pH 8,0, y se mezcl� con 2x tampón de muestra (Biorad).

La detección de GFPuv se realizó utilizando un anticuerpo primario anti-GFP de ratón policlonal (BD Biosciences/Clontech, Palo Alto, Calif.) y un anticuerpo secundario anti-ratón de cabra purificado por afinidad marcado con peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.). Las inmunotransferencias se revelaron utilizando un sistema de detección ECL+Plus (Amersham Biosciencies, Piscataway, NJ) y las transferencias se expusieron a una película Kodak-X-OMAT XAR-2. Para calcular la cantidad de lisis celular que puede contribuir a la liberación de las fusiones ClyA-GFPuv hacia los sobrenadantes, se detect� la contaminación de

5 los sobrenadantes con la proteína citopl�smica GroEL utilizando un anticuerpo de conejo anti-GroEL de E. coli (Sigma) y un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (BioRad). Las inmunotransferencias de GroEL se revelaron utilizando el sustrato conjugado Immun-star AP (BioRad).

Resultados

Variantes de clyA

10 El gen clyA de S. Typhi se mut� en el pl�smido pSEC92gfpuv (figura 5). El pSEC92gfpuv (SEQ ID NO:32) codifica una ClyA con optimización de codones fusionada a GFPuv. La secuencia de clyA con optimización de codones se muestra en SEQ ID NO:33. Los genes clyA que portan mutaciones puntuales aleatorias y, por tanto, que codifican los variantes de la presente invención, se denominan en la presente clyM (véase, por ejemplo, la tabla 3). La secuencia diana sometida a mutag�nesis abarca los restos 18 a 303. Se construyó una serie de pl�smidos pClyM

15 que son muy similares a pSEC92gfpuv excepto que portan clyM en lugar de clyA. En cada pClyM, un gen gfpuv se fusiona cadena abajo de clyM. Esta fusión no solo permite rastrear la expresión de ClyM, sino que también sirve como indicador para el plegamiento correcto de ClyM (Waldo, G.S. et al., 1999, Nat. Biotechnol., 17(7):691-695).

Actividad hemol�tica de los variantes de ClyA

Se secuenci� clyM a partir de 43 clones que seguían manteniendo su actividad hemol�tica. La ClyM en estos clones

20 porta de 1 a 4 mutaciones (tabla 3; las posiciones de las mutaciones en ClyA se corresponden con la secuencia del polip�ptido de ClyA de SEQ ID NO:2). Los resultados de la secuencia indican que puede introducirse una mutación en muchas posiciones de cualquier subdominio de ClyA sin afectar a su actividad hemol�tica. Por tanto, los amino�cidos en estas posiciones no son críticos para la actividad hemol�tica de ClyA en el contexto del dominio de fusión cadena abajo.

25 Tabla 3

Posici�n de la mutación en ClyA

n.� del clon de ClyM Dominio Posici�n de la mutación en ClyA n.� del clon de ClyM Dominio

19

HM42 ∀A/A' 167 HM49 ∀D

20

HM30 ∀A/A' 168 HM23 ∀D

25

HM42 ∀A/A' 168 HM54 ∀D

29

HM32 ∀A/A' 169 HM20 ∀D

33

HM15 ∀A/A' 170 HM44 ∀D

51

HM42 171 HM27 ∀D

55

HM17 171 HM35 ∀D

55

HM23 172 HM44 ∀D

58

HM25 ∀B 180 HM20

66

HM14 ∀B 182 HM35

71

HM10 ∀B 193 HM54 lengua #

72

HM45 ∀B 203 HM28 ∀E

73

HM40 ∀B 203 HM39 ∀E

73

HM26 ∀B 208 HM26 ∀F

73

HM18 ∀B 219 HM23 ∀F

78

HM26 ∀B 222 HM8 ∀F

Posici�n de la mutación en ClyA

n.� del clon de ClyM Dominio Posici�n de la mutación en ClyA n.� del clon de ClyM Dominio

84

HM45 ∀B 224 HM32 ∀F

84

HM37 ∀B 226 HM45 ∀F

90

HM11 ∀B 230 HM8 ∀F

104

HM53 234 HM11 ∀F

106

HM42 ∀C 234 HM43 ∀F

107

HM53 ∀C 234 HM44 ∀F

110

HM14 ∀C 242 HM46 ∀F

110

HM26 ∀C 244 HM29 ∀F

111

HM44 ∀C 246 HM28 ∀F

114

HM46 ∀C 250 HM32 ∀F

114

HM51 ∀C 263 HM10

122

HM20 ∀C 272 HM44 ∀G

123

HM51 ∀C 279 HM46 ∀G

128

HM13 ∀C 270 HM2 ∀G

131

HM45 ∀C 285 HM37 ∀G

143

HM52 ∀C 256 HM39 ∀G

150

HM57 ∀C 294 HM7

157

HM2 ∀C

160

HM39

Para determinar cuáles son los amino�cidos críticos para la actividad hemolisina de ClyA de S. Typhi se secuenci� clyM a partir de 111 clones que no tenían actividad hemol�tica visible (o muy reducida), pero que seguían siendo fluorescentes sobre agar de sangre de oveja. Se descubrió que 18 de estos clones tenían solo una mutación de un 5 amino�cido (tabla 4). La mayoría de estos amino�cidos est�n localizados en las alfa-h�licas C, E, F o G. No se localizaron mutaciones en este grupo en las hélices A, B o D. Se ha indicado previamente que la alteración del puente de ciste�na intramolecular natural entre los restos 87 y 285 de ClyA abole la actividad hemol�tica evitando la oligomerizaci�n requerida para la formación de poros y la actividad citol�tica (Atkins A. et al., 2000, J. Biol. Chem.,

275: 41150-41155). La "Posición" indicada y el amino�cido de tipo salvaje ("wt") en la tabla 4 se corresponden con la

10 secuencia de amino�cidos del polip�ptido de ClyA de S. Typhi mostrado en SEQ ID NO:2. El "dominio" es el dominio concreto del polip�ptido de ClyA de S. Typhi.

Tabla 4

Clon

Posición wt Mutación Dominio SEQ ID NO:

M133

109 A T ∀C

M165

109 A V ∀C

M188

116 L Q ∀C

M187

148 L P ∀C

M179

163 S C vuelta entre ∀C y ∀D

Clon

Posición wt Mutación Dominio SEQ ID NO:

M103

195 S N lengua-#

M30

198 I N ∀E 30

M128

199 A D ∀E

M135

204 E K ∀E

M182

204 E D ∀E

M109

205 G D ∀E

M64

207 L R ∀F

M185

215 L P ∀F

M163

225 L S ∀F

M176

229 V L ∀F

M150

281 M K ∀G

M171

284 T P ∀G

M148

285 C W ∀G

Exportaci�n de variantes de ClyA

Para investigar la actividad de exportación de los 18 clones fluorescentes no hemol�ticos (o con una actividad hemol�tica reducida) listados en la tabla 4, se seleccionaron los sobrenadantes del cultivo de estos 18 clones para la presencia de GFPuv mediante inmunotransferencia. Los resultados demuestran que 6 mutaciones individuales, es decir, S195!N, I198!N, A199!D, E204!K, E204!D, y G205!D, conservan propiedades de exportación similares a las fusiones de proteínas de tipo salvaje (hemol�ticas) ClyA::GFPuv, mientras que siguen siendo no hemol�ticas y fluorescentes (figura 6). Los 6 amino�cidos se agrupan a un distancia muy estrecha, todos localizados en la hélice pequeña E junto a la lengua-#.

Despu�s se midió específicamente la actividad hemol�tica de estos 6 variantes de ClyA (figura 7). Las mutaciones S195N, I198N, A199D o E204K redujeron drásticamente la actividad hemol�tica hasta 2-8% del tipo salvaje. Una mutación G205D redujo la actividad hemol�tica hasta menos del 50% del tipo salvaje. De modo interesante, una sustitución E204D tiene mucho menos efecto (reducción del 30%) sobre la actividad hemol�tica frente a la sustitución E204K (reducción hasta menos del 2% del tipo salvaje), lo cual demuestra claramente el efecto de los diferentes amino�cidos introducidos en una posición dada dentro de ClyA. Estos resultados demuestran que las funciones de la citolisis y la exportación de proteínas pueden estar desacopladas en ClyA. El desacoplamiento de estas dos funciones puede lograrse mediante la mutación de un restos amino�cido individual dentro de una región muy pequeña de ClyA, es decir, los amino�cidos en la hélice pequeña E adyacente a la lengua-#.

Construcci�n de un mutante triple

Utilizando los anteriores resultados, el gen clyA con optimización de codones en pSEC92gfpuv después se remodific� para contener una mutación triple: I198N, A199D, E204K (SEQ ID NO:31), creando pSEC93gfpuv. Puesto que cada una de estas mutaciones individuales reduce sustancialmente la actividad hemol�tica sin tener un efecto aparente sobre la exportación, se espera que la combinación de estas tres mutaciones pueda abolir completamente la actividad hemol�tica. La exportación de la fusión ClyA::GFPuv mutante triple se ensay� mediante inmunotransferencia (figura 8A). Los resultados demuestran que la exportación del mutante triple desde la cepa de vacuna de vector vivo CVD 908-htrA es casi indistinguible de las fusiones ClyA wt::GFPuv, y los ensayos de la actividad hemol�tica confirmaron que este mutante triple no tiene actividad citol�tica con los eritrocitos (figura 9). De nuevo, la ausencia de GroEL en los sobrenadantes sugiere con fuerza que las fusiones de variantes de ClyA est�n siendos exportadas con eficacia hacia el sobrenadante en ausencia de autolisis detectable (figura 8B).

Inmunogenicidad de las proteínas de fusión exportadas

En una realización preferida, estos mutantes no hemol�ticos se fusionan con ant�genos distintos de GFPuv, para desarrollar vacunas de vectores vivos contra pat�genos humanos que incluyen, pero no se limitan al ant�geno

protector PA83 de longitud completa de la toxina del ántrax. Por tanto, resulta crítico evaluar si las fusiones de ClyA no hemol�ticas siguen siendo inmunog�nicas, con respuestas inmunol�gicas pertinentes (respuestas celulares y/o humorales protectoras) capaces de dirigirse al dominio extraño cadena abajo.

Por tanto, se ensay� la inmunogenicidad de las fusiones de proteínas ClyA::GFPuv de variantes no hemol�ticos en ratones. Los ratones se inmunizaron por vía intranasal con dos dosis (109 unidades formadoras de colonias (CFU) por dosis) de cepas de vectores vivos atenuadas CVD 908-htrA que portan pl�smidos derivados de pSEC92gfpuv que expresan proteínas de fusión ClyA::GFPuv de variantes no hemol�ticos. Todos los ratones recibieron un refuerzo intramuscular con GFPuv purificada en el día 42. Los resultados se indican en la figura 10 como la media geométrica de las titulaciones (en unidades ELISA (EU)) de IgG s�rica contra el dominio GFPuv de ClyA::GFPuv. Resulta inmediatamente obvio que la inmunogenicidad del mutante triple de ClyA codificado por pSEC93gfpuv (que contiene las 3 sustituciones de amino�cidos I198N, A199D, E204K) no es tan inmunog�nica como el variante no hemol�tico expresado por pSEC92M30gfpuv (que expresa un mutante no hemol�tico que contiene la única sustitución I198N). Tal como se esperaba, la ClyA::GFPuv inalterada expresada a partir de cepas que portan el pSEC92gfpuv original proporcionar la mayor inmunidad humoral específica de GFPuv, pero la inmunogenicidad del mutante no hemol�tico M30 (I198N) es comparable. Los resultados de este experimento crítico claramente demuestran que aunque es posible eliminar genéticamente la actividad hemol�tica de ClyA conservando al mismo tiempo sus capacidades de exportación, unos cambios sutiles introducidos en la estructura de las proteínas de fusión ClyA::GFPuv como sustituciones de restos acumuladas, pueden afectar drásticamente a la inmunogenicidad de estas proteínas de fusión.

Ejemplo 7: Construcción y análisis de otros variantes no hemol�ticos de ClyA de S. Typhi

Cada una de las mutaciones creadas en el mutante triple (pSEC93gfpuv) analizadas en el ejemplo 6 se deriv� de loci adyacentes en el dominio ∀E que pueden provocar cambios en la conformación de la proteína GFPuv (u otro dominio de fusión cadena abajo) expresada por el pl�smido. Por tanto, se diseño otra estrategia para alterar la actividad hemol�tica de la proteína ClyA.

Construcci�n de pl�smidos derivados de pSEC91-83

En lugar de optimizar la estrategia de ClyA no hemol�tica utilizando pSEC92gfpuv, se introdujeron mutaciones puntuales en un pl�smido de expresión previamente descrito, pSEC91-83, que codifica ClyA fusionada con el ant�geno protector (PA83) de la toxina del ántrax, para abolir la actividad hemol�tica de ClyA (Galen et al., 2009, J. Infect. Dis., 199:326-335). Debido a que la mutación individual (I198N) induce un nivel de IgG anti-GFP que es comparable al control positivo, esta mutación comprende la mutación primaria con la que se ensay� otra mutación distinta. Se construyeron tres derivados de pSEC91-83 como sigue:

1) Mutante individual 1 = I198N introducido en clyA de pSEC91-83 para crear pSEC91-83I198N.

2) Mutante individual 2 = C285W introducido en clyA de pSEC91-83 para crear pSEC91-83C285W; ha sido previamente establecido que esta localización abole la actividad hemol�tica de la proteína ClyA (Kim et al. (2008); tabla 4 en la presente, clon M148).

3) Mutante doble (DM) = I198N y C285W introducidos en clyA de pSEC91-83 para crear pSEC91-83DM.

Se diseñaron dos pares de cebadores para introducir las mutaciones en clyA codificada por pSEC91-83 utilizando procedimientos de mutag�nesis específica dirigida a sitio convencionales:

1) I198N

G873: 5' - TATTTCCTATTCTAATGCTGCGGGCGTGATTGAAGG -3' (SEQ ID NO:33)

G874: 5' -CCTTCAATCACGCCCGCAGCATTAGAATAGGAAATA - 3' (SEQ ID NO:34)

2) C285W

G875: 5' - TGATTAACACCTGGAATGAATACCAACAACGTCATGG -3' (SEQ ID NO:35)

G876: 5' -CCATGACGTTGTTGGTATTCATTCCAGGTGTTAATCA - 3' (SEQ ID NO:36)

Cada una de las tres construcciones (pSEC91-83I198N, pSEC91-83C285W, y pSEC91-83DM) se construyó con éxito y se transform� en el vector vivo CVD 908-htrA. Sin embargo, los resultados iniciales sugieren que las cepas no son estables utilizando el esqueleto de pSEC91-83. Por tanto, se seleccion� otro esqueleto que incorpora el sistema estabilizante SSB para la posterior modificación (pGEN222SXbaI).

Construcci�n de clones CVD 908-htrA-ssb(pS-CPA83)

El pGEN222SXbaI es un derivado del pl�smido previamente descrito pGEN222 (Galen et al., 1999, Infect. Immun., 67:6424-6433) en el que se ha introducido el sistema de estabilizaci�n SSB. Para modificar este pl�smido de número intermedio de copias, el módulo ssb utilizado en la construcción del pl�smido de mantenimiento temporal pBRmSSB primero se escindi� de pCV546 como un módulo Xba I-Nhe I de 798 pb y se insert� en un derivado de pGEN222, destruyendo el sitio Spe I exclusivo y creando pGEN222S. Puesto que ssb actuar� de forma eficaz como una función de muerte postsegregacional in vivo, la inclusión de hok-sok ya no es necesaria, de forma que el sitio Xho I 5'-proximal a hok-sok se cambi� mediante mutag�nesis específica dirigida a sitio por un sitio Xba I, creando pGEN222SXbaI para la futura deleci�n de hok-sok y bla.

Tambi�n se diseño un módulo especial y se cre� para permitir la selección sencilla de pl�smidos antes de la introducción en cepas CVD 908-htrAssb. Este módulo est� formado por un gen de tetraciclina flanqueado por sitios de recombinación FRT, denominados en la presente FRT-tetA-FRT y flanqueados por los sitios de restricción Xba I y Not I. Este módulo FRT-tetA-FRT Xba I-Not I se gener� utilizando los siguientes cebadores con pSEC91 como ADN molde:

FRT-tetA-directo:

TCTAGAgaagttcctattctatatatagtataggaacttcGCTAGCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATA AGCTTTAATGCGGTAGTTTATCAC (SEQ ID NO:37)

FRT-tetA-inverso:

TCTAGAgaagttcctatactatatatagaataggaacttcGCTAGCCTATCAGGTCGAGGTGGCCCGGCTC CATGCACCGCGACGCAACGCGGGGAG (SEQ ID NO:38)

Este módulo FRT-tetA-FRT se recuper� en pCR-BLUNT II-TOPO para la excisi�n fácil como un fragmento Xba I-Not I de 1397 pb.

Se realizaron las siguientes etapas en la construcción de vectores de expresión que emplean el esqueleto de pGR222SXbaI. En construcciones distintas, los alelos clyA mutados se subclonaron a partir de pSEC91-83I198N, pSEC91-83C285W, y pSEC91-83DM mediante digestión con BamHI y AvrII, y el acoplamiento en pGEN222SXbaI roto con las mismas enzimas de restricción, creando pGEN222SXbaI-I198N, pGEN222SXbaI-C285W y pGEN222SXbalI-DM.

Despu�s, los módulos bla-hok-sok de los pl�smidos pGEN222SXbaI-I198N, pGEN222SXbaI-C285W y pGEN222SXbalI-DM resultantes se reemplazaron por el módulo FRT-tetA-FRT digiriendo pCR-BLUNT II-TOPO que contiene FRT-tetA-FRT con Xbal y NotI, e insertando este fragmento de 1397 pb en los pl�smidos pGEN222SXbaI-I198N, pGEN222SXbaI-C285W y pGEN222SXbalI-DM digeridos de forma idéntica, creandos las construcci�nes resistentes a tetraciclina, denominadas como sigue:

1) pTS-CPA83-I198N - mutante individual 1

2) pTS-CPA83-C285W - mutante individual 2

3) pTS-CPA83-DM - mutante doble.

Estas construcciones se recuperaron en DH5∀%ssb.

Despu�s, el pl�smido pCP20 se introdujo en estas tres cepas para inducir la excisi�n del módulo del gen de tetraciclina utilizando una metodología idéntica a la utilizada para delecionar ssb de los cromosomas de DH5∀%ssb y CVD 908-htrAssb.

Por último, las construcciones resultantes que tienen un sistema estabilizante SSB y que carecen de marcadores de resistencia a antibióticos se transformaron en CVD 908-htrAssb y se denominaron como sigue:

1) CVD908-htrAssb (pS-CPA83-I198N) - mutante individual 1

2) CVD908-htrAssb (pS-CPA83-C285W) -mutante individual 2

3) CVD908-htrAssb (pS-CPA83-DM) -mutante doble

Se realizaron unos análisis de inmunotransferencia Western para la detección de la expresión de la proteína de fusión según se ha descrito (Galen et al., 2009, J. Infect. Dis., 199:326-335). Los lisados de células enteras que expresan las fusiones ClyM-PA83 se separaron sobre geles de SDS-poliacrilamida. La detección de las proteínas de fusión de PA83 con un peso molecular relativo de aproximadamente 117 kDa se realizó utilizando IgG policlonal anti-PA de cabra (List Biological Laboratories, Campbell, CA) e IgG anti-cabra de conejo marcada con peroxidasa de rábano (HRP) (Kirkegaard & Perry Labs, Inc., Gaithersburg, MD). Las inmunotransferencias se revelaron utilizando el sistema de detección ECL+Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y las transferencias se expusieron a una película Kodak X-OMAT XAR-2. Los resultados de las inmunotransferencias se muestran en la figura 12.

Se realizó la medición de la liberación de hemoglobina desde los eritrocitos según se ha descrito (Sansonetti et al., 1986, Infect. Immun., 51: 461-469), con varias modificaciones. Las bacterias se cultivaron hasta la fase logarítmica tardía (DO600 a 0,9-1,0) y se recolectaron. Se mezclaron 1 x 109 células en 50 ul de PBS con un volumen igual de eritrocitos de oveja lavados (Lampire Biological, Pipersville, PA) a una concentración de 4 x 109/ml. La mezcla se 5 centrifug� a 2.200 x g durante 15 min a 30 �C y después se incub� a 37 �C durante dos horas. La reacción se resuspendi� añadiendo 150 ul de PBS frío y después se centrifug� a 2.200 x g durante 15 min a 4 �C. Al final de la reacción se trasladaron 100 ∃l del sobrenadante a una placa de microtitulaci�n de fondo plano. Se midió la actividad hemol�tica leyendo la densidad óptica a 545 nm en un lector de microplacas Versamax (Molecular Devicers, Toronto, Canadá). Los resultados del ensayo se muestran en la figura 13. El pSE10, pSEC91 y pSEC91-83 expresan cada

10 uno ClyA no modificada. La cepa Ty21a es la cepa de vacuna tifoidea que est� autorizada en la actualidad; no sorprende que muestre una ligera actividad hemol�tica, según ha sido advertido previamente por Oscarsson et al. (Oscarsson et al., 2002, Infect. Immun., 70:5759-5769). Estos resultados claramente demuestran que la actividad hemol�tica de cada una de las tres construcciones pS-CPA83 (I198N, C285W y DM) ha sido abolida.

Para comparar la inmunogenicidad entre las construcciones que expresan PA83 fusionada a ClyA de tipo salvaje (es

15 decir, la cepa CVD 908-htrA(pSEC91-83)) frente a PA83 procedente de las cepas que expresan los variantes ClyA estabilizados con SSB (es decir, CVD908-htrAssb (pS-CPA83-I198N), CVD908-htrAssb (pS-CPA83-C285W), y CVD908-htrAssb (pS-CPA83-DM)), se inmunizaron ratones hembra BALB/c (H2d) por vía intranasal a lo largo de 7 semanas según se describe en la tabla 5.

Tabla 5

Grupo

Ratones totales 1er cebador (10-22-08) 1 x 109 CFU/10 ∃l 2o cebador (11-5-08) 1 x 109 CFU/10 ∃l 3er refuerzo (12-3-08)

1 Jaulas (A,B)

10 CVD908-htrA (intrasanal) CVD908-htrA (intrasanal) proteína PA más alhidrogel (intramuscular)

2 Jaulas (C,D)

10 CVD908htrA(pSEC91-83) (intrasanal) CVD908htrA(pSEC91-83) (intrasanal) proteína PA más alhidrogel (intramuscular)

3 Jaulas (E,F)

10 CVD908-htrA (mutante individual 1 pS-CPA83-I198N) (intrasanal) CVD908-htrA (mutante individual 1 pS-CPA83-I198N) (intrasanal) proteína PA más alhidrogel (intramuscular)

4 Jaulas (G,H)

10 CVD908-htrA (mutante individual 2 pS-CPA83-C285W) (intrasanal) CVD908-htrA (mutante individual 2 pS-CPA83-C285W) (intrasanal) proteína PA más alhidrogel (intramuscular)

5 Jaulas (I,J)

10 CVD908-htrA (mutante doble pSCPA83-DM) (intrasanal) CVD908-htrA (mutante doble pSCPA83-DM) (intrasanal) proteína PA más alhidrogel (intramuscular)

6 Jaulas (K)

5 PBS (intrasanal) PBS (intrasanal) PBS (intramuscular)

20 * Proteína PA83 más alhidrogel: 10 ∃g de PA83 absorbida con 0,5 mg de alhidrogel por dosis (50 ∃l). Sangrado:

-

preinmunizaci�n: día -1 (10-21-08)

-

postinmunizaci�n: día 13 (11-4-08), 28 (11-19-08), 40 (12-1-08), 49 (12-10-08), 56 (12-17-08) y 70 (12-31-08)

Las condiciones bajo las cuales se produjeron los diferentes in�culos se muestran a continuación: 25 1) CVD 908htrA

(i)

Se cultiva en estr�as a partir de una disolución madre sobre 2x LA + DHB y se incuba a 30 �C durante 48 horas.

(ii)

Se inoculan 2-3 colonias aisladas a partir de la placa en 5 ml de 2x LB + DHB y se incuba a 30 �C durante la noche.

(iii) Se subcultivan 2,5 ml del cultivo de la noche (1:100) en 250 ml de 2x LB + DHB y se espera hasta que la DO600 nm alcance aproximadamente 1,4 a 37 �C (aproximadamente 4 h).

(vi)

Se centrifuga (6.000 rpm, 20 min), se rechaza todo el sobrenadante y se resuspende en 300 ∃l de PBS.

(v)

Se diluye 1:1.000 para la lectura de la DO para asegurarse de que DO600 nm sea aproximadamente 0,4-0,5.

(vi)

Se extraen 10 ∃l para la inmunizaci�n (1-2 x 109 CFU/10 ∃l). 2) CVD 908htrA(pSEC91-83)

(i)

Se cultiva en estr�as a partir de una disolución madre sobre 2x LA + DHB + Kan (25 ∃g/ml) y se incuba a 30 �C durante 48 horas.

(ii)

Se inoculan 2-3 colonias de la placa en 25 ml de 2x LB + DHB + Kan (25 ∃g/ml) y se incuba a 30 �C durante la noche.

(iii) Se subcultivan 20 ml del cultivo de la noche (1:12,5) en 250 ml de 2x LB + DHB + Kan (25 ∃g/ml) y se espera hasta que la DO600 nm alcance aproximadamente 1,4 a 37 �C (aproximadamente 5 h 30 min).

(vi)

Se centrifuga (6.000 rpm, 20 min), se rechaza todo el sobrenadante y se resuspende en 300 ∃l de PBS.

(v)

Se diluye 1:1.000 para la lectura de la DO para asegurarse de que DO600 nm sea aproximadamente 0,4-0,5.

(vi)

Se extraen 10 ∃l para la inmunizaci�n (1-2 x 109 CFU/10 ∃l). 3) CVD 908htrA-ssb(pS-CPA83-I198N) = mutante individual 1 de ClyA (I198N en un esqueleto de pSSB)

(i)

Se cultiva en estr�as a partir de una disolución madre sobre 2x LA + DHB y se incuba a 30 �C durante 48 horas.

(ii)

Se inoculan 2-3 colonias de la placa en 25 ml de 2x LB + DHB y se incuba a 30 �C durante la noche.

(iii) Se subcultivan 20 ml del cultivo de la noche (1:12,5) en 250 ml de 2x LB + DHB y se espera hasta que la DO600 nm alcance aproximadamente 1,4 a 37 �C (aproximadamente 5 h).

(vi)

Se centrifuga (6.000 rpm, 20 min), se rechaza todo el sobrenadante y se resuspende en 150 ∃l de PBS.

(v)

Se diluye 1:1.000 para la lectura de la DO para asegurarse de que DO600 nm sea aproximadamente 0,4-0,5.

(vi)

Se extraen 10 ∃l para la inmunizaci�n (1-2 x 109 CFU/10 ∃l). 4) CVD 908htrA-ssb(pS-CPA83-C285W) = mutante individual 2 de ClyA (C285W en un esqueleto de pSSB)

(i)

Se cultiva en estr�as a partir de una disolución madre sobre 2x LA + DHB y se incuba a 30 �C durante 48 horas.

(ii)

Se inoculan 2-3 colonias de la placa en 30 ml de 2x LB + DHB y se incuba a 30 �C durante la noche.

(iii) Se subcultivan 20 ml del cultivo de la noche (1:12,5) en 250 ml de 2x LB + DHB y se espera hasta que la DO600 nm alcance aproximadamente 1,4 a 37 �C (aproximadamente 5 h).

(vi)

Se centrifuga (6.000 rpm, 20 min), se rechaza todo el sobrenadante y se resuspende en 150 ∃l de PBS.

(v)

Se diluye 1:1.000 para la lectura de la DO para asegurarse de que DO600 nm sea aproximadamente 0,4-0,5.

(vi)

Se extraen 10 ∃l para la inmunizaci�n (1-2 x 109 CFU/10 ∃l). 5) CVD 908htrA-ssb(pS-CPA83-DM) = mutante doble de ClyA (I198N y C285W en un esqueleto de pSSB)

(i)

Se cultiva en estr�as a partir de una disolución madre sobre 2x LA + DHB y se incuba a 30 �C durante 48 horas.

(ii)

Se inoculan 2-3 colonias de la placa en 30 ml de 2x LB + DHB y se incuba a 30 �C durante la noche.

(iii) Se subcultivan 20 ml del cultivo de la noche (1:12,5) en 250 ml de 2x LB + DHB y se espera hasta que la DO600 nm alcance aproximadamente 1,4 a 37 �C (aproximadamente 5 h).

(vi)

Se centrifuga (6.000 rpm, 20 min), se rechaza todo el sobrenadante y se resuspende en 150 ∃l de PBS.

(v)

Se diluye 1:1.000 para la lectura de la DO para asegurarse de que DO600 nm sea aproximadamente 0,4-0,5.

(vi)

Se extraen 10 ∃l para la inmunizaci�n (1-2 x 109 CFU/10 ∃l).

Se mide la Ig anti-PA83 s�rica total mediante ELISA tal como se describió previamente (Galen et al., 2009, J. Infect. Dis., 199:326-335). Las placas se revistieron con PA83 (List Biological) a 2 ∃g/ml en PBS y se bloque� con leche en polvo al 10% en PBS. Se ensayaron muestras por duplicado en diluciones en serie. Se emple� IgG anti-mono marcada con HRP (KPL) como el conjugado, seguido del sustrato TMB (KPL). Se calcularon las titulaciones de IgG anti-PA mediante la interpolación de los valores de la absorbancia corregidos para la regresión de las muestras individuales en una curva patrón. Los resultados se muestran en la figura 14. Además, la figura 15 proporciona una tabla que muestra una comparación del porcentaje de ratones con seroconversi�n y GMT después de una vacunación con vectores vivos de S. Typhi atenuados que portan pl�smidos que suministran PA83 fusionado con ClyA de tipo salvaje y los variantes de ClyA no hemol�ticos. Estos datos indican que aunque los variantes de ClyA de mutantes individuales y de mutante doble inducen una inmunidad humoral menos específica de PA83 7 días después del refuerzo, los niveles se convierten en indistinguibles de la inmunogenicidad de ClyA de tipo salvaje-PA83 4 semanas después del refuerzo (día 70) y son significativamente diferentes de los de los ratones cebados con el vector vivo vacío y reforzados con PA83 (grupo 1). Los resultados demuestran claramente que los variantes de ClyM no hemol�ticos todavía pueden conservar la inmunogenicidad de las proteínas extra�as fusionadas con el extremo carboxi-terminal de ClyM.

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Wang, J.Y., M.F. Pasetti, F. Noriega, R.J. Anderson, S.S. Wasserman, J.E. Galen, M. Sztein, y M.M. Levine, 2001,

20 Construction, genotypic and phenotypic characterization, and immunogenicity of attenuated DguaBA Salmonella enterica serovar Typhi strain CVD 915, Infect. Immun., 69:4734-4741.

Wu, K. y T.K Wood, 1994, Evaluation of the hok/sok killer locus for enhanced plasmid stability, Biotechnol. Bioeng., 44:912-921.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> University of Maryland, Baltimore

GALEN, James E. 5 CHEN, Yuansha

<120> ClyA no hemol�tica para la excreci�n de proteínas

<130> 70089.0006WOU2

<150> US 61/058,299

<151>

<160> 41 15 <170> Patentln versión 3.5

<210> 1

<211> 6271

<212> ADN 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Pl�smido de expresión pSEC84

25 <400> 1

5

<210> <211> <212> <213> 2 305 PRT Salmonella Typhi

<400>

2

5

<210> <211> <212> <213> 3 102 ADN Secuencia Artificial

10

<220> <223> <400> Cebador de clonaci�n 3

15

<210>

4

<211>

101

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

20

<220>

<223> Cebador de clonaci�n

10

<210> <211> <212> <213> 5 97 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Cebador de clonaci�n

15

<400> 5

20

<210> <211> <212> <213> 6 69 ADN Secuencia Artificial

25

<220> <223> <400> Cebador de clonaci�n 6

30

<210> <211> <212> <213> 7 60 ADN Secuencia Artificial

35

<220> <223> Cebador de clonaci�n

<400>

7

40

<210> <211> <212> <213> 8 101 ADN Secuencia Artificial

45

<220> <223> Cebador de clonaci�n

50

<210> <211> <212> <213> 9 101 ADN Secuencia Artificial

55

<220> <223> <400> Cebador de clonaci�n 8

5

<210> <211> <212> <213> 9 101 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Cebador de clonaci�n

10

<400> 9

15

<210> <211> <212> <213> 10 71 ADN Secuencia Artificial

20

<220> <223> Cebador de clonaci�n

<400>

10

25 <210> 11

<211> 103

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

30 <220>

<223> Cebador de clonaci�n

<210> 12

<211> 46

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de clonaci�n

<400> 12

50

<210> <211> <212> <213> 13 80 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

Cebador de clonaci�n

<400> 13

5

<210> <211> <212> <213> 14 110 ADN Secuencia Artificial

10

<220> <223> Cebador de clonaci�n

15 <210> 15

<211> 94

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<223> Cebador de clonaci�n

<210> 16

<211> 97

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de clonaci�n

<400> 16

40

<210> <211> <212> <213> 17 30 ADN Secuencia Artificial

45

<220> <223> <400> Cebador de clonaci�n 17

50

<210> <211> <212> <213> 18 8908 ADN Secuencia Artificial

55

<220> <223> vector pSEC84sacB

<400> 18

5

<210> <211> <212> <213> 19 2253 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

gen de fusión ClyA::SacB

10

<220> <221> <222> CDS (1)..(2253)

<400>

19

5

<210> <211> <212> <213> 20 749 PRT Secuencia Artificial

10

<220> <223> <400> Constructo sintético 20

5

<210> <211> <212> <213> 21 921 ADN Salmonella Typhi

<400>

21

53

5

<210> <211> <212> <213> 22 1102 ADN Salmonella Typhi

<400>

22

5

<210> <211> <212> <213> 23 1102 ADN Salmonella Paratyphi

<400>

23

5 <210> 24

<211> 904

<212> ADN

<213> Shigella Flexneri

10 <400> 24

5

<210> <211> <212> <213> 25 1080 ADN Escherichia Coli

<400>

25

5

<210> <211> <212> <213> 26 26 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

cebador PCR sintetizado químicamente

10

<400> 26

15

<210> <211> <212> <213> 27 36 ADN Secuencia Artificial

20

<220> <223> <400> cebador PCR sintetizado químicamente 27

25

<210> <211> <212> <213> 28 40 ADN Secuencia Artificial

30

<220> <223> cebador PCR sintetizado químicamente

<400>

28

<211> <212> <213>

40 ADN Secuencia Artificial

40

<220> <223> cebador PCR sintetizado químicamente

<400> 29

5

<210> <211> <212> <213> 30 881 ADN Secuencia Artificial

10

<220> <223> mutante clyA I198N sintetizado químicamente

<400>

30

<210> 31

<211> 919

<212> ADN

20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> mutante clyA I198N, A199D, E204K sintetizado químicamente

25 <400> 31

5

<210> <211> <212> <213> 32 6273 ADN Secuencia Artificial

10

<220> <223> pl�smido sintetizado químicamente que codifica ClyA con cod�n optimizado, condensado con GFPuv

<400>

32

5

<210> <211> <212> <213> 33 909 ADN Secuencia Artificial

10

<220> <223> <400> secuencia de polinucle�tidos de S. Typhi clyA con cod�n optimizado sintetizada químicamente 33

<210>

34

<211>

36

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

cebador PCR sintetizado químicamente

<400>

34

<210>

35

<211>

36

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

cebador PCR sintetizado químicamente

<400>

35

<210>

36

<211>

37

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

cebador PCR sintetizado químicamente

<400>

36

<210> 37

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador PCR sintetizado químicamente

<400> 37

<210>

38

<211>

96

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

cebador PCR sintetizado químicamente

<400>

38

<210>

39

<211>

97

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

cebador PCR sintetizado químicamente

<400>

39

<210>

40

<211>

1368

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

casete FRT-tetA-FRT Xba I-Not I sintetizado químicamente

<400>

40

5

<210> <211> <212> <213> 41 6979 ADN Secuencia Artificial

10

<220> <223> <400> Pl�smido de expresión pGEN222SXbaI 41

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Un método para producir una proteína de fusión, que comprende:

   (a)

   transformar una población de bacterias con un vector de expresión que codifica una proteína de fusión, en el que dicha proteína de fusión comprende una proteína de interés unida al extremo carboxi-terminal de una proteína de exportación, en el que dicha proteína de exportación es una proteína citolisina A (ClyA) de Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) que tiene una actividad hemol�tica sustancialmente reducida en comparación con la proteína ClyA de SEQ ID NO:2, teniendo dicha proteína de exportación la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y teniendo una mutación seleccionada del grupo que consiste en una mutación S195N, una mutación I198N, una mutación A199D, una mutación E204K y una mutación C285W, y

   (b)

   cultivar las bacterias transformadas de (a) en un medio de cultivo bajo condiciones en las que dicha proteína de fusión se expresa y se exporta hacia el medio de cultivo.

2. 2.- Una población de bacterias para su uso para inducir una respuesta inmunol�gica contra una proteína de fusión en un sujeto, en la que dicha población de bacterias produce y exporta una proteína de fusión en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunol�gica en dicho sujeto contra dicha proteína de fusión, en la que dichas bacterias comprenden un vector de expresión que codifica dicha proteína de fusión, en la que dicha proteína de fusión comprende una proteína de interés unida al extremo carboxi-terminal de una proteína de exportación, y en la que dicha proteína de exportación es una proteína citolisina A (ClyA) de Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) que tiene una actividad hemol�tica sustancialmente reducida en comparación con la proteína ClyA de SEQ ID NO:2, teniendo dicha proteína de exportación la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y teniendo una mutación seleccionada del grupo que consiste en una mutación S195N, una mutación I198N, una mutación A199D, una mutación E204K y una mutación C285W.
3. 3.- Un vector de expresión que comprende un módulo de expresión, en el que el módulo de expresión comprende una secuencia codificadora de una proteína de exportación unida a una secuencia codificadora de una proteína de interés en una disposición 5' a 3', en el que dicha proteína de exportación es una proteína citolisina A (ClyA) de Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) que tiene una actividad hemol�tica sustancialmente reducida en comparación con la proteína ClyA de SEQ ID NO:2, teniendo dicha proteína de exportación la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y teniendo una mutación seleccionada del grupo que consiste en una mutación S195N, una mutación I198N, una mutación A199D, una mutación E204K y una mutación C285W.
4. 4.- El método de la reivindicación 1 o la población de bacterias para su uso para inducir una respuesta inmunol�gica de la reivindicación 2, en el que dicha bacteria se selecciona del grupo que consiste en Salmonella spp., Vibrio spp. Escherichia spp. y Shigella spp.
5. 5.- El método o la población de bacterias para su uso para inducir una respuesta inmunol�gica de la reivindicación 4, en el que dicha bacteria se selecciona del grupo que consiste en S. Typhi, E. coli, E. coli enterotoxig�nica (ETEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) y Shigella flexneri 2a.
6. 6.- El método, la población de bacterias para su uso para inducir una respuesta inmunol�gica o el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la proteína de interés es un ant�geno.
7. 7.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 5 y 6, que comprende además recoger dicha proteína de fusión desde el medio de cultivo.
8. 8.- El método, la población de bacterias para su uso para inducir una respuesta inmunol�gica o el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteína citolisina A (ClyA) de S. Typhi tiene la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y tiene una mutación C285W, y otra mutación seleccionada del grupo que consiste en una mutación I198N, una mutación A199D, y una mutación E204K.
9. 9.- El método, la población de bacterias para su uso para inducir una respuesta inmunol�gica o el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteína citolisina A (ClyA) de S. Typhi tiene la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y tiene una mutación I198N, una mutación A199D, y una mutación E204K.
10. 10.- El método, la población de bacterias para su uso para inducir una respuesta inmunol�gica o el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la proteína citolisina A (ClyA) de S. Typhi tiene la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2 y tiene una mutación I198N y una mutación C285W.
11. 11.- El método, la población de bacterias para su uso para inducir una respuesta inmunol�gica o el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteína citolisina A (ClyA) de S. Typhi tiene la secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2, y en el que la proteína de interés es la proteína de la toxina del ántrax PA83.
12. 12.- La población de bacterias para su uso para para inducir una respuesta inmunol�gica de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 4 a 6 y 8 a 11, en la que dicho sujeto es un animal.
13. 13.- La población de bacterias para su uso para para inducir una respuesta inmunol�gica de la reivindicación 12, en el que dicho sujeto es un ser humano.

    Figura 15

    Grupo

    Régimen de inmunizaci�na Porcentaje de ratonesb con seroconversi�n y (GMT)c

    Cebador 1

    Cebador 2 Refuerzo Dia 42 Día 49 Día 56 Día 70

    1

    CVD 908-htrA CVD 908-htrA PA 0 (16) 20 (104) 100 (9.807) 100 (223.230)

    2

    CVD 908-htrA(pSEC91-83) CVD 908-htrA(pSEC91-83) PA 80 (479) 100 (84.498) 100 (297.860) 100 (967.681)

    3

    CVD 908-htrA(pS-CPA83-I198N)) CVD 908-htrA(pS-CPA83-I198N) PA 10 (31) 100 (15.223) 100 (120.477) 100 (670.169)

    4

    CVD 908-htrA(pS-CPA83-C285W) CVD 908-htrA(pS-CPA83-C285W) PA 0 (15) 100 (14.079) 100 (137.606) 100 (607.847)

    5

    CVD 908-htrA(pS-CPA83-DM) CVD 908-htrA(pS-CPA83-DM) PA 0 (21) 100 (4.258) 100 (85.290) 100 (699.931)

    6

    PBS PBS PBS 0 (21) 0 (21) 0 (21) 0 (28)

    aLos animales recibieron las inmunizaciones primarias en los días 0 y 14 y las inmunizaciones de refuerzo en el día 42.

    b Representa el porcentaje de ratones que desarrollan titulaciones de IgG anti-PA s�ricas recíprocas después de la vacunación. Los sueros se ensayaron a partir de dos diluciones en serie en dos veces comenzando en 1:50. c Representa la media geométrica de las titulaciones anti-PA s�ricas (GMT), en unidades ELISA (EU).

    88