CN104024400A - 经修饰的百日咳博德特氏菌菌株 - Google Patents

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Abstract

提供了衍生于母株Tohama的重组百日咳博德特氏菌菌株。所述新菌株使用等位基因交换载体pSS4245通过同源重组获得，这容许替换细菌染色体的部分而不会留下任何附属突变。编码PT亚基SI的片段经过替换而引入两个导致PT毒性活性失活的突变。这种菌株能够进一步修饰而表达增量的rPT和/或PRN。具有其启动子和ptl终止子并含有上述突变的ptx-ptl操纵子的五个PT结构基因的ptx簇的第二拷贝能够插入所述染色体上其他位置。另外，所述PRN基因的第二拷贝能够插入所述染色体上。在这两种情况下，遗弃的基因位点选择为所述插入位点而避免引入不期望的遗传改变。

Description

经修饰的百日咳博德特氏菌菌株
技术领域
本发明描述了衍生于标识为Tohama的母株并使用载体pSS4245整合突变和其它(附加，additional)基因拷贝的重组百日咳博德特氏菌(百日咳杆菌，Bordetella pertussis)菌株的构建。
背景技术
百日咳(Pertussis)或百日咳(whooping cough)是由上呼吸道的百日咳博德特氏菌感染所致的严重婴儿疾病[1]。疫苗已经面世几十年，其由百日咳博德特氏菌的灭活全细胞构成。它们作为三价白喉-破伤风-百日咳组合或者作为还提供抗乙型肝炎和b型流感嗜血杆菌侵袭性疾病的免疫力的新组合进行给药[2]。在少数几个国家中由于其令人质疑的安全谱使用全细胞疫苗已经减少、不鼓励或甚至受禁，这种令人质疑的安全谱是由于高水平内毒素和与灭活全细胞相关的其它细菌毒素所致[3,4]。
无细胞疫苗，以它们不包含全细胞而只有部分或广泛纯化的细菌抗原而得名，在1981年引入日本[5]。在无细胞疫苗中的所述组分抗原的较高纯度解读为到改善的临床安全谱。这些疫苗在验证其安全性和有效性的广泛现场试验之后于90年代中期引入工业化国家[6]。然而，由WHO更广泛引入到免疫扩展计划项目(Expanded Program of Immunization)却受阻于无细胞疫苗的显著较高的成本。
百日咳博德特氏菌的主要毒力因子是百日咳毒素(PT)[7,8]而百日咳类毒素(PTd)是无细胞疫苗中的主要抗原[8]。不像白喉和破伤风毒素，可以通过甲醛的简单处理而失活，PT已经证明更难以通过化学方法灭活[9]。目前，不同的失活方法都适用于商业化生产。在广泛通用的PT变性中所有都是通过化学处理所致。两候选疫苗都是使用遗传灭活毒素(rPT)进行探究的[10～12]而这些候选疫苗之一列入了现场药效试验中[11-12]。
然而，含rPT的疫苗尚不可获得。
发明内容
根据本发明的第一实施方式，提供了一种经遗传修饰的百日咳博德特氏菌Tohama菌株，其中所述Tohama菌株的具有ATCC登记号BAA-589的所述百日咳毒素S1基因，具有Arg9→Lys9和Glu129→Gly129突变并且由于所述突变而并未包括整合的抗生素抗性基因，其中所述经修饰的菌株能够表达去毒的百日咳毒素(rPT)。
载体pSS4245可以用于引入所述S1突变而并未整合抗生素抗性基因。
所述菌株可以通过使用载体pSS4245将所述ptx操纵子的拷贝整合到所述经修饰的Tohama菌株染色体的非功能区而进一步进行修饰，其中所述整合的ptx操纵子包含一组S2-S5基因和经修饰而包括所述突变Arg9→Lys9和Glu129→Gly129的S1基因，所述经修饰的菌株由此具有两个分开定位在所述Tohama染色体中的ptx操纵子而并未整合抗生素抗性基因，并能够表达相对于仅具有一个ptx操纵子的菌株水平增强的去毒的百日咳毒素。
所述ptx操纵子的拷贝可以整合于非功能假基因(伪基因，pseudogene)之内或之间。
所述ptx操纵子的拷贝可以整合于假定的(putative)铵转运子(铵转运蛋白，ammonium transporter)假基因amtB和假定的自主转运子(自主转运蛋白、自转运蛋白，autotransporter)假基因之间。
所述整合的所述ptx操纵子的拷贝可以受控于ptx-ptl操纵子启动子之下。
其它所述ptl操纵子的拷贝可以不引入到所述菌株中。
所述菌株可以包括多于一个所述经修饰的ptx操纵子的插入拷贝。
所述菌株可以进一步通过使用载体pSS4245将编码百日咳杆菌粘附素(Pertactin)的prn基因的拷贝整合到所述经修饰的Tohama菌株染色体的非功能区中进行修饰，所述经修饰的Tohama菌株由此具有两个分开定位在所述Tohama染色体中的prn基因而未整合抗生素抗性基因，而所述经修饰的Tohama菌株能够表达相对于仅具有一个prn基因的菌株水平增强的百日咳杆菌粘附素。
所述插入的prn基因可以位于非功能假基因之内或之间。
所述prn基因的拷贝可以整合于假定的谷胱甘肽S-转移酶假基因(pseudo-putative glutathione S-transferase gene)和假定的天冬氨酸消旋酶假基因(pseudo putative aspartate racemase gene)之间。
所述prn基因的拷贝可以受控于prn启动子之下.。
所述菌株可以包含多于一个所述prn基因的插入拷贝，而可以包含至少两个经修饰的ptx操纵子和至少两个prn基因。
优选所述野生型Tohama菌株的功能基因并未移除、替换或失活。
根据本发明的第二实施方式，提供了一种生产经修饰的百日咳博德特氏菌菌株的方法，所述方法包括用包含所述突变Arg9→Lys9和Glu129→Gly129的S1基因替换标识为Tohama的百日咳博德特氏菌菌株内具有ATCC登记号BAA-589的所述催化亚基S1基因的步骤，其中载体pSS4245用于用所述经修饰的S1基因替换所述未经修饰的S1基因，由此导致整合所述经修饰的基因而未整合抗生素抗性基因并且产生能够表达去毒的百日咳毒素(rPT)的菌株。
所述方法可以进一步包括使用载体pSS4245将所述ptx操纵子的拷贝整合到所述经修饰的Tohama菌株染色体的非功能区中的步骤，其中所述整合的ptx操纵子包含一组S2-S5基因和经修饰而包括所述突变Arg9→Lys9和Glu129→Gly129的S1基因由此生成具有两个分开定位在所述Tohama染色体中的ptx操纵子而未整合抗生素抗性基因的经修饰的Tohama菌株，所述经修饰的Tohama菌株能够表达相对于仅具有一个ptx操纵子的菌株水平增强的去毒的百日咳毒素。
所述方法可以进一步包括使用载体pSS4245将编码百日咳杆菌粘附素的prn基因的拷贝整合到所述经修饰的Tohama菌株染色体的非功能区的步骤，由此生产的经修饰的Tohama菌株具有两个分开定位在所述Tohama染色体中的prn基因而未整合抗生素抗性基因，所述经修饰的Tohama菌株能够表达相对于仅具有一个prn基因的菌株水平增强的百日咳杆菌粘附素。
多于一个所述经修饰的ptx操纵子和/或所述prn基因的拷贝可以插入到所述Tohama菌株的染色体中。
根据本发明的第三实施方式，提供了一种生产百日咳博德特氏菌抗原的方法，其包括以下步骤：
在培养基中培养以上所述的经遗传修饰的百日咳博德特氏菌Tohama菌株而实现所述抗原的表达，其中所述抗原包括通过所述菌株中存在的基因编码的去毒的百日咳毒素(rPT)、百日咳杆菌粘附素和丝状血凝素(Filamentous Hemagglutinin)(FHA)；和回收所述抗原。
所述PT和FHA抗原可以从培养基中回收，而同时所述PRN抗原可通过提取方法如高温处理而部分从培养基中和部分从细胞中回收。
凝集原2和/或3也可以进行表达并回收。
根据本发明的第四实施方式，提供了一种由上述方法制备的抗原。
所述抗原可以用于受试者中预防百日咳感染，具体而言，用于生产预防百日咳感染的无细胞疫苗(acellular vaccine)。
根据本发明的第四实施方式，提供了一种包含如上所述制备的抗原的无细胞疫苗。所述抗原可以是去毒的百日咳毒素和/或百日咳杆菌粘附素。所述疫苗可以进一步包括用于预防或治疗其它疾病(包括白喉、破伤风、乙型肝炎、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌中的一种或多种)的FHA、凝集原2和/或凝集原3和/或抗原。
附图说明
图1：等位基因交换载体pSS4245的示意性结构。
图2：用于将经修饰的S1基因构建于所述等位基因交换载体pSS4245中的载体。A：用于通过氯霉素抗性盒(cassette)替换所述S1基因并插入于所述S1侧翼区(S1flanging regions)之间的等位基因交换元件。B：用于将所述经修饰的S1基因恢复到其在所述ptx-ptl操纵子中精确位置的等位基因交换元件。为了获得所述等位基因交换，这些载体经过线性化而插入到pSS4245中，其随后通过从大肠杆菌SM10接合转移(conjugativetransfer)而引入到百日咳博德特氏菌中。
图3：等位基因交换过程。A：通过氯霉素抗性标记导致S1基因替换的双重组(double recombination)事件。B：导致其原始位置重新插入所述经修饰的S1基因的双重组事件。
图4：将所述ptx操纵子的第二拷贝插入到所述百日咳博德特氏菌染色体中的载体。A：所述ptx操纵子的第二拷贝的插入位点选择于两个分别携带两个移码突变的遗弃基因(abandoned gene)之间。B：用于将氯霉素标记插入到所选择的位点的等位基因交换元件。C：所述具有其原始启动子的ptx操纵子的示意性结构。所述ptx-ptl终止子经过克隆插入于所述S3基因之后。这个簇(cluster)最终整合到所述SS4245衍生物中而替换所述氯霉素标记并产生插入所述PT结构基因的第二拷贝的所述第二等位基因交换事件。
图5：所述R9K和E129G突变在Bp-WWC和Bp-WWD中的识别。对于菌株Bp-WWD显示了围绕所述突变的原始序列数据，其具有两个PT结构簇的拷贝。对于百日咳博德特氏菌Tohama(共有序列)及衍生物Bp-WWC和Bp-WWD显示了所述相应的序列比对。
图6：将所述prn基因的第二拷贝插入百日咳博德特氏菌染色体中的载体。A：所述prn基因的第二拷贝的所述插入位点选择于两个携带移码突变和缺失的遗弃基因之间。B：受控于fha启动子之下并侧接靶整合位点的所述prn基因的示意结构。C：受控于自身的启动子之下并侧接靶整合位点的所述prn基因的示意结构。
图7：CHO细胞簇聚(cell clustering)测试。所述细胞生长至接近汇合然后加入PT稀释液并在2天之后对所述簇聚评分。A：800ng PT(菌株Bp-WWC)。B：对照物，未加PT。C：2.6pg wt PT(菌株Tohama)对应于所述检测阈值。D：43pg wt PT(菌株Tohama)。
具体实施方式
本文中描述了衍生于标识为Tohama的母株的重组百日咳博德特氏菌菌株。所述新菌株通过同源重组使用等位基因交换载体pSS4245而获得[41]。这种载体容许替换部分细菌染色体而不会留下任何附属突变(accessory mutation)。
对PT、FHA和百日咳杆菌粘附素(PRN)的基因已经进行了克隆和测序[35-39]。百日咳毒素是一种包含6个多肽亚基，通过5个由单个启动子表达的不同结构基因编码的复杂蛋白。其酶促和其大部分的毒性活性都是由其亚基S1介导的，而其细胞结合和促有丝分裂性质是由于其它的亚基所致，这形成B亚基。
在第一实施方式中，编码PT亚基的S1的片段经过置换而引入两个引起毒性活性失活的突变。在第二实施方式中，具有其启动子和所述ptl终止子的所述ptx-ptl操纵子并含有上述突变的所述五个PT结构基因的所述ptx簇的所述第二拷贝插入到所述染色体上的其他位置。所述ptx-ptl操纵子中存在的ptl辅助基因(auxiliary gene)的组织并未修改。这种菌株产生增量的rPT。在第三实施方式中，所述prn基因的第二拷贝插入到所述染色体上。在这两种情况下，遗弃基因位点选择作为插入位点而避免引入不良遗传改变，并且所述抗原表达通过自身启动子驱动，因而受到所述母本(parent)Tohama菌株中相同的调节。
PT和更是这样的PRN在高密度培养基中是限制性抗原(limitingantigen)，而FHA由百日咳博德特氏菌在这些条件下自然过量生产。然而，PRN能够由重组大肠杆菌(E.coli)或毕赤酵母(Pichia pastoris)高收率获得[14,15]，而仅PT亚基能够表达于大肠杆菌中，但未能组装成成熟毒素，且免疫原性不足以视为潜在候选疫苗[16]。现在应该理解的是，成熟毒素的组装和分泌需要几个在稍后阶段发现的辅助基因，其是所述ptx-ptl操纵子的ptl部分的部件(part)[17]。
虽然已经报道通过操纵基因拷贝数增强生产而提高细菌毒素的生产[18,19]，具体而言是PT[20]，但是这主要用于多拷贝质粒载体或基因是串联重复的。这可能具有关于菌株遗传稳定性(特别是在生产环境中)的后果。例如，使用多拷贝质粒载体通过文献Lee et al.[40]产生的所述百日咳博德特氏菌菌株并没有显示出PT生产的任何提高，而所述质粒却进行了重排，所述PT操纵子删除或所述转移接合子(transconjugant)发生了向无毒相的转化。
与前面在百日咳博德特氏菌中使用的等位基因交换载体相反，pSS4245在所述染色体上不需要或留下附属突变，特别是由早期等位基因交换方法中所需要的自发链霉素抗性突变体的选择所导致的影响rpsL的所述突变[22]。这种影响看家(housekeeping)基因的突变可能会伤及毒力而因此危及毒力因子包括PT、FHA和PRN的表达。本发明的菌株会产生恒定水平的其它抗原，特别是FHA，并能够用于生产不太昂贵的(承担得起的)无细胞百日咳疫苗。
结果
百日咳博德特氏菌染色体中S1基因的突变
为了将所述两个突变R9K和E129G引入亚基S1中，使用了两步法，以避免所述两个突变之间的区域内重组的可能性，这种重组会导致所述突变之一丢失。这种方法还允许通过选择性培养基上的简单复制平板培养选择所述所需的菌落。首先两个大肠杆菌载体构建于氯霉素抗性基因(CmR)取代了野生型S1基因(图2A)或由包括所需突变的经修饰的S1基因取代了野生型S1基因(图2B)的pBluescript II SK+中，两者侧接1.2-1.5kB所述S1上游和下游区域。这些载体随后经过加工处理而将其插入物引入到pSS4245中。这些衍生物转移到大肠杆菌SM10中进行接合转移并等位基因交换到百日咳博德特氏菌菌株Tohama中。所述质粒pSS5Cm3通过所述CmR标记产生了所述S1基因替代(图3A)。质粒pSS5S13-9K-129G将所述S1基因恢复至其原始位置，现在具有所述两个所需的突变(图3B)。在选择性培养基上选择分离物之后，所述CmR和经修饰的S1基因在预期位置的整合通过PCR扩增(数据未显示)进行验证。所述突变的S1基因在预期位置的整合，正如通过PCR采用能够结合所述S1基因上游5'和3'下游侧翼区和内部(数据未示出)的特异性引物进行验证，是显而易见的。在选择用于进一步阐述的所述克隆的所述S1基因中的突变通过DNA测序验证。所述新菌株标识为Bp-WWC。
第二组PT结构基因的第二整合位点的插入
最初试图通过在与百日咳博德特氏菌相容的多拷贝质粒上插入整个ptx-ptl操纵子而提高PT表达，却未能提供有用的菌株，这间接表明PT过度表达有潜在的毒性，并必须保持在一定限度内才能获得能存活的菌株。为了增加所述PT毒素产率，第二组PT结构基因引入到Bp-WWC染色体中。为了识别插入靶位点，所述百日咳博德特氏菌Tohama基因组的序列经过扫描而识别了许多假基因。假定的铵转运子基因和假定的自主转运子基因之间的所述DNA序列选择用于插入(posn.2,903,988-2,905,228和2,905,291-2,908,277)。这些基因每一个都携带会断送其功能的移码突变(图4A)。遵照以上部分中列出的通用策略。首先，所述大肠杆菌载体pSKPD5Cm3通过将所述CmR基因插入到侧接所选整合位点的区域内进行构建(图4B)。在将所关注的序列插入到pSS4245中后，等位基因交换通过所述CmR标记进行选择。所述CmR基因在所设计的位置的整合通过PCR(数据未显示)进行验证。在所述第二载体中所述5个PT结构基因S1...S3与ptx启动子和所述ptl终止子一起继S3基因之后插入到相同的侧翼区而产生在S1中包含所述两个突变的载体pSKptxter(图4C)。等位基因交换进入靶整合位点将所述PT结构基因的功能簇的第二拷贝插入到Bp-WWC菌株中。所述新菌株标识为Bp-WWD。整合的结果使用结合到ptx操纵子上游或下游区域及内部的引物进行扩增而验证，这证实了预期的整合而未干扰发生重组的所述区域。
所述S1基因的测序和所述R9K和E129G突变的识别
应用自动测序验证所需突变的存在。在具有所述S1基因的两个整合拷贝的菌株Bp-WWD的情况下，原则上PCR扩增会产生所述两个基因的拷贝的混合物。在所述插入之一中一个意想不到的点突变将会作为对应位置的双核苷酸分配(assignment)出现。在R9K和E129G位置的荧光信号的单峰指示Bp-WWC上的正确序列并指示Bp-WWD中S1的两个拷贝具有相同的突变。围绕两个所需突变的序列报道于图5中，该图显示了菌株Bp-WWD的测序记录和所述wt Tohama、Bp-WWC和Bp-WWD的序列比对。
所述PRN基因的第二拷贝插入到Bp-WWD菌株中
由于PRN生产的限制，受控于所述fha启动子和其自身终止子之下的prn结构基因的第二拷贝引入到假定的谷胱甘肽S-转移酶假基因和假定的天冬氨酸消旋酶的两个假基因之间的Bp-WWD染色体中(图6A)。所述pSKPD2Cm3大肠杆菌载体构建于所述CmR基因插入所述侧接所选插入位点的上游和下游区域之间。另一载体使用所述相同侧翼区和所述受控于所述FHA启动子的prn基因进行构建(图6B)。在将所述CmR标记插入所需位置后，所述CmR基因使用通常的等位基因交换选择和筛选程序替换成所述prn功能块(functional block，功能元件)。
从这种构建体中分离出来的所述百日咳博德特氏菌菌株并不表达PRN而其它抗原的水平最终无法检测。据初步结论，如果在所述较强的FHA启动子控制下过度生产，则所述PRN产物是有毒的并仅仅逃逸已失去生产PRN能力的突变体或所有毒力因子是可行的。因此，决定引入所述天然的prn启动子代替所述fha启动子。pSKPD25FpPRN3用于用所述原始的PRN启动子代替所述FHA启动子而产生具有其自身的天然启动子和终止子的功能块(图6C)。这个功能块通过通常的等位基因交换程序插入到所选择的位点而获得具有在其自身启动子控制之下的所述prn基因的第二非串联重复拷贝的菌株。所述预期的插入通过使用结合于所述prn基因侧接区域和内部的引物的PCR扩增进行验证。这种菌株通常是可行的，并标识为Bp-WWE。
PT和PRN构建体的遗传稳定性
所述菌株Bp-WWE经过培养，并连续继代培养于MSS培养基中而达到共计约50代。最后一个培养物经过稀释并接种于MSS-琼脂。三十个分离的菌落随机挑出。三十个菌落对其S1和prn基因通过PCR(数据未示出)进行分析。所述结果表明，所有的菌落在预期的位置上都含有S1和prn基因的两个拷贝。
PT和FHA在摇瓶中的表达
PT和FHA在摇瓶培养中的生产通过ELISA进行分析。摇瓶培养物都处于含七(2,6-O-二甲基)-β-环糊精的改良的斯坦纳-斯科尔特(Stainer-Scholte)培养基(MSS)中[23,24]。菌株Bp-WWC和Bp-WWD的结果列于表1和表2中。菌株Bp-WWD中PT的产量相比于Bp-WWC和wt.Tohama大约加倍，表明了所述结构基因簇的表达水平和拷贝数的预期相关性。
表1：通过菌株Tohama、Bp-WWC和Bp-WWD的PT生产。细胞在MSS培养基中生长于摇瓶中48小时(实验#1)或20-24小时(实验#2)。两独立瓶的结果都对实验#2进行显示。经离心收获后，所述上清液通过直接ELISA采用兔多克隆抗体(实验#1)或通过夹心ELISA使用兔多克隆抗体作为捕获试剂和检测用的S2特异性单克隆(Abcam)进行检测分析。
表2:通过菌株Bp-WWC和Bp-WWD abd Bp-WWE的PT和FHA生产。细胞在MSS培养基中生长于摇瓶中24小时或36小时。经离心收获后，所述上清液对于PT和FHA通过夹心ELISA使用兔多克隆抗体作为捕获试剂和检测用的S2特异性单克隆(Abcam)或FHA单克隆剂(NIBSC)进行检测分析。
PRN在摇瓶中的表达
PRN在Bp-WWC，Bp-WWD和Bp-WWE的摇瓶培养中的生产生长于MSS培养基中。由于PRN从其膜结合前体中释放是由于未识别的蛋白酶不精确切割的结果[25]，因此PRN表达通过免疫印迹密度分析进行测定从而也评价所述抗原的完整性。同时还发现，在高密度发酵罐培养中，显著比例的PRN会自发释放到来自膜结合前体(未发表的观察结果)的培养物上清液中。因此，研究了这个属性是否被所引入的遗传修饰所改变。PRN在所述澄清的培养物上清液和所述分离的细胞的60℃提取物上进行检测分析。其结果如表3所示。PRN毒素在Bp-WWC和Bp-WWD中的含量相似。据发现在Bp-WWE中呈现两倍增加而再次表明表达水平和所述基因拷贝数的良好相关性。然而，对于Bp-WWE，培养物上清液中发现的PRN比例尽管在这些摇瓶培养物中是增加的，但所述上清液比例仍然很小或可忽略不计。
表3：通过菌株Bp-WWC，Bp-WWD和Bp-WWE的PRN生产。细胞生长于摇瓶中48小时。所述上清液和细胞通过离心分离。将细胞悬浮于原始培养体积的提取缓冲液中，并加热至60℃保持30分钟，然后再次离心而收集提取物。通过免疫蛋白印迹法检测分析两个部分中的PRN。
PRN在所有这些摇瓶培养物中的水平远低于类似条件下PT和FHA的浓度。虽然PRN不如PT生产效率高，但这个结果并不能反映高密度发酵罐培养物中的一般发现。这种差异由这样一个事实解释，即PRN是一种细胞表面蛋白，而PT和FHA要进行分泌并必然要在摇瓶中进行，所述生长时间要进行限制才能避免细胞溶解和抗原降解，因此所述生物质生长时间限制为24-36小时而培养物能够达到1～1.5的最大OD650，这相应地限制了PRN的主要来源。
PT失活的评价
PT从培养物上清液通过初始硫酸铵沉淀经配体交换色谱法替换的Ozcengiz方法[26]改良而纯化[27,28]。分析来自野生型百日咳博德特氏菌和Bp-WWC(遗传灭活的PT)的所述PT毒素的毒性并通过CHO细胞簇聚测试[29]进行比较。这种测试比对于PT报道的其它功能检测分析具有显著更高的灵敏度。天然毒素(native toxin)，从菌株百日咳博德特氏菌Tohama纯化，证实了每孔2.6pg的簇聚端点(clustering endpoint)。所述遗传灭活的PT在在该项测试中获得的最高浓度，即每个样品0.8～1.6μg下并没有促进簇聚(图7)。因此，考虑由PT的低溶解度所施加的限制，
这项测试能够证明毒性降低了5×105～106的倍数(factor)。所述结果表明，Bp-WWC的PT毒素顺利地通过五个核苷酸替换(导致PT亚基S1中两个氨基酸取代)而灭活。
讨论
无标记基因的插入和替换在这些实验中通过使用pSS4245作为百日咳博德特氏菌中的载体取得了成功。在第二同源重组导致所述质粒的切除后，相比于cre-lox系统[30]或在博德特氏菌中所使用的早期等位基因交换程序[22]在染色体中不会留下抗生素基因标记或任何瘢痕(scar)。遗传失活的PT毒素的过度产生报道于1992年[20]，是通过使用ptx基因的串联重复或另一个拷贝插入所述fha基因中实现的。所得到的菌株过量产生的PT高达80mg/L。串联重复的基因是已知导致遗传不稳定性的潜在原因。出于这个原因，百日咳博德特氏菌的基因组序列经过扫描而找出合适的整合位点。假基因两个终止子之间的DNA位置选定为所述ptx簇的整合位点。所述PT结构簇的拷贝数限制为2，因为这些毒力因子的过度生产会加重细胞代谢的负担，这会导致生长速率变慢以及最终的遗传不稳定性，正如所述初步尝试已经间接证明的那样。
本发明人报道，prn基因通过所述fha启动子驱动更高表达的过表达对所述百日咳博德特氏菌细胞显然是有毒的，这可能与较高的PT表达有关。他们的发现并没有证实更强的启动子替换所述PRN启动子会提高PRN表达[21]。因此，在所述天然(原生，native)PRN启动子控制之下增加所述基因的拷贝数为所选的方法。所述第二个基因拷贝的fha启动子被天然prn启动子替换而产生的菌株具有所述PRN基因的第二拷贝而其天然启动子插入到所述染色体上的另一位置。PRN对宿主细胞的毒性也报道于大肠杆菌中[31]。所述fha启动子随后被天然prn启动子替换，所得到的菌株在摇瓶表现出生长正常并产生相应数量加倍的PRN。尽管摇瓶中所述自发释放到所述上清液中的数量最低，但PRN在培养物上清液和细胞提取物之间的分布稍有变化，而上清液中占总PRN的较大分数。
虽然由于所述pH值快速上升和由谷氨酸碳源代谢的氨释放所致的中毒[32]限制了摇瓶中的生长，但这提供了所述菌株潜在处于优化的发酵罐条件下的有用指示。采用PT增强表达(Bp-WWD)或两个限制性抗原PT和PRN(Bp-WWE)增强表达构建稳定菌株，已经得到证明。采用单独的PT增强生产，Bp-WWD只能产生数量不足的PRN，而在这种情况下，将会指示在重组大肠杆菌或毕赤酵母菌中使用了PRN的独立供应。由于所述两个抗原PT和PRN的水平随着Bp-WWE等量增加，所述两个抗原的匹配数量预计将在高密度培养物中也会获得，由此简化了生产作业。
结论
含有PT遗传灭活的S1::R9K-E129G亚基的百日咳博德特氏菌菌株经过构建而没有任何标记或瘢痕留在其染色体中。通过在所述ptx-ptl操纵子启动子和ptl终止子控制下将5个结构基因(S1突变ptx)整合到所述染色体上的两个假基因之间而发现摇瓶中PT毒素呈两倍增加。PT的失活通过CHO细胞簇聚检测分析进行验证。此外，PRN产量通过将所述prn基因的第二拷贝整合到所述染色体上别处的其它假基因之间而增加。所述菌株据发现在摇瓶继代培养物中具有遗传稳定性，再生产的后代数比大规模(>1000L)发酵中所必需的后代数更高。这些菌株，具体而言是其中所述PT和PRN抗原的相对数量匹配疫苗组成的Bp-WWE，应该证明是有用的，使得可生产成本不高的无细胞百日咳疫苗，由于通过天然抗原对于足够的免疫原性所需的剂量更低和所述菌株对于所述两个限制性抗原PT和PRN的生产率更高而有助于降低成本。
方法
细菌菌株、质粒和培养条件
在本研究中使用的所有化学品和试剂是分子生物学或分析品级的。化学品购自Merck和Sigma。细菌培养基获自Difco(美国)和Merck(德国)。限制和修饰酶购自New England Biolabs(美国)。
大肠杆菌DH5α(Invitrogen，美国)用作克隆宿主。这种菌株37℃生长于Luria Bertani培养基(LB)中。所述大肠杆菌DH5α转化子(transformant)生长在LB中，其补充有合适的抗生素：氨苄青霉素(50μg/mL)或氯霉素(15μg/mL)。大肠杆菌SM10获自Dr.Earle S.Stibitz(Division of Bacterial，Parasitic，and Allergenic Products，Center forBiologics Evaluation and Research，Food and Drug Administration，USA)，并用作接合供体菌株。这种菌株37℃生长于补充卡那霉素(50μg/mL)的LB中。所述大肠杆菌SM10转化子生长在LB中，其补充有卡那霉素(50μg/mL)、氨苄青霉素(50μg/mL)和新霉素(10μg/mL)。百日咳博德特氏菌Tohama获自ATCC并具有ATCC登记号BAA-589(百日咳博德特氏菌Tohama Ph.I染色体登录号NC_002929，EMBL/GenBank登录号BX470248，序列可获自威康信托基金会桑格研究所(Wellcome Trust SangerInstitute)(http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/bacteria/bordetella.html)[42]。
百日咳博德特氏菌菌株35℃生长于Bordet-Gengou(BG)琼脂或经改良的斯坦纳-斯科尔特(Stainer-Scholte)培养基(MSS)上。质粒pBluescriptII SK+获自Stratagene，USA，pSS4245获自Dr.Earle S.Stibitz而pACYC184获自New England Biolabs(美国)。
表4:引物
S1侧翼区的克隆和氯霉素基因的插入
百日咳博德特氏菌菌株Tohama的染色体DNA用作源材料。所述S1基因的上游区域使用5'F-PT-SalI和5'R-PT-MCS引物通过PCR进行扩增。后者包含KpnI，XbaI，BglII和NotI位点。所述扩增产物从琼脂糖凝胶中回收，并用QIAEX II提取试剂盒(Qiagen)纯化。所述1287bp扩增产物用SalI和NotI消化并克隆到用同样的酶消化的大肠杆菌载体pSKΔKpnI中。pSKΔKpnI是KpnI位点通过消化、Klenow酶补平(fill-in)和重新环化移除的pBluescript II SK+衍生物。所得的构建体通过热激(heat shock)转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中并标识为pSK5'。下游区域也同样通过采用3'F-PT-XbaI和3'R-PT-BglII引物扩增而获得。所述1531bp产物用XbaI和BglII消化而所述回收的片段插入到用相同的酶消化的pSK5'中而得到pSK53。
所述CmR基因获自质粒pACYC184。所述基因使用所述引物CmF-KpnI和CmR-XbaI进行扩增。所述1295bp PCR产物经过纯化和用KpnI和XbaI消化而插入到同样酶切的pSK53中。所得的质粒标识为pSK5Cm3。这种质粒引入了侧接所述S1基因的5'上游和3'下游区的所述氯霉素抗性基因(图2A)。
所述S1基因通过同源重组的交换
为了实施所述等位基因交换进入百日咳博德特氏菌中，使用了所述新开发的载体pSS4245(图1)。这种载体的完整描述尚未公布，而因此我们在这里报告其结构的概述。这种载体专门设计用于博德特氏菌种中的等位基因交换。它包含一个可以插入所述染色体上的所关注的基因及其侧接序列的多连接子克隆位点，多个抗生素抗性基因，包括用于大肠杆菌中选择载体及其衍生物的氨苄青霉素。复制的起点衍生于pBR322，这间接表明所述载体能够在大肠杆菌中复制，但会在百日咳博德特氏菌中自毁。还有的链霉素磷酸转移酶基因衍生于Tn5：此基因赋予百日咳博德特氏菌但不会赋予大肠杆菌链霉素抗性[33]。大肠杆菌供体和百日咳博德特氏菌受体之间的接合转移可能因为存在衍生于质粒RP4的转移起点而发生。这要求使用大肠杆菌SM10作为供体菌株，反式地(in trans)提供衍生于RP4的所必要的接合功能[22]。接合仅仅通过在支撑两种细菌生长的琼脂板上对供体百日咳博德特氏菌和所述供体大肠杆菌一起划线而发生。由于所述载体在百日咳博德特氏菌中是自毁的，则选择链霉素用于通过在侧接所关注基因的区域之一中同源重组而整合所述整个载体及其StrR标记的百日咳博德特氏菌细胞，并同时消除了所述大肠杆菌供体。为了解决这种共整合体和消除大部分载体而保存所感兴趣的基因，pSS4245连同所述对应的酶切位点一起引入所述I-SceI大范围核酸酶(meganuclease)基因(图1)[34]。所述核酸酶置于所述ptx-ptl操纵子启动子的控制之下。在所述百日咳博德特氏菌染色体上还没有相应的酶切位点。共整合体(cointegrate)的选择不得不在调节条件下实施，在这种情况下百日咳博德特氏菌包括PT的所有毒力因子都被抑制。这种条件通过向接合(mating)过程中所用的MSS-琼脂平板加入20mM烟酸而获得。所述接合后体混合物向MSS-琼脂(无烟酸添加)转移会减轻ptx启动子的抑制，而因此随后表达I-SceI核酸酶。这导致所述整合的载体中细菌染色体在所述核酸酶位点的水平发生双链断裂。如果没有修复这将是致命的。DNA损伤也激活进行修复的所述SOS响应：所述重组频率增加了2-3log而所述损伤则最终被第二同源重组消除[34]。在任一情况下，大部分的载体会丢失。如果所述第二重组发生于同一侧翼区，则原始菌株再生，如果发生于其它侧翼区，则获得所需的菌株。很少菌落需要与大约相同尺寸的侧翼区一样对其氯霉素抗性状态进行筛选，所述两种所得的菌株类型，即亲本和重组，大约等量分布。
质粒pSK5Cm3用SacI和BglII消化而所述连接于pSS4245的回收片段用SacI和BamHI进行酶切。在转化进入大肠杆菌SM10中之后，所得的质粒标识为pSS5Cm3。刮下百日咳博德特氏菌菌株Tohama(在MSS-琼脂上用20mM烟酸4天)的新鲜培养物和具有所述载体的大肠杆菌SM10(在具有氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素的LB-琼脂上过夜)的新鲜培养物并与20mM烟酸和10mM MgCl2混合于含有LB:MSS(1:1)的琼脂平板上。35℃下3小时后，所述混合物用拭子取到(swab)具有20mM烟酸、50μg/mL链霉素和5μg/mL氯霉素的MSS上。拭子(swab)生长划线到MSS-琼脂上，其具有用于第二重组事件的5μg/mL氯霉素。所得的单菌落通过复制平板培养进行测试而少数具有SmS和CmR表型的菌落保留用于进一步的测试(图3A)。所述菌落采用百日咳博德特氏菌特异性引物通过PCR扩增确认为百日咳博德特氏菌。所述CmR基因在所设计的位置的整合通过PCR采用特异性结合到所述CmR基因上游5'(5'F-int和5'RCM-int引物)和3'(3'FCM-int和3'R-int引物)下游侧翼区和内部的引物进行验证。根据PCR分析，证实了所述5'和3'侧翼区均存在，以及所述CmR基因已经插入预期位置代替了所述S1基因。这些验证也证实了所述等位基因交换过程没有导致发生重组的所述S1侧翼区中的任何改变。
经修饰的S1基因的构建
所述S1基因通过PCR扩增克隆，并通过位点定向的PCR诱变进行突变。所述引物S1F-PT-KpnI和S1R-PT-XbaI用于扩增所述染色体DNA的基因。所述纯化的PCR产物用XbaI和KpnI消化而所述回收的908bp片段连接到相同酶切的pSK53中。经过转化和菌落选择之后，所获得的质粒标识为pSK5S13。
位点定向PCR诱变使用所述具有序列错配CGC→AAG的内部F-R9K和R-R9K引物，导致所述R9K替换。这些引物用于独立的反应循环中。所述扩增产物随后合并，并在退火之后继续扩增4-5个循环。所述外引物随后加入到所述反应中而产生含有所需突变的整个S1片段。所述相同的方法步骤适用于使用所述内部错配引物F-E129G和R-E129G产生所述第二突变，而产生所述序列GAA→GGG，导致所述E129G替换。
所得到的片段用XbaI和KpnI消化并插入到用相同酶切的pSK53中而获得质粒pSK5S13-9K-129G(图2B)。这用SacI和BglII消化而所述回收的片段连接于用SacI和BamHI酶切的pSS4245中。在转化进入大肠杆菌SM10中之后，所得的质粒标识为pSS5S13-9K-129G。
如上所述实施等位基因交换而将所述经修饰的S1基因插回到百日咳博德特氏菌染色体上最初的位置，但没有通过氯霉素选择接合后体。在这种情况下所需的菌株已经失去了这种标记，而因此通过复制平板培养的筛选是必要的，才能识别具有所需表型CmS和SmS的菌落。所述获得的Tohama衍生物标识为Bp-WWC(图3B)。所述S1突变的基因在设计位置的整合通过PCR采用特异性引物进行验证。所述引物能够结合所述S1基因的上游5'(5'F-int和R-R9K引物)和3'(F-E129G和3'R-int引物)下游侧翼区和内部。
第二组所述5PT结构基因的插入
侧接靶向插入位点的序列(图4A)首先克隆而获得pSKPD5Cm3。所述上游1688bp片段采用引物5'F-PD-ApaI和5'R-PD-MCS扩增，用ApaI和KpnI消化并连接于用相同酶切的pSK5Cm3中而获得pSKPD5'-Cm。所述下游2980bp片段采用引物3'F-PD-MCS和3'R-PD-BglⅡ扩增，用XbaI和BglII消化并连接于用相同酶切的pSKPD5'-Cm中。所得的质粒标识为pSKPD5Cm3(图4B)。
所述接合的构建体通过用NotI和BglII消化该质粒并连接于用NotI和BamHI消化的pSS4245中而获得。所得的质粒标识为pSSPD53-Cm。对于SmS和CmR的接合转移和选择提供了所需的百日咳博德特氏菌衍生物Bp-PD53-Cm，其中所述完整的上游，下游和CmR插入物的存在通过PCR扩增验证。所述引物能够结合所述CmR基因的上游5'(5'FPD-int和5'RCM-int引物)和3'(3'FCM-int和3'RPD-int引物)下游侧翼区和内部。
具有其启动子的所述ptx操纵子的功能拷贝通过邻近(next to)所述S3基因插入所述ptx-ptl终止子而产生。具有其操纵子启动子的PT的所述5个结构基因(经修饰的S1，S2，S4，S5，S3)由Bp-WWC DNA使用引物PtxF-BamHI和PtxR-MCS进行扩增。所述3469bp扩增产物用BamHI和SpeI消化而所述回收的片段连接于用相同酶切的pSK□RI中而获得pSKptx。所述pSK□RI是其中EcoRI位点已经通过消化和用所述Klenow酶补平和重新环化而移除的pBluescript II SK+变体。
所述ptx-ptl操纵子终止子随后采用TerF-EcoRI和TerR-SpeI引物扩增。所述223bp产物用EcoRI和SpeI双酶消化并连接到用相同酶切的pSKptx中。经过转化和菌落选择后，所述获得的质粒标识为pSKptxter(图4C)。所述质粒随后用BamHI和SpeI双酶消化并连接到用相同酶切的pSSPD5Cm3中而获得所述接合的载体pSSPDptxter。按照上述等位基因交换到Bp-PD53Cm中，其中采用针对SmS和CmS菌落的影印筛选而获得标识为Bp-WWD的菌株。所述S1突变的基因在设计位置的整合通过PCR采用特异性引物进行验证。所述引物能够结合所述S1基因上游5'(5'FPD-int和R-R9K引物)和3'(F-E129G和3'RPD-int引物)下游侧翼区和内部。
所述PRN结构基因第二拷贝的插入
氯霉素抗性基因整合到选择用于整合所述PRN结构基因第二拷贝的靶位点。
缺乏BamHI位点的pBluescript SK+的衍生物通过用所述酶消化，用所述Klenow酶补平和连接而进行构建。所得的质粒转化到大肠杆菌中，并标识为pSKΔH1。
所述百日咳博德特氏菌Tohama菌株的序列经过扫描而识别出假基因。假定的谷胱甘肽S-转移酶假基因和假定的天冬氨酸消旋酶假基因之间的DNA序列选为所述插入位点(posn.1,344,710-1,345,685和1,345,693-1,346049)。这些基因携带移码突变，并非功能性的(图6A)。
利用携带SpeI(5'F-PD2-SpeI)的引物和包括BamHI和NotI(5'R-PD2-MCS)限制位点的多连接子扩增所述靶插入位点的所述5'上游区域。所述扩增产物用凝胶电泳分离并用SpeI和NotI双酶消化。所得的片段连接到用相同酶消化的pSKΔH1的片段中。所得的质粒转化到大肠杆菌中，并标识为pSKPD25。所述3'-下游片段类似地用携带XbaI(3'F-PD2-XbaI)和NotI(3'R-PD2-NotI)限制性位点的引物扩增。在用相同酶消化后，所述获得的片段连接到用相同酶消化的pSKPD25的片段中。所得的质粒转化到大肠杆菌中，并标识为pSKPD253。
所述氯霉素抗性位点由质粒pACYC184使用携带BamHI(CmF-BamHI)和XbaI(CmR-XbaI)限制位点的引物通过PCR扩增而获得。所述PCR产物用两种酶消化并克隆到用相同酶切的pSKPD253中。连接后，所得的质粒转化入大肠杆菌，通过限制性分析验证并标识为pSKPD25Cm3。
在通过限制性图谱绘制验证后，所述质粒用NotI和SpeI消化并将所述获得的片段连接到用相同酶双酶消化的pSS4245中。所得的质粒标识为pSSP2D5Cm3并转化到大肠杆菌SM10中。
使用Bp-WWD作为受体百日咳博德特氏菌菌株，如上进行接合，并对CmR和SmS单菌落进行选择。所述CmR基因在所设计位置的整合通过PCR采用仅仅特异性结合所述CmR基因上游5'(5'FPD2-int和5'RCM-int引物)和3'(3'FCM-int和3'RPD2-int引物)下游侧翼区和内部的引物进行验证。
prn基因在fha启动子控制之下的整合
所述PRN的结构基因由百日咳博德特氏菌DNA使用始于ATG起始密码子(F)的引物和携带XbaI(R)限制位点的引物进行扩增。仅包含所述编码区和所述终止子的所述2,808bp扩增产物通过“A”拖尾协议(‘A’加尾协议，‘A’tailing protocol)(Promega)处理。所得的片段克隆到pGEM-T easy载体中。所述得到的质粒标识为载体pGEM-TPRN通过限制性分析而证实。在创建通过更强FHA启动子驱动的所述PRN基因第二拷贝的初始实验工作中，所述FHA启动子通过PCR扩增而从百日咳博德特氏菌DNA中分离出来并在PRN基因之前插入。所述FHA启动子通过携带所述BamHI(FHAproF-BamHI)的引物和含有NdeI-XbaI(FHAR-MCS)的多连接子(polylinker)而扩增。所述纯化的产物用BamHI和XbaI进行酶切，随后所述回收的DNA片段连接到也用相同酶切的pSKPD253中。所得的质粒，标识为pSKPD253Fp，通过限制性分析验证。这种质粒用NdeI和XbaI进行酶切，然后与由pGEMTPRN通过PRNF-NdeI和PRNR-XbaI引物扩增并用相同酶切的所述prn基因的PCR产物进行连接。所得的质粒标识为pSKPD25FpPRN3(图6B)。所述接合构建体通过用NotI和SpeI消化该质粒并连接到用相同酶消化的pSS4245中而获得。所得的质粒标识为pSSPD2FpPRN。所述构建体插入到所述Bp-WWD染色体的所选定位置而替换使用常规等位基因交换方法和如上所述的筛选引入的氯霉素抗性标记。
prn基因在prn启动子控制之下的表达
所述PRN启动子通过百日咳博德特氏菌DNA的PCR扩增使用具有限制性位点BamHI(PrnProF-BamHI)和NdeI(PRNProR-NdeI)的引物进行克隆。所述质粒pSKPD25FpPRN3用BamHI和NdeI进行酶切而产生已经失去所述FHA启动子的片段。所述PRN启动子连接于其位置。在转化到大肠杆菌中并通过限制性分析验证之后，所得的质粒标识为pSKPD25PRN3(图后6C)。所述质粒用NotI进行酶切并插入到用相同酶切的pSS4245中。所获得的构建体，pSSPD2prn，转移到大肠杆菌SM10中而实施所述等位基因交换。所获得的百日咳博德特氏菌菌株标识为Bp-WWE。prn基因在设计位置的整合通过PCR采用仅特异性结合于所述prn基因上游5'(5'FPD2-int和PRNProR-NdeI引物)和3'(PRNF-int和3'RPD2-int引物)下游侧翼区和内部的引物进行验证。
摇瓶培养中的PT、FHA和PRN表达
在装有100mL用甲基化的β环糊精补充的MSS培养基的摇瓶中35℃，200rpm培养所述Bp-WWC、、Bp-WWD和Bp-WWE生长。经过32-48小时的生长，收集所述培养物上清液并通过ELISA法检测分析而定量所述PT和FHA的表达水平。PRN表达通过蛋白免疫印迹密度(光密度，densitometric)分析测定从而也评价抗原的完整性。此检测分析方法既对澄清的培养物上清液进行实施，也对通过在等渗缓冲液中60℃下加热获得的细胞提取液进行实施。
PT和FHA的ELISA检测分析
抗PT或FHA(1:1000，NLAC，泰国)的纯化兔多克隆抗体涂覆于96孔板(NUNC Maxisorp)内，每孔100μL，在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中，并在4℃下培养过夜。用含0.1％吐温20的磷酸盐缓冲盐水pH7.4(PBST)洗涤3次后，用每孔100μL含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBST实施封闭，然后在37℃下培养1小时。在弃去所述封闭缓冲液并洗涤后，载入所述标准PT、FHA或样品的稀释液并在37℃下培养1小时。在用PBST冲洗3次后，加入100μL在封闭缓冲液中的抗PT亚基S2小鼠单克隆抗体(1:30,000，Abcam，USA))或抗FHA小鼠单克隆抗体(1:10,000，NIBSC，UK)并在相同条件下培养。在用PBST洗涤3次所述孔之后，使用100μL在封闭缓冲液中的兔抗小鼠(H+L)IgG–HRP共轭物(Abcam，美国)1:10,000稀释液作为第二抗体，并在37℃下再培养1小时。在用PST冲洗后，加入100μL3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)(KPL，USA)作为酶底物。所述显色反应用每孔100μL1N HCl终止。用微量滴定板读数器(微量滴定读板器)在450nm下测定光密度。
PRN的蛋白免疫印迹分析
标准PRN和样品的稀释液解析(resolve)于10％SDS-PAGE凝胶中，随后使用半干蛋白印迹系统转移至PVDF膜上。所述膜用PBST中的5％脱脂奶粉封闭1小时。在弃去所述封闭溶液后，所述膜用20mL在封闭缓冲液中的抗-PRN绵羊血清(1:10,000，NIBSC，UK)培养1小时，然后用PBST洗涤3次。然后将所述膜用20mL兔抗绵羊IgG-HRP共轭物(SantaCruz Biotechnology，美国)在相同条件下培养，并再次洗涤。所述膜随后浸渍于3,3'-二氨基苄脒中直到棕色显影。所述反应通过用去离子水漂洗2-3次终止，然后放置室温下至干燥。所述膜经过扫描并转换为图像文件。通过所述样品和参照条带的光密度分析使用专用软件推导PRN浓度。
遗传稳定性
所述菌株在35℃和200rpm下培养于100mL MSS培养基中48小时，然后将0.1mL培养物转移到100mL MSS中而在相同条件下培养并重复该步骤4次以上。每次转移相当于10代。所述培养物经过稀释并接种于MSS琼脂上。随机挑出三十个独立的菌落。在所选择的30个菌落中两个进行PCR分析，而检测所述PT和PRN插入物的预期存在。
CHO细胞簇聚检测分析
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞簇聚活性通过Hewlett等(Hewlett et al.)的方法进行测定[28]。简而言之，CHO细胞培养于补充有10％胎牛血清的所述cRPMI1640培养基中。所述细胞在37℃下于5％CO2气氛下进行培养。所述培养的细胞用胰蛋白酶处理，并用cRPMI1640培养基调节至2×104个细胞/mL，而向96孔微培养板的孔中每孔分配200μL部分。测试样品和参照PT毒素按照10倍间隔连续稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH7.4中并向这些孔中加入25μL体积的稀释液。在相同条件下培养48小时而允许最大簇聚，细胞用结晶紫染色并拍照。
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Claims (39)

1.一种经遗传修饰的百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)Tohama菌株，其中所述Tohama菌株的ATCC登记号为BAA-589的百日咳毒素S1基因具有Arg9→Lys9和Glu129→Gly129突变并且由于所述突变而不包括整合的抗生素抗性基因，其中所述经修饰的菌株能够表达去毒的百日咳毒素(rPT)。
2.根据权利要求1所述的经修饰的Tohama菌株，其中载体pSS4245用于引入所述S1突变而不整合抗生素抗性基因。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的经修饰的Tohama菌株，其标识为Bp-WWC并具有………登记号………。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的经修饰的Tohama菌株，其已通过使用载体pSS4245将ptx操纵子的拷贝整合到所述经修饰的Tohama菌株的染色体的非功能区而进一步修饰，其中所述整合的ptx操纵子包含一组S2-S5基因和经修饰而包括所述突变Arg9→Lys9和Glu129→Gly129的S1基因，所述经修饰的菌株由此具有两个分开定位于所述Tohama染色体中而无整合的抗生素抗性基因的ptx操纵子，并能够表达相对于仅具有一个ptx操纵子的菌株水平增强的去毒百日咳毒素。
5.根据权利要求4所述的经修饰的Tohama菌株，其中所述ptx操纵子的拷贝整合于非功能假基因之内或之间。
6.根据权利要求4或5中任一项所述的经修饰的Tohama菌株，其中所述ptx操纵子的拷贝整合于假定的铵转运子假基因amtB和假定的自主转运子假基因之间。
7.根据权利要求4～6中任一项所述的经修饰的Tohama菌株，其中所述ptx操纵子的整合的拷贝受控于ptx-ptl操纵子启动子。
8.根据权利要求4～7中任一项所述的经修饰的Tohama菌株，其不包含所述ptl操纵子的其它拷贝。
9.根据权利要求4～8中任一项所述的经修饰的Tohama菌株，其包含多于一个的所述经修饰的ptx操纵子的插入拷贝。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的经修饰的Tohama菌株，其已通过使用载体pSS4245将编码百日咳杆菌粘附素的prn基因的拷贝整合到所述经修饰的Tohama菌株的染色体的非功能区中而进一步修饰，所述经修饰的Tohama菌株由此具有两个分开定位在所述Tohama染色体中而未整合抗生素抗性基因的prn基因，而所述经修饰的Tohama菌株能够表达相对于仅具有一个prn基因的菌株水平增强的百日咳杆菌粘附素。
11.根据权利要求10所述的经修饰的Tohama菌株，其中所述插入的prn基因位于非功能假基因之内或之间。
12.根据权利要求10或11中任一项所述的经修饰的Tohama菌株，其中所述prn基因的拷贝整合于假定的谷胱甘肽S-转移酶假基因和假定的天冬氨酸消旋酶假基因之间。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的经修饰的Tohama菌株，其中所述prn基因的拷贝受控于prn启动子。
14.根据权利要求10～13中任一项所述的经修饰的Tohama菌株，其包含多于一个的所述prn基因的插入拷贝。
15.根据权利要求10～14中任一项所述的经修饰的Tohama菌株，其包含至少两个经修饰的ptx操纵子和至少两个prn基因。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的经修饰的Tohama菌株，其中野生型Tohama菌株的功能基因并未移除、替换或失活。
17.一种生产经修饰的百日咳博德特氏菌菌株的方法，所述方法包括用包含突变Arg9→Lys9和Glu129→Gly129的S1基因替代标识为Tohama的百日咳博德特氏菌菌株中ATCC登记号为BAA-589的催化亚基S1基因的步骤，其中载体pSS4245用于使用所述经修饰的S1基因代替未经修饰的S1基因，由此导致所述经修饰的基因的整合而未整合抗生素抗性基因，并且产生能够表达去毒的百日咳毒素(rPT)的菌株。
18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括使用载体pSS4245将ptx操纵子的拷贝整合到所述经修饰的Tohama菌株染色体的非功能区中的步骤，其中所述整合的ptx操纵子包含一组S2-S5基因和经修饰而包括所述突变Arg9→Lys9和Glu129→Gly129的S1基因，由此生产经修饰的Tohama菌株，所述经修饰的Tohama菌株具有两个分开定位在所述Tohama染色体中而未整合抗生素抗性基因的ptx操纵子，所述经修饰的Tohama菌株能够表达相对于仅具有一个ptx操纵子的菌株水平增强的去毒百日咳毒素。
19.根据权利要求17或18中任一项所述的方法，其进一步包括使用载体pSS4245将编码百日咳杆菌粘附素的prn基因的拷贝整合至所述经修饰的Tohama菌株染色体的非功能区中的步骤，由此生产经修饰的Tohama菌株，所述经修饰的Tohama菌株具有两个分开定位于所述Tohama染色体中而未整合抗生素抗性基因的prn基因，所述经修饰的Tohama菌株能够表达相对于仅具有一个prn基因的菌株水平增强的百日咳杆菌粘附素。
20.根据权利要求17～19中任一项所述的方法，其不包括将所述ptl操纵子的拷贝整合至所述经修饰的Tohama菌株的染色体中的步骤，使得所述经修饰的Tohama菌株仅含有单个ptl操纵子。
21.根据权利要求17～20中任一项所述的方法，其中野生型Tohama菌株的功能基因并未移除、替换或失活。
22.根据权利要求18～21中任一项所述的方法，其中所述ptx操纵子和/或所述prn基因整合于非功能假基因之内或之间。
23.根据权利要求18～22中任一项所述的方法，其中所述ptx操纵子的拷贝整合于假定的铵转运子假基因amtB和假定的自主转运子假基因之间。
24.根据权利要求18～23中任一项所述的方法，其中整合的所述ptx操纵子的拷贝受控于ptx-ptl操纵子启动子。
25.根据权利要求19～24中任一项所述的方法，其中所述prn基因的拷贝整合于假定的谷胱甘肽S-转移酶假基因和假定的天冬氨酸消旋酶假基因之间。
26.根据权利要求19～25中任一项所述的方法，其中整合的所述prn基因的拷贝受控于所述prn启动子。
27.根据权利要求19～26中任一项所述的方法，其中所述经修饰的ptx操纵子的拷贝和所述prn基因的拷贝插入到所述Tohama菌株的染色体中。
28.根据权利要求18～27中任一项所述的方法，其中多于一个的所述经修饰的ptx操纵子的拷贝插入至所述Tohama菌株的染色体之中。
29.根据权利要求19～28中任一项所述的方法，其中多于一个的所述prn基因的拷贝插入至所述Tohama菌株的染色体之中。
30.一种生产百日咳博德特氏菌抗原的方法，其包括以下步骤：
(i)在培养基中培养权利要求1～16中任一项所述的或根据权利要求17～29中任一项所述的方法生产的经遗传修饰的百日咳博德特氏菌Tohama菌株而实现所述抗原的表达，其中所述抗原包括通过所述菌株中存在的基因所编码的去毒百日咳毒素(rPT)、百日咳杆菌粘附素和丝状血凝素(FHA)；和
(ii)回收所述抗原。
31.根据权利要求30所述的方法，其中从所述培养基中回收至少一些所述抗原。
32.根据权利要求30或31中任一项所述的方法，其中凝集原2和/或3也被表达和回收。
33.通过权利要求30～32中任一项所述的方法而生产的抗原。
34.根据权利要求33所述的抗原，用于预防受试者的百日咳感染。
35.通过权利要求30～32中任一项所述的方法生产的抗原在生产用于预防受试者百日咳感染的无细胞疫苗的方法中的用途。
36.一种无细胞疫苗，包含根据权利要求30～32中任一项所述的方法生产的抗原。
37.根据权利要求36所述的疫苗，其中所述抗原是去毒的百日咳毒素和/或百日咳杆菌粘附素。
38.根据权利要求37所述的疫苗，其进一步包括FHA、凝集原2和/或凝集原3。
39.根据权利要求36～38中任一项所述的疫苗，其进一步包括用于预防或治疗其它疾病的抗原，包括白喉、破伤风、乙型肝炎、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌中的一种或多种。
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