BR112014014950A2 - cepa tohama de bordetella pertussis, métodos para produzir uma cepa de bordetella pertussis e antígenos de bordetella pertussis, antígeno, uso de um antígeno, e, vacina acelular - Google Patents

Abstract

1 / 1 resumo “cepa tohama de bordetella pertussis, mã‰todos para produzir uma cepa de bordetella pertussis e antãgenos de bordetella pertussis, antãgeno, uso de um antãgeno, e, vacina acelular” sã£o providas cepas da bordetella pertussis recombinantes derivadas da cepa precursora tohama. as cepas inã©ditas sã£o obtidas por recombinaã§ã£o homã³loga usando um vetor de troca alã©lica pss4245, que permite a substituiã§ã£o de seã§ãµes do cromossomo bacteriano sem deixar mutaã§ãµes acessã³rias. o segmento que codifica da subunidade s1 de pt ã© substituã­do para introduzir duas mutaã§ãµes que causam inativaã§ã£o da atividade tã³xica de pt. esta cepa pode ser adicionalmente modificada para expressar maiores quantidades de rpt e/ou prn. uma segunda cã³pia do agrupamento de ptx dos cinco genes estruturais de pt do operon ptx-ptl, com seu promotor e o terminador de ptl e contendo as mutaã§ãµes anteriores pode ser inserida em outra parte no cromossomo. alã©m do mais, uma segunda cã³pia do gene prn pode ser inserida no cromossomo. em ambos os casos, loci do gene abandonado sã£o selecionados como o sã­tio de inserã§ã£o para evitar a introduã§ã£o de alteraã§ãµes genã©ticas indesejã¡veis.

Description

“CEPA DE BORDETELLA PERTUSSIS GENETICAMENTE MODIFICADA, E, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA CEPA DE BORDETELLA PERTUSSIS MODIFICADA E PARA PRODUZIR ANTÍGENOS DE BORDETELLA PERTUSSIS” CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção diz respeito a construção de cepas recombinantes de Bordetella pertussis derivadas de uma cepa precursora designada Tohama e usando vetor pSS4245 para integração de mutações e cópias adicionais dos genes.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] Coqueluche ou tosse convulsa é uma grave doença de criança causada por infecção de Bordetella pertussis do trato respiratório superior [1]. Vacinas que consistem em células totais mortas de B. pertussis foram disponíveis por décadas. Elas são administradas como combinação trivalente de Difteria-Tétano-Coqueluche ou combinações mais novas fornecendo também imunidade contra Hepatite B e doença invasiva tipo b de Haemophilus influenzae [2]. O uso de vacinas de célula total foi reduzido, desencorajado ou mesmo banido em um alguns países, devido a seu perfil de segurança questionável, que é devido a altos níveis de endotoxina e outras toxinas bacterianas associadas com as células totais mortas [3, 4].

[0003] Vacinas acelulares, assim denominadas pelo fato de que elas não contêm células totais, mas somente antígenos bacterianos parcial ou extensivamente purificados, foram introduzidas no Japão em 1981 [5]. A maior pureza dos antígenos componentes em vacinas acelulares traduziu em um melhor perfil de segurança clínica. Essas vacinas foram introduzidas em meados dos anos noventa em países industrializados depois experiências extensivas de campo que demonstrou sua segurança e eficácia [6]. Uma introdução mais ampla por WHO no Expanded Program of Immunization foi, entretanto, impedida pelo custo significativamente mais alto de vacinas acelulares.

[0004] Um principal fator de virulência de B. pertussis é Toxina Pertussis (PT) [7, 8] e toxoide de coqueluche (PTd) é o principal antígeno em vacinas acelulares [8]. Diferente de toxinas de Difteria e Tétano, que podem ser inativadas por tratamento simples com formaldeído, PT mostrou-se mais difícil de ser inativado por meios químicos [9]. Atualmente, diferentes processos de inativação estão em uso para produção comercial. Todos têm em comum a desnaturação extensiva de PT causada pelo tratamento químico. Duas vacinas candidatas foram exploradas usando uma toxina geneticamente inativada (rIPT) [10-12] e um desses candidatos foi incluído em uma experiência de eficácia do campo [11-12].

[0005] Vacinas contendo rPT, entretanto, não estão ainda disponíveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] De acordo com uma primeira modalidade da invenção, é fornecida uma cepa Tohama de Bordetella pertussis geneticamente modificada, em que o gene S! da Toxina Pertussis da cepa Tohama com número de acesso ATCC BAA-589 tem mutações Arg9—-Lys9 e Glu129—Gly129 e não inclui um gene de resistência a antibiótico integrado em decorrência das mutações, em que a cepa modificada é capaz de expressar Toxina Pertussis destoxificada (rPT).

[0007] Vetor pSS4245 pode ser usado para introduzir as mutações de S1 sem integração de um gene de resistência a antibiótico.

[0008] A cepa pode ter sido adicionalmente modificada por integração de uma cópia do operon pix em uma região não funcional do cromossomo da cepa Tohama modificada usando vetor pSS4245, em que o operon ptx integrado compreende um conjunto de genes S2 - S5 e um gene S1 que foi modificado para incluir as mutações Arg9—Lys9 e Glu129—Gly129, a cepa modificada por meio disso tendo dois operons ptrx que são posicionados à parte no cromossomo Tohama sem um gene de resistência a antibiótico integrado, e sendo capaz de expressar maiores níveis de Toxina Pertussis destoxificada com relação a uma cepa com somente um operon ptx.

[0009] A cópia do operon ptx pode ser integrada em pseudogenes não funcionais ou entre eles.

[00010] A cópia do operon ptx pode ser integrada entre um pseudogene amtB transportador de amônio putativo e um pseudogene autotransportador putativo.

[00011] A cópia integrada do operon ptx pode estar sob o controle de um promotor de operon ptx-ptl.

[00012] Uma cópia adicional do operon ptl pode não estar incorporada na cepa.

[00013] A cepa pode incluir mais que uma cópia inserida do operon ptx modificado.

[00014] A cepa pode ser adicionalmente modificada por integração de uma cópia de um gene prn que codifica Pertactina em uma região não funcional do cromossomo da cepa Tohama modificada usando vetor pSS4245, a cepa Tohama modificada por meio disso tendo dois genes prns, que são posicionados à parte no cromossomo Tohama sem integração de um gene de resistência a antibiótico, e a cepa Tohama modificada sendo capaz de expressar maiores níveis de Pertactina com relação a uma cepa com somente um gene prn.

[00015] O gene prn inserido pode ser localizado em pseudogenes não funcionais ou entre eles.

[00016] A cópia do gene prn pode ser integrada entre um gene glutationa S-transferase pseudoputativo e um gene aspartato racemase pseudoputativo.

[00017] A cópia do gene prn pode estar sob o controle de um promotor de prn.

[00018] A cepa pode compreender mais que uma cópia inserida do gene prn, e pode compreender pelo menos dois operons ptx modificados e pelo menos dois genes prn.

[00019] Preferivelmente, genes funcionais da cepa Tohama tipo selvagem não foram removidos, substituídos ou inativados.

[00020] De acordo com uma segunda modalidade da invenção, é fornecido um método de produzir uma cepa de B. Pertussis modificada, o método compreendendo a etapa de substituir o gene S! da subunidade catalítica em uma cepa de B. Pertussis designada Tohama e com número de acesso ATCC BAA-589 com um gene S/ que inclui as mutações Arg9—Lys9 e Glu129—Gly129 em que o vetor pSS4245 é usado para substituir o gene S! não modificado com o gene SI! modificado, por meio disso, resultando em integração do gene modificado sem integração de um gene de resistência a antibiótico, e sendo produzida uma cepa que é capaz de expressar Toxina Pertussis destoxificada (rPT).

[00021] O método pode adicionalmente incluir a etapa de integrar uma cópia do operon ptx em uma região não funcional do cromossomo da cepa Tohama modificada usando vetor pSS4245, em que o operon ptx integrado compreende um conjunto de genes S2 - S5 e um gene S! que foi modificado para incluir as mutações Arg9—Lys9 e Glul29—Gly129, por meio disso produzindo uma cepa Tohama modificada, que tem dois operons ptx que são posicionados à parte no cromossomo Tohama sem integração de um gene de resistência a antibiótico, a cepa Tohama modificada sendo capaz de expressar maiores níveis de Toxina Pertussis destoxificada com relação a uma cepa com somente um operon ptx.

[00022] O método pode adicionalmente incluir a etapa de integrar uma cópia de um gene prn que codifica Pertactina em uma região não funcional do cromossomo da cepa Tohama modificada usando vetor pSS4245, por meio disso produzindo uma cepa Tohama modificada que tem dois genes prn que são posicionados à parte no cromossomo Tohama, sem integração de um gene de resistência a antibiótico, a cepa Tohama modificada sendo capaz de expressar maiores níveis de Pertactina com relação a uma cepa com somente um gene prn.

[00023] Mais que uma cópia do operon ptx modificado e/ou o gene prn pode ser inserida no cromossomo da cepa Tohama.

[00024] De acordo com uma terceira modalidade da invenção, é fornecido um método de produzir antígenos de Bordetella Pertussis que compreende as etapas de: cultivar uma cepa Tohama de B. Pertussis geneticamente modificada descrita anteriormente em um meio de cultura para efetuar expressão dos antígenos, em que os antígenos incluem Toxina Pertussis destoxificada (rPT), Pertactina e Hemaglutinina Filamentosa (FHA) codificadas por genes presentes na cepa; e recuperar os antígenos.

[00025] Os antígenos de PT e FHA podem ser recuperados do meio de cultura, enquanto o antígeno de PRN pode ser recuperado em parte do meio de cultura e em parte das células por procedimentos de extração tal como tratamento a alta temperatura.

[00026] Aglutinógenos 2 e/ou 3 podem também ser expressos e recuperados.

[00027] De acordo com uma quarta modalidade da invenção, é fornecido um antígeno produzido pelo método descrito anteriormente.

[00028] O antígeno pode ser usado na prevenção de infecção de Pertussis em um sujeito e, em particular, na fabricação de uma vacina acelular para prevenção de infecção de Pertussis.

[00029] De acordo com uma quarta modalidade da invenção, é fornecida uma vacina acelular compreendendo um antígeno produzido da maneira descrita anteriormente. O antígeno pode ser Toxina Pertussis destoxificada e/ou Pertactina. A vacina pode adicionalmente incluir FHA, Aglutinógeno 2 e/ou Aglutinógeno 3 e/ou antígenos para prevenir ou tratar outras doenças, incluindo um ou mais de Difteria, Tétano, Hepatite B, Poliomielite e Hemophilus influenzae tipo b.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00030] Figura 1: Estrutura esquemática do vetor pSS4245 de troca alélica

[00031] Figura 2: Vetores para a construção de um gene SI modificado no vetor pSsS4245 de troca alélica. A: Elemento de troca alélica para substituir o gene S! por um cassete de resistência a cloranfenicol, inserido entre as regiões de flanqueamento de S/. B: Elemento de troca alélica para retornar o gene S! modificado para sua posição exata no operon ptx-ptl. Para obter a troca alélica, esses vetores são linearizados e inseridos em pSS4245, que é então introduzido no B. Pertussis por transferência conjugativa de SM10 de E. coli.

[00032] Figura 3: Procedimento de troca alélica. À: Eventos de recombinação dupla que levam à substituição do gene S! por um marcador de resistência a cloranfenicol. B: Eventos de recombinação dupla que levam à reinserção do gene S! modificado na sua posição original.

[00033] Figura 4: Vetores para a inserção da segunda cópia do operon ptx no cromossomo de B. Pertussis. À: O sítio de inserção para uma segunda cópia do operon ptx foi selecionado entre dois genes abandonados carregando cada qual duas mutações de deslocamento do quadro. B: Elementos de troca alélica usados para inserir um marcador de cloranfenicol no sítio selecionado. C: Estrutura esquemática do operon ptx com seu promotor original. O terminador de ptx-ptl foi clonado e inserido depois do gene S3. Este agrupamento foi finalmente integrado no derivado de SS4245 para substituir o marcador de cloranfenicol e gerar o segundo evento de troca alélica para inserir a segunda cópia dos genes estruturais de PT.

[00034] Figura 5: Identificação das mutações R9K e EI29G em Bp- WWC e Bp-WWD. Dados de sequência bruta em torno das mutações são mostrados para cepa Bp-WWD, que tem duas cópias do agrupamento estrutural de PT. Os alinhamentos de sequência correspondentes são mostrados para Tohama B. Pertussis (sequência de consenso) e derivados Bp- WWC e Bp-WWD.

[00035] Figura 6: Vetores para a inserção da segunda cópia do gene prn no cromossomo de B. Pertussis. À: O sítio de inserção para uma segunda cópia do gene prn foi selecionado entre dois genes abandonados carregando mutações de deslocamento do quadro e uma deleção. B: Estrutura esquemática do gene prn sob controle do promotor de fha e flanqueamento com sítio de integração alvo. C: Estrutura esquemática do gene prn sob controle de seu próprio promotor e flanqueamento com sítio de integração alvo.

[00036] Figura 7: Teste de agrupamento de célula CHO. As células foram crescidas até próximo a confluência, então diluições de PT foram adicionadas e o agrupamento foi pontuado depois de 2 dias. A: 800 ng de PT (cepa Bp-WWO). B: Controle, nenhuma PT adicionada. C: 2,6 pg em peso de PT (cepa Tohama) correspondente ao patamar de detecção. D. 43 pg em peso de PT (cepa Tohama).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00037] Cepas recombinantes de Bordetella Pertussis derivadas de uma cepa precursora designada Tohama são descritas aqui. As cepas inéditas são obtidas por recombinação homóloga usando um vetor pSS4245 de troca alélica [41]. Este vetor permite a substituição de seções do cromossomo bacteriano sem deixar nenhuma mutação acessória.

[00038] Os genes para PT, FHA e Pertactina (PRN) foram clonados e sequenciados [35-39]. Toxina de Pertussis é uma proteína complexa composta de seis subunidades de polipeptídeo, codificada por cinco diferentes genes estruturais expressos de um único promotor. Suas atividades enzimáticas e na maioria das vezes tóxicas são mediadas por sua subunidade

SI, enquanto sua ligação celular e propriedades mitogênicas são devido a outras subunidades, que formam a subunidade B.

[00039] Em uma primeira modalidade, o segmento que codifica a subunidade S7 de PT foi substituído para introduzir duas mutações causando a inativação da atividade tóxica. Em uma segunda modalidade, uma segunda cópia do agrupamento de ptx dos cinco genes estruturais de PT do operon ptx- ptl, com seu promotor e o terminador de prl e contendo as mutações anteriores, foi inserida em outra parte no cromossomo. A organização de genes auxiliares de ptl presentes no operon ptx-ptl não foi modificada. Esta cepa produzida aumentou as quantidades de rPT. Em uma terceira modalidade, uma segunda cópia do gene prn foi inserida no cromossomo. Em ambos os casos, loci do gene abandonados foram selecionados como sítio de inserção para evitar a introdução de alterações genéticas indesejáveis, e a expressão do antígeno foi acionada pelos promotores autólogos, sujeito assim ao mesmo regulamento como da cepa Tohama precursora.

[00040] PT e principalmente PRN são os antígenos limitantes em culturas de alta densidade, enquanto FHA é naturalmente sobreproduzida por B. Pertussis nessas condições. PRN, entretanto, poderia ser obtida em alta produção a partir de E. coli ou Pichia pastoris recombinantes [14, 15] enquanto que somente subunidades de PT poderiam ser expressas em E. coli, mas, não conseguiram montar na toxina madura e foram insuficientemente imunogênicas para ser consideradas candidatas a vacina potenciais [16]. Entende-se agora que montagem e secreção da toxina madura exigem diversos genes auxiliares descobertos em um estágio posterior, que são parte da seção de ptl do operon ptx-ptl [17].

[00041] Embora tenha sido reportado que maior produção por manipulação de número de cópia genética aumenta a produção de toxinas bacterianas [18, 19], em particular PT [20], isto foi amplamente usado com vetores de plasmídeo multicópias ou genes foram repetidos em tandem. Isto pode ter consequências na estabilidade das cepas genéticas, em particular, em um ambiente de produção. Por exemplo, as cepas de B. Pertussis geradas por Lee et al. [40] usando vetores de plasmídeo multicópias não mostraram nenhum aumento na produção de PT, e o plasmídeo foi rearranjado, o operon de PT deletado ou os transconjugantes passaram por conversão para uma fase avirulenta.

[00042] Contrário aos vetores de troca alélica usados anteriormente em B. Pertussis, pSS4245 não exige ou deixa mutações auxiliares no cromossomo, em particular, a mutação que afeta rpsL que resulta da seleção de mutantes resistentes a estreptomicina espontâneos exigidos no procedimento anterior de trocas alélicas [22]. Tais mutações que afetam genes zeladores podem impedir a virulência e, consequentemente, a expressão de fatores de virulência incluindo PT, FHA e PRN. As cepas da presente invenção produzem níveis inalterados dos outros antígenos, em particular FHA, e podem ser usadas para a produção de vacinas de coqueluche acelulares disponíveis. Resultados Mutação do gene SI em cromossomo de B. Pertussis

[00043] Para introduzir as duas mutações R9K e E129G na subunidade S1, foi usada uma abordagem de dois estágios, para evitar a possibilidade de recombinação na região entre as duas mutações, que causaria a perda de uma das mutações. Esta abordagem também permite a seleção das colônias desejadas por plaqueamento réplica simples no meio seletivo. Primeiro dois vetores de E. coli foram construídos em pBluescript II SK+, onde o gene SI tipo selvagem foi substituído por um gene de resistência a cloranfenicol (Cm) (Figura 2A) ou por um gene S! modificado incluindo as mutações desejadas (Figura 2B), ambos flanqueados por 1,2-1,5 kB das regiões de S1 à montante e à jusante. Esses vetores foram então processados e seus insertos introduzidos no pSS4245. Esses derivados foram transferidos para SM10 de

E. coli para transferência conjugativa e troca alélica para cepa de Tohama B. Pertussis. O plasmídeo pSS5Cm3 gerou uma substituição do gene S/ pelo marcador de Cm? (Figura 3A). O plasmídeo pSS5S13-9K-129G restaurou o gene SI! para a sua posição original, agora com as duas mutações desejadas (Figura 3B). Depois da seleção de isolados no meio seletivo, a integração dos genes Cm? e SI modificado na posição esperada foi confirmada por amplificação de PCR (dados não mostrados). A integração do gene S! mutado na posição esperada foi evidente conforme confirmado por PCR com iniciadores específicos que poderiam ligar as regiões de flanqueamento 5º à montante e 3º à jusante e internamente no gene S/ (dados não mostrados). As mutações no gene S/ do clone selecionado para elaboração adicional foram confirmadas por sequenciamento de DNA. A cepa inédita foi designada Bp- WWPC.

Inserção de um segundo sítio de integração para um segundo conjunto de genes estruturais de PT

[00044] Tentativas iniciais de aumentar expressão de PT inserindo o operon ptx-ptl total em um plasmídeo multicópias compatível com B. Pertussis não conseguiu distribuir cepas úteis, sugerindo que a sobre- expressão de PT é potencialmente tóxica e deve permanecer dentro de certos limites para obter cepas viáveis. A fim de aumentar a produção de toxina PT, um segundo conjunto de gene estrutural de PT foi introduzido no cromossomo Bp-WWC. Para identificar um sítio alvo de inserção, a sequência do genoma Tohama de B. Pertussis foi varrida e muitos pseudogenes foram identificados. A sequência de DNA entre um gene transportador de amônio putativo e um gene autotransportador putativo foi selecionada para inserção (posn. 2.903.988-2.905.228 e 2.905.291-2.908.277). Esses genes carregam cada qual das mutações de deslocamento do quadro que arruína sua funcionalidade (Figura 4A). A estratégia geral esboçada na seção anterior foi seguida. Primeiro, o vetor pPSKPD5Cm;3 de £. coli foi construído inserindo o gene Cm? nas regiões flanqueando o sítio de integração selecionado (Figura 4B). Depois da inserção das sequências de interesse no pSS4245, troca alélica foi selecionada pelo marcador de Cm*?. Integração do gene Cm? na posição designada foi confirmada por PCR (dados não mostrados). No segundo vetor, os 5 genes estruturais de PT S/...S3 foram inseridos com o promotor de ptx e o terminador de ptl depois do gene S3 nas mesmas regiões de flanqueamento para gerar o vetor pSKptxter incluindo as duas mutações em S! (Figura 4C). Troca alélica no sítio de integração alvo inseriu uma segunda cópia do agrupamento funcional dos genes estruturais de PT na cepa Bp-WWC. A nova cepa foi designada Bp-WWD. O resultado de integração foi verificado por amplificação usando ligação de iniciadores nas regiões à montante ou à jusante e dentro do operon ptx, que apresentou a integração esperada sem interrupção das regiões onde a recombinação Ocorreu. Sequenciamento do gene SI e identificação das mutações R9K e E129G

[00045] Sequenciamento automatizado foi aplicado para confirmar a presença das mutações desejadas. No caso de cepa Bp-WWD que tem duas cópia integradas do gene S!, amplificação de PCR produz em princípio uma mistura das cópias dos dois genes. Uma mutação no ponto inesperado em um dos insertos apareceria como uma associação de nucleotídeo duplo na posição correspondente. O único pico de sinal de fluorescência nas posições de R9K e E129G indicou a sequência correta em Bp-WWC e que as duas cópias de S/ em Bp-WWD tiveram mutações idênticas. A sequência em torno das duas mutações desejadas é reportada na figura 5, que mostra os registros de sequenciamento para cepa Bp-WWD e os alinhamentos de sequência para Tohama wt, Bp-WWC e Bp-WWD. Inserção de uma segunda cópia dos genes PRN na cepa Bp-WWD

[00046] Devido à limitação de produção de PRN, uma segunda cópia de gene estrutural prn sob controle do promotor de fha e seu próprio terminador foi introduzida no cromossomo de Bp-WWD entre os dois pseudogenes do pseudogene de glutationa S-transferase putativo e um aspartato racemase putativo (Figura 6A). O vetor pPSKPD2Cm3 de E. coli foi construído onde o gene Cm*º foi inserido entre as regiões à montante e à jusante flanqueando o sítio de inserção selecionado. Um outro vetor foi construído usando as mesmas regiões de flanqueamento e o gene prn sob o controle do promotor de FHA (Figura 6B). Depois da inserção do marcador de Cm? na posição desejada, o gene Cm? foi substituído pelo bloco funcional de prn usando a procedimentos usuais de seleção e classificação de troca alélica.

[00047] As cepas de B. Pertussis isoladas desta construção não expressaram PRN e o nível dos outros antígenos eventualmente não foi detectável. Concluiu-se tentativamente que o produto de PRN é tóxico, se sobreproduzido sob o controle do promotor de FHA mais forte, e somente escapam mutantes que perderam a capacidade de produzir PRN ou todos os fatores de virulência forem viáveis. Decidiu-se, portanto, introduzir o promotor de prn natural no lugar do promotor de fha. PSKPD25FpPRN3 foi usado para substituir o promotor de FHA pelo promotor de PRN original para gerar um bloco funcional com seu próprio promotor e terminador natural (Figura 6C). Este bloco funcional foi inserido no sítio selecionado pelo procedimento usual de troca alélica para obter uma cepa com uma segunda cópia repetida não em tandem, do gene prn sob controle de seu próprio promotor. A inserção esperada foi confirmada por amplificação de PCR com ligação de iniciadores nas regiões de flanqueamento e internamente no gene prn. Esta cepa foi normalmente viável e foi designada Bp- WWE. Estabilidade genética de construtos de PT e PRN

[00048] A cepa Bp- WWE foi cultivada e serialmente subcultivada em meio MSS para alcançar aproximadamente um total de 50 gerações. A última cultura foi diluída e plaqueada em ágar do MSS. Trinta colônias isoladas foram aleatoriamente selecionadas. Trinta colônias foram analisadas quanto seus genes S! e prn por PCR (dados não mostrados). O resultado mostrou que todas as colônias continham duas cópias de genes SI e prn nas posições esperadas. Expressão de PT e FHA em frasco de agitação

[00049] A produção de PT e FHA em culturas em frasco de agitação foi analisada por ELISA. Culturas em frascos de agitação foram todas em meio Stainer-Scholte Modificado (MSS) contendo heptaquis(2,6-O-dimetil)- B-ciclodextrina [23, 24]. Resultados de cepas Bp-WWC e Bp-WWD são mostrados nas tabelas 1 e 2. A produção de PT foi cerca de o dobro em cepa Bp-WWD comparada com Bp-WWC e wt Tohama mostrando a correlação esperada do nível de expressão e o número de cópias do agrupamento do gene estrutural. Tabela 1: produção de PT por cepas Tohama, Bp-WWC e Bp-WWD. Células foram crescidas em frascos de agitação por 48 horas (expt. tff1) ou 20- 24 horas (expt. 12) em meio MSS. Os resultados dos dois frascos independentes são mostrados para expt. 42. Depois de colheita por centrifugação, os sobrenadantes foram ensaiados por uma ELISA direta com um anticorpo policlonal coelho (expt. fl) ou por uma ELISA sanduíche usando um anticorpo policlonal coelho como reagente de captura e um monoclonal específico de S2 (Abcam) para detecção.

PT, ug/ml Cepa Meio Expt. 1 Expt. 12 Meme 2 Nas Bp-WWD MSS 5,25 4,5-5,3 Tabela 2: Produção de PT e FHA por cepas Bp-WWC e Bp-WWD abd Bp- WWE. Células foram crescidas em frascos de agitação para 24 ou 36 horas em meio MSS. Depois da colheita por centrifugação, os sobrenadantes foram ensaiados com relação a PT e FHA por uma ELISA sanduíche usando um anticorpo policlonal coelho como reagente de captura e um monoclonal específico de S2 (Abcam) ou um regente monoclonal de FHA (NIBSC) para detecção. PT, ug/mlL FHA, ug/mL Cepa Meio 24 horas 36 horas 24 horas 36 horas Bp-WWC MSS 3,16 2,96 10,9 20,5 Bp-WWD MSS 4,21 4,03 517 12,8 Bp-WWE MSS 4,63 4,97 11,4 18,9 Expressão de PRN em frasco de agitação

[00050] A produção de PRN nas culturas em frasco de agitação de Bp- WWC, Bp-WWD e Bp-WWE cresceu em meio MSS. Como liberação de PRN de seu precursor ligado a membrana é o resultado de uma clivagem imprecisa por proteases não identificadas [25], expressão de PRN foi determinada por análise densitométrica western blot para avaliar também a integridade do antígeno. Observou-se também que em culturas em fermentador de alta densidade, uma fração significativa de PRN é espontaneamente liberada no sobrenadante da cultura a partir do precursor ligado a membrana (observações não publicadas). Portanto, foi investigado se esta propriedade foi modificada pelas modificações genéticas introduzidas. PRN foi ensaiada no sobrenadante clarificado das culturas e no extrato 60ºC das células separadas. Os resultados são mostrados na tabela 3. A quantidade de toxina de PRN em Bp-WWC e Bp-WWD foram similares. Um aumento duas vezes foi observado em Bp-WWE mostrando novamente uma boa correlação do nível de expressão e o número de cópia genética. Entretanto, com Bp-WWE, a fração de PRN observada no sobrenadante da cultura foi aumentada, embora nessas culturas de frasco a fração do sobrenadante tenha permanecido pequena ou desprezível.

Tabela 3: Produção de PRN por cepas Bp-WWC, Bp-WWD e Bp-WWE. Células foram crescidas em frascos de agitação por 48 horas. O sobrenadante e células foram separados por centrifugação. As células foram suspensas no volume de cultura original de tampão de extração e aquecidas a 60ºC por 30 minutos, então centrifugadas novamente para coletar o extrato. PRN foi ensaiada em ambas as frações por Western blot.

Cepa Extrato, ug/mL Sobrenadante, ug/mL (9%) Total, ug/mL Bp-WWC 3,34 0,08 (2,3 %) 3,42 Bp-WWD 3,04 0,04 (1,3 %) 3,08 Bp-WWE 6,77 0,60 (8,2 %) 7,37

[00051] O nível de PRN em todas essas culturas de frasco foi igualmente abaixo da concentração de PT e FHA em condições similares. Embora PRN seja produzida menos eficientemente do que PT, este resultado não reflete o descobertas geralmente feitas em culturas em fermentador de alta densidade. Esta discrepância é explicada pelo fato de que PRN é uma proteína de superfície celular enquanto que PT e FHA são secretados e por necessidade em frascos de agitação, o tempo de crescimento é limitado para evitar célula lise e degradação do antígeno, consequentemente o tempo de crescimento da biomassa é limitado a 24-36 horas e culturas podem atingir um ODs5o máximo de 1-1,5, que correspondentemente limita a fonte primária de PRN. Avaliação de inativação de PT

[00052] PT foi purificada de sobrenadantes de cultura por uma modificação do processo de Ozcengiz [26] onde a precipitação de sulfato de amônio inicial foi substituída por cromatografia de troca de ligante [27, 28]. A toxicidade da toxina PT de B. Pertussis e Bp-WWC do tipo selvagem (PT geneticamente inativada) foi analisada e comparada por teste de agrupamento de célula CHO [29]. Este teste tem uma sensibilidade muito maior do que outros ensaios funcionais reportados para PT. A toxina nativa, purificada a partir da cepa Tohama B. Pertussis demonstrou um ponto final de agrupamento a 2,6 pg por poço. A PT geneticamente inativada não promoveu agrupamento nas concentrações mais altas obtidas neste teste, a saber, 0,8-1,6 ug por amostra (Figura 7). Este teste pode, portanto, demonstrar uma redução de toxicidade por um fator de 5 x 10º a 1056, considerando as limitações impostas pela baixa solubilidade de PT. O resultado mostra que toxina PT de Bp-WWC>C foi inativada com sucesso por cinco substituições de nucleotídeo resultando em duas substituições aminoácido em subunidade S/ de PT.

Discussão

[00053] Inserção e substituição genética não marcadas nesses experimentos foram bem sucedidas usando pSS4245 como o vetor em B. Pertussis. Depois de uma segunda recombinação homóloga causando a excisão do plasmídeo, nenhum marcador genético de antibiótico ou nenhuma marca foram deixados no cromossomo quando comparados com o sistema cre-lox [30] ou procedimentos anteriores de troca alélica usados em Bordetella [22]. Sobreprodução de toxina PT geneticamente desativada foi reportada em 1992 [20] usando repetições em tandem de genes ptx ou uma outra cópia inserida no gene fha. À cepa resultante sobreproduziu PT até 80 mg/L. Genes repetidos em tandem são uma causa potencial conhecida de instabilidade genética. Por este motivo, a sequência de genoma de B. Pertussis foi varrida para descobrir sítios de integração adequados. A posição de DNA entre dois terminadores de pseudogenes foi selecionada como sítios de integração para o agrupamento de ptx. O número de cópia para O agrupamento estrutural de PT foi limitado a dois, as sobreprodução desses fatores de virulência coloca um carga no metabolismo celular, que pode resultar em taxa crescimento e eventualmente instabilidade genética mais baixa, já que as tentativas preliminares foram sugeridas.

[00054] Foi reportado que sobre-expressão de gene prn pelo promotor de fha para acionar maior expressão foi aparentemente tóxica para a célula de B. Pertussis, possivelmente em associação com maior expressão de PT. Suas descobertas não confirmam a maior expressão de PRN por substituição do promotor de PRN por um promotor mais forte [21]. Portanto aumentar o número de cópia genética sob o controle do promotor de PRN nativo foi a abordagem selecionada. O promotor de fha da segunda cópia genética foi substituído pelo promotor de prn nativo para gerar uma cepa com uma segunda cópia do gene PRN e seu promotor nativo inserido em uma outra posição no cromossomo. A toxicidade de PRN para a célula do hospedeiro foi também reportada em E. coli [31]. O promotor de fha foi então substituído pelo promotor de prn nativo, a cepa resultante exibiu crescimento normal em frascos agitadores e produziu quantidades correspondentemente duplas de PRN. A distribuição de PRN entre sobrenadante da cultura e extrato celular foi um pouco modificada com uma maior fração da PRN total no sobrenadante, embora em frascos de agitação as quantidades espontaneamente liberada no sobrenadante sejam mínimas.

[00055] Embora o crescimento em frasco de agitação seja limitado devido ao rápido aumento do pH e intoxicação resultante da liberação de amônia pelo metabolismo da fonte de carbono de glutamato [32], ele fornece uma indicação útil do potencial da cepa em condições de fermentador otimizadas. Foi demonstrada a construção de cepas estáveis com maior expressão de PT (Bp-WWD) ou dos dois antígenos PT e PRN limitantes (Bp- WWE). Com maior produção de PT sozinha, Bp-WWD pode somente gerar quantidades insuficientes de PRN e neste caso, o uso de um suprimento independente de PRN em E. coli ou P. pastoris recombinantes seria indicado. Como o nível dos dois antígenos PT e PRN foi igualmente maior com Bp- WWE, espera-se obter também quantidades casadas dos dois antígenos em culturas de alta densidade, por meio disso simplificando operações de produção. Conclusões

[00056] Cepas de B. Pertussis que contêm uma subunidade S/::R9K- E1I129G geneticamente inativada de PT foram construídas sem nenhum marcador ou marca deixada em seu cromossomo. Um aumento duas vezes de toxina PT foi observado em frascos de agitação por integração de 5 genes estruturais (ptx com S! mutado) sob o controle do promotor de operon ptx-ptl e terminador de ptl entre dois pseudogenes no cromossomo. Inativação de PT foi confirmada por ensaio de agrupamento da célula CHO. Além disso, produção de PRN foi aumentada por integração de uma segunda cópia do gene prn entre outros pseudogenes em outra parte no cromossomo. As cepas foram observadas geneticamente estáveis em subculturas de frasco de agitação reproduzindo um número de gerações maior que seria necessário em fermentação uma grande escala (>1.000 L). Essas cepas, em particular Bp- WWE, onde as quantidades relativas dos antígenos PT e PRN casam a composição de vacinas, devem mostrar utilidade para permitir a produção de vacinas de coqueluche acelulares disponíveis, contribuindo para a redução de custo de pelas menores dosagem exigidas por antígenos nativos para imunogenicidade adequada e a maior produtividade da cepa para o dois antígenos PT e PRN limitantes. Métodos Cepas bacterianas, plasmídeos e condições de cultura

[00057] Todos os produtos químicas e reagentes usados em este estudo foram tanto biologia molecular quanto grau analítico. Produtos químicos foram adquiridos da Merck and Sigma. Meios de cultura bacteriana foram obtidos da Difco (USA) and Merck (Alemanha). Enzimas de restrição e modificação foram adquiridas da New England Biolabs (USA).

[00058] DH5a de E. coli (Invitrogen, USA) foi usado como um hospedeiro de clonagem. Esta cepa foi crescida a 37ºC em meio Luria Bertani (LB). Os transformantes DH5a de E. coli foram crescidos em LB suplementado com antibióticos apropriados: ampicilina (50 ug/mL) ou cloranfenicol (15 ug/mL). SM10 de E. coli foi obtido da Dr. Earle S. Stibitz (Division of Bacterial, Parasitic, and Allergenic Products, Center for Biologics Evaluation and Research, Food and Drug Administration, USA) e usados como uma cepa doadora de conjugação. Esta cepa foi crescida a 37ºC em LB suplementado com canamicina (50 ug/mL). Os transformantes SM10 de E. coli foram crescidos em LB suplementado com canamicina (50 ug/mL), ampicilina (50 ug/mL) e neomicina (10 ug/mL). Tohama B. Pertussis foi obtida da ATCC e tem número de acesso ATCC BAA-589 (Bordetella

Pertussis Tohama Ph. I cromossomo número de acesso. NC 002929, EMBL/GenBank número de acesso. BX470248, sequência disponível pela Wellcome Trust Sanger Institute (http://wwW.sanger.ac.uk/resources/ downloads/bacteria/bordetella.html) [42]).

[00059] Cepas de B. Pertussis foram crescidas a 35ºC em ágar Bordet- Gengou (BG) ou meio Stainer-Scholte modificado (MSS). Plasmídeo pBluescript II SK+ foi obtido da Stratagene, USA, pSS4245 foi obtido da Dr. Earle S. Stibitz e pACYCI184 foi obtido da New England Biolabs (USA). Tabela 4: Iniciadores de nucleotídeo Nome Sequência SF-PT-Sall GCGGTCGACGGCGCGCAATGCGGCGCGGAC Seq ID No: 1 GGGGGCGGCCGCGAGATCTCTCTAGACGGTACCATCGCG — SegIDNo:2 S'R-PT-MCS CGACTTTGCGCCGAAGGA 3F-PT-Xbal CGTTCTAGACCTGGCCCAGCCCEGCCCAAC Seg ID No:3 3R-PT-BgIll GGCAGATCTGCAGTTCGAGCAGATCGCCGG Seq ID No:4 CmF-Kpnl CGCGGTACCTGATGTCCGGCGGTGCTTITG Seq ID No:5 CmR-Xbal AATCTAGATATCGTCAATTATTACCTCCAC Seq ID No:6 SIF-PT-Kpnl GATGGTACCGGTCACCGTCCGGACCGTGCT Seq ID No:7 SIR-PT-Xbal CAGGTCTAGAACGAATACGCGATGCTTTCG Seq ID No:8 R-R9K GGGCGGGAGTCATACTTGTATACGGTGGCGG Seq ID No:9 F-R9K CCGCCACCGTATACAAGTATGACTCCCGCCCE Seg ID No:10 F-E129G CCACCTACCAGAGCGGGTATCTGGCACACCGG Seg ID No:11 R-E129G CCGGTGTGCCAGATACCCGCTCTGGTAGGTGG Seg ID No:12 5'F-PD-Apai GGAGGGCCCATGAAACTCGTCATCGCCATCATCAAGCCC — SeqID No:13 TACGGTACCGGATCCCGCATCGCAACAACGGGGTCATCG — SeqID No:14 5'R-PD-MCS CGACCC CGTTCTAGAACTAGTCCGCTACCAGGTGTAGCGATAGCCC Seg ID No:15 3'F-PD-MCS AGGTG 3'R-PD-BgllI TGTAGATCTCGGCGAGATACTTGCGTTTCGGCGTTGTCG — SeqIDNo:16 PtxF-BamHT TTGGGATCCCAGCGCAGCCCTCCAACGEGCCATCC Seg ID No:17 TCTACTAGTAAGAATTCTCGCGGTATCCGTCAAGGAAAAA SegID No:18 PIXR-MCS CATGGAC TerF-EcoRI GCGGAATTCCGCCTGCCGCCTGCACGCAT Seg ID No:19 TerR-Spel TCCACTAGTCAAGGGCATCGGGCGCCGGC Seg ID No:20 S'F-PD2-Spel CGCACTAGTCTATTCCAGCGGCGGGTCGAAATGGC Seg ID No:21 SR-PD2MCS CCCCAGGCGGCCGCTGTCTAGAGTGGATCCCAGGCCGAT — Seg ID No:22 " GCGTCCGCCGTGCAGGC 3F-PD2-Xbal ATCTCTAGAATGGGCACCTCGGCCACGCTGGCGCTG Seg ID No:23 ' AAGTATCGCGGCCGATGAGCGAAACCCTGTTGAAAGTAT — Seq ID No:24 3'R-PD2-Notl c CmF-BamHI CGCGGATCCTGATGTCCGGCGGTGCTTITG Seg ID No:25 FHAproF-BamHI — TCTGGATCCCTGCGCTGGCACCEGEGGEGGGECG Seg ID No:26 GCCTCTAGATTCATATGATTCCGACCAGCGAAGTGAAGTA Seg ID No:27 FHAR-MCS AT PRNF-Ndel CTGGTCGGCATATGAACATGTCTCTGTCACGCATTG Seg ID No:28 PRNR-Xbal GCCTCTAGAGCCTGGAGACTGGCACCGGCCAAGE Seg ID No:29 PrnProF-BamHI — CGGGGATCCGCACCCTGGCCTGEGGGGCGGGACE Seg ID No:30 PRNProR-Ndel — AGACATGTTCATATGGATGCCAGGTGGAGAGCAGA Seg ID No:31 SF-int CTAGCGTTCGCATACCAAATCCTTGC Seg ID No:32 S'RCM-int CCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGG Seg ID No:33 3FCM-int TCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAG Seg ID No:34 3R-int AGCATGTTGCGGTGTTCCCGGAATG Seg ID No:35

S'FPD-int ATGACGGAAAGCCGCATGGGCATTGGGTCC Seq ID No:36 3'RPD-int TTCGTACGTGTTCAGGTGCCGATTGCCGG Seq ID No:37 S'FPD2-int TGGGCTGGCTGTTCTGGCACGAAACG Seq ID No:38 3RPD2-int TTCATCGAATCGGCGCTGATCCTGGC Seq ID No:39 PRNF-int AGGTGCAGCCATACATCAAGGCCAGC Seq ID No:40 Clonagem de regiões de flanqueamento SI e inserção de um gene de cloranfenicol

[00060] O DNA cromossômico da cepa de Tohama B. Pertussis foi usado como material de fonte. A região do gene S! à montante foi amplificada por PCR usando os iniciadores 5S'F-PT-Sall e SR-PT-MCS. O último contém sítios KpnI, Xbal, BgIII e Notl. O produto da amplificação foi recuperado de agarose gel e purificado por estojo QIAEX II Extraction (Qiagen). O produto de amplificação de 1287 bp foi digerido com Sall e Notl e clonado no vetor pSKAKpnI de E. coli digerido com as mesmas enzimas. PSKAKpnI é um derivado de pBluescript Il SK+ onde o sítio KpnI foi removido por digestão, enchimento com a enzima de Klenow e recircularização. O construto resultante foi transformado por choque térmico nas células competentes de E. coli DH5Saa e designada pSK5'. A região à jusante foi similarmente obtida por amplificação com os iniciadores 3'F-PT- Xbal e 3R-PT-BglIIl. O produto de 1531 bp foi digerido com Xbal e BgIIT e o fragmento recuperado inserido no pSK5' digerido com as mesmas enzimas para obter pSK53.

[00061] O gene Cm? foi obtido do plasmídeo pACYCI84. O gene foi amplificado usando os iniciadores CmF-KpnI e Cm?*-Xbal. O produto de 1295 bp PCR foi purificado e digerido com KpnI e Xbal e inserido no pSK53 cortado com as mesmas enzimas. O plasmídeo resultante foi designado PSK5Cm3. Este plasmídeo incorpora o gene de resistência a cloranfenicol flanqueado pelas regiões 5* à montante e 3 à jusante do gene S7 (Figura 2A). Troca do gene SI por recombinação homóloga

[00062] Para realizar a troca alélica no B. Pertussis, o vetor pSS4245 recém desenvolvido (Figura 1) foi usado. Uma descrição completa deste vetor não foi publicada e, portanto, reportamos aqui uma revisão de sua estrutura.

Este vetor foi especificamente designado para troca alélica em espécie Bordetella. Ele contém um sítio de clonagem multiligante onde o gene de interesse e suas sequências de flanqueamento no cromossomo podem ser inseridas, diversos genes de resistência a antibióticos, incluindo ampicilina, usados para selecionar o vetor e seus derivados em E. coli. À origem da replicação é derivada de pBR322, que implica que o vetor pode replicar em E. coli, mas é suicida em B. Pertussis. Existe também um gene de estreptomicina fosfotransferase derivado de Tn5: este gene confere resistência a estreptomicina a B. Pertussisó, mas não a E. coli [33]. Transferência conjugativa entre um doador de E. coli e um recipiente de B. Pertussis pode acontecer devido à presença de uma origem de transferência derivada de plasmídeo RP4. Este exige o uso de SMIO de £. coli como cepa doadora, fornecendo em trans as funções conjugativas necessárias derivadas de RP4

[22]. Conjugação acontece meramente riscando juntos o recipiente de B. Pertussis e o doador de E. coli em placas de ágar que suportam o crescimento das duas bactérias. Como o vetor é suicida em B. Pertussis, estreptomicina seleciona para células de B. Pertussis que integraram o vetor total e seu marcador Strº por recombinação homóloga em uma das regiões que flanqueiam o gene de interesse, e ao mesmo tempo elimina o doador de E. coli. Para resolver isto, cointegrar e eliminar a maioria dos vetores, salvo o gene de interesse, pSS4245 incorpora o gene I-Scel meganuclease junto com o sítio de clivagem correspondente (Figura 1) [34]. A nuclease é colocada sob o controle do promotor de operon ptx-ptl. Não existe nenhum sítio de clivagem correspondente no cromossomo de B. Pertussis. Seleção de cointegração tem de ser conduzida em condições de modulação, onde todos os fatores de virulência de B. Pertussis incluindo PT são reprimidos. Esta condição foi obtida adicionando 20 mM de ácido nicotínico nas placas de ágar do MSS usadas no processo de casamento. Transferência da mistura exconjugantes para ágar do MSS sem ácido nicotínico adicionado alivia a repressão do promotor de ptx e, consequentemente, a nuclease I-Scel é então expressa. Isto causa uma quebra de fita dupla no cromossomo bacteriano no nível do sítio de nuclease no vetor integrado. Isto ainda é letal se não reparado. Dano de DNA também ativa a resposta a SOS para reparo: a frequência de recombinação é aumentada por 2-3 log e a lesão é eventualmente eliminada por uma segunda recombinação homóloga [34]. Em qualquer caso a maioria dos vetores tem perda. Se a segunda recombinação acontecer na mesma região de flanqueamento, a cepa original é regenerada, se acontecer na outra região de flanqueamento, a cepa desejada é obtida. Algumas colônias precisam ser classificadas quanto a seu estado de resistência a cloranfenicol como com regiões de flanqueamento que têm quase o mesmo tamanho, os dois tipos de cepas resultantes, a saber, precursora e recombinante, são quase igualmente distribuídas.

[00063] Plasmídeo pSK5Cm3 foi digerido com Sacl e Bglll e o fragmento recuperado ligado no pSS4245 cortado com SaclI e BamHI. Depois da transformação no SMI1O de £. coli o plasmídeo resultante foi designado pSS5Cm3. Culturas frescas de cepa de Tohama B. Pertussis (4 dias em ágar do MSS com ácido nicotínico 20 mM) e de SM10 de E. coli hospedando o vetor (por toda a noite em ágar do LB com ampícilina, canamicina e cloranfenicol) foram raspadas e misturadas em placas de ágar contendo LB:MSS (1:1) com ácido nicotínico 20 mM e MgCl; 10 mM. Depois de 3 horas a 35ºC, a mistura foi esfregada no MSS com ácido nicotínico 20 mM, 50 ug/mL de estreptomicina e 5 ug/mL de cloranfenicol. O crescimento do esfregaço foi riscado no ágar do MSS com 5 ug/mL de cloranfenicol para o segundo evento de recombinação. As únicas colônias resultantes foram testadas por plaqueamento de réplica e um algumas colônias com o fenótipo de Smº e Cm? foram retidas para teste adicional (Figura 3A). As colônias foram confirmadas como B. Pertussis por amplificação de PCR com iniciadores específicos de B. Pertussis. À integração do gene Cm? na posição designada foi confirmada por PCR com os iniciadores que ligam especificamente nas regiões de flanqueamento 5º à montante (iniciadores 5'F- int e SRCM-int) e 3º (iniciadores 3FCM-int e 3'R-int) à jusante e internamente no gene Cm*?. A partir da análise de PCR, confirmou-se que as regiões de flanqueamento 5' e 3' estavam presentes e que o gene Cm? foram inseridos na posição esperada no lugar do gene S/. Essa verificação também confirmou que o processo de troca alélica não causou nenhuma alteração nas regiões de flanqueamento S! onde a recombinação ocorreu. Construção de um gene S1 modificado

[00064] O gene SI foi clonado por amplificação de PCR e mutado por mutagênese de PCR direcionada ao sítio. Os iniciadores SIF-PT-KpnI e SIR- PT-Xbal foram usados para amplificar o gene do DNA cromossômico. O produto de PCR purificado foi digerido com Xbal e KpnlI e o fragmento de 908 bp recuperado foi ligado no pSK53 cortado com as mesmas enzimas. Depois da transformação e seleção de colônia, o plasmídeo resultante foi designado pSK5S13.

[00065] Mutagênese de PCR direcionada ao sítio usou os iniciadores F- R9K e R-R9K internos com a sequência mal pareada CGCSAAG, causando a substituição de R9K. Esses iniciadores foram usados em ciclos de reação separados. Os produtos de amplificação foram então combinados e a amplificação foi continuou por 4-5 ciclos depois do anelamento. Os iniciadores externos foram então adicionados na reação para gerar todo o fragmento de S/ contendo a mutação desejada. O mesmo procedimento foi aplicado para gerar a segunda mutação usando os iniciadores F-E129G e R- E129G internos mal pareados, para gerar a sequência GAA>GGG, causando a substituição de E129G.

[00066] O fragmento resultante foi digerido com Xbal e Kpnl e inserido no pSK53 cortado com as mesmas enzimas para obter plasmídeo PSK5573-9K-129G (Figura 2B). Isto foi digerido com SacIl e Bgllh e o fragmento recuperado ligado no pSS4245 cortado com SaclI e BamHI. Depois da transformação no SMIO de E. coli, o plasmídeo resultante foi designado pSS5S13-9K-129G.

[00067] Troca alélica para inserir o gene SI modificado de volta para sua posição original no cromossomo de B. Pertussis foi realizada como anteriormente, mas, sem seleção dos exconjugantes por cloranfenicol. As cepas desejadas neste caso perderam este marcador e, portanto, classificação por plaqueamento de réplica foi necessária para identificar colônias com o fenótipo de Cmº e Sm desejado. O derivado de Tohama resultante foi designado Bp-WWC (Figura 3B). A integração do gene S! mutado na posição designada foi confirmada por PCR com os iniciadores específicos. Os iniciadores poderiam ligar nas regiões de flanqueamento 5º à montante (iniciadores 5'F-int e R-R9K) e 3º à jusante (F-E129G e iniciadores 3'R-int) e dentro do gene S/. Inserção de um segundo conjunto dos 5 genes estruturais de PT

[00068] As sequências flanqueamento o sítio de inserção alvejado (Figura 4A) foram primeiro clonados para obter pPSKPD5SCm3. O fragmento de 1688 bp à montante foi amplificado com os iniciadores 5ºF-PD-Apai e R-PD-MCS digerido com Apai e KpnI e ligado no pPSK5SCm3 cortado com as mesmas enzimas para produzir pPSKPD5'-Cm. O fragmento 2980 bp à jusante foi amplificado com os iniciadores 3'F-PD-MCS e 3'R-PD-Bglll digerido com Xbal e BgIII e ligado no pPSKPD5'-Cm cortado com as mesmas enzimas. O plasmídeo resultante foi designado pPSKPD5Cm;3 (Figura 4B).

[00069] O construto conjugativo foi obtido digerindo este plasmídeo com Notl e Bglll e ligação no pSS4245 digerido com Notl e BamHI. O plasmídeo resultante foi designado pSSPD53-Cm. Transferência conjugativa e seleção para Smº e Cm? forneceu o Bp-PD53-Cm derivado B. Pertussis desejado, onde a presença do inserto de Cm? à montante e à jusante intacto foi confirmada por amplificação de PCR. Os iniciadores poderiam ligar as regiões de flanqueamento 5º à montante (iniciadores 5'FPD-int e S'RCM-int) e 3 à jusante (3"FCM-int e 3'RPD-int iniciadores) e dentro do gene Cm*.

[00070] Uma cópia do operon ptx funcional com seu promotor foi gerada por inserção do terminador de ptx-ptl próximo do gene 53. Os cinco genes estruturais de PT (SI, S2, S4, S5, S3 modificados) com seu promotor de operon foram amplificados a partir do DNA de Bp-WWC usando os iniciadores PtxF-BamHTI e PtxR-MCS. O produto de 3469 bp amplificado foi digerido com BamHTI e Spel e o fragmento recuperado ligado no pSKARI cortado com as mesmas enzimas para produzir pSKptx. pSKARI é uma variante de pBluescript II SK+ onde o sítio EcoRI foi removido por digestão e enchimento com a enzima Klenow e recircularização.

[00071] O terminador de operon ptx-ptl foi então amplificado com os iniciadores TerF-EcoRI e TerR-Spel. O produto de 223 bp foi duplamente digerido com EcoRI e Spel e ligado no pSKptx cortado com as mesmas enzimas. Depois da transformação e seleção da colônia, o plasmídeo resultante foi designado pSKptxter (Figura 4C). Este plasmídeo foi então duplamente digerido com BamHI e Spel e ligado no pSSPD5Cm3 cortado com as mesmas enzimas para produzir o vetor pSSPDptxter conjugativo. Troca alélica no Bp-PD53Cm foi realizada da maneira descrita anteriormente, com classificação de réplica para colônias de Sm; e Cm para obter a cepa designada Bp-WWD. A integração do gene SI mutado na posição designada foi confirmada por PCR com iniciadores específicos. Os iniciadores poderiam ligar nas regiões de flanqueamento 5º à montante (iniciadores 5'FPD-int e R- R9K) e 3º à jusante (iniciadores F-E129G e 3'RPD-int) e dentro do gene S!/. Inserção de uma segunda cópia do gene estrutural PRN Integração de um gene de resistência a cloranfenicol no sítio alvo selecionado para integrar uma segunda cópia de o gene estrutural PRN.

[00072] Um derivado de pBluescript SK+ que não tem o sítio BamHI foi construído por digestão com a enzima, enchimento com a enzima Klenow e ligação. O plasmídeo resultante foi transformado no E. coli e designada pSKAHI.

[00073] A sequência da cepa de Tohama B. Pertussis foi varrida e pseudogenes foram identificados. A sequência de DNA entre um pseudogene de glutationa S-transferase putativo e um pseudogene de aspartato racemase putativo foi selecionada como o sítio de inserção (posn. 1,344,710-1,345,685 e 1,345,693-1,346049). Esses genes carregam mutações de deslocamento do quadro e não são funcionais (Figura 6A).

[00074] A região 5º à montante do sítio de inserção alvejado foi amplificada usando iniciadores carregando Spel (SF-PD2-Spel) e um multiligante incluindo sítios de restrição BamHI e Notl (S'R-PD2-MCS). O produto amplificado foi isolado por eletroforese em gel e duplamente digerido com Spel e Notl. O fragmento resultante foi ligado em um fragmento de PSKAHI1 digerido com as mesmas enzimas. O plasmídeo resultante foi transformado no E. coli e designado pPSKPD25. O fragmento 3º à jusante foi similarmente amplificado com iniciadores carregando sítios de restrição Xbal (3'F-PD2-Xbal) e Notl (3 R-PD2-Notl). Depois da digestão com as mesmas enzimas, o fragmento resultante foi ligado em um fragmento de pSKPD25 digerido com as mesmas enzimas. O plasmídeo resultante foi transformado em E. coli e designado pSKPD253.

[00075] O sítio de resistência a cloranfenicol foi obtido por amplificação de PCR a partir do plasmídeo pACYCI184 usando iniciadores carregando um sítio de restrição BamHI (CMF-BamHT) e Xbal (Cm?º-Xbal). O produto de PCR foi digerido com as duas enzimas e clonado no pSKPD253 cortado com as mesmas enzimas. Depois da ligação, o plasmídeo resultante foi transformado em E. coli, verificado por análise de restrição e designado PpSKPD25Cm3.

[00076] Depois de verificação por mapeamento de restrição, o plasmídeo foi digerido com Notl e Spel e o fragmento resultante ligado no pSS4245 duplamente digerido com as mesmas enzimas. O plasmídeo resultante foi designado pPSSP2D5Cm3 e transformado em SM10 de E. coli.

[00077] Conjugação foi conduzida como anteriormente, usando Bp- WWD como o cepa recipiente de B. Pertussis, com seleção de únicas colônias de Cm? e Smº. A integração do gene Cm? na posição designada foi confirmada por PCR com os iniciadores que especificamente ligam somente nas regiões de flanqueamento 5º à montante (iniciadores S'FPD2-int e S'RCM-int) e 3º à jusante (iniciadores 3'FCM-int e 3'RPD2-int) e dentro do gene Cm?. Integração de gene prn sob controle do promotor de fha

[00078] O gene estrutural de PRN foi amplificado a partir de DNA de B. Pertussis usando um iniciador de partida no códon de partida ATG (F) e um iniciador carregando um sítio de restrição Xbal (R). O produto de 2808 bp amplificado contendo somente a região codificante e o terminador foi tratado por um protocolo de cauda “A (Promega). O fragmento resultante foi clonado no vetor pGEM-T easy. O plasmídeo resultante designado pGEM-TPRN foi verificado por análise de restrição. Em um desenvolvimento inicial para criar uma segunda cópia do gene PRN acionado pelo promotor de FHA mais forte, o promotor de FHA foi isolado do DNA de B. Pertussis por amplificação de PCR e inserido antes do gene PRN. O promotor de FHA foi amplificado por iniciadores carregando o BamHI (FHAproF-BamHI) e um poliligante contendo Ndel-Xbal (FHAR-MCS). O produto purificado foi cortado com BamHI e Xbal então o fragmento de DNA recuperado foi ligado no PSKPD253, também cortado com as mesmas enzimas. O plasmídeo resultante designado pSKPD253Fp foi verificado por análise de restrição. Este plasmídeo foi cortado com Ndel e Xbal então ligado com o produto de PCR do gene prn que foi amplificado a partir de iniciadores pGEMTPRN por PRNF-Ndel e PRNR-Xbal e cortado com as mesmas enzimas. O plasmídeo resultante foi designado pSKPD25FpPRN3 (Figura 6B). O construto conjugativo foi obtido digerindo este plasmídeo com Notl e Spel e ligação no pSS4245 digerido com as mesmas enzimas. O plasmídeo resultante foi designado pSSPD2FpPRN. Este construto foi inserido na posição selecionada do cromossomo de Bp-WWD para substituir o marcador de resistência a cloranfenicol introduzido usando o procedimento usual de troca alélicas e classificação, da maneira descrita anteriormente. Expressão de gene prn sob controle do promotor de prn

[00079] O promotor de PRN foi clonado por amplificação de PCR a partir do DNA de B. Pertussis usando iniciadores com os sítios de restrição BamHI (PrnProF-BamHI) e Ndel (PRNProR-Ndel). O plasmídeo PSKPD25FpPRN3 foi cortado com BamHI e Ndel para gerar um fragmento que teve perda do promotor de FHA. O promotor de PRN foi ligado em seu lugar. Depois da transformação em E. coli e verificação por análise de restrição, o plasmídeo resultante foi designado pSKPD25PRN3 (Figura 6C). O plasmídeo foi cortado com Notl e inserido no pSS4245 cortado com a mesma enzima. O construto resultante, pPSSPD2prn foi transferido para SM10 de E. coli para conduzir a troca alélica. A cepa resultante de B. Pertussis foi designada Bp-WWE. O integração de gene prn na posição designada foi confirmada por PCR com os iniciadores que ligam especificamente somente nas regiões de flanqueamento 5' à montante (iniciadores)S'FPD2-int e PRNProR-Ndel e 3º à jusante (iniciadores PRNF-int e 3'RPD2-int) e dentro do gene prn. Expressão de PT, FHA e de PRN em cultura de frasco agitador.

[00080] O Bp-WWC, Bp-WWD e Bp-WWE foram crescidas em frascos de agitação com 100 mL de meio MSS suplementado com B- ciclodextrina metilada a 35ºC, 200 rpm. Depois de 32-48 horas de crescimento, os sobrenadantes de cultura foram coletados e ensaiados por ELISA para quantificar o nível de expressão de PT e FHA. Expressão de PRN foi determinada por análise densitométrica western blot para avaliar também a integridade do antígeno. Este ensaio foi conduzido tanto no sobrenadante clarificado da cultura quanto no extrato celular obtido por aquecimento a 60ºC em tampão isotônico. Ensaio ELISA para PT e FHA

[00081] Anticorpo policlonal coelho purificado contra PT ou FHA (1:1000, NLAC, Tailândia) foi revestido em placas de 96 poços (NUNC Maxisorp) com 100 uL por poço em tampão de carbonato/bicarbonato (pH 9,6) e incubado por toda a noite a 4ºC. Depois de lavar 3 vezes com salina tamponada com fosfato, pH 7,4 com Tween 20 0,1% (PBST), bloqueio foi realizado com 100 uL por poço de PBST incluindo 3 % de albumina de soro bovino (BSA) então incubado a 37ºC por 1 hora. Depois de descartar o tampão de bloqueio e lavagem, diluições de PT, FHA padrões ou amostras foram carregadas e incubadas a 37ºC por 1 hora. Depois de lavar 3 vezes com PBST, 100 uL de anticorpo monoclonal camundongo da subunidade S2 anti- PT (1:30,000, Abcam, USA)) ou anticorpo monoclonal camundongo anti- FHA (1:10,000, NIBSC, UK) em tampão de bloqueio foram adicionados e incubados nas mesmas condições. Depois de lavar o poço 3 vezes com PBST, 100 uL de diluição 1:10.000 em tampão de bloqueio de coelho anti- camundongo (H + L) conjugado IZG-HRP (Abcam, USA) foi usado como anticorpo secundário e incubado novamente por 37ºC por 1 hora. Depois de lavar com PST, 100 uL de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (KPL, USA) foram adicionados como o substrato da enzima. A reação de cor foi terminada com 100 uL de HCI IN por poço. Densidade ótica foi medida a 450 nm usando uma leitora de placa microtituladora. Ensaio Western blot para PRN

[00082] Diluições de PRN padrão e amostras foram resolvidas em um gel SDS-PAGE 10 % então transferidas para uma membrana de PVDF usando um sistema blotting semisseco. A membrana foi bloqueada com leite desnatado 5 % em PBST por 1 hora. Depois de descartar esta solução de bloqueio, a membrana foi incubada com 20 mL de soro cabra anti-PRN (1:10.000, NIBSC, UK) em tampão de bloqueio por 1 hora, então lavada 3 vezes com PBST. A membrana foi então incubada nas mesmas condições com 20 mL de conjugado IZG-HRP coelho anti-cabra (Santa Cruz Biotecnologia, USA) e lavada novamente. As membranas foram então imersas em 3,3'-diaminobenzamidina até revelar a cor marrom. A reação foi terminada rinsando 2-3 vezes com água deionizada, então deixada secar à temperatura ambiente. A membrana foi varrida e convertida em um arquivo de imagem. Concentrações de PRN foram derivadas por análise densitométrica da amostra e bandas de referência usando software dedicado. Estabilidade genética

[00083] As cepas foram cultivadas em 100 mL de meio MSS a 35ºC e 200 rpm por 48 horas, então 0,1 mL de cultura foi transferido em 100 mL de MSS e incubado na mesma condição e esta etapa foi repetida 4 vezes mais. Cada transferência corresponde a 10 gerações. A cultura foi diluída e plaqueada em ágar do MSS. Trinta colônias isoladas foram aleatoriamente selecionadas. Nas trinta colônias selecionadas duas foram analisadas por PCR para detectar a presença esperada dos insertos de PT e PRN. Ensaio de agrupamento de célula CHO

[00084] Atividade de célula agrupamento ovário hamster chinês (CHO) foi determinada pelo método de Hewlett et al. [28] Resumidamente, células CHO foram cultivadas em o meio cRPMI 1640 suplementado com 10 % de soro bovino fetal. As células foram incubadas a 37ºC sob atmosfera de CO, 5 %. As células cultivadas foram tripsinizadas e ajustadas a 2 x 10º células/mL com meio cRPMI 1640 pra distribuir um porção de 200 uL cada qual em poços de uma placa de microcultura de 96 poços. Amostras de teste e toxina PT de referência foram diluídas serialmente em intervalos dez vezes em salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 e um volume de 25 uL das diluições foi adicionado nos poços. Depois da incubação por 48 horas nas mesmas condições para permitir agrupamento máximo, as células foram manchadas com violeta cristalina e fotografadas. Referências

1. Mattoo S, Cherry JD: Clin Microbiol Rev 2005, 18:326-382.

2. Aristegui J, Usonis V, Coovadia H, Riedemann S, Win KM, Gatchalian S, Bock HL: Facilitating the WHO expanded program of immunization: the clinical profile of a combined diphtheria, tetanus, pertussis, hepatitis B and Haemophilus influenzae type b vaccine. Int J Infect Dis 2003, 7:143-151.

3. Miller DL, Ross EM, Alderslade R, Bellman MH, Rawson NS: Pertussis immunisation and serious acute neurological illness in children. Br Med J (Clin Res Ed) 1981, 282:1595-1599.

4. Stuart-Harris C: Benefits and risks of immunization against pertussis. Dev Biol Stand 1979, 43:75-83.

5. Sato Y, Sato H: Development of acellular pertussis vaccines. Biologicals 1999, 27:61-69.

6. Brown B, Greco D, Mastrantonio P, Salmaso S, Wassilak S: Pertussis vaccine trials. Trial synopses. Dev Biol Stand 1997, 89:37-47.

7. Monack D, Munoz JJ, Peacock MG, Black WJ, Falkow S: Expression of pertussis toxin correlates with pathogenesis in Bordetella species. J Infect Dis 1989, 159:205-210.

8. Weiss AA, Hewlett EL: Virulence factors of Bordetella pertussis. Ann Rev Microbiol 1986, 40:661-686.

9, Munoz JJ, Arai H, Cole RL: Mouse-protecting and histamine- sensitizing — activities of pertussiszen and fimbrial hemagglutinin from Bordetella pertussis. Infect Immun 1981, 32:243-250.

10. Loosmore SM, Zealey GR, Boux HA, Cockle SA, Radika K,

Fahim RE, Zobrist GJ, Yacoob RK, Chong PC, Yao FL, et al.: Engineering of genetically detoxified pertussis toxin analogs for development of a recombinant whooping cough vaccine. Infect Immun 1990, 58:3653-3662.

11. Nencioni L, Pizza M, Bugnoli M, De Magistris T, Di Tommaso A, Giovannoni F, Manetti R, Marsili 1, Matteucci G, Nucci D, et al.: Characterization of genetically inactivated pertussis toxin mutants: candidates for a new vaccine against whooping cough. Infect Immun 1990, 58:1308-1315.

12. Pizza M, Covacci A, Bartoloni A, Perugini M, Nencioni L, De Magistris MT, Villa L, Nucci D, Manetti R, Bugnoli M, et al.: Mutants of pertussis toxin suitable for vaccine development. Science 1989, 246:497-500.

13. Greco D, Salmaso S, Mastrantonio P, Giuliano M, Tozzi AE, Anemona A, Ciofi degli Atti ML, Giammanco A, Panei P, Blackwelder WC, et al: A controlled trial of two acellular vaccines and one whole-cell vaccine against pertussis. Progetto Pertosse Working Group. N Engl J Med 1996, 334:341-348.

14. Makoff AJ, Oxer MD, Ballantine SP, Fairweather NF, Charles IG: Protective surface antigen P69 of Bordetella pertussis: its characterization and very high level expression in Escherichia coli. Biotechnology (N Y) 1990, 8:1030-1033.

15. Romanos MA, Clare JJ, Beesley KM, Rayment FB, Ballantine SP, Makoff AJ, Dougan G, Fairweather NF, Charles IG: Recombinant Bordetella pertussis pertactin (P69) from the yeast Pichia pastoris: high-level production and immunological properties. Vaccine 1991,9:901-906.

16. Nicosia A, Bartoloni A, Perugini M, Rappuoli R: Expression and immunological properties of the five subunits of pertussis toxin. Inf Immu. 1987, 55:963-967.

17. Kotob SI, Hausman SZ, Burns DL: Localization of the promoter of the ptl genes of Bordetella pertussis, which encode proteins essential for secretion of pertussis toxin. Infect Immun 1995, 63:3227-3230.

18. Clare JJ, Rayment FB, Ballantine SP, Sreekrishna K, Romanos MA: High-level expression of tetanus toxin fragment C in Pichia — pastoris strains containing multiple tandem integrations of the gene. Biotechnology (N Y) 1991,9:455-460.

19. Rappuoli R: Isolation and characterization of Corynebacterium diphtheriae nontandem double lysogens hyperproducing CRMI197. Appl Environ Microbiol 1983, 46:560-564.

20. Zealey GR, Loosmore SM, Yacoob RK, Cockle SA, Herbert AB, Miller LD, Mackay NJ, Klein MH: Construction of Bordetella pertussis strains that overproduce genetically inactivated pertussis toxin. Appl Environ Microbiol 1992, 58:208-214.

21. Loosmore SM, Yaacoob RK, Zealey GR, Jackson GED, Yang Y- P, Chong PS-C, Shortreed JM, Coleman DC, Cunningham JD, Gisonni L, Klein MH: Hybrid genes over-express pertactin from Bordetella pertussis. Vaccine 1995, 13:571-580.

22. Stibitz S: Use of conditionally counterselectable suicide vectors for allelic exchange. Methods Enzymol 1994, 235:458-

465.

23. Imaizumi A, Suzuki Y, Ono S, Sato H, Sato Y: Heptakis(2,6-O- dimethyI)b-cyclodetrin: a novel growth stimulant for Bordetella pertussis phase LI. J. Clin. Microbiol. 1983, 17:781-

786.

24. Imaizumi A, Suzuki Y, Ono S, Sato H, Sato Y: Effects of heptakis(2,6-O-dimethyl)b-cyclodextrin on the production of pertussis toxin by Bordetella pertussis. Inf. Immun. 1983, 41:1138-1143.

25. Capiau C, Carr SA, Hemling ME, Pl ainchamp D, Conrath K, Hauser P, Simoen E, Comberbach M, Roelants P, Desmons P, Permanne P, Petre JO: Purification, characterization, and immunological evaluation of the 69-kDa outer membrane protein of Bordetella pertussis. In:Proceedings of the sixth international symposium on pertussis, Manclark CR (ed., 1990. DHHS publication Nº (FDA) 90-1164, pp7586.

26. Ozcengiz E, Kilinc K, Buyuktanir O, Gunalp A: Rapid purification of pertussis toxin (PT) and filamentous hemagglutinin (FHA) by cation-exchange chromatography. Vaccine 2004, 22:1570-1575.

27. Chong P, Jackson G, Cwyk W, Klein M: Simultaneous determination of Bordetella pertussis toxin and filamentous haemagglutinin concentrations by hydroxyapatite high- performance liquid chromatography. J Chromatogr 1990, 512:227-236.

28. Capiau C, Desmons P: Method for isolating and purifying Bordetella pertussis antigenic factors. US pat. 5,391,715.

29. Hewlett EL, Sauer KT, Myers GA, Cowell JL, Guerrant RL: Induction of a novel morphological response in Chinese hamster ovary cells by pertussis toxin. Infect Immun 1983, 40:1198-1203.

30. Sauer B: Functional expression of the cre-lox site-specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 1987,7:2087-2096.

31. Charles 1, Fairweather N, Pickard D, Beesley J, Anderson R, Dougan G, Roberts M: Expression of the Bordetella pertussis P.69 pertactin adhesin in Escherichia coli: fate of the carboxy-terminal domain. Microbiology 1994, 140 ( Pt 12):3301-3308.

32. Frohlich BT, De Bernardez Cmark ER, Siber GR, Swartz RW: Improved pertussis toxin production by Bordetella pertussis through adjusting the growth medium's ionic composition. J Biotechnol 1995, 39:205-219.

33. O'Neill EA, Kiely GM, Bender RA: Transposon Tn5 encodes streptomycin resistance in nonenteric bacteria. J Bacteriol 1984, 159:388-389.

34. Posfai G, Kolisnychenko V, Bereczki Z, Blattner FR: Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome. Nucleic Acids Res 1999, 27:4409-4415.

35. Nicosia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 4631 [1986].

36. Loosmore et al., Nucl. Acids Res. 17, 8365 [1989].

37. Relman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2637 [1989].

38. Charles et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3554 [1989].

39. Glaser et al., Molec. Microbiol. 2, 19 [1988].

40. “Leeetal. 1989, Infect. Immun. 57: 1413-1418.

41. Inatsuka CS, et al., Pertactin is required for Bordetella to resist neutrophil-mediated — clearance — Infect. — Immun. 2010, doi:10.1128/IAI.00188-10.

42. Parkhill et al., Comparative analysis of the genome sequences of Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica. Nature Genetics (2003) 35 32-40.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1. Cepa de Bordetella Pertussis geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que o gene SI da Toxina Pertussis apresenta as mutações Arg9—Lys9 e Glu129—Gly129, não inclui um gene de resistência a antibiótico integrado e é capaz de expressar Toxina Pertussis destoxificada (PT).

2. Cepa modificada de acordo com a reivindicação |, caracterizada pelo fato de que o vetor pSS4245 foi usado para introduzir as mutações em S/ sem integração de um gene de resistência a antibiótico.

3. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma cepa Tohama.

4. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que foi adicionalmente modificada por: (a) integração de pelo menos uma cópia do operon ptx em uma região não funcional do cromossomo da cepa modificada, em que o operon ptx integrado compreende um conjunto de genes S2 - S5 e um gene S1 que foi modificado para incluir as mutações Arg9—Lys9 e Glu129—Gly129, a cepa modificada tendo, assim, pelo menos dois operons ptx que são posicionados à parte no cromossomo e sendo capaz de expressar maiores níveis de Toxina Pertussis destoxificada em relação a uma cepa com somente um operon ptx; e/ou (b) integração de pelo menos uma cópia de um gene prn que codifica Pertactina em uma região não funcional do cromossomo da cepa modificada, a cepa modificada tendo, assim, pelo menos dois genes prn que são posicionados à parte no cromossomo e sendo capaz de expressar maiores níveis de Pertactina em relação a uma cepa com somente um gene prn; em que a cepa modificada não inclui qualquer gene de resistência a antibiótico integrado.

5. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 4,

caracterizada pelo fato de que o vetor pSS4245 foi usado para introduzir a cópia do operon ptx e/ou do gene prn sem integração de um gene de resistência a antibiótico.

6. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a cópia do operon ptx e/ou do gene prn é integrada em ou entre pseudogenes não funcionais.

7. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende mais de uma cópia inserida do operon ptx modificado e/ou mais de uma cópia inserida do gene prn.

8. Cepa modificada de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos dois operons ptx modificados e/ou pelo menos dois genes prn.

9. Método para produzir uma cepa de Bordetella Pertussis modificada como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende a etapa de introduzir mutações Arg9—Lys9 e Glu129—Gly129 no gene S! de uma cepa de B. pertussis, resultando, assim, na produção de uma cepa modificada que é capaz de expressar Toxina Pertussis destoxificada (rPT) e que não inclui qualquer gene de resistência a antibiótico.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o vetor pSS4245 é usado para introduzir as mutações em S! sem integração de um gene de resistência a antibiótico.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a cepa de B. pertussis é uma cepa Tohama.

12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de: (a) integrar pelo menos uma cópia do operon ptx em uma região não funcional do cromossomo da cepa modificada, em que o operon ptx integrado compreende um conjunto de genes S2 - S5 e um gene S!1 que foi modificado para incluir as mutações Arg9—>Lys9 e Glul29—Gly129, produzindo, assim, uma cepa modificada que tem pelo menos dois operons ptx que são posicionados à parte no cromossomo e sendo capaz de expressar maiores níveis de Toxina Pertussis destoxificada em relação a uma cepa com somente um operon ptx; e/ou (b) integrar pelo menos uma cópia de um gene prn que codifica Pertactina em uma região não funcional do cromossomo da cepa modificada, produzindo, assim, uma cepa modificada que tem pelo menos dois genes prn que são posicionados à parte no cromossomo e sendo capaz de expressar maiores níveis de Pertactina em relação a uma cepa com somente um gene prn; em que o operon ptx e/ou o gene prn é integrado sem integração de qualquer gene de resistência a antibiótico.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o vetor pSS4245 é usado para introduzir a cópia do operon ptx e/ou do gene prn sem integração de um gene de resistência a antibiótico.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o operon ptx e/ou do gene prn são integrados em ou entre pseudogenes não funcionais.

15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que uma cópia do operon ptx modificado e uma cópia do gene prn são inseridas no cromossomo da cepa.

16. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que mais de uma cópia do operon ptx modificado é inserida no cromossomo da cepa e/ou mais de uma cópia do gene prn é inserida no cromossomo da cepa.

17. Método para produzir antígenos de Bordetella Pertussis, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (1) cultivar a cepa de B. Pertussis geneticamente modificada como definida na reivindicação 1 em um meio de cultura para efetuar expressão dos antígenos, em que os antígenos incluem Toxina Pertussis destoxificada (rPT), Pertactina e Hemaglutinina Filamentosa (FHA) codificada por genes presentes na cepa; e (11) recuperar os antígenos a partir do meio de cultura ou de um extrato celular.