JP4732348B2 - 非抗生物質耐性選択マーカー含有選択システム - Google Patents
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Description
本発明は、araD遺伝子、araD遺伝子の変異型、それらの相補配列、またはそれらの触媒作用活性断片の選択マーカーとしての使用、及び、araD遺伝子欠損細菌株の使用に基づく新規選択システムに関する。本発明はさらに、araD遺伝子、araD遺伝子の変異型、それらの相補配列、またはそれらの触媒作用活性断片を含む新規ベクター、及び、araD遺伝子欠損新規細菌株に関する。本発明はそのうえ、関心対象の遺伝子を含むプラスミドで形質転換された細胞を選択する方法に関する。
細胞培養で増殖させた細菌、及び他の細胞における、効果的な遺伝子操作のための必須要件は、特定の遺伝子型改変を受けた細胞を選択する能力である。組み換えDNA技術における最も一般的な選択手法は、クローニング用のベクターまたはプラスミドに選択マーカーを含めることである。選択マーカーは、それを含まないものから、選択マーカーを含む宿主細胞を分離することを可能にする、クローン化された遺伝子またはDNA配列であり得る。選択マーカーは、適当な選択培地により、クローニングベクターを細胞中に維持する。さもなければ、プラスミドの複製は細菌宿主にとってエネルギー負荷となるため、プラスミドを失った細菌は、プラスミドを持つ細胞に対して生育培地中、有利な生長を示すであろう。
本発明の目的は、組換え治療用製品の製造において、これまでに開示されている選択システムを使用する際の問題点を回避した、抗生物質を含まない新規選択システムを提供することである。
本発明は、インビボ投与される組換え治療用製品の製造、特にDNAワクチンの製造に使用することができる、抗生物質を含まない代替選択システムを見出すという努力に基づいている。驚くことに、原核生物、及びヒトを含む哺乳動物等の真核生物の両方のペントースリン酸経路に関係する araD遺伝子をプラスミドの選択マーカーとして、栄養要求性の宿主細胞において成功裏に使用できることが見出された。栄養要求性の利用は、後にプラスミド調製物を汚染し得るような有毒物質の使用、または生成を含まないという利点を有する。
(a)異種プロモーターに操作可能に連結され、(i)特異的DNA配列に結合するDNA結合ドメインと(ii)核成分に結合する機能ドメインとを含む核アンカリングタンパク質またはその機能的均等物をコードするDNA配列、及び
(b)核アンカリングタンパク質のための結合部位を形成するマルチマー化されたDNA配列
を含む発現ベクターであり、該ベクターはパピロマーウイルスの複製起点を欠き、かつ
(c)araD遺伝子、変異araD遺伝子、それらの相補配列、またはそれらの触媒作用活性断片を含む発現ベクターである。
(a)ウシ乳頭腫ウイルス1型(BPV)のE2タンパク質、及び
(b) 頭-尾(head-to-tail)型構造として存在していてもよく、または間隔をあけた配置でベクターに含まれていてもよい、クラスターとしてベクターに包含されるBPV E2タンパク質の多重結合部位
を含む発現ベクターであり、該ベクターはパピロマーウイルスの複製起点を欠き、かつ
(c)araD遺伝子、その相補配列、またはその触媒作用活性断片を含む発現ベクターである。
araD選択プラスミドのクローニング
araD選択構築物をクローニングするため、プラスミドS6wtd1EGFP(図2)を用いた。これは、プラスミドの土台の機能性成分として、pMB1複製起点及びカナマイシン耐性マーカーを有する。このプラスミドのカナマイシン耐性は、大腸菌トランスポゾンTn903由来の遺伝子により付与されている。
s6araDL1:
S6araDR1:
S6araDL2:
S6araDR2:
M13F22:
M13R24:
並びにaraD特異的プライマー
araD F311:
araD F614:
araD R700:
araD R421:
を用いた配列決定により正確な配列であることを確認した。増幅された配列中の変異は、異なるクローンとの組換えにより修復された。
変異araD選択プラスミドのクローニング
変異araD選択構築物をクローニングするため、カナマイシン耐性[トランスポゾンTn5由来カナマイシン耐性マーカー(neo)遺伝子]を持つプラスミドp3hCG(図14)を、制限エンドヌクレアーゼBcuI及びHindIIIで切断し、Klenowフラグメント(Fermentas、リトアニア)を用いて末端を満たし、アガロースゲル電気泳動後、4647bpの大きさの断片をゲルから精製した。pMB1複製起点、及び、araD遺伝子コード配列の8位における、終結コドンをもたらすCからTへの変異を持つaraD配列を、プラスミドparaDMgB(図15)より制限エンドヌクレアーゼBcuI及びEco52Iにより切り出し、Klenowフラグメント(Fermentas、リトアニア)を用いて末端を満たし、DNAの5'-末端を子牛腸アルカリホスファターゼ(Calf Intestine Alkaline Phosphatase(CIAP);Fermentas、リトアニア)により脱リン酸化した。アガロースゲル電気泳動後、1532bpの大きさの断片をゲルから精製し、上記で得た4647bpの断片と連結した。araD欠損大腸菌AG1株を、この連結混合物で形質転換し、0.5%酵母エキス、2%L-アラビノース及び25μg/mlカナマイシンを含む選択M9培地を含む寒天培地上に植菌した。植菌から24時間後にコロニーを検査したところ、コロニーの大きさが均一であることが示された。細菌からプラスミドを抽出し、araD遺伝子座の配列決定をすることによりさらに特徴付けた。
アラビノース感受性ΔaraD大腸菌株の構築
DH5αT1、AG1及びJM109の三種の大腸菌株が、ΔaraD変異体を構築するのに使用された。大腸菌ゲノム中のaraD遺伝子は、Datsenko及びWanner[PNAS 97 (2000) 6640-6645]に記載の方法により破壊した。この方法では、ファージλRed組換えシステムを活用する。簡単にいうと、このシステムの手法では、ホモロジーエクステンションを持つプライマーを用いたPCRにより作られた選択可能な抗生物質耐性遺伝子によって、染色体配列を置換する。これは、これらの隣接するホモロジー部分のRed媒介組換えにより達成される。
RF1 100ml
RF2 100ml
ara(pr1)
ara(pr4)
大腸菌DH5αT1ΔaraD株、AG1ΔaraD株、及びJM109ΔaraD株の試験
挿入部位付近のaraD遺伝子上にアニーリング部位を含むaraVlisF
及びaraVlisR
のプライマーを用いたコロニーPCRにより、実施例2に記載のようにして電気穿孔法により得られたコロニーを、カナマイシン耐性遺伝子の有無について試験した。araDに挿入がない場合、大腸菌DH5αT1、AG1及びJM109からは272bpのPCR産物が期待され、araD遺伝子にPCR産物が挿入されている場合には、1545bpの産物が期待された。15個のコロニーのうち、DH5αT1ΔaraDについては3個、AG1ΔaraDについては9個、そしてJM109ΔaraDについては14個を調べ、それぞれが1545bpの産物を示した。そこで、これらの株がカナマイシン耐性遺伝子の挿入を含むと結論付けた。
及びaraVR
を用いて行った。これらのプライマーは、カナマイシン耐性遺伝子がaraD遺伝子に挿入されている場合、435bpの産物を生成する。AG1ΔaraD株及びJM109ΔaraD株については6個のコロニー、DH5αT1ΔaraD株については3個のコロニーを試験し、全てが正しい産物であった。
L-リブロース-5-リン酸4-エピメラーゼを潜在的にコードする遺伝子内において追加に変異を持つ大腸菌株の生成
大腸菌は、異なるオペロン上に、2つの追加のL-リブロース-5-リン酸4-エピメラーゼのコード配列を含む。L−アスコルビン酸分解経路のulaF遺伝子及びsgbE遺伝子は、エピメラーゼ活性を持つ遺伝子をコードする(Wen Shan Yew, Jhon A.Gerlt, J.Bacteiol. 184 (2002) 302-306)。選択の厳密性を増し、エピメラーゼ活性を持つ他の遺伝子による大腸菌株の起こりうる適応機構を避ける、または除くため、大腸菌ゲノム中のUlaF遺伝子及びSgbE遺伝子のコード配列を中断した。このような適応機構は、好適な条件下での長期に亘るプラスミド生産で起り得る。
ulaFvalisR
ulaFvalisF
sgbEalum
sgbEylem
sgbEvalisR
sgbEvalisF
両方の株から15個のコロニーが試験され、4個が正しい産物を産生していた。
表3から判るように、本発明の株では、アラビノース感受性に本質的な差異は無かった。同様に、ΔaraD株及びΔaraDΔulaFΔsgbE株のプラスミド収量を実施例3に記載されるようにして試験したところ(結果示さず)、大腸菌AG1ΔaraD株とAG1ΔaraDΔulaFΔsgbE株、またはDH5αT1ΔaraD株とDH5αT1ΔaraDΔulaFΔsgbE株で差異は見出されなかった。
S6wtd1EGFP/araD2の安定性
細菌細胞の増殖中の安定性は、ワクチン用ベクターの重要な特性である。細菌中におけるS6wtd1EGFP/araD2の安定性を試験するため、実施例3で調製した大腸菌AG1ΔaraD株及びJM109ΔaraD株に該プラスミドを形質転換し、ベクターが無傷であることを、4世代に亘ってプラスミドDNA分析により追跡した。
抗生物質選択システムの本発明のL-アラビノース選択システムとの比較
抗生物質選択システムの本発明のL-アラビノース選択システムとの比較では、次の生育培地を用いた。
培地1:M9培地+0.5%酵母エキス、0.2%グルコース、及び25μg/mlカナマイシン(選択培地);
培地2:M9培地+0.5%酵母エキス、及び0.2%グルコース(非選択培地);
培地3:M9培地+0.5%酵母エキス、0.2%L-アラビノース、及び25μg/mlカナマイシン(選択培地);並びに
培地4:M9培地+0.5%酵母エキス、及び0.2%L-アラビノース(非選択培地)。
培地5: M9培地+0.5%酵母エキス、0.2%L-アラビノース、及び25μg/mlカナマイシン(選択培地);並びに
培地6:M9培地+0.5%酵母エキス、0.2%グルコース、及び25μg/mlカナマイシン(非選択培地)。
AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2の流加発酵
プラスミド含有細菌の産生を目的として、araD遺伝子に基づく選択システムをさらに流加発酵でも試験した。AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2プレートから単一のコロニーを採取し、0.5%酵母エキス、0.2%L-アラビノース、及び25μg/mlのカナマイシンを含有する250ml M9培地に接種し、激しく震盪しながら37℃で一晩インキュベートした。18時間後、接種物のOD600は、6.4であった。5lの発酵開始培地(8g/l KH2PO4;10g/l NaCl;5g/l NH4Cl;5g/l酵母エキス;2g/l L-アラビノース;2g/l MgSO4; 25mg/lカナマイシン及び0.1g/lチアミン;NH4OHでpH6.7に)を入れた発酵器に、160mlの接種物を添加した。5.5時間の生育後、発酵供給培地(300g/l L-アラビノース;150g/l酵母エキス;50mg/lカナマイシン;0.2g/lチアミン)の自動的供給を、生育速度0.15h-1と仮説して(炭素源に限定された生育となる)開始した。供給速度は、式F(t)=myS*Sin/Sf(ここで、mySは所望の生長速度、Sinはその時点で添加される炭素源量、Sfは供給培地中の炭素源濃度である)に従い、コンピューターで制御された。OD600を測定することにより、生育を追跡し、プラスミドDNAのための試料を採取した。発酵の間に記録されたデータは、図11に示される。1lの供給培地が消費された時点で発酵を終了した。最終OD600は、45であった。遠心分離により細菌塊を回収し、2l STEバッファーで1回洗浄した。細菌生物量の収量は、湿重量で410gであった。プラスミドDNA算出量のデータは、表6に表される。
AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2の精製
AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2の精製を以下のように行った(図12)。
RNaseを用いない点を除いて、Qiagenのプラスミド精製ハンドブック(Qiagen's Plasmid Purification Handbook)に従って、清澄な溶解物を調製した。
プラスミドDNA精製を、幾つかの改変を採用したAmersham Pharmaciaの3工程スーパーコイルプラスミド精製プロセスにより行った。
Claims (18)
- 選択マーカーとしてaraD遺伝子と、関心対象の遺伝子とを保持するベクターが付加されているaraD遺伝子欠損大腸菌細胞を含み、該ベクターで形質転換された細胞を選択するための、抗生物質を含まない、選択システム。
- araD遺伝子がL-リブロース-5-リン酸4-エピメラーゼ遺伝子(EC 5.1.3.4)である、請求項1記載の選択システム。
- ベクターのaraD遺伝子が、L-リブロース-5-リン酸4-エピメラーゼの8位のグルタミンのコドンに替えて、8位における、終結コドンをもたらすCからTへの変異を持つ、請求項2記載の選択システム。
- 大腸菌が大腸菌株JM109である、請求項1〜3いずれか一項記載の選択システム。
- 大腸菌が大腸菌株DH5αT1である、請求項1〜3いずれか一項記載の選択システム。
- 大腸菌が大腸菌株AG1である、請求項1〜3いずれか一項記載の選択システム。
- 大腸菌株がaraD遺伝子及びulaF遺伝子を欠損している、請求項4〜6のいずれか一項記載の選択システム。
- 大腸菌株がaraD遺伝子及びsgbE遺伝子を欠損している、請求項4〜6のいずれか一項記載の選択システム。
- 大腸菌株がaraD遺伝子、ulaF遺伝子、及びsgbE遺伝子を欠損している、請求項4〜6のいずれか一項記載の選択システム。
- L-リブロース-5-リン酸4-エピメラーゼの8位のグルタミンのコドンに替えて、8位における、終結コドンをもたらすCからTへの変異を持つaraD遺伝子を選択マーカーとして含むベクター。
- (a)異種プロモーターに操作可能に連結され、(i)特異的DNA配列に結合するDNA結合ドメインと(ii)核成分に結合する機能ドメインとを含む核アンカリングタンパク質またはその機能的均等物をコードするDNA配列、及び
(b)核アンカリングタンパク質のための結合部位を形成するマルチマー化されたDNA配列
をさらに含む発現ベクターであり、パピロマーウイルスの複製起点を欠く、
請求項10記載のベクター。 - (a)異種プロモーターに操作可能に連結された、ウシ乳頭腫ウイルス1型(BPV)のE2タンパク質である核アンカリングタンパク質をコードするDNA配列、及び
(b)ベクターにクラスターとして導入されたBPV E2タンパク質の多重結合部位であるマルチマー化されたDNA配列であって、核アンカリングタンパク質のための結合部位を形成するDNA配列であり、該多重結合部位は頭-尾(head-to-tail)型構造として、または間隔をあけた配置でベクターに含まれていてもよい、DNA配列
をさらに含む発現ベクターであり、パピロマーウイルスの複製起点を欠く、
請求項10記載のベクター。 - マルチマー化されたDNA配列に欠失をさらに含む、請求項12記載のベクター。
- シャイン・ダルガルノ配列に変異をさらに含む、請求項12記載のベクター。
- 請求項10〜14のいずれか一項記載のベクターを含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の選択システム。
- 選択マーカーとしてaraD遺伝子と、関心対象の遺伝子とを含むプラスミドをaraD欠損大腸菌宿主細胞に挿入する段階、及び該細胞をアラビノース含有培地で生育させる段階を含む、抗生物質を用いない、該プラスミドで形質転換された細胞を選択する方法。
- araD遺伝子がL-リブロース-5-リン酸4-エピメラーゼ遺伝子(EC 5.1.3.4)である、請求項16記載の方法。
- ベクターのaraD遺伝子が、L-リブロース-5-リン酸4-エピメラーゼの8位のグルタミンのコドンに替えて、8位における、終結コドンをもたらすCからTへの変異を持つ、請求項17記載の方法。
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