JP6636661B2 - 大腸菌における組換えcrm197の産生強化 - Google Patents

大腸菌における組換えcrm197の産生強化 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、2014年3月3日に出願された米国仮出願第61/947,234号の利益を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、大腸菌、好ましくは減少ゲノム大腸菌K12株における組換えCRM197の産生を対象とする。
ジフテリア毒素(DTx)は、ジスルフィド架橋によって一緒に連結されたA(活性)ドメイン及びB(結合)ドメインを含有する、535個のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖として合成されたコリネバクテリウムジフテリアの二成分外毒素である。この毒素は、細胞受容体(HB−EGF受容体)に結合し、エンドサイトーシスによって細胞に進入し、そこでAドメインがンパク質分解切断によりBドメインから解放される。次に、Aドメインは、Bドメインによって作られた細孔を通してエンドソームを退出して、細胞質に進入し、そこでそれはタンパク質合成を阻害して最終的に細胞死をもたらす。
CRM197は、タンパク質を酵素的に不活性かつ非毒性にする、グリシンに対するグルタミン酸の単一アミノ酸置換(G52E)を含有するDtxの突然変異型である。CRM197は、被包性細菌に対する共役ワクチンの理想的な担体であることが分かっている。共役ワクチンは、免疫原性が乏しく、T細胞非依存性莢膜多糖類に共有結合的に連結し、よって、高度に免疫原性であり、抗原(複数可)に対して長期間持続する免疫をもたらす共役抗原を作り出すCRM197を含む。
担体タンパク質としてCRM197を含有するワクチンは、数百万人の小児を免疫するために成功裏に使用されており、これにはMenveo(登録商標)(髄膜炎菌の血清群A−C−W135−Yに対する4価の共役ワクチン)、Menjugate(登録商標)及びMeningitec(登録商標)(髄膜炎菌の血清型Cに対する)、Vaxem−Hib(登録商標)及びHibTITER(登録商標)(B型インフルエンザ菌Hibに対する)、ならびに多価の肺炎球菌共役体Prevnar(商標)が含まれる。
破傷風及びジフテリア毒素とは対照的に、CRM197は、化学的解毒を必要とせず、したがって、均質に精製され、共役に直接使用することができる。CRM197は、現在、βファージの多重溶原菌から発現されるコリネバクテリウムジフテリアC7、またはシュードモナスフルオレッセンスのプラスミド系からのいずれかの発酵によって製造される。CRM197の収量(C.ジフテリア発酵中に培地中に放出される)は低く、数十mg/L〜約200mg/Lの範囲であり、バイオセーフティーレベル2の施設を必要とし、1ミリグラムのCRM197当たり約$500(米ドル)の小売価格となる。単回投与ワクチンは、典型的には、約10及び60μgのCRM197を含有し、1憶5千万を超える投与が毎年使用される。現在の共役CRM197ワクチンの需要は供給を上回り、発展途上国におけるワクチンプログラムの開始が遅れ、数百万人の小児の健康が危険に曝されている。
さらに、一部の癌において高度に発現されるヘパリン結合上皮増殖因子(pro−HB−EGF)の可溶性形態に結合するCRM197の能力に基づき、卵巣癌などの癌治療におけるCRM197の治療上の使用の可能性が最近報告された。この治療可能性の研究開発は、さらに多くの株を現在の産生方法に位置付ける。
CRM197の高価格及び供給不足に寄与する唯一の最大要因は、産生に主要な大腸菌において多量のCRM197を生成する能力が歴史的にないことである。CRM197の不溶性形態は大腸菌において比較的中程度の収量まで発酵させることができるが、不溶性産物の一部のみしか可溶性形態に変換することができない(Stefanら、2011)。大腸菌において多量の可溶性CRM197を産生することは、さらにより困難となっている。治療に使用するための多量のCRM197を確実かつ安価に産生するための方法は、当該技術分野において大幅な進歩となるだろう。
本発明は、大腸菌宿主細胞において組換えCRM197タンパク質を産生するための方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、組換えCRM197タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結された、CRM197タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む、減少ゲノム大腸菌をインキュベートすることを含む。BL21などの野生型大腸菌株における産生と比較した、CRM197の収量における大幅な増加は、本発明による減少ゲノム大腸菌宿主細胞において達成される。CRM197タンパク質をコードする核酸配列は、好ましくは、大腸菌宿主細胞における発現をコドン最適化する。好ましい実施形態では、天然の親大腸菌株は、K12株である。別の実施形態では、本方法は、組換えCRM197タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結されたCRM197タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む天然のK12株大腸菌をインキュベートすることを含む。
一態様では、CRM197タンパク質をコードする核酸配列は、大腸菌宿主細胞(好ましくは減少ゲノム大腸菌宿主細胞)の周辺質へのCRM197タンパク質の移送を指向するシグナル配列をコードする核酸配列に融合され、それにより、1リットル当たり約1グラム〜1リットル当たり約10グラムの可溶性CRM197の収量が達成される。本発明のこの態様によると、大腸菌宿主(好ましくは減少ゲノム大腸菌宿主)は、大腸菌周辺質へのCRM197の輸送を指向することが可能なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする5’シグナル配列部分と、その天然のシグナル配列を欠くCRM197タンパク質をコードする3’CRM197部分とを含む核酸配列を含む、発現ベクターを含む。好ましくは、CRM197の発現は誘導性であり、本方法は、(a)大腸菌(好ましくは減少ゲノム大腸菌)を成長させる工程と、(b)CRM197の発現を誘導する工程とを含む。好ましくは、本方法は、発酵装置内で実行される。
関連した態様では、(例えば、減少ゲノム)大腸菌宿主細胞は、タンパク質コード配列に動作可能に連結された誘導性プロモーター(例えば、lac誘導体プロモーター)を含む発現ベクターで形質転換され、CRM197の発現は好適な量の誘導剤(例えば、イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG))の添加によって誘導される。好ましくは、振盪フラスコ条件下で、誘導は、約0.1〜約1.5(より好ましくは約0.2〜約0.9、さらにより好ましくは約0.3〜約0.6)の、600nm(その波長で、1光学密度(OD)単位は約0.8×109細胞/mlに相当する)での光学密度で生じる。発酵条件下で、誘導は、好ましくは、約100〜400、より好ましくは約150〜300、最も好ましくは200〜275(例えば、230〜250)のOD600で生じる。他の関連した態様では、成長及び/または誘導中の培養物のpHは、約6.5〜約7.5であり、成長及び/または誘導温度は、約20℃〜約30℃(好ましくは約25℃)であり、成長培地は、血清、酵母抽出物、及び動物由来の副産物を含まない。特に好ましい実施形態では、(例えば減少ゲノム)大腸菌を成長させることは、37℃で比較的短い初期インキュベーション(例えば、1〜3時間)を行い、続いて誘導前及び後に20℃〜30℃で(好ましくは約25℃で)成長させることを含むか、あるいは誘導前及び後に20℃〜30℃で(好ましくは約25℃で)連続成長させることを含む。
関連した実施形態では、得られた可溶性CRM197の収量は、少なくとも約0.5g/L、少なくとも約.7g/L、少なくとも約1.0g/L、少なくとも約1.3g/L、少なくとも約1.5g/L、少なくとも約1.7g/L、少なくとも約2.0g/L、少なくとも約2.3g/L、少なくとも約2.5g/L、少なくとも約2.7g/L、少なくとも約3.0g/L、少なくとも約3.5g/L、少なくとも約3.7g/L、少なくとも約4.0g/L、少なくとも約4.5g/L、少なくとも約5g/L、少なくとも約5.5g/L、少なくとも約6.0g/L、少なくとも約7.0g/L、少なくとも約8.0g/L、少なくとも約9.0g/L、または少なくとも約10.0g/Lである。他の実施形態では、得られた可溶性CRM197の収量は、約1.0g/L〜約10.0g/L、約1.0g/L〜約9.0g/L、約1.0g/L〜約8.0g/L、約1.0g/L〜約7.0g/L、約1.0g/L〜約6.0g/L、約1.0g/L〜約5.0g/L、約1.0g/L〜約4.0g/L、約1.0g/L〜約3.0g/L、または約1.0g/L〜約2.0g/Lである。他の実施形態では、得られた可溶性CRM197の収量は、約2.0g/L〜約10.0g/L、約2.0g/L〜約9.0g/L、約2.0g/L〜約8.0g/L、約2.0g/L〜約7.0g/L、約2.0g/L〜約6.0g/L、約2.0g/L〜約5.0g/L、約2.0g/L〜約4.0g/L、約2.0g/L〜約4.0g/L、または約2.0g/L〜約3.0g/Lである。他の実施形態では、得られた可溶性CRM197の収量は、約3.0g/L〜約10.0g/L、約3.0g/L〜約9.0g/L、約3.0g/L〜約8.0g/L、約3.0g/L〜約7.0g/L、約3.0g/L〜約6.0g/L、約3.0g/L〜約5.0g/L、または約3.0g/L〜約4.0g/Lである。
関連した態様では、5’シグナル配列部分は、シグナル認識粒子(SRP)依存性シグナル配列(DsbA、TolB、及びTorT分泌シグナルなど)、Sec−依存性シグナル配列(OmpF、OmpT、OmpA、PhoA、MalE、LamB、LivK、及びPelB分泌シグナルなど)、またはツインアルギニン透過(TAT)シグナル配列(TorA及びSufl分泌シグナルなど)をコードする。一部の実施形態では、5’シグナル配列部分は、Sec−依存性シグナル配列、好ましくはOmpAまたはOmpF分泌シグナルをコードする。特に好ましい実施形態では、5’シグナル配列部分は、ompF分泌シグナルをコードする。
他の好ましい実施形態では、5’シグナル配列部分は、MglB、MalE、OppA、RbsB、Agp、FkpA、YtfQ、HdeA、HdeB、OmpC、及びGlnH分泌シグナルから選択されるシグナル配列をコードする。特に好ましい実施形態では、5’シグナル配列部分は、YtfQ分泌シグナルをコードする。
別の関連した態様では、大腸菌宿主細胞は、発現制御配列に動作可能に連結された、周辺質におけるCRM197の移行及び/または折り畳みを補助するための1つ以上のタンパク質をコードする配列を含む1つ以上の核酸をさらに含む。周辺質におけるCRM197の移行及び/または折り畳みを補助するための1つ以上のタンパク質をコードする配列を含む核酸(複数可)は、CRM197をコードするヌクレオチド配列を含む同じ発現ベクターの一部であるか、または異なる発現ベクターに位置し得る。CRM197の移行及び/または折り畳みを補助するためのタンパク質は、限定されないが、シャペロン(Skp、DnaK、DnaJ、CaflM、及びCaflAなど)、ジスルフィド結合形成タンパク質(DsbA、DsbB、DsbC、及びDsbDなど)、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ(PpiA、PpiD、FkpA、及びSurAなど)、可溶性パートナータンパク質(MBP、GST、及びチオレドキシンなど)、分泌経路タンパク質(YebF、MalE、HlyA、Hirudin、OmpF、及びSpyなど)、プロテアーゼ阻害剤(YccAなど)、及び搬出飽和を緩和するタンパク質(PspAなど)を含む。
別の実施形態では、CRM197タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、シグナル配列に融合されず、それにより、1リットル当たり約2グラム〜1リットル当たり約25グラムの不溶性CRM197の収量が達成される。本発明のこの態様によると、(例えば、減少ゲノム)大腸菌宿主は、その天然のシグナル配列を欠き、それにより、CRM197タンパク質が大腸菌宿主の細胞質において発現される、CRM197タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む。
いくつかの態様では、本発明は、(例えば、減少ゲノム)大腸菌宿主細胞において組換えCRM197タンパク質を産生するための方法に関し、本方法は、周辺質へのCRM197タンパク質の移送を指向するシグナル配列に融合された、CRM197タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現ベクター内に連結すること、発現ベクターで大腸菌宿主細胞を形質転換すること、及び形質転換した大腸菌宿主細胞を、組換えCRM197タンパク質の発現に好適な培養培地中で培養することを含み(可溶性CRM197の収量は約1〜10g/L、好ましくは約2〜10g/Lである)、培養物から大腸菌細胞を採取し、洗剤の不在下で機械的方法により採取した細胞を溶解することをさらに含む。任意に、本方法は、得られた溶解物の可溶性画分を得ること(例えば、遠心分離して、可溶性と不溶性画分を分離することにより)、及び可溶性画分(大腸菌宿主によって産生された可溶性CRM197を含む)を1つ以上の精製工程に供することをさらに含む。一実施形態では、可溶性CRM197は、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び/または陰イオン交換クロマトグラフィーに供される。好ましい実施形態では、大腸菌宿主細胞は、減少ゲノム大腸菌宿主細胞である。
他の態様では、本発明は、発現ベクターを含む(例えば、減少ゲノム)大腸菌宿主細胞に関し、該発現ベクターは、大腸菌周辺質へのCRM197の輸送を指向することが可能なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする5’シグナル配列部分と、発現制御配列に動作可能に連結された、その天然のシグナル配列を欠くCRM197タンパク質をコードする3’CRM197部分とを含む、核酸配列を含む核酸配列を含む。好ましい実施形態では、大腸菌宿主細胞は、少なくとも減少ゲノム大腸菌MDS42株から欠失される遺伝子を欠くか、または少なくとも減少ゲノム大腸菌MDS69株から欠失される遺伝子を欠く減少ゲノム大腸菌宿主細胞である。
本発明のこれら及び他の実施形態は、本明細書において以下により詳細に記載される。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
減少ゲノム大腸菌宿主において組換えCRM197を産生するための方法であって、前記組換えCRM197タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結された周辺質へのCRM197タンパク質の移送を指向するシグナル配列に融合された、前記CRM197タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌をインキュベートし、それにより、1リットル当たり少なくとも1グラムの可溶性CRM197の収量を得ることを含み、前記天然の親大腸菌株が、K12株、好ましくはK12 MG1655である、前記方法。
(項目2)
1リットル当たり少なくとも2グラム、1リットル当たり少なくとも3グラム、1リットル当たり少なくとも4グラム、または1リットル当たり少なくとも5グラムの可溶性CRM197の収量が得られる、項目1に記載の前記方法。
(項目3)
前記シグナル配列が、OmpA、OmpF、MglB、MalE、OppA、RbsB、Agp、FkpA、YtfQ、HdeA、HdeB、OmpC、及びGlnHシグナル配列からなる群から選択される、項目2に記載の前記方法。
(項目4)
前記シグナル配列が、OmpFまたはYtfQである、項目3に記載の前記方法。
(項目5)
前記シグナル配列が、YtfQである、項目4に記載の前記方法。
(項目6)
前記減少ゲノム大腸菌が、大腸菌株MG1655より約2%〜約40%小さい、好ましくは約5%〜約30%小さいように遺伝子操作されるゲノムを有する、項目1〜5のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目7)
前記減少ゲノム大腸菌が、そこから、前記大腸菌K−12株MG1655の少なくとも次のDNAセグメント:b0245−b0301、b0303−b0310、b1336−b1411、b4426−b4427、b2441−b2450、b2622−b2654、b2657−b2660、b4462、b1994−b2008、b4435、b3322−b3338、b2349−b2363、b1539−b1579、b4269−b4320、b2968−b2972、b2975−b2977、b2979−b2987、b4466−4468、b1137−b1172、b0537−b0565、b0016−b0022、b4412−b4413、b0577−b0582、b4415、b2389−b2390、b2392−b2395、b0358−b0368、b0370−b0380、−b2856−b2863、b3042−b3048、b0656、b1325−b1333、b2030−b2062、b2190−b2192、b3215−b3219、b3504−b3505、b1070−b1083、b1878−b1894、b1917−b1950、b4324−b4342、b4345−b4358、b4486、b0497−b0502、b0700−b0706、b1456−b1462、b3481−b3484、b3592−b3596、b0981−b0988、b1021−b1029、b2080−b2096、b4438、b3440−b3445、b4451、b3556−b3558、b4455、b1786、b0150−b0153、及びb2945を欠失している、項目6に記載の前記方法。
(項目8)
前記減少ゲノム大腸菌が、そこから、前記大腸菌K−12 MG1655株の少なくとも次のDNAセグメント:b0315−b0331、b0333−b0341、b0346−b0354、b2481−b2492、b2219−b2230、b4500、b3707−b3723、b0644−b0650、b4079−4090、b4487、b4092−b4106、b0730−b0732、b3572−b3587、b1653、b2735−b2740、b2405−b2407、b3896−b3900、b1202、b4263−b4268、b0611、b2364−b2366、b0839、b0488−b0500、及びb0502をさらに欠失している、項目7に記載の前記方法。
(項目9)
前記減少ゲノム大腸菌が、MDS42株である、項目7に記載の前記方法。
(項目10)
前記減少ゲノム大腸菌が、MDS69株である、項目8に記載の前記方法。
(項目11)
前記減少ゲノム大腸菌が、機能recA(b2699)遺伝子を含む、項目1〜10のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目12)
前記減少ゲノム大腸菌が、relA遺伝子であって、前記relA遺伝子のコード配列の547または548位に少なくとも1つの点突然変異を有するrelA遺伝子を含み、前記突然変異が、547位でのG→A突然変異、547位でのG→T突然変異、548位でのC→G突然変異、または548位でのC→T突然変異のうちの1つ以上から選択される、項目1〜11のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目13)
前記減少ゲノム大腸菌が、機能polB(b0060)、dinB(b0231)、及び任意にumuDC(b1183−b1184)遺伝子を欠く、項目1〜12のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目14)
前記減少ゲノム大腸菌が、以下の修飾:(i)オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を強化するためのrph遺伝子の欠失、(ii)活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生するための、ilvG遺伝子における天然−2フレームシフト突然変異を補完する突然変異の導入、ならびに(iii)iclR及びarpA遺伝子の欠失を含む、項目1〜13のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目15)
前記減少ゲノム大腸菌が、挿入配列を含まない、項目1〜14のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目16)
前記CRM197ヌクレオチド配列が、前記大腸菌宿主細胞における発現のために最適化される、項目1〜15のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目17)
(a)前記減少ゲノム大腸菌を成長させることと、
(b)CRM197の発現を誘導することと、を含む、項目1〜16のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目18)
前記方法が、発酵装置内で実行される、項目17に記載の前記方法。
(項目19)
工程(a)が、前記減少ゲノム大腸菌を37℃で最大19時間成長させ、続いて工程(b)の前及び後で、約20〜30℃、好ましくは約25℃で成長させることを含む、項目17または18に記載の前記方法。
(項目20)
工程(a)及び(b)が、血清、酵母抽出物、または他の動物由来の副産物を含まない成長培地中で行われる、項目17〜19のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目21)
工程(a)において、pHが、6.5〜7.5の範囲である、項目18〜21のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目22)
前記pHが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、またはヒスチジン緩衝液を用いて維持される、項目17〜21のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目23)
前記緩衝液が、リン酸緩衝液である、項目22に記載の前記方法。
(項目24)
発現が、工程(b)において、好適な量のIPTGを添加することによって誘導される、項目17〜23のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目25)
発現が、100〜400、好ましくは200〜275、より好ましくは230〜250のOD600で誘導される、項目18〜24のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目26)
前記発酵装置が、0.5〜50,000リットルの培養物を含む、項目18〜25のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目27)
(c)洗剤の不在下で、前記培養した減少ゲノム大腸菌細胞を機械的に破砕し、前記得られた細胞溶解物を遠心分離して、可溶性画分を得る、さらなる工程を含む、項目17〜26のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目28)
前記機械的破砕が、超音波処理または微細流動化を含む、項目27に記載の前記方法。
(項目29)
CRM197が、1つ以上の精製工程により、前記可溶性画分から精製される、項目27または28に記載の前記方法。
(項目30)
前記1つ以上の精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び/または陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、項目29に記載の前記方法。
(項目31)
前記精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、項目30に記載の前記方法。
(項目32)
CRM197タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に融合されず、それにより、1リットル当たり約2グラム〜1リットル当たり約20グラムの不溶性CRM197の収量が得られる、項目1に記載の前記方法。
(項目33)
前記不溶性CRM197が、1つ以上の可溶化工程に供される、項目32に記載の前記方法。
(項目34)
CRM197タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、ompFまたはytfQシグナル配列に融合され、前記減少ゲノム大腸菌宿主が、次の修飾:(i)前記大腸菌K−12 MG1655株の次のDNAセグメント:b0245−b0301、b0303−b0310、b1336−b1411、b4426−b4427、b2441−b2450、b2622−b2654、b2657−b2660、b4462、b1994−b2008、b4435、b3322−b3338、b2349−b2363、b1539−b1579、b4269−b4320、b2968−b2972、b2975−b2977、b2979−b2987、b4466−4468、b1137−b1172、b0537−b0565、b0016−b0022、b4412−b4413、b0577−b0582、b4415、b2389−b2390、b2392−b2395、b0358−b0368、b0370−b0380、b2856−b2863、b3042−b3048、b0656、b1325−b1333、b2030−b2062、b2190−b2192、b3215−b3219、b3504−b3505、b1070−b1083、b1878−b1894、b1917−b1950、b4324−b4342、b4345−b4358、b4486、b0497−b0502、b0700−b0706、b1456−b1462、b3481−b3484、b3592−b3596、b0981−b0988、b1021−b1029、b2080−b2096、b4438、b3440−b3445、b4451、b3556−b3558、b4455、b1786、b0150−b0153、及びb2945の欠失、(ii)オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を強化するためのrph遺伝子の欠失、(iii)活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生するための、ilvG遺伝子における天然−2フレームシフト突然変異を補完する突然変異の導入、ならびに(iv)iclR及びarpA遺伝子の欠失を含み、
それにより、1リットル当たり少なくとも1グラム、好ましくは1リットル当たり少なくとも2グラムの可溶性CRM197の収量が得られる、項目1に記載の前記方法。
(項目35)
前記減少ゲノム大腸菌宿主が、そこから、前記大腸菌K−12 MG1655株の少なくとも次のDNAセグメント:b0315−b0331、b0333−b0341、b0346−b0354、b2481−b2492、b2219−b2230、b4500、b3707−b3723、b0644−b0650、b4079−4090、b4487、b4092−b4106、b0730−b0732、b3572−b3587、b1653、b2735−b2740、b2405−b2407、b3896−b3900、b1202、b4263−b4268、b0611、b2364−b2366、b0839、b0488−b0500、及びb0502をさらに欠失している、項目34に記載の前記方法。
(項目36)
発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌宿主であって、前記発現ベクターが、前記大腸菌周辺質へのCRM197の輸送を指向することが可能なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする5’シグナル配列部分と、その天然のシグナル配列を欠く前記CRM197タンパク質をコードする3’CRM197部分と、を含む核酸配列を含む、前記減少ゲノム大腸菌宿主。
CRM197の不溶性形態の検査を目的とした実験に使用されたCRM197配列におけるヘアピン構造の解放をもたらすDNA配列の変化を示す。最適化した配列(B)は、より高い最小エネルギー(本来の配列の−4.27と比較して、最適化した配列は−1.68)を生成し、二次構造をほどき、本来の配列に対して開始部位(ATG)とリボソーム結合部位(RBS)の両方の認識を強化する。 減少ゲノム大腸菌MDS42 recA株(recA欠失を有するMDS42株)におけるCRM197のサイトゾル発現を示す。振盪フラスコ培養物を、最小培地中で0.5の光学密度(OD)まで成長させ、次に、示されるように、0または250μMのいずれかのIPTGで誘導された。電気泳動は4〜12%勾配アクリルアミドビス−トリスゲルを用い、続いてGelCode染色試薬を用いてタンパク質染色を行った。1レーンにつき、0.04ODの材料を充填した。M=マーカーレーン、T=全細胞タンパク質、S=可溶性画分、I=不溶性画分。多量のサイトゾルCRM197が不溶性画分(矢印)中に存在し、不溶性CRM197の産生における構築物及び株の強固な性質を確認した。 減少ゲノムMDS42recA株におけるCRM197の周辺質送達に関して検査されたシグナル配列を示す。上のパネル(A)は、コドン最適化したCRM197配列の5’端に融合された異種シグナル配列の図である。下の左側のパネル(B)は、3つの大腸菌分泌経路を代表するシグナル配列を図示する。下の右側のパネル(C)は、周辺質におけるCRM197の移行及び/または折り畳みを補助するそれらの能力を試験するために、CRM197と同時発現されたタンパク質を図示する。 OmpA及びOmpFシグナル配列を用いた、MDS42recAにおけるCRM197発現のタンパク質ゲル分析を示す。シャペロンとしてΔaa1−5 YccA(OmpA+CRM197+/−YccA)またはΔaa1−5 YccA(OmpF+CRM197+/−YccA)のいずれかを用いた、25℃での早期(パネルA及びC;0.01のOD600で誘導剤を添加)及び後期(パネルB及びD;約0.4のOD600で誘導剤を添加)誘導。矢印は、各誘導剤シリーズにおけるCRM197の最高レベルを示す。CRM197の真下に移行する内因性大腸菌タンパク質に留意されたい。ゲル方法は、図2に関して記載される通りであった。周辺質試料は、周辺質化緩衝液(Periplasting Buffer)(Epicentre,Madison,WI)の補助により調製された。1.5mlのエッペンドルフチューブ中で10分間、7,500×gで遠心分離することにより、2OD試料を採取した。上清を除去し、細胞ペレットを50μlの周辺質化緩衝液(200mMトリス−HCl[pH7.5]、20%スクロース、1mMのEDTA、及び30U/μlのReady−Lyseリゾチーム)に穏やかに再懸濁した。室温で5分後、50μlの氷冷水を迅速に再懸濁ペレットに添加した。混合物を、15分間、4,000×gで遠心分離することにより、スフェロプラストから周辺質画分を分取する前に氷上で5分間インキュベートした。周辺質画分を代表する上清をSDS−PAGE分析用に調製した。0.12OD単位と等しい量を充填した。 MDS42recA宿主細胞におけるCRM197発現に対する、炭素源としてグルコースまたはグリセロールを使用する作用を比較する。パネルAは、全細胞タンパク質(1レーンにつき、0.04ODを充填)を示す。パネルAは、単離した周辺質タンパク質(1レーンにつき、0.12ODを充填)を示す。高濃度のCRM197がグルコース補足した培地において生成されたことに留意されたい。「42のみ」と表示されるレーンは、発現ベクターを含まない(即ち、CRM197を発現しない)MDS42recAを用いた対照レーンである。 MDS42プラットホーム上に構築された4つの株と、MDS69プラットホーム上に構築された4つの株とを含むompAシグナル配列に融合されたCRM197をコードする発現ベクターを保有する、8つの減少ゲノム大腸菌株におけるCRM197発現のタンパク質ゲル分析を示す。試験したMDS42株は、(i)MDS42、(ii)MDS42recA、(iii)MDS42 metab(rph及びilvGフレームシフト突然変異の補正ならびにiclR及びarpA遺伝子の欠失を含むMDS42株)、及び(iv)MDS42 Blon metab(IS挿入が祖先大腸菌lonプロモーターの−10領域から−35領域を分離するB株大腸菌のlonプロモーター領域の配列を摸倣するための、Lonプロテアーゼ(b0439)プロモーター領域の修飾をさらに含むMDS42 metab)である。試験したMDS69株は、(i)MDS69 metab(rph及びilvGフレームシフト突然変異の補正ならびにiclR及びarpA遺伝子の欠失を含むMDS69株)、(ii)MDS69 Blon metab(上述のLonプロテアーゼプロモーター修飾をさらに含むMDS69 metab)、(iii)MDS69 lpp metab(lpp遺伝子の欠失をさらに含むMDS69 metab(MG1655のヌクレオチド1755260−1755687)、及び(iv)MDS69 Blon,lpp metabである。パネルA及びCは、示されるIPTG濃度で誘導した後に単離された全細胞タンパク質を示す。パネルB及びDは、並行して行われた周辺質単離を示す。ゲル方法は、図2に記載される通りであった。 MDS42及びMDS69プロテアーゼ株におけるCRM197発現のタンパク質ゲル分析を示す。パネルA及びCは、示されるIPTG濃度で誘導した後に単離された全細胞タンパク質を示す。パネルB及びDは、並行して行われた周辺質単離を示す。ゲル方法は、図2に記載される通りであった。 10リットル規模の既定最小培地中で、OmpAシグナル配列に融合されたCRM197をコードする発現ベクターを保有する、減少ゲノム大腸菌MDS42 metab株を流加発酵した後の、発酵試料のタンパク質ゲル及びウエスタンブロットを示す。パネルA:全細胞タンパク質(TCP)及び周辺質(Peri)調製物を、示される発酵ODで回収した。IPTGは、OD=200で添加された。パネルB:抗ジフテリア毒素抗体を用いたウエスタンブロットは、CRM197を決定的に特定するために使用された。CRM197は誘導前に発現されなかったことに留意されたい。SFC=振盪フラスコ対照である。TCP及びPeri試料のレーンにつき、それぞれ、0.04及び0.12ODが充填された。ゲル方法は、図2に記載される通りであった。 (i)MDS42recA株におけるOmpA−CRM197の発現後の、従来の洗剤系緩衝液を用いて単離された全細胞タンパク質(TCP)(パネルA及びパネルBの左側3つのレーン)、及び(ii)周辺質タンパク質調製物(パネルBの右側3つのレーン)のタンパク質ゲルを示す。パネルA:全細胞タンパク質の試料(左側)は、高速(21kg)で10分間遠心分離され、次いで再分析された(右側)。CRM197は、可溶性画分には見られなかった。パネルB:全細胞タンパク質(TCP)及び周辺質画分の高速遠心分離は、CRM197が洗剤に曝露された細胞質画分において不溶性であり(左側)、洗剤に曝露されなかった周辺質画分において可溶性である(右側)ことを示す。ゲル方法は、図2に記載される通りであった。矢印は、可溶性画分において現れなかったTCP中のCRM197を示す。 洗剤及び機械的溶解のタンパク質ゲルならびにCRM197溶解度を示す。CRM197に融合されたompAをコードする発現ベクターを保有するMDS42recA細胞は、図8に関して記載されるように流加発酵に供された。溶解剤の存在下で、(A)洗剤(Bugbuster(登録商標)(Novagen)、細胞膜を破砕する非イオン性洗剤の専有混合物)または(B)機械的(超音波処理)溶解のいずれかを用いて、細胞を溶解した。洗剤の不在下での溶解が高レベルの可溶性CRM197をもたらしたことに留意されたい。GSH:GSSG=グルタチオンの酸化比に還元、M=マーカー、Sol=可溶性画分、TCP=全細胞タンパク質。誘導剤(IPTG)=35μM。 OmpA−CRM197をコードする発現ベクターを保有するMDS69 metab宿主細胞の発酵を示すグラフである。CRM197は、流加発酵において、1.95g/Lの最大収量が達成された最大30時間点まで増加することが分かった。 発酵試料において多量の可溶性CRM197を示す図11の発酵からのタンパク質ゲルを示す。MDS69 metab株は、炭素源としてグルコースを有する最小培地中で流加発酵に供された。誘導剤の添加前(22時間)、または28もしくは29時間のいずれかで回収した試料は音波処理によって均質化され、異なる細胞画分が単離された。CRM197は、可溶性(Sol)画分において排他的に見られた。TCP=全細胞タンパク質、Insol=不溶性画分。 CRM197の2カラム精製の結果を示す。パネルA:図12に示される28時間発酵試料の50ODは、微細流動化装置(MF)の均質化に供された。可溶性及び不溶性(IS)画分を単離し、可溶性材料(25OD当量)をフェニルセファロースカラム上に充填した。「可溶性」と表示された3つのレーンは、それぞれ、0.1、0.07、及び0.04ODの事前充填された可溶性試料である。CRM197含有材料は、10mMのNaCl、10mMのリン酸緩衝液(pH7.5)で溶出された。5つの2.5mlの試料を連続して回収し(左から右)、丸で示される画分をプールした。主な溶出試料から精製除去され、蒸留水のみを用いた溶出後に見られた少量の未プロセスCRM197(矢印)に留意されたい。パネルB:パネルAからプールした試料をDEAEセファロースカラム上に充填し、異なる塩濃度(0.1MのNaCl、続いて1MのNaCl、及び最後に1.5MのNaCl)を用いて溶出した。最高純度のCRM197は1MのNaClで溶出された。抗ジフテリア毒素抗体(1:1000希釈)ウエスタンブロットは、並行して行われたタンパク質染色ゲルに沿って示される。F、通過画分;W、カラム洗浄;MF=微細流動化後の総破砕物、IS=微細流動化破砕物の遠心分離後の不溶性画分、S=微細流動化破砕物の遠心分離後の可溶性画分。 野生型B株BLR(DE3)と比較した、MDS42recAにおけるCRM197発現のタンパク質ゲル分析。細胞を、タンパク質を周辺質に指向するompA−CRM197融合をコードする発現ベクターで形質転換し、振盪フラスコ中で、25℃で19時間成長させた。CRM197の発現は、示される濃度でIPTGを添加することにより、OD=0.3(後期段階)で誘導された。周辺質タンパク質を単離し、分析した。CRM197の真下に移行する内因性大腸菌タンパク質に留意されたい。 MDS69 metab及びMDS69 metab低突然変異速度宿主におけるpSX2−OmpA CRM197及びpSX2−OmpF CRM197発現から生成された周辺質画分のタンパク質ゲル分析。OmpF−CRM197クローンは、同じ宿主における、及び同じ誘導条件を用いたompA−CRM197クローン(レーン8〜9)よりも、MDS69 meta低突然変異宿主(レーン5〜6)において多くの可溶性周辺質CRM197を産生する。レーン11〜15は、細胞採取後の培地上清の試料を表し、これらの誘導及び成長条件下で、ほとんど、または全くCRM197が培地中に放出されないことを示す。 CRM197 DNA及びアミノ酸配列を示す。図16Aは、成熟CRM197タンパク質の発現及びプロセシングを周辺質空間に指向するために、シグナル配列で発現に最適化されたCRM197 ORFのDNA配列を示す。図16Bは、細胞質における発現に最適化されたCRM197 ORFのDNA配列を示す。図16Cは、シグナル配列プロセシング(図16A)またはN末端メチオニン除去(図16B)後に産生された成熟CRM197タンパク質のアミノ酸配列を示す。 CRM197 DNA及びアミノ酸配列を示す。図16Aは、成熟CRM197タンパク質の発現及びプロセシングを周辺質空間に指向するために、シグナル配列で発現に最適化されたCRM197 ORFのDNA配列を示す。図16Bは、細胞質における発現に最適化されたCRM197 ORFのDNA配列を示す。図16Cは、シグナル配列プロセシング(図16A)またはN末端メチオニン除去(図16B)後に産生された成熟CRM197タンパク質のアミノ酸配列を示す。 CRM197 DNA及びアミノ酸配列を示す。図16Aは、成熟CRM197タンパク質の発現及びプロセシングを周辺質空間に指向するために、シグナル配列で発現に最適化されたCRM197 ORFのDNA配列を示す。図16Bは、細胞質における発現に最適化されたCRM197 ORFのDNA配列を示す。図16Cは、シグナル配列プロセシング(図16A)またはN末端メチオニン除去(図16B)後に産生された成熟CRM197タンパク質のアミノ酸配列を示す。 大腸菌K株及び/またはB株において相対的存在量に従い分類された減少ゲノムMDS69 metab株におけるCRM197の周辺質送達に関して検査されたシグナル配列を示す。 減少ゲノム大腸菌MDS69 metab株にOD約0.3で添加された25μMの誘導剤(IPTG)での、次のシグナル配列:OmpF、MalE、HdeA、OppA、HdeB、及びGlnH(誘導A)ならびにOmpF、MglB、Agp、OmpC、RbsB、FkpA、及びYtfQ(誘導B)を有する周辺質CRM197のμg/OD(上のパネル)及びμg/ml(キャリパー分析)を示す。 減少ゲノム大腸菌MDS69 metab株にOD約0.3で添加された35μMの誘導剤(IPTG)での、次のシグナル配列:OmpF、MalE、HdeA、OppA、HdeB、及びGlnH(誘導A)ならびにOmpF、MglB、Agp、OmpC、RbsB、FkpA、及びYtfQ(誘導B)を有する周辺質CRM197のμg/OD(上のパネル)及びμg/ml(キャリパー分析)を示す。 減少ゲノム大腸菌MDS69 metab株にOD約0.3で添加された50μMの誘導剤(IPTG)での、次のシグナル配列:OmpF、MalE、HdeA、OppA、HdeB、及びGlnH(誘導A)ならびにOmpF、MglB、Agp、OmpC、RbsB、FkpA、及びYtfQ(誘導B)を有する周辺質CRM197のμg/OD(上のパネル)及びμg/ml(キャリパー分析)を示す。 減少ゲノム大腸菌MDS69 metab株にOD約0.3で添加された、0、25、35、及び50μMの誘導剤でのOmpFシグナル配列、ならびに0、25、35、50、75、100、150、及び250μMの誘導剤でのYtfQシグナル配列で得られた周辺質CRM197のμg/OD(上のパネル)及びμg/ml(キャリパー分析)を比較する。結果は、2セットの実験の平均である。 OD=0.3(後期段階)で添加された50μM(OmpF)または50、75、100、150、250μM(YtfQ)の誘導剤濃度での、OmpFまたはYtfQシグナル配列を有するMDS69 metabの周辺質(P)及び培地(M)におけるCRM197収量を比較するタンパク質ゲル分析である。試料は、分析用に指定されたODで回収された。 示される誘導剤濃度での、OmpFまたはYtfQシグナル配列を有するMDS metab細胞における、及びompFシグナル配列を有するBL21(DE3)細胞におけるCRM197の周辺質発現を比較する。誘導剤はOD約2(非常に後期の誘導)で添加され、試料はキャリパーによって分析された。(可溶性)周辺質CRM197のg/L(OD600=250に外挿)は、誘導剤の各濃度で示される。
本発明は、様々な形態で具体化されることが可能であるが、いくつかの実施形態の以下の説明は、本開示が本発明の例示として考えられ、本発明を図示される特定の実施形態に限定することが意図されないという理解によりなされる。見出しは単に便宜上のために提供され、いかなる方法でも本発明を制限するものと解釈されない。任意の見出し下に図示される実施形態は、任意の他の見出し下に図示される実施形態と組み合わせることができる。
別途明示的に示されない限り、本出願に指定される様々な範囲においおける数値の使用は、近似として記述されるが、記述される範囲内の最小値と最大値は両方とも、用語「約」が先行する。このように、記述される範囲を上回る及び下回るわずかな変動は、範囲内の値と実質的に同じ結果を達成するために使用され得る。本明細書で使用される、用語「約」及び「およそ」とは、数値を指す場合、問題の関連技術の者に明白かつ一般的な意味を有するものとする。また、範囲の開示は、列記される最小値と最大値の間の各値、ならびにそのような値によって形成され得る任意の範囲を含む連続する範囲として意図される。これは、有限の上限及び/または下限を含むまたは含まない、形成され得る範囲を含む。これは、所与の開示される数字を別の開示される数字に分けることにより導出可能である比率も含む。したがって、当業者は、多くのそのような比率、範囲、及び比率の範囲が本明細書に提示されるデータ及び数字から明白に導かれ得、全てが本発明の様々な実施形態を表すことを理解するだろう。
本明細書で使用される「減少ゲノム」細菌は、そのゲノム(例えば、タンパク質コード遺伝子)の約1%〜約75%が欠失した、例えば、ゲノムの約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、または約60%が欠失した細菌を意味する。一実施形態では、本発明の実践に使用される減少ゲノム細菌は、好ましくは、天然の親株のゲノムよりも少なくとも2パーセント(2%)及び最大20パーセント(20%)(その間の任意の数を含む)小さいように遺伝子操作されるゲノムを有する。好ましくは、ゲノムは、天然の親株のゲノムよりも少なくとも5パーセント(5%)及び最大30パーセント(30%)小さい。より好ましくは、ゲノムは、天然の親株のゲノムよりも少なくとも8パーセント(8%)〜14パーセント(14%)〜20パーセント(20%)(その間の任意の数を含む)小さい。あるいは、ゲノムは、天然の親株のゲノムよりも20%未満、30%未満、40%未満、または50%未満小さいように操作され得る。用語「天然の親株」とは、株系の基礎を表すと科学会により一般的に理解される自然界または天然の環境に見られ、より小さいゲノムを有する細菌株を生成するためにそのゲノム上で一連の欠失を行うことができる細菌株を意味する。天然の親株は、操作された株が比較される株も指し、操作された株は、天然の親株の完全補体未満を有する。ゲノムが一連の欠失後に小さくなったパーセンテージは、「全ての欠失後の欠失された塩基対の総数」を「全ての欠失前のゲノムにおける塩基対の総数」で除し、100を乗じることにより計算される。同様に、ゲノムが天然の親株より小さいパーセンテージは、より小さいゲノムを有する株(それが産生されたプロセスに関わらず)におけるヌクレオチドの総数を天然の親株におけるヌクレオチドの総数で除し、100を乗じることにより計算される。
一実施形態では、「減少ゲノム」細菌は、上記のゲノム量の除去が最小培地上で成長する生物の能力に許容できないほど影響を及ぼさない細菌を意味する。2つ以上の遺伝子の除去が本文脈において最小培地上で成長する生物の能力に「許容できないほど影響を及ぼす」かは、特定の用途に依存する。例えば、増殖における30%の減少は、一用途では許容可能であるが、別の用途では許容可能ではない場合がある。加えて、DNA配列をゲノムから欠失する有害作用は、培養条件を変更するなどの手段により減少される場合がある。そのような手段は、さもなければ許容できない有害作用を許容可能なものに変える場合がある。一実施形態では、増殖速度は、親株とほぼ同じである。しかしながら、親株よりも約5%、10%、15%、20%、30%、40%〜約50%低い範囲の増殖速度は、本発明の範囲内である。より具体的には、本発明の細菌の倍加時間は、約15分〜約3時間の範囲であってよい。好適な減少ゲノム細菌の非限定的な例ならびにDNAを大腸菌などの細菌から欠失するための方法は、米国特許第6,989,265号、同第7,303,906号、同第8,119,365号、同第8,039,243号、及び同第8,178,339号に開示されており、その各々は、本明細書において参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される、用語「b番号」は、Blattner et al.,Science 277:1453−1474(1997)に記載されるように、K−12 MG1655株の各遺伝子に割り付けられる固有のIDを指す。
本明細書で使用される用語「CRM197」は、交差反応材料197(CRM197)である、CRM197においてグリシン(野生型毒素において52位)のグルタミン酸での置換をもたらす単一G→A遷移を有するジフテリア毒素突然変異型を指す。このミスセンス突然変異は、ADP−リボシルトランスフェラーゼ活性の損失に関与する。例えば、Giannini et al.,Nucleic Acids Res.12(10):4063−4069(1984)を参照されたい。
いくつかの実施形態では、減少ゲノム大腸菌宿主細胞において組換えCRM197タンパク質を産生するための方法が提供される。例えば、野生型大腸菌宿主株と比較して、意外にも高収量の組換えCRM197が減少ゲノム大腸菌宿主株を使用した不溶性または可能性形態において産生され得ることが分かった。一態様では、本方法は、宿主細胞の細胞質において、不溶性CRM197の増加した産生をもたらす。他の態様では、本方法は、宿主細胞の周辺質において、可溶性CRM197の増加した産生をもたらす。好ましい実施形態では、減少ゲノム大腸菌宿主細胞を作製するために使用される天然の親大腸菌株は、K−12 MG1655株などのK−12株である。
一部の実施形態では、K−12 MG1655などの天然のK−12株は、本明細書に記載される方法による組換えCRM197を産生するために使用される。
本発明に従って使用するためのCRM197のヌクレオチド配列は、組換えDNA技術を用いて調製され得る。例えば、CRM197は、化学的に合成されるか、またはコーニーバクテリオファージ(cornyebacteriophage)βによって保有されるジフテリア毒素の野生型構造遺伝子の既知のヌクレオチド配列に基づく部位特異的突然変異誘発により調製され得る(Greenfield et al.,Proc Nat Acad Sci,80:6953−6957(1993))。好ましくは、CRM197のヌクレオチド配列は、大腸菌における発現に最適化される。
異種核酸の様々な配列特徴は最適化され得、翻訳開始領域の修飾、mRNA構造要素の変更、及び異なるコドンバイアスの使用を含むが、これらに限定されない。大腸菌宿主細胞における発現を改善するために核酸配列を最適化するための方法は、当該技術分野において既知であり、米国特許第7,561,972号に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。好ましくは、大腸菌における発現のための、CRM197のヌクレオチド配列の最適化は、少なくともコドン最適化を含む。大腸菌においてほとんど使用されない異種核酸配列におけるコドンの存在は、コードされるタンパク質の翻訳を遅らせ、大腸菌宿主細胞において発現の減少をもたらし得る。よって、一態様では、大腸菌における一般的なコドン使用は、大腸菌におけるCRM197の発現を最適化するために使用される。大腸菌における発現のためのCRM197の最適化は、好ましくは、二次構造の干渉を最小に抑えることも含む。二次構造の干渉は、転写及び翻訳を妨害することにより、大腸菌における異種タンパク質の発現の減少をもたらし得る。例えば、開始部位でのmRNA二次構造は、翻訳効率と逆相関している。大腸菌の周辺質における発現に最適化された例示的なCRM197ヌクレオチド配列は、シグナル配列をコードする上流領域に付加されるとき、配列番号1として提供される(図16A)。大腸菌の細胞質における発現に最適化された例示的なCRM197ヌクレオチド配列は、上流のATG開始コドンに付加されるとき、配列番号3として提供される(図16B)。本発明の方法が配列番号1として記載されるCRM197ヌクレオチド配列に限定されないことを理解する。大腸菌における発現のために異種ヌクレオチド配列を最適化するためのさらなる戦略は、当該技術分野において既知であり、上述の戦略に加えて、またはその代替えとして使用され得る。
発現系を含む大腸菌などの遺伝子操作された細菌宿主細胞から組換え異種タンパク質を調製するためのプロセスは、当業者に周知である。組換えCRM197は、これらの方法のいずれかにより、(例えば、減少ゲノム)大腸菌宿主細胞において発現され得る。一態様では、本方法は、発現系を含む減少ゲノム大腸菌宿主細胞に関し、該発現系は、プロモーターが誘導されるときにCRM197が宿主細胞において発現されるように、誘導性プロモーターに動作可能に連結されたCRM197をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい態様では、プロモーターは、好適な量のIPTGを添加することにより誘導される。ポリヌクレオチドの減少ゲノム大腸菌宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、微量注入法、電気穿孔、接合、感染などを含むがこれらに限定されない、Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology(1986)及びSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)に記載されるものなどのいくつかの標準的な分子生物学技術のいずれかにより達成され得る。同様に、宿主において、ポリヌクレオチドを維持、伝播、もしくは発現する、及び/またはポリペプチドを発現するのに好適な任意の系またはベクターは、本発明を実践するために使用することができる。例えば、適切なDNA配列は、標準的な技術により、プラスミドなどのベクター内に挿入され得る。
本発明の一態様は、(例えば、減少ゲノム)大腸菌宿主細胞におけるCRM197の周辺質発現に関する。周辺質におけるタンパク質の発現は産業用途に使用され、Hanahan,J.Mol.Biol.,166:557−580(1983)、Hockney,Trends Biotechnol.,12:456−632(1994)、及びHannig et al.,Trends Biotechnol.,16:54−60(1998)に概説されており、その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。よって、いくつかの実施形態では、組換えCRM197タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結された、シグナル配列に融合された、CRM197タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む(例えば、減少ゲノム)大腸菌を成長させることを含む方法が提供され、該シグナル配列は、大腸菌宿主の周辺質へのCRM197タンパク質の移送を指向する。これらの方法によると、意外にも高収量の無傷可溶性CRM197が産生され、可溶性CRM197の実質的に全てが回収され得る。
タンパク質上のシグナル配列の存在は、大腸菌の内膜にわたって新しく翻訳されたタンパク質の周辺質空間への輸送を促進する。次に、シグナル配列が切断され、したがって、天然のC.ジフテリアシグナル配列の、大腸菌の周辺質へのCRM197の移送を指向するシグナル配列との置換が、最終的に、同じアミノ酸配列を有する成熟タンパク質をもたらす。
大腸菌周辺質への異種タンパク質の指向を可能にするシグナル配列の代表的な例は以下に列記される。本発明の方法に有用なシグナル配列が以下に列記されるものに限定されないことを理解する。好ましくは、シグナル配列は、大腸菌において発現されるとき、周辺質への少なくとも70、80、90、または100%のポリペプチドの指向をもたらす。
本発明に従って使用するためのさらなるシグナル配列は、CpdB(3’−ヌクレオチダーゼ/2’,3’−環状ヌクレオチド2’−ホスホジエステラーゼ)、YdeN(推定上のスルファターゼ)、OsmY(高浸透圧による誘導)、ArtI(サブユニットアルギニンABC輸送体)、GltL(グルタミン酸塩ABC輸送体)、及びCybC(シトクロームb562)を含むが、これらに限定されない。
好ましい実施形態では、シグナル配列は、ytfQ、OmpA、及びOmpFシグナル配列から選択される。特に好ましい実施形態では、シグナル配列は、OmpFシグナル配列である。別の特に好ましい実施形態では、シグナル配列は、YtfQシグナル配列である。
任意の減少ゲノム大腸菌株が本明細書に記載の方法に従い宿主細胞として使用され得る。一態様では、減少ゲノム大腸菌は、5%〜30%または5%〜20%など、その天然の親株のゲノムよりも少なくとも2パーセント(2%)及び最大40パーセント(40%)(その間の任意の数字を含む)小さいように遺伝子操作されるゲノムを有する。ゲノムが一連の欠失後に小さくなったパーセンテージは、「全ての欠失後の欠失された塩基対の総数」を「全ての欠失前の親株のゲノムにおける塩基対の総数」で除し、100を乗じることにより計算される。別の態様では、減少ゲノム細菌は、4.41Mb〜3.71Mb、4.41Mb〜3.25Mb、または4.41Mb〜2.78Mbのゲノムを有する。本明細書に記載の方法に従って使用するための減少ゲノム大腸菌株は、国際特許公開第WO2003/070880号に記載の方法により、親大腸菌株の累積ゲノム欠失により産生され得る。
親大腸菌株は、任意の大腸菌株であってよいが、好ましくはK−12株(例えば、MG1655(ATCC No.47076)もしくはW3110(ATCC No.27325))またはB株である。特に好ましい親大腸菌株は、4,639,674の塩基対を有するゲノムを有するK−12 MG1655株(注釈版m56、NCBI受入番号U000961)である。
一態様では、親大腸菌株は、米国特許第8,178,339号(参照により本明細書に組み込まれる)の表2〜20に列記される遺伝子のうちの1つ以上を欠くK−12株である。好ましい実施形態では、減少ゲノム大腸菌K−12株は、少なくとも次の遺伝子(Blattner et al.,Science,277:1453−74及びGenBank受入番号400096に記述される名称に基づき「b」番号で識別される):b0245−b0301、b0303−b0310、b1336−b1411、b4426−b4427、b2441−b2450、b2622−b2654、b2657−b2660、b4462、b1994−b2008、b4435、b3322−b3338、b2349−b2363、b1539−b1579、b4269−b4320、b2968−b2972、b2975−b2977、b2979−b2987、b4466−b4468、b1137−b1172、b0537−b0565、b0016−b0022、b4412−b4413、b0577−b0582、b4415、b2389−b2390、b2392−b2395、b0358−b0368、b0370−b0380、b2856−b2863、b3042−b3048、b0656、b1325−b1333、b2030−b2062、b2190−b2192、b3215−b3219、b3504−b3505、b1070−b1083、b1878−b1894、b1917−b1950、b4324−b4342、b4345−b4358、b4486、b0497−b0502、b0700−b0706、b1456−b1462、b3481−b3484、b3592−b3596、b0981−b0988、b1021−b1029、b2080−b2096、b4438、b3440−b3445、b4451、b3556−b3558、及びb4455を欠き、これらは、減少ゲノム(または多重欠失)MDS39株を作製するために、大腸菌K−12 MG1655から欠失された遺伝子である。別の好ましい実施形態では、減少ゲノム大腸菌K−12株は、次の遺伝子:b1786をさらに欠き、これは減少ゲノムMDS40株を作製するために、MDS39から欠失された遺伝子である。別の好ましい実施形態では、減少ゲノム大腸菌K−12株は、次の遺伝子:b0150−b01530をさらに欠き、これは、MDS41を作製するために、MDS40から欠失された遺伝子である。また別の好ましい実施形態では、減少ゲノム大腸菌K−12株は、次の遺伝子:b2945(endA)をさらに欠き、これは、減少ゲノムMDS42株を作製するために、MDS41から欠失された遺伝子である。さらに別の実施形態では、減少ゲノム大腸菌K−12株は、次の遺伝子:b0315−b0331、b0333−b0341、及びb0346−b0354のうちのいずれかをさらに欠き、これは、減少ゲノムMDS43株を作製するために、MDS42から欠失された遺伝子である。また別の実施形態では、減少ゲノム大腸菌K−12株は、次の遺伝子:b2481−b2492、b2219−b2230、b4500、b3707−b3723、b0644−b0650、b4079−4090、b4487、b4092−b4106、b0730−b0732、b3572−b3587、b1653、b2735−b2740、b2405−b2407、b3896−b3900、b1202、b4263−b4268、b0611、b2364−b2366、b0839、b0488−b0500、b0502のうちのいずれかをさらに欠き、これは、MDS60を作製するために、MDS43から欠失された遺伝子である。また別の好ましい実施形態では、減少ゲノム大腸菌K−12株は、次の遺伝子:b0566−b0575、b2209、b0160−b0161、b1431−b1444、b3643、b1037−b1043、b0383、b0226−b0234、b2115−b2132のうちのいずれかをさらに欠き、これは、MDS69を作製するために、MDS60から欠失された遺伝子である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法において使用するための減少ゲノム大腸菌K−12株は、MDS41、MDS42、MDS60、またはMDS69である。
本発明において使用するための大腸菌宿主細胞は、好ましくは、機能recA遺伝子(b2699)を含むが、機能recA遺伝子(b2699)を欠く大腸菌もCRM197を産生するために宿主細胞として使用され得る。例えば、MDS40株、MDS41株、MDS42株、またはMDS69株などの減少ゲノム大腸菌株は、修飾された大腸菌K−12株から遺伝子を完全にまたは部分的に欠失することによるb2699の不活性化により修飾され得る。一実施形態では、OmpAシグナル配列に融合されたCRM197は、機能recA遺伝子を欠く減少ゲノム大腸菌宿主において発現される。
別の態様では、減少ゲノム大腸菌は、WIPO公開第2013/059595号(その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるように、Pol II、Pol IV、及びPol Vをコードする遺伝子からなる群から選択される1つ以上の非機能遺伝子を含む。一実施形態では、減少ゲノム大腸菌は、非機能PolB(b0060によりコードされる、大腸菌K12 MG1655ゲノム上に63429−65780を統合する)遺伝子、及びDinB(b0231によりコードされる、MG1655ゲノム上に250898−251953を統合する)遺伝子を有する。別の実施形態では、減少ゲノム大腸菌は、非機能PolB、DinB、及びUmuDC(b1183−b1184によりコードされる、MG1655ゲノム上に1229990−1231667を統合する)遺伝子を有する。好ましくは、遺伝子(複数可)は、完全なまたは部分的な欠失により不活性にされる。例えば、polB、dinB、及びumuDC遺伝子は、MDS40株、MDS41株、MDS42株、またはMDS69株などの減少ゲノム大腸菌株において非機能性にされ得る。
別の態様では、減少ゲノム大腸菌(例えば、MDS40株、MDS41株、MDS42株、またはMDS69株)は、(a)オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を強化する、(b)活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生する、ならびに(c)iclR及びarpA遺伝子産物の発現を減少させるように遺伝子修飾されている。
ピリミジンヌクレオチドの合成を触媒する酵素である大腸菌オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、pyrE遺伝子であるb番号b3642によりコードされる。pyrE遺伝子は、上流rph遺伝子(b3643)を有するオペロンに存在する。pyrE遺伝子は、rph遺伝子のコード領域における−1フレームシフト突然変異により、MG1655及びW3310などの大腸菌K−12株において準最適なレベルで発現される。オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性は、rph−pyrEオペロンのプロモーターをpyrEの翻訳開始部位の近くにもってくるrphコード配列を完全に除去する欠失により強化され得る。あるいは、米国特許第8,293,505号(その内容は、参照により組み込まれる)に記載される方法のいずれかが、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を強化するために使用され得る。
大腸菌アセトヒドロキシ酸シンターゼIIは、通常、ilvG遺伝子によりコードされる大きいサブユニット、及びilvM遺伝子(b3769)によりコードされる小さいサブユニットからなる。大腸菌K−12 MG1655株のilvG配列は破壊され、実際、GenBank受入番号AAC77488.1に記載されるように、偽遺伝子(b番号b4488)である。ilvG偽遺伝子は、2つの別個のコード配列ilvG_1(b3767)及びilvG_2(b3768)から構成される。MG1655などのK−12株におけるilvG偽遺伝子配列は、他の大腸菌株(例えば、B株、O株等)に見られる無傷ilvG遺伝子に対して、983位及び984位でのヌクレオチドGTの欠失を含む。これらのヌクレオチドの欠失はフレームシフト突然変異をもたらし、K−12 ilvG偽遺伝子配列の982〜984位でのヌクレオチドTGAは、ilvG_1に相当するilvGの切断形態をもたらす未成熟終止コドンとしての機能を果たす。よって、ilvGの正常な遺伝子産物は発現されず、アセトヒドロキシ酸シンターゼIIは大腸菌K−12株に存在しない。減少ゲノム大腸菌は、ilvG遺伝子において天然−2フレームシフト突然変異を補足する突然変異の導入により、活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生するように修飾され得る。あるいは、減少ゲノム大腸菌は、米国特許第7,300,776号(その全内容は参照により本明細書に組み込まれる)に記載の方法のいずれかにより、活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生するように修飾され得る。
大腸菌K株のiclR及びarpA遺伝子は、それぞれ、グリオキシレート短絡酵素及びアセチル−CoAシンセターゼの発現を調節する調節タンパク質をコードする隣接遺伝子である。iclR(イソシトレートリアーゼ調節因子)遺伝子であるb番号b4018は、NCBI Entrez GeneID番号948524で記載される。arpA(アンキリン様調節タンパク質)遺伝子であるb番号b4017は、NCBI Entrez GeneID番号944933で記載される。arpA遺伝子は、K−12株配列に対してBL21DE3及びREL606などのB株のゲノム配列において部分的に欠失されることが分かった。iclR及びarpA遺伝子は、iclR及びarpA遺伝子配列の全てまたは一部の欠失により、例えば、米国特許第6,989,265号の列8行45〜列14行41に記載の「傷跡のない」欠失方法により、減少ゲノム大腸菌において不活性化され得る(即ち、非機能性にされる)。
他の実施形態では、減少ゲノム大腸菌は、米国特許第8,367,380号(その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載の突然変異のうちのいずれかを有するrelA遺伝子を含む。例えば、MDS40株、MDS41株、MDS42株、またはMDS69株などの減少ゲノム大腸菌株は、これらの突然変異のうちのいずれかを組み込むように修飾され得る。
本発明に従って使用するための減少ゲノム大腸菌は、上述の修飾のいずれの組み合わせを含み得る。一部の好ましい実施形態では、少なくともMDS42の欠失を含む、または少なくともMDS69の欠失を含み、(a)オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を強化する、(b)活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生する、ならびに(c)iclR及びarpA遺伝子産物の発現を減少させるように遺伝子修飾された減少ゲノム大腸菌が、CRM197の周辺質産生のための宿主として採用される。減少ゲノム大腸菌は、好ましくは、機能recA遺伝子を含む。
様々なタンパク質コード遺伝子が減少ゲノム細菌を形成するために欠失され得る。大腸菌及び他の細菌において、欠失され得るDNA配列の種類は、一般的に、生物または生物の遺伝子産物の安定性に悪影響を及ぼすものを含む。不安定性を生じるそのような要素は、ゲノム不安定性において役割を果たし得る転移性要素、挿入配列、及び他の「利己的DNA」要素を含むが、これらに限定されない。例えば、挿入配列(IS)要素及びそれらの関連する転置は、時折、細菌ゲノムに見出され、よって欠失の標的である。IS配列は大腸菌において一般的であり、それらの全てが欠失され得る。本文の明確性の目的のため、我々は、無傷または不完全に関わらず、ゲノムにおいて1つの点から別の点に移動することができるDNA要素を一般的に指すために、IS要素及び転移性要素という用語を使用する。科学技術におけるIS要素の有害作用の例は、それらが配列決定の伝播中に宿主大腸菌のゲノムからプラスミド内に移ることができるという事実である。この人為産物は、宿主細胞から全てのIS要素を欠失させることにより防止することができる。特定の用途のため、活性及び不活性プロファージなどのゲノム不安定性に関連する他の特定の遺伝子も欠失され得る。特に好ましい実施形態では、本発明による減少ゲノム大腸菌宿主は、そこから全ての挿入配列を欠失している(即ち、挿入配列を含まない)。関連する態様では、減少ゲノム大腸菌宿主は、全てのIS1、IS2、IS3、IS5、IS150、及びIS186挿入配列を欠く。
本発明の減少ゲノム細菌は、例えば、限定されないが、細菌の成長及び代謝に不要なある特定の遺伝子、偽遺伝子、プロファージ、望ましくない内因性制限−修飾遺伝子、病原性遺伝子、毒素遺伝子、線毛遺伝子、周辺質タンパク質遺伝子、インベイシン遺伝子、リポ多糖体遺伝子、クラスIII分泌系、ファージ毒性決定因子、ファージ受容体、病原性島、RHS要素、未知の機能の配列、及び細菌の同じ天然親種の2株間で共通して見られない配列を欠くようにも操作され得る。細胞生存に必要ではない他のDNA配列も欠失または削除され得る。
特定の好ましい実施形態では、天然の親大腸菌K株のゲノムよりも5パーセント(5%)〜30パーセント(30%)小さいゲノムを有し、全ての挿入配列(IS)要素を欠く減少ゲノム大腸菌が提供される。大腸菌MG1655のゲノムマップ上のIS要素の位置は、図1及び米国特許第8,178,339号(その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)の表2に示される。大腸菌において一般的に生じ、除去され得る挿入配列要素は、IS1、IS2、IS3、IS4、IS5、IS30、IS150、IS186、IS600、IS911、及びIS10を含むが、これらに限定されない。好ましくは、天然の親大腸菌株は、大腸菌K−12 MG1655株である。
別の特に好ましい実施形態では、減少ゲノム大腸菌は、次の遺伝子:b0018、b0150、b0152−b0153、b0161、b0227、b0250、b0291−b0293、b0297、b0316、b0329、b0365、b0371、b0376、b0383−b0384、b0494、b0497−b0498、b0545、b0553、b0559、b0562、b0565、b0567、b0569、b0572−b0574、b0611、b0700、b0704、b0839、b0983−b0986、b1023−b1024、b1072、b1079−b1080、b1083、b1038−b1039、b1041−b1043、b1329、b1357、b1369、b1377、b1383、b1386、b1435−b1436、b1440、b1562、b1878、b1889、b1920、b1995、b2000、b2062、b2123、b2126、b2131−b2132、b2190、b2209、b2487、b2637、b2647、b2945、b3043、b3046−b3048、b3215−b3216、b3219、b3325、b3329、b3338、b3482、b3579、b3584、b3586、b3593、b3596、b4080、b4088、b4105、b4280、b4290−b4292、b4309−b4311、b4314、b4316−b4320、b4412、b4415、b4455、及びb4487単独またはいずれの組み合わせを含むが、これらに限定されない、1つ以上の周辺質タンパク質遺伝子の欠失(複数可)を含む。
本発明の別の態様では、K−12 MG1655などの天然のK−12株は、本明細書に記載の方法による組換えCRM197を産生するために使用される。
組換えタンパク質は、Skp、DnaK、DnaJ、CaflM、CaflA、DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、PpiA、PpiD、FkpA、SurA、MBP、GST、YebF、MalE、HlyA、Hirudin、OmpF、Spy、YccA、及びPspAを含むが、これらに限定されない組換えタンパク質の適切な折り畳みを提供し得るシャペロン/ジスルフィド結合形成酵素と同時発現され得る。組換えタンパク質の周辺質発現に有用なこのようなタンパク質の核酸配列は、米国特許第5,747,662号、同第5,578,464号、及び同第6,022,952号(その各々は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載のものを含むが、これらに限定されない。
CRM197をコードする発現ベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞(減少ゲノムまたは天然K12株)は、任意の発酵形式で培養することができる。例えば、本明細書において、振盪フラスコ培養、バッチ、流加、半連続、及び連続発酵モードを使用することができる。本明細書で、使用される「発酵」は、文献上の発酵が採用される実施形態、及び他の非発酵性培養モードが採用される実施形態の両実施形態を含む。さらに、1リットル規模及びより大きい発酵量を含む任意の発酵規模が採用され得る。一実施形態では、発酵量は1リットルまたは少なくとも1リットルである。他の実施形態では、発酵量は、5リットル、10リットル、15リットル、20リットル、25リットル、50リットル、75リットル、100リットル、200リットル、500リットル、1,000リットル、5,000リットル、10,000リットル、50,000リットル以上であるか、または少なくともそれらである。
様々な実施形態では、発酵培地は、栄養豊富培地、最小培地、及び鉱物塩培地の中から選択され得る。好ましい実施形態では、最小培地または鉱物塩培地が選択される。培地は、好ましくは、血清及び動物由来産物を含まないか、または実質的に含まない。鉱物塩培地は、典型的には、鉱物塩及び炭素源(例えば、グルコース、スクロース、またはグリセロール)からなる。鉱物塩培地を作製するために使用される鉱物塩は、例えば、リン酸カリウム、硫酸アンモニウムもしくは塩化アンモニウム、硫酸マグネシウムもしくは塩化マグネシウム、ならびに塩化カルシウム、ホウ酸塩、及び鉄、銅、マンガン、及び亜鉛の硫酸塩などの微量鉱物の中から選択されるものを含む。ペプトン、トリプトン、アミノ酸、または酵母抽出物などの有機窒素源は、鉱物塩培地に含まれない。代わりに、無機窒素源が使用され、これは、例えば、アンモニウム塩、水性アンモニア、及びガス状アンモニアの中から選択され得る。好ましい鉱物塩培地は、炭素源としてグルコースを含有する。鉱物塩培地と比較すると、最小培地も鉱物塩及び炭素源を含有し得、例えば、低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトン、または他の成分を補充し得るが、これらは非常に最小レベルで添加される。
複数の実施形態では、標的培養細胞密度は、誘導剤、好ましくはIPTGがタンパク質産生を開始させるために添加されるときに達成される。誘導時の細胞密度、誘導剤の濃度、pH、及び温度が発現に最適な条件を決定するために変動し得ることを理解する。
好ましい実施形態では、培養物のpHは、約6.5〜7.5である。
形質転換した減少ゲノム大腸菌の成長、培養、及び/または発酵は、生存可能な温度範囲内で行われるが、好ましくは、約20℃〜約30℃であり、より好ましくは、約25℃である。別の好ましい実施形態では、培養は、37℃での比較的短い初期インキュベーション(例えば、1〜3時間)、続いて、誘導前及び誘導後に、約20℃〜約30℃、好ましくは約25℃で成長させることを含む。他の実施形態では、培養は、誘導前及び誘導後に約25℃で成長させることを含む。
複数の実施形態では、振盪フラスコ条件下で、誘導剤は、20〜30℃、好ましくは25℃のインキュベーション温度で、約0.1〜約1.5、より好ましくは約0.2〜約0.9、さらにより好ましくは約0.3〜約0.6)の、600nmでの光学密度(OD)で添加される。600nmで、1OD単位は、約0.8×10細胞/mlに相当する。他の実施形態では、発酵条件下で、誘導剤は、約100〜400、より好ましくは約150〜300、最も好ましくは230〜250のOD600で添加される。
本方法は、野生型大腸菌B株などの従来の発現系と比較して、適切にプロセスされたCRM197のレベルの増加を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、可溶性CRM197における増加を提供する。この文脈において、用語「可溶性」とは、生理学的条件下で、緩衝液中で10〜30分間回転させたとき、タンパク質が約5,000〜20,000×重力の遠心分離で沈殿しないことを意味する。逆に、「不溶性」とは、生理学的条件下で、緩衝液中で10〜30分間回転させたとき、タンパク質が5,000〜20,000×重力での遠心分離により沈殿し得ることを意味する。
本発明の方法は、(例えば、減少ゲノム)大腸菌宿主細胞から産生された組換えCRM197の回収を含み得る。可溶性タンパク質として周辺質において産生されるとき、可溶性形態の組換えCRM197の回収は、好ましくは、洗剤及び溶解剤の不在下で、大腸菌宿主細胞を機械的に溶解することにより達成される。機械的破砕は、典型的には、超音波処理(Neppiras and Hughes,Biotechnology and Bioengineering,6:247−270(1964))、微細流動化(Sauer et al.,Biotechnology and Bioengineering,33:1330−1342(1989))、またはビーズ粉砕(Limon−Lason et al.,Biotechnology and Bioengineering,21(5):745−774(1979))を伴う。当該技術分野において既知の他の機械的方法も採用され得る。
組換えCRM197は、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、免疫沈降法などを含むが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の標準的な技術により精製され得る。好ましい実施形態では、組換えCRM197の精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び/または陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。
CRM197の収量は、キャピラリーゲル電気泳動及びウエスタンブロット分析などの当業者に既知の方法により決定され得る。活性アッセイは、タンパク質の収量に関する情報も提供し得る。タンパク質収量の有用な尺度は、培養量当たりの組換えタンパク質の量(例えば、タンパク質のグラム/培養物のリットル)、活性タンパク質のパーセントもしくは画分(例えば、活性タンパク質の量/アッセイに使用されたタンパク質の量)、全細胞タンパク質のパーセントもしくは画分、タンパク質/細胞の量、及び乾燥バイオマスのパーセントもしくは比率を含む。
CRM197を評価するための活性アッセイは、当該技術分野において既知であり、文献に記載されており、免疫学的アッセイ、例えば、ウエスタンブロット分析及びELISA、ならびに受容体結合アッセイ、例えば、ジフテリア毒素受容体(proHB−EGF)結合を含み得る。一実施形態では、活性は、アッセイされた総量と比較される、抽出上清中の%活性組換えCRM197タンパク質により表される(即ち、アッセイに使用されたCRM197の総量に対する、アッセイにより活性であると決定されたCRM197の量に基づく)。別の実施形態では、活性は、標準、例えば、天然タンパク質と比較した、抽出上清中の%活性組換えCRM197タンパク質により表される(即ち、各試料から同量のタンパク質がアッセイに使用される標準試料中の活性タンパク質の量に対する、上清抽出試料中の活性CRM197タンパク質の量に基づく)。複数の実施形態では、約60%〜約100%、約70%〜約100%、約80%〜約100%、約90%〜約100%、約95%〜約100%、または約99%〜100%の組換えCRM197タンパク質が活性であると決定される。
CRM197の同一性を確認する手段も当該技術分野において既知であり、例えば、タンパク質は、MALDI−TOF質量分析法、N末端配列決定分析、またはペプチドマッピングを使用する、ペプチド質量フィンガープリントにより分析され得る。
以下は、とりわけ、本発明の好ましい実施形態である。
減少ゲノム大腸菌K12株宿主において組換えCRM197を産生するための方法は、組換えCRM197タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結される減少ゲノム大腸菌宿主の周辺質へのCRM197タンパク質の移送を指向するOmpFまたはYtfQシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に融合された、CRM197タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌K12株をインキュベートし、それにより、1リットル当たり少なくとも1グラム、好ましくは少なくとも2グラムの可溶性CRM197の収量を得ることを含み、インキュベーション条件は、動物由来の血清もしくは他の動物由来の副産物を含まない最小培地中で大腸菌宿主細胞を培養することを含む。
減少ゲノム大腸菌K12株宿主において組換えCRM197を産生するための方法は、組換えCRM197タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結される減少ゲノム大腸菌宿主の周辺質へのCRM197タンパク質の移送を指向するOmpFまたはYtfQシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に融合された、CRM197タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌K12株をインキュベートし、それにより、1リットル当たり少なくとも1グラム、好ましくは少なくとも2グラムの可溶性CRM197の収量を得ることを含み、インキュベーション条件は、動物由来の血清もしくは他の動物由来の副産物を含まない最小培地中で大腸菌宿主細胞を培養することを含み、該減少ゲノム大腸菌K12株は、そこから、大腸菌K−12 MG1655株の少なくとも次のDNAセグメント:b0245−b0301、b0303−b0310、b1336−b1411、b4426−b4427、b2441−b2450、b2622−b2654、b2657−b2660、b4462、b1994−b2008、b4435、b3322−b3338、b2349−b2363、b1539−b1579、b4269−b4320、b2968−b2972、b2975−b2977、b2979−b2987、b4466−4468、b1137−b1172、b0537−b0565、b0016−b0022、b4412−b4413、b0577−b0582、b4415、b2389−b2390、b2392−b2395、b0358−b0368、b0370−b0380、b2856−b2863、b3042−b3048、b0656、b1325−b1333、b2030−b2062、b2190−b2192、b3215−b3219、b3504−b3505、b1070−b1083、b1878−b1894、b1917−b1950、b4324−b4342、b4345−b4358、b4486、b0497−b0502、b0700−b0706、b1456−b1462、b3481−b3484、b3592−b3596、b0981−b0988、b1021−b1029、b2080−b2096、b4438、b3440−b3445、b4451、b3556−b3558、b4455、b1786、b0150−b0153、及びb2945を欠失し、任意に、次のさらなる修飾:(i)b4017、b4018、及びb3643の欠失、及び(ii)b4488の982位でATジヌクレオチドの挿入を有し、インキュベーション条件は、動物由来の血清または他の動物由来の副産物を含まない最小培地中で大腸菌宿主細胞を培養することを含む。
減少ゲノム大腸菌K12株宿主において組換えCRM197を産生するための方法は、組換えCRM197タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結される減少ゲノム大腸菌宿主の周辺質へのCRM197タンパク質の移送を指向するOmpFまたはYtfQシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に融合された、CRM197タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌K12株をインキュベートし、それにより、1リットル当たり少なくとも1グラム、好ましくは少なくとも2グラムの可溶性CRM197の収量を得ることを含み、インキュベーション条件は、動物由来の血清もしくは他の動物由来の副産物を含まない最小培地中で大腸菌宿主細胞を培養することを含み、該減少ゲノム大腸菌K12株は、そこから、大腸菌K−12 MG1655株の少なくとも次のDNAセグメント:b0245−b0301、b0303−b0310、b1336−b1411、b4426−b4427、b2441−b2450、b2622−b2654、b2657−b2660、b4462、b1994−b2008、b4435、b3322−b3338、b2349−b2363、b1539−b1579、b4269−b4320、b2968−b2972、b2975−b2977、b2979−b2987、b4466−4468、b1137−b1172、b0537−b0565、b0016−b0022、b4412−b4413、b0577−b0582、b4415、b2389−b2390、b2392−b2395、b0358−b0368、b0370−b0380、b2856−b2863、b3042−b3048、b0656、b1325−b1333、b2030−b2062、b2190−b2192、b3215−b3219、b3504−b3505、b1070−b1083、b1878−b1894、b1917−b1950、b4324−b4342、b4345−b4358、b4486、b0497−b0502、b0700−b0706、b1456−b1462、b3481−b3484、b3592−b3596、b0981−b0988、b1021−b1029、b2080−b2096、b4438、b3440−b3445、b4451、b3556−b3558、b4455、b1786、b0150−b0153、b2945、b0315−b0331、b0333−b0341、b0346−b0354、b2481−b2492、b2219−b2230、b4500、b3707−b3723、b0644−b0650、b4079−4090、b4487、b4092−b4106、b0730−b0732、b3572−b3587、b1653、b2735−b2740、b2405−b2407、b3896−b3900、b1202、b4263−b4268、b0611、b2364−b2366、b0839、b0488−b0500、及びb0502を欠失し、任意に、次のさらなる修飾:(i)b4017、b4018、及びb3643の欠失、ならびに(ii)b4488の982位でATジヌクレオチドの挿入を有し、インキュベーション条件は、動物由来の血清または他の動物由来の副産物を含まない最小培地中で大腸菌宿主細胞を培養することを含む。
実施例1
減少ゲノム大腸菌宿主における不溶性CRM197の細胞質発現
CRM197は、現在、βファージの多重溶原菌、またはシュードモナスフルオレッセンスの組換えプラスミド系から発現される、コリネバクテリウムジフテリアC7の発酵によって製造される。C.ジフテリアにおけるCRM197の収量は低く(最大で約200mg/L)、バイオセーフティーレベル2(BSL2)の施設を必要とする。P.フルオレッセンスにおける産生は、高収量(約2g/L)をもたらすが、両宿主は、多くの可動性要素、潜在性(cyrptic)プロファージ、及び病原性機能を有する遺伝子残余を保持する。細菌発酵において、挿入配列(IS)要素の可動性は、関心の遺伝子を不活性化する挿入をもたらす場合がある。最終結果は、発酵不良または望ましくない切断産物の発現である場合があり、その両方が経済的に問題であり、潜在的に危険である。加えて、CRM197のその毒性親への復帰突然変異は、最悪の結果をもたらす可能性がある。CRM197の復帰突然変異は、組織培養細胞において検出された毒性活性に起因した可能性がある(Qiaoら、2008)。よって、減少した突然変異速度を有する発現系は、復帰突然変異の最低レベルのリスクと合わせた最も高い信頼性及び生産性をもたらし得る。
CRM197の高値及び供給不足に起因する唯一の最大要因は、産生に主要な大腸菌において多量のCRM197を生成する能力が歴史的にないことである。CRM197は、細菌の細胞質において発現されるとき不溶性であり、標準的な商業的大腸菌株において作製されたとき、使用前に再度折り畳むことを必要とする。比較的低量のCRM197が従来の株において産生されるため、減少ゲノム大腸菌株のMDS42が、振盪フラスコ培養において、不溶性CRM197の産生宿主として試験された。
減少ゲノムMDS42株は、国際特許公開第WO2003/070880号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載の方法により産生された。簡潔に述べると、一連の減少ゲノム株(MDS01−MDS39)は、親株の大腸菌MG1655からの核酸配列の一連の39の累積欠失(およそ14.1%のゲノム)を作製することにより産生された。K−12配列及びISデータベースの全ての配列を含有するゲノムスキャンチップ(NimbleGen Systems,Madison,WI)へのハイブリダイゼーションは、全てのIS要素を欠くように設計された第1の株であるMDS39が、予想外に、その産生中に新しい位置に転座したIS要素のさらなるコピーを含有したことを明らかにした。これらのIS要素は、MDS40を産生するために欠失された。fhuACDB(tonA遺伝子座)は、MDS41を産生するためにMDS40から欠失された。MDS01−MDS41を産生するために作製された各累積欠失の位置及び機能は、米国特許第8,178,339号(その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる)の表2に見ることができる。次いで、endA遺伝子は、MDS42を産生するためにMDS41から欠失された。MDS69を作製するために、27のさらなる核酸欠失がMDS42において作製された。MDS42及びMDS42(MDS43、MDS44、MDS69など)に基づく全ての株は、挿入配列を含まない。
不溶性CRM197を産生するために、CRM197配列においてヘアピン構造の解放をもたらすDNA配列変化を含む、修飾したCRM197配列を採用した。最適化したCRM197配列は、翻訳開始を阻害し、開始部位(ATG)及びリボソーム結合部位(RBS)の両方の認識を強化する二次構造を除去する。図1を参照されたい。
天然のCRM197シグナル配列は除去され、最適化したCRM197配列(cyto−CRM197、配列番号3)は、PCRにより増幅され、カナマイシン抵抗性カセットを含有し、クローン化した配列の発現を駆動するためにラクトース誘導性プロモーターを使用する発現ベクターpSX2内にサブクローン化された。CRM197(その天然のシグナル配列を欠く)を含有するプラスミドpSX2は、減少ゲノム大腸菌MDS42株内に形質転換され、振盪フラスコ培養において検査された。簡潔に述べると、3mlの培養物を、0.2%グルコース及び50μg/mlのカナマイシンを補充し、20mlの培養物を初期OD600=0.075に播種するために使用された、Korz最小培地(Korz DJ et al.,J.Biotechnol.,39(1):59−65(1995))中で飽和に成長させた。次に、振盪フラスコを用いて、最適レベルの不溶性細胞質CRM197を産生した成長温度及び誘導剤(IPTG)濃度を(プラスミド選択性抗生物質カナマイシンを補充した最小培地中で)決定した。最適なIPTG濃度は、250μMであると決定された。図2は、IPTGの添加前に0.5(後期誘導)のOD600に成長させた3つの別個の培養物からの全細胞タンパク質の高速遠心分離後の、全細胞タンパク質(T)ならびに可溶性画分(S)及び不溶性画分(I)を分析するタンパク質ゲルの例である。意外にも、多量のcyto−CRM197が不溶性画分に存在した(図2を参照、矢印)。タンパク質標準に対して定量したとき、振盪フラスコの結果は、OD600が200の適度の発酵において、10〜12g/Lのcyto−CRM197を予測する。減少ゲノム大腸菌宿主細胞における不溶性CRM197の産生は、従来の大腸菌株よりも10倍高かった。
実施例2
減少ゲノム大腸菌宿主における可溶性CRM197の周辺質発現
次に、減少ゲノム大腸菌株における可溶性CRM197の産生が、周辺質空間へのCRM197の発現を指向することにより試験された。CRM197は、大腸菌において可溶性形態で産生することが大層難しいと証明されている。高度に発現されたタンパク質の周辺質空間への搬出は、正しいタンパク質折り畳み及びジスルフィド架橋の形成に最適な非減少環境を提供することにより安定性を補助する。この目的のため、最高レベルのCRM197の周辺質送達を生じたシグナル配列及びシャペロンタンパク質を特定するために、いくつかの同時発現されたシャペロンタンパク質と組み合わせて、6つのシグナル配列が検証された。図3は、検証されたシグナル配列及び同時発現されたシャペロンタンパク質を図示する。検証されたシグナル配列は、3つの大腸菌分泌経路の各々からの代表的なシグナル配列を含んだ。
大腸菌をコドン最適化したCRM197オープンリーディングフレーム(ORF)(配列番号1)を、DNA2.0(Menlo Park,CA)から注文した。CRM197 ORFは、PelBシグナル配列をコードする配列が先行した。pelB及びCRM197 ORFは、pSX2発現ベクター内にクローン化するのを容易にするように設計された配列に隣接した。5’隣接配列−PelBシグナル配列−CRM197 ORF(終止コドンを含む)−3’隣接配列のヌクレオチド配列を下の表1に提供し、隣接配列は下線付きで表示され、、PelBシグナル配列をコードするヌクレオチド配列は太字、CRM197 ORFは標準文字である。
表1:pelB(太字)−CRM197ヌクレオチド配列(標準文字)+隣接配列(下線付き):
PelB−CRM197 ORFをコードするヌクレオチド配列は、pSX2ベクターへのクローン化に必要な隣接領域を生成するために、センスプライマー(GGAGATATACATATGAAATACTTGCTGCCAACC)及びアンチセンスプライマー(CTTTGTTAGCAGCCGATTAGCTTTTGATCTCAAAGAACA)を用いてDNA2.0クローンからPCR増幅された。
代替えのシグナル配列は、2または3工程PCRプロセスを使用して、CRM197 ORFに融合された。第1の工程では、シグナル配列のC末端コード領域及びCRM197のN末端コード領域の両方を網羅するセンスプライマーは、CRM197のC末端コード領域を網羅するアンチセンスプライマーと一緒に使用された。第2の工程では、シグナル配列のORFを完了するプライマーは、CRM197のC末端コード領域を網羅する同じプライマーと共に使用された。シグナル配列のN末端領域を網羅する短いプライマー及びCRM197のC末端コード領域を網羅する同じプライマーを含んだOmpA−CRM197構築物の場合では、第3の工程が使用された。大腸菌ompA及びOmpFシグナル配列をCRM197 ORFに融合するために使用されたプライマーは、以下に記載される。
大腸菌ompAコードされたシグナル配列をCRM197 ORFに融合するために以下のプライマーが使用された。工程1に関して、センスプライマー=5’−GCTACCGTAGCGCAGGCCGGTGCGGATGATGTTGTGGA−3’であり、アンチセンスプライマー=5’−CTTTGTTAGCAGCCGATTAGCTTTTGATCTCAAAGAACA−3’であった。工程2に関して、センスプライマー=5’−GGAGATATACATATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC−3’であり、アンチセンスプライマー=5’−CTTTGTTAGCAGCCGATTAGCTTTTGATCTCAAAGAACA−3’であった。工程3に関して、センスプライマー=5’−GGAGATATACATATGAAAAAGACAGCTATCG−3’であり、アンチセンスプライマー=5’−CTTTGTTAGCAGCCGATTAGCTTTTGATCTCAAAGAACA−3’であった。
ompFコードされたシグナル配列をCRM197 ORFに融合するために、以下のプライマーが使用された。工程1に関して、センスプライマー=5’−GTTAGTAGCAGGTACTGCAAACGCTGGTGCGGATGATGTTGTGGA−3’であり、アンチセンスプライマー=5’−CTTTGTTAGCAGCCGATTAGCTTTTGATCTCAAAGAACA−3’であった。工程2に関して、センスプライマー=5’−GGAGATATACATATGATGAAGCGCAATATTCTGGCAGTGATCGTCCCTGCTCTGTTAGTAGCAGGTACTGCAAACGCT−3’であり、アンチセンスプライマー=5’−CTTTGTTAGCAGCCGATTAGCTTTTGATCTCAAAGAACA−3’であった。
完了したシグナル配列−CRM197 PCR産物をpSX2発現ベクター内にクローン化した。シグナル配列−CRM197 PCR産物の末端は、pSX2ベクターの配列と重複する15bpの配列を保有した。pSX2ベクターは、クローン化反応を容易にするために、制限酵素Kpn I及びSac Iで直線化された。クローン化反応は、組換えpSX2発現ベクターを生成するためにIS609のさらなる欠失を有する、MDS42、MDS42recA、またはMDS42recA内に形質転換された。シグナル配列−CRM197領域及び隣接ベクター配列は、配列分析により検証された。
図3(B)に図示されるシグナル配列とCRM197配列(その天然のシグナル配列を欠く)との組み合わせを含有するプラスミドpSX2は、減少ゲノム大腸菌MDS42株またはMDS42recA株(recA遺伝子の欠失を有するMDS42株(recA1819対立遺伝子))内に形質転換され、振盪フラスコ培養において検査された。シグナル配列及びシャペロンタンパク質に加えて、検査された培養評価項目は、温度、誘導剤(IPTG)濃度、及び誘導剤が添加された時間点(初期[0.01のOD600nm]または後期[約0.4のOD600nm])を含んだ。以下の条件は、CRM197の周辺質分泌に最適であると決定され、これらの条件は、後続の実験:(i)37℃で短時間のインキュベーションが先行する(例えば、2時間)、約25℃の温度での成長、(ii)後期誘導(約0.4のOD600でIPTGを添加)、及び(iii)15〜35μM(cyto−CRM197の最適な発現に必要とされる約1/10)の誘導剤(IPTG)濃度において使用された。
簡潔に述べると、3mlの培養物を、0.2%グルコース及び50μg/mlのカナマイシンを補充し、20mlの培養物を初期OD600=0.075に播種するために使用された、Korz最小培地中で飽和に成長させた。20mlの培養物(125mlのバッフル付きErlenmeyerフラスコにおいて)を、37℃の振盪インキュベータ(250rpm)内に2時間設置した。次に、培養物を25℃の振盪インキュベータに移動し、OD600が0.3〜0.4になるまで監視した。その時点で、IPTGを示される濃度で添加した。誘導された培養物を一晩、25Cの振盪インキュベータ内でインキュベートした。誘導合計時間は18〜22時間であった。誘導後、培養物のOD600が決定された。2OD単位を表す培養物のアリコートを、周辺質試料を作製するためにプロセスした。周辺質試料は、周辺質化緩衝液(Periplasting Buffer)(Epicentre,Madison,WI)の補助により調製された。1.5mlのエッペンドルフチューブ中で10分間、7500×gで遠心分離することにより、2OD試料を採取した。上清を取り除き、細胞ペレットを50μlの周辺質化緩衝液(200mMのトリス−HCl[pH7.5]、20%スクロース、1mMのEDTA、及び30U/μlのReady−Lyseリゾチーム)中に穏やかに再懸濁した。室温で5分後、50μlの氷冷水を迅速に再懸濁ペレットに添加した。混合物を、15分間4000×gで遠心分離することによりスフェロプラストから周辺質画分を分取する前に、氷上で5分間インキュベートした。周辺質画分を代表する上清をSDS−PAGE分析用に調製した。1レーンにつき、0.12OD単位と等しい量を充填した。
CRM197の周辺質内への最大分泌をもたらす最も良好なシグナル配列及び誘導特徴を図4に示す。周辺質シグナルOmpA及びOmpFは、周辺質へのCRM197の最大移送を容易にすることが分かった。3つの同時発現されたシャペロンタンパク質のいずれも周辺質送達に異なって影響を与えなかった(例示的な発現が図4のYccAと、及びそれなしで比較されたとき)。OmpA及びOmpFはほぼ類似する量の周辺質CRM197をもたらすように思われたため、OmpA−CRM197は、後続の実験に使用された。
ompA及びompFを含むsec−依存性経路の成分の発現は、カタボライト抑制を受ける可能性があるため、ompA−CRM197の産生に対する炭素源としてのグリセロールの影響は、上述の条件下で、振盪フラスコ培養において、減少ゲノム大腸菌MDS42株のグルコースと比較された。図5に図示されるように、グリセロールを補充した最小培地は、グルコースと比較して、劇的に低いレベルのCRM197発現をもたらした。したがって、グルコースは、全ての後続の実験において炭素源として使用された。
次に、いくつかの異なる減少ゲノム大腸菌宿主細胞における周辺質CRM197の産生が比較された。よって、MDS42株またはMDS69株のいずれかの背景内の一連の欠失は、(i)細胞代謝を最適化した欠失、または(ii)CRM197発現に悪影響を及ぼす可能性があるプロテアーゼ(例えば、Blon)を除去またはそのレベルを減少させる欠失のいずれかを含有するMDS42に関して上述される最適な条件に基づき、振盪フラスコ培養において、周辺質(可溶性)CRM197の産生に対するそれらの作用について検査された。MDS42に基づく次の減少ゲノム大腸菌株が試験された:MDS42recA、MDS42metab、及びMDS42Blon/metab。MDS42metabは、(i)iclR(b番号b4018、NCBI Entrez GeneID番号948524で記載される)及びarpA遺伝子(b番号b4017、NCBI Entrez GeneID番号944933で記載される)を欠失させる、(ii)rph遺伝子(b3643)を欠失させる(それにより、下流pyrE遺伝子の転写レベルを増加させる)、ならびに(iii)982位でのATジヌクレオチドの挿入によって(活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIの発現をもたらす)ilvGフレームシフト突然変異を補正することにより作製された。MDS42Blon/metabは、MDS42metabに関して記載される修飾、ならびにIS挿入が祖先大腸菌lonプロモーターの−35領域を−10領域から分離する、B株大腸菌のlonプロモーター領域の配列を摸倣するために、lonプロテアーゼ(b0439)プロモーター領域の修飾を含有する。MDS69に基づく次の減少ゲノム大腸菌株が試験された:MDS69metab(MDS42metabに関して上述されるように修飾されたMDS69株)、MDS69Blon/metab(Blonプロテアーゼ修飾を含むようにさらに変更されたMDS69metab、MDS69lpp/metab(リポタンパク質lppを欠失するようにさらに修飾されたMDS69metab(b1677)、及びMDS69Blon/lpp/metab(Blonプロテアーゼ修飾及びリポタンパク質lpp遺伝子欠失の両方を含むようにさらに修飾されたMDS69metab)。
図6は、これらの株におけるOmpA−CRM197発現を比較する。検査した8つの株のうち、最高レベルのCRM197発現は、代謝活性(代謝株)の強化を目的とした欠失を含有したこれらの株(MDS42またはMDS69背景のいずれかの上で)において明らかであった。しかしながら、意外にも、試験した全ての株が全細胞タンパク質調製物(図6のパネルA及びC)におけるタンパク質ゲルでも明らかであった大量の周辺質CRM197(図6のパネルB及びD)を含有した。重要なことに、これらの結果は、プロテアーゼ欠失Blonが代謝株においてCRM197レベルに影響を与えなかったことを示す。加えて、その不在によりsec−依存性周辺質輸送系を「解放する」と考えられた非常に多数のリポタンパク質タンパク質Lppの除去は、周辺質CRM197レベルに影響を与えないことも分かった。これらの実験からの培地は、誘導後に単離され、CRM197放出に関して検査された。CRM197は、検査したどの株の培地においても特定されなかった。表2は、最高周辺質CRM197発現レベルを生成したMDS株の収量結果の要約である。これらの結果は、同じゲル上で実行されたタンパク質標準と共に示される4つの株からのCRM197の染色強度を比較することによって得られた。振盪フラスコ値は、100または200OD600のいずれかに達する発酵におけるCRM197の量を予測するために外挿された。表2に示される4つの株は、典型的には、流加発酵において300のODに達し、これらの株が従来の株において現在可能であるよりもはるかに多くのCRM197を生成する能力を有することを示唆する。
CRM197は、高品質のCRM197産生の誘発を提供したタンパク質分解切断に高度に感受性である(Bishai et al.,J.Bacteriol.,169:5140−51(1987);Recombinant Production of Carrier Proteins,GEN News,Dec.1,2012)。別個の実験一式では、周辺質CRM197の産生は、減少ゲノム大腸菌株からのプロテアーゼ遺伝子の標的除去が周辺質におけるCRM197の増加をもたらすかを決定するために、一連のプロテアーゼ欠失株において検査された。よって、次のプロテアーゼコード遺伝子が組み合わせで別個に欠失された:degP(b0161)、prc(b1830)、htpX(b1829)、ならびにlonプロモーター領域の一部分。個々に、または組み合わせのいずれかでのプロテアーゼ遺伝子の欠失は、CRM197の発現レベルに影響を与えなかった。プロテアーゼ遺伝子の特定の組み合わせを欠失するように修飾された減少ゲノム大腸菌MDS42株がCRM197の周辺質発現に対して作用がなかったことを図示する図7を参照されたい。このデータは、MDS42またはMDS69に基づく減少ゲノム大腸菌株において産生されたとき、おそらくこれらの株における低レベルのプロテアーゼ活性により、CRM197のタンパク質分解切断が生じないことを示す。
実施例3
流加発酵におけるCRM197産生
次に、減少ゲノム大腸菌株におけるCRM197株の商業規模の拡大が検査された。よって、MDS42代謝株におけるOmpA−CRM197は、10リットル規模の既定最小培地中で流加発酵に供された。発酵条件は、0.18ODに播種された37℃でのバッチ相を含み、バッチ培地中の1%グルコースが消費されるまで(約7.5時間)成長させた。流加相は、バッチ培地がグルコースを枯渇したときに生じるDOスパイクにより誘引された。供給は、重量測定法で制御された0.3Mu(1/時間)の成長速度をもたらすように指数関数的供給速度で開始された(約12.5時間)。誘導点は、利用可能なリン酸塩がほぼ枯渇した時点であるように決定された。誘導点約2時間前の時点で、温度を25℃に変更し、供給速度を、0.2Mu(1/時間)の成長速度をもたらす速度に下げた。誘導剤(100uM)が添加されたら、約7時間の間、1時間当り80gのグルコースが添加されるように、供給を一定速度に変更した。発酵OD600は300に近づき、図8に図示されるように、非常に高レベルの周辺質標的CRM197を生成した。最適な条件での第2の発酵は、試験発酵において高レベルの一貫性を示す約2g/Lの周辺質CRM197レベルをもたらした。
上述の結果は、振盪フラスコ及び10Lの流加発酵の両方において、MDS42及びMDS69などの減少ゲノム大腸菌産生宿主において得られた可溶性CRM197の驚くべき収量を示す。
予備発酵分析中に観察された問題の1つは、全細胞タンパク質単離におけるCRM197の可溶性形態の減少であった。周辺質単離方法は、大規模には適用できないため、可溶性CRM197単離の一般方法が開発された。初期実験は、不溶性であった従来の全細胞タンパク質(TCP)単離後に観察されたCRM197が可溶性形態で単離することができるかを判断するために行われた。よって、MDS42recA株におけるOmpA−CRM197は、上述の10リットル規模の既定最小培地中で流加発酵に供された(37℃でのインキュベーション、続いて誘導剤の添加前の25℃での短期間のインキュベーションを含む)。多量の周辺質CRM197を含有する細胞は、全細胞タンパク質(TCP)を単離するために、市販の非イオン性洗剤系緩衝液での標準的な洗剤消化に供された。全細胞タンパク質の試料を高速(21kg)で10分間遠心分離し、可溶性画分を単離した。TCPの試料及び可溶性画分を分析した。図9のパネルAに図示されるように、CRM197の可溶性周辺質形態は、洗剤の均質化により完全に不溶性となった。逆に、周辺質調製物(上述のように)は、高速遠心分離に供されたとき、周辺質CRM197は、予想通り、可溶性形態を維持した。図9のパネルBを参照されたい。
不溶性のCRM197の画分を回収する試みにおいて、洗剤系の細菌細胞溶解は、洗剤溶解と比較してCRM197を生成するための産生レベルのプラットホームのより助けとなり、商業的規模拡大プロセスにおいて周辺質を単離する必要性を排除するであろう細胞溶解の機械的方法と比較された。加えて、溶解は、下の表3に記載されるタンパク質の溶解を強化することが知られる化学剤の存在下で行われた。
表3:溶解方法及び溶解剤のリスト
超音波処理及び微細流動化は50mMのトリスHCl緩衝液(pH8)中で行われ、全ての溶解方法はリゾチームとベンゾナーゼとの商業混合物であるLysonase(商標)(Novagen,Darmstadt,Germany)の存在下で実行された。次に、表3に列記される薬剤の各々は、別個の調製物において試験された。図10は、洗剤または機械的溶解により行われた一連の単離の例である。可溶性CRM197は、洗剤溶解を用いて得ることができず、溶解剤を含んだ洗剤溶解を用いた、可溶性CRM197のわずかな増加のみが明らかであった。グリセロール及びスクロースは、洗剤単独と比較したとき、可溶性画分に見られた可溶性CRM197の量を多少高めた(図10のパネルA)。しかしながら、機械的溶解は、可溶性画分において、CRM197のレベルを劇的に増加させた。実際、CRM197レベルの劇的な増加は、超音波処理(図10のパネルB)または微細流動化が使用されたか否かに関わらず、機械的溶解に供された全試料からの可溶性画分において明らかであった。さらに、機械的溶解後に得られた可溶性CRM197の量は、溶解剤によって著しく異ならなかった(表3の他の全ての薬剤と「薬剤なし」を比較)。機械的溶解方法から生成された結果の取りまとめは、MDS42におけるCRM197(短い37℃でのインキュベーション、続いて25℃での成長、及び25〜35μMのIPTGでの後期段階誘導を含む培養条件を使用)が7.2〜8.3%の全細胞タンパク質及び6.3〜7.7%の可溶性タンパク質を含むことを示唆する。これらの結果は、機械的溶解が大規模な商業的発酵に使用される細胞破砕の標準的な方法であり、多量の可溶性CRM197を生成する能力を暗示するため、興味深い。
前述のデータに基づき、可溶性CRM197を生成するための好適な商業的プロトコルは、細胞が低速遠心分離によって回収され、好適な緩衝液(例えば、50mMのトリス−HCl緩衝液、pH約8)中で、機械的手段により(例えば、超音波処理または微細流動化)溶解される、周辺質シグナル配列(例えば、ompAまたはompFによりコードされる)に融合されたCRM197コード配列をコードする発現ベクターを保有する減少ゲノム大腸菌宿主の25℃での発酵を含む。残渣を除去するために遠心分離した後、可溶性CRM197は、次に、上清から単離される。振盪フラスコ中で、培養物を25℃及び25〜35mMのIPTGでインキュベートし、95〜100%のCRM197を可溶性形態で単離した。
ompA−CRM197融合を含有する発現ベクターを保有する減少ゲノム大腸菌MDS69 metab株を用いた(上述のように)発酵の結果の要約は、下の表4に示される。これらの発酵は、既定最小培地及び対数成長後期での誘導剤IPTGの添加を用いた流加条件下で生じた。発酵規模は10リットルであった。誘導剤の濃度を変更することにより、周辺質CRM197の量は0.5から約2g/Lに増加した。
図11は、100μMの誘導剤濃度を採用する発酵の詳細を図示する。全細胞タンパク質(TCP)単離物を可溶性(Sol)及び不溶性(Insol)画分と比較するこの発酵からのゲルは、発酵中、可溶性CRM197の強固な発現を明らかに示した(図12を参照)。
減少ゲノム大腸菌宿主株の流加発酵における可溶性CRM197の産生に最適な条件は以下の通りであった。温度に関して、37℃でインキュベーションすることにより、バッチ相において成長を開始させ、続いて誘導剤(この場合、IPTG)の添加前に20〜25℃に温度を変更することが最適であった。最適なpH範囲は6.5〜7.5(例えば、6.5、7.0、または7.5)である。最適な誘導剤濃度は100〜250μMのIPTGである(成長の後期対数期中に添加された)。培地条件に関して、最小培地条件は適切であると判断され、費用削減の利点及び動物由来の産物を含まない既定条件を有する。重要なことには、従来の大腸菌株は、最小培地中で盛んに成長しない。これらの最適な条件を採用することにより、少なくとも4g/Lの可溶性CRM197の標的収量が減少ゲノム大腸菌宿主株(例えば、MDS42またはMDS69)を用いた10L規模の発酵において確実に産生され得ると推定される。
実施例4
CRM197の下流プロセシング
減少ゲノム大腸菌におけるCRM197の産生及び機械的溶解後、CRM197は精製され得る。CRM197が発酵条件下でMDS69 metabから産生されたかを判断するために、疎水性相互作用クロマトグラフィー(フェニルセファロース)と陰イオン交換クロマトグラフィー(DEAE−セルロース)との組み合わせを使用して、小規模の精製が行われた。図11に示される50OD単位の28時間発酵試料は、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)の溶液中で、微細流動化装置(MF)を用いて均質化に供された。得られた均質物を、10分間21,000gで遠心分離し、可溶性及び不溶性(IS)画分を単離した。ウエスタンブロット及びジフテリア毒素(DPX)に対してポリクローナル抗体を用いて、CRM197が可溶性画分において非常に豊富であることが分かった(図13のパネルAは、3つの濃度(0.1、0.07、及び0.04OD)での、微細流動化装置(MF)及び再懸濁不溶性(IS)画分を、プレカラム可溶性画分と比較する)。可溶性画分(25OD等価)を濾過し(0.45μm)、13%(wt/vol)硫酸アンモニウムとし、10mMの塩化ナトリウム、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)で予め平衡化されたフェニルセファロースカラム(フェニルセファロースHP HiTrap,General Electric)上に充填した。0.6Mの硫酸アンモニウム、6mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を用いてカラムを洗浄し、CRM197を低塩条件(10mMの塩化ナトリウム、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.5)下で溶出した。次に、5つの2.5mLの溶出した画分を抗DPXウエスタンブロット及びタンパク質染色により分析した(図13のパネルA、10mM NaClと表示されたレーン)。小量の未プロセスCRM197(図13のパネルA、矢印)は、主の溶出した試料から離れて精製され、蒸留水で最終洗浄された。次に、図13のパネルAにおいて丸が付けられた画分をプールし、蒸留水で1:2に希釈し、10mMの塩化ナトリウム、10mMのリン酸ナトリウム(pH7.5)で平衡化されている、1mlのDEAE sepharose fast flow(Pharmacia)を含有するカラム上に充填した。試料を充填し、通過液を回収した後、カラムを3容量の50mMの塩化ナトリウム、0.5mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)で洗浄した。増加塩化ナトリウム濃度:100mMのNaCl(2回、3ml)、1MのNaCl(3ml)、及び1.5MのNaCl(3ml)を用いてCRM197を溶出した。SDS−PAGE分析は、最も高純度の可溶性CRM197が1MのNaClを用いて溶出されたことを明らかにしたが、かなりの量が尚もカラムに結合されたままであった。
これらの結果は、減少ゲノム大腸菌宿主株において産生されたCRM197が非常に可溶性であり、既存の精製方法を用いて高純度に単離され得ることを示す。
実施例5
野生型株と比較した減少ゲノム大腸菌宿主におけるCRM197産生
減少ゲノム大腸菌株におけるCRM197の周辺質産生が類似する条件下で野生型大腸菌株におけるCRM197の産生と比較された。よって、CRM197大腸菌BLR(DE3)がOmpA−CRM197融合を保有するpSX2ベクターで形質転換され、周辺質産生が評価され、減少ゲノム大腸菌MDS42recA株におけるCRM197の周辺質産生と比較された。発酵条件は上述の通りであった。37℃での短い成長開始相の後、0.2%グルコース(及びBLR(DE3に関しては31μg/mlのイソロイシン)培養物)を補充したKorz培地中で、細胞を25℃で19時間成長させた。CRM197の発現は、15または25mM IPTGを用いて、OD=0.3で誘導された。
図14に図示されるように、周辺質CRM197の産生において少なくとも約5倍の増加が野生型B株と比較して減少ゲノム大腸菌宿主において観察された。
さらなる実験は、OmpF−CRM197融合が、OmpA−CRM197融合と比較して、減少ゲノム大腸菌宿主において多量の可溶性周辺質CRM197を実際にもたらしたことを明らかにした。減少ゲノム大腸菌宿主MDS69 metab株及びMDS69 lowmut株(polB(b0060)、dinB(b0231)、及びumuDC(b1183−b1184)の欠失をさらに含むMDS69株)は、OmpF−CRM197融合をコードする発現ベクターで形質転換され、CRM197の周辺質発現は、同じ条件下で、OmpA−CRM197融合をコードする発現ベクターを保有するMDS69 lowmut宿主における発現と比較された。37℃での短い成長開始相の後、0.2%グルコースを補充したKorz培地中で、細胞を25℃で23時間成長させた。CRM197の発現は、25または35mMのIPTGを用いて、OD=0.3〜0.34で誘導された。周辺質タンパク質を単離し、各株における可溶性CRM197の発現を分析した。図15に図示されるように、OmpA−CRM197構築物と比較して、高収量のCRM197がOmpF−CRM197構築物で得られた。
実施例6
減少ゲノム大腸菌株における様々なシグナル配列を用いたCRM197産生試験
シグナル配列は、周辺質画分の2Dゲル分析によって決定されるように、大腸菌B株及びK株の周辺質におけるそれらの存在量に基づき選択された(Han,Mee−Jung et al.,Journal of Bioscience and Bioengineering,117(4):437−442(2014))。表5は、選択されたシグナル配列及びB株及びK株の周辺質におけるそれらの相対的存在量を列挙する。
表5及び図17に図示されるシグナル配列及びCRM197配列(その天然のシグナル配列を欠く)の組み合わせを含有するプラスミドpSX2(MglB、MalE、OppA、RbsB、Agp、FkpA、YtfQ、HdeA、HdeBまたはGlnH;OmpF及びOmpCも試験された)は、減少ゲノム大腸菌MDS69 metab株(図18〜21においてT69 Meta)内に形質転換され、振盪フラスコ培養において検査された。上述のように、MDS69 metabは、MDS69背景上に次の修飾:(i)iclR(b番号b4018、NCBI Entrez GeneID番号948524で記載)及びarpA遺伝子(b番号b4017、NCBI Entrez GeneID番号944933で記載)の欠失、(ii)rph遺伝子(b3643)の欠失、ならびに(iii)982位でのATジヌクレオチドの挿入によるilvGフレームシフト突然変異の補正を含む。簡潔に述べると、スターター培養物を生成するために、MOPS最小培地−カナマイシン(MMM/Kan)−グルコース条痕板からの形質転換した細菌のコロニー形成単位を、0.2%グルコース及び50μg/mlのカナマイシンを補充した3mlのKorz最小培地中に再懸濁し、37℃で一晩インキュベートした。スターター培養物は、125mlのErlenmeyerフラスコに20mlのKorz/0.2%グルコース/KanをOD600=0.05となるように播種し、37℃で1.5時間成長させ、次いで25℃に変更し、OD600が約0.3になるまで成長させるために使用された。その時点で、誘導剤(IPTG)を25μM、35μM、または50μMの濃度で添加した(後期誘導)。次に、後期誘導を25℃で20時間成長させ、2ODの培養物を採取した。BugBuster+Lysonaseを用いて全細胞タンパク質を調製し、震央周辺質化方法(Epicentre Periplasting Method)を用いて周辺質及びスフェロプラスト画分を調製した。
図_18〜20は、それぞれ、示されるシグナル配列(誘導A−OmpF、MalE、HdeA、OppA、HdeB、GlnH;誘導B−OmpF、MglB、Agp、OmpC、RbsB、FkpA、YtfQ)を用いた、25μM、35μM、または50μMの誘導剤濃度での(可溶性)CRM197の周辺質収量を示す。25μMの誘導剤濃度での全てのシグナル配列で、良好な収量が得られた(図18)。興味深いことに、35μMの誘導剤濃度で、YtfQシグナル配列を用いたCRM197の収量は、他の試験したシグナル配列を用いた、この誘導剤濃度で得られたCRM197の収量に対して大幅に増加した(図19)。この作用は、50μMの誘導剤濃度でさらにより顕著になり、CRM197の収量は高いままであり、一方他の試験したシグナル配列を用いたCRM197の収量は、この誘導剤濃度で大幅に減少した(図20)。よって、CRM197とYtfQシグナル配列との組み合わせは、試験した他のシグナル配列とのCRM197の組み合わせよりも大幅に広い誘導範囲を有すると判断された。
YtfQシグナル配列を用いたCRM197の誘導範囲をさらに評価するために、上述の方法に従い、各々8つのIPTG(誘導剤)レベルの2つの培養物を、MDS69 metab(0、25、35、50、75、100、150、及び250μM)において試験した。対照として、CRM197及びOmpFシグナル配列を用いたMDS69 metabに関して、各々4つのIPTGレベルの2つの培養物も試験した(0、25、35、50μM)。全細胞タンパク質(TCP)及びキャリパーの周辺質分析用の2OD試料を回収した。
各誘導剤レベルに関して試験した2つの培養物の平均結果を図21に図示する。YtfQシグナル配列(YtfQ−CRM197)との組み合わせでのCRM197の収量は、最大100μMの全誘導剤レベルにわたって高いままであった。しかしながら、OmpFとの組み合わせでのCRM197の収量は、25及び35μMの誘導剤濃度でのみ高かった。図22は、50μMのIPTG(OmpF)ならびに50、75、100、150、及び250μMのIPTG(YtfQ)での、周辺質(P)及び培地(M)におけるCRM197収量に対するOmpF及びYtfQシグナル配列の作用を比較するタンパク質ゲルである。意外にも、YtfQシグナル配列に関して、大量の周辺質CRM197が50、75、及び100μMの誘導剤濃度で明らかであったが、OmpF配列に関して、非常に少量の周辺質CRM197が50μMの誘導剤濃度で存在した。
簡潔に述べると、スターター培養物を生成するために、MOPS最小培地−カナマイシン(MMM/Kan)−グルコース条痕板からの形質転換した細菌のコロニー形成単位を、0.2%グルコース及び50μg/mlのカナマイシンを補充した3mlのKorz最小培地中に再懸濁し、37℃で一晩インキュベートした。スターター培養物は、125mlのErlenmeyerフラスコに20mlのKorz/0.2%グルコース/KanをOD600=0.05となるように播種し、37℃で1.5時間成長させ、次いで25℃に変更し、OD600が約0.3になるまで成長させるために使用された。その時点で、誘導剤(IPTG)を25μM、35μM、または50μMの濃度で添加した(後期誘導)。次に、後期誘導を25℃で20時間成長させ、2ODの培養物を採取した。BugBuster+Lysonaseを用いて全細胞タンパク質を調製し、震央周辺質化方法を用いて周辺質及びスフェロプラスト画分を調製した。
次に、MDS69 metabにおけるOmpFまたはYtfQのいずれかのシグナル配列との組み合わせ、及び大腸菌B株(BL21DE3)におけるOmpFとの組み合わせのCRM197収量に対する、非常に後期誘導(OD600約2)の作用を評価した。簡潔に述べると、25℃のスターター培養物を生成するために、0.2%グルコース及び50μg/mlのカナマイシニン(Kanamycinin)を補充した3mlのKorz最小培地を、形質転換したMDS69 metabまたはBL21DE3のコロニー形成単位を播種し、37℃で一晩インキュベートし、0.2%グルコース及び50μg/mlのカナマイシニン(Kanamycinin)を補充した15mlのKorz最小培地を125mlのErlenmeyerフラスコに播種し、これを25℃で一晩成長させるために使用した。スターター培養物を使用して、90mlのKorz/0.2%グルコース/カナマイシンを500mlのErlenmeyerフラスコにOD600=0.1となるように播種し、続いてOD600>2となるまで25℃で成長させ(飽和またはほぼ飽和)、次に、様々なIPTG濃度で誘導するために(非常に後期誘導)、125mlのErlenmeyerフラスコの4×20のアリコートに分けた。誘導物を25℃で20時間成長させ、2ODの培養物を分析用に採取した。BugBuster+Lysonaseを用いて全細胞タンパク質(TCP)を調製した。震央周辺質化方法を用いて周辺質及びスフェロプラスト画分を調製した。図23に示されるように、最大100μMのIPTGまでの良好な周辺質発現は、MDS69 metabにおけるCRM197とOmpFシグナル配列との組み合わせに関して観察され、これは、200mMの誘導剤濃度で減少し、おそらく不溶性に起因する。良好な周辺質発現は、最大400μMのIPTG(試験された最高濃度)までのMDS69 metabにおけるCRM197とYtfQシグナル配列との組み合わせに関して観察され、不溶性CRM197は観察されなかった。弱い発現は、試験された全誘導剤濃度(25〜200μM)で、BL21(DE3)株におけるCRM197とOmpFの組み合わせに関して観察された。CRM197はスフェロプラストにおいて観察されなかった。
要約−示されるデータは、減少ゲノム大腸菌宿主における可溶性CRM197の産生が従来の方法によって得られる収量の10倍である収量を送達したことを示す。減少ゲノム大腸菌宿主における産生は、効率を増大し、製造費用を削減することが予想される。さらに、減少ゲノム大腸菌宿主における産生は、非減少ゲノムを用いた従来の細菌において産生されたものよりも清浄で安全でもある。これらの改善は、薬学的タンパク質製品の産生に広く影響し、最終的には、それらを必要するリスクがある集団のワクチンへのアクセスを広げるだろう。さらに、CRM197の高収量は、幅広い範囲のシグナル配列との組み合わせで観察された。CRM197との組み合わせでYtfQシグナル配列において観察された幅広い誘導範囲は、YtfQがK株大腸菌と比較したB株大腸菌において非常に多い量で見出され、例示的な減少ゲノム株がK株に基づくため、意外であった。減少ゲノム大腸菌におけるYtfQとの組み合わせでのCRM197の幅広い誘導範囲は、誘導剤の濃度がタンパク質の産生中に変えることができ、したがって、これらの宿主におけるCRM197との組み合わせでのYtfQシグナル配列の使用がCRM197の収量のさらなる増加をもたらすため、大きな利点である。

Claims (26)

  1. 減少ゲノム大腸菌宿主において組換えCRM197を産生するための方法であって、前記組換えCRM197タンパク質の発現に好適な条件下で、周辺質へのCRM197タンパク質の移送を指向するompA、ompFまたはytfQシグナル配列に融合された、前記CRM197タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌をインキュベートし、それにより、1リットル当たり少なくとも1グラムの可溶性CRM197の収量を得ることを含み、前記ヌクレオチド配列は、発現制御配列に動作可能に連結されており、天然の親大腸菌株が、K−12株であり、ここで、前記減少ゲノム大腸菌宿主は、大腸菌K−12 MG1655株の少なくとも次のDNAセグメント:b0245−b0301、b0303−b0310、b1336−b1411、b4426−b4427、b2441−b2450、b2622−b2654、b2657−b2660、b4462、b1994−b2008、b4435、b3322−b3338、b2349−b2363、b1539−b1579、b4269−b4320、b2968−b2972、b2975−b2977、b2979−b2987、b4466−4468、b1137−b1172、b0537−b0565、b0016−b0022、b4412−b4413、b0577−b0582、b4415、b2389−b2390、b2392−b2395、b0358−b0368、b0370−b0380、b2856−b2863、b3042−b3048、b0656、b1325−b1333、b2030−b2062、b2190−b2192、b3215−b3219、b3504−b3505、b1070−b1083、b1878−b1894、b1917−b1950、b4324−b4342、b4345−b4358、b4486、b0497−b0502、b0700−b0706、b1456−b1462、b3481−b3484、b3592−b3596、b0981−b0988、b1021−b1029、b2080−b2096、b4438、b3440−b3445、b4451、b3556−b3558、b4455、b1786、b0150−b0153、及びb2945、又は、別の大腸菌K−12株における対応するDNAセグメントの欠失を含む、方法。
  2. 前記天然の親大腸菌株が、K−12株 MG1655である、請求項1に記載の方法。
  3. 1リットル当たり少なくとも2グラムの可溶性CRM197の収量が得られる、請求項1または2に記載の方法。
  4. 前記シグナル配列が、OmpFまたはYtfQである、請求項1に記載の方法。
  5. 前記シグナル配列が、YtfQである、請求項4に記載の方法。
  6. 前記減少ゲノム大腸菌が、そこから、前記大腸菌K−12 MG1655株の少なくとも次のDNAセグメント:b0315−b0331、b0333−b0341、b0346−b0354、b2481−b2492、b2219−b2230、b4500、b3707−b3723、b0644−b0650、b4079−4090、b4487、b4092−b4106、b0730−b0732、b3572−b3587、b1653、b2735−b2740、b2405−b2407、b3896−b3900、b1202、b4263−b4268、b0611、b2364−b2366、b0839、b0488−b0500、及びb0502をさらに欠失している、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記減少ゲノム大腸菌が、MDS42株である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記減少ゲノム大腸菌が、MDS69株である、請求項6に記載の方法。
  9. 前記減少ゲノム大腸菌が、機能recA(b2699)遺伝子を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記減少ゲノム大腸菌が、relA遺伝子であって、前記relA遺伝子のコード配列の547または548位に少なくとも1つの点突然変異を有するrelA遺伝子を含み、前記突然変異が、547位でのG→A突然変異、547位でのG→T突然変異、548位でのC→G突然変異、または548位でのC→T突然変異のうちの1つ以上から選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記減少ゲノム大腸菌が、機能polB(b0060)、機能dinB(b0231)、及び機能umuDC(b1183−b1184)遺伝子の1つ以上を欠く、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記減少ゲノム大腸菌が、挿入配列を含まない、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記CRM197ヌクレオチド配列が、前記大腸菌宿主細胞における発現のために最適化される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
  14. (a)前記減少ゲノム大腸菌を成長させることと、
    (b)CRM197の発現を誘導することと、を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記方法が、発酵装置内で実行される、請求項14に記載の方法。
  16. 以下のうちの1つ以上:(1)工程(a)が、前記減少ゲノム大腸菌を37℃で最大19時間成長させ、続いて工程(b)の前及び後で、約20〜30℃で成長させることを含む、(2)工程(a)及び(b)が、血清、酵母抽出物、または他の動物由来の副産物を含まない成長培地中で行われる、(3)工程(a)において、pHが、6.5〜7.5の範囲である、ならびに/あるいは(4)pHが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、またはヒスチジン緩衝液を用いて維持される、を含む、請求項14または15に記載の方法。
  17. 前記緩衝液が、リン酸緩衝液である、請求項16に記載の方法。
  18. 発現が、工程(b)において、好適な量のIPTGを添加することによって誘導される、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 発現が、200〜275のOD600で誘導される、請求項14〜18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記発酵装置が、0.5〜50,000リットルの培養物を含む、請求項15〜19のいずれか一項に記載の方法。
  21. (c)洗剤の不在下で、前記培養した減少ゲノム大腸菌細胞を機械的に破砕し、前記得られた細胞溶解物を遠心分離して、可溶性画分を得る、さらなる工程を含む、請求項14〜20のいずれか一項に記載の方法。
  22. CRM197が、1つ以上の精製工程により、前記可溶性画分から精製される、請求項21に記載の方法。
  23. 前記1つ以上の精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び/または陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項22に記載の方法。
  24. 前記精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項23に記載の方法。
  25. 前記減少ゲノム大腸菌が、機能recA(b2699)遺伝子を欠く、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
  26. 周辺質へのCRM197タンパク質の移送を指向するompA、ompFまたはytfQシグナル配列に融合された、前記CRM197タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌宿主であって、前記ヌクレオチド配列は、発現制御配列に動作可能に連結されており、天然の親大腸菌株が、K−12株であり、ここで、前記減少ゲノム大腸菌宿主は、大腸菌K−12 MG1655株の少なくとも次のDNAセグメント:b0245−b0301、b0303−b0310、b1336−b1411、b4426−b4427、b2441−b2450、b2622−b2654、b2657−b2660、b4462、b1994−b2008、b4435、b3322−b3338、b2349−b2363、b1539−b1579、b4269−b4320、b2968−b2972、b2975−b2977、b2979−b2987、b4466−4468、b1137−b1172、b0537−b0565、b0016−b0022、b4412−b4413、b0577−b0582、b4415、b2389−b2390、b2392−b2395、b0358−b0368、b0370−b0380、b2856−b2863、b3042−b3048、b0656、b1325−b1333、b2030−b2062、b2190−b2192、b3215−b3219、b3504−b3505、b1070−b1083、b1878−b1894、b1917−b1950、b4324−b4342、b4345−b4358、b4486、b0497−b0502、b0700−b0706、b1456−b1462、b3481−b3484、b3592−b3596、b0981−b0988、b1021−b1029、b2080−b2096、b4438、b3440−b3445、b4451、b3556−b3558、b4455、b1786、b0150−b0153、及びb2945、又は、別の大腸菌K−12株における対応するDNAセグメントの欠失を含む、減少ゲノム大腸菌宿主。
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