JP6636661B2 - 大腸菌における組換えcrm197の産生強化 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年3月3日に出願された米国仮出願第61/947,234号の利益を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
減少ゲノム大腸菌宿主において組換えCRM197を産生するための方法であって、前記組換えCRM197タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結された周辺質へのCRM197タンパク質の移送を指向するシグナル配列に融合された、前記CRM197タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌をインキュベートし、それにより、1リットル当たり少なくとも1グラムの可溶性CRM197の収量を得ることを含み、前記天然の親大腸菌株が、K12株、好ましくはK12 MG1655である、前記方法。
(項目2)
1リットル当たり少なくとも2グラム、1リットル当たり少なくとも3グラム、1リットル当たり少なくとも4グラム、または1リットル当たり少なくとも5グラムの可溶性CRM197の収量が得られる、項目1に記載の前記方法。
(項目3)
前記シグナル配列が、OmpA、OmpF、MglB、MalE、OppA、RbsB、Agp、FkpA、YtfQ、HdeA、HdeB、OmpC、及びGlnHシグナル配列からなる群から選択される、項目2に記載の前記方法。
(項目4)
前記シグナル配列が、OmpFまたはYtfQである、項目3に記載の前記方法。
(項目5)
前記シグナル配列が、YtfQである、項目4に記載の前記方法。
(項目6)
前記減少ゲノム大腸菌が、大腸菌株MG1655より約2%〜約40%小さい、好ましくは約5%〜約30%小さいように遺伝子操作されるゲノムを有する、項目1〜5のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目7)
前記減少ゲノム大腸菌が、そこから、前記大腸菌K−12株MG1655の少なくとも次のDNAセグメント:b0245−b0301、b0303−b0310、b1336−b1411、b4426−b4427、b2441−b2450、b2622−b2654、b2657−b2660、b4462、b1994−b2008、b4435、b3322−b3338、b2349−b2363、b1539−b1579、b4269−b4320、b2968−b2972、b2975−b2977、b2979−b2987、b4466−4468、b1137−b1172、b0537−b0565、b0016−b0022、b4412−b4413、b0577−b0582、b4415、b2389−b2390、b2392−b2395、b0358−b0368、b0370−b0380、−b2856−b2863、b3042−b3048、b0656、b1325−b1333、b2030−b2062、b2190−b2192、b3215−b3219、b3504−b3505、b1070−b1083、b1878−b1894、b1917−b1950、b4324−b4342、b4345−b4358、b4486、b0497−b0502、b0700−b0706、b1456−b1462、b3481−b3484、b3592−b3596、b0981−b0988、b1021−b1029、b2080−b2096、b4438、b3440−b3445、b4451、b3556−b3558、b4455、b1786、b0150−b0153、及びb2945を欠失している、項目6に記載の前記方法。
(項目8)
前記減少ゲノム大腸菌が、そこから、前記大腸菌K−12 MG1655株の少なくとも次のDNAセグメント:b0315−b0331、b0333−b0341、b0346−b0354、b2481−b2492、b2219−b2230、b4500、b3707−b3723、b0644−b0650、b4079−4090、b4487、b4092−b4106、b0730−b0732、b3572−b3587、b1653、b2735−b2740、b2405−b2407、b3896−b3900、b1202、b4263−b4268、b0611、b2364−b2366、b0839、b0488−b0500、及びb0502をさらに欠失している、項目7に記載の前記方法。
(項目9)
前記減少ゲノム大腸菌が、MDS42株である、項目7に記載の前記方法。
(項目10)
前記減少ゲノム大腸菌が、MDS69株である、項目8に記載の前記方法。
(項目11)
前記減少ゲノム大腸菌が、機能recA(b2699)遺伝子を含む、項目1〜10のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目12)
前記減少ゲノム大腸菌が、relA遺伝子であって、前記relA遺伝子のコード配列の547または548位に少なくとも1つの点突然変異を有するrelA遺伝子を含み、前記突然変異が、547位でのG→A突然変異、547位でのG→T突然変異、548位でのC→G突然変異、または548位でのC→T突然変異のうちの1つ以上から選択される、項目1〜11のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目13)
前記減少ゲノム大腸菌が、機能polB(b0060)、dinB(b0231)、及び任意にumuDC(b1183−b1184)遺伝子を欠く、項目1〜12のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目14)
前記減少ゲノム大腸菌が、以下の修飾:(i)オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を強化するためのrph遺伝子の欠失、(ii)活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生するための、ilvG遺伝子における天然−2フレームシフト突然変異を補完する突然変異の導入、ならびに(iii)iclR及びarpA遺伝子の欠失を含む、項目1〜13のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目15)
前記減少ゲノム大腸菌が、挿入配列を含まない、項目1〜14のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目16)
前記CRM197ヌクレオチド配列が、前記大腸菌宿主細胞における発現のために最適化される、項目1〜15のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目17)
(a)前記減少ゲノム大腸菌を成長させることと、
(b)CRM197の発現を誘導することと、を含む、項目1〜16のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目18)
前記方法が、発酵装置内で実行される、項目17に記載の前記方法。
(項目19)
工程(a)が、前記減少ゲノム大腸菌を37℃で最大19時間成長させ、続いて工程(b)の前及び後で、約20〜30℃、好ましくは約25℃で成長させることを含む、項目17または18に記載の前記方法。
(項目20)
工程(a)及び(b)が、血清、酵母抽出物、または他の動物由来の副産物を含まない成長培地中で行われる、項目17〜19のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目21)
工程(a)において、pHが、6.5〜7.5の範囲である、項目18〜21のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目22)
前記pHが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、またはヒスチジン緩衝液を用いて維持される、項目17〜21のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目23)
前記緩衝液が、リン酸緩衝液である、項目22に記載の前記方法。
(項目24)
発現が、工程(b)において、好適な量のIPTGを添加することによって誘導される、項目17〜23のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目25)
発現が、100〜400、好ましくは200〜275、より好ましくは230〜250のOD600で誘導される、項目18〜24のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目26)
前記発酵装置が、0.5〜50,000リットルの培養物を含む、項目18〜25のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目27)
(c)洗剤の不在下で、前記培養した減少ゲノム大腸菌細胞を機械的に破砕し、前記得られた細胞溶解物を遠心分離して、可溶性画分を得る、さらなる工程を含む、項目17〜26のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目28)
前記機械的破砕が、超音波処理または微細流動化を含む、項目27に記載の前記方法。
(項目29)
CRM197が、1つ以上の精製工程により、前記可溶性画分から精製される、項目27または28に記載の前記方法。
(項目30)
前記1つ以上の精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び/または陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、項目29に記載の前記方法。
(項目31)
前記精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、項目30に記載の前記方法。
(項目32)
CRM197タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に融合されず、それにより、1リットル当たり約2グラム〜1リットル当たり約20グラムの不溶性CRM197の収量が得られる、項目1に記載の前記方法。
(項目33)
前記不溶性CRM197が、1つ以上の可溶化工程に供される、項目32に記載の前記方法。
(項目34)
CRM197タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、ompFまたはytfQシグナル配列に融合され、前記減少ゲノム大腸菌宿主が、次の修飾:(i)前記大腸菌K−12 MG1655株の次のDNAセグメント:b0245−b0301、b0303−b0310、b1336−b1411、b4426−b4427、b2441−b2450、b2622−b2654、b2657−b2660、b4462、b1994−b2008、b4435、b3322−b3338、b2349−b2363、b1539−b1579、b4269−b4320、b2968−b2972、b2975−b2977、b2979−b2987、b4466−4468、b1137−b1172、b0537−b0565、b0016−b0022、b4412−b4413、b0577−b0582、b4415、b2389−b2390、b2392−b2395、b0358−b0368、b0370−b0380、b2856−b2863、b3042−b3048、b0656、b1325−b1333、b2030−b2062、b2190−b2192、b3215−b3219、b3504−b3505、b1070−b1083、b1878−b1894、b1917−b1950、b4324−b4342、b4345−b4358、b4486、b0497−b0502、b0700−b0706、b1456−b1462、b3481−b3484、b3592−b3596、b0981−b0988、b1021−b1029、b2080−b2096、b4438、b3440−b3445、b4451、b3556−b3558、b4455、b1786、b0150−b0153、及びb2945の欠失、(ii)オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を強化するためのrph遺伝子の欠失、(iii)活性アセトヒドロキシ酸シンターゼIIを産生するための、ilvG遺伝子における天然−2フレームシフト突然変異を補完する突然変異の導入、ならびに(iv)iclR及びarpA遺伝子の欠失を含み、
それにより、1リットル当たり少なくとも1グラム、好ましくは1リットル当たり少なくとも2グラムの可溶性CRM197の収量が得られる、項目1に記載の前記方法。
(項目35)
前記減少ゲノム大腸菌宿主が、そこから、前記大腸菌K−12 MG1655株の少なくとも次のDNAセグメント:b0315−b0331、b0333−b0341、b0346−b0354、b2481−b2492、b2219−b2230、b4500、b3707−b3723、b0644−b0650、b4079−4090、b4487、b4092−b4106、b0730−b0732、b3572−b3587、b1653、b2735−b2740、b2405−b2407、b3896−b3900、b1202、b4263−b4268、b0611、b2364−b2366、b0839、b0488−b0500、及びb0502をさらに欠失している、項目34に記載の前記方法。
(項目36)
発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌宿主であって、前記発現ベクターが、前記大腸菌周辺質へのCRM197の輸送を指向することが可能なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする5’シグナル配列部分と、その天然のシグナル配列を欠く前記CRM197タンパク質をコードする3’CRM197部分と、を含む核酸配列を含む、前記減少ゲノム大腸菌宿主。
減少ゲノム大腸菌宿主における不溶性CRM197の細胞質発現
CRM197は、現在、βファージの多重溶原菌、またはシュードモナスフルオレッセンスの組換えプラスミド系から発現される、コリネバクテリウムジフテリアC7の発酵によって製造される。C.ジフテリアにおけるCRM197の収量は低く(最大で約200mg/L)、バイオセーフティーレベル2(BSL2)の施設を必要とする。P.フルオレッセンスにおける産生は、高収量(約2g/L)をもたらすが、両宿主は、多くの可動性要素、潜在性(cyrptic)プロファージ、及び病原性機能を有する遺伝子残余を保持する。細菌発酵において、挿入配列(IS)要素の可動性は、関心の遺伝子を不活性化する挿入をもたらす場合がある。最終結果は、発酵不良または望ましくない切断産物の発現である場合があり、その両方が経済的に問題であり、潜在的に危険である。加えて、CRM197のその毒性親への復帰突然変異は、最悪の結果をもたらす可能性がある。CRM197の復帰突然変異は、組織培養細胞において検出された毒性活性に起因した可能性がある(Qiaoら、2008)。よって、減少した突然変異速度を有する発現系は、復帰突然変異の最低レベルのリスクと合わせた最も高い信頼性及び生産性をもたらし得る。
減少ゲノム大腸菌宿主における可溶性CRM197の周辺質発現
次に、減少ゲノム大腸菌株における可溶性CRM197の産生が、周辺質空間へのCRM197の発現を指向することにより試験された。CRM197は、大腸菌において可溶性形態で産生することが大層難しいと証明されている。高度に発現されたタンパク質の周辺質空間への搬出は、正しいタンパク質折り畳み及びジスルフィド架橋の形成に最適な非減少環境を提供することにより安定性を補助する。この目的のため、最高レベルのCRM197の周辺質送達を生じたシグナル配列及びシャペロンタンパク質を特定するために、いくつかの同時発現されたシャペロンタンパク質と組み合わせて、6つのシグナル配列が検証された。図3は、検証されたシグナル配列及び同時発現されたシャペロンタンパク質を図示する。検証されたシグナル配列は、3つの大腸菌分泌経路の各々からの代表的なシグナル配列を含んだ。
流加発酵におけるCRM197産生
次に、減少ゲノム大腸菌株におけるCRM197株の商業規模の拡大が検査された。よって、MDS42代謝株におけるOmpA−CRM197は、10リットル規模の既定最小培地中で流加発酵に供された。発酵条件は、0.18ODに播種された37℃でのバッチ相を含み、バッチ培地中の1%グルコースが消費されるまで(約7.5時間)成長させた。流加相は、バッチ培地がグルコースを枯渇したときに生じるDOスパイクにより誘引された。供給は、重量測定法で制御された0.3Mu(1/時間)の成長速度をもたらすように指数関数的供給速度で開始された(約12.5時間)。誘導点は、利用可能なリン酸塩がほぼ枯渇した時点であるように決定された。誘導点約2時間前の時点で、温度を25℃に変更し、供給速度を、0.2Mu(1/時間)の成長速度をもたらす速度に下げた。誘導剤(100uM)が添加されたら、約7時間の間、1時間当り80gのグルコースが添加されるように、供給を一定速度に変更した。発酵OD600は300に近づき、図8に図示されるように、非常に高レベルの周辺質標的CRM197を生成した。最適な条件での第2の発酵は、試験発酵において高レベルの一貫性を示す約2g/Lの周辺質CRM197レベルをもたらした。
CRM197の下流プロセシング
減少ゲノム大腸菌におけるCRM197の産生及び機械的溶解後、CRM197は精製され得る。CRM197が発酵条件下でMDS69 metabから産生されたかを判断するために、疎水性相互作用クロマトグラフィー(フェニルセファロース)と陰イオン交換クロマトグラフィー(DEAE−セルロース)との組み合わせを使用して、小規模の精製が行われた。図11に示される50OD単位の28時間発酵試料は、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)の溶液中で、微細流動化装置(MF)を用いて均質化に供された。得られた均質物を、10分間21,000gで遠心分離し、可溶性及び不溶性(IS)画分を単離した。ウエスタンブロット及びジフテリア毒素(DPX)に対してポリクローナル抗体を用いて、CRM197が可溶性画分において非常に豊富であることが分かった(図13のパネルAは、3つの濃度(0.1、0.07、及び0.04OD)での、微細流動化装置(MF)及び再懸濁不溶性(IS)画分を、プレカラム可溶性画分と比較する)。可溶性画分(25OD等価)を濾過し(0.45μm)、13%(wt/vol)硫酸アンモニウムとし、10mMの塩化ナトリウム、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)で予め平衡化されたフェニルセファロースカラム(フェニルセファロースHP HiTrap,General Electric)上に充填した。0.6Mの硫酸アンモニウム、6mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を用いてカラムを洗浄し、CRM197を低塩条件(10mMの塩化ナトリウム、10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.5)下で溶出した。次に、5つの2.5mLの溶出した画分を抗DPXウエスタンブロット及びタンパク質染色により分析した(図13のパネルA、10mM NaClと表示されたレーン)。小量の未プロセスCRM197(図13のパネルA、矢印)は、主の溶出した試料から離れて精製され、蒸留水で最終洗浄された。次に、図13のパネルAにおいて丸が付けられた画分をプールし、蒸留水で1:2に希釈し、10mMの塩化ナトリウム、10mMのリン酸ナトリウム(pH7.5)で平衡化されている、1mlのDEAE sepharose fast flow(Pharmacia)を含有するカラム上に充填した。試料を充填し、通過液を回収した後、カラムを3容量の50mMの塩化ナトリウム、0.5mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)で洗浄した。増加塩化ナトリウム濃度:100mMのNaCl(2回、3ml)、1MのNaCl(3ml)、及び1.5MのNaCl(3ml)を用いてCRM197を溶出した。SDS−PAGE分析は、最も高純度の可溶性CRM197が1MのNaClを用いて溶出されたことを明らかにしたが、かなりの量が尚もカラムに結合されたままであった。
野生型株と比較した減少ゲノム大腸菌宿主におけるCRM197産生
減少ゲノム大腸菌株におけるCRM197の周辺質産生が類似する条件下で野生型大腸菌株におけるCRM197の産生と比較された。よって、CRM197大腸菌BLR(DE3)がOmpA−CRM197融合を保有するpSX2ベクターで形質転換され、周辺質産生が評価され、減少ゲノム大腸菌MDS42recA株におけるCRM197の周辺質産生と比較された。発酵条件は上述の通りであった。37℃での短い成長開始相の後、0.2%グルコース(及びBLR(DE3に関しては31μg/mlのイソロイシン)培養物)を補充したKorz培地中で、細胞を25℃で19時間成長させた。CRM197の発現は、15または25mM IPTGを用いて、OD=0.3で誘導された。
減少ゲノム大腸菌株における様々なシグナル配列を用いたCRM197産生試験
シグナル配列は、周辺質画分の2Dゲル分析によって決定されるように、大腸菌B株及びK株の周辺質におけるそれらの存在量に基づき選択された(Han,Mee−Jung et al.,Journal of Bioscience and Bioengineering,117(4):437−442(2014))。表5は、選択されたシグナル配列及びB株及びK株の周辺質におけるそれらの相対的存在量を列挙する。
Claims (26)
- 減少ゲノム大腸菌宿主において組換えCRM197を産生するための方法であって、前記組換えCRM197タンパク質の発現に好適な条件下で、周辺質へのCRM197タンパク質の移送を指向するompA、ompFまたはytfQシグナル配列に融合された、前記CRM197タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌をインキュベートし、それにより、1リットル当たり少なくとも1グラムの可溶性CRM197の収量を得ることを含み、前記ヌクレオチド配列は、発現制御配列に動作可能に連結されており、天然の親大腸菌株が、K−12株であり、ここで、前記減少ゲノム大腸菌宿主は、大腸菌K−12 MG1655株の少なくとも次のDNAセグメント:b0245−b0301、b0303−b0310、b1336−b1411、b4426−b4427、b2441−b2450、b2622−b2654、b2657−b2660、b4462、b1994−b2008、b4435、b3322−b3338、b2349−b2363、b1539−b1579、b4269−b4320、b2968−b2972、b2975−b2977、b2979−b2987、b4466−4468、b1137−b1172、b0537−b0565、b0016−b0022、b4412−b4413、b0577−b0582、b4415、b2389−b2390、b2392−b2395、b0358−b0368、b0370−b0380、b2856−b2863、b3042−b3048、b0656、b1325−b1333、b2030−b2062、b2190−b2192、b3215−b3219、b3504−b3505、b1070−b1083、b1878−b1894、b1917−b1950、b4324−b4342、b4345−b4358、b4486、b0497−b0502、b0700−b0706、b1456−b1462、b3481−b3484、b3592−b3596、b0981−b0988、b1021−b1029、b2080−b2096、b4438、b3440−b3445、b4451、b3556−b3558、b4455、b1786、b0150−b0153、及びb2945、又は、別の大腸菌K−12株における対応するDNAセグメントの欠失を含む、方法。
- 前記天然の親大腸菌株が、K−12株 MG1655である、請求項1に記載の方法。
- 1リットル当たり少なくとも2グラムの可溶性CRM197の収量が得られる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記シグナル配列が、OmpFまたはYtfQである、請求項1に記載の方法。
- 前記シグナル配列が、YtfQである、請求項4に記載の方法。
- 前記減少ゲノム大腸菌が、そこから、前記大腸菌K−12 MG1655株の少なくとも次のDNAセグメント:b0315−b0331、b0333−b0341、b0346−b0354、b2481−b2492、b2219−b2230、b4500、b3707−b3723、b0644−b0650、b4079−4090、b4487、b4092−b4106、b0730−b0732、b3572−b3587、b1653、b2735−b2740、b2405−b2407、b3896−b3900、b1202、b4263−b4268、b0611、b2364−b2366、b0839、b0488−b0500、及びb0502をさらに欠失している、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記減少ゲノム大腸菌が、MDS42株である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記減少ゲノム大腸菌が、MDS69株である、請求項6に記載の方法。
- 前記減少ゲノム大腸菌が、機能recA(b2699)遺伝子を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記減少ゲノム大腸菌が、relA遺伝子であって、前記relA遺伝子のコード配列の547または548位に少なくとも1つの点突然変異を有するrelA遺伝子を含み、前記突然変異が、547位でのG→A突然変異、547位でのG→T突然変異、548位でのC→G突然変異、または548位でのC→T突然変異のうちの1つ以上から選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記減少ゲノム大腸菌が、機能polB(b0060)、機能dinB(b0231)、及び機能umuDC(b1183−b1184)遺伝子の1つ以上を欠く、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記減少ゲノム大腸菌が、挿入配列を含まない、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CRM197ヌクレオチド配列が、前記大腸菌宿主細胞における発現のために最適化される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- (a)前記減少ゲノム大腸菌を成長させることと、
(b)CRM197の発現を誘導することと、を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。 - 前記方法が、発酵装置内で実行される、請求項14に記載の方法。
- 以下のうちの1つ以上:(1)工程(a)が、前記減少ゲノム大腸菌を37℃で最大19時間成長させ、続いて工程(b)の前及び後で、約20〜30℃で成長させることを含む、(2)工程(a)及び(b)が、血清、酵母抽出物、または他の動物由来の副産物を含まない成長培地中で行われる、(3)工程(a)において、pHが、6.5〜7.5の範囲である、ならびに/あるいは(4)pHが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、またはヒスチジン緩衝液を用いて維持される、を含む、請求項14または15に記載の方法。
- 前記緩衝液が、リン酸緩衝液である、請求項16に記載の方法。
- 発現が、工程(b)において、好適な量のIPTGを添加することによって誘導される、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 発現が、200〜275のOD600で誘導される、請求項14〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発酵装置が、0.5〜50,000リットルの培養物を含む、請求項15〜19のいずれか一項に記載の方法。
- (c)洗剤の不在下で、前記培養した減少ゲノム大腸菌細胞を機械的に破砕し、前記得られた細胞溶解物を遠心分離して、可溶性画分を得る、さらなる工程を含む、請求項14〜20のいずれか一項に記載の方法。
- CRM197が、1つ以上の精製工程により、前記可溶性画分から精製される、請求項21に記載の方法。
- 前記1つ以上の精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び/または陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項23に記載の方法。
- 前記減少ゲノム大腸菌が、機能recA(b2699)遺伝子を欠く、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 周辺質へのCRM197タンパク質の移送を指向するompA、ompFまたはytfQシグナル配列に融合された、前記CRM197タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌宿主であって、前記ヌクレオチド配列は、発現制御配列に動作可能に連結されており、天然の親大腸菌株が、K−12株であり、ここで、前記減少ゲノム大腸菌宿主は、大腸菌K−12 MG1655株の少なくとも次のDNAセグメント:b0245−b0301、b0303−b0310、b1336−b1411、b4426−b4427、b2441−b2450、b2622−b2654、b2657−b2660、b4462、b1994−b2008、b4435、b3322−b3338、b2349−b2363、b1539−b1579、b4269−b4320、b2968−b2972、b2975−b2977、b2979−b2987、b4466−4468、b1137−b1172、b0537−b0565、b0016−b0022、b4412−b4413、b0577−b0582、b4415、b2389−b2390、b2392−b2395、b0358−b0368、b0370−b0380、b2856−b2863、b3042−b3048、b0656、b1325−b1333、b2030−b2062、b2190−b2192、b3215−b3219、b3504−b3505、b1070−b1083、b1878−b1894、b1917−b1950、b4324−b4342、b4345−b4358、b4486、b0497−b0502、b0700−b0706、b1456−b1462、b3481−b3484、b3592−b3596、b0981−b0988、b1021−b1029、b2080−b2096、b4438、b3440−b3445、b4451、b3556−b3558、b4455、b1786、b0150−b0153、及びb2945、又は、別の大腸菌K−12株における対応するDNAセグメントの欠失を含む、減少ゲノム大腸菌宿主。
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