JP7296449B2 - 変異体RpoCコード配列を含む核酸分子 - Google Patents
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Description
また、いくつかの例では、変異体RpoCは、(1)配列番号28を含むN末端ドメイン、(2)配列番号29を含む中央ドメイン、及び(3)配列番号30を含むC末端ドメインを含む。R47C置換は、N末端ドメイン内に存在する。
また、いくつかの例では、変異体RpoCは、配列番号27を含む。
本開示の別の態様によれば、上記核酸分子を含む組換え微生物が開示される。
本開示の別の態様によれば、組換え微生物における対象ベクターのコピー数を調節するための方法が開示される。この方法は、対象ベクターの複製に十分な条件下において培養培地中で組換え微生物を培養することにより対象ベクターのコピー数を調節することを含む。
本明細書で使用される場合、ベクターという用語は、自然に、又はプラスミド、ウイルスベクター、コスミド、又は人工染色体などの微生物への導入によって微生物中に存在し得る核酸分子を意味する。
いくつかの例において、変異体RpoCの発現は、配列番号26を含む野生型RpoCの発現と比較して、プラスミドのコピー数を減少させる。参考までに、配列番号26は大腸菌の野生型RpoCに相当する。上記のように、変異体RpoCは1種のRpoCであるため、転写、染色体の複製、及びプラスミドの複製において役割を果たす。また、上記のように、R47C置換を含み、それ以外は大腸菌の野生型RpoCと同一である変異体RpoCは、プラスミドコピー数を、例えば、約25%~75%減少させる。いくつかの例において、変異体RpoCの発現は、配列番号26を含む野生型RpoCの発現と比較して、プラスミドのコピー数を10%~80%、例えば、25%~75%、30%~70%、35%~65%、40%~60%、45%~55%、10%~40%、20%~50%、30%~60%、40%~70%、又は50%~80%減少させる。
したがって、いくつかの例では、変異体RpoCは、(1)配列番号28を含むN末端ドメイン、(2)配列番号29を含む中央ドメイン、及び(3)配列番号30を含むC末端ドメインを含み、R47C置換は、上記のように、N末端ドメイン内に存在する。いくつかの例では、変異体RpoCは、(1)配列番号31を含むN末端ドメイン、(2)配列番号32を含む中央ドメイン、及び(3)配列番号33を含むC末端ドメインを含み、R47C置換は、上記のように、N末端ドメイン内に存在する。いくつかの例では、変異体RpoCは、上記のように、配列番号27と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、変異体RpoCは、上記のように、配列番号27を含む。
実施例1:染色体上のrpoC配列を置換するためのプラスミドの構築
(1)rpoCフラグメント及びsacBベクターの調製。
実施例:1-(1)に記載の第1の0.5kbDNAフラグメント、第2の0.5kbDNAフラグメント、及びsacBベクターカットを、pJSL47の構築に使用した。pJSL47プラスミドは、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB製)及びColi Genetic Stock Center(CGSC)の7636株であるBW25113を使用して構築された。
大腸菌LS5218の染色体上のrpoC(配列番号7)を変異体poC配列(配列番号1)で置換するために、pJSL47プラスミドをエレクトロポレーションにより大腸菌株LS5218に導入し、続いて50mg/Lのカナマイシンを含むルリア-ベルターニ(LB)寒天プレート上で増殖した単一コロニーを選択した。選択したコロニーの染色体へのpJSL47の挿入を、配列番号8及び配列番号9のプライマーを使用するPCRによって確認した。sacB遺伝子及びR6K起点を二次選択(「pop-out」)するために、選択した株を、NaClを含まないが、10%スクロースを含むLB寒天プレート上で増殖させた。形質転換体を、LS5218rpoC(配列番号7)が変異体poC配列(配列番号1)に置換されているかについて、PCR及び配列確認によって確かめた。正しい遺伝子型を有する得られた株を大腸菌CC06-9642と命名した。
野生型株であるLS5218及び株CC06-9642の両方には、F-様プラスミド(67,502bp)が含まれている。CC06-9642を作出した後、F-様プラスミドの存在をPCR法で確認した。使用したプライマーは、例えば、配列番号10及び11のものであった。CC06-9642が作出されたとき、CC06-9637も作出された。これらの違いは、CC06-9642にはF-様プラスミドが含まれるが、CC06-9637には含まれないことである。CC06-9637のRpoCも変異体rpoCである。
(1)RepFICフラグメント及びカナマイシン耐性遺伝子フラグメントの調製。
RepFICレプリコン(配列番号14)を含む5.2kbのDNAフラグメントを増幅するために、大腸菌株LS5218のゲノムDNA(gDNA)を、QIAGEN Genomic-tipシステムを使用して抽出し、上記gDNAをテンプレートとして用い、PfuUltra II Fusion HS DNAポリメラーゼ(Agilent社製)を使用してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施した。PCRは、配列番号15及び配列番号16のプライマーを使用して、95℃で30秒間の変性、56℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で5分間の伸長を30サイクル行った。
大腸菌LS5218のRepFICレプリコンと比較して1つのヌクレオチド置換を含み、プラスミドコピー数の増加をもたらす改変されたRepFICレプリコン(配列番号19)が得られた。改変されたRepFICレプリコン(配列番号19)を含む5.2kbのDNAフラグメントを増幅するために、大腸菌LS5218のgDNAをテンプレートとして用い、PfuUltra II Fusion HS DNAポリメラーゼを使用してPCRを行った。PCRは、配列番号15及び配列番号20のプライマーを使用して、95℃で30秒間の変性、56℃で30秒間のアニーリング、72℃で3分間の伸長を30サイクル行った。配列番号21及び配列番号16のプライマーを使用して、72℃で2分30秒間伸長するために別のPCRを行った。
実施例3-(1)に記載のRepFICフラグメント及びKanRフラグメントを、pJSL48と呼ばれるプラスミドの構築に使用した。pJSL48プラスミドは、図7A~Bに示すように、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB製)を使用して構築された。
プラスミドコピー数を測定するために、プラスミドpJSL48及びpJSL49を大腸菌LS5218に導入し、大腸菌株CC06-9665及びCC06-9666を得た。プラスミドpJSL48及びpJSL49をCC06-9642にも導入し、それぞれ大腸菌株CC06-9638及びCC06-9639を得た。
細胞サンプル中のプラスミドのコピー数を、プラスミド上のマーカーDNA配列、RepFICレプリコンの相対的な存在量から、β-ガラクトシダーゼをコードする1コピーの染色体遺伝子lacZのコピー数と比較して推定した。RepFICに使用したプライマーは配列番号10及び配列番号11であった。lacZに使用したプライマーは配列番号12及び配列番号13であった。カナマイシン耐性遺伝子に使用したプライマーは配列番号22及び配列番号23であった。
R47C置換を含む変異体RpoCをコードする変異体rpoCコード鎖を含む核酸分子を含むように形質転換された大腸菌株を上記のように調製し、大腸菌CC06-9637と命名したものを、2018年6月15日に、ブダペスト条約に基づく国際寄託機関である韓国微生物保存センターに、アクセッション番号KCCM12276Pとして寄託した。この株は、ブダペスト条約の下で国際寄託機関によって寄託されている。
Claims (13)
- 変異体rpoC RNAポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質コード配列(変異体rpoCコード配列)を含む核酸分子であって、
変異体rpoCコード配列は、変異体RpoC RNAポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質(変異体RpoC)をコードし、
変異体RpoCはR47C置換を含み、R47C置換の番号付けは、大腸菌の野生型RpoC RNAポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質(野生型RpoC)に基づいて定義され、
変異体RpoCは、配列番号27と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、
変異体RpoCの発現は、配列番号26を含む野生型RpoCの発現と比較して、プラスミドのコピー数を減少させる、核酸分子。 - 変異体RpoCは、
(1)配列番号28を含むN末端ドメイン、
(2)配列番号29を含む中央ドメイン、及び
(3)配列番号30を含むC末端ドメインを含み、
R47C置換は、N末端ドメイン内に存在する、請求項1に記載の核酸分子。 - 変異体RpoCは、
(1)配列番号31を含むN末端ドメイン、
(2)配列番号32を含む中央ドメイン、及び
(3)配列番号33を含むC末端ドメインを含み、
R47C置換は、N末端ドメイン内に存在する、請求項1に記載の核酸分子。 - 変異体RpoCは、配列番号27を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の核酸分子を含む組換え微生物。
- 組換え微生物は、形質転換、接合、又は形質導入のうちの1つ以上によって、前記核酸分子を含むrpoCコード配列ベクターを前駆体微生物に導入することにより調製されるか、又は
組換え微生物は染色体を含み、変異体rpoCコード配列は、変異体rpoCコード配列による内因性rpoCコード配列の置換に基づいて染色体に存在する、請求項6に記載の組換え微生物。 - 組換え微生物は、エシェリキア(Escherichia)属の細菌又は大腸菌種の細菌のうちの1つ以上から調製されたものである、請求項6に記載の組換え微生物。
- 請求項6~8のいずれか一項に記載の組換え微生物における対象ベクターのコピー数を調節する方法であって、対象ベクターの複製に十分な条件下において培養培地中で組換え微生物を培養することを含み、組換え微生物における変異体RpoCの発現が、対象ベクターのコピー数を調節する方法。
- 請求項6~8のいずれか一項に記載の組換え微生物を使用することにより標的産物を作製する方法であって、組換え微生物は、標的遺伝子ベクターを含み、標的遺伝子ベクターは、標的産物を作製するための標的遺伝子を含み、前記方法は、
(1)組換え微生物が標的遺伝子を発現する条件下において培養培地中で組換え微生物を培養することにより、標的産物を作製するステップ、及び
(2)組換え微生物及び/又は培養培地から標的産物を回収するステップを含む方法。 - 標的産物は、(i)標的RNA、(ii)標的タンパク質、(iii)標的生体材料、(iv)標的ポリマー、その前駆体、及び/又はその生産のための酵素、(v)標的甘味料、その前駆体、及び/又はその生産のための酵素、(vi)標的油、その前駆体、及び/又はその生産のための酵素、(vii)標的脂肪、その前駆体、及び/又はその生産のための酵素、(viii)標的多糖類、その前駆体、及び/又はその生産のための酵素、(ix)標的アミノ酸、その前駆体、及び/又はその生産のための酵素、(x)標的ヌクレオチド、その前駆体、及び/又はその生産のための酵素、(xi)標的ワクチン、その前駆体、及び/又はその生産のための酵素、又は(xii)標的医薬品、その前駆体、及び/又はその生産のための酵素のうちの1つ以上を含む、請求項10に記載の方法。
- 標的産物は、(i)標的ポリマー、その前駆体、及び/又はその生産のための酵素、又は(ii)標的生体高分子、その前駆体、及び/又はその生産のための酵素のうちの1つ以上を含む、請求項10に記載の方法。
- 変異体rpoCコード配列及び遺伝子置換配列を含む遺伝子置換ベクターであって、
変異体rpoCコード配列は、配列番号28を含む変異体RpoCのN末端ドメインをコードし、
遺伝子置換配列は、微生物の染色体内の内因性rpoCコード配列を変異体rpoCコード配列で置換するための、遺伝子置換ベクター。
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