WO2022201917A1 - 大腸菌を用いた外来タンパク質の製造方法 - Google Patents

大腸菌を用いた外来タンパク質の製造方法 Download PDF

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coli
gene
protein
strain
seq
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来佳 山際
智久 ▲徳▼永
陶三 西山
和信 水口
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株式会社カネカ
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a foreign protein using E. coli.
  • Various hosts are used for the production of recombinant proteins using genetic recombination technology.
  • animal cells such as CHO (Chinese Hamster Ovary) cells
  • microorganisms such as Escherichia coli and yeast.
  • Microorganisms have the advantage of being able to produce target proteins in a short time and at a low cost compared to animal cells.
  • Escherichia coli is one of the most studied microorganisms, and is frequently used in protein production because it proliferates in a short time and is easy to handle.
  • proteins are generally produced intracellularly. ) must be recovered. Especially when cell disruption is involved, it is necessary to purify the target protein from various and large amounts of host-derived substances, and these post-treatment steps greatly affect the production cost of the target protein.
  • Contamination of proteins derived from host cells can be reduced by using a method that selectively releases the contents of the periplasm without releasing the contents of the cytoplasm for foreign proteins. Therefore, the process of purifying foreign proteins is easier than the process of purifying them from the cytoplasm.
  • the periplasm is an oxidizing environment, it is known that expressing a foreign protein in the periplasm facilitates the formation of intramolecular and intermolecular disulfide bonds and the associated functional expression of the foreign protein. Due to the above circumstances, techniques for expressing foreign proteins in the periplasm are widely used in protein production (eg, Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
  • the method of expressing the foreign protein of interest in E. coli and extracting the foreign protein from the periplasm of E. coli is widely used. Different efficiencies are known. Therefore, a technique for efficiently obtaining foreign proteins from E. coli is desired regardless of their molecular weight and the like.
  • the present invention provides a method for producing a protein using E. coli, which enables efficient extraction and purification of the foreign protein of interest after localizing it in the E. coli periplasm. for the purpose.
  • a method for producing a protein comprising the following steps (a) to (c): (a) introducing a gene encoding a foreign protein of interest into Escherichia coli in which a gene related to maintenance of the outer membrane structure has been modified; (b) a step of culturing the E. coli of (a); and (c) a step of recovering the foreign protein of interest from the periplasmic fraction of the cultured cells.
  • the gene associated with maintenance of the outer membrane structure is selected from the group consisting of pal, lpp, ompA, tolA, mepS, nlpI, arcA, bamD, cyoA, dppA, ecnB, mrcA, mrcB, oppA and slyB;
  • the method according to (1) wherein at least one of (3) Two or more genes selected from the group consisting of pal, lpp, ompA, tolA, mepS, nlpI, arcA, bamD, cyoA, dppA, ecnB, mrcA, mrcB, oppA and slyB of the E.
  • coli are modified.
  • the method according to (6), wherein the modification is partial mutation of the signal sequence.
  • the method according to (6), wherein the modification is partial mutation of a structural gene.
  • a method for producing a protein using Escherichia coli which enables efficient extraction and purification of the protein after localizing the target foreign protein in the Escherichia coli periplasm. It is possible to provide
  • the method for producing protein of the present invention is characterized by including the following steps (a) to (c). (a) introducing a gene encoding a foreign protein of interest into Escherichia coli in which a gene related to maintenance of the outer membrane structure has been modified; (b) a step of culturing the E. coli of (a); and (c) a step of recovering the foreign protein of interest from the periplasmic fraction of the cultured cells.
  • the method of the present invention is a method capable of efficiently recovering the expressed foreign protein of interest localized in the periplasm of E. coli by providing the above characteristics.
  • the term "foreign protein” means a protein that is encoded by a gene that has been integrated from outside the host cell and that is not normally expressed in a non-transformed host cell.
  • the Escherichia coli strain used in the method for producing the protein of the present invention is a genetically modified strain, but the Escherichia coli strain that serves as the basis is not particularly limited, and is known.
  • E. coli strains can be used.
  • the B strain or a strain derived from the B strain, or the K12 strain or a strain derived from the K12 strain can be preferably used.
  • the HB101 strain which is a hybrid strain of the B and K12 strains, can be used.
  • strains derived from the B strain for example, the BL21 strain and the REL606 strain are known.
  • strains derived from the K12 strain W3110 strain, DH10B strain, BW25113 strain, DH5 ⁇ strain, MG1655 strain, JM109 strain, RV308 strain and the like are known.
  • the E. coli strain used in the method of the present invention is a genetically modified strain in which one or more genes related to maintenance of outer membrane structure have been modified.
  • the term "outer membrane formation-related gene” refers to a gene associated with the maintenance of the outer membrane structure of E. coli. More specifically, the "outer membrane formation-related gene” is a gene of E. coli, that is, a nucleic acid (DNA or RNA, preferably DNA) possessed by E. coli, which is involved in the expression of proteins related to the maintenance of the outer membrane structure of E. coli. point to The adventitia formation-related gene is not particularly limited as long as it is a gene associated with the maintenance of the adventitia structure. , mrcB, oppA and slyB genes.
  • the pal, lpp, ompA or tolA gene is more preferred, and the pal or lpp gene is even more preferred. More specifically, a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 4 to 32 and 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, A gene having a nucleotide sequence with a sequence identity of 97% or more, 98% or more, or 99% or more is preferred.
  • sequence identity of base sequences can be determined using techniques, sequence analysis software, etc. well known to those skilled in the art. Examples include the blastn program of the BLAST algorithm and the fasta program of the FASTA algorithm.
  • sequence identity of a base sequence to be evaluated with a base sequence X means that the base sequence X and the base sequence to be evaluated are aligned (aligned), gaps are introduced as necessary, It is a value expressed in % of the frequency at which the same base appears at the same site in the base sequence including the gap portion when the degree of base matching between the two is maximized.
  • arcA is a gene for expressing ArcA (Aerobic respiration control).
  • An example of the nucleotide sequence of the structural gene encoding ArcA of E. coli is shown in SEQ ID NO:4.
  • the signal sequence of arcA is shown in SEQ ID NO:5.
  • bamD is a gene for expressing the outer membrane protein BamD.
  • An example of the base sequence of the structural gene encoding BamD in E. coli is shown in SEQ ID NO:6.
  • the bamD signal sequence is shown in SEQ ID NO:7.
  • cyoA is a gene for expressing CyoA, a membrane protein that constitutes the respiratory system.
  • An example of the nucleotide sequence of the structural gene encoding E. coli CyoA is shown in SEQ ID NO:8.
  • the cyoA signal sequence is shown in SEQ ID NO:9.
  • dppA is a gene for expressing DppA, which is a dipeptide binding protein.
  • An example of the nucleotide sequence of the structural gene encoding DppA of E. coli is shown in SEQ ID NO:10.
  • the signal sequence of dppA is shown in SEQ ID NO:11.
  • ecnB is a gene for expressing the toxin lipoprotein EcnB.
  • An example of the nucleotide sequence of the structural gene encoding EcnB of E. coli is shown in SEQ ID NO: 12.
  • the ecnB signal sequence is shown in SEQ ID NO:13.
  • lpp is the gene for expressing the major outer membrane lipoprotein Lpp.
  • SEQ ID NO: 14 shows an example of the nucleotide sequence of the structural gene encoding E. coli Lpp.
  • the lpp signal sequence is shown in SEQ ID NO:15.
  • mepS is a gene for expressing MepS, a peptidoglycan DD-endopeptidase/peptidoglycan LD-peptidase.
  • SEQ ID NO: 16 shows an example of the nucleotide sequence of the structural gene encoding E. coli MepS.
  • the signal sequence of mepS is shown in SEQ ID NO:17.
  • mrcA is a gene for expressing MrcA, a peptidoglycan glycosyltransferase/peptidoglycan DD-transpeptidase.
  • An example of the nucleotide sequence of the structural gene encoding MrcA of E. coli is shown in SEQ ID NO: 18.
  • the signal sequence of mrcA is shown in SEQ ID NO:19.
  • mrcB is a gene for expressing MrcB, a peptidoglycan glycosyltransferase/peptidoglycan DD-transpeptidase.
  • An example of the nucleotide sequence of the structural gene encoding MrcB of E. coli is shown in SEQ ID NO:20.
  • the signal sequence of mrcB is shown in SEQ ID NO:21.
  • nlpI is a gene for expressing lipoprotein NlpI.
  • An example of the nucleotide sequence of the structural gene encoding NlpI of E. coli is shown in SEQ ID NO:22.
  • the signal sequence of NlpI is shown in SEQ ID NO:23.
  • ompA is a gene for expressing the outer membrane protein OmpA.
  • An example of the nucleotide sequence of the structural gene encoding E. coli OmpA is shown in SEQ ID NO:24.
  • the OmpA signal sequence is shown in SEQ ID NO:25.
  • oppA is a gene for expressing the periplasmic oligopeptide-binding protein OppA.
  • An example of the nucleotide sequence of the structural gene encoding E. coli OppA is shown in SEQ ID NO:26.
  • the signal sequence of oppA is shown in SEQ ID NO:27.
  • Pal is a gene for expressing outer membrane lipoprotein Pal.
  • SEQ ID NO: 28 shows an example of the nucleotide sequence of the structural gene encoding Pal of Escherichia coli. The signal sequence of pal is shown in SEQ ID NO:29.
  • slyB is a gene for expressing SlyB, a peptidyl-prolyl cis-trans isomerase.
  • An example of the nucleotide sequence of the structural gene encoding E. coli SlyB is shown in SEQ ID NO:30.
  • the signal sequence of slyB is shown in SEQ ID NO:31.
  • TolA is a gene for expressing TolA, one of the proteins that make up the Tol/Pal system.
  • the Tol/Pal system is a complex composed of multiple proteins present in Gram-negative bacteria, and is reported to be involved in outer membrane invagination during cell division and structural maintenance of the outer membrane.
  • SEQ ID NO: 32 shows an example of the nucleotide sequence of the structural gene encoding E. coli TolA.
  • modification of a gene refers to a naturally occurring gene (also referred to as “wild-type”) in which the nucleotide sequence is altered. point to The modification referred to here is not particularly limited as long as the base sequence of the original gene is modified in some way, and examples thereof include complete deletion and partial mutation.
  • the E. coli genetically modified strain used in the method of the present invention has a genetic modification that alters the expression of one or more outer membrane formation-related genes.
  • genetic modification that alters the expression of one or more genes associated with outer membrane formation means genetic modification that significantly changes the activity of the protein encoded by the gene as compared to the parent strain.
  • genetic alterations in which the activity of the protein encoded by said gene is attenuated compared to the parent strain are preferred, including genetic alterations in which the activity is completely lost.
  • a state in which protein activity is attenuated means a state in which the expression level of mRNA, which is a transcription product of a target gene, or a protein, which is a translation product, is reduced, or a state in which the expression level of a protein, which is a transcription product of a target gene, is reduced.
  • a state in which a protein does not function normally as mRNA or protein.
  • deficiency of a gene means deletion or damage, preferably deletion.
  • the partial mutation includes deletion, insertion, substitution and the like, preferably partial deletion or partial substitution.
  • Partial deletion means partially deleting a gene or protein.
  • Partial substitution refers to the substitution of a part of the nucleotide sequence of a gene or the amino acid sequence of a protein with another sequence. In the present invention, partial substitution that causes a missense mutation is preferred. .
  • the "one or more adventitia formation-related genes" to be modified are also simply referred to as "genes of interest".
  • the target gene may be one adventitia formation-related gene or two or more adventitia formation-related genes.
  • one adventitia formation-related gene may be modified at a plurality of sites.
  • any region such as the N-terminal region, internal region, C-terminal region, etc. may be deleted.
  • the sequences before and after the region to be deleted do not have the same reading frame.
  • at least a part of the coding region of the amino acid sequence and/or the expression regulatory sequence of the gene of interest for example, the total number of bases of the coding region and/or the expression regulatory sequence, for example, A region consisting of 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more of the number of bases can be deleted. Alternatively, 100% of the region can be deleted (complete deletion).
  • the genome DNA may be an Escherichia coli genetically modified strain in which at least the region from the initiation codon to the termination codon of the target gene is deleted.
  • the "expression control sequence” is not particularly limited as long as it is a nucleotide sequence that can be involved in the expression of the coding region, and may be a signal sequence and/or SD sequence (eg, 5'-AGGAGGA-3').
  • E. coli genetically modified strains of the present invention include modified strains having a complete deletion or partial mutation of the signal sequence and/or SD sequence.
  • modification of the target gene in the genomic DNA of E. coli strains include introducing a missense mutation into the amino acid sequence coding region of the gene on the genomic DNA, introducing a stop codon (nonsense mutation), or 1 Examples include introducing a frameshift mutation that adds or deletes up to 2 bases.
  • Another example of modification of the target gene in the genomic DNA of an E. coli strain can be achieved by inserting another sequence into the expression regulatory sequence or amino acid sequence coding region of the gene on the genomic DNA.
  • the insertion site may be any region of said gene.
  • sequences before and after the insertion site do not have the same reading frame.
  • Other sequences include, but are not limited to, marker genes. Marker genes include drug resistance markers for drugs such as kanamycin, ampicillin, tetracycline, and chloramphenicol, and auxotrophic markers for nutritional components such as leucine, histidine, lysine, methionine, arginine, tryptophan, and uracil. is not limited to
  • the E. coli genetically modified strain can be achieved by, for example, mutation treatment, genetic recombination technology, gene expression suppression treatment using RNAi, gene editing, and the like.
  • the mutagenesis treatment includes ultraviolet irradiation, or normal mutagenesis treatments such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethyl methanesulfonate (EMS), methyl methanesulfonate (MMS), and the like. treatment with a mutagen used in
  • a method of preparing an E. coli outer membrane formation-related gene with partial mutation and integrating it into the genome of any E. coli strain can also be suitably used.
  • Methods for preparing E. coli outer membrane formation-related genes having partial mutations include methods known to those skilled in the art, for example, overlap PCR method and total synthesis method using appropriate oligonucleotides as primers.
  • Known methods can be used as appropriate for the method of incorporating the prepared E. coli outer membrane formation-related gene having partial mutations into host cells. 2000), Proc. Natl. Acad. Sci. Bacteriol., 179, 6228-6237), etc., but the method described in Link et al., which does not integrate foreign genes other than the E. coli genome, is particularly preferable.
  • techniques for preparing a recombinant vector of an outer membrane formation-related gene having a partial mutation include a ligation method, In-Fusion (Clontec), a PCR method, a total synthesis method, etc., but are particularly limited to these. not something.
  • a ligation method In-Fusion (Clontec)
  • a PCR method a total synthesis method, etc.
  • a total synthesis method etc.
  • periplasmic chaperones such as FkpA, Dsb, and SurA in partial mutant strains.
  • Modification of the target gene in the genomic DNA of the E. coli strain can also be achieved by replacing the gene in the genomic DNA of the E. coli strain with a deleted gene or marker gene.
  • the deletion-type gene is an inactive gene that has been modified by deleting part or all of the target gene so as not to produce a protein that functions normally.
  • deletion-type genes include, for example, a linear DNA containing an arbitrary sequence that does not have the function of the target gene, and the substitution target sites on the genomic DNA (i.e., the above-mentioned A linear DNA comprising sequences upstream and downstream of the target gene (part or all of the target gene), or a linear DNA directly connecting the sequences upstream and downstream of the site to be replaced on the genomic DNA.
  • marker genes include, for example, linear DNA containing a sequence of a marker gene, and a site to be replaced on the genomic DNA (that is, part or all of the gene of interest) is located at both ends of the sequence of the marker gene.
  • Linear DNA with upstream and downstream sequences is included.
  • the marker gene may be removed if necessary after the above replacement.
  • FRT flippase recognition target
  • E. coli genetically modified strain is a strain in which the pal gene has been modified, E. coli Pal in which the gene (SEQ ID NO: 40) encoding Pal (having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33) on the E. coli genome has been mutated. It also includes E. coli in which the gene encoding the signal peptide (SEQ ID NO:42) has been mutated.
  • the signal peptide is mutated, other signal peptides such as OmpA, OmpF and Lpp may be used.
  • the Pal mutation is preferably partial mutation, particularly partial deletion.
  • E. coli containing a partially deleted Pal-encoding gene are E. coli in which the gene (SEQ ID NO: 28) encoding Pal (having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33) on the E. coli genome is partially deleted, and Pal E. coli having a partial deletion in the gene (SEQ ID NO: 29) encoding the signal peptide (SEQ ID NO: 34) of E. coli.
  • SEQ ID NO: 28 the gene encoding Pal (having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33) on the E. coli genome is partially deleted
  • Pal E. coli having a partial deletion in the gene (SEQ ID NO: 29) encoding the signal peptide (SEQ ID NO: 34) of E. coli for example, Cascales E. et al. and Lloubes R, (2004), Mol Microbiol. , 51(3), 873-885.
  • Pal partial mutants can also be prepared by introducing a gene encoding a partially mutated Pal into a Pal-deficient strain in which the Pal-encoding gene has been deleted, and expressing the partially mutated Pal.
  • Escherichia coli in which Pal (SEQ ID NO: 33) is partially mutated, and the partial mutation is more preferably partially deleted.
  • the partial mutation of Pal is one or more amino acid sequence portions selected from the signal peptide of Pal, the amino acid sequences of positions 3 to 17, positions 19 to 121, and positions 123 to 152 of SEQ ID NO: 49. Mutations are preferred.
  • an E. coli strain having a mutation in Pal for example, an E. coli strain having a gene (SEQ ID NO: 36) encoding Pal (SEQ ID NO: 35) lacking amino acids at positions 3 to 17 on its genome.
  • E. coli strain having the encoding gene (SEQ ID NO: 42) on its genome, and a gene (SEQ ID NO: 44) encoding Pal (SEQ ID NO: 43) lacking amino acids at positions 94 to 121.
  • E. coli strain having on the genome the E. coli strain having on the genome the gene (SEQ ID NO: 46) encoding Pal (SEQ ID NO: 45) lacking the amino acids at positions 123 to 152, the amino acid at position 126
  • an E. coli strain containing the pal gene having the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 and 50 can be used. preferable.
  • Pal having the partial mutation has one or more amino acids substituted, deleted, and/or added in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 and 49. It may be an amino acid sequence obtained by "One or more" is, for example, 1 to 80, preferably 1 to 70, preferably 1 to 60, preferably 1 to 50, preferably 1 to 40, preferably 1 to 30, preferably is 1 to 20, preferably 1 to 15, preferably 1 to 10, preferably 1 to 5, preferably 1 to 4, preferably 1 to 3, preferably 1 to 2, preferably There is one.
  • Pal having the partial mutation may have 60% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 and 50.
  • Said sequence identity may be 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • sequence identity of amino acid sequences can be determined using techniques, sequence analysis software, etc. well known to those skilled in the art.
  • the blastp program of the BLAST algorithm and the fasta program of the FASTA algorithm can be used.
  • sequence identity of a given amino acid sequence to be evaluated with amino acid sequence X means that the amino acid sequence X and the amino acid sequence to be evaluated are aligned (aligned), gaps are introduced as necessary, It is the value expressed in % of the frequency of appearance of the same amino acid at the same site in the amino acid sequence including the gap portion when the degree of amino acid identity between the two is maximized.
  • the E. coli genetically modified strain is a strain in which the lpp gene is modified, a gene encoding Lpp (for example, Lpp having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51) on the E. coli genome (for example, the base sequence of SEQ ID NO: 14 ) mutated, and E. coli mutated in the gene encoding the Lpp signal peptide (eg, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15).
  • Lpp for example, Lpp having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51
  • the E. coli genome for example, the base sequence of SEQ ID NO: 14
  • E. coli mutated in the gene encoding the Lpp signal peptide eg, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15
  • the signal peptide is mutated, other signal peptides such as OmpA, OmpF and Pal may be used.
  • the E. coli genetically modified strain is a strain in which the ompA gene is modified, a gene encoding OmpA (for example, OmpA having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52) on the E. coli genome (for example, the base sequence of SEQ ID NO: 24 ), and E. coli in which the gene encoding the signal peptide of OmpA (eg, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 36) is mutated.
  • the signal peptide is mutated, other signal peptides such as Lpp, OmpF, and Pal may be used.
  • the E. coli genetically modified strain is a strain in which the tolA gene is modified
  • a gene encoding TolA on the E. coli genome for example, TolA having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 53
  • SEQ ID NO: 32 sequence for example, the base of SEQ ID NO: 32 sequence
  • step (a) The method of the present invention includes (a) a step of introducing a gene encoding a foreign protein of interest into E. coli in which a gene related to maintenance of outer membrane structure has been modified (hereinafter also referred to as “step (a)”). .
  • the method of the present invention includes introducing a gene encoding a foreign protein of interest (foreign protein) into an E. coli genetically modified strain to produce the foreign protein of interest. More specifically, in the method of the present invention, an expression vector containing a gene encoding a foreign protein of interest is introduced into an E. coli genetically modified strain.
  • expression vector refers to an artificially constructed nucleic acid molecule that has the function of expressing a gene in an expression cassette integrated into the expression vector in a host cell after transformation.
  • the expression vector contains a cloning site containing one or more restriction enzyme recognition sequences, an overlap region for using Clontec's In-Fusion cloning system or the like, a marker gene such as a drug resistance gene, and a self-replicating sequence. etc.
  • Expression vectors include, for example, plasmid vectors and artificial chromosomes. Plasmid vectors are preferably used because they facilitate vector preparation and transformation of E. coli strains. Examples of plasmids include known expression vectors such as pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19 and pBluescript, but are not particularly limited thereto.
  • An "expression cassette” is composed of a promoter and a gene encoding a foreign protein, and may contain a terminator. Promoters to be used include promoters known to those skilled in the art, such as lac promoter, tac promoter, ara promoter, tet promoter and T7 promoter, but are not particularly limited thereto.
  • the method of the present invention requires that the foreign protein of interest be transferred from the cytoplasm of E. coli to the periplasmic space. Therefore, it is required that a periplasmic localization signal sequence is added to the 5' end of the gene encoding the foreign protein.
  • Periplasmic translocation signals that function in E. coli include, but are not limited to, PelB, OmpA, PhoA, OmpF, STII, and the like.
  • a periplasmic translocation signal is required for translocation to the periplasmic space, and the addition of a periplasmic translocation signal is not required for a foreign protein.
  • the base sequence of the gene encoding the foreign protein (foreign gene) to be incorporated into the expression vector is 200 to 4,500 bp, particularly 500 bp, due to the stability of the expression vector and high efficiency of introduction into the host. It is preferable to set the length to about 2,000 bp.
  • foreign proteins produced by the method of the present invention include enzymes derived from microorganisms and proteins derived from multicellular organisms such as animals and plants.
  • examples include phytase, protein A, protein G, protein L, amylase, glucosidase, cellulase, lipase, protease, glutaminase, peptidase, nuclease, oxidase, lactase, xylanase, trypsin, pectinase, isomerase, and fluorescent proteins. It is not limited to these. Biopharmaceutical proteins are particularly preferred.
  • biopharmaceutical proteins include partial antibodies such as VHH, scFv, and Fab, cytokines, growth factors, protein kinases, protein hormones, Fc fusion proteins, and human serum albumin (HSA) fusion proteins.
  • amino acids that make up the foreign protein may be natural or non-natural, or may be modified.
  • amino acid sequence of the protein may be artificially modified or designed de-novo.
  • the drug resistance marker gene of the plasmid vector in the present invention is not particularly limited in the E. coli strain provided by the present invention. Specific examples include kanamycin-resistant genes, ampicillin-resistant genes, tetracycline-resistant genes, chloramphenicol-resistant genes, etc., which can be selected by resistance in media containing kanamycin, ampicillin, tetracycline, and chloramphenicol, respectively. is possible.
  • the expression vector is introduced into the genetically modified E. coli strain.
  • Techniques for introducing an expression vector into an E. coli strain are not particularly limited, and for example, gene transfer methods such as electroporation, calcium chloride, competent cell and protoplast methods can be used.
  • Step (b) The method of the present invention includes a step of culturing the E. coli genetically modified strain introduced with the gene encoding the foreign protein obtained in step (a) (hereinafter also referred to as “step (b)”).
  • the above-mentioned E. coli genetically modified strain can be cultured in an appropriate medium.
  • the culture method may be batch culture, fed-batch culture, or continuous culture.
  • the medium may be either a synthetic medium or a natural medium, as long as it contains nutrients such as carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins, etc. necessary for growth of the genetically modified strain of E. coli.
  • the carbon source may be any carbon source that can be assimilated by the genetically modified strain of Escherichia coli, and includes sugars such as glucose and fructose, alcohols such as ethanol and glycerol, and organic acids such as acetic acid. be able to.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium salts such as ammonium sulfate, nitrogen compounds such as amines, and natural nitrogen sources such as peptone.
  • inorganic salts include potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, and potassium carbonate.
  • vitamins examples include biotin and thiamine.
  • substances required for the growth of the E. coli genetically modified strain for example, required amino acids in the case of an amino acid-requiring strain) can be added.
  • a medium containing peptone, yeast extract and sodium chloride is preferably used.
  • the peptone is preferably soy peptone.
  • a preferred example of a medium containing peptone, yeast extract and sodium chloride is 2xYT medium.
  • culture conditions are not particularly limited, but preferred examples include shaking culture and stirring culture.
  • the culture temperature is 20-50°C, preferably 20-42°C, more preferably 25-33°C.
  • the culture time is 3 hours to 5 days, preferably 5 hours to 3 days.
  • nutrients or inducers can be supplied to the medium by shot or fed-batch as needed.
  • the inducer is appropriately selected depending on the promoter used. For example, direct induction of the lac promoter or tac promoter, or indirect induction of the T7 promoter by expressing T7 RNA polymerase with the lac promoter, lactose, isopropyl- ⁇ -Thiogalactopyranoside (IPTG) and the like are used.
  • IPTG is used as an inducer
  • protein expression can be induced by adding IPTG to a final concentration of 0.1 to 2.0 mM, more preferably 0.2 to 1.0 mM.
  • timing of inducing the expression of the foreign protein is not particularly limited as long as the foreign protein is expressed and secreted into the culture supernatant, but is preferably early logarithmic growth phase, mid-logarithmic growth phase or late logarithmic growth phase. , particularly preferably in the late logarithmic growth phase.
  • Step (c) The method of the present invention includes a step of recovering the foreign protein of interest from the periplasmic fraction of the E. coli genetically modified strain cultured in step (b) (hereinafter also referred to as “step (c)”).
  • Bacteria can be recovered from the culture solution by any known technique such as centrifugation. At that time, in order to further improve the yield of the target protein, the culture supernatant may be collected and the target protein may be purified separately from the cells.
  • a target protein is recovered from the recovered cells.
  • it is necessary to extract the protein from the periplasmic fraction of the bacterial cells without performing a bacterial cell disruption treatment in order to suppress the contamination of the protein in the cytoplasm.
  • Any known technique can be used for extracting protein from the periplasmic fraction in step (c).
  • Known techniques for extracting proteins from the periplasmic fraction of Escherichia coli include, for example, osmotic shock method, chelating agent treatment, treatment with cell wall-degrading enzymes such as lysozyme, treatment with weak chaotropic substances (e.g., arginine) (e.g., patent documents 1), heat treatment, low-concentration surfactant treatment, and freeze-thaw.
  • osmotic shock method chelating agent treatment
  • treatment with cell wall-degrading enzymes such as lysozyme
  • treatment with weak chaotropic substances e.g., arginine
  • heat treatment low-concentration surfactant treatment
  • freeze-thaw freeze-thaw.
  • chemical methods particularly the cold osmotic shock method using osmotic shock, are preferred over mechanical methods such as sonication and high-pressure homogenizers. , the use of chelating agents, and the use of low concentrations of surfactants. It is known that the yield of target protein by such chemical methods is generally lower than that by mechanical methods.
  • the method of the present invention uses a genetically modified strain of Escherichia coli, making it possible to obtain the desired protein at a high yield even by a chemical method.
  • the cold osmotic shock method is the most common method used to extract the periplasmic fraction, and for example, the following methods can be used. After suspending the cells in a sucrose hypertonic solution prepared using an EDTA/Tris buffer, the cells are collected and suspended in ice-cold water. The cells are harvested again and the supernatant is obtained as the periplasmic fraction. Here, before suspending the cells in the hypertonic solution, the cells may be washed with a Tris buffer. In addition, the suspension and harvesting of the cells in the hypertonic solution may be carried out in multiple cycles.
  • the following method can be used as a method using a chelating agent.
  • Cells are suspended in a weakly basic Tris/EDTA buffer containing a relatively high concentration of EDTA and incubated at room temperature for 15 minutes to 6 hours. Harvest again to obtain the supernatant as the periplasmic fraction. The suspension and harvesting of the cells in the Tris/EDTA buffer may be repeated.
  • Tris/EDTA method the above method is also referred to as "Tris/EDTA method”.
  • a method using a low-concentration surfactant for example, a method using bile salts such as sodium cholate and sodium deoxycholate, which are less likely to cause protein denaturation, can be used. Specifically, for example, the following method can be used.
  • the cells are suspended in a sodium deoxycholate solution of about 0.15% by weight, shaken at room temperature for about 30 minutes to 7 hours, collected, and the supernatant is obtained as a periplasmic fraction. Multiple cycles of suspension and harvesting of the cells in the sodium deoxycholate solution may be performed.
  • the periplasmic fraction when using a normal E. coli strain, may not contain a sufficient amount of protein depending on the type of target protein.
  • the method of the present invention has the advantage that the periplasmic fraction can contain a larger amount of the target protein.
  • a target protein can be purified from the periplasmic fraction. Any known technique can be used as a protein purification technique. For example, ammonium sulfate precipitation, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like can be used. Since the method of the present invention does not involve disrupting cells, it is possible to efficiently purify the target protein in a state where there is little contamination with proteins other than the target.
  • the protein may be purified from the culture supernatant separately from or mixed with the periplasmic fraction. By recovering proteins also from the culture supernatant, it becomes possible to further increase the protein yield.
  • the method for producing host E. coli for producing the protein of the present invention includes the following steps (i) and (ii). It is characterized by (i) a step of modifying a gene associated with maintenance of the outer membrane structure of E. coli; and (ii) a step of introducing a gene encoding a foreign protein of interest into the gene-modified E. coli obtained in (i) .
  • E. coli produced by the method for producing host E. coli of the present invention expresses the foreign protein of interest by the introduced gene. At that time, the foreign protein of interest is preferably accumulated in the periplasm of the E. coli.
  • the method for producing the host E. coli of the present invention includes a step of modifying an E. coli outer membrane formation-related gene (hereinafter also referred to as “step (i)”).
  • the E. coli strain used in the method for producing the host E. coli of the present invention is as described in the section “1-1 E. coli strain” in “1 Method for producing protein” above.
  • the adventitia formation-associated gene to be modified is as described in the above section "1-2 Artsitia formation-associated gene”.
  • specific methods, conditions, and the like for modifying the E. coli outer membrane formation-related gene are as described in the above section “1-3 E. coli strains with modified outer membrane formation-related gene”.
  • step (ii) The method for producing host E. coli of the present invention includes a step of introducing a gene encoding a foreign protein of interest into the E. coli genetically modified strain obtained in step (i) (hereinafter also referred to as “step (ii)”). .
  • step (ii) the expression vector used for gene introduction, the method of introduction, etc. are as described in the above “1-4 Gene introduction step (step (a))”.
  • the amino acid number described in the present invention is the number in the full-length protein including the signal sequence.
  • Genetic recombination techniques used in the present invention such as polymerase chain reaction (PCR), gene synthesis, DNA isolation and purification, restriction enzyme treatment, modified DNA cloning, transformation, etc., are known to those skilled in the art. The following examples were carried out according to the procedures described in the reagent and instrument manufacturer's accompanying manuals, unless otherwise specified.
  • the plasmid vector used for transformation is the E. coli E. coli constructed vector. It was prepared by introducing into E. coli DH5 ⁇ competent cells (Takara Bio Inc.) and culturing and amplifying the resulting transformant. Plasmids were extracted from plasmid-carrying strains using FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics). The cloning vector used was a modified pTH18cs (National Institute of Genetics: NIG) having a tetracycline resistance gene as a marker. An expression vector having a lac repressor gene was used to express the target protein.
  • NIG National Institute of Genetics
  • Example 1 Preparation of genetically modified Escherichia coli strains associated with outer membrane formation E. coli strains lacking pal, partially lacking pal, and point mutants of lpp were prepared according to Link A. et al. J. (J. Bacteriol., 1997 179, 6228-6237). To completely delete the pal gene, a DNA fragment (SEQ ID NO: 1) having EcoRI and SalI cleavage sites at both ends and homologous arms of about 500 bp each upstream and downstream outside the pal gene was amplified by PCR. The DNA fragment and cloning vector prepared above were cleaved with restriction enzymes EcoRI and SalI, and each cleaved DNA fragment was used for ligation.
  • the plasmid (p ⁇ pal) thus prepared was introduced into Escherichia coli BL21 strain by the calcium chloride method, and a p ⁇ pal-carrying strain was selected using a medium containing tetracycline. See Link A. above. J. It was confirmed by these methods that the target gene had been deleted by homologous recombination, and the obtained modified strain was designated as the ⁇ pal strain.
  • ppal1 and plpp1 were each introduced into Escherichia coli BL21 strain, and modified strains were selected using a medium containing tetracycline. Modification of the target gene by homologous recombination was confirmed, and the resulting modified strains were designated as pal1 strain and lpp1 strain, respectively.
  • Example 2 Measurement of recovery efficiency of target protein from outer membrane formation-associated genetically modified E. coli strain was carried out to investigate the recovery efficiency of In this example, various Escherichia coli were made to produce anti-von Willebrand factor (vWF) VHH antibodies as target proteins, and their recovery efficiency was investigated.
  • E. coli into which an expression vector containing a gene (SEQ ID NO: 54) encoding an anti-vWF VHH antibody was introduced by electroporation was cultured in 1 mL of semi-synthetic medium. The recovery efficiency of the target protein recovered from the periplasmic fraction of each E. coli strain was calculated, assuming that the sum total of the anti-vWF nanobody (target protein) contained in the soluble fraction of the cells was 100% recovery. Each fraction was prepared using the following two techniques respectively.
  • the supernatant was collected as hypertonic fraction 2 and the cells were suspended in 250 ⁇ L of ice-cold hypotonic solution (1 mM MgCl 2 ). The suspension was centrifuged at 12,000 ⁇ g for 5 minutes and the supernatant was collected as hypotonic fraction 1. Cells were suspended in 250 ⁇ L of hypotonic solution, centrifuged at 12,000 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was collected as hypotonic solution fraction 2. Cells were suspended in 250 ⁇ L of PBS, crushed twice with an ultrasonicator (UH-50: SMT) for 30 seconds, centrifuged at 12,000 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was used as crushed fraction 1. Recovered. The cells were suspended in 250 ⁇ L of PBS, washed, centrifuged at 12,000 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was collected as the crushed fraction 2.
  • UH-50: SMT ultrasonicator
  • Tris/EDTA method As in (1), 250 ⁇ L of the culture medium was centrifuged at 6,400 xg for 10 minutes to separate the supernatant and cells. Cells were suspended in 250 ⁇ L of Tris/EDTA buffer (100 mM Tris/HCl, 10 mM EDTA pH 7.4), allowed to stand at room temperature for 90 minutes, centrifuged at 12,000 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was centrifuged at 12,000 ⁇ g for 5 minutes. Collected as /E fraction 1. Cells were washed by resuspending the cells in 250 ⁇ L of Tris/EDTA buffer and centrifuging at 12,000 ⁇ g for 5 minutes. The supernatant was collected as T/E fraction 2.
  • Tris/EDTA buffer 100 mM Tris/HCl, 10 mM EDTA pH 7.4
  • Cells were suspended in 250 ⁇ L of PBS, crushed twice with an ultrasonicator (UH-50: SMT) for 30 seconds, centrifuged at 12,000 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was used as crushed fraction 1. Recovered. The cells were suspended in 250 ⁇ L of PBS, washed, centrifuged at 12,000 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was collected as the crushed fraction 2.
  • UH-50: SMT ultrasonicator
  • a part of the target protein was observed to be secreted in the culture supernatant in all strains (data not shown). It was found that the recovery amount of the target protein can be further improved by further recovering the target protein in the culture supernatant.
  • Example 3 Measurement of target protein recovery efficiency from outer membrane formation-related genetically modified E. coli strains using Keio collection This experiment was carried out to examine the recovery efficiency of the target protein from the genetically modified E. coli strain.
  • the ompA, tolA, mepS, nlpI, arcA, cyoA, dppA, ecnB, mrcA, mrcB, oppA, and slyB-deficient strains of the Keio collection which is a mutant strain of Escherichia coli BW25113, were added with an anti-vWF nanobody as the target protein. was produced and its recovery efficiency was examined.
  • An expression vector containing a gene (SEQ ID NO: 54) encoding an anti-vWF nanobody was introduced into each mutant by electroporation, and cultured in 0.8 mL of semi-synthetic medium.
  • the recovery efficiency of the target protein recovered from the periplasmic fraction was calculated by setting the total recovery rate of the anti-vWF nanobody (target protein) contained in the soluble fraction of the cells to 100%.
  • Each fraction was prepared by the cold osmotic shock method under the same conditions as in Example 2.
  • the anti-vWF nanobody in each fraction was subjected to Western blotting analysis under the same conditions as in Example 2.
  • the recovery rate of the anti-vWF nanobody in each fraction was calculated from the band intensity.
  • the sum of the hypertonic fractions 1 and 2 and the hypotonic fractions 1 and 2 was taken as the recovered amount.
  • a comparison of the wild-type strain and the genetically modified E. coli strain related to outer membrane formation showed that any It was confirmed that the recovery rate by the cold osmotic shock method was also improved in E. coli with genetically modified outer membrane formation-related genes.

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Abstract

大腸菌を用いて発現させた目的の外来タンパク質を、ペリプラズムから効率的に抽出精製する。　下記の（ａ）～（ｃ）の工程を含む、タンパク質の製造方法を提供する。　（ａ）外膜構造の維持に関連する遺伝子が改変された大腸菌に目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程、　（ｂ）（ａ）の大腸菌を培養する工程、及び　（ｃ）培養後の菌体のペリプラズム画分より目的の外来タンパク質を回収する工程。

Description

大腸菌を用いた外来タンパク質の製造方法
　本発明は、大腸菌を用いた外来タンパク質の製造方法に関する。
　遺伝子組換え技術を用いた組換えタンパク質の生産には、様々な宿主が用いられている。例えば、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞といった動物細胞や、大腸菌や酵母といった微生物等が挙げられる。微生物においては、動物細胞と比較して短時間かつ低コストで目的タンパク質を生産できるというメリットがある。とりわけ、大腸菌は最も研究されている微生物の一つで、短時間で増殖し、かつ取扱いも容易なことからタンパク質生産において頻繁に利用されている。
　大腸菌を用いたタンパク質生産において、一般的には細胞内でタンパク質が生産されるため、発酵培養後に培養液を菌体と培養上清に分離し、ペリプラズム抽出、細胞破砕、又は封入体（インクルージョンボディー）の回収等の操作を行う必要がある。特に細胞破砕を伴う場合、目的のタンパク質を多種・多量の宿主由来物質から精製する必要があることから、これらの後処理工程が目的タンパク質の生産コストに大きく影響する。
　外来タンパク質に関して、細胞質内の内容物を放出させずにペリプラズムの内容物を選択的に放出させる方法を用いると、宿主細胞由来のタンパク質の混入を軽減できる。そのため、外来タンパク質の精製プロセスが細胞質からの精製プロセスと比較して容易である。また、ペリプラズムは酸化的環境であるため、ペリプラズムに外来タンパク質を発現させることで、分子内・分子間のジスルフィド結合の形成およびそれに伴う外来タンパク質の機能発現を実現しやすいことも知られる。上記の事情により、タンパク質の生産において、ペリプラズムに外来タンパク質を発現させる手法は広く実施されている（例えば、特許文献１及び非特許文献１）。
特開平０８－２４２８７９号公報
C. Schimek et al., Biotechnol Progress.36: e2999 (2020)
　上記の通り、目的の外来タンパク質を大腸菌に発現させ、大腸菌のペリプラズムから前記外来タンパク質を抽出する方法は広く使用されるが、発現させる外来タンパク質の分子量や発現レベル等によって、目的の外来タンパク質の抽出効率が異なることが知られる。したがって、外来タンパク質を、その分子量等によらず、効率よく大腸菌から取得する手法が望まれる。
　本発明は、大腸菌を用いるタンパク質の製造方法であって、目的とする外来タンパク質を大腸菌ペリプラズムに局在させた後に効率的に前記タンパク質を抽出精製することが可能な、タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究を行った結果、外膜構造の維持に関連する遺伝子の改変を有する大腸菌株を用いることで、ペリプラズムに局在する発現した外来タンパク質の抽出効率が高くなることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本明細書によれば、以下の発明が提供される。
（１）下記の（ａ）～（ｃ）の工程を含む、タンパク質の製造方法：
　（ａ）外膜構造の維持に関連する遺伝子が改変された大腸菌に目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程、
　（ｂ）（ａ）の大腸菌を培養する工程、及び
　（ｃ）培養後の菌体のペリプラズム画分より目的の外来タンパク質を回収する工程。
（２）前記外膜構造の維持に関連する遺伝子が、ｐａｌ、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｔｏｌＡ、ｍｅｐＳ、ｎｌｐＩ、ａｒｃＡ、ｂａｍＤ、ｃｙｏＡ、ｄｐｐＡ、ｅｃｎＢ、ｍｒｃＡ、ｍｒｃＢ、ｏｐｐＡ及びｓｌｙＢからなる群から選択される少なくとも１つである、（１）に記載の方法。
（３）前記大腸菌の、ｐａｌ、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｔｏｌＡ、ｍｅｐＳ、ｎｌｐＩ、ａｒｃＡ、ｂａｍＤ、ｃｙｏＡ、ｄｐｐＡ、ｅｃｎＢ、ｍｒｃＡ、ｍｒｃＢ、ｏｐｐＡ及びｓｌｙＢからなる群から選択される２つ以上の遺伝子が改変されている、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記大腸菌の、ｐａｌ、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ及びｔｏｌＡからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が改変されている、（１）又は（２）に記載の方法。
（５）前記改変が完全欠損である、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記改変が部分変異である、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（７）前記改変がシグナル配列の部分変異である（６）に記載の方法。
（８）前記改変が構造遺伝子の部分変異である（６）に記載の方法。
（９）前記大腸菌が、Ｂ株由来またはＫ１２株由来である（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）タンパク質を製造するための宿主大腸菌の作製方法であって、下記の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む、方法：
　（ｉ）大腸菌の外膜構造の維持に関連する遺伝子に改変を加える工程；及び
　（ｉｉ）（ｉ）で得られた遺伝子が改変された大腸菌に、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程。
（１１）前記大腸菌が目的の外来タンパク質を発現し、前記目的の外来タンパク質が前記大腸菌のペリプラズムに蓄積される、（１０）に記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-046808号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、大腸菌を用いるタンパク質の製造方法であって、目的とする外来タンパク質を大腸菌ペリプラズムに局在させた後に効率的に前記タンパク質を抽出精製することが可能な、タンパク質の製造方法を提供することが可能である。
１．タンパク質の製造方法
　本発明のタンパク質の製造方法は、下記の（ａ）～（ｃ）の工程を含むことを特徴とする。
　（ａ）外膜構造の維持に関連する遺伝子が改変された大腸菌に目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程、
　（ｂ）（ａ）の大腸菌を培養する工程、及び
　（ｃ）培養後の菌体のペリプラズム画分より目的の外来タンパク質を回収する工程。
　本発明の方法は、上記の特徴を備えることにより、大腸菌のペリプラズムに局在する発現した目的の外来タンパク質を、効率よく回収することが可能な方法である。
　本明細書において、「外来タンパク質」とは、宿主細胞外部から組み込まれた遺伝子にコードされているタンパク質で、形質転換を行っていない宿主細胞が通常発現しないタンパク質のことを意味する。
１－１　大腸菌株
　本発明のタンパク質の製造方法（以下、「本発明の方法」とも称する）に使用する大腸菌は、遺伝子改変株であるが、その基となる大腸菌株は特に限定されず、公知の大腸菌株をいずれも使用できる。特に、Ｂ株若しくはＢ株から派生した株、又は、Ｋ１２株若しくはＫ１２株から派生した株を好適に使用できる。あるいは、Ｂ株とＫ１２株とのハイブリッド株であるＨＢ１０１株を使用できる。Ｂ株から派生した株としては、例えば、ＢＬ２１株、ＲＥＬ６０６株が知られる。また、Ｋ１２株から派生した株としては、Ｗ３１１０株、ＤＨ１０Ｂ株、ＢＷ２５１１３株、ＤＨ５α株、ＭＧ１６５５株、ＪＭ１０９株、ＲＶ３０８株等が知られる。
１－２　外膜形成関連遺伝子
　本発明の方法に使用する大腸菌株は、１以上の外膜構造の維持に関連する遺伝子が改変された遺伝子改変株である。
　本明細書において、「外膜形成関連遺伝子」とは、大腸菌の外膜構造の維持に関連する遺伝子を指す。より具体的には、「外膜形成関連遺伝子」は、大腸菌の外膜構造の維持に関連するタンパク質の発現に関与する、大腸菌の遺伝子、すなわち大腸菌が有する核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を指す。外膜形成関連遺伝子は、外膜構造の維持に関連する遺伝子であれば、特に限定されないが、例えば、ｐａｌ、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｔｏｌＡ、ｍｅｐＳ、ｎｌｐＩ、ａｒｃＡ、ｂａｍＤ、ｃｙｏＡ、ｄｐｐＡ、ｅｃｎＢ、ｍｒｃＡ、ｍｒｃＢ、ｏｐｐＡ及びｓｌｙＢ遺伝子とすることが好ましい。特に、ｐａｌ、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ又はｔｏｌＡ遺伝子とすることがより好ましく、ｐａｌ又はｌｐｐ遺伝子とすることがさらに好ましい。より具体的には、配列番号４～３２のいずれかで表される塩基配列と、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有する遺伝子とすることが好ましい。
　本明細書において、塩基配列の「配列同一性」は、当業者に周知の手法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムのｂｌａｓｔｎプログラム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムのｆａｓｔａプログラムが挙げられる。本発明において、ある評価対象塩基配列の、塩基配列Ｘとの「配列同一性」とは、塩基配列Ｘと評価対象塩基配列とを整列（アラインメント）させ、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだ塩基配列において同一部位に同一の塩基が出現する頻度を％で表示した値である。
　上記の外膜形成関連遺伝子のうち、ａｒｃＡは、ＡｒｃＡ（Ａｅｒｏｂｉｃ　ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ）を発現するための遺伝子である。大腸菌のＡｒｃＡをコードする構造遺伝子の塩基配列の一例を配列番号４に示す。ａｒｃＡのシグナル配列を配列番号５に示す。
　ｂａｍＤは、外膜タンパク質ＢａｍＤを発現するための遺伝子である。大腸菌におけるＢａｍＤをコードする構造遺伝子の塩基配列の一例を配列番号６に示す。ｂａｍＤのシグナル配列を配列番号７に示す。
　ｃｙｏＡは、呼吸系を構成する膜タンパク質であるＣｙｏＡを発現するための遺伝子である。大腸菌のＣｙｏＡをコードする構造遺伝子の塩基配列の一例を配列番号８に示す。ｃｙｏＡのシグナル配列を配列番号９に示す。
　ｄｐｐＡは、ジペプチド結合タンパク質（ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）であるＤｐｐＡを発現するための遺伝子である。大腸菌のＤｐｐＡをコードする構造遺伝子の塩基配列の一例を配列番号１０に示す。ｄｐｐＡのシグナル配列を配列番号１１に示す。
　ｅｃｎＢは、ｔｏｘｉｎリポタンパク質ＥｃｎＢを発現するための遺伝子である。大腸菌のＥｃｎＢをコードする構造遺伝子の塩基配列の一例を配列番号１２に示す。ｅｃｎＢのシグナル配列を配列番号１３に示す。
　ｌｐｐは、主要外膜リポタンパク質Ｌｐｐを発現するための遺伝子である。大腸菌のＬｐｐをコードする構造遺伝子の塩基配列の一例を配列番号１４に示す。ｌｐｐのシグナル配列を配列番号１５に示す。
　ｍｅｐＳは、ペプチドグリカンＤＤ－エンドペプチダーゼ／ペプチドグリカンＬＤ-ペプチダーゼであるＭｅｐＳを発現するための遺伝子である。大腸菌のＭｅｐＳをコードする構造遺伝子の塩基配列の一例を配列番号１６に示す。ｍｅｐＳのシグナル配列を配列番号１７に示す。
　ｍｒｃＡは、ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ／ペプチドグリカンＤＤ－トランスペプチダーゼであるＭｒｃＡを発現するための遺伝子である。大腸菌のＭｒｃＡをコードする構造遺伝子の塩基配列の一例を配列番号１８に示す。ｍｒｃＡのシグナル配列を配列番号１９に示す。
　ｍｒｃＢは、ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ／ペプチドグリカンＤＤ－トランスペプチダーゼであるＭｒｃＢを発現するための遺伝子である。大腸菌のＭｒｃＢをコードする構造遺伝子の塩基配列の一例を配列番号２０に示す。ｍｒｃＢのシグナル配列を配列番号２１に示す。
　ｎｌｐＩは、リポタンパク質ＮｌｐＩを発現するための遺伝子である。大腸菌のＮｌｐＩをコードする構造遺伝子の塩基配列の一例を配列番号２２に示す。ＮｌｐＩのシグナル配列を配列番号２３に示す。
　ｏｍｐＡは、外膜タンパク質ＯｍｐＡを発現するための遺伝子である。大腸菌のＯｍｐＡをコードする構造遺伝子の塩基配列の一例を配列番号２４に示す。ＯｍｐＡのシグナル配列を配列番号２５に示す。
　ｏｐｐＡは、ペリプラズムオリゴペプチド結合タンパク質ＯｐｐＡを発現するための遺伝子である。大腸菌のＯｐｐＡをコードする構造遺伝子の塩基配列の一例を配列番号２６に示す。ｏｐｐＡのシグナル配列を配列番号２７に示す。
　ｐａｌは、外膜リポタンパク質Ｐａｌを発現するための遺伝子である。大腸菌のＰａｌをコードする構造遺伝子の塩基配列の一例を配列番号２８に示す。ｐａｌのシグナル配列を配列番号２９に示す。
　ｓｌｙＢは、ぺプチジルプロリル　シス－トランス　イソメラーゼ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ－ｐｒｏｌｙｌ　ｃｉｓ－ｔｒａｎｓ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）であるＳｌｙＢを発現するための遺伝子である。大腸菌のＳｌｙＢをコードする構造遺伝子の塩基配列の一例を配列番号３０に示す。ｓｌｙＢのシグナル配列を配列番号３１に示す。
　ｔｏｌＡは、Ｔｏｌ／Ｐａｌシステムを構築するタンパク質の１つであるＴｏｌＡを発現するための遺伝子である。Ｔｏｌ／Ｐａｌシステムとは、グラム陰性細菌に存在する、複数のタンパク質からなる複合体であり、細胞分裂中の外膜陥入や、外膜の構造維持に関与することが報告されている。大腸菌のＴｏｌＡをコードする構造遺伝子の塩基配列の一例を配列番号３２に示す。
１－３　外膜形成関連遺伝子が改変された大腸菌株
　本明細書において、遺伝子の「改変」とは、天然に存在する遺伝子（「野生型」とも称する）に対して、塩基配列の変更が加わることを指す。ここでいう改変は、元の遺伝子の塩基配列に対して何らかの変更が加えられていれば、特に制限されないが、例えば、完全欠損又は部分変異が挙げられる。
　本発明の方法に使用される大腸菌遺伝子改変株は、１以上の外膜形成関連遺伝子の発現を変化させる遺伝子改変を有する。ここで「１以上の外膜形成関連遺伝子の発現を変化させる遺伝子改変」とは、前記遺伝子がコードするタンパク質の活性が親株と比較して有意に変化する遺伝子改変を意味する。特に、前記遺伝子がコードするタンパク質の活性が、親株と比較して減弱化される遺伝子改変が好ましく、これには、活性が完全に消失する遺伝子改変も包含される。タンパク質の活性が減弱化した状態とは、対象遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質の発現量が低下している状態や、前記対象遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質が、ｍＲＮＡまたはタンパク質として正常に機能しない状態を指す。
　本明細書において、遺伝子の「欠損」とは、欠失または損傷を意味し、好ましくは欠失である。前記部分変異としては、欠損、挿入、置換等が挙げられるが、好ましくは、部分欠損又は部分置換である。「部分欠損」とは遺伝子、もしくはタンパク質を部分的に欠損させることを意味する。また、「部分置換」とは、遺伝子の塩基配列又はタンパク質のアミノ酸配列の一部が他の配列に置換されることをいうが、本発明においては、ミスセンス変異を生じる部分置換であることが好ましい。以下、改変される「１以上の外膜形成関連遺伝子」について、単に「対象遺伝子」とも称する。対象遺伝子は１つの外膜形成関連遺伝子であってもよく、２以上の外膜形成関連遺伝子であってもよい。また、１つの外膜形成関連遺伝子の複数の箇所が改変されていてもよい。
　前記部分欠損として、前記対象遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列のコード領域の一部を欠失させる場合、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域を欠失させてもよい。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。好適には、ゲノムＤＮＡにおいて、前記対象遺伝子のうちアミノ酸配列のコード領域および／または発現調節配列の少なくとも一部、例えば、コード領域および／または発現調節配列の全体の塩基数に対して、例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上の塩基数からなる領域を欠失させることができる。あるいは、前記領域の１００％を欠失させることができる（完全欠損）。また、例えば、ゲノムＤＮＡにおいて、前記対象遺伝子のうち少なくとも開始コドンから終止コドンまでの領域が欠失した大腸菌遺伝子改変株とすることができる。
　本明細書において「発現調節配列」は、コード領域の発現に関与しうる塩基配列であえば特に限定されないが、シグナル配列及び／又はＳＤ配列（例えば、５’－ＡＧＧＡＧＧＡ－３’）としてもよい。本発明の大腸菌遺伝子改変株は、シグナル配列及び／又はＳＤ配列の完全欠損又は部分変異を有する改変株を包含する。
　大腸菌株のゲノムＤＮＡにおける前記対象遺伝子の改変の他の例としては、ゲノムＤＮＡ上の前記遺伝子のアミノ酸配列コード領域にミスセンス変異を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１～２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等が例示できる。
　大腸菌株のゲノムＤＮＡにおける前記対象遺伝子の改変の他の例としては、ゲノムＤＮＡ上の前記遺伝子の発現調節配列又はアミノ酸配列コード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は、前記遺伝子のいずれの領域であってもよい。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列は、特に制限されないが、例えば、マーカー遺伝子が挙げられる。マーカー遺伝子としては、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール等の薬剤に対する薬剤耐性マーカー、ロイシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、ウラシル等の栄養成分に対する栄養要求性マーカーが挙げられるがこれに限定されない。
　前記大腸菌遺伝子改変株は、例えば、突然変異処理、遺伝子組換え技術、ＲＮＡｉを用いた遺伝子発現抑制処理、遺伝子編集等によって達成できる。
　突然変異処理としては、紫外線照射、または、Ｎ－メチル－Ｎ'－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤による処理が挙げられる。
　遺伝子組換え技術としては、公知の技術（例えば、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１６５（１９９８），３３５－３４０、ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ｄｅｃ．１９９５，ｐ７１７１－７１７７、Ｃｕｒｒ　Ｇｅｎｅｔ　１９８６；１０（８）：５７３－５７８、ＷＯ９８／１４６００等）を利用できる。
　部分変異を有する大腸菌外膜形成関連遺伝子を調製して、任意の大腸菌株のゲノムに組み込む手法も好適に使用できる。部分変異を有する大腸菌外膜形成関連遺伝子を調製する手法は、当業者の公知の手法、例えば、適正なオリゴヌクレオチドをプライマーとしたオーバーラップＰＣＲ法や全合成法が挙げられる。調製した部分変異を有する大腸菌外膜形成関連遺伝子を宿主細胞へ組み込む手法は、公知の手法を適宜使用することができ、Ｒｅｄ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ　システム（Ｄａｔｓｅｎｋｏ　Ｋ．Ａ．，ａｎｄ　Ｗａｎｎｅｒ　Ｂ．Ｌ．著（２０００年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７（１２），６６４０－６６４５）や宿主細胞の相同組換え機構によって組み込まれる手法（Ｌｉｎｋ　Ａ．Ｊ．他著（１９９７年），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，６２２８－６２３７）等が挙げられるが、特に、大腸菌ゲノム以外の外来遺伝子がゲノム上に組み込まれないＬｉｎｋ他において記載された手法が好ましい。
　この際、部分変異を有する外膜形成関連遺伝子の組換えベクターを調製する手法は、ライゲーション法、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃ社）、ＰＣＲ法、全合成法等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。また、組換えベクターを宿主細胞へ導入するためには、例えば、宿主として大腸菌を用いる場合、塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の手法で可能だが、特にこれらに限定されるものではない。
　外来タンパク質の生産量・分泌量を増加させるために、部分変異株において、ＦｋｐＡ、Ｄｓｂ、ＳｕｒＡなどのペリプラズム性シャペロンの共発現を組み合わせることも可能である。
　大腸菌株のゲノムＤＮＡにおける対象遺伝子の改変は、大腸菌株のゲノムＤＮＡにおける前記遺伝子を、欠失型遺伝子又はマーカー遺伝子に置換することにより実現することもできる。ここで欠失型遺伝子とは、前記対象遺伝子の一部又は全部を欠失させて正常に機能するタンパク質を産生しないように改変された不活性遺伝子である。欠失型遺伝子の例としては、例えば、前記対象遺伝子の機能を有さない任意の配列を含む線状ＤＮＡであって、当該任意の配列の両端にゲノムＤＮＡ上の置換対象部位（すなわち、前記対象遺伝子の一部又は全部）の上流および下流の配列を備える線状ＤＮＡ、或いは、ゲノムＤＮＡ上の前記置換対象部位の上流および下流の配列を直結した線状ＤＮＡが挙げられる。マーカー遺伝子の例としては、例えば、マーカー遺伝子の配列を含む線状ＤＮＡであって、前記マーカー遺伝子の配列の両端にゲノムＤＮＡ上の置換対象部位（すなわち、前記対象遺伝子の一部または全部）の上流および下流の配列を備える線状ＤＮＡが挙げられる。前記線状ＤＮＡにより大腸菌株を形質転換して、宿主株のゲノムＤＮＡの置換対象部位の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、１ステップで置換対象部位を前記線状ＤＮＡの配列に置換することができる。この置換により大腸菌株のゲノムＤＮＡにおいて前記対象遺伝子を欠損させることができる。
　マーカー遺伝子は上記の置換ののちに必要により除去してもよい。この目的では、マーカー遺伝子を効率的に除去できるよう、マーカー遺伝子の両端に、相同組換え用の配列、又は、フリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）配列を付加しておくことが好ましい。
　大腸菌遺伝子改変株が、ｐａｌ遺伝子が改変された株である場合、大腸菌ゲノム上のＰａｌ（配列番号３３に示すアミノ酸配列を有する）をコードする遺伝子（配列番号４０）を変異させた大腸菌、Ｐａｌのシグナルペプチドをコードする遺伝子（配列番号４２）を変異させた大腸菌も含む。シグナルペプチドを変異させる場合、他のシグナルペプチド、例えば、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＦ、Ｌｐｐ等のシグナルペプチドであっても良い。
　Ｐａｌの変異は、部分変異、特に部分欠損であることが好ましい。部分欠損を有するＰａｌをコードする遺伝子を含む大腸菌は、大腸菌ゲノム上のＰａｌ（配列番号３３に示すアミノ酸配列を有する）をコードする遺伝子（配列番号２８）を部分的に欠損させた大腸菌と、Ｐａｌのシグナルペプチド（配列番号３４）をコードする遺伝子（配列番号２９）に部分欠損を有する大腸菌を包含する。Ｐａｌに部分欠損を施す箇所は、例えば、Ｃａｓｃａｌｅｓ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌｌｏｕｂｅｓ　Ｒ著，（２００４年），Ｍｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１（３），８７３－８８５に記載の箇所とすることができる。
　Ｐａｌ部分変異株は、Ｐａｌをコードする遺伝子を欠損させたＰａｌ欠損株に部分変異を有するＰａｌをコードした遺伝子を有する遺伝子を導入し、部分変異を有するＰａｌを発現させることで調製することも可能であるが、本発明では、Ｐａｌ（配列番号３３）が部分変異した大腸菌を用いることが好ましく、前記部分変異は部分欠損であることがより好ましい。
　前記Ｐａｌの部分変異は、Ｐａｌのシグナルペプチド、配列番号４９の３位から１７位、１９位から１２１位、および１２３位から１５２位のアミノ酸配列の中から選ばれる一つ以上のアミノ酸配列の部分変異であることが好ましい。
　Ｐａｌに変異を有する大腸菌株としては、例えば、３位のアミノ酸から１７位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号３５）をコードしている遺伝子（配列番号３６）をゲノム上に有する大腸菌株、１９位のアミノ酸から４３位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号３７）をコードしている遺伝子（配列番号３８）をゲノム上に有する大腸菌株、４４位のアミノ酸から６２位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号３９）をコードしている遺伝子（配列番号４０）をゲノム上に有する大腸菌株、６２位のアミノ酸から９３位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号４１）をコードしている遺伝子（配列番号４２）をゲノム上に有する大腸菌株、９４位のアミノ酸から１２１位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号４３）をコードしている遺伝子（配列番号４４）をゲノム上に有する大腸菌株、１２３位のアミノ酸から１５２位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号４５）をコードしている遺伝子（配列番号４６）をゲノム上に有する大腸菌株、１２６位のアミノ酸から１２９位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号４７）をコードしている遺伝子（配列番号４８）をゲノム上に有する大腸菌株、１４４位のアミノ酸から１４７位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号４９）をコードしている遺伝子（配列番号５０）をゲノム上に有する大腸菌株が挙げられる。
　本発明の方法に使用される大腸菌株としては、配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８及び５０のうちのいずれかに示す塩基配列を有するｐａｌ遺伝子を含む大腸菌を用いることが好ましい。
　前記部分変異を有するＰａｌは、配列番号３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７及び４９のいずれかに示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加したアミノ酸配列であっても良い。「１もしくは複数個」は、例えば１～８０個、好ましくは１～７０個、好ましくは１～６０個、好ましくは１～５０個、好ましくは１～４０個、好ましくは１～３０個、好ましくは１～２０個、好ましくは１～１５個、好ましくは１～１０個、好ましくは１～５個、好ましくは１～４個、好ましくは１～３個、好ましくは１～２個、好ましくは１個である。
　前記部分変異を有するＰａｌは、配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８及び５０のいずれかに示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有していても良い。前記配列同一性は、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上としてもよい。
　本明細書において、アミノ酸配列の配列同一性は、当業者に周知の手法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムのｂｌａｓｔｐプログラム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムのｆａｓｔａプログラムが挙げられる。本発明において、ある評価対象アミノ酸配列の、アミノ酸配列Ｘとの「配列同一性」とは、アミノ酸配列Ｘと評価対象アミノ酸配列とを整列（アラインメント）させ、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだアミノ酸配列において同一部位に同一のアミノ酸が出現する頻度を％で表示した値である。
　大腸菌遺伝子改変株が、ｌｐｐ遺伝子が改変された株である場合、大腸菌ゲノム上のＬｐｐ（一例として、配列番号５１のアミノ酸配列を有するＬｐｐ）をコードする遺伝子（一例として、配列番号１４の塩基配列）を変異させた大腸菌、Ｌｐｐのシグナルペプチドをコードする遺伝子（一例として、配列番号１５の塩基配列）を変異させた大腸菌を含む。シグナルペプチドを変異させる場合、他のシグナルペプチド、例えば、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＦ、Ｐａｌ等のシグナルペプチドであっても良い。
　大腸菌遺伝子改変株が、ｏｍｐＡ遺伝子が改変された株である場合、大腸菌ゲノム上のＯｍｐＡ（一例として、配列番号５２のアミノ酸配列を有するＯｍｐＡ）をコードする遺伝子（一例として、配列番号２４の塩基配列）を変異させた大腸菌、ＯｍｐＡのシグナルペプチドをコードする遺伝子（一例として、配列番号３６の塩基配列）を変異させた大腸菌も含む。シグナルペプチドを変異させる場合、他のシグナルペプチド、例えば、Ｌｐｐ、ＯｍｐＦ、Ｐａｌ等のシグナルペプチドであっても良い。
　大腸菌遺伝子改変株が、ｔｏｌＡ遺伝子が改変された株である場合、大腸菌ゲノム上のＴｏｌＡ（一例として、配列番号５３に示すアミノ酸配列を有するＴｏｌＡ）をコードする遺伝子（一例として、配列番号３２の塩基配列）を変異させた大腸菌を含む。
１－４　遺伝子導入工程（工程（ａ））
　本発明の方法は、（ａ）外膜構造の維持に関連する遺伝子が改変された大腸菌に目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程（以下、「工程（ａ）」とも称する）を含む。
１－４－１　発現ベクター
　本発明の方法は、大腸菌遺伝子改変株に目的の外来タンパク質（外来タンパク質）をコードする遺伝子を導入し、目的の外来タンパク質を生成させることを含む。より具体的には、本発明の方法において、大腸菌遺伝子改変株には、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターが導入される。
　本明細書において、「発現ベクター」とは、形質転換後の宿主細胞において、発現ベクターに組み込まれた発現カセット中の遺伝子が発現する機能を有する人為的に構築された核酸分子のことを意味する。発現ベクターは発現カセットに加えて、１つ以上の制限酵素認識配列を含むクローニングサイト、Ｃｌｏｎｔｅｃ社のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム等を用いるためのオーバーラップ領域、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子、自己複製配列等を有することができる。発現ベクターは、例えば、プラスミドベクターや人工染色体が挙げられるが、ベクター調製や、大腸菌株の形質転換が容易であることから、プラスミドベクターを好適に使用できる。プラスミドとしては、公知の発現ベクターである、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
　「発現カセット」とは、プロモーターおよび外来タンパク質をコードしている遺伝子より構成され、ターミネーターを含んでも良い。使用するプロモーターとしては、当業者において公知のプロモーター、例えば、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ａｒａプロモーター、ｔｅｔプロモーター、Ｔ７プロモーター等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
　本発明の方法では、目的となる外来タンパク質を、大腸菌の細胞質からペリプラズム空間へ移行されることを要する。そのため、外来タンパク質をコードする遺伝子の５´末端側にペリプラズム移行シグナル配列が付加されていることを要する。大腸菌内で機能を発揮するペリプラズム移行シグナルとしては、例えば、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ＳＴＩＩ等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。また、ペリプラズム空間への移行にペリプラズム移行シグナルを必要と外来タンパク質に関しては、ペリプラズム移行シグナルの付加を要さない。
　本発明の方法において、発現ベクターに組み込まれる外来タンパク質をコードする遺伝子（外来遺伝子）の塩基配列は、発現ベクターの安定性と宿主への導入効率の高さから、２００～４，５００ｂｐ、特に５００～２，０００ｂｐ程度の長さとすることが好ましい。
　本発明の方法によって生産される外来タンパク質の例としては、微生物由来の酵素類、動物や植物といった多細胞生物由来のタンパク質等が挙げられる。例えば、フィターゼ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、アミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、グルタミナーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、ラクターゼ、キシラナーゼ、トリプシン、ペクチナーゼ、イソメラーゼ、及び蛍光タンパク質等が挙げられるが、これらに限定はされるものではない。特に、バイオ医薬品用タンパク質が好ましい。
　バイオ医薬品用タンパク質として、例えば、ＶＨＨ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなどの部分抗体、サイトカイン、成長因子、プロテインキナーゼ、タンパク質ホルモン、Ｆｃ融合タンパク質、およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合タンパク質等が挙げられる。
　上記外来タンパク質を構成するアミノ酸は天然のものでもよいし、非天然のものでもよいし、修飾を受けていてもよい。また、タンパク質のアミノ酸配列は、人為的な改変がなされているものでもよいし、ｄｅ－ｎｏｖｏで設計されたものでもよい。
　本発明におけるプラスミドベクターの薬剤耐性マーカー遺伝子は、本発明で提供される大腸菌株では特に限定されるものではない。具体的な例としては、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられ、それぞれカナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールを含む培地における耐性により選択することが可能である。
１－４－２　遺伝子導入
　本発明の方法において、遺伝子改変大腸菌株に前記発現ベクターが導入される。発現ベクターを大腸菌株に導入する手法は、特に制限されないが、例えば、エレクトロポレーション法、塩化カルシウム法、コンピテントセル法、プロトプラスト法等の遺伝子導入法により行うことができる。
１－５　大腸菌を培養する工程（工程（ｂ））
　本発明の方法は、前記工程（ａ）で得られた外来タンパク質をコードする遺伝子を導入した大腸菌遺伝子改変株を培養する工程（以下「工程（ｂ）」とも称する）を含む。
　前記大腸菌遺伝子改変株の培養は適当な培地中で行うことができる。培養方法は、回分培養、流加培養、連続培養のいずれでもよい。培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなど前記大腸菌遺伝子改変株の増殖に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。
　炭素源としては、前記大腸菌遺伝子改変株の資化できる炭素源であればいずれでもよく、グルコース、フラクトースのような糖質、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などをあげることができる。
　窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトンのような天然窒素源などを挙げることができる。
　無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カリウムなどを挙げることができる。
　ビタミンとしては、ビオチンやチアミンなどを挙げることができる。さらに必要に応じて前記大腸菌遺伝子改変株が生育に要求する物質（例えばアミノ酸要求性株であれば要求アミノ酸）を添加することができる。
　本発明の方法においては、好ましくはペプトン、酵母エキス及び塩化ナトリウムを含む培地を用いる。ペプトンは好ましくは大豆ペプトンである。ペプトン、酵母エキス及び塩化ナトリウムを含む培地の例としては２×ＹＴ培地が好ましい。
　本発明の方法において、培養条件は特に限定されないが、好ましくは振とう培養や攪拌培養等が例示できる。培養温度は２０～５０℃、好ましくは２０～４２℃、より好ましくは２５～３３℃である。培養時間は、３時間～５日間、好ましくは５時間～３日間である。
　本発明の方法において、必要に応じて、栄養素又は誘導物質をショットや流加により培地に供給することができる。
　誘導物質は、使用するプロモーターにより適宜選択され、例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターの直接的誘導や、ｌａｃプロモーターでＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを発現させることでのＴ７プロモーターの間接的誘導では、ラクトースやイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などが用いられる。ＩＰＴＧを誘導物質として用いる場合、終濃度が０．１～２．０ｍＭ、より好ましくは０．２～１．０ｍＭとなるように添加することでタンパク質発現誘導を行うことができる。
　また、外来タンパク質発現誘導を行うタイミングは、外来タンパク質が発現して培養上清中に分泌されるなら、特に限定されないが、好ましくは対数増殖期初期、対数増殖期中期または対数増殖期後期であり、特に好ましくは対数増殖期後期である。
１－６　目的タンパク質を回収する工程（工程（ｃ））
　本発明の方法は、工程（ｂ）で培養された大腸菌遺伝子改変株の菌体のペリプラズム画分より、目的の外来タンパク質を回収する工程（以下、「工程（ｃ）」とも称する）を含む。
１－６－１　菌体の回収
　培養液からの菌体の回収は、遠心分離等の公知の手法をいずれも使用できる。その際、目的タンパク質の収率をさらに向上させるため、培養上清を回収し、菌体とは別に目的タンパク質を精製してもよい。
１－６－２　ペリプラズム画分の抽出
　回収された菌体から、目的タンパク質を回収する。目的タンパク質の回収に際しては、細胞質内のタンパク質の混入を抑制するため、菌体破砕処理を行わず、菌体のペリプラズム画分からタンパク質を抽出することを要する。工程（ｃ）においてペリプラズム画分からタンパク質を抽出する手法は、公知の手法をいずれも使用できる。
　大腸菌のペリプラズム画分からタンパク質を抽出する公知の手法としては、例えば、浸透圧ショック法、キレート剤処理、リゾチーム等の細胞壁分解酵素による処理、弱いカオトロピック物質（例えば、アルギニン）による処理（例えば、特許文献１を参照）、加熱処理、低濃度の界面活性剤処理、凍結融解が知られる。これらの手法は、過度な細胞破砕により細胞質内の画分が細胞外に露出することなく、ペリプラズム画分のタンパク質を抽出できる条件が、抽出物中の目的タンパク質と不純物の比率の上で好ましいが、特に限定されず、いずれも使用できる。これらの手法は、単独で使用されてもよく、また、組み合わされて使用されてもよい。大腸菌の細胞破砕による細胞質の露出のリスクを低減するためには、超音波処理、高圧ホモジナイザー等の機械的な手法よりも、化学的な手法、特に、浸透圧ショックを使用するコールドオスモティックショック法、キレート剤を使用する手法、低濃度の界面活性剤を使用する手法を使用することが好ましい。一般的に、このような化学的手法による目的タンパク質の収率は、機械的な手法よりも低いことが知られる。本発明の方法は、大腸菌遺伝子改変株を使用することで、化学的手法によっても高い収率で目的タンパク質を取得することが可能である。
　コールドオスモティックショック法は、ペリプラズム画分に抽出に使用される最も一般的な手法であり、例えば、次の手法をとりうる。ＥＤＴＡ／Ｔｒｉｓバッファーを用いて調製したスクロース高張液に菌体を懸濁した後、集菌して、氷冷した水に菌体を懸濁する。再度集菌して、上清をペリプラズム画分としてうる。ここで、菌体を高張液に懸濁する前に、菌体をＴｒｉｓ緩衝液で洗浄してもよい。また、高張液への菌体の懸濁と集菌は、複数サイクル実施してもよい。
　キレート剤を使用する手法としては、例えば、次の手法をとりうる。比較的高濃度のＥＤＴＡを含む弱塩基性のＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液に菌体を懸濁して、室温で１５分間～６時間インキュベーションする。再度集菌して、上清をペリプラズム画分として得る。Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液への菌体の懸濁と集菌とは、繰り返し行われてもよい。本明細書において、上記の手法を「Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ法」とも称する。
　低濃度の界面活性剤を使用する手法としては、例えば、タンパク質の変性を生じにくい、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等の胆汁酸塩を使用する手法をとりうる。具体的には、例えば、次の手法をとりうる。菌体を０．１５重量％程度のデオキシコール酸ナトリウム溶液中に懸濁して、室温で３０分間～７時間程度振とう反応させた後、集菌し、上清をペリプラズム画分として得る。デオキシコール酸ナトリウム溶液中への菌体の懸濁と集菌は、複数サイクル実施してもよい。
　上記の公知のペリプラズム抽出の手法を用いた場合、通常の大腸菌株を使用した場合は、目的タンパク質の種類等によっては、ペリプラズム画分に十分量のタンパク質が含まれないことがある。本発明の方法は、ペリプラズム画分に、より多量の目的タンパク質を含ませることができる、という利点を有する。
１－６－３　タンパク質精製
　前記ペリプラズム画分から、目的タンパク質を精製することができる。タンパク質の精製手法としては、公知の手法をいずれも使用可能である。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を使用することができる。本発明の方法は、細胞の破砕を伴わないことにより、目的以外のタンパク質の混入が少ない状態から、目的タンパク質を効率よく精製することが可能である。
　前記ペリプラズム画分とは別に、あるいは混合して、前記培養上清からタンパク質を精製してもよい。培養上清からもタンパク質を回収することにより、よりタンパク質の収量を上げることが可能となる。
２．宿主大腸菌の作製方法
　本発明のタンパク質を製造するための宿主大腸菌の作製方法（以下、「本発明の宿主大腸菌の作製方法」とも称する）は、下記の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含むことを特徴とする。
　（ｉ）大腸菌の外膜構造の維持に関連する遺伝子を改変させる工程；及び
　（ｉｉ）（ｉ）で得られた遺伝子が改変された大腸菌に、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程。
　本発明の宿主大腸菌の作製方法で作製された大腸菌は、導入された遺伝子により、目的の外来タンパク質を発現する。その際、前記目的の外来タンパク質は、前記大腸菌のペリプラズムに蓄積されることが好ましい。
２－１　宿主大腸菌の遺伝子改変工程（工程（ｉ））
　本発明の宿主大腸菌の作製方法は、大腸菌の外膜形成関連遺伝子を改変させる工程（以下、「工程（ｉ）」とも称する）を含む。本発明の宿主大腸菌の作製方法において、使用する大腸菌株は、上記「１　タンパク質の製造方法」の「１－１　大腸菌株」の項に記載した通りである。また、改変に対象となる外膜形成関連遺伝子は、上記「１－２　外膜形成関連遺伝子」の項に記載した通りである。さらに、大腸菌の外膜形成関連遺伝子を改変させる具体的な手法、条件等は、上記「１－３　外膜形成関連遺伝子が改変された大腸菌株」の項に記載した通りである。
２－２　外来遺伝子導入工程（工程（ｉｉ））
　本発明の宿主大腸菌の作製方法は、工程（ｉ）で得られた大腸菌遺伝子改変株に、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程(以下、「工程（ｉｉ）」とも称する)を含む。工程（ｉｉ）において、遺伝子導入に使用する発現ベクター、導入手法等は、上記「１－４　遺伝子導入工程（工程（ａ））」に記載した通りである。
　以下の実施例を掲げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　本発明に記載されるアミノ酸番号は、シグナル配列を含むタンパク質全長における番号である。本発明で用いられる遺伝子組換え技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子合成、ＤＮＡの単離および精製、制限酵素処理、改変ＤＮＡのクローニング、形質転換などは、当業者に公知である。以下の実施例は、特に記載のない限り、試薬・機器の製造元の添付マニュアルに記載されている手順で実施されたものである。
　以下の実施例において、ＰＣＲはＰｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いた。ＰＣＲ産物や制限酵素反応液の精製は、ＱＩＡｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。ＰＣＲ以外でのＤＮＡ断片の調製は、通常の遺伝子合成を用いた。形質転換に用いるプラスミドベクターは、構築したベクターを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社）に導入し、得られた形質転換体を培養して増幅することによって調製した。プラスミド保持株からのプラスミドの抽出はＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて行った。クローニングベクターは、ｐＴＨ１８ｃｓ（国立遺伝学研究所：ＮＩＧ）を改変したもので、マーカーとしてテトラサイクリン耐性遺伝子を有するものを使用した。目的タンパク質の発現には、ｌａｃリプレッサー遺伝子を有する発現ベクターを用いた。
（実施例１）外膜形成関連遺伝子改変大腸菌株の調製
　大腸菌のｐａｌ全欠損、部分欠損株およびｌｐｐの点変異株をＬｉｎｋ　Ａ．Ｊ．他（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９７年　１７９，６２２８－６２３７）の方法を参考にして調製した。ｐａｌ遺伝子を全欠損させるために、ＰＣＲ法により、両端にＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ切断部分を有し、ｐａｌ遺伝子外の上流・下流それぞれ約５００ｂｐのホモロジーアームを有するＤＮＡ断片（配列番号１）を増幅した。上記で調製したＤＮＡ断片およびクローニングベクターを、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩによって切断し、各切断されたＤＮＡ断片を用いてライゲーションを行った。このように調製したプラスミド（ｐΔｐａｌ）を大腸菌ＢＬ２１株に塩化カルシウム法で導入し、テトラサイクリンを含む培地を用いてｐΔｐａｌ保持株を選択した。上記Ｌｉｎｋ　Ａ．Ｊ．らの方法で、相同組換えにより目的の遺伝子が欠損されたことを確認し、得られた改変株をΔｐａｌ株とした。
　上記と同様の手順で、両端にＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ切断部位を有し、Ｐａｌの３９位から６３位を欠損させた目的の改変ｐａｌ遺伝子の上流および下流にそれぞれ約２００ｂｐのホモロジーアームを有するＤＮＡ断片（配列番号２）および、Ｌｐｐのシグナル配列の１４位のＧｌｙをＡｓｐに置換した目的の改変ｌｐｐ遺伝子の上流および下流にそれぞれ約２００ｂｐのホモロジーアームを有するＤＮＡ断片（配列番号３）を増幅し、クローニングベクター（それぞれ、「ｐｐａｌ１」、「ｐｌｐｐ１」とした）を調製した。ｐｐａｌ１及びｐｌｐｐ１についても、ｐΔｐａｌと同様にそれぞれ大腸菌ＢＬ２１株に導入し、テトラサイクリンを含む培地を用いて改変株を選択した。相同組換えにより目的の遺伝子が改変されたことを確認し、得られた改変株を、それぞれｐａｌ１株、ｌｐｐ１株とした。
（実施例２）外膜形成関連遺伝子改変大腸菌株からの目的タンパク質回収効率の測定
　本実施例は、野生株および実施例１で調製した３種の外膜形成関連遺伝子改変大腸菌株からの目的タンパク質の回収効率を調べるために実施した。本実施例では、各種大腸菌に目的タンパク質として抗フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）ＶＨＨ抗体を産生させ、その回収効率を調べた。抗ｖＷＦ　ＶＨＨ抗体をコードする遺伝子（配列番号５４）を含む発現用ベクターをエレクトロポレーション法によって導入した大腸菌を１ｍＬの半合成培地で培養した。菌体の可溶性画分に含まれる抗ｖＷＦナノボディ（目的タンパク質）の総和を回収率１００％として、各大腸菌株におけるペリプラズム画分から回収された目的タンパク質の回収効率を算出した。各画分は、以下の２つの手法をそれぞれ用いて調製した。
（１）コールドオスモティックショック法
　２５０μＬの培養液を６，４００×ｇで１０分間遠心分離し上清と細胞に分けた。細胞を２５０μＬの高張液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、５００ｍＭ　スクロース、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０）に懸濁し、室温で１０分間静置した後、１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を高張液画分１として回収した。細胞を、２５０μＬの高張液に再度懸濁して細胞を洗浄し、１２，０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を高張液画分２として回収し、細胞を２５０μＬの氷冷した低張液（１ｍＭ　ＭｇＣｌ２）に懸濁した。懸濁液を１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を低張液画分１として回収した。細胞を２５０μＬの低張液に懸濁し、１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を低張液画分２として回収した。細胞を２５０μＬのＰＢＳに懸濁し、超音波破砕機（ＵＨ－５０：ＳＭＴ社）で３０秒×２回破砕し、１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を破砕画分１として回収した。細胞を２５０μＬのＰＢＳに懸濁して洗浄した後、１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を破砕画分２として回収した。
（２）Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ法
　（１）と同様に、２５０μＬの培養液を６，４００×ｇで１０分間遠心分離し上清と細胞に分けた。細胞を２５０μＬのＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７．４）に懸濁し、室温で９０分間静置した後、１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清をＴ／Ｅ画分１として回収した。細胞を２５０μＬのＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液に再度懸濁して細胞を洗浄し、１２，０００×ｇで５分間遠心分離した。上清をＴ／Ｅ画分２として回収した。細胞を２５０μＬのＰＢＳに懸濁し、超音波破砕機（ＵＨ－５０：ＳＭＴ社）で３０秒×２回破砕し、１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を破砕画分１として回収した。細胞を２５０μＬのＰＢＳに懸濁して洗浄した後、１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を破砕画分２として回収した。
ウェスタンブロッティング解析：
　上記のコールドオスモティックショック法およびＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ法で回収した各画分６μＬに２μＬの４×Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ社）を加えて混合し、９５℃で５分間加熱したあと３μＬをポリアクリルアミドゲルにアプライした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜にブロッティングし、Ｂｌｏｃｋｎｇ　Ｏｎｅ（ナカライテスク社）でブロッキングした。ＴＢＳ－Ｔで洗浄後、抗ヒト化ＶＨＨポリクローナルウサギ抗体と抗ウサギポリクローナルヤギ抗体－ＨＲＰを用いて抗体反応を行い、ＥｚＷｅｓｔＬｕｍｉ　ｐｌｕｓ（ＡＴＴＯ社）を用いて検出し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏｒａｄ社）とＱｕａｎｔｉｔｙ　Ｏｎｅ（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いてバンド強度を求めた。バンド強度から、各画分の回収率を算出した。コールドオスモティックショック法では、高張液画分１、２、低張液画分１、２を合わせたものを、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ法では、Ｔ／Ｅ画分１、２を合わせたものを回収量とした。破砕画分１、２から生成された分も合わせた、菌体からの全抗ｖＷＦナノボディ（目的タンパク質）に占める、前記回収量の割合（回収効率）を算出し、野生株と外膜形成関連遺伝子改変大腸菌株での違いを調べた（表１）。野生株と外膜形成関連遺伝子改変大腸菌株の比較したところ、ｐａｌやｌｐｐが改変された株を用いることで、コールドオスモティックショック法とＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ法のいずれにおいても回収率が向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　いずれの株においても、培養上清中に目的タンパク質の一部の分泌が観察された（データ示さず）。培養上清中の目的タンパク質をさらに回収することで、目的タンパク質の回収量をさらに向上できることが判明した。
（実施例３）Ｋｅｉｏ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを用いた外膜形成関連遺伝子改変大腸菌株からの目的タンパク質回収効率の測定
　本実施例は、大腸菌の一遺伝子欠損ライブラリーであるＫｅｉｏ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを用いて、外膜形成関連遺伝子改変大腸菌株からの目的タンパク質の回収効率を調べるために実施した。本実施例では、大腸菌ＢＷ２５１１３の変異株であるＫｅｉｏ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのｏｍｐＡ、ｔｏｌＡ、ｍｅｐＳ、ｎｌｐＩ、ａｒｃＡ、ｃｙｏＡ、ｄｐｐＡ、ｅｃｎＢ、ｍｒｃＡ、ｍｒｃＢ、ｏｐｐＡ、及びｓｌｙＢの欠損株に、目的タンパク質として抗ｖＷＦナノボディを産生させ、その回収効率を調べた。各変異株に抗ｖＷＦナノボディをコードする遺伝子（配列番号５４）を含む発現用ベクターをエレクトロポレーション法によって導入し、０．８　ｍＬの半合成培地で培養した。各変異株について、菌体の可溶性画分に含まれる抗ｖＷＦナノボディ（目的タンパク質）の総和を回収率１００％として、ペリプラズム画分から回収された目的タンパク質の回収効率を算出した。各画分は、実施例２と同様の条件で、コールドオスモティックショック法により調製した。また、各画分の抗ｖＷＦナノボディは、実施例２と同様の条件でウェスタンブロッティング解析を行った。
　バンド強度から、各画分における抗ｖＷＦナノボディの回収率を算出した。高張液画分１、２、低張液画分１、２を合わせたものを回収量とした。破砕画分１、２から生成された分も合わせた、菌体からの全抗ｖＷＦナノボディに占める、前記回収量の割合を算出し、野生株(ＢＷ２５１１３株)と外膜形成関連遺伝子改変大腸菌株との差異を調べた（表２）。野生株と外膜形成関連遺伝子改変大腸菌株とを比較したところ、ｏｍｐＡ、ｔｏｌＡ、ｍｅｐＳ、ｎｌｐＩ、ａｒｃＡ、ｃｙｏＡ、ｄｐｐＡ、ｅｃｎＢ、ｍｒｃＡ、ｍｒｃＢ、ｏｐｐＡ、及びｓｌｙＢの欠損株を用いることで、いずれの外膜形成関連遺伝子改変大腸菌においてもコールドオスモティックショック法での回収率が向上することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (11)

  1. 　下記の（ａ）～（ｃ）の工程を含む、タンパク質の製造方法：
    　（ａ）外膜構造の維持に関連する遺伝子が改変された大腸菌に目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程、
    　（ｂ）（ａ）の大腸菌を培養する工程、及び
    　（ｃ）培養後の菌体のペリプラズム画分より目的の外来タンパク質を回収する工程。
  2. 　前記外膜構造の維持に関連する遺伝子が、ｐａｌ、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｔｏｌＡ、ｍｅｐＳ、ｎｌｐＩ、ａｒｃＡ、ｂａｍＤ、ｃｙｏＡ、ｄｐｐＡ、ｅｃｎＢ、ｍｒｃＡ、ｍｒｃＢ、ｏｐｐＡ、及びｓｌｙＢからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記大腸菌の、ｐａｌ、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｔｏｌＡ、ｍｅｐＳ、ｎｌｐＩ、ａｒｃＡ、ｂａｍＤ、ｃｙｏＡ、ｄｐｐＡ、ｅｃｎＢ、ｍｒｃＡ、ｍｒｃＢ、ｏｐｐＡ、及びｓｌｙＢからなる群から選択される２つ以上の遺伝子が改変されている、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記大腸菌の、ｐａｌ、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ及びｔｏｌＡからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が改変されている、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　前記改変が完全欠損である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記改変が部分変異である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記改変がシグナル配列の部分変異である請求項６に記載の方法。
  8. 　前記改変が構造遺伝子の部分変異である請求項６に記載の方法。
  9. 　前記大腸菌が、Ｂ株由来またはＫ１２株由来である請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　タンパク質を製造するための宿主大腸菌の作製方法であって、下記の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む、方法：
    　（ｉ）大腸菌の外膜構造の維持に関連する遺伝子を改変させる工程；及び
    　（ｉｉ）（ｉ）で得られた遺伝子が改変された大腸菌に、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程。
  11. 　前記大腸菌が目的の外来タンパク質を発現し、前記目的の外来タンパク質が前記大腸菌のペリプラズムに蓄積される、請求項１０に記載の方法。
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