JPH10150984A - 抗体分子の製造方法 - Google Patents
抗体分子の製造方法Info
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- JPH10150984A JPH10150984A JP32211696A JP32211696A JPH10150984A JP H10150984 A JPH10150984 A JP H10150984A JP 32211696 A JP32211696 A JP 32211696A JP 32211696 A JP32211696 A JP 32211696A JP H10150984 A JPH10150984 A JP H10150984A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 所期の活性をもつ抗体分子を迅速に効率よく
製造する方法を提供すること。 【解決手段】 抗体重鎖遺伝子又は抗体軽鎖遺伝子を含
有する担体ＤＮＡでラン藻細胞を形質転換することによ
りラン藻細胞で抗体重鎖タンパク及び抗体軽鎖タンパク
のそれぞれを発現させ、次いで抗体重鎖タンパクと抗体
軽鎖タンパクを in vitro で会合せしめることを特徴と
する抗体分子の製造方法。
製造する方法を提供すること。 【解決手段】 抗体重鎖遺伝子又は抗体軽鎖遺伝子を含
有する担体ＤＮＡでラン藻細胞を形質転換することによ
りラン藻細胞で抗体重鎖タンパク及び抗体軽鎖タンパク
のそれぞれを発現させ、次いで抗体重鎖タンパクと抗体
軽鎖タンパクを in vitro で会合せしめることを特徴と
する抗体分子の製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は抗体分子の製造方法
に関し、さらに詳しくは、ラン藻細胞を利用して、所期
の活性をもつ抗体分子を迅速に、効率よく製造する方法
に関する。
に関し、さらに詳しくは、ラン藻細胞を利用して、所期
の活性をもつ抗体分子を迅速に、効率よく製造する方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術及び課題】細胞融合あるいは細胞の不死化
によるモノクロナール抗体作製技術の開発などにより、
ヒトやマウス等で有用な抗体が得られるようになってき
た。それらの抗体を産生する細胞からそれらをコードす
る遺伝子が数多くクローニングされ、抗体分子中の抗原
との結合に関与する領域（ＣＤＲ：Complementary Dete
rminingRegion）を遺伝子レベルで人為的に組換えるこ
とが可能となってきた。
によるモノクロナール抗体作製技術の開発などにより、
ヒトやマウス等で有用な抗体が得られるようになってき
た。それらの抗体を産生する細胞からそれらをコードす
る遺伝子が数多くクローニングされ、抗体分子中の抗原
との結合に関与する領域（ＣＤＲ：Complementary Dete
rminingRegion）を遺伝子レベルで人為的に組換えるこ
とが可能となってきた。
【０００３】しかし、ある特定の抗原に結合する特異的
な抗体分子を得ることは必ずしも容易ではない。コンピ
ューターグラフィックを用いたモデリングによって、Ｃ
ＤＲ領域を改変した抗体分子が目的の抗原に対して実際
にどのような反応性を示すかを調べるためには、なんら
かの細胞にその抗体分子を発現させる必要がある。動物
の培養細胞を宿主として抗体分子を発現させる場合、抗
体分子を発現するための系の構築が複雑であり、また、
必ずしも効率よく抗体分子を発現させることができると
は限らない。
な抗体分子を得ることは必ずしも容易ではない。コンピ
ューターグラフィックを用いたモデリングによって、Ｃ
ＤＲ領域を改変した抗体分子が目的の抗原に対して実際
にどのような反応性を示すかを調べるためには、なんら
かの細胞にその抗体分子を発現させる必要がある。動物
の培養細胞を宿主として抗体分子を発現させる場合、抗
体分子を発現するための系の構築が複雑であり、また、
必ずしも効率よく抗体分子を発現させることができると
は限らない。
【０００４】本発明の目的はこのような問題を解決する
ための新しい手段を提供することにある。すなわち、本
発明の主たる目的は、ヒト、その他の動物、例えばマウ
ス等の抗体の重鎖又は軽鎖の遺伝子を組み込んだプラス
ミド又はＤＮＡ担体を構築し、これらのＤＮＡをラン藻
細胞に導入して重鎖及び軽鎖を別々に発現させ in vitr
o において活性化させ、迅速に活性を持った抗体分子を
得ることにある。
ための新しい手段を提供することにある。すなわち、本
発明の主たる目的は、ヒト、その他の動物、例えばマウ
ス等の抗体の重鎖又は軽鎖の遺伝子を組み込んだプラス
ミド又はＤＮＡ担体を構築し、これらのＤＮＡをラン藻
細胞に導入して重鎖及び軽鎖を別々に発現させ in vitr
o において活性化させ、迅速に活性を持った抗体分子を
得ることにある。
【０００５】
【発明の開示】本発明は、抗体重鎖遺伝子又は抗体軽鎖
遺伝子を含有する担体ＤＮＡでラン藻細胞を形質転換す
ることによりラン藻細胞で抗体重鎖タンパク及び抗体軽
鎖タンパクのそれぞれを発現させ、次いで抗体重鎖タン
パクと抗体軽鎖タンパクを invitro で会合せしめるこ
とを特徴とする抗体分子の製造方法を提供するものであ
る。
遺伝子を含有する担体ＤＮＡでラン藻細胞を形質転換す
ることによりラン藻細胞で抗体重鎖タンパク及び抗体軽
鎖タンパクのそれぞれを発現させ、次いで抗体重鎖タン
パクと抗体軽鎖タンパクを invitro で会合せしめるこ
とを特徴とする抗体分子の製造方法を提供するものであ
る。
【０００６】すなわち、本発明は、動物の培養細胞より
生育が速く、異種タンパクを効率よく容易に発現可能な
ラン藻細胞を宿主として用い、抗体の重鎖又は軽鎖をコ
ードする遺伝子を宿主の細胞で活性を持つプロモーター
及びターミネーター等と連結し、これらをＤＮＡ担体と
して又は宿主細胞中で複製可能なプラスミドに導入し、
ラン藻細胞を形質転換して宿主細胞中で効率よく抗体の
重鎖及び軽鎖タンパクを発現させ、該タンパクを in vi
tro で会合させることにより活性をもった抗体分子を調
製するものである。この方法により、動物の培養細胞を
用いた系に比べより迅速に、より効率よく且つ経済的
に、所期の活性をもった抗体分子をスクリーニングする
ことが可能となる。
生育が速く、異種タンパクを効率よく容易に発現可能な
ラン藻細胞を宿主として用い、抗体の重鎖又は軽鎖をコ
ードする遺伝子を宿主の細胞で活性を持つプロモーター
及びターミネーター等と連結し、これらをＤＮＡ担体と
して又は宿主細胞中で複製可能なプラスミドに導入し、
ラン藻細胞を形質転換して宿主細胞中で効率よく抗体の
重鎖及び軽鎖タンパクを発現させ、該タンパクを in vi
tro で会合させることにより活性をもった抗体分子を調
製するものである。この方法により、動物の培養細胞を
用いた系に比べより迅速に、より効率よく且つ経済的
に、所期の活性をもった抗体分子をスクリーニングする
ことが可能となる。
【０００７】以上、本発明の方法についてさらに詳細に
説明する。
説明する。
【０００８】（１） 担体ＤＮＡの造成 本発明に従いラン藻細胞を形質転換するために用いうる
担体ＤＮＡとしては、ヒト、その他の哺乳動物、例えば
マウス等の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする構造遺伝子
と、宿主細胞中でプロモーター活性を有する転写開始領
域、ＳＤ様配列及び転写終止領域等とを連結することに
より造成することができる。
担体ＤＮＡとしては、ヒト、その他の哺乳動物、例えば
マウス等の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする構造遺伝子
と、宿主細胞中でプロモーター活性を有する転写開始領
域、ＳＤ様配列及び転写終止領域等とを連結することに
より造成することができる。
【０００９】 抗体の重鎖又は軽鎖をコードする構造
遺伝子 本発明の方法に従い発現させうる抗体遺伝子としては特
に制限はなく、任意の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする
構造遺伝子又はその一部分のアミノ酸配列をコードする
遺伝子を用いることができる。また、抗体遺伝子はｃＤ
ＮＡ、ＲＮＡ、合成ＤＮＡであることができるが、一般
にはｃＤＮＡが好適である。かかる抗体遺伝子の具体例
としては、例えば、特願平７−３０６４２４号明細書に
記載されているＣＬＮ−ＩｇＧモノクローナル抗体の重
鎖又は軽鎖をコードするｃＤＮＡ、ＲＮＡ又は合成ＤＮ
Ａ等が挙げられる。これらの抗体遺伝子はそれを含むプ
ラスミド等から標準的方法により分離することができ
る。
遺伝子 本発明の方法に従い発現させうる抗体遺伝子としては特
に制限はなく、任意の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする
構造遺伝子又はその一部分のアミノ酸配列をコードする
遺伝子を用いることができる。また、抗体遺伝子はｃＤ
ＮＡ、ＲＮＡ、合成ＤＮＡであることができるが、一般
にはｃＤＮＡが好適である。かかる抗体遺伝子の具体例
としては、例えば、特願平７−３０６４２４号明細書に
記載されているＣＬＮ−ＩｇＧモノクローナル抗体の重
鎖又は軽鎖をコードするｃＤＮＡ、ＲＮＡ又は合成ＤＮ
Ａ等が挙げられる。これらの抗体遺伝子はそれを含むプ
ラスミド等から標準的方法により分離することができ
る。
【００１０】 転写開始領域 担体ＤＮＡの造成に使用しうる転写開始（プロモータ
ー）領域は、宿主として用いるラン藻細胞の種類に応じ
て適合するものが選択される。具体的に、例えば、プロ
モーター領域としては、リブロース−１,５−二リン酸
カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ遺伝子のプロモータ
ー領域、シアノファージＮ１のプロモーターＩ、ＩＩ、
ｐｓｂＡのプロモーター領域、K. Shinozagi らの文献
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８０：４０５０−４０
５４（１９８３）］に記載のプラスミドｐＡＮＥ１８
（ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩサイトにＲｕＢｉｓＣＯプ
ロモーター領域を含む約５.６ＭＤａのＥｃｏＲＩ断片
が挿入されているもの）を常法（例えば、T. Maniatis
et. al., Molecular cloning-A Laboratory Manual-Col
d Spring Horbor Laboratory 刊参照）に従って制限酵
素ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ及びＰｓｔＩを用いて切り出す
ことにより調製することができるＲｕＢｉｓＣｏ遺伝子
のプロモーター領域等が挙げられる。
ー）領域は、宿主として用いるラン藻細胞の種類に応じ
て適合するものが選択される。具体的に、例えば、プロ
モーター領域としては、リブロース−１,５−二リン酸
カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ遺伝子のプロモータ
ー領域、シアノファージＮ１のプロモーターＩ、ＩＩ、
ｐｓｂＡのプロモーター領域、K. Shinozagi らの文献
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８０：４０５０−４０
５４（１９８３）］に記載のプラスミドｐＡＮＥ１８
（ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩサイトにＲｕＢｉｓＣＯプ
ロモーター領域を含む約５.６ＭＤａのＥｃｏＲＩ断片
が挿入されているもの）を常法（例えば、T. Maniatis
et. al., Molecular cloning-A Laboratory Manual-Col
d Spring Horbor Laboratory 刊参照）に従って制限酵
素ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ及びＰｓｔＩを用いて切り出す
ことにより調製することができるＲｕＢｉｓＣｏ遺伝子
のプロモーター領域等が挙げられる。
【００１１】 ＳＤ様配列 本発明において用いる担体ＤＮＡには、リボソーム認識
配列として、抗体遺伝子の上流側で且つプロモーター領
域の下流側にＳＤ様配列が導入される。ＳＤ様配列とし
ては、宿主のラン藻のリボソーマルＲＮＡと相捕的なも
のを使用するのが好ましく、ラン藻としてアナキスティ
ス・ニジユランス６３０１株を用いる場合のＳＤ様配列
としてはＧＧＡＧなる塩基配列のものを使用することが
できるが、これに限られるものではなく、ＳＤ様配列と
して知られている他の塩基配列のものも同様に使用する
ことができる。そのようなＳＤ様配列は塩基数が少ない
ので、通常、合成によってつくることが多い。
配列として、抗体遺伝子の上流側で且つプロモーター領
域の下流側にＳＤ様配列が導入される。ＳＤ様配列とし
ては、宿主のラン藻のリボソーマルＲＮＡと相捕的なも
のを使用するのが好ましく、ラン藻としてアナキスティ
ス・ニジユランス６３０１株を用いる場合のＳＤ様配列
としてはＧＧＡＧなる塩基配列のものを使用することが
できるが、これに限られるものではなく、ＳＤ様配列と
して知られている他の塩基配列のものも同様に使用する
ことができる。そのようなＳＤ様配列は塩基数が少ない
ので、通常、合成によってつくることが多い。
【００１２】また、ＳＤ様配列は通常ＡＴＧ（翻訳開始
点）の前に位置し、ＳＤ様配列からＡＴＧまでの長さ
（塩基数）は抗体遺伝子の発現に影響を与える可能性が
あるので、宿主の種類、抗体遺伝子の塩基配列等に応じ
て発現量が最適となるように調節することが望ましい。
その長さは宿主ラン藻の種類、抗体遺伝子の塩基配列等
により異なるが、一般には３〜１０ベース程度であり、
最適の長さは抗体遺伝子の塩基配列等に応じて実験的に
決めることができる。
点）の前に位置し、ＳＤ様配列からＡＴＧまでの長さ
（塩基数）は抗体遺伝子の発現に影響を与える可能性が
あるので、宿主の種類、抗体遺伝子の塩基配列等に応じ
て発現量が最適となるように調節することが望ましい。
その長さは宿主ラン藻の種類、抗体遺伝子の塩基配列等
により異なるが、一般には３〜１０ベース程度であり、
最適の長さは抗体遺伝子の塩基配列等に応じて実験的に
決めることができる。
【００１３】ＳＤ様配列を含むＤＮＡ断片の調製は、通
常、ＡＴＧ（翻訳開始点）の前まで又はＡＴＧも含めて
行なうことができ、そのＤＮＡ断片の合成はそれ自体既
知の遺伝子操作技術［例えば、日本生化学会編「続生化
学実験講座１遺伝子研究法ＩＩ」東京化学同人刊（１９
８７年）参照］によって容易に行なうことができる。 転写終止領域 担体ＤＮＡの造成に使用しうる転写終止（ターミネータ
ー）領域もまた、宿主として用いるラン藻の種類に応じ
て適合するものが選択される。具体的には例えば、Anab
aena ＰＣＣ７１２０のｐｓｂＡ遺伝子のターミネータ
ー領域、ａｒｇＣ遺伝子のターミネーター領域、K. Shi
nozaki らの文献［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８
０：４０５０−４０５４（１９８３）］に記載のプラス
ミドｐＡＮＰ１１５５（ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩサイト
にＲｕＢｉｓＣＯのターミネーター領域を含む約１.５
ＭＤａのＰｓｔＩ断片が挿入されているもの）を常法に
従って制限酵素ＥｃｏＲｌとＰｓｔＩを用いて切り出す
ことにより調製することができる A. nidulans のＲｕ
ＢｉｓＣＯ遺伝子のターミネーター領域が挙げられる。
常、ＡＴＧ（翻訳開始点）の前まで又はＡＴＧも含めて
行なうことができ、そのＤＮＡ断片の合成はそれ自体既
知の遺伝子操作技術［例えば、日本生化学会編「続生化
学実験講座１遺伝子研究法ＩＩ」東京化学同人刊（１９
８７年）参照］によって容易に行なうことができる。 転写終止領域 担体ＤＮＡの造成に使用しうる転写終止（ターミネータ
ー）領域もまた、宿主として用いるラン藻の種類に応じ
て適合するものが選択される。具体的には例えば、Anab
aena ＰＣＣ７１２０のｐｓｂＡ遺伝子のターミネータ
ー領域、ａｒｇＣ遺伝子のターミネーター領域、K. Shi
nozaki らの文献［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８
０：４０５０−４０５４（１９８３）］に記載のプラス
ミドｐＡＮＰ１１５５（ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩサイト
にＲｕＢｉｓＣＯのターミネーター領域を含む約１.５
ＭＤａのＰｓｔＩ断片が挿入されているもの）を常法に
従って制限酵素ＥｃｏＲｌとＰｓｔＩを用いて切り出す
ことにより調製することができる A. nidulans のＲｕ
ＢｉｓＣＯ遺伝子のターミネーター領域が挙げられる。
【００１４】 抗体遺伝子を含有する発現可能なオペ
ロンの作成 上記のようにして調製されるプロモーター領域、ＳＤ様
配列を含むＤＮＡ断片及びターミネーター領域は、抗体
遺伝子をコードする構造遺伝子と共に、（プロモーター
領域）−（ＳＤ様配列を含むＤＮＡ断片）−（翻訳開始
コドン、ＡＴＧ）−（抗体遺伝子）−（翻訳終止コド
ン）−（ターミネーター領域）の順で、それ自体既知の
方法により連結され、ラン藻細胞で発現可能なオペロン
が造成される。
ロンの作成 上記のようにして調製されるプロモーター領域、ＳＤ様
配列を含むＤＮＡ断片及びターミネーター領域は、抗体
遺伝子をコードする構造遺伝子と共に、（プロモーター
領域）−（ＳＤ様配列を含むＤＮＡ断片）−（翻訳開始
コドン、ＡＴＧ）−（抗体遺伝子）−（翻訳終止コド
ン）−（ターミネーター領域）の順で、それ自体既知の
方法により連結され、ラン藻細胞で発現可能なオペロン
が造成される。
【００１５】プロモーター及びＳＤ配列はそれぞれ単一
である必要はなく、２つ又はそれ以上のプロモーターを
縦列させて用いたり及び／又は２つ又はそれ以上ＳＤ様
配列を縦列させて用いることも可能である。
である必要はなく、２つ又はそれ以上のプロモーターを
縦列させて用いたり及び／又は２つ又はそれ以上ＳＤ様
配列を縦列させて用いることも可能である。
【００１６】上記の抗体遺伝子を含有するオペロンは、
宿主及び／又はオペロンの種類などによっては実質的に
そのままの状態で宿主を形質転換することも可能である
が、通常は宿主に適したベクター（プラスミド）に導入
して形質転換に用いられる。さらに、宿主細胞中で活性
を示すプロモーター領域及びターミネーター領域を用い
て本発明者らによって造成されたｐＡＲＵＢ１９［Take
shima et al., ＤＮＡ Ｒｅｓ．，１：１８１−１８９
（１９９４）、（プロモーター領域）−（ＳＤ様配列を
含むＤＮＡ断片）−（マルチクローニング領域）−（タ
ーミネーター領域）を有する］のような発現プラスミド
を用いれば、抗体の重鎖もしくは軽鎖をコードする遺伝
子をそのマルチクローニング領域、例えば、ＳｐｈＩ部
位に導入することにより、ラン藻細胞で発現可能な抗体
遺伝子を含有するオペロンを構築することが可能であ
る。
宿主及び／又はオペロンの種類などによっては実質的に
そのままの状態で宿主を形質転換することも可能である
が、通常は宿主に適したベクター（プラスミド）に導入
して形質転換に用いられる。さらに、宿主細胞中で活性
を示すプロモーター領域及びターミネーター領域を用い
て本発明者らによって造成されたｐＡＲＵＢ１９［Take
shima et al., ＤＮＡ Ｒｅｓ．，１：１８１−１８９
（１９９４）、（プロモーター領域）−（ＳＤ様配列を
含むＤＮＡ断片）−（マルチクローニング領域）−（タ
ーミネーター領域）を有する］のような発現プラスミド
を用いれば、抗体の重鎖もしくは軽鎖をコードする遺伝
子をそのマルチクローニング領域、例えば、ＳｐｈＩ部
位に導入することにより、ラン藻細胞で発現可能な抗体
遺伝子を含有するオペロンを構築することが可能であ
る。
【００１７】 ベクター 前記の発現可能なオペロンを導入しうるベクターとして
は、ラン藻細胞中で用いられる広範囲の種類のベクター
を使用することができ、例えば、ｐＵＣ１０４、ｐＵＣ
１０５［C. J. Kuhlemeier et al., Mol. Gen. Genet.
１８４：２４９−２５４（１９８１）参照］；ｐＬＳ１
０３［L. A. Sherman and P. van de Putte, J. Bacter
iol., １５０：４１０−４１３（１９８２）参照］；ｐ
ＤＰＬ１３［S. Gendel et al., J. Bacteriol., １５
６：１４８−１５４（１９８３）参照］；ｐＵＣ３０３
［C. J. Kuhlemeier et al., Plasmid １０：１５６−
１６３（１９８３）参照］；ｐＳＧ１１１［S. S. Gold
en and L. A. Sherman, J.Bacteriol., １５５：９６６
−９７２（１９８３）参照］；ｐＰＵＣ２９［C.J. Kuh
lemeier et al., Gene ３１：１０９−１１６（１９８
４）参照］；ｐＰＬＡＮＢａｌ［D. E. Laudenbach et
al., Mol. Gen. Genet., １９９：３００−３０５（１
９８５）参照］；ｐＢＡＳ１８［K. Shinozaki et al.,
Gene １９：２２１−２２４（１９８２）参照］などが
挙げられる。
は、ラン藻細胞中で用いられる広範囲の種類のベクター
を使用することができ、例えば、ｐＵＣ１０４、ｐＵＣ
１０５［C. J. Kuhlemeier et al., Mol. Gen. Genet.
１８４：２４９−２５４（１９８１）参照］；ｐＬＳ１
０３［L. A. Sherman and P. van de Putte, J. Bacter
iol., １５０：４１０−４１３（１９８２）参照］；ｐ
ＤＰＬ１３［S. Gendel et al., J. Bacteriol., １５
６：１４８−１５４（１９８３）参照］；ｐＵＣ３０３
［C. J. Kuhlemeier et al., Plasmid １０：１５６−
１６３（１９８３）参照］；ｐＳＧ１１１［S. S. Gold
en and L. A. Sherman, J.Bacteriol., １５５：９６６
−９７２（１９８３）参照］；ｐＰＵＣ２９［C.J. Kuh
lemeier et al., Gene ３１：１０９−１１６（１９８
４）参照］；ｐＰＬＡＮＢａｌ［D. E. Laudenbach et
al., Mol. Gen. Genet., １９９：３００−３０５（１
９８５）参照］；ｐＢＡＳ１８［K. Shinozaki et al.,
Gene １９：２２１−２２４（１９８２）参照］などが
挙げられる。
【００１８】また、そのようなベクターは、プラスミド
及びウイルスから必要に応じて誘導することができ、例
えば、アナキスティス・ニデュランス由来のプラスミド
ｐＢＡ１の複製開始領域（ＯｒｉＡ）と、プラスミドｐ
ＵＣのマルチクローニング領域と、大腸菌ＣｏｌＥ１系
プラスミドの複製開始領域（ＯｒｉＥ）とから本発明者
らによって造成された大腸菌及びラン藻細胞内で複製可
能なシャトルベクターｐＢＡＳ１０、ｐＢＡＳ１０Ｒ、
ｐＢＡＸ１８、ｐＢＡＸ１８Ｒ［Takeshima etal., Ｄ
ＮＡ Ｒｅｓ.,１：１８１−１８９（１９９４）参
照］；ｐＢＡＸ２０［特開平４−２８１７９３公報参
照］なども有利に使用することができる。
及びウイルスから必要に応じて誘導することができ、例
えば、アナキスティス・ニデュランス由来のプラスミド
ｐＢＡ１の複製開始領域（ＯｒｉＡ）と、プラスミドｐ
ＵＣのマルチクローニング領域と、大腸菌ＣｏｌＥ１系
プラスミドの複製開始領域（ＯｒｉＥ）とから本発明者
らによって造成された大腸菌及びラン藻細胞内で複製可
能なシャトルベクターｐＢＡＳ１０、ｐＢＡＳ１０Ｒ、
ｐＢＡＸ１８、ｐＢＡＸ１８Ｒ［Takeshima etal., Ｄ
ＮＡ Ｒｅｓ.,１：１８１−１８９（１９９４）参
照］；ｐＢＡＸ２０［特開平４−２８１７９３公報参
照］なども有利に使用することができる。
【００１９】 担体ＤＮＡの構築 上記で述べた抗体遺伝子を含有する発現可能なオペロ
ンは、それ自体既知の遺伝子操作技術によって、上記
で述べた如きベクター（プラスミド）に導入することが
できる。
ンは、それ自体既知の遺伝子操作技術によって、上記
で述べた如きベクター（プラスミド）に導入することが
できる。
【００２０】例えば、モノクローナル抗体ＣＬＮ−Ｉｇ
Ｇの重鎖をコードする構造遺伝子を用いて前記に述べ
た如くして調製されるオペロンは、例えばアナキスティ
ス・ニデュランス細胞中で複製可能なシャトルベクター
ｐＢＡＸ１８、ｐＢＡＳ１０、ｐＢＡＸ２０などに例え
ばＥｃｏＲＩを用いて開裂させ、おのおののＤＮＡ断片
を一緒にし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを作用させることによ
り挿入され、抗体遺伝子発現プラスミドが得られる。ベ
クターに挿入されるオペロンは一つである必要はなく、
同一方向であれば、２、３、４個又はそれ以上縦列させ
ることも可能である。
Ｇの重鎖をコードする構造遺伝子を用いて前記に述べ
た如くして調製されるオペロンは、例えばアナキスティ
ス・ニデュランス細胞中で複製可能なシャトルベクター
ｐＢＡＸ１８、ｐＢＡＳ１０、ｐＢＡＸ２０などに例え
ばＥｃｏＲＩを用いて開裂させ、おのおののＤＮＡ断片
を一緒にし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを作用させることによ
り挿入され、抗体遺伝子発現プラスミドが得られる。ベ
クターに挿入されるオペロンは一つである必要はなく、
同一方向であれば、２、３、４個又はそれ以上縦列させ
ることも可能である。
【００２１】（２） 形質転換及び発現 本発明に従えば、以上の如くして造成される担体ＤＮＡ
を用いてラン藻細胞が形質転換される。その際に使用し
うるラン藻細胞としては、例えば、アナキスティス・ニ
デュランス６３０１株（Synechococcus ＰＣＣ６３０
１）、アナキスティス・ニデュランスＲ２株（Synechoc
occus ＰＣＣ７９４２）、SynechococcusＰＣＣ７００
２、Synechococcus ＰＣＣ７４１８（Aphanothece halo
phytica）、Synechocystis ＰＣＣ６８０３、Synechocy
stis ＰＣＣ６７１４、Spirulinaplatensis、 Anabaena
ＰＣＣ７１２０（Nostoc ＰＣＣ７１２０）、Nostoc Ｐ
ＣＣ７１１９（Anabaena ＰＣＣ７１１９）、Calothrix
ＰＣＣ７６０１などのほか、本発明者らが水前寺苔か
ら単離した単細胞性のラン藻（Aphanothece sacrum、 特
願平８−１９１６０５号明細書参照）などが挙げられ
る。
を用いてラン藻細胞が形質転換される。その際に使用し
うるラン藻細胞としては、例えば、アナキスティス・ニ
デュランス６３０１株（Synechococcus ＰＣＣ６３０
１）、アナキスティス・ニデュランスＲ２株（Synechoc
occus ＰＣＣ７９４２）、SynechococcusＰＣＣ７００
２、Synechococcus ＰＣＣ７４１８（Aphanothece halo
phytica）、Synechocystis ＰＣＣ６８０３、Synechocy
stis ＰＣＣ６７１４、Spirulinaplatensis、 Anabaena
ＰＣＣ７１２０（Nostoc ＰＣＣ７１２０）、Nostoc Ｐ
ＣＣ７１１９（Anabaena ＰＣＣ７１１９）、Calothrix
ＰＣＣ７６０１などのほか、本発明者らが水前寺苔か
ら単離した単細胞性のラン藻（Aphanothece sacrum、 特
願平８−１９１６０５号明細書参照）などが挙げられ
る。
【００２２】前記の担体ＤＮＡによるこれらラン藻細胞
の形質転換はそれ自体既知の方法、例えば、R. D. Port
er［ＣＲＣ Critical Reviews in Microbiology １３
（２）：１１１−１３２（１９８５）］、D. A. Lightf
oot ら［J. General. Microbiology １３４：１５０９
−１５１４（１９８８）］、S. S. Golden ら［J. Bact
eriology １５８：３６−４２（１９８４）］、H. Dani
ell ら［Proc.,Natl. Acad. Sci. USA ８３：２５４６
−２５５０（１９８６）］、T. Matsunaga ら［Appl. B
iochem. Biotechnol. ２４／２５：１５１−１６０（１
９９０）］、落合英夫［バイオサイエンスとインダスト
リー４９：７４９−７５１（１９９１）］などの方法に
従って行うことができる。
の形質転換はそれ自体既知の方法、例えば、R. D. Port
er［ＣＲＣ Critical Reviews in Microbiology １３
（２）：１１１−１３２（１９８５）］、D. A. Lightf
oot ら［J. General. Microbiology １３４：１５０９
−１５１４（１９８８）］、S. S. Golden ら［J. Bact
eriology １５８：３６−４２（１９８４）］、H. Dani
ell ら［Proc.,Natl. Acad. Sci. USA ８３：２５４６
−２５５０（１９８６）］、T. Matsunaga ら［Appl. B
iochem. Biotechnol. ２４／２５：１５１−１６０（１
９９０）］、落合英夫［バイオサイエンスとインダスト
リー４９：７４９−７５１（１９９１）］などの方法に
従って行うことができる。
【００２３】例えば、抗体遺伝子発現プラスミドをアナ
キスティス・ニデュランスへ D. A.Lightfoot らの方法
で導入し形質転換することができる。得られる形質転換
体はアンピシリン耐性などにより選抜した後、イムノブ
ロッティング法、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等
により所期の形質転換体が得られていることを確認する
ことができる。
キスティス・ニデュランスへ D. A.Lightfoot らの方法
で導入し形質転換することができる。得られる形質転換
体はアンピシリン耐性などにより選抜した後、イムノブ
ロッティング法、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等
により所期の形質転換体が得られていることを確認する
ことができる。
【００２４】このようにして得られる形質転換体は、宿
主細胞の増殖に適したそれ自体既知の培地で培養され
る。その際、形質転換体が選択的に増殖するための適当
な薬剤、例えばアンピシリン等を加えることが好まし
く、また、必要があれば発現を誘導するための薬剤の培
地中への添加あるいは温度や光等の培養条件を変更する
ことができる。
主細胞の増殖に適したそれ自体既知の培地で培養され
る。その際、形質転換体が選択的に増殖するための適当
な薬剤、例えばアンピシリン等を加えることが好まし
く、また、必要があれば発現を誘導するための薬剤の培
地中への添加あるいは温度や光等の培養条件を変更する
ことができる。
【００２５】形質転換体宿主がアナキスティス・ニデュ
ランスの場合、培地としてはＢＧ−１１培地、ＭＡ培地
等が適しており、また、培養条件として、培養温度は一
般に１０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃の範囲内が
適している。さらに、培地のｐＨは通常７〜９の範囲内
及び照度は５００〜５０００ルクスの範囲内が適してい
る。このような条件下に培養は５〜２０日程度行うこと
ができる。また、培養は静置又は撹拌下で行うことがで
きる。
ランスの場合、培地としてはＢＧ−１１培地、ＭＡ培地
等が適しており、また、培養条件として、培養温度は一
般に１０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃の範囲内が
適している。さらに、培地のｐＨは通常７〜９の範囲内
及び照度は５００〜５０００ルクスの範囲内が適してい
る。このような条件下に培養は５〜２０日程度行うこと
ができる。また、培養は静置又は撹拌下で行うことがで
きる。
【００２６】（３） 抗体分子の in vitro 構築 上記の如くして得られる抗体重鎖タンパク及び抗体軽鎖
タンパクをそれぞれ含む画分は、そのまま重鎖タンパク
及び軽鎖タンパクの量がほぼ等しくなるような割合で混
合し、適当な温度、例えば、約４〜約４０℃の温度でイ
ンキュベートし、そして場合によっては適当な緩衝液に
対する透析を行なって、抗体重鎖タンパクと抗体軽鎖タ
ンパクとを会合させ、目的とする活性のある抗体分子を
形成せしめる。
タンパクをそれぞれ含む画分は、そのまま重鎖タンパク
及び軽鎖タンパクの量がほぼ等しくなるような割合で混
合し、適当な温度、例えば、約４〜約４０℃の温度でイ
ンキュベートし、そして場合によっては適当な緩衝液に
対する透析を行なって、抗体重鎖タンパクと抗体軽鎖タ
ンパクとを会合させ、目的とする活性のある抗体分子を
形成せしめる。
【００２７】抗体分子の形成の確認は、通常のアッセイ
技術、例えば、該抗体分子に抗原性を示す分子を用いる
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって行なうこと
ができる。
技術、例えば、該抗体分子に抗原性を示す分子を用いる
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって行なうこと
ができる。
【００２８】このようにして再構築された抗体分子は、
通常の方法、例えば、塩析、透析、イオン交換クロマト
グラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、クロマトフ
ォーカシング、ハイドロフォービックインターラクショ
ンクロマトグラフィー、アフィニティ−クロマトグラフ
ィー、電気泳動などの物理学的手法あるいは生化学的手
法を適宜組合わせて用いることにより精製回収すること
ができる。
通常の方法、例えば、塩析、透析、イオン交換クロマト
グラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、クロマトフ
ォーカシング、ハイドロフォービックインターラクショ
ンクロマトグラフィー、アフィニティ−クロマトグラフ
ィー、電気泳動などの物理学的手法あるいは生化学的手
法を適宜組合わせて用いることにより精製回収すること
ができる。
【００２９】このようにして製造される抗体分子は、例
えば、目的の活性を持つ抗体をスクリーニングするため
に用いることができる。また、大量に回収することがで
きれば、ＥＬＩＳＡ等の免疫学的手法のための一次抗体
としても利用することができる。さらに、ＣＬＮ−Ｉｇ
Ｇのような抗癌性ヒト モノクローナル抗体であれば、
ラン藻に発現させて製造された抗体分子を抗癌のための
ワクチンとして用いることも可能である。
えば、目的の活性を持つ抗体をスクリーニングするため
に用いることができる。また、大量に回収することがで
きれば、ＥＬＩＳＡ等の免疫学的手法のための一次抗体
としても利用することができる。さらに、ＣＬＮ−Ｉｇ
Ｇのような抗癌性ヒト モノクローナル抗体であれば、
ラン藻に発現させて製造された抗体分子を抗癌のための
ワクチンとして用いることも可能である。
【００３０】
【実施例】以下、本発明を実施例によってさらに具体的
に説明する。なお、実施例で用いるクローニングベクタ
ーは以下の如くして調製した。
に説明する。なお、実施例で用いるクローニングベクタ
ーは以下の如くして調製した。
【００３１】クローニングベクターの調製 ヒト モノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧの重鎖（γ）
をコードするｃＤＮＡクローニングベクターｐＧ６１１
（特願平７−３０６４２４号明細書参照）を有する大腸
菌ＪＭ１０９株及びＣＬＮ−ＩｇＧの軽鎖（κ）をコー
ドするｃＤＮＡクローニングベクターｐＫ４１３（特開
平７−３０６４２４号明細書参照）を有する大腸菌ＪＭ
１０９株をおのおの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
む１００ｍｌの２ＹＴ培地（トリプトン１８ｇ／ｌ、酵
母抽出エキス１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ）を
加え、３７℃で一晩振とうさせながら培養した。これら
の細胞をおのおの１００００ｒｐｍで１０分間遠心して
集め、３０ｍｌのＳＥＴ（２０％ショ糖、５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７.６）に懸濁
し、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを調製
した。おのおのの細胞懸濁液に７０ｍｌの溶菌混合液
（１％ＳＤＳ、０.２Ｎ水酸化ナトリウム）を加えて穏
やかに混合することにより大腸菌を溶菌させた。１５分
間氷冷した後、３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４.８）を加
え、穏やかに混ぜることにより変性したゲノムＤＮＡ、
タンパク質およびＳＤＳを白沈させた。これらの溶液を
１００００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心して上清を得、
得られたおのおのの上清に等量のイソプロパノールを加
えた。これらの混合液を１００００ｒｐｍ、４℃で１０
分間遠心してプラスミドＤＮＡを沈澱させた。上澄みを
捨て、おのおののペレットを６ｍｌのＴＥ（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）に溶解し、お
のおのの溶液に２ｍｌの８Ｍ ＬｉＣｌを加えて氷浴中
でインキュベートした。４時間後、生じたＲＮＡの沈澱
を１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心しておのおの
上清を得た。得られた上清におのおの２倍量のエタノー
ルを加え、１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心して
プラスミドＤＮＡの沈澱を集めた。おのおののプラスミ
ドＤＮＡを２ｍｌのＴＥに溶解し、５μｌの１０ｍｇ／
ｍｌ ＲＮａｓｅをおのおの加えて３７℃でインキュベ
ートした。２時間後、これらの溶液に等量のフェノー
ル：クロロホルム：イソアミル アルコール（２５：２
４：１）を加え、ボルテックスでよく混合した後、１５
０００ｒｐｍで４分間遠心して水層をおのおの得た（２
回）。これらの溶液に等量のクロロホルム：イソアミル
アルコール（２４：１）を加えよく撹拌し、１５０００
ｒｐｍで３分間遠心して上層をおのおの得た。これらの
水溶液に２００μｌの５Ｍ塩化ナトリウム及び２.５容
のエタノールを加えよく混合して１０分間放置した後、
おのおののプラスミドＤＮＡの沈澱を１５０００ｒｐ
ｍ、４℃で２０分間遠心して集めた。おのおのの沈澱を
７０％エタノールで洗浄し、真空デシケーター中で乾固
させた。おのおののＤＮＡを５０μｌのＴＥに溶解し、
以下の実施例に用いた。
をコードするｃＤＮＡクローニングベクターｐＧ６１１
（特願平７−３０６４２４号明細書参照）を有する大腸
菌ＪＭ１０９株及びＣＬＮ−ＩｇＧの軽鎖（κ）をコー
ドするｃＤＮＡクローニングベクターｐＫ４１３（特開
平７−３０６４２４号明細書参照）を有する大腸菌ＪＭ
１０９株をおのおの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
む１００ｍｌの２ＹＴ培地（トリプトン１８ｇ／ｌ、酵
母抽出エキス１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ）を
加え、３７℃で一晩振とうさせながら培養した。これら
の細胞をおのおの１００００ｒｐｍで１０分間遠心して
集め、３０ｍｌのＳＥＴ（２０％ショ糖、５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７.６）に懸濁
し、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを調製
した。おのおのの細胞懸濁液に７０ｍｌの溶菌混合液
（１％ＳＤＳ、０.２Ｎ水酸化ナトリウム）を加えて穏
やかに混合することにより大腸菌を溶菌させた。１５分
間氷冷した後、３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４.８）を加
え、穏やかに混ぜることにより変性したゲノムＤＮＡ、
タンパク質およびＳＤＳを白沈させた。これらの溶液を
１００００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心して上清を得、
得られたおのおのの上清に等量のイソプロパノールを加
えた。これらの混合液を１００００ｒｐｍ、４℃で１０
分間遠心してプラスミドＤＮＡを沈澱させた。上澄みを
捨て、おのおののペレットを６ｍｌのＴＥ（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）に溶解し、お
のおのの溶液に２ｍｌの８Ｍ ＬｉＣｌを加えて氷浴中
でインキュベートした。４時間後、生じたＲＮＡの沈澱
を１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心しておのおの
上清を得た。得られた上清におのおの２倍量のエタノー
ルを加え、１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心して
プラスミドＤＮＡの沈澱を集めた。おのおののプラスミ
ドＤＮＡを２ｍｌのＴＥに溶解し、５μｌの１０ｍｇ／
ｍｌ ＲＮａｓｅをおのおの加えて３７℃でインキュベ
ートした。２時間後、これらの溶液に等量のフェノー
ル：クロロホルム：イソアミル アルコール（２５：２
４：１）を加え、ボルテックスでよく混合した後、１５
０００ｒｐｍで４分間遠心して水層をおのおの得た（２
回）。これらの溶液に等量のクロロホルム：イソアミル
アルコール（２４：１）を加えよく撹拌し、１５０００
ｒｐｍで３分間遠心して上層をおのおの得た。これらの
水溶液に２００μｌの５Ｍ塩化ナトリウム及び２.５容
のエタノールを加えよく混合して１０分間放置した後、
おのおののプラスミドＤＮＡの沈澱を１５０００ｒｐ
ｍ、４℃で２０分間遠心して集めた。おのおのの沈澱を
７０％エタノールで洗浄し、真空デシケーター中で乾固
させた。おのおののＤＮＡを５０μｌのＴＥに溶解し、
以下の実施例に用いた。
【００３２】実施例１：抗体遺伝子発現プラスミドの構
築 （１−ｉ） 抗体遺伝子の調製 １.５ｍｌ容エッペンドルフチューブに５μｇ（２０μ
ｌ）のヒトモノクローナル抗体ＣＬＮ ＩｇＧの重鎖
（γ）をコードするｃＤＮＡクローニングベクターｐＧ
６１１をとり、１０μｌの１０ＸＨ緩衝液（５００ｍＭ
トリス−塩酸、ｐＨ７.５、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、１
０ｍＭジチオスレイトール、１０００ｍＭＮａＣｌ）、
４μｌのＥｃｏＲＩ（１０ｕｎｉｔｓ／μｌ）および滅
菌水を加えて１００μｌとした。このチューブを３７℃
で４時間反応させた後、１／１０容の３Ｍ酢酸カリウム
および３倍容のエタノールを加え、−８０℃のフリーザ
ー中で冷却した。このチューブを１５０００ｒｐｍで１
０分間遠心してＤＮＡを沈澱させた。上澄みを捨て、７
０％エタノールで洗浄した後、真空デシケーター中で乾
固させた。
築 （１−ｉ） 抗体遺伝子の調製 １.５ｍｌ容エッペンドルフチューブに５μｇ（２０μ
ｌ）のヒトモノクローナル抗体ＣＬＮ ＩｇＧの重鎖
（γ）をコードするｃＤＮＡクローニングベクターｐＧ
６１１をとり、１０μｌの１０ＸＨ緩衝液（５００ｍＭ
トリス−塩酸、ｐＨ７.５、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、１
０ｍＭジチオスレイトール、１０００ｍＭＮａＣｌ）、
４μｌのＥｃｏＲＩ（１０ｕｎｉｔｓ／μｌ）および滅
菌水を加えて１００μｌとした。このチューブを３７℃
で４時間反応させた後、１／１０容の３Ｍ酢酸カリウム
および３倍容のエタノールを加え、−８０℃のフリーザ
ー中で冷却した。このチューブを１５０００ｒｐｍで１
０分間遠心してＤＮＡを沈澱させた。上澄みを捨て、７
０％エタノールで洗浄した後、真空デシケーター中で乾
固させた。
【００３３】残ったＤＮＡを４０μｌの１０ｍＭトリス
−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８.０、ＴＥ）溶解し、１％ア
ガロースゲルに載せ、５０Ｖの電圧で電気泳動を行って
プラスミドＤＮＡと抗体遺伝子（約１.７ｋｂ）とを分
離した。このゲルを臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色
し、トランスイルミネーター上で目的の大きさの断片を
含むバンドを切り出した。このゲルを細かく切り、２ｍ
ｌ容エッペンドルフチューブに入れ、このゲルの３倍容
の飽和ヨウ化ナトリウム溶液（ＤＮＡ精製キット ジー
ンクリーンに含まれる、米国ＢｌＯ １０１社製）を加
えた。５０℃でインキュベートして目的のＤＮＡを含む
アガロースゲルを完全に溶解し、２０μｌのガラスミル
ク（ジーンクリーンに含まれる）を加えた。このチュー
ブを氷浴中で１０分間インキュベートし、すぐに１５０
００ｒｐｍで３０秒間遠心してガラスミルクを沈澱させ
た。このガラスミルクを３００μｌの飽和ＮａＩ溶液に
懸濁し、再び遠心することにより洗浄した。同様に５０
０μｌのＮＥＷ洗浄液（ジーンクリーンに含まれる）で
３回洗浄した。洗浄液を完全に除いた後、５０μｌの滅
菌水にガラスミルクを懸濁し、５５℃で５分間インキュ
ベートした。インキュベート後、１５０００ｒｐｍで３
分間遠心して上澄みを得た。
−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８.０、ＴＥ）溶解し、１％ア
ガロースゲルに載せ、５０Ｖの電圧で電気泳動を行って
プラスミドＤＮＡと抗体遺伝子（約１.７ｋｂ）とを分
離した。このゲルを臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色
し、トランスイルミネーター上で目的の大きさの断片を
含むバンドを切り出した。このゲルを細かく切り、２ｍ
ｌ容エッペンドルフチューブに入れ、このゲルの３倍容
の飽和ヨウ化ナトリウム溶液（ＤＮＡ精製キット ジー
ンクリーンに含まれる、米国ＢｌＯ １０１社製）を加
えた。５０℃でインキュベートして目的のＤＮＡを含む
アガロースゲルを完全に溶解し、２０μｌのガラスミル
ク（ジーンクリーンに含まれる）を加えた。このチュー
ブを氷浴中で１０分間インキュベートし、すぐに１５０
００ｒｐｍで３０秒間遠心してガラスミルクを沈澱させ
た。このガラスミルクを３００μｌの飽和ＮａＩ溶液に
懸濁し、再び遠心することにより洗浄した。同様に５０
０μｌのＮＥＷ洗浄液（ジーンクリーンに含まれる）で
３回洗浄した。洗浄液を完全に除いた後、５０μｌの滅
菌水にガラスミルクを懸濁し、５５℃で５分間インキュ
ベートした。インキュベート後、１５０００ｒｐｍで３
分間遠心して上澄みを得た。
【００３４】次に、５０μｌのＴＥにガラスミルクを懸
濁し、５５℃でのインキュベートおよび遠心により上澄
みをとり、前の操作で得た上澄みと合わせ１つにした。
この溶液に等量のフェノール（ＴＥで飽和、ｐＨ８.
０）を加え、ボルデックスでよく混合した後、１５００
０ｒｐｍで３分間遠心して水層を得た。この溶液に等量
のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を
加えよく撹拌し、１５０００ｒｐｍで３分間遠心して上
層を得た。この水溶液に３.３μｌの３Ｍ酢酸ナトリウ
ムおよび１μｌのエタ沈メート（ニッポンジーン社製）
を加え、よく撹拌した後、２−２.５倍容のエタノール
を加え１５０００ｒｐｍで１０分間遠心してＤＮＡを沈
澱させた。沈澱を７０％エタノールで洗浄し、真空デシ
ケーター中でＤＮＡを乾固させた。ＤＮＡを８μｌの滅
菌水に溶解し、ＤＮＡ blunting kit（宝酒造社製）の
１０Ｘ反応液１μｌを加え７０℃でインキュベートし
た。５分後、このチューブを３７℃のインキュベーター
に移し、１μｌのＴ4ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ blun
ting kit 含まれる）を加え５分間インキュベートし
た。９０μｌの５０ｍＭトリス−５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８.０）を加え、激しくボルデックスすることにより
反応を停止させた。フェノール：クロロホルム、クロロ
ホルム抽出、エタノール沈澱してＤＮＡを回収した。得
られたＤＮＡを１０μｌのＴＥに溶解し、以下の実験に
用いた。
濁し、５５℃でのインキュベートおよび遠心により上澄
みをとり、前の操作で得た上澄みと合わせ１つにした。
この溶液に等量のフェノール（ＴＥで飽和、ｐＨ８.
０）を加え、ボルデックスでよく混合した後、１５００
０ｒｐｍで３分間遠心して水層を得た。この溶液に等量
のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を
加えよく撹拌し、１５０００ｒｐｍで３分間遠心して上
層を得た。この水溶液に３.３μｌの３Ｍ酢酸ナトリウ
ムおよび１μｌのエタ沈メート（ニッポンジーン社製）
を加え、よく撹拌した後、２−２.５倍容のエタノール
を加え１５０００ｒｐｍで１０分間遠心してＤＮＡを沈
澱させた。沈澱を７０％エタノールで洗浄し、真空デシ
ケーター中でＤＮＡを乾固させた。ＤＮＡを８μｌの滅
菌水に溶解し、ＤＮＡ blunting kit（宝酒造社製）の
１０Ｘ反応液１μｌを加え７０℃でインキュベートし
た。５分後、このチューブを３７℃のインキュベーター
に移し、１μｌのＴ4ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ blun
ting kit 含まれる）を加え５分間インキュベートし
た。９０μｌの５０ｍＭトリス−５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８.０）を加え、激しくボルデックスすることにより
反応を停止させた。フェノール：クロロホルム、クロロ
ホルム抽出、エタノール沈澱してＤＮＡを回収した。得
られたＤＮＡを１０μｌのＴＥに溶解し、以下の実験に
用いた。
【００３５】また、１.５ｍｌ容エッペンドルフチュー
ブにヒトモノクローナル抗体ＣＬＮＩｇＧの軽鎖（κ）
をコードするｃＤＮＡのクローニングベクターｐＫ４１
３を５μｇ（２０μｌ）とり、１０μｌの１０ＸＨ緩衝
液、４μｌのＥｃｏＲＩ（１０ｕｎｉｔｓ／μｌ）およ
び滅菌水を加えて１００μｌとした。このチューブを３
７℃で４時間反応させた後、ＤＮＡをエタノール沈澱し
て回収し、１％アガロースゲルに載せ電気泳動を行って
プラスミドＤＮＡと抗体遺伝子（約１.０ｋｂ）とを分
離させた。このゲルをＥｔＢｒで染色した後、トランス
イルミネーター上で目的の大きさの断片を含むバンドを
切り出し、ＤＮＡをジーンクリーンを用いてアガロース
から溶出した。溶出したＤＮＡ（１００μｌ）をフェノ
ール、クロロホルム抽出・エタノール沈澱により精製し
た。得られたＤＮＡを８μｌの滅菌水に溶解し、ＤＮＡ
Blunting Kit を用いてこのＤＮＡの両末端を平滑末端
化した。フェノール：クロロホルム、クロロホルム抽
出、エタノール沈澱してＤＮＡを沈澱させた。得られた
ＤＮＡを１０μｌのＴＥに溶解し、以下の実験に用い
た。
ブにヒトモノクローナル抗体ＣＬＮＩｇＧの軽鎖（κ）
をコードするｃＤＮＡのクローニングベクターｐＫ４１
３を５μｇ（２０μｌ）とり、１０μｌの１０ＸＨ緩衝
液、４μｌのＥｃｏＲＩ（１０ｕｎｉｔｓ／μｌ）およ
び滅菌水を加えて１００μｌとした。このチューブを３
７℃で４時間反応させた後、ＤＮＡをエタノール沈澱し
て回収し、１％アガロースゲルに載せ電気泳動を行って
プラスミドＤＮＡと抗体遺伝子（約１.０ｋｂ）とを分
離させた。このゲルをＥｔＢｒで染色した後、トランス
イルミネーター上で目的の大きさの断片を含むバンドを
切り出し、ＤＮＡをジーンクリーンを用いてアガロース
から溶出した。溶出したＤＮＡ（１００μｌ）をフェノ
ール、クロロホルム抽出・エタノール沈澱により精製し
た。得られたＤＮＡを８μｌの滅菌水に溶解し、ＤＮＡ
Blunting Kit を用いてこのＤＮＡの両末端を平滑末端
化した。フェノール：クロロホルム、クロロホルム抽
出、エタノール沈澱してＤＮＡを沈澱させた。得られた
ＤＮＡを１０μｌのＴＥに溶解し、以下の実験に用い
た。
【００３６】（１ーｉｉ） 発現プラスミド構築のため
のベクターの調製 アナキスティス・ニデュランス６３０１株（Anacystis
nidulans ６３０１）のための発現ベクターｐＡＲＵＢ
１９（Takeshima ら、ＤＮＡ Research １：１８１−１
８９、１９９４）５μｇを１.５ｍｌ容エッペンドルフ
チューブに入れ、５μｌ １０ＸＫ緩衝液（２００ｍＭ
トリス−塩酸、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭジチオ
スレイトール、１０００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８.５）、２
μｌ ＳｐｈＩ（宝酒造社製、２４ユニット）に滅菌水
を加えて５０μｌとし、３７℃で４時間インキュベート
した。この反応液を１％アガロースゲルを用いた電気泳
動により、未消化のベクターＤＮＡとＳｐｈＩで消化さ
れたベクターＤＮＡとを分離した。ＳｐｈＩで消化され
たベクターＤＮＡをジーンクリーンを用いてアガロース
ゲルから溶出し、フェノール、クロロホルム抽出、エタ
ノール沈澱を行って精製した。精製したＤＮＡを４４μ
ｌの滅菌水に溶解し、５μｌの１０Ｘ反応液（５００ｍ
Ｍトリス−塩酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ９.０）お
よび１μｌ（０.３ｕｎｉｔｓ／μｌ）のアルカリホス
ファターゼ（大腸菌Ｃ７５由来、宝酒造社製）を加え６
５℃でインキュベートした。１時間後、さらに１μｌの
アルカリホスファターゼを加え３７℃で１時間インキュ
ベートした。反応液に等量のフェノール：クロロホル
ム、クロロホルム抽出およびエタノール沈澱してＤＮＡ
を精製、回収した。回収したＤＮＡを２０μｌのＴＥに
溶解し、次の実験に用いた。
のベクターの調製 アナキスティス・ニデュランス６３０１株（Anacystis
nidulans ６３０１）のための発現ベクターｐＡＲＵＢ
１９（Takeshima ら、ＤＮＡ Research １：１８１−１
８９、１９９４）５μｇを１.５ｍｌ容エッペンドルフ
チューブに入れ、５μｌ １０ＸＫ緩衝液（２００ｍＭ
トリス−塩酸、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭジチオ
スレイトール、１０００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８.５）、２
μｌ ＳｐｈＩ（宝酒造社製、２４ユニット）に滅菌水
を加えて５０μｌとし、３７℃で４時間インキュベート
した。この反応液を１％アガロースゲルを用いた電気泳
動により、未消化のベクターＤＮＡとＳｐｈＩで消化さ
れたベクターＤＮＡとを分離した。ＳｐｈＩで消化され
たベクターＤＮＡをジーンクリーンを用いてアガロース
ゲルから溶出し、フェノール、クロロホルム抽出、エタ
ノール沈澱を行って精製した。精製したＤＮＡを４４μ
ｌの滅菌水に溶解し、５μｌの１０Ｘ反応液（５００ｍ
Ｍトリス−塩酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ９.０）お
よび１μｌ（０.３ｕｎｉｔｓ／μｌ）のアルカリホス
ファターゼ（大腸菌Ｃ７５由来、宝酒造社製）を加え６
５℃でインキュベートした。１時間後、さらに１μｌの
アルカリホスファターゼを加え３７℃で１時間インキュ
ベートした。反応液に等量のフェノール：クロロホル
ム、クロロホルム抽出およびエタノール沈澱してＤＮＡ
を精製、回収した。回収したＤＮＡを２０μｌのＴＥに
溶解し、次の実験に用いた。
【００３７】（１−ｉｉｉ） 発現プラスミドの構築 実施例１−ｉおよび１−ｉｉで調製したＣＬＮ ＩｇＧ
の重鎖（γ）をコードするＥｃｏＲＩ断片０.１μｇ
（１μｌ）とＳｐｈＩ、ポリメラーゼおよびアルカリホ
スファターゼ処理したｐＡＲＵＢ１９０.４μｇ（２μ
ｌ）に Takara ligation kit のＡ液（１５μｌ）を加
え混合した。さらに、Ｂ液（３μｌ）を加えよく混合し
た後、１６℃で一晩インキュベートした。この反応液を
１０μｌとり大腸菌ＪＭ１０９株のコンピーテント細胞
液（ニッポンジーン社製：１００μｌ）に加え穏やかに
混合し、直ちに氷浴中でインキュベートした。３０分間
インキュベートした後、３７℃の水浴に移して２分間放
置することにより、熱ショックを与えＤＮＡを細胞中に
取り込ませた。熱ショックを与えた後、直ちに氷浴中に
移した。５分間放置した後、１ｍｌの２ＹＴ培地（トリ
プトン１８ｇ／ｌ、酵母抽出エキス１０ｇ／ｌ、塩化ナ
トリウム５ｇ／ｌ）を加え、３７℃でゆっくり振とうさ
せながら１時間インキュベートした。この細胞懸濁液を
５０、１００、１５０μｌとり２ＹＴ寒天培地（５０μ
ｇ／ｍｌアンピシリン、１.５％寒天を含む）におのお
の塗布した。
の重鎖（γ）をコードするＥｃｏＲＩ断片０.１μｇ
（１μｌ）とＳｐｈＩ、ポリメラーゼおよびアルカリホ
スファターゼ処理したｐＡＲＵＢ１９０.４μｇ（２μ
ｌ）に Takara ligation kit のＡ液（１５μｌ）を加
え混合した。さらに、Ｂ液（３μｌ）を加えよく混合し
た後、１６℃で一晩インキュベートした。この反応液を
１０μｌとり大腸菌ＪＭ１０９株のコンピーテント細胞
液（ニッポンジーン社製：１００μｌ）に加え穏やかに
混合し、直ちに氷浴中でインキュベートした。３０分間
インキュベートした後、３７℃の水浴に移して２分間放
置することにより、熱ショックを与えＤＮＡを細胞中に
取り込ませた。熱ショックを与えた後、直ちに氷浴中に
移した。５分間放置した後、１ｍｌの２ＹＴ培地（トリ
プトン１８ｇ／ｌ、酵母抽出エキス１０ｇ／ｌ、塩化ナ
トリウム５ｇ／ｌ）を加え、３７℃でゆっくり振とうさ
せながら１時間インキュベートした。この細胞懸濁液を
５０、１００、１５０μｌとり２ＹＴ寒天培地（５０μ
ｇ／ｍｌアンピシリン、１.５％寒天を含む）におのお
の塗布した。
【００３８】これらのプレートを３７℃で一晩インキュ
ベートして、多数のコロニーを得た。得られたコロニー
を１.５ｍｌの２ＹＴ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリ
ンを含む）に移植して、３７℃で一晩振とうさせながら
培養した。培養液を２ｍｌ容エッペンドルフに移し、１
００００ｒｐｍで１分間遠心して細胞を集めた。上澄み
を捨てた後、残った細胞のペレットを１５０μｌのＳＥ
Ｔ（２０％蔗糖、５０ｍＭトリス−塩酸、５０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ７.６）に懸濁し、アルカリ−ＳＤＳ法に
よりプラスミドＤＮＡを調製した。細胞懸濁液に溶菌混
合液（１％ ＳＤＳ、０.２Ｎ水酸化ナトリウム）３５０
μｌを加えて穏やかに混ぜることにより大腸菌を溶菌さ
せた。１０分間氷冷した後、３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ
４.８）１５０μｌを加え、変性したゲノムＤＮＡ、タ
ンパク質およびＳＤＳを白沈させた。この溶液を１５０
００ｒｐｍで１０分間遠心して上澄みを得、この上澄み
に等量のイソプロパノールを加えた。１５０００ｒｐｍ
で１０分間遠心してプラスミドＤＮＡおよびＲＮＡを沈
澱させた。上澄みを捨て、ペレットを１００μｌのＴＥ
に溶解し、２μｌのＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加
えて３７℃でインキュベートした。２時間後、この溶液
をフェノール：クロロホルム、クロロホルム処理して得
られる上清に３倍容のエタノールおよび１／１０容の３
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.８）を加えて１５０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心した。上澄みを捨て７０％エタノー
ルでペレットを洗浄した後、真空デシケーター中でこの
ペレットを乾固させた。
ベートして、多数のコロニーを得た。得られたコロニー
を１.５ｍｌの２ＹＴ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリ
ンを含む）に移植して、３７℃で一晩振とうさせながら
培養した。培養液を２ｍｌ容エッペンドルフに移し、１
００００ｒｐｍで１分間遠心して細胞を集めた。上澄み
を捨てた後、残った細胞のペレットを１５０μｌのＳＥ
Ｔ（２０％蔗糖、５０ｍＭトリス−塩酸、５０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ７.６）に懸濁し、アルカリ−ＳＤＳ法に
よりプラスミドＤＮＡを調製した。細胞懸濁液に溶菌混
合液（１％ ＳＤＳ、０.２Ｎ水酸化ナトリウム）３５０
μｌを加えて穏やかに混ぜることにより大腸菌を溶菌さ
せた。１０分間氷冷した後、３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ
４.８）１５０μｌを加え、変性したゲノムＤＮＡ、タ
ンパク質およびＳＤＳを白沈させた。この溶液を１５０
００ｒｐｍで１０分間遠心して上澄みを得、この上澄み
に等量のイソプロパノールを加えた。１５０００ｒｐｍ
で１０分間遠心してプラスミドＤＮＡおよびＲＮＡを沈
澱させた。上澄みを捨て、ペレットを１００μｌのＴＥ
に溶解し、２μｌのＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加
えて３７℃でインキュベートした。２時間後、この溶液
をフェノール：クロロホルム、クロロホルム処理して得
られる上清に３倍容のエタノールおよび１／１０容の３
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.８）を加えて１５０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心した。上澄みを捨て７０％エタノー
ルでペレットを洗浄した後、真空デシケーター中でこの
ペレットを乾固させた。
【００３９】得られたプラスミドＤＮＡのペレットを２
５μｌの滅菌水に溶解し、１０ＸＨ緩衝液３μｌ及びＳ
ａｌＩ（１２ｕｎｉｔｓ／μｌ、宝酒造社製）２μｌを
加えて、３７℃で４時間反応させた。得られたプラスミ
ドＤＮＡのＳａｌＩ消化物を１％アガロースゲルに載せ
電気泳動を行った。その結果、培養した２８のクローン
のうち２つのクローンが、目的の遺伝子（ＣＬＮ Ｉｇ
Ｇの重鎖（γ）をコード）を発現できる方向にインサー
トしたプラスミドを保持していることがわかった。これ
ら２つのクローンのうち１つを２００ｍｌの２ＹＴ培地
（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に植え付け、
３７℃で一晩培養した。細胞を１００００ｒｐｍで１０
分間遠心して集め、プラスミドＤＮＡをアルカリ−ＳＤ
Ｓ法により細胞から抽出し、ＲＮａｓｅ処理、フェノー
ル（２回）、クロロホルム抽出及びエタノール沈澱して
精製した（ｐＡＲＵＢＨ１１−γ）。
５μｌの滅菌水に溶解し、１０ＸＨ緩衝液３μｌ及びＳ
ａｌＩ（１２ｕｎｉｔｓ／μｌ、宝酒造社製）２μｌを
加えて、３７℃で４時間反応させた。得られたプラスミ
ドＤＮＡのＳａｌＩ消化物を１％アガロースゲルに載せ
電気泳動を行った。その結果、培養した２８のクローン
のうち２つのクローンが、目的の遺伝子（ＣＬＮ Ｉｇ
Ｇの重鎖（γ）をコード）を発現できる方向にインサー
トしたプラスミドを保持していることがわかった。これ
ら２つのクローンのうち１つを２００ｍｌの２ＹＴ培地
（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に植え付け、
３７℃で一晩培養した。細胞を１００００ｒｐｍで１０
分間遠心して集め、プラスミドＤＮＡをアルカリ−ＳＤ
Ｓ法により細胞から抽出し、ＲＮａｓｅ処理、フェノー
ル（２回）、クロロホルム抽出及びエタノール沈澱して
精製した（ｐＡＲＵＢＨ１１−γ）。
【００４０】他方、実施例１−ｉおよび１−ｉｉで調製
したＣＬＮ ＩｇＧの軽鎖（κ）をコードするＥｃｏＲ
Ｉ断片０.１μｇ（１μｌ）とＳｐｈＩ、ポリメラーゼ
およびアルカリホスファターゼ処理したｐＡＲＵＢ１９
０.４μｇ（２μｌ）に Takara ligation kit のＡ液
（１５μｌ）を加え混合した。さらに、Ｂ液（３μｌ）
を加えよく混合した後、１６℃で一晩インキュベートし
た。この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株のコンピー
テント細胞を形質転換し、細胞を塗布した。これらのプ
レートを３７℃で一晩インキュベートして、２ＹＴ寒天
培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１.５％寒天を含
む）上に多数のコロニーを得た。得られたコロニーを
１.５ｍｌの２ＹＴ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン
を含む）に移植して、３７℃で一晩培養した。培養液を
２ｍｌ容エッペンドルフに移し、１００００ｒｐｍで１
分間遠心して細胞を集め、アルカリ−ＳＤＳ法によりプ
ラスミドＤＮＡを抽出した。
したＣＬＮ ＩｇＧの軽鎖（κ）をコードするＥｃｏＲ
Ｉ断片０.１μｇ（１μｌ）とＳｐｈＩ、ポリメラーゼ
およびアルカリホスファターゼ処理したｐＡＲＵＢ１９
０.４μｇ（２μｌ）に Takara ligation kit のＡ液
（１５μｌ）を加え混合した。さらに、Ｂ液（３μｌ）
を加えよく混合した後、１６℃で一晩インキュベートし
た。この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株のコンピー
テント細胞を形質転換し、細胞を塗布した。これらのプ
レートを３７℃で一晩インキュベートして、２ＹＴ寒天
培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１.５％寒天を含
む）上に多数のコロニーを得た。得られたコロニーを
１.５ｍｌの２ＹＴ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン
を含む）に移植して、３７℃で一晩培養した。培養液を
２ｍｌ容エッペンドルフに移し、１００００ｒｐｍで１
分間遠心して細胞を集め、アルカリ−ＳＤＳ法によりプ
ラスミドＤＮＡを抽出した。
【００４１】得られたプラスミドＤＮＡをおのおの２５
μｌの滅菌水に溶解し、１０ＸＨ緩衝液３μｌ及びＰｓ
ｔＩ（１２ｕｎｉｔｓ／μｌ、宝酒造社製）２μｌを加
えて、３７℃で４時間反応させた。得られたプラスミド
ＤＮＡのＰｓｔＩ消化物を１％アガロースゲルに載せ電
気泳動を行った。その結果、培養した１４のクローンの
うち２つのクローンが、目的の遺伝子（ＣＬＮ ＩｇＧ
の軽鎖（κ）をコード）を発現できる方向にインサート
したプラスミドを保持していることがわかった。これら
２つのクローンのうち１つを２００ｍｌの２ＹＴ培地
（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に植え付け、
３７℃で一晩培養した。細胞を１００００ｒｐｍで１０
分間遠心して集め、プラスミドＤＮＡをアルカリ−ＳＤ
Ｓ法により細胞から抽出し、ＲＮａｓｅ処理、フェノー
ル（２回）、クロロホルム抽出及びエタノール沈澱して
精製した（ｐＡＲＵＢＨ１１−κ）。
μｌの滅菌水に溶解し、１０ＸＨ緩衝液３μｌ及びＰｓ
ｔＩ（１２ｕｎｉｔｓ／μｌ、宝酒造社製）２μｌを加
えて、３７℃で４時間反応させた。得られたプラスミド
ＤＮＡのＰｓｔＩ消化物を１％アガロースゲルに載せ電
気泳動を行った。その結果、培養した１４のクローンの
うち２つのクローンが、目的の遺伝子（ＣＬＮ ＩｇＧ
の軽鎖（κ）をコード）を発現できる方向にインサート
したプラスミドを保持していることがわかった。これら
２つのクローンのうち１つを２００ｍｌの２ＹＴ培地
（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に植え付け、
３７℃で一晩培養した。細胞を１００００ｒｐｍで１０
分間遠心して集め、プラスミドＤＮＡをアルカリ−ＳＤ
Ｓ法により細胞から抽出し、ＲＮａｓｅ処理、フェノー
ル（２回）、クロロホルム抽出及びエタノール沈澱して
精製した（ｐＡＲＵＢＨ１１−κ）。
【００４２】実施例２：抗体遺伝子のラン藻アナキステ
ィス・ニデュランス６３０１株での発現 （２−ｉ） 抗体遺伝子発現プラスミドによるアナキス
ティス・ニデュランス６３０１株の形質転換 アナキスティス・ニデュランス６３０１株を１００ｍｌ
のＢＧ−１１液体培地（下記表１参照）中、３０℃光照
射下で４日間培養し、１００００ｒｐｍで８分間遠心し
て細胞を集めた。細胞のペレットを新しい培地に懸濁
し、細胞数を１×１０9 ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（０.５ ＯＤ
730nm＝５×１０8ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に調製した。実施
例１、（１−ｉｉｉ）で調製した発現プラスミドｐＡＲ
ＵＢＨ１１−γ及びｐＡＲＵＢＨ１１−κをおのおの
０.５μｇ（５μｌ）とり、１×１０9ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
に調製した細胞懸濁液（１ｍｌ）に加えた。穏やかに撹
拌した後、細胞の入ったチューブをアルミ箔で被い、ロ
ータリーシェーカー（大洋科学社製；ＲＴ−５０）を用
いて室温で一晩回転培養した。アルミ箔をはずし、光照
射（約２０００ルクス）下で６時間インキュベートし
た。これらの細胞懸濁液を一部（２５、５０、１００μ
ｌ）とり、ＢＧ−１１寒天培地（１μｇ／ｍｌアンピシ
リン、１ｍＭチオ硫酸ナトリウム、１.５％寒天を含
む）に塗布した。これらのプレートを光照射下（約２０
００ルクス）室温で７〜１０日間インキュベートし、多
数のアンピシリン耐性コロニーを得た。
ィス・ニデュランス６３０１株での発現 （２−ｉ） 抗体遺伝子発現プラスミドによるアナキス
ティス・ニデュランス６３０１株の形質転換 アナキスティス・ニデュランス６３０１株を１００ｍｌ
のＢＧ−１１液体培地（下記表１参照）中、３０℃光照
射下で４日間培養し、１００００ｒｐｍで８分間遠心し
て細胞を集めた。細胞のペレットを新しい培地に懸濁
し、細胞数を１×１０9 ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（０.５ ＯＤ
730nm＝５×１０8ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に調製した。実施
例１、（１−ｉｉｉ）で調製した発現プラスミドｐＡＲ
ＵＢＨ１１−γ及びｐＡＲＵＢＨ１１−κをおのおの
０.５μｇ（５μｌ）とり、１×１０9ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
に調製した細胞懸濁液（１ｍｌ）に加えた。穏やかに撹
拌した後、細胞の入ったチューブをアルミ箔で被い、ロ
ータリーシェーカー（大洋科学社製；ＲＴ−５０）を用
いて室温で一晩回転培養した。アルミ箔をはずし、光照
射（約２０００ルクス）下で６時間インキュベートし
た。これらの細胞懸濁液を一部（２５、５０、１００μ
ｌ）とり、ＢＧ−１１寒天培地（１μｇ／ｍｌアンピシ
リン、１ｍＭチオ硫酸ナトリウム、１.５％寒天を含
む）に塗布した。これらのプレートを光照射下（約２０
００ルクス）室温で７〜１０日間インキュベートし、多
数のアンピシリン耐性コロニーを得た。
【００４３】 表−１ Ｇ−１１ 成分 mg/1 NaNO3 1500 K2HPO4 40 MgSO４7H2O 75 CaCl２2H2O 36 Na2CO3 20 H3BO3 2.86 NnCl２4H2O 1.81 ZnSO４7H2O 0.222 CuSO４5H2O 0.079 Co(NO3)2 6H2O 49.4μg Na2MoO４2H2O 0.39 酒石酸第一鉄 6 EDTA 2Na 2H2O 10 クエン酸 6 pH 7.1 （２−ｉｉ） ＥＬＩＳＡによる形質転換体に発現した
抗体の定量 プレート上に生育したおのおののコロニーを２ｍｌのＢ
Ｇ−１１液体培地（５μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）
に移し、ロータリーシェーカーを用いて光照射下（約２
０００ルクス）、室温で約１０日間培養した。これらの
培養液を１００ｍｌのＢＧ−１１液体培地（５０μｇ／
ｍｌアンピシリンを含む）におのおの移し、２週間培養
した。さらに、１０ＬのＢＧ−１１液体培地（５０μｇ
／ｍｌアンピシリンを含む）を入れたスピンナー（１２
Ｌ容）におのおの移し、２０日間培養（１０日目に５０
μｇ／ｌになるようにアンピシリンを添加）した。おの
おのの細胞を１００００ｒｐｍで１０分間遠心して集
め、２０ｍｌの１ｍＭ ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチ
ルスルホニル）を含むＰＢＳ（Ｎａ2ＨＰＯ4 ５.７５ｇ
／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4１.０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム４０ｇ
／ｌ及び塩化カリウム１.０ｇ／ｌ、ｐＨ６.７〜６.
８）に懸濁した。おのおのの細胞を、超音波破砕装置
（ソニケーターModel Ｗ−２２０：Heat Systems-Ultra
sonic, Inc. 製）を用いて破砕し（１５ｓｅｃ×５）、
１５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心しておのおのの
上清を得た。
抗体の定量 プレート上に生育したおのおののコロニーを２ｍｌのＢ
Ｇ−１１液体培地（５μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）
に移し、ロータリーシェーカーを用いて光照射下（約２
０００ルクス）、室温で約１０日間培養した。これらの
培養液を１００ｍｌのＢＧ−１１液体培地（５０μｇ／
ｍｌアンピシリンを含む）におのおの移し、２週間培養
した。さらに、１０ＬのＢＧ−１１液体培地（５０μｇ
／ｍｌアンピシリンを含む）を入れたスピンナー（１２
Ｌ容）におのおの移し、２０日間培養（１０日目に５０
μｇ／ｌになるようにアンピシリンを添加）した。おの
おのの細胞を１００００ｒｐｍで１０分間遠心して集
め、２０ｍｌの１ｍＭ ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチ
ルスルホニル）を含むＰＢＳ（Ｎａ2ＨＰＯ4 ５.７５ｇ
／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4１.０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム４０ｇ
／ｌ及び塩化カリウム１.０ｇ／ｌ、ｐＨ６.７〜６.
８）に懸濁した。おのおのの細胞を、超音波破砕装置
（ソニケーターModel Ｗ−２２０：Heat Systems-Ultra
sonic, Inc. 製）を用いて破砕し（１５ｓｅｃ×５）、
１５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心しておのおのの
上清を得た。
【００４４】得られたおのおのの細胞抽出液を用いて E
nzyme Linked Immuno Sorbent Assay（ＥＬＩＳＡ）に
より、形質転換ラン藻のおのおのの細胞中で抗体遺伝子
が発現しているかどうかを調べた。９６ウェルプレート
（Nunc社製）の各ウェルに５０μｌの一次抗体液（おの
おの１００倍にＰＢＳで希釈：重鎖（γ）の測定にはア
フィニティー精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ；Corganon Te
knika N. V. 社製、軽鎖（κ）の測定にはヒト kappa l
ight chain に対するヤギ抗血清；kent Laboratories I
nc 社製）を入れ、３７℃で３０分間インキュベートし
た。一次抗体を捨て、各ウェルを２００μｌのゼラチン
緩衝液（３％ゼラチンを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。
次に、各ウェルに２００μｌの１％ＢＳＡを含むＰＢＳ
を入れ、３７℃で３０分間インキュベートしてブロッキ
ングを行った。各ウェルを２００μｌのゼラチン緩衝液
で３回洗浄した後、５０μｌの希釈した細胞抽出液（１
０、５０及び１００倍）を入れ、３７℃で１時間インキ
ュベートした。各ウェルを２００μｌのゼラチン緩衝液
で３回洗浄した後、次に５０μｌの二次抗体（おのおの
ＰＢＳで３０００倍に希釈：重鎖（γ）の測定にはペル
オキシダーゼ標準抗ヒトＩｇＧγ；The Binding Site L
TD 社製、軽鎖（κ）の測定にはペルオキシダーゼ標準
ヒト kappa light chain；The Binding Site LTD 社
製）を入れて３７℃で３０分間インキュベートした。各
ウェルを２００μｌのゼラチン緩衝液で５回洗浄した
後、オルト−フェニレンジアミン溶液（１２ｍｇ／３０
ｍｌオルト−フェニレンジアミン及び６μｌ／３０ｍｌ
過酸化水素水を含むクエン酸緩衝液、ｐＨ５.０）を入
れて３７℃、暗所で３０分間インキュベートした。イン
キュベート後、直ちに５０μｌの５Ｎ硫酸を各ウェルに
加えて反応を停止させた。反応を終えたプレートは、マ
イクロプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ
−３２）を用いて４９０ｎｍと６６０ｎｍの二波長で比
色定量した。その結果、軽鎖のラン藻細胞中での発現量
は抗体の反応性が弱いためはっきりとした数値を求める
ことはできなかったが、重鎖の発現量は１.６６μｇ
（細胞抽出液１ ＯＤ280nm当り）と高い値を示した。
nzyme Linked Immuno Sorbent Assay（ＥＬＩＳＡ）に
より、形質転換ラン藻のおのおのの細胞中で抗体遺伝子
が発現しているかどうかを調べた。９６ウェルプレート
（Nunc社製）の各ウェルに５０μｌの一次抗体液（おの
おの１００倍にＰＢＳで希釈：重鎖（γ）の測定にはア
フィニティー精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ；Corganon Te
knika N. V. 社製、軽鎖（κ）の測定にはヒト kappa l
ight chain に対するヤギ抗血清；kent Laboratories I
nc 社製）を入れ、３７℃で３０分間インキュベートし
た。一次抗体を捨て、各ウェルを２００μｌのゼラチン
緩衝液（３％ゼラチンを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。
次に、各ウェルに２００μｌの１％ＢＳＡを含むＰＢＳ
を入れ、３７℃で３０分間インキュベートしてブロッキ
ングを行った。各ウェルを２００μｌのゼラチン緩衝液
で３回洗浄した後、５０μｌの希釈した細胞抽出液（１
０、５０及び１００倍）を入れ、３７℃で１時間インキ
ュベートした。各ウェルを２００μｌのゼラチン緩衝液
で３回洗浄した後、次に５０μｌの二次抗体（おのおの
ＰＢＳで３０００倍に希釈：重鎖（γ）の測定にはペル
オキシダーゼ標準抗ヒトＩｇＧγ；The Binding Site L
TD 社製、軽鎖（κ）の測定にはペルオキシダーゼ標準
ヒト kappa light chain；The Binding Site LTD 社
製）を入れて３７℃で３０分間インキュベートした。各
ウェルを２００μｌのゼラチン緩衝液で５回洗浄した
後、オルト−フェニレンジアミン溶液（１２ｍｇ／３０
ｍｌオルト−フェニレンジアミン及び６μｌ／３０ｍｌ
過酸化水素水を含むクエン酸緩衝液、ｐＨ５.０）を入
れて３７℃、暗所で３０分間インキュベートした。イン
キュベート後、直ちに５０μｌの５Ｎ硫酸を各ウェルに
加えて反応を停止させた。反応を終えたプレートは、マ
イクロプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ
−３２）を用いて４９０ｎｍと６６０ｎｍの二波長で比
色定量した。その結果、軽鎖のラン藻細胞中での発現量
は抗体の反応性が弱いためはっきりとした数値を求める
ことはできなかったが、重鎖の発現量は１.６６μｇ
（細胞抽出液１ ＯＤ280nm当り）と高い値を示した。
【００４５】実施例３：ラン藻に別々に発現させた抗体
の in vitro での再構築 ＣＮＬ−ＩｇＧの重鎖及び軽鎖を発現しているそれぞれ
の細胞から調製した［実施例２、（２−ｉｉ）］おのお
のの抽出液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、この
値を基に濃度が１：１になるようにおのおのの抽出液を
混ぜ合わせた。この混合液（約４０ｍｌ）を透析チュー
ブに入れて、変性溶液（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８.
０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＫＣｌを含む）に
対して６０時間透析を行った。この液をプロテインＡセ
ファロースカラム（HiTrapTM protein A，Pharmacia LK
B Biotechnology 社製）に通して、重鎖（γ）と軽鎖
（κ）の両分子が会合して完全な抗体に構築された抗体
分子（ＣＬＮ ＩｇＧ）をプロティンＡに結合させた。
変性溶液でカラムを十分に洗浄した後、プロテインＡに
結合した抗体分子を０.１Ｍグリシン−塩酸、０.５Ｍ塩
化ナトリウム（ｐＨ２.７）で溶出させた。溶出した抗
体溶液に１.０Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９.０）を少量加え
て中和し、透析チューブに入れてＰＢＳに対して一晩透
析を行った。この抗体溶液をウルトラフリー（Ｍ.Ｗ.３
００００、ミリポア社製）に入れ、遠心することにより
１０倍に濃縮した。この溶液を用いて Laemmli（Natur
e，２２７：６８０、１９７０）の方法にしたがってＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動を行い銀染色
（日本バイオラッド社製）することにより、ヒト−ヒト
ハイブリドーマの培養上清から得られたモノクローナル
抗体ＣＬＮ−ＩｇＧと電気化学的性質を比較した。その
結果、ラン藻の抽出液から得られた抗体溶液を泳動させ
たレーンでは、プロテインＡに結合しない抗体分子の軽
鎖と同じ移動度を示すバンドが検出された。
の in vitro での再構築 ＣＮＬ−ＩｇＧの重鎖及び軽鎖を発現しているそれぞれ
の細胞から調製した［実施例２、（２−ｉｉ）］おのお
のの抽出液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、この
値を基に濃度が１：１になるようにおのおのの抽出液を
混ぜ合わせた。この混合液（約４０ｍｌ）を透析チュー
ブに入れて、変性溶液（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８.
０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＫＣｌを含む）に
対して６０時間透析を行った。この液をプロテインＡセ
ファロースカラム（HiTrapTM protein A，Pharmacia LK
B Biotechnology 社製）に通して、重鎖（γ）と軽鎖
（κ）の両分子が会合して完全な抗体に構築された抗体
分子（ＣＬＮ ＩｇＧ）をプロティンＡに結合させた。
変性溶液でカラムを十分に洗浄した後、プロテインＡに
結合した抗体分子を０.１Ｍグリシン−塩酸、０.５Ｍ塩
化ナトリウム（ｐＨ２.７）で溶出させた。溶出した抗
体溶液に１.０Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９.０）を少量加え
て中和し、透析チューブに入れてＰＢＳに対して一晩透
析を行った。この抗体溶液をウルトラフリー（Ｍ.Ｗ.３
００００、ミリポア社製）に入れ、遠心することにより
１０倍に濃縮した。この溶液を用いて Laemmli（Natur
e，２２７：６８０、１９７０）の方法にしたがってＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動を行い銀染色
（日本バイオラッド社製）することにより、ヒト−ヒト
ハイブリドーマの培養上清から得られたモノクローナル
抗体ＣＬＮ−ＩｇＧと電気化学的性質を比較した。その
結果、ラン藻の抽出液から得られた抗体溶液を泳動させ
たレーンでは、プロテインＡに結合しない抗体分子の軽
鎖と同じ移動度を示すバンドが検出された。
【００４６】また、in vitro で再構築させた抗体分子
が活性を持っているかどうかを調べるために、マウスの
モノクローナル抗体イデオＮｏ．３３（ＣＬＮ ＩｇＧ
のイデオトープを認識、特開平０７−１０１９９９号公
報参照）を一次抗体として、実施例２．（２−ｉｉ）と
同様にＥＬＩＳＡを行った。その結果、in vitro で再
構築させた抗体溶液中には、８４.５ｎｇ／０.０２２
ＯＤ280nmという値（０．３８％）で活性化されたＣＬ
Ｎ ＩｇＧが含まれていることがわかった。
が活性を持っているかどうかを調べるために、マウスの
モノクローナル抗体イデオＮｏ．３３（ＣＬＮ ＩｇＧ
のイデオトープを認識、特開平０７−１０１９９９号公
報参照）を一次抗体として、実施例２．（２−ｉｉ）と
同様にＥＬＩＳＡを行った。その結果、in vitro で再
構築させた抗体溶液中には、８４.５ｎｇ／０.０２２
ＯＤ280nmという値（０．３８％）で活性化されたＣＬ
Ｎ ＩｇＧが含まれていることがわかった。
【００４７】以上の結果は、抗体の重鎖及び軽鎖をラン
藻細胞で別々に発現させて in vitro で再構築させるこ
とにより活性化できることを示しており、さらに、この
ことはラン藻細胞に抗体の重鎖及び軽鎖を同時に発現さ
せることにより、ラン藻細胞内において活性を持った抗
体を作らせることが可能であることを示している。
藻細胞で別々に発現させて in vitro で再構築させるこ
とにより活性化できることを示しており、さらに、この
ことはラン藻細胞に抗体の重鎖及び軽鎖を同時に発現さ
せることにより、ラン藻細胞内において活性を持った抗
体を作らせることが可能であることを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:89）
Claims (1)
- 【請求項１】 抗体重鎖遺伝子又は抗体軽鎖遺伝子を含
有する担体ＤＮＡでラン藻細胞を形質転換することによ
りラン藻細胞で抗体重鎖タンパク及び抗体軽鎖タンパク
のそれぞれを発現させ、次いで抗体重鎖タンパクと抗体
軽鎖タンパクを in vitro で会合せしめることを特徴と
する抗体分子の製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32211696A JPH10150984A (ja) | 1996-11-19 | 1996-11-19 | 抗体分子の製造方法 |
| EP97912489A EP0971034A4 (en) | 1996-11-19 | 1997-11-18 | PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY MOLECULES |
| PCT/JP1997/004188 WO1998022590A1 (fr) | 1996-11-19 | 1997-11-18 | Procede pour preparer des molecules d'anticorps |
| AU49670/97A AU4967097A (en) | 1996-11-19 | 1997-11-18 | Process for preparing antibody molecules |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32211696A JPH10150984A (ja) | 1996-11-19 | 1996-11-19 | 抗体分子の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10150984A true JPH10150984A (ja) | 1998-06-09 |
Family
ID=18140106
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32211696A Pending JPH10150984A (ja) | 1996-11-19 | 1996-11-19 | 抗体分子の製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0971034A4 (ja) |
| JP (1) | JPH10150984A (ja) |
| AU (1) | AU4967097A (ja) |
| WO (1) | WO1998022590A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000060103A2 (en) * | 1999-04-01 | 2000-10-12 | Monsanto Technology Llc | Dna construct comprising a cyanophage of cyanobacteria promoter and its use |
| US7410637B2 (en) | 2000-06-20 | 2008-08-12 | Phycotransgenics, Llc | Transgenic algae for delivering antigens to an animal |
| DE60236374D1 (de) * | 2001-03-23 | 2010-06-24 | Advanced Bionutrition Corp | Verfahren zur Herstellung eines Futtermittels enthaltend Bakterien für Aquakultur und seiner Verwendung |
| US20100183523A1 (en) | 2009-01-22 | 2010-07-22 | Wagner Richard E | Dental composition and method |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8308235D0 (en) * | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| DE3853481T2 (de) * | 1987-09-09 | 1995-10-19 | Celltech Therapeutics Ltd | Fv Antikörperfragment-Herstellung. |
| JP2574549B2 (ja) * | 1991-03-08 | 1997-01-22 | 萩原 義秀 | 新規プラスミド |
| JPH0767393B2 (ja) * | 1991-03-13 | 1995-07-26 | 萩原 義秀 | ポリペプチドの発現方法 |
| JPH04346792A (ja) * | 1991-05-22 | 1992-12-02 | Hagiwara Yoshihide | 抗癌ヒトモノクローナル抗体のアミノ酸配列及びそれをコードするｄｎａ塩基配列 |
| GB9215541D0 (en) * | 1992-07-22 | 1992-09-02 | Celltech Ltd | Protein expression system |
-
1996
- 1996-11-19 JP JP32211696A patent/JPH10150984A/ja active Pending
-
1997
- 1997-11-18 WO PCT/JP1997/004188 patent/WO1998022590A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1997-11-18 AU AU49670/97A patent/AU4967097A/en not_active Abandoned
- 1997-11-18 EP EP97912489A patent/EP0971034A4/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1998022590A1 (fr) | 1998-05-28 |
| AU4967097A (en) | 1998-06-10 |
| EP0971034A1 (en) | 2000-01-12 |
| EP0971034A4 (en) | 2005-02-23 |
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