KR20050085190A

KR20050085190A - 저온-유도성 발현 벡터

Info

Publication number: KR20050085190A
Application number: KR1020057009634A
Authority: KR
Inventors: 준 토모노; 하루미 우에노; 마사유키 기시모토; 히로아키 사가와; 이쿠노신 가토
Original assignee: 다카라 바이오 가부시키가이샤
Priority date: 2002-12-11
Filing date: 2003-12-11
Publication date: 2005-08-29
Also published as: CN100379870C; ATE408692T1; EP1582587A1; CA2508808A1; TW200510534A; EP1582587B1; WO2004053126A1; AU2003289023B2; US7244588B2; TWI316091B; CN1748027A; DE60323678D1; US20060148033A1; JPWO2004053126A1; EP1582587A4; AU2003289023A1

Abstract

5'-비해독 영역은 5'-비해독 영역에 의해 형성되는 스템 구조 사이의 거리를 변화시키기 위하여 도입된 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는, 저온 쇼크 단백질 유전자 mRNA로부터 유래된 5'-비해독 영역을 코딩하는 여역을 갖는 벡터.

Description

저온-유도성 발현 벡터{Cold-induced expression vector}

본 발명은 유전공학용 벡터 및 상기 벡터를 사용하여 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.

최근 유전공학을 사용하여 유용한 단백질을 생산하는 기술이 광범위하게 사용되고 있다. 이중, 숙주로서 대장균(Escherichia coli)을 사용하는 발현 시스템이 가장 보편적으로 사용되고 있는 발현 시스템이다. 다수의 단백질은 재조합체를 사용하여 생산되고 있다. 소위 발현 벡터가 일반적으로 작제되고 재조합체를 사용하여 유용한 단백질을 생산하기 위하여 사용되고 있다. 발현 벡터에서, 관심의 대상이 되는 유전자를 RNA 폴리머라제에 의해 인지되는 프로모터의 조절하에 놓는다. 숙주로서 대장균에 대한 발현 벡터로 사용되는 프로모터의 예로서 lac, trp, tac, gal 및 ara 프로모터가 있다. 대장균 RNA 폴리머라제에 의해 직접 인지되는 것외의 프로모터를 사용하는 발현 벡터 pET-시스템 (Novagen)을 포함한다. pET-시스템은 대장균을 감염시키는 박테리오파지 T7로부터 RNA 폴리머라제에 의해 인지되는 프로모터를 사용한다(참조 J. Mol. Biol., 189:113-130 (1986); 유전자, 56:125-135 (1987)). pET-시스템의 경우, T7 RNA 폴리머라제는 대장균에서 발현되고, T7 프로모터의 하류에 위치하는 관심의 대상이 되는 유전자는 T7 RNA 폴리머라제에 의해 전사되고, 관심의 대상이 되는 단백질은 숙주의 해독 시스템을 사용하여 합성된다.

그러나, 관심의 대상이 되는 단백질이 pET-시스템을 포함하는 다수의 대장균 발현 시스템을 사용하여 고도의 수준으로 발현되는 경우, 관심의 대상이 되는 단백질은 여러 경우로 소위 봉입체(inclusion body)로 불려지는 불용성 컴플렉스를 형성할 수 있다. 결과, 그의 활성 형태의 관심의 대상이 되는 단백질의 양은 현저히 감소하게 된다. 수개의 폴리펩티드에 대하여 활성인 폴리펩티드는 봉입체의 가용화 및 재폴딩에 의해 수득되었다고 보고되었다. 여러 경우에 있어 일반적으로 회수율은 낮다. 또한, 관심의 대상이 되는 각 단백질에 대한 적절한 재폴딩 조건이 연구될 필요가 있다. 따라서, 대장균에서 활성 단백질을 직접 발현시키는 시스템이 요구되고 있다.

하기의 결과로서 봉입체가 형성된다고 판단된다. 그의 적절한 형태(conformation)로 폴딩되기 앞서 해독된 폴리펩티드 쇄의 중간체는 분자간 상호작용에 기인하여 거대한 불용성 컴플렉스를 형성하기 위하여 또다른 폴리펩티드와 얽히게(interwound) 된다. 몇몇 경우에 있어, 통상의 것 37℃ (20 내지 30℃)보다 낮은 온도에서 재조합 대장균 세포를 배양하므로써 그의 활성 형태의 단백질의 발현 수준은 향상된다고 공지되어 있다. 이는 리보솜에 의한 느린 해독으로 그의 적절한 구조로 폴딩되는 중간체에 충분한 시간을 제공받기 때문이고, 저온 조건하의 세포내 단백질분해효소의 느린 작용으로 발현되는 활성 단백질의 안정성은 향상될 것으로 예측된다. 따라서, 봉입체를 형성하는 단백질을 생산함에 유용한 바 저온 조건하에서 재조합 대장균 세포를 배양하는 방법에 관심을 기울이게 되었다.

대수증식기동안 대장균 세포에 대한 배양 온도를 37℃로부터 10-20℃로 저하시킨 경우, 대장균 세포의 성장은 일시적으로 정지하였고, 동시에 소위 저온 쇼크 단백질로 명명되는 단백질 그룹의 발현이 유도된다. 단백질은 유도 수준에 기초하여 두 그룹으로 분류된다: 그룹 I (10배 이상) 및 그룹 II (10배 미만). 그룹 I내 단백질은 CspA, CspB, CspG 및 CsdA (see J. Bacteriol., 178:4919-4925 (1996); J. Bacteriol., 178:2994-2997 (1996))를 포함한다. 온도를 37℃로부터 10℃로 변화시킨 후 1.5시간 째 CspA (WO 90/09447)의 발현 수준은 전체 세포 단백질의 13%에 도달하기 때문에(참조 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:283-287 (1990)), 저온에서 재조합 단백질을 생산하기 위하여 cspA 유전자에 대한 프로모터를 사용하려는 시도가 이루어졌다.

cspA 유전자를 사용하여 저온 조건하에서 재조합 단백질을 발현시키기 위한 시스템과 관련하여 상기 언급한 고도로 효능이 있는 전사 개시외에도 저온에서 유전자에 대한 프로모터에 의해 하기와 같은 효능이 나타났다:

(1) cspA 유전자로부터 전사되고 해독될 수는 없는 mRNA가 기능성 CspA 단백질을 코딩하지 못하는 경우(특히, CspA 단백질의 N-말단 서열중 일부만을 코딩하는 경우), 상기와 같은 mRNA는 장기간 동안 저온 쇼크 단백질을 포함하는 다른 대장균 단백질의 발현을 저해한다. 이 기간동안 mRNA은 차별적으로 해독된다(J. Bacteriol., 178:4919-4925 (1996); WO 98/27220). 이 현상을 LACE(절단된(truncated) cspA 발현의 저온-의존성 항생 효과)(low temperature-dependent antibiotic effect of truncated cspA expression effect) 효과로서 명명한다.

(2) 하류 박스로 명명된 15개의 뉴클레오티드로 구성된 서열은 cspA 유전자의 개시 코돈으로부터 12개의 뉴클레오티드 하류에 위치한다. 저온 조건하에서의 해독율은 이 서열 때문에 높다.

(3) 159개의 뉴클레오티드로 구성된 5'-비해독 영역은 cspA 유전자에 대한 mRNA중 개시 코돈 및 전사 개시 사이트 사이에 위치한다. 이 영역은 37℃에서의 CspA 발현에 부정적인 효과를 나타내고 저온 조건하에서는 긍정적인 효과를 나타낸다.

특히, 상기 (1)에 기술된 바와 같은 현상은 cspA 유전자를 사용하여 관심의 대상이 되는 단백질만을 특이 발현시킬 수 있다는 가능성을 제안한다. 따라서, 이 시스템을 구조 분석을 위해 동위 원소-표지된 단배질의 제조 또는 고도로 순수한 재조합 단백질의 생산에 적용시킬 수 있다는 예측할 수 있다.

발현 벡터를 포함하는 대장균 세포를 세포가 유도되기 쉬운 수준까지 배양하는 것은 어려울 수 있거나, 심지어 유전자에 대한 프로모터의 발현 조정이 불완전하고 유전자 산물의 숙주에 손해를 가하는 겅우 발현 벡터의 작제는 불가능할 수 있다는 것이 공지되어 있다(참조, 예, United States Patent No. 5654169).

상기 언급한 문제들을 해결하기 위하여, 추가로 유전자 발현 효율을 향상시키고, 발현되는 산물을 용이하게 수득하기 위하여 cspA 유전자의 5'-비해독 영역을 사용하여 발현 벡터를 개변(modification)하려고 시도하여 왔다(WO 99/27117). 발현을 엄격하게 조정하기 위하여 오퍼레이터를 도입하거나 유전자 발현 수준을 향상시키기 위하여 5'-비해독 영역로 돌연변이를 도입하므로써 개변하는 것이 본 명세서에 기술되어 있다.

발명의 개시

상기 기술된 바와 같이, 저온 조건하의 단백질 발현 시스템은 매우 유효한 시스템이며, 추가로 발현 효율 등이 개선될 필요가 있다.

본 발명의 주요 목적은 예를 들면, csp 유전자를 사용하여 발현 벡터의 유전자 발현 효율을 향상시킴으로써 저온 조건하에서의 유전자 발현을 위한 보다 우수한 시스템을 구성하는 것이다.

본 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 csp 유전자로부터 유래된 5'-비해독 영역의 뉴클레오티드 서열로 도입하는 개변의 효과를 평가하였다. 결과 본 발명자들은 mRNA의 5'-비해독 영역에 상응하는 부분에서 형성된 스템사이의 거리를 조절하여 하류 서열에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 향상시킬 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 추가로, 본 발명자들은 개변된 5'-비해독 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 작제하게 되었다. 이로써, 본 발명은 완성되었다.

본 발명을 하기에 요약한다. 본 발명의 제 1면은 저온 쇼크 단백질 유전자에 대한 mRNA로부터 유래된 5'-비해독 영역을 코딩하는 부분을 갖는 벡터에 관한 것으로서, 여기에서, 돌연변이는 5'-비해독 영역내로 도입되어 상기 영역에서 형성되는 스템 구조 사이의 거리가 변화될 수 있도록 한다.

제 1면에 따라, 5'-비해독 영역내로 도입되는 돌연변이는 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실에 의해 예시된다. 서열 번호:1중 593번 뉴클레오티드 내지 598번 뉴클레오티드에 상응하는 대장균 cspA 유전자내로 돌연변이가 도입된 벡터가 특히 바람직한 일면을 예시한다.

제 1면에 따른 벡터에서, 5'-비해독 영역을 코딩하는 부분은 추가로 오퍼레이터를 가질 수 있다. 서열 번호:2, 3 또는 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 5'-비해독 영역은 벡터에서 특히 바람직한 5'-비해독 영역의 예가 된다.

제 1면의 벡터는 5'-비해독 영역을 코딩하는 부분의 상류에 위치하는 프로모터를 가질 수 있다. 추가로, 5'-비해독 영역을 코딩하는 부분의 하류에 위치하는, 사용하는 숙주의 리보솜 RNA에서 안티(anti)-하류 박스 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

예를 들면, 제 1면의 벡터는 플라스미드 벡터일 수 있다.

본 발명의 제 2면은

(1) 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 유전자가 혼입된 제 1면의 벡터로 숙주를 형질전환시켜 형질전환체를 수득하고;

(2) 형질전환체를 배양하고;

(3) 통상의 온도보다 낮은 온도로 배양 온도를 바꾸어 관심의 대상이 되는 단백질을 발현시키는 것을 포함하는, 관심의 대상이 되는 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.

제 2면에 따라, 프로모터는 단계 (3)동안, 또는 그 후 유도될 수 있다.

본 발명을 수행하기 위한 최상의 모드

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 사용되는 바, "영역(region)"은 핵산(DNA 또는 RNA)의 부분을 언급한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "mRNA의 5'-비해독 영역"은 단백질을 코딩하지 않고, DNA로부터 전사의 결과로서 합성된 mRNA의 5'측상에 위치하는 영역을 언급한다. 이하, 상기 영역은 또한 "5'-UTR (5'-비해독 영역)"로서 언급될 수 있다. 달리 언급하지 않는 한, 5'-UTR은 대장균 cspA 유전자에 대한 mRNA의 5'-비해독 영역, 또는 그의 개변을 언급한다.

본 명세서에서 사용되는 바, "저온 쇼크 단백질 유전자"는 그의 생리학적 온도로부터 유기체의 성장 온도를 저하시킬 때 발현이 유도되는, 단백질을 코딩하는 유전자를 언급한다.

본 발명에 따라 사용되는 저온 쇼크 단백질 mRNA의 5'-UTR을 코딩하는 부분은 유전자에 대한 mRNA에서 5' 내지 개시 코돈으로의 영역을 코딩하는 부분이다. 상기 부분은 대장균 저온 쇼크 단백질 유전자 (cspA, cspB, cspG, csdA 등)에서 특징적으로 발견된다(J. Bacteriol., 178:4919-4925 (1996); J. Bacteriol., 178:2994-2997 (1996)). 상기 유전자로부터 전사되는 mRNA중 5' 말단으로부터 100개 이상의 뉴클레오티드 부분은 단백질로 해독되지 않는다. 이 부분은 유전자 발현의 저온 반응에 중요하다. 5'-비해독 영역을 임의의 단백질의 mRNA중 그의 5' 말단에 가한 경우, 저온 조건하에서 mRNA은 단백질로 해독된다.

본 발명에 따라 사용되는 "mRNA의 5'-비해독 영역"를 상기 언급된 특이 유전자로부터 유래된 어느 것으로 제한하지 않는다. 저온 쇼크 단백질 유전자로부터 유래되고 2개 이상의 스템 구조를 형성할 수 있는 5'-비해독 영역을 본 발명에 따라 사용할 수 있다.

상기 열거한 바와 같은 저온 쇼크 단백질 유전자로부터 유래된 5'-UTRs를 코딩하는 부분을 본 발명의 벡터로 사용할 수 있다. 특히, 대장균 cspA 유전자로부터 유래된 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 대장균 cspA 유전자의 뉴클레오티드 서열은 등록되어 있고, GenBank 유전자 데이타베이스로부터 수탁번호 M30139로 대중들은 이용할 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 서열 번호:1에 나타낸다. 추가로, 뉴클레오티드 서열이 부분적으로 개변된 5'-UTR 또한 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 예를 들면, WO 99/27117에 기술된 바와 같은 플라스미드 pMM047 또는 pMM048에 포함된 cspA 유전자로부터의 5'-UTR-코딩 부분을 사용할 수 있다. 플라스미드 pMM048에 포함된 대장균 cspA 유전자로부터의 5'-UTR-코딩 부분의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호:5에 나타낸다. 이 서열은 본 명세서의 실시예에서 사용되는 플라스미드 pCold08NC2에 포함된 5'-UTR을 코딩하는 부분의 뉴클레오티드 서열과 일치한다.

본 발명은 돌연변이가 아마도 5'-UTR에서 형성되는 2차 구조이 스템사이의 거리를 조절할 수 있도록 돌연변이를 5'-UTR-코딩 부분으로 도입시키는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 스템사이의 거리는 스템 사이의 영역에 상응하는 부분으로 뉴클레오티드(들)를 삽입하거나 상기 부분에서 뉴클레오티드 일부를 결실시켜 증가 또는 감소시킬 수 있다. 돌연변이가 도입되는 위치, 또는 돌연변이에서 삽입되거나 결실되는 뉴클레오티드(들)의 수와 관련하여, 돌연변이의 결과로서 돌연변이가 없는 것과 비교하였을 때 하류 연결된 유전자의 발현 수준이 향상되는 한 특별히 제한하지 않는다. 돌연변이는 바람직하게 5'-UTR의 저온 특이적 유전자 발현을 달성하기 위한 능력을 방해하지 않는다는 것은 언급할 필요도 없다.

대장균 cspA 유전자로부터 유래된 5'-UTR은 서열 번호:1의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드 584번 내지 뉴클레오티드 593번 영역 및 뉴클레오티드 598번 내지 뉴클레오티드 608번 영역에서 스템 구조를 형성할 것으로 예상된다. 따라서, 상기-언급한 영역(뉴클레오티드 593번 내지 뉴클레오티드 598번) 사이의 부분 또는 도입된 돌연변이를 갖는 5'-UTR에서 상기 언급한 부분에 상응하는 부분으로 뉴클레오티드(들)의 삽입 또는 결실을 도입하므로써 스템사이의 거리를 조절할 수 있다. 본 발명은 상기 언급한 스템 사이의 거리의 조절과 관련하여 제한하지 않는다.

본 발명에 따른 결실 돌연변이는 스템 사이의 부분에서 1개 내지 뉴클레오티드 모두의 결실을 포함한다. 삽입 돌연변이는 1개 내지 100개의 뉴클레오티드(들), 바람직하게 3내 내지 60개 뉴클레오티드들, 더욱 바람직하게 8개 내지 40개의 뉴클레오티드들의 삽입을 포함한다.

본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 실시예에서 기술하는 플라스미드 벡터, pCold08s2, pCold08s12 및 pCold08s32에 포함된 5'-UTRs가 본 발명의 바람직한 일례를 예시한다. 플라스미드 벡터에 포함된 5'-UTRs의 뉴클레오티드 서열을 각각 서열 번호:2, 3 및 4에 나타낸다.

본 발명의 발현 벡터는 본 발명에 따라 제조되고 스템 사이의 거리가 상기 기술한 바와 같이 조절되는 5'-UTR을 코딩하는 부분을 사용하여 제조할 수 있다. 특히, 하기와 같이 제조할 수 있다. 출발 물질로서 5'-UTR-코딩 DNA에 의해 코딩되는 mRNA에 의해 형성되는 2차 구조를 가정할 수 있다. 공지된 방법을 사용하여 스템 사이의 부분에 상응할 것으로 예상되는 부분에 삽입 또는 결실 돌연변이를 도입한다. 그렇게 수득한 DNA를 적절한 프로모터와 함께 벡터내로 도입한다.

본 발명의 벡터는 벡터로서의 목적을 달성하기 위하여 사용될 수 있는 한, 통상 사용되는 벡터중 하나일 수 있다(예: 플라스미드, 파지 또는 바이러스 벡터). 본 발명의 벡터가 숙주내로 전달된 후 숙주에서 게놈 DNA으로 통합될 수 있다면 적절할 것이다.

5'-UTR은 본 발명의 벡터에서 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 영역 및 프로모터 사이에 삽입된다. 본 발명에 따라 사용하는 프로모터의 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 저온에서 도고의 프로모터 활성을 갖는 것으로 예상되는 저온 쇼크 단백질 유전자들 (예: cspA, cspB, cspG 및 cspA)로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 사용하고자 하는 숙주에서 RNA내로의 전사를 개시하는 능력을 갖는다면 프로모터는 어느 것일 수 있다. 대장균을 숙주로서 사용하고자 하는 경우, 프로모터 예로서, lac, trp, tac, gal 또는 ara 프로모터를 사용할 수 있다.

상기 언급한 요소들 외에 포함되는 영역와 관련하여, 본 발명의 벡터는 예로서 복제 기원, 선별 마커로서 사용되는 약물-내성 유전자, 또는 조절 서열 예로서 작동자 또는 종결자를 포함한다.

다양한 유전자의 발현-조절 영역에 존재하는 조절자, 예로서, 대장균 락토오스 오페론으로부터 유래된 lac 조절자를 본 발명에 따라 사용할 수 있다.

프로모터는 적절한 유도제, 예를 들면 락토오스 또는 그의 유사체 (바람직하게, 이소프로필-β-D-티오갈락토사이드(IPTG))를 사용하여 lac 조절자의 작용을 상쇄시킴으로써 작용할 수 있다. 조절자 서열은 일반적으로 프로모터의 하류 및 전사 개시 사이트 근처에 위치한다. 본 발명의 벡터는 추가로 조절자 작용에 필요한 조절 유전자(예: lac 조절자에 대한 lacI ^q 유전자)를 가질 수 있다.

상기 언급한 요소외에도 5'-비해독 영역 하류에 사용하는 숙주의 리보솜 RNA에서 안티-하류 박스 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하여 발현 효율을 향상시킬 수 있다. 예를 들면, 대장균의 경우, 안티-하류 박스 서열은 16S 리보솜 RNA는 위치 1467번 내지 위치 1481번에 존재한다(The EMBO Journal, 15:665-674 (1996)). 이 서열에 고도로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 저온 쇼크 단백질의 N-말단 펩티드를 코딩하는 영역을 사용할 수 있다. 안티-하류 박스 서열에 상보적인 서열을 위치시켜 개시 코돈으로부터 1 내지 5번째 뉴클레오티드에서 출발할 수 있도록 하는 것이 효과적이다. 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 유전자를 벡터내로 혼입시켜 단백질을 N-말단 펩티드와 함께 융합 단백질로서 발현시킬 수 있다. 다르게는 영역특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis)을 사용하여 염기 치환을 도입하여 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 유전자를 안티-하류 박스 서열에 상보적이도록 할 수 있다. 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 유전자를 벡터내로 도입하여 관심의 대상이 되는 단백질이 융합 단백질로서 발현되도록 한 경우, 관심의 대상이 되는 단백질의 활성을 폐기하지 않는 한 펩티드의 길이는 어느 것일 수 있다. 융합 단백질을 발현시키는 벡터를 예를 들면, 접합 사이트에서 공학처리하여 관심의 대상이 되는 단백질이 적절한 프로테아제를 사용하여 융합 단백질로부터 분리될 수 있도록 할 수 있다. 다르게는, 공학처리하여 융합 단백질을 정제 또는 검출을 위해 사용될 수 있는 펩티드와 융합된 단백질로서 발현시킬 수 있다. 발현되는 단백질의 정제를 위해 사용할 수 있는 펩티드의 예로서 제한하는 것은 아니지만, 히스티딘 tag (His-Tag) 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)를 포함한다.

예를 들면, 관심의 대상이 되는 단백질은 하기와 같이 플라스미드로서 작제된 본 발명의 벡터를 사용하여 발현된다. 단백질을 코딩하는 유전자를 본 발명의 플라스미드 벡터내로 클로닝하고 플라스미드로 적절한 숙주를 형질전환시켜 관심의 대상이 되는 단백질을 발현시키는 형질전환체를 수득할 수 있다. 형질전환체는 특히 배양 온도를 저하시킴으로써 관심의 대상이 되는 단백질을 발현시킬 수 있다. 벡터가 조절자를 갖는 경우 조절자의 작용은 프로모터를 유도하는 적절한 수단을 사용하여 폐기될 수 있다.

단백질을 발현 위해 본 발명의 벡터를 사용하는 경우, 관심의 대상이 되는 단백질은 상기 언급한 LACE 효과에 기인하여 차별적으로 해독된다. 결과, 재조합 단백질의 통상의 발현과 비교하여 배양물중 관심의 대상이 되는 단백질의 함량은 고도로 높고, 따라서, 고도로 순수한 관심의 대상이 되는 단백질을 제조할 수 있다. 적절한 동위원소의 존재하에 관심의 대상이 되는 단백질을 발현시켜 동위원소-표지된 단백질을 제조할 수 있다. 그렇게 수득한 고도로 순수한 표지된 단백질은 NMR을 사용하는 구조 분석에 적절할 수 있다. 예를 들면, 배양물 또는 배양물의 용해물(lysate)을 NMR 분석에 직접 사용할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만 그로써 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.

본 명세서에 기술된 방법중 플라스미드 제작 및 제한 효소 분해를 포함하는 기본 방법은 [T. Maniatis et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory]에 기술된 방법에 따라 수행될 수 있다. 달리 언급하지 않는 한, 하기 기술된 바와 같은 플라스미드 작제를 위한 숙주로서 대장균 JM109를 사용하였고, 1.5%의 농도로 아가를 LB 배지에 가하고 생성된 혼합물을 고형화하여 제조된 50μg/ml의 앰피실린 또는 LB 아가 배지를 포함하는 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% NaCl, pH 7.0)를 사용하였다.

참고 실시예: 플라스미드 pCold08NC2 작제

pCold08NC2는 WO 99/27117에 기술된 것에 기초하여 국제특허 미생물 기탁하에 1997년 10월 31일(원 기탁일)에 독립 행정법인 산업기술총합 연구소 특허생물기탁센터(일본, 이바라키켄 305-8566 츠쿠바시, 히가시 1-초메, 1-1 AIST 츠쿠바 센터 6)에 기탁된 대장균 JM/109/pMM047 (FERM BP-6523)에 포함된어 있는 플라스미드 pMM047를 출발물질로서 사용하여 작제하였다.

플라스미드 pCold08NC2는 상류측으로부터 하류측으로 하기 순서대로 lac 프로모터, 개변된 대장균 cspA 유전자-유래된 5'-UTR 및 다중 클로닝 사이트를 갖는다. 또한, 플라스미드는 lacI 유전자, 대장균 16S 리보솜 RNA중 안티-하류 서열에 완전하게 상보적인 하류 박스 서열, 6개의 히스티딘 잔기로 구성된 히스티딘 태그, 및 인자 Xa에 의해 인지되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

실시예 1: 벡터 pCold08s2의 작제 및 단백질 발현 수준 조사

(1) 플라스미드 벡터 pCold08s2의 작제

참고 실시예 1로부터 얻은 플라스미드 pCold08NC2중 5'-UTR-코딩 부분으로 20개 뉴클레오티드의 삽입 돌연변이를 하기와 같이 도입하였다.

주형으로서 플라스미드 pCold08NC2 , 및 합성 프라이머 Sp20F (서열 번호:6) 및 프라이머 CSPterR (서열 번호:7)을 사용하여 PCR을 수행하였다. 50 ng의 pCold08NC2, 5㎕의 Ex Taq 버퍼, 8㎕의 dNTP 믹스, 5 pmol의 프라이머 Sp20, 5 pmol의 프라이머 CSPterR, 0.5㎕의 Takara Ex Taq (Takara Bio) 및 총 용량이 50 ㎕이 되도록 하는 양만큼의 멸균수를 포함하는 반응 혼합물에서 PCR (94℃, 1분(변성), 55℃, 1분(프라이머 어닐링) 및 72℃, 1분(합성 반응), 30 싸이클)을 수행하였다. 전체 PCR 반응 혼합물을 3%(w/v) 저 융점 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 약 300-bp의 증폭된 DNA 단편을 겔로부터 정제하고 5㎕의 멸균수에 현탁시키고 증폭 단편 SC로서 사용하였다.

합성 프라이머 Sp20R (서열 번호:8) 및 프라이머 NheF2 (서열 번호:9), 및 주형으로서 pCold08를 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하였다. 전체 PCR 반응 혼합물을 3%(w/v) 저 융점 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 약 150-bp의 증폭된 DNA 단편을 겔로부터 정제하고 5㎕의 멸균수에 현탁시키고 증폭 단편 SN로서 사용하였다.

각각 1 ㎕의 증폭된 단편 SC 및 SN, 5㎕의 Ex Taq 버퍼, 5 ㎕ dNTP 믹스 및 총 용량이 50 ㎕이 되도록 하는 양만큼의 멸균수를 포함하는 반응 혼합물을 94℃에서 10분간 가열하고, 60분동안 37℃으로 저온각시키고 15분간 37℃에서 인큐베이션시켰다. 0.5㎕의 Takara Ex Taq를 그에 가하고, 혼합물을 3분동안 72℃에서 가열하였다.

5 pmol의 각 프라이머 NheF2 및 CSPterR, 5㎕의 Ex Taq 버퍼, 5㎕의 dNTP mix 및 총 용량이 100 ㎕이 되도록 하는 양만큼의 멸균수를 반응 혼합물에 가하였다. 생성된 반응 혼합물에 PCR(94℃, 1분, 55℃, 1분 및 72℃, 2분, 30 싸이클)을 수행하였다. 전체 PCR 반응 혼합물을 3%(w/v) 저 융점 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 약 400-bp의 증폭된 DNA 단편을 겔로부터 정제하고 5㎕의 멸균수에 현탁시키고 증폭 단편 Sp20-1으로서 사용하였다.

Sp20-1를 제한 효소 NheI 및 EcoRI (둘 모두 Takara Bio사로부터 입수)로 이중으로 분해하였다. 생성된 DNA 단편을 1% 저 융점 아가로스 겔상에서 전기영동시켜 분리한 후, 추출하고 정제하였다. 정제된 DNA 단편 및 NheI 및 EcoRI로 분해된 pCold08를 혼합하고 DNA Ligation Kit (Takara Bio)를 사용하여 함께 결찰시켰다. 결찰 반응 혼합물을 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시키고 형질전환체를 앰피실린을 포함하는 LB 아가 배지상에서 배양하였다. 플라스미드를 생성된 콜로니로부터 제조하고, DNA 서열화하였다. PCR 산물이 적절하게 삽입된 플라스미드를 선별하고 pCold08s2로 지정하였다. pCold08s2에서 뉴클레오티드 서열 5'-GAGCGGATAACAATTTCACA-3' (서열 번호:11)을 pCold08NC2의 5'-UTR중 +120 및 +121 사이(서열 번호:5)에 삽입하였다. lac 조절자에서 전사 개시 사이트를 +1로서 정의한다. 이 위치는 서열 번호:1에 나타낸 cspA 유전자의 뉴클레오티드 서열중 597번 뉴클레오티드 598번 뉴클레오티드 사이의 위치에 상응한다. pCold08s2에 포함된 5'-UTR의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호:2에 나타낸다.

(2) 단백질 발현을 위한 플라스미드의 작제

(2)-1 플라스미드 벡터 pCold08s2-GFP의 작제

아쿠아리아 빅토리아(Aequorea victoria)로부터 유래된 GFP 단백질을 코딩하는 유전자를 하기와 같이 pCold082에 도입하였다. 주형으로서 플라스미드 pQBI63 (Takara Bio), 및 합성 프라이머 GFP-F (서열 번호:11) 및 프라이머 GFP-R (서열 번호:12)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 50ng의 pQBI63, 5㎕의 Ex Taq 버퍼, 8㎕의 dNTP 믹스, 5 pmol의 각각의 프라이머 GFP-F 및 GFP-R, 0.5㎕의 Takara Ex Taq (Takara Bio) 및 총 용량이 50 ㎕이 되도록 하는 양만큼의 멸균수를 포함하는 반응 혼합물에 PCR(94℃, 1분, 55℃, 1분 및 72℃, 1분, 30 싸이클)을 수행하였다. 전체 PCR 반응 혼합물을 3%(w/v) 저 융점 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. GFP 유전자를 포함하는 약 700-bp의 증폭된 DNA 단편을 겔로부터 정제하고 5㎕의 멸균수에 현탁시켰다. DNA 단편을 EcoRI 및 XbaI (Takara Bio)으로 이중으로 분해하였다. 분해된 DNA 단편을 1% 저 융점 아가로스 겔상에서 전기영동시켜 분리한 후, 추출하고 정제하였다. 정제된 DNA 단편 및 EcoRI 및 XbaI로 분해된 pCold08s2를 혼합하고 DNA Ligation Kit (Takara Bio)를 사용하여 함께 결찰시켰다. 결찰 반응 혼합물을 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시키고 형질전환체를 앰피실린을 포함하는 LB 아가 배지상에서 배양하였다. 플라스미드를 생성된 콜로니로부터 제조하고, DNA 서열화하였다. PCR 산물이 적절하게 삽입된 플라스미드를 선별하고 pCold08s2-GFP로 지정하였다. 추가로, GFP 유전자를 포함하는 증폭된 DNA 단편을 5'-UTR중 삽입된 서열을 갖지 않는 pCold08NC2내로 도입하여 유사한 방식으로 pCold08-GFP를 수득하였다.

(2)-2 플라스미드 벡터 pCold08s2-H296의 작제

파이브로넥틴으로부터 유래된 헤파린-결합 폴리펩티드인 H296 단편 단백질을 코딩하는 유전자를 하기와 같이 pCold082내로 도입하였다.

주형으로서 플라스미드 pCH102 (미국 특허 No. 5198423), 및 합성 프라이머 H296-F (서열 번호:13) 및 프라이머 H296-R (서열 번호:14)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 50ng의 pCH102, 5㎕의 Ex Taq 버퍼, 8㎕의 dNTP 믹스, 5 pmol의 각각의 프라이머 H296-F 및 H296-R, 0.5㎕의 Takara Ex Taq 및 및 총 용량이 50 ㎕이 되도록 하는 양만큼의 멸균수를 포함하는 반응 혼합물에 PCR(94℃, 1분, 55℃, 1분 및 72℃, 1분, 30 싸이클)을 수행하였다. 전체 PCR 반응 혼합물을 3%(w/v) 저 융점 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 약 1-kbp 증폭된 DNA 단편를 겔로부터 정제하고 5㎕의 멸균수에 현탁시켰다. DNA 단편을 EcoRI 및 BamHI (Takara Bio)으로 이중으로 분해하였다. 1% 저 융점 아가로스 겔상에서 전기영동시켜 분리한 후, 추출하고 정제하였다. EcoRI 및 BamHI으로 분해된 H296 유전자 및 pCold08s2를 포함하는 정제된 DNA 단편을 혼합하고 DNA Ligation Kit (Takara Bio)를 사용하여 함께 결찰시켰다. 결찰 반응 혼합물을 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시키고 형질전환체를 앰피실린을 포함하는 LB 아가 배지상에서 배양하였다. 플라스미드를 생성된 콜로니로부터 제조하고, DNA 서열화하였다. PCR 산물이 적절하게 삽입된 플라스미드를 선별하고 pCold08s2-H296로 지정하였다. 추가로, H296 유전자를 포함하는 증폭된 DNA단편을 5'-UTR중 삽입된 서열을 갖지 않는 pCold08NC2내로 도입하여 유사한 방식으로 pCold08-H296를 수득하였다.

(2)-3 플라스미드 벡터 pCold08s2-lac의 작제

β-갈락토시다아제 (lacZ) 유전자를 포함하는 플라스미드 pKM005(M. Inouye (ed.), Experimental Manipulation of Gene Expression, pp.15-32, 1983, New York Academic Press)를 BamHI 및 SalI (Takara Bio)로 분해하였다. 전체 반응 혼합물을 1%(w/v) 저 융점 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. lacZ 유전자를 포함하는 DNA 단편을 겔로부터 정제하고 5㎕의 멸균수에 현탁시켰다. 정제된DNA 단편 및 BamHI 및 SalI으로 분해된 pCold08s2를 혼합하고 DNA Ligation Kit (Takara Bio)를 사용하여 함께 결찰시켰다. 10㎕의 결찰 반응 혼합물을 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시키고 형질전환체를 앰피실린을 포함하는 LB 아가 배지상에서 배양하였다. 플라스미드를 생성된 콜로니로부터 제조하고, DNA 서열화하였다. PCR 산물이 적절하게 삽입된 플라스미드를 선별하고 pCold08s2-lac로 지정하였다. 추가로, lacZ 유전자를 포함하는 증폭된 DNA단편을 5'-UTR중 삽입된 서열을 갖지 않는 pCold08NC2내로 도입하여 유사한 방식으로 pCold08-lac를 수득하였다.

(3) 발현 수준 평가

(3)-1 pCold08s2-GFP 및 pCold08s2-H296를 사용한 발현 수준 평가

대장균(Escherichia coli) BL21 (Novagen) 또는 CL83 (J. Bacteriol., 180:90-95 (1998))를 pCold08s2-GFP (실시예 1-(2)-1에서 제조) 또는 pCold08s2-H296 (1-(2)-2에서 제조), 또는 대조군으로서 pCold08-GFP 또는 pCold08-H296로 형질전환시켰다. 각 형질전환체를 50μg/ml의 앰피실린을 포함하는 2.5ml의 앰피실린으로 접종시키고 진탕시키면서 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 배양물을 3 ml의 동일한 배지에 1%(v/v)의 농도로 접종시키고 진탕시키면서 37℃에서 배양하였다. 혼탁도(OD600nm)가 0.2에 도달하였을 때, 배양 온도를 15℃로 저하시키고, 15분동안 상기 온도에서 계속하여 인큐베이션시켰다. 이후, IPTG를 최종 농도 1 mM로 가하고 배양 온도를 15℃로 유지시키면서 24시간동안 계속하여 진탕시키면서 배양하였다. 혼탁도를 측정한 후(OD600nm), 원심분리에 의해 2ml의 배양물로부터 수거한 세포를 100㎕의 세포 현탁액(50 mM 트리스-하이드로클로라이드 버퍼 (pH 7.5), 150 mM 염화나트륨)에 현탁시켰다. 약 3.75 x 10⁶ 세포(혼탁도에 기초하여 산출됨)에 상응하는 현탁액을 10% SDS 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시켰다. 겔을 Coomassie Brilliant Blue (CBB)로 염색하고 탈색시켰다. ["Seibutsukagaku Jikken No Tebiki 2" (Kagakudojin)]에 기술된 바와 같이 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하였다. Total Lab ver.1.11(Nonlinear Dynamics)를 사용하여 겔에 상 분석을 수행하여 GFP 및 H296의 발현 수준을 측량하였다. pCold08s2-GFP 및 pCold08s2-H296을 포함하는 재조합체의 단백질 발현 수준 대 5'-UTR중 삽입된 서열을 갖지 않는, pCold08-GFP 및 pCold08-H296을 포함하는 재조합체의 것의 비를 표 1에 나타낸다.

표 1

플라스미드	숙주	발현배율*
pCold08s2-GFP	BL21	1.5-배
	CL83	2.0-배
pCold08s2-H296	BL21	1.5-배
	CL83	1.5-배

*발현 배율: 상 분석에 기초하여 산출된, pCold08s2 클론에 대한 발현 수준/pCold08 클론에 대한 발현 수준

표 1에 나타낸 SDS 폴리아크릴아미드 겔 분석의 결과에 기초하여, 5'-UTR중 20개의 뉴클레오티드의 삽입을 갖는 벡터 pCold08s2를 사용하여 제조된 클론에 대한 발현 수준은 pCold08NC2를 사용하여 제조된 클론에 대한 것에 비하여 더욱 향상되었다.

(3)-2 pCold08s2-lac를 사용한 발현 수준 평가

대장균(Escherichia coli) BL21 또는 CL83를 pCold08s2-lac (실시예 1-(2)-3에서 제조), 또는 대조군으로서 pCold08-lac를 사용하여 형질전환시켰다. 각 형질전환체를 50μg/ml의 앰피실린을 포함하는 2.5ml의 앰피실린으로 접종시키고 진탕시키면서 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 배양물을 3 ml의 동일한 배지에 1%(v/v)의 농도로 접종시키고 진탕시키면서 37℃에서 배양하였다. 혼탁도(OD600nm)가 0.2에 도달하였을 때, 배양 온도를 15℃로 저하시키고, 15분동안 상기 온도에서 계속하여 인큐베이션시켰다. 이후, IPTG를 최종 농도 1 mM로 가하여 발현을 유도하고, 배양 온도를 15℃로 유지시키면서 계속하여 배양하였다. 유도 직전 및 유도 후 배양 3 또는 24시간째 37℃에서 배양물로부터 채취한 샘플을 [J.H. Miller, Experiments in Molecular 유전자tics, pp.352-355, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory]에 기술된 바와 같은 방법에 따라 β-갈락토시다아제 활성을 측정하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.

표 2: β-갈락토시다아제 활성(유니트)

플라스미드	숙주	유도 전	유도후 3시간째	유도후 24시간째
pCold08-lac	BL21CL83	101106971	4951028514	8555031504
pCold08s2-lac	BL21CL83	9151 5172	66314 56028	11977072459

표 2에 나타낸 바와 같이, 5'-UTR중 20개의 뉴클레오티드의 삽입을 갖는 pCold08s2-lac를 포함하는 형질전환체의 β-갈락토시다아제 활성은 유도 후 24시간째 pCold08-lac를 포함하는 형질전환체보다 더욱 높았다(1.4-배 (숙주: BL21) 또는 2.3-배 (숙주: CL83))

실시예 2: 벡터 pCold08s12 및 pCold08s32의 작제 단백질 발현 수준의 조사

(1) 플라스미드 벡터 pCold08s12 작제

프라이머 Sp20F 및 CSPterR를 대신하여 프라이머 Sp12F (서열 번호:15) 및 Sp12R (서열 번호:16)을 사용하는 것을 제외하고 실시예 1-(1)에 기술된 바와 같이 플라스미드 pCold08s12를 작제하였다. 플라스미드 pCold08s12에서, 12개의 뉴클레오티드의 삽입 돌연변이를 참고 실시예 1로부터의 플라스미드 pCold08NC2중 5'-UTR-코딩 부분에 도입하였다.

pCold08s12에서, 뉴클레오티드 서열 5'-ATGTTTTGTAGA-3' (서열 번호:17)를 pCold08NC2중 5'-UTR의 +120 및 +121 사이(서열 번호:5)에 삽입하였다. pCold08s12에 포함된 5'-UTR의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호:3으로 나타낸다.

(2) 플라스미드 벡터 pCold08s32의 작제

프라이머 Sp20F 및 Sp20R를 대신하여 프라이머 Sp32F (서열 번호:18) 및Sp32R (서열 번호:19)를 사용하는 것을 사용하는 것을 제외하고 실시예 1-(1)에 기재된 바와 같이 플라스미드 pCold08s32를 작제하였다. 플라스미드 pCold08s32에서, 32개의 뉴클레오티드의 삽입 돌연변이를 참고 실시예 1로부터의 플라스미드 pCold08NC2중 5'-UTR-코딩 부분에 도입하였다.

pCold08s32에서, 뉴클레오티드 서열 5'-ATGTTTTGTAGATTTGAAAGAGTAGATTAGTA-3' (서열 번호:20)을 5'-UTR의 +120 및 +121 사이(서열 번호:5)에 삽입하였다. pCold08s32에 포함된 5'-UTR의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호:5로 나타낸다.

(3) 플라스미드 벡터 pCold08s12-H296 및 pCold08s32-H296의 작제

실시예 1-(2)-1에 기술된 바와 제조된 H296 유전자를 포함하는 약 1-kbp DNA 단편을 EcoRI 및 BamHI을 사용하여 이중으로 분해하였다. 분해된 DNA 단편을 1% 저 융점 아가로스 겔상에서 전기영동시켜 분리한 후, 추출하고 정제하였다. 정제된 DNA 단편 및 EcoRI 및 BamHI로 분해된 pCold08s12 또는 pCold08s32를 혼합하고 DNA Ligation Kit (Takara Bio)를 사용하여 함께 결찰시켰다. 결찰 반응 혼합물을 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시키고 형질전환체를 앰피실린을 포함하는 LB 아가 배지상에서 배양하였다. 플라스미드를 생성된 콜로니로부터 제조하고, DNA 서열화하였다. PCR 산물이 적절하게 삽입된 플라스미드를 선별하고 pCold08s12-H296 및 pCold08s32-H296로 지정하였다.

(4) pCold08s12-H296 및 pCold08s32-H296을 사용한 발현 수준 평가

대장균(Escherichia coli) BL21 또는 CL83을 상기 (3)에서 제조한 pCold08s12-H296 또는 pCold08s32-H296, 또는 대조군으로서 pCold08-H296으로 형질전환시켰다. 각 형질전환체를 50μg/ml의 앰피실린을 포함하는 2.5ml의 앰피실린으로 접종시키고 진탕시키면서 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 배양물을 3 ml의 동일한 배지에 1%(v/v)의 농도로 접종시키고 진탕시키면서 37℃에서 배양하였다. 혼탁도(OD600nm)가 0.2에 도달하였을 때, 배양 온도를 15℃로 저하시키고, 15분동안 상기 온도에서 계속하여 인큐베이션시켰다. 이후, IPTG를 최종 농도 1 mM로 가하고 배양 온도를 15℃로 유지시키면서 진탕시키면서 24시간동안 계속하여 배양하였다. 각 재조합체에 대한 H296의 발현 수준을 실시예 1-(3)-1에 기술된 바와 같이 생성된 배양물에 대하여 측량하였다. pCold08s12-H296 및 pCold08s32-H296를 포함하는 재조합체에 대하여 측정된 단백질 발현 수준 대 5'-UTR중 삽입된 서열을 갖지 않는, pCold08-H296를 포함하는 재조합체에 대한 것의 비를 표 3에 나타낸다.

표 3

플라스미드	숙주	발현배율*
pCold08s12-H296	BL21	1.3-배
	CL83	1.5-배
pCold08s32-H296	BL21	1.4-배
	CL83	1.8-배

*발현 배율: 상 분석에 기초하여 산출된, pCold08s12 또는 pColds32 클론에 대한 발현 수준/pCold08 클론에 대한 발현 수준

SDS 폴리아크릴아미드 겔 분석 결과 12 또는 32개의 뉴클레오티드가 삽입된 5'-UTR를 갖는 벡터를 사용하여 관찰된 발현 수준이 삽입을 갖지 않는 벡터를 사용하여 관찰된 발현 수준과 비교하여 향상되었음이 입증되었다.

산업상 이용가능성

본 발명은 저온 조건하에서 발현 효율이 높은 발현 벡터를 제공한다. 상기 벡터를 사용하여 고도로 순수한 단백질 시료를 제조하기 위하여 관심의 대상이 되는 단백질을 특이적으로 발현시킬 수 있다. 추가로, 상기 벡터를 사용하여 저온-조건하에서 단백질을 발현시킴으로써 그의 활성을 유지하는 단백질을 효율적으로 수득할 수 있다.

서열 목록

서열 번호:2 : cspA 유전자의 개변된 5' 비해독 영역

서열 번호:3 : cspA 유전자의 개변된 5' 비해독 영역

서번호:4 : cspA 유전자의 개변된 5' 비해독 영역

서번호:5 : cspA 유전자의 개변된 5' 비해독 영역

서번호:6 : PCR용 합성 프라이머

서번호:7 : PCR용 합성 프라이머

서번호:8 : PCR용 합성 프라이머

서번호:9 : PCR용 합성 프라이머

서번호:10 : cspA 유전자의 5' 비해독 영역으로 삽입된 합성 뉴클레오티드

서번호:11 : PCR용 합성 프라이머

서번호:12 : PCR용 합성 프라이머

서번호:13 : PCR용 합성 프라이머

서번호:14 : PCR용 합성 프라이머

서번호:15 : PCR용 합성 프라이머

서번호:16 : PCR용 합성 프라이머

서번호:17 : cspA 유전자의 5' 비해독 영역내로 삽입된 합성 뉴클레오티드

서번호:18 : PCR용 합성 프라이머

서번호:19 : PCR용 합성 프라이머

서번호:20 : cspA 유전자의 5' 비해독 영역내로 삽입된 합성 뉴클레오티드

SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> Cold-inducible expression vector <130> 664200 <150> JP 2002-359956 <151> 2002-12-11 <160> 20 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1209 <212> DNA <213>Escherichia coli <400> 1 aagcttcgat gcaattcacg atcccgcagt gtgatttgag gagttttcaa tggaatataa 60 agatccaatg catgagctgt tgagcagcct ggaacagatt gtttttaaag atgaaacgca 120 gaaaattacc ctgacgcaca gaacaacgtc ctgtaccgaa attgagcagt tacgaaaagg 180 gacaggatta aaaatcgatg atttcgcccg ggttttgggc gtatcagtcg ccatggtaaa 240 ggaatgggaa tccagacgcg tgaagccttc aagtgccgaa ctaaaattga tgcgtttgat 300 tcaagccaac ccggcattaa gtaagcagtt gatggaatag acttttatcc actttattgc 360 tgtttacggt cctgatgaca ggaccgtttt ccaaccgatt aatcataaat atgaaaaata 420 attgttgcat cacccgccaa tgcgtggctt aatgcacatc aacggtttga cgtacagacc 480 attaaagcag tgtagtaagg caagtccctt caagagttat cgttgatacc cctcgtagtg 540 cacattcctt taacgcttca aaatctgtaa agcacgccat atcgccgaaa ggcacactta 600 attattaaag gtaatacact atgtccggta aaatgactgg tatcgtaaaa tggttcaacg 660 ctgacaaagg cttcggcttc atcactcctg acgatggctc taaagatgtg ttcgtacact 720 tctctgctat ccagaacgat ggttacaaat ctctggacga aggtcagaaa gtgtccttca 780 ccatcgaaag cggcgctaaa ggcccggcag ctggtaacgt aaccagcctg taatctctgc 840 ttaaaagcac agaatctaag atccctgcca tttggcgggg atttttttat ttgttttcag 900 gaaataaata atcgatcgcg taataaaatc tattattatt tttgtgaaga ataaatttgg 960 gtgcaatgag aatgcgcaac gccgtaagta aggcgggaat aatttcccgc cgaagactct 1020 tactctttca atttgcaggc taaaaacgcc gccagctcat aactctcctg tttaatatgc 1080 aattcacaca gtgaatctct tatcatccag gtgaaaaata aaagcgtgaa acaaatcact 1140 attaaagaaa gtaatctata tttctgcgca ttccagctct gtgttgattt cacgagtatg 1200 tactgcacc 1209 <210> 2 <211> 164 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified 5' Untranslated Region of cspA Gene <400> 2 aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat ccagtgtagt aaggcaagtc 60 ccttcaagag cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca 120 cgagcggata acaatttcac attaattatt aaaggtaata cacc 164 <210> 3 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified 5' Untranslated Region of cspA Gene <400> 3 aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat ccagtgtagt aaggcaagtc 60 ccttcaagag cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca 120 catgttttgt agattaatta ttaaaggtaa tacacc 156 <210> 4 <211> 176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified 5' Untranslated Region of cspA Gene <400> 4 aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat ccagtgtagt aaggcaagtc 60 ccttcaagag cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca 120 catgttttgt agatttgaaa gagtagatta gtattaatta ttaaaggtaa tacacc 176 <210> 5 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified 5' Untranslated Region of cspA Gene <400> 5 aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat ccagtgtagt aaggcaagtc 60 ccttcaagag cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca 120 cttaattatt aaaggtaata cacc 144 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer for PCR <400> 6 gtgcggataa caatttcaca ttaattatta aaggtaatac 40 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer for PCR <400> 7 tgcgcattct cattgcaccc 20 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer for PCR <400> 8 tgtgaaattg ttatccgctc gtgtgccttt cggcgatatg 40 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer for PCR <400> 9 gttttcccgc tagccaaatt gtgagcggat a 31 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Nucleotide inserted into 5' Untranslated Region of cspA Gene <400> 10 gagcggataa caatttcaca 20 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer for PCR <400> 11 aagataacaa aggaattcga gtaaaggaga agaacttt 38 <210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer for PCR <400> 12 tctggacatt ctagattatt tgtatagttc atccatg 37 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer for PCR <400> 13 ccatccatgg aattcggcta ttcctgcacc aactga 36 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer for PCR <400> 14 gaaaacctag gatccttatg tggaaggaac atccaa 36 <210> 15 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer for PCR <400> 15 catatcgccg aaaggcacac atgttttgta gattaattat taaaggtaat ac 52 <210> 16 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer for PCR <400> 16 gtattacctt taataattaa tctacaaaac atgtgtgcct ttcggcgata tg 52 <210> 17 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Nucleotide inserted into 5' Untranslated Region of cspA Gene <400> 17 atgttttgta ga 12 <210> 18 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer for PCR <400> 18 atgttttgta gatttgaaag agtagattag tattaattat taaaggtaat ac 52 <210> 19 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer for PCR <400> 19 tactaatcta ctctttcaaa tctacaaaac atgtgtgcct ttcggcgata tg 52 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Nucleotide inserted into 5' Untranslated Region of cspA Gene <400> 20 atgttttgta gatttgaaag agtagattag ta 32 1/10

Claims

돌연변이가 5'-비해독 영역에서 형성되는 스템 구조 사이의 거리를 변화시키기 위하여 도입되는 저온 쇼크 단백질 유전자에 대한 mRNA로부터 유래된 5'-비해독 영역을 코딩하는 부분을 갖는 벡터.
제 1항에 있어서, 도입되는 돌연변이는 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실인 벡터.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 돌연변이가 서열 번호:1중 593번 뉴클레오티드 내지 598번 뉴클레오티드에 상응하는 영역으로 도입되는 벡터.
제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 5'-비해독 영역을 코딩하는 부분이 추가로 오퍼레이터를 갖는 벡터.
제 4항에 있어서, 5'-비해독 영역을 코딩하는 부분이 서열 번호:2, 3 또는 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 5'-비해독 영역을 코딩하는 부분인 벡터.
제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 5'-비해독 영역을 코딩하는 부분의 상류에 위치하는 프로모터를 갖는 벡터.
제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 사용하는 숙주의 리보솜 RNA에서 안티(anti)-하류 박스 서열에 상보적이고, 5'-비해독 영역을 코딩하는 부분의 하류에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터.
제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드 벡터인 벡터.
(1) 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 유전자가 혼입된 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항의 벡터로 숙주를 형질전환시켜 형질전환체를 수득하고;

(2) 형질전환체를 배양하고;

(3) 통상의 온도보다 낮은 온도로 배양 온도를 바꾸어 관심의 대상이 되는 단백질을 발현시키는 것을 포함하는, 관심의 대상이 되는 단백질을 발현시키는 방법.
제 9항에 있어서, 프로모터가 단계 (3)동안, 또는 그 후 유도되는 방법.