JP4370353B2 - Ｄｎａ及びかかるｄｎａを用いた低温での目的蛋白質の発現方法 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝子組換え技法において使用されるベクター、及び該ベクターを用いた蛋白質の発現方法に関する。

遺伝子組換え技術を用いた有用蛋白質の生産は、今日では広く用いられている技術である。中でも大腸菌を宿主とした発現系は最も一般的に用いられている発現系であり、多くの蛋白質が組換体によって生産されるようになってきた。これら組換体による有用蛋白質の生産には、ＲＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーター支配下に目的遺伝子を配置した、いわゆる発現ベクターを構築して用いるのが一般的である。発現ベクターに用いられるプロモーターの例としては、例えば大腸菌を宿主とする場合には、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｇａｌ、ａｒａ等のプロモーター等が使用されている。また、これら大腸菌のＲＮＡポリメラーゼに直接認識されるプロモーター以外のものを利用した発現ベクターとして、大腸菌に感染するバクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーターを利用したｐＥＴ−システム（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製）［ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第１８９巻、第１１３〜１３０頁（１９８６）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、第５６巻、第１２５〜１３５頁（１９８７）］がある。ｐＥＴ−システムの場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを大腸菌内で発現させ、このＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより発現ベクター上のＴ７プロモーター下流に配置された目的遺伝子の転写が行われ、更に宿主の翻訳システムによって目的蛋白質の合成が行われる。

しかしながら、ｐＥＴ−システムも含めた多くの大腸菌発現系で目的蛋白質が高レベルで発現された場合、目的蛋白質が不溶性の複合体、いわゆるインクルージョンボディとなり、活性型の目的蛋白質の量が非常に低くなる場合が多い。いくつかのポリペプチドでは、インクルージョンボディを可溶化後リフォールディング操作を行って活性型ポリペプチドを得た例が報告されているが、一般的にその回収量は低い場合が多く、また、各目的蛋白質ごとに適切なリフォールディング条件を検討する必要がある。そのため、活性型蛋白質を直接大腸菌内で発現させるシステムが求められていた。

インクルージョンボディの形成は、翻訳されたポリペプチド鎖が正しい立体構造にフォールディングする前の中間体の段階で、分子間相互作用により他のポリペプチド鎖と絡み合い、巨大な不溶性の複合体となることによると考えられている。このような場合、組換体大腸菌の培養温度を通常用いられる３７℃よりも低い温度（２０〜３０℃）で行うと活性型蛋白質の発現量が増加することが知られている。これは、リボソームによる翻訳の速度が遅くなることにより、中間体が正しい構造にフォールディングする時間的ゆとりが得られることと、低温条件下で細胞内蛋白質分解酵素の働きが遅くなり、発現された活性型蛋白質の安定性が増すためと推測されている。このように、インクルージョンボディとなる蛋白質の生産には、低温条件下で組換体大腸菌を培養する方法は有効な方法として注目されてきた。

一方、対数増殖期の大腸菌の培養温度を３７℃から１０〜２０℃に低下させると大腸菌の増殖は一時的に止まり、その間にコ−ルドショック蛋白質と呼ばれる一群の蛋白質の発現が誘導される。該蛋白質はその誘導レベルに応じて第Ｉ群（１０倍以上）第ＩＩ群（１０倍未満）に分けられ、第Ｉ群の蛋白質としては、ＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＧ、及びＣｓｄＡなどが挙げられる。中でもＣｓｐＡは、３７℃から１０℃への温度シフトの１．５時間後にその発現量は全菌体蛋白質の１３％までに達することから［プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８７巻、第２８３〜２８７頁（１９９０）］、低温における組換え蛋白質の生産にｃｓｐＡ遺伝子のプロモーターを利用することが試みられてきた。

ｃｓｐＡ遺伝子を用いた低温条件下での組換体蛋白質発現系は、上述のように該遺伝子のプロモーターが低温で高効率で転写を開始させること以外に、以下のような有効性が示されている。
（１）ｃｓｐＡ遺伝子から転写された翻訳可能なｍＲＮＡが機能を有するＣｓｐＡ蛋白質をコードしていない場合、より具体的には、ＣｓｐＡ蛋白質のＮ末端配列の一部のみをコードしている場合には、このようなｍＲＮＡはコールドショック蛋白質も含めた他の大腸菌蛋白質の発現を長時間阻害し、その間は該ｍＲＮＡの翻訳が優先的に行われる［ジャーナル オブ バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、第１７８巻、第４９１９〜４９２５頁（１９９６）］。
（２）ｃｓｐＡ遺伝子の開始コドンから１２塩基下流の位置には、１５塩基からなるダウンストリームボックス（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｂｏｘ）と呼ばれる配列があり、低温条件下での翻訳効率を高いものにしている。
（３）ｃｓｐＡ遺伝子ｍＲＮＡの転写開始点から開始コドンまでにある１５９塩基からなる５’非翻訳領域は、ＣｓｐＡの発現に対して、３７℃では負の、低温条件下では正の影響を与えている。

しかしながら、該遺伝子のプロモーターは確かに低温で高効率で転写を開始することが可能であるが、実際には通常の培養に用いられる温度（３７℃）においても作用しており、該遺伝子から転写されるｍＲＮＡの安定性が該遺伝子の発現を調節していることが示唆されている［モレキュラー マイクロバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第２３巻、第３５５〜３６４頁（１９９７）］。そのため、ｃｓｐＡ遺伝子のプロモーターを用いて構築されている発現ベクターでは発現調節が不完全であり、その産物が宿主にとって有害であるような遺伝子の場合、発現ベクターを含有する大腸菌を誘導可能な状態まで培養するのが困難であったり、あるいは発現ベクターの構築すら不可能なこともある。

例えば、米国特許第５６５４１６９号明細書には、ｃｓｐＡ遺伝子のプロモーターを用いた発現プラスミドに、プロモーターの評価に一般に用いられるβガラクトシダーゼ遺伝子を挿入した場合ですら、発現産物の影響で構築物を大腸菌に保持することが困難であると記載されている。

一方、ｃｓｐＡ遺伝子のプロモーターの有する転写開始能力は転写開始点から−３７の位置より下流の領域に保持されていることは知られているが、その必須領域は確認されていない。また、上記の米国特許明細書にはｃｓｐＡ遺伝子のプロモーターとしての機能に必須な領域として該遺伝子の転写開始点から−４０〜＋９６の領域が示されているが、該領域はｍＲＮＡに転写され、かつ蛋白質はコードしない領域を１００塩基近くも含んでいる。このように、低温において効率のよい転写を達成しようとする場合に必要とされる、ｃｓｐＡプロモーターの最小領域はいまだ明らかにされていない。

したがって、本発明の目的は、その遺伝子産物が宿主にとって有害であるため、従来技術では発現系の構築あるいは効率よい遺伝子産物の生産が困難であった遺伝子であっても、該遺伝子を発現させるための形質転換体が作製可能であり、かつ低温条件下でも該遺伝子産物を高効率で発現させることが可能なベクターを提供することにある。

本発明者らは、かかる目的を達成するためにｃｓｐＡ遺伝子のプロモーターの下流にｌａｃオペレーター配列を挿入することにより、プラスミドの構築や誘導可能状態までの培養中に、該プロモーターからの遺伝子発現を調節することを試みた。こうして構築されたｌａｃオペレーターにより調節可能なｃｓｐＡプロモーターを有する発現ベクターを用いることにより、ｌａｃオペレーター配列を持たないｃｓｐＡプロモーターを利用した発現ベクターでは構築不可能であったエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素（Ｆｄａｓｅ２）をコードする遺伝子が挿入された該酵素発現プラスミドの構築に成功した。更に該プラスミドで形質転換された形質転換体の培養中にｌａｃオペレーターを不活性化すると同時に培養温度を低くすることにより、該酵素を誘導発現することができることを見出した。このことは、オペレーター配列の導入により、常温（３７℃）での発現が制御可能な低温発現ベクターの構築が可能となったことを示している。
更に、本発明者らはその機能を保持しうるｃｓｐＡプロモーターの最小必要領域を決定し、本発明を完成するに至った。

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はベクターに関するものであって、下記の各要素を含有することを特徴とする：
（１）使用する宿主中でその作用を示すプロモーター、
（２）（１）のプロモーターの作用を調節するための調節領域、及び
（３）コールドショック蛋白質遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコードする領域、あるいは該非翻訳領域に少なくとも１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加が施された領域をコードする領域。

本発明の第２の発明は、下記工程を包含することを特徴とする目的蛋白質の発現方法に関する：
（１）発現させようとする目的蛋白質をコードする遺伝子を組込んだ本発明の第１の発明のベクターで宿主を形質転換する工程、
（２）得られた形質転換体を培養する工程、
（３）調節領域の機能を介してプロモーターの作用を誘導すると共に培養温度を通常の温度より低下させて目的蛋白質を発現させる工程。

更に、本発明の第３の発明は、単離されたｃｓｐＡプロモーターに関し、配列表の配列番号５に示される塩基配列を含み、かつ１３５塩基以下の塩基配列からなることを特徴とする。

発明の実施の形態
以下に本発明を具体的に説明する。
本発明の第１の発明の（１）のプロモーターとしては特に限定はなく、使用する宿主中でＲＮＡへの転写を開始する活性を有するものであればよい。任意のプロモーターを上記（３）のコールドショック蛋白質遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコードする領域と組合せて使用することにより、低温応答性のプロモーターとして使用することができる。なお、発現誘導時に高い転写効率が望まれる場合には、上記のｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＧ、ｃｓｄＡといったコールドショック蛋白質遺伝子由来のプロモーターが本発明に適しており、特にｃｓｐＡ遺伝子由来のプロモーターが好適である。

また、上記（２）の調節領域としては、（１）のプロモーターの下流に位置する遺伝子の発現を制御可能なものであれば特に限定はない。例えば、プロモーターより転写されたｍＲＮＡに相補的なＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）を転写するような領域をベクターに導入しておくことにより、プロモーター下流の遺伝子からの目的蛋白質の翻訳を阻害することができる。アンチセンスＲＮＡの転写を（１）のプロモーターとは異なる適当なプロモーターの制御下におくことにより、目的蛋白質の発現を調節することができる。また、種々の遺伝子の発現調節領域に存在するオペレーターを利用してもよい。例えば、大腸菌ラクトースオペロン由来のｌａｃオペレーターを本発明に使用することができる。ｌａｃオペレーターは適当な誘導物質、例えばラクトースやその構造類似体、特に好適にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の使用によってその機能を解除し、プロモーターを作用させることが可能である。このようなオペレーター配列は、通常、プロモーター下流の転写開始点付近に配置される。

上記（３）のコールドショック蛋白質ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコードする領域とは、ｍＲＮＡの開始コドンよりも５’側の部分をコードしている領域である。大腸菌のコールドショック蛋白質遺伝子（ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＧ、及びｃｓｄＡ）にはこの領域が特徴的に見出されており［ジャーナル オブ バクテリオロジー、第１７８巻、第４９１９〜４９２５頁（１９９６）、ジャーナル オブ バクテリオロジー、第１７８巻、第２９９４〜２９９７頁（１９９６）］、これらの遺伝子から転写されたｍＲＮＡのうちの５’末端より１００塩基以上の部分が蛋白質に翻訳されない。この領域は遺伝子発現の低温応答性に重要であり、任意の蛋白のｍＲＮＡの５’末端にこの５’非翻訳領域を付加することにより、該ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳が低温条件下で起こるようになる。このコールドショック蛋白質ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域は、その機能を保持する範囲においてその塩基配列に１以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加が施されたものであってもよい。

本明細書において「領域」とは核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）上のある範囲を指す。また、本明細書に記載の「ｍＲＮＡの５’非翻訳領域」とは、ＤＮＡからの転写によって合成されるｍＲＮＡのうち、その５’側に存在し、かつ蛋白質をコードしていない領域をいう。以降の本明細書においては該領域を「５’−ＵＴＲ（５’−Ｕｎｔｒａｎｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎ）」と記載する。なお、特に断らない限り５’−ＵＴＲは大腸菌ｃｓｐＡ遺伝子のｍＲＮＡ、あるいはこれが改変されたものの５’非翻訳領域をさす。

本発明のベクターには上記に列記されたコールドショック蛋白質遺伝子由来の５’−ＵＴＲをコードする領域を使用することができるが、特にｃｓｐＡ遺伝子由来のものが好適に使用できる。更にその塩基配列を一部改変したものであってもよく、例えば上記（２）に示したオペレーターの導入等によってこの領域の塩基配列が改変されたものであってもよい。下記実施例に示されるように、配列表の配列番号１に示される塩基配列を含むｍＲＮＡ、例えば配列表の配列番号２、３あるいは４に示される塩基配列のｍＲＮＡをコードする領域、更にこれらの配列に改変を加えたｍＲＮＡをコードする領域を含む領域を使用することができる。このコールドショック蛋白質遺伝子の５’−ＵＴＲをコードする領域は（１）のプロモーターと発現させようとする蛋白質をコードする遺伝子の開始コドンとの間に配置され、また、該領域上にオペレーターが導入されていてもよい。例えば配列表の配列番号２〜４に示される塩基配列の５’−ＵＴＲは、その塩基配列中にｌａｃオペレーター配列を含んでおり、低温での選択的な目的蛋白質の発現に効果的である。

また、上記構成要素に加えて、用いる宿主のリボソーマルＲＮＡのアンチダウンストリームボックス配列と相補性を有する塩基配列を５’非翻訳領域の下流に含有させることにより発現効率を上昇させることができる。例えば大腸菌の場合、１６ＳリボソーマルＲＮＡの１４６７−１４８１の位置にアンチダウンストリームボックス配列が存在し、この配列と高い相補性を示す塩基配列を含有するコールドショック蛋白質のＮ末端ペプチドをコードする領域を用いることができる。例えば、配列表の配列番号２８に示される塩基配列あるいはその配列に高い相同性を有する配列を人工的に導入してもよい。アンチダウンストリームボックス配列と相補性を有する配列は、開始コドンから数えて１〜１５塩基目程度のところから始まるように配置されると効果的である。目的蛋白質をコードする遺伝子は、該蛋白質がこれらのＮ末端ペプチドとの融合蛋白質として発現されるようにベクターに組込まれるか、あるいは、目的蛋白質をコードする遺伝子がアンチダウンストリームボックス配列と相補性を有するように、部位特異的変異導入法により塩基置換が導入される。目的蛋白質が融合蛋白質として発現されるようにベクターに組込まれている場合、該ペプチドは目的蛋白質が活性を失わない範囲で任意の長さのものであってよい。このような融合蛋白質発現用ベクターは、例えば適当なプロテアーゼによって該融合蛋白質から目的蛋白質を単離できるよう、その接続部分に工夫が施されたもの、精製あるいは検出に利用可能なペプチドと融合蛋白質として発現されるように工夫が施されたもの等であることができる。更に、目的蛋白質遺伝子の下流に転写終結配列（ターミネーター）が配置されたベクターはベクターの安定性が向上し目的蛋白質の高発現に有利である。

本発明のベクターは、ベクターとしての目的を達成できるものであれば一般的に用いられるベクター、例えばプラスミド、ファージ、ウイルス等のいずれであってもよい。また、本発明のベクターに含有される上記の構成要素以外の領域としては、例えば複製起点、選択マーカーとして使用される薬剤耐性遺伝子、オペレーターの機能に必要な調節遺伝子、例えばｌａｃオペレーターに対してはｌａｃＩ^ｑ遺伝子、等を有することができる。また、本発明のベクターは宿主に導入された後にはそのゲノムＤＮＡ上に組込まれてもかまわない。

例えば、プラスミドとして構築された本発明のベクターを使用した目的蛋白質の発現は以下のような工程で実施される。本発明のプラスミドベクターに目的の蛋白質をコードする遺伝子をクローニングし、該プラスミドで適当な宿主を形質転換することにより、該蛋白質を発現させるための形質転換体を得ることができる。このような形質転換体はプロモーターの作用がオペレーターによって抑制されているため、非誘導状態では上記蛋白質が発現されず、仮に上記蛋白質が宿主にとって有害なものであっても上記ベクターは宿主中に安定に保持される。

上記の形質転換体を通常の培養温度、例えば３７℃、非誘導状態で培養してその細胞数を増加させた後、オペレーターの作用を解除して転写を誘導し、目的の蛋白質を発現させる。この際、転写誘導を行う前、あるいは転写誘導と同時に培養温度を下げることにより、目的蛋白質がインクルージョンボディを形成することを抑制して活性を有する形の目的蛋白質を取得することができる。

以下に、具体的なプラスミドベクターの構築を挙げて、本発明について更に詳しく説明する。なお、本明細書においては特に断らない限り、大腸菌ＣｓｐＡ蛋白質を「ＣｓｐＡ」、該蛋白質の発現に関与する遺伝子上の領域を「ｃｓｐＡ遺伝子」、該遺伝子のプロモーター領域を「ｃｓｐＡプロモーター」と記載する。また、ＧｅｎＢａｎｋ 遺伝子データベースに受託番号Ｍ３０１３９として登録、公開されている天然のｃｓｐＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号６に示す。該配列中、塩基番号４２６〜４３０及び４４８〜４５３がプロモーターのコア配列、塩基番号４６２が主要な（ｍａｊｏｒ）転写開始点（＋１）、塩基番号６０９〜６１１がＳＤ配列（リボソーム結合配列）、塩基番号６２１〜６２３及び８３２〜８３４がそれぞれＣｓｐＡの開始コドン及び終止コドンである。したがって該配列中で５’−ＵＴＲをコードするのは塩基番号４６２から６２０の部分である。

まず、ｃｓｐＡ遺伝子を利用した発現プラスミドとして、ｃｓｐＡ遺伝子をそのまま用いたプラスミドベクターｐＭＭ０３１シリーズ（ｐＭＭ０３１及びｐＭＭ０３１Ｆ１）を構築し、これらに外来遺伝子を導入した外来遺伝子発現プラスミドの構築及び該プラスミドを使用した蛋白質発現について説明する。

これらの発現プラスミドの詳細な構築方法は実施例１−（１）に記載されている。例えばプラスミドｐＭＭ０３１は、ｐＵＣ系プラスミドの複製起点、アンピシリン耐性遺伝子などを含むプラスミドベクターｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）のＡｆｌＩＩＩ−ＥｃｏＲＩサイト間のｌａｃプロモーターを含む領域が、ｃｓｐＡ遺伝子のプロモーター領域、５’−ＵＴＲをコードする領域、及び１３アミノ酸残基のＣｓｐＡのＮ末端部分をコードする領域と置き換えられた構造をしている。なお、プラスミドｐＭＭ０３１Ｆ１では、ＣｓｐＡのＮ末端より１３番目のアスパラギンをコードするコドンがリジンをコードするものに変化している。これらのｐＭＭ０３１シリーズに用いられているｃｓｐＡ遺伝子のプロモーター領域は、その機能に必須な領域を含む該遺伝子の転写開始点から数えて−６７以降の領域である。また、ＣｓｐＡのＮ末端部分１３アミノ酸残基をコードする領域は、ｃｓｐＡ遺伝子の低温条件下での高い翻訳効率を担っているダウンストリームボックス配列を十分に含んでいる。これらのことから、ｐＭＭ０３１シリーズは、ｃｓｐＡ遺伝子の低温条件下での高い蛋白質発現効率を十分に反映することのできる発現ベクターである。

実際にｐＭＭ０３１シリーズのプラスミドが低温誘導型の発現ベクターとして機能し、有用蛋白質を活性型の蛋白質として発現できることは、実施例１−（２）にラウス関連ウイルス（Ｒｏｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２、ＲＡＶ−２）由来の逆転写酵素遺伝子を例として用いて確認された。しかしながら、ｐＭＭ０３１シリーズを用いて構築された該逆転写酵素発現ベクターにより形質転換された大腸菌を３７℃で取扱った場合、外来の遺伝子を含有しないｐＭＭ０３１シリーズのプラスミドの形質転換体と比べて形成されるコロニーが小さく、また菌の生育速度が遅いことが観察された。このことは、ｃｓｐＡ遺伝子、特に該遺伝子のプロモーターを利用した場合には３７℃における発現の制御が不十分であり、蛋白質の生産には問題のあることを示唆する。

３７℃におけるｃｓｐＡ遺伝子の発現制御の不正確さは、発現しようとする蛋白質が宿主にとって更に毒性の高いものである場合には発現プラスミドを構築することが不可能となるほど致命的なものであることが示された。実施例１−（３）に示したように、ｐＭＭ０３１シリーズのプラスミドベクターを用いたエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素（Ｆｄａｓｅ２）発現プラスミドの構築を試みたとき、発現産物の宿主に対する毒性のために該プラスミドの構築は不可能であった。発現されたＦｄａｓｅ２が宿主に対して影響を与えるために発現ベクターの構築が不可能となることは、その構築操作時の副産物として、該酵素をコードする遺伝子中の１あるいは２塩基の欠失によって読取り枠がずれ、該酵素を発現できなくなったプラスミドは得られていることから容易に推測される。更に、Ｆｄａｓｅ２の宿主大腸菌に対する毒性については、従来の技術として紹介したｐＥＴ−システム（ノバジェン社製）のプラスミドｐＥＴ３ｄを用いて該酵素発現ベクターを構築した後、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つ発現用宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換しようとした際に形質転換体が得られないことからも示される。

そこで、本発明者らはこれらの結果を基に実用上有効な新たな発現ベクターの開発を行い、本発明のプラスミドベクターを見い出すに至った。

すなわち、本発明者らは、非誘導状態（３７℃）での発現レベルを下げ、目的蛋白質の発現をコントロールできるような低温発現プラスミドベクターｐＭＭ０３７を開発した。ｐＭＭ０３７は、ｐＭＭ０３１シリーズのｐＭＭ０３１Ｆ１上にある転写開始点（＋１）下流の＋２〜＋１８の領域のかわりに、機能的なｌａｃオペレーターが形成できるようにデザインされた３１塩基の配列が挿入されている以外、ｐＭＭ０３１Ｆ１と全く同じ構造をしている。プラスミドベクターｐＭＭ０３７上にコードされた５’−ＵＴＲ、すなわち転写開始点〜ＣｓｐＡ開始コドン直前の塩基までの塩基配列を配列表の配列番号２に示す。

この発現プラスミドベクターの構築方法は実施例２−（１）に記載されている。すなわち、機能的なｌａｃオペレーターがｃｓｐＡプロモーター下流に形成されるようにデザインされた、ｃｓｐＡ遺伝子転写開始点上流の領域の配列とｌａｃオペレーターの配列とを含むプライマーＣＳＡ＋１ＲＬＡＣ（配列表の配列番号１１に該プライマーの塩基配列を示す）を合成することができる。５’末端をリン酸化したこのプライマーと、ｐＭＭ０３１シリーズのプラスミド構築に用いられたプライマーＣＳＡ−６７ＦＮ（配列表の配列番号７に該プライマーの塩基配列を示す）とを用い、野生型ｃｓｐＡ遺伝子を含むプラスミドｐＪＪＧ０２［ジャーナル オブ バクテリオロジー、第１７８巻、第４９１９〜４９２５頁（１９９６）］を鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ｃｓｐＡ遺伝子のプロモーターの下流にｌａｃオペレーター領域を配したＤＮＡ断片を得ることができる。このとき、プライマーＣＳＡ−６７ＦＮ上のＮｃｏＩサイト、プライマーＣＳＡ＋１ＲＬＡＣ上のＮｈｅＩサイトのように、用いるプライマーの末端近くに制限酵素認識配列をデザインしておくとその後の構築、改変に便利である。得られたＤＮＡ断片をＮｃｏＩ消化した後、プラスミドｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）のＮｃｏＩ−ＳｍａＩ間に挿入してプラスミドｐＭＭ０３４を構築できる。

得られたｐＭＭ０３４をＮｃｏＩサイト及びｐＴＶ１１８Ｎ上にあるＡｆｌＩＩＩ サイトで切断し、クレノウフラグメントを用いて末端を平滑化した後、セルフライゲーションすることにより、ｐＴＶ１１８Ｎ由来のｌａｃプロモーターを除いたプラスミドｐＭＭ０３５を構築できる。

次に、ｐＭＭ０３５のｌａｃオペレーター領域の下流にｃｓｐＡｍＲＮＡの５’非翻訳領域をコードする配列を挿入することができる。すなわち、実施例１−（１）のように構築されたｐＭＭ０３１Ｆ１を鋳型として、プライマーＣＳＡ＋２０ＦＮ（配列表の配列番号１２にプライマーＣＳＡ＋２０ＦＮの塩基配列を示す）及びＭ１３プライマーＭ４（宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行い、ｃｓｐＡ遺伝子の転写開始点の下流１９塩基目からｐＭＭ０３１Ｆ１のマルチクローニングサイトまでを含むＤＮＡ断片を得ることができる。このＤＮＡ断片をＣＳＡ＋２０ＦＮ上に配したＮｈｅＩサイト、及びマルチクローニングサイト上のＸｂａＩサイトで切断した後、先に得られたｐＭＭ０３５のＮｈｅＩ−ＸｂａＩ間に、それぞれのサイトが再生する方向に挿入してｐＭＭ０３７を構築できる。

こうして得られたプラスミドｐＭＭ０３７の常温（３７℃）における目的蛋白質の発現制御の能力及び低温における目的蛋白質の発現能力の有効性は、ｐＭＭ０３７上にあるｐＴＶ１１８Ｎ由来のマルチクローニングサイトに目的蛋白質をコードする遺伝子を導入して調べることができる。

上記のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素（Ｆｄａｓｅ２）をコードする遺伝子を有する発現プラスミドはオペレーターを持たないｐＭＭ０３１シリーズのプラスミドベクターでは構築することすらできない。しかしながら、該遺伝子をＣｓｐＡのＮ末端部分をコードする配列と同じ読取り枠となるようプラスミドベクターｐＭＭ０３７に挿入して構築された発現プラスミドであるプラスミドｐＭＦＤＡ１０２は、ｌａｃリプレッサー高発現株の大腸菌、例えば大腸菌ＪＭ１０９中に安定に保持される。このように、上記のプラスミドベクターが実質上有効な発現制御の能力を有することが示される。

さらに、得られた形質転換体を常温（３７℃）にて培養し、誘導に適した濁度に達した際に培養温度を低温、例えば１５℃に下げると同時に、適当な誘導剤、例えば終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（以下ＩＰＴＧと略す）を添加し、更に適当な時間培養を続ける。この培養液より得られた菌体について、そこで発現されている蛋白質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、該融合ポリペプチドのバンドを検出することにより、ｐＭＭ０３７の低温における目的蛋白質の発現能力を確認することができる。あるいは、得られた菌体を超音波処理等に付して菌体抽出液を調製し、その菌体抽出液に含まれる目的蛋白質の生理活性を測定すれば、活性型として発現された目的蛋白質の量を知ることができる。上記のプラスミドｐＭＦＤＡ１０２で形質転換された大腸菌は、上記の誘導操作により活性を有するＦｄａｓｅ２蛋白質を発現した。

なお、上記のプラスミドベクターｐＭＭ０３７の構築において、ｃｓｐＡ遺伝子の転写開始点直後（＋２以降の位置）にｌａｃオペレーターが導入されたにもかかわらず、ｃｓｐＡプロモーターはその本来の機能である低温での転写開始活性を保持していた。このことから、ｃｓｐＡプロモーターは転写開始点までの領域にその機能を保持していることがわかる。したがってｃｓｐＡプロモーターの機能には、上記の−３７の位置から転写開始点までの領域、すなわち配列表の配列番号６に示した天然のｃｓｐＡ遺伝子の塩基配列のうち、塩基番号４２５〜４６１の部分のみが必須である。このｃｓｐＡプロモーターの必須領域の塩基配列を配列表の配列番号５に示す。

このようにして構築されたプラスミドベクターｐＭＭ０３７は、塩基の欠失、付加、挿入、置換等の変異を導入し改変することが可能であり、本発明の構成要素にこれら変異を導入したものも本発明の範囲内である。以下に、ｐＭＭ０３７を基本構造として本発明者らが行った、本発明のベクターの改変例について説明する。

まず、５’−ＵＴＲをコードする領域に欠失変異を導入できる。実施例３−（１）に記載されているようにして、ｐＭＭ０３７のｌａｃオペレーター領域の直後にｃｓｐＡ遺伝子のＳＤ配列をつないだプラスミド、すなわち、配列表の配列番号２に示されたｐＭＭ０３７上にコードされた５’−ＵＴＲのうち、塩基番号３３〜１６１の部分が欠失したものをコードするプラスミドベクターｐＭＭ０３６を構築することができる。このｐＭＭ０３６は、５’−ＵＴＲをコードする配列に導入された欠失変異以外はｐＭＭ０３７と全く同じ構造をしている。

次に、発現させようとする蛋白質に融合させるＣｓｐＡのＮ末端部分のアミノ酸残基の長さを変えることができる。実施例３−（２）に記載されているようにして、ｐＭＭ０３７上のＣｓｐＡのＮ末端部分をコードする領域をＣｓｐＡの全アミノ酸配列コード領域（７０アミノ酸残基）とし、その後ろにマルチクローニングサイトを配して、目的遺伝子がＣｓｐＡの７０アミノ酸残基との融合ポリペプチドとして発現されるプラスミドベクターｐＭＭ０３８を構築できる。このｐＭＭ０３８は、融合ポリペプチドとして発現されるＣｓｐＡをコードする配列の全長が含まれている以外はｐＭＭ０３７と全く同じ構造をしている。

また、５’−ＵＴＲをコードする配列に置換変異を導入できる。実施例３−（３）に記載のように、ｐＭＭ０３７上の５’−ＵＴＲをコードする領域上の天然のｃｓｐＡ遺伝子の転写開始点から数えて＋２０から＋２６に当る領域に６塩基の置換変異を導入したプラスミドベクターｐＭＭ０４７を構築することができる。このｐＭＭ０４７は、上記の置換変異以外はｐＭＭ０３７と全く同じ構造をしている。なお、プラスミドベクターｐＭＭ０４７で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＭＭ０４７と命名、表示され、平成９年１０月３１日（原寄託日）より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−１６４９６として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６５２３（国際寄託への移管請求日：平成１０年９月２４日）として寄託されている。プラスミドベクターｐＭＭ０４７にコードされている５’−ＵＴＲ、すなわち転写開始点からＣｓｐＡ開始コドン直前の塩基までの塩基配列を配列表の配列番号３に示す。

更に、これらの変異を同時に２つ以上導入することが可能である。実施例３−（４）に記載のように、上記のプラスミドｐＭＭ０４７の５’−ＵＴＲをコードする配列上に更に３０塩基の欠失変異を導入したプラスミドベクターｐＭＭ０４８を構築することができる。このｐＭＭ０４８は、ｐＭＭ０４７と同じ６塩基の置換変異及び天然のｃｓｐＡ遺伝子の転写開始点から数えて＋５６から＋８５に当る領域、すなわち配列表の配列番号３に示された塩基配列中の塩基番号７０〜９９の配列をコードする部分が欠失している以外はｐＭＭ０３７と全く同じ構造をしている。配列表の配列番号４に、プラスミドベクターｐＭＭ０４８にコードされている５’−ＵＴＲの塩基配列を示す。

上記のプラスミドベクターｐＭＭ０４７、ｐＭＭ０４８が低温での蛋白質発現能力を保持していることから、これら２つのプラスミド構築に当ってｃｓｐＡ遺伝子由来の５’−ＵＴＲに導入された変異はその機能に影響を与えないことが示された。したがって低温での蛋白質発現に必須なｃｓｐＡ遺伝子由来の５’−ＵＴＲ上の領域は、プラスミドｐＭＭ０４８にコードされた天然のｃｓｐＡ遺伝子の転写開始点から数えて＋２７〜＋５５及び＋８６〜＋１５９の領域であることが示される。該領域の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
このようにして構築された、ｐＭＭ０３７の改変プラスミドベクターｐＭＭ０３６、ｐＭＭ０３８、ｐＭＭ０４７、及びｐＭＭ０４８の常温（３７℃）における目的蛋白質の発現制御の能力及び低温における目的蛋白質の発現能力の有効性は、例えば発現ベクターの発現能の評価によく用いられるβガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子）を利用して評価することができる。

すなわち、実施例３−（５）に記載のごとく、プラスミドｐＫＭ００５［１９８３年、ニューヨーク アカデミック プレス発行、井上正順編集、エクスペリメンタル マニピュレーション オブ ジーン エクスプレッション（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、第１５〜３２頁］から得たｌａｃＺ遺伝子を含む約６．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＭＭ０３７及びその改変プラスミドに挿入することにより、ＣｓｐＡのＮ末端１２アミノ酸残基及びマルチクローニングサイト由来の１０アミノ酸残基がβ−ガラクトシダーゼの１０番目のアミノ酸残基のところでつながった融合β−ガラクトシダーゼ発現ベクターを構築することができる。なおｐＭＭ０３８の場合は、ＣｓｐＡのＮ末端７０アミノ酸残基及びマルチクローニングサイト由来の９アミノ酸残基がβ−ガラクトシダーゼの１０番目のアミノ酸残基のところでつながった融合β−ガラクトシダーゼをコードしている。得られたｌａｃＺ遺伝子を含むプラスミドは、それぞれプラスミドｐＭＭ０３７ｌａｃ、ｐＭＭ０３６ｌａｃ、ｐＭＭ０３８ｌａｃ、ｐＭＭ０４７ｌａｃ、及びｐＭＭ０４８ｌａｃと命名されている。

各プラスミドを用いて形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を常温（３７℃）にて培養し、誘導に適した濁度に達した際に培養温度を低温、例えば１５℃に下げると同時に、適当な誘導剤、例えば終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、更に適当な時間培養を続けた後、得られた培養液中のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することにより、低温における蛋白質の発現能力を比較することができる。また、誘導直前の菌体を用いれば、３７℃における非誘導状態での発現量も比較することができる。

β−ガラクトシダーゼ活性は、１９７２年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｊ．Ｈ．ミラー（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ）著、エクスペリメンツ イン モレキュラー ジェネティクス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第３５２〜３５５頁に記載の方法で測定できる。

表１に示されるとおり、いずれのプラスミドで形質転換した大腸菌でも３７℃におけるβ−ガラクトシダーゼ活性は、コントロールとして用いたｌａｃプロモーターの下流にｌａｃＺ遺伝子を導入したｐＴＶ１１８Ｎｌａｃとほぼ同じレベルであり、３７℃における発現が効果的にコントロールされていることがわかる。なお、このとき検出された３７℃におけるβ−ガラクトシダーゼ活性は、培養に使用されたＬＢ培地（トリプトン １％、酵母エキス ０．５％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ７．０）中に混在するラクトース等により若干誘導が行われているレベルである。

一方、いずれのプラスミドで形質転換した大腸菌でも１５℃への温度シフト及び誘導剤の添加によってβ−ガラクトシダーゼ活性の増加が見られた。このことは、各プラスミドが低温において目的蛋白質を高発現する能力を有することを示している。なお、ｃｓｐＡ遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’−ＵＴＲの大部分を欠失したプラスミドｐＭＭ０３６に関しては、他のプラスミドに比べてβ−ガラクトシダーゼ発現量が低い。

また、ｐＭＭ０４７ｌａｃ、ｐＭＭ０４８ｌａｃについて得られた結果は、これらのプラスミドがコードするｍＲＮＡの５’−ＵＴＲに導入された変異が低温での蛋白質発現に関して悪影響を及ぼさないこと、すなわち、配列表の配列番号１にその塩基配列を示したこれらの変異が導入されなかった領域がその機能に必須であることを示している。

さらに、これらのプラスミドで形質転換された形質転換体について各温度におけるβ−ガラクトシダーゼ発現量を調べてみたところ、１０℃あるいは１５℃のような低温状態ではプラスミドｐＭＭ０３８ｌａｃ、ｐＭＭ０３７ｌａｃ、及びｐＭＭ０４７ｌａｃはいずれもコントロールであるｐＴＶ１１８Ｎｌａｃと比較して高い発現量を、２０℃では同レベルの発現量を、３７℃では低い発現量をそれぞれ示した。このことは、これらのプラスミドがコードするｍＲＮＡの５’−ＵＴＲが、主に１５℃以下の低温状態での蛋白質発現に有効であることを示している。一方、プラスミドｐＭＭ０４８ｌａｃはｐＴＶ１１８Ｎｌａｃと２０℃以下のような低温状態で高い発現量を、３７℃でも同等の発現量を示した。このことは、ｐＭＭ０４８に導入された変異の結果、該プラスミドが常温、低温双方での高い蛋白質発現能力を獲得したことを示している。

一方、本発明のベクターは本発明の構成要素以外の領域に様々な機能をもつことができるのは当然である。例えば、本発明のベクターは、実質的に終止コドンを含まないようなマルチクローニングサイトやプラスミドの安定化のための転写ターミネーターなどを含むことができる。実施例４に記載のように、ｃｓｐＡ遺伝子の開始コドンを含む部位がＮｃｏＩサイトあるいはＮｄｅＩサイトに変換され、ＣｓｐＡのＮ末端をコードする領域に続くマルチクローニングサイトが実質的に終止コドンを含まない配列に変更され、その下流には３つの読み取り枠いずれにも終止コドンが出現する配列を持ち、さらに下流にはｃｓｐＡ遺伝子由来の転写ターミネーター領域を含む、読取り枠がマルチクローニングサイト上で一つずつ異なるシリーズベクターを構築することができる。ｐＭＭ０４７を基本骨格としたプラスミドはｐＣｏｌｄ０１ＮＣシリーズ（ＮｃｏＩサイトを含む）あるいはｐＣｏｌｄ０１ＮＤシリーズ（ＮｄｅＩサイトを含む）プラスミド、ｐＭＭ０４８を基本骨格としたプラスミドはｐＣｏｌｄ０２ＮＣシリーズあるいはｐＣｏｌｄ０２ＮＤシリーズプラスミドと命名されている。このように実質的に終止コドンを含まず読取り枠が一つずつ異なるマルチクローニングサイトを持ったシリーズプラスミドは、外来遺伝子の挿入が容易であり発現ベクターが容易に構築できる。

これらｐＣｏｌｄ０１シリーズおよびｐＣｏｌｄ０２シリーズプラスミドが、その基本骨格となったプラスミドｐＭＭ０４７あるいはｐＭＭ０４８とそれぞれ同等の発現能を保持していることは、ｌａｃＺ遺伝子を利用して評価することができる。表５に示されるとおり、上記のプラスミドにｌａｃＺ遺伝子が挿入されたプラスミドで形質転換された大腸菌は、表１に示されたｐＭＭ０４７ｌａｃあるいはｐＭＭ０４８ｌａｃで形質転換された大腸菌とそれぞれ同等のβ−ガラクトシダーゼ発現パターンを示し、上記のプラスミドがプラスミドｐＭＭ０４７あるいはｐＭＭ０４８とそれぞれ同等の発現能を保持していることが示される。

これまで具体的に例示してきた本発明のベクターは、すべてオペレーターとしてｌａｃオペレーターを用いているため、遺伝子発現が目的の場合には宿主としてｌａｃリプレッサー高発現株の大腸菌（ｌａｃＩ^ｑ株）、例えば大腸菌ＪＭ１０９を使う必要がある。本発明のベクターには他のオペレーターを使用することも可能であり、この場合には当該オペレーターに適した制御方法が用いられるのは当然である。また、当業者には自明なことであるが、上記のｐＣｏｌｄシリーズプラスミドのようにｌａｃオペレーターを用いている場合でも、このプラスミド上にｌａｃリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩ遺伝子）を導入することにより、宿主に関する制限をなくすことができる。

例えば、実施例５に記載のように、ｌａｃＩ遺伝子を含むｐＣｏｌｄ０３シリーズ及びｐＣｏｌｄ０４シリーズプラスミドを構築することができる。これらのプラスミドはｌａｃＩ遺伝子を持つ以外はそれぞれｐＣｏｌｄ０１シリーズ及びｐＣｏｌｄ０２シリーズプラスミドとそれぞれ全く同じ構造をしている。また、同様にしてｌａｃＩ遺伝子の代わりにｌａｃリプレッサー高発現遺伝子であるｌａｃＩ^ｑ遺伝子を用いたプラスミド、例えばｐＣｏｌｄ０５シリーズ及びｐＣｏｌｄ０６シリーズプラスミドを構築することも可能である。

このようにして構築されたｌａｃＩ遺伝子あるいはｌａｃＩ^ｑ遺伝子を含むプラスミドの目的蛋白質の発現制御の能力、ならびに低温における目的蛋白質の発現能力の有効性は、これらのプラスミドにｌａｃＺ遺伝子を挿入し、ｌａｃＩ遺伝子を持たない大腸菌ＤＨ５αを宿主として用いることにより容易に評価できる。表６にはｌａｃＩ、ｌａｃＩ^ｑ遺伝子の効果が示されている。非誘導状態である３７℃において、ｌａｃＩ遺伝子を持たないｐＣｏｌｄ０１ＮＣ２ｌａｃでは発現が十分にコントロールされておらず、高いβ−ガラクトシダーゼ活性が認められる。なお、３７℃においてｐＣｏｌｄ０１より高い発現能を有するｐＣｏｌｄ０２（ｐＭＭ０４８の誘導体）の場合、大腸菌ＤＨ５αを宿主として形質転換体が得られない。それに対して、ｌａｃＩ遺伝子を持つｐＣｏｌｄ０３ＮＣ２ｌａｃ及びｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ｌａｃは３７℃における発現が効果的にコントロールされており、さらにｌａｃＩ^ｑ遺伝子が存在するｐＣｏｌｄ０５ＮＣ２ｌａｃ及びｐＣｏｌｄ０６ＮＣ２ｌａｃは、より効果的に発現が抑制され効果的にコントロールされていることがわかる。また、これらのプラスミドについて、誘導状態での目的蛋白質の発現能力には実質上変化は見られていない。したがって、ｌａｃオペレーターを構成要素として含む本発明のベクターにｌａｃＩ遺伝子あるいはｌａｃＩ^ｑ遺伝子を導入することにより、ｌａｃリプレッサーの有無による宿主に制限がなくなることが示される。

また、目的の遺伝子の発現効率を向上させるために、１６ＳリボソーマルＲＮＡ中に存在するアンチダウンストリームボックス配列に高い相補性を有する塩基配列（ダウンストリームボックス配列）を本発明のベクターに導入することができる。大腸菌ＣｓｐＡのＮ末端部分をコードする領域に存在するダウンストリームボックス配列は、上記のアンチダウンストリームボックス配列に対して６７％の相補性しか有していない。これをより高い相補性、好ましくは８０％以上の相補性を有する塩基配列とすることにより、その下流に接続された遺伝子をより高い効率で発現させることが可能になる。

さらに、本発明のベクターは、発現された目的の遺伝子産物の精製を容易にするためのペプチドであるタグ配列をコードする塩基配列や、タグ配列のような目的の遺伝子産物中の余分なペプチドの除去に利用されるプロテアーゼ認識アミノ酸配列をコードする塩基配列を導入することができる。

精製用のタグ配列としては、数個のヒスチジン残基からなるヒスチジンタグやマルトース結合蛋白質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等が使用できる。ヒスチジンタグを付加された蛋白質はキレーティングカラムを使用して容易に精製することができ、他のタグ配列についてもこれらに特異的な親和性を有するリガンドを使用することにより、簡便に精製することができる。また、余分なペプチドの除去に利用されるプロテアーゼとしてはファクターＸａ、スロンビン、エンテロキナーゼ等を使用することができ、本発明のベクターにこれらのプロテアーゼによって特異的に切断されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を導入すればよい。

例えば、実施例６には１６ＳリボソーマルＲＮＡ中に存在するアンチダウンストリーム配列に完全に相補的なダウンストリームボックス配列、６個のヒスチジン残基からなるヒスチジンタグおよびファクターＸａの認識アミノ酸配列をコードする塩基配列が導入されたプラスミド（ｐＣｏｌｄ０７シリーズ及びｐＣｏｌｄ０８シリーズ）が記載されている。当該プラスミドのタンパク発現能をｌａｃＺ遺伝子を用いて評価することにより、相補性の低いダウンストリームボックス配列を有するプラスミドに比較して、発現されるβ−ガラクトシダーゼ活性が著しく上昇することが示される。また、誘導前におけるβ−ガラクトシダーゼ発現量は多少増加するが、これは許容できるレベルであり、上記のようにこれらのプラスミド上のｌａｃＩ遺伝子をｌａｃＩ^ｑ遺伝子に変更することにより、効果的に抑制できる。

また、ｐＣｏｌｄ０７シリーズあるいはｐＣｏｌｄ０８シリーズを用いた場合には、目的蛋白質はダウンストリームボックス配列にコードされるペプチド、ヒスチジンタグ、ならびにファクターＸａの認識アミノ酸配列を含むリーダーペプチドとの融合蛋白質として発現される。この融合蛋白質はヒスチジンタグを含むことから、キレーティングカラムを用いて１ステップで精製することができる。次に、該蛋白質をファクターＸａで処理することによりリーダーペプチドを目的蛋白質から切断し、さらにキレーティングカラムを再度通過させることによりリーダーペプチドが除去された目的蛋白質のみを取得することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本的な操作については１９８９年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．）に記載の方法によった。更に、以下に示すプラスミドの構築には、特に記載の無い限り大腸菌ＪＭ１０９を宿主とし、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（トリプトン １％、酵母エキス ０．５％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ７．０）あるいはＬＢ培地に１．５％の寒天を加え固化させたＬＢプレートを用いて３７℃で好気的に培養した。

実施例１． ｐＭＭ０３１シリーズ低温誘導ベクターの構築及び誘導能の検討
（１）プラスミドベクターｐＭＭ０３１及びｐＭＭ０３１Ｆ１の構築
ｃｓｐＡ遺伝子を含むプラスミドｐＪＪＧ０２［ジャーナル オブ バクテリオロジー、第１７８巻、第４９１９〜４９２５頁（１９９６）］を鋳型として、合成プライマーＣＳＡ−６７ＦＮ及びＣＳＡ１３Ｒ（プライマーＣＳＡ−６７ＦＮ及びＣＳＡ１３Ｒの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号７、８に示す）を用いてＰＣＲを行い、ｃｓｐＡ遺伝子のプロモーターから１３番目のアミノ酸残基をコードする領域までを含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を上記の各プライマー上に配したＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩサイトで切断した後、プラスミドｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ間に挿入してプラスミドｐＭＭ０３０を構築した。次に該プラスミドをＮｃｏＩ（宝酒造社製）及びＡｆｌＩＩＩ（ＮＥＢ社製）で消化し、クレノウフラグメント（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化した後、セルフライゲーションを行ってｐＴＶ１１８Ｎ由来のｌａｃプロモーターを除いたプラスミドｐＭＭ０３１を得た。プラスミドｐＭＭ０３１は、ｃｓｐＡ遺伝子のプロモーター領域（６７塩基）、５’非翻訳領域（１５９塩基）、及びＣｓｐＡのＮ末端から１３番目のアミノ酸残基までをコードする領域（３９塩基）の下流に、ｐＴＶ１１８Ｎ由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩのマルチクローニングサイトをもつプラスミドベクターである。

次に、ｐＭＭ０３１上のｃｓｐＡ遺伝子の開始コドンから始まる読取り枠をマルチクローニングサイト上でずらすために、ｐＭＭ０３１に挿入されたＣｓｐＡのＮ末端部分をコードする領域の３’末端を１塩基欠失させたプラスミドベクターｐＭＭ０３１Ｆ１を構築した。プラスミドｐＭＭ０３１Ｆ１は、プライマーＣＳＡ１３Ｒの代りにプライマーＣＳＡ１３Ｒ２（配列表の配列番号９にプライマーＣＳＡ１３Ｒ２の塩基配列を示す）を用いたほかはｐＭＭ０３１の構築と全く同じ方法で構築した。したがって、このプラスミドは、ｐＭＭ０３１上のＣｓｐＡのＮ末端領域のコード領域の３’末端が１塩基少ないこと以外はｐＭＭ０３１と同じである。なお、この１塩基の欠失により、該プラスミドｐＭＭ０３１Ｆ１にコードされるＣｓｐＡのＮ末端から１３番目のアミノ酸残基はアスパラギンからリジンに置換される。

（２）ラウス関連ウイルス（Ｒｏｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２、ＲＡＶ−２）由来の逆転写酵素をコードする遺伝子を用いた、ｐＭＭ０３１シリーズ低温誘導ベクターの誘導能の検討
特開平７−３９３７８号公報に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴ８ＲＡＶ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７１６）よりラウス関連ウイルス（Ｒｏｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２、ＲＡＶ−２）由来の逆転写酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドｐＴ８ＲＡＶを調製した。該プラスミドをＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ（共に宝酒造社製）で消化し、上記の逆転写酵素をコードする遺伝子及びその下流にある転写終結配列を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を（１）で得られたｐＭＭ０３１Ｆ１のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ間に挿入してプラスミドｐＭＭ０３１ＲＡＶを構築した。

ｐＭＭ０３１ＲＡＶ及びｐＭＭ０３１を用いて大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上にそれぞれの形質転換体のコロニーを形成させたところ、ｐＭＭ０３１ＲＡＶにより形質転換された大腸菌のコロニーは、明らかにｐＭＭ０３１による形質転換体のコロニーよりも小さいことが観察された。次に、得られた形質転換体をそれぞれ１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で好気的に一晩培養した。この培養液をそれぞれ２本ずつ新鮮な５ｍｌの同じ培地に１％ずつ植菌して３７℃で好気的に培養し、濁度がＯＤ６００＝０．６に達した時点でその一方の培養温度を１５℃とし更に２０時間培養した。この培養中、ｐＭＭ０３１ＲＡＶによる形質転換体の誘導濁度到達までの培養時間は、ｐＭＭ０３１による形質転換体の約２倍程度要した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、１５℃で培養したｐＭＭ０３１ＲＡＶによる形質転換体でのみ、分子量約１０万の逆転写酵素と考えられるバンドが観察され、ｐＭＭ０３１上のｃｓｐＡ由来の蛋白質発現システムが低温誘導型であることが確認できた。

次に、大腸菌抽出液を調製し逆転写酵素活性を測定した。すなわち、ｐＭＭ０３１ＲＡＶにより形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で好気的に一晩培養した。この培養液を新鮮な１００ｍｌの同じ培地に４％植菌して３７℃で好気的に培養し、濁度がＯＤ６００＝０．６に達した時点で培養温度を１５℃とし更に５時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、破砕用緩衝液［５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．３）、６０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ−４０、１ｍＭ ＤＴＴ、５μＭ ４−アミジノフェニルメタンスルホニルフルオライドハイドロクロライド］４．７ｍｌに懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。これを遠心分離して上清を回収し、大腸菌抽出液を得た。この抽出液を酵素希釈液〔５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１０％ グリセロール、０．１％ ＮＰ−４０、２ｍＭ ＤＴＴ〕で１０倍希釈した後、逆転写酵素活性を特開平７−３９３７８号公報記載の方法で測定したところ、全体で約１０６１ユニットの逆転写酵素活性が検出された。これは少なくとも培養液１ｍｌ当り１０ユニットの逆転写酵素が発現されていることを示し、ｐＭＭ０３１の低温時の発現量が高いことが明らかになった。

（３）ｐＭＭ０３１シリーズ低温誘導ベクターを用いたエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素（Ｆｄａｓｅ２）遺伝子のクローニング
アルテロモナス スピーシーズ（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＳＮ−１００９株由来のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素（ＯＲＦ−２、以下Ｆｄａｓｅ２と略す。また該酵素をコードする遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１０に示す）をコードする遺伝子を含むプラスミドｐＳＦＤＡ７を導入した大腸菌ＪＭ１０９株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＳＦＤＡ７、ＦＥＲＭ ＢＰ−６３４０）より常法に従ってプラスミドを調製した。得られたｐＳＦＤＡ７をＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で消化後、１％アガロースゲル電気泳動により分離し、Ｆｄａｓｅ２のＣ末端領域をコードする約４．８ｋｂのＤＮＡ断片を切り出して抽出精製した。このＤＮＡ断片をｐＭＭ０３１のＨｉｎｄＩＩＩ サイトにｃｓｐＡプロモーターとＦｄａｓｅ２遺伝子の向きが同じになるように挿入しｐＭＭ０３１−Ｆｄａｓｅ２Ｃを得た。次に、ｐＳＦＤＡ７をＳｎａＢＩ（宝酒造社製）で消化し、Ｆｄａｓｅ２の４番目のアミノ酸残基からＣ末端アミノ酸までをコードする領域を含む約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を先に得られたｐＭＭ０３１−Ｆｄａｓｅ２ＣのＳｍａＩ−ＳｎａＢＩ間に挿入することにより、ｐＭＭ０３１上にあるＣｓｐＡのＮ末端配列と同じ読取り枠にＦｄａｓｅ２の４番目のアミノ酸残基以降が接続された融合ポリペプチド発現ベクターの構築を試みた。しかしながら、得られた形質転換体２６個についてプラスミドを抽出精製して解析したところ、２１個のプラスミドに約２．５ｋｂのＳｎａＢＩ断片が挿入されており、そのうち２個のみで該断片が正しい向きに挿入されていた。更にこの２個のプラスミドについて結合部分の塩基配列を解析したところ、ＳｍａＩの切断箇所に起こった１塩基の欠失のためにＣｓｐＡとＦｄａｓｅ２の読取り枠がずれており、目的の融合ポリペプチドを発現可能なプラスミドではなかった。

上記構築方法では、挿入されるＤＮＡ断片が平滑末端であり正逆両方向に挿入されるため、更に別の方法で融合ポリペプチド発現ベクターの構築を試みた。すなわち、プラスミドｐＳＦＤＡ７をＳｎａＢＩ、ＸｂａＩ（ともに宝酒造社製）で消化して得られる、Ｆｄａｓｅ２の４番目のアミノ酸残基以降その約半分をコードする約１ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を先に得られたｐＭＭ０３１−Ｆｄａｓｅ２ＣのＳｍａＩ−ＸｂａＩ間に挿入することにより、上記の融合ポリペプチド発現プラスミドの構築を試みた。しかしながら、得られた形質転換体１２個についてプラスミドを抽出精製して解析したところ、上記の約１ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは３個のみで、更にこれらの塩基配列解析の結果、やはりＳｍａＩの切断箇所に１〜２塩基の欠失が起こっており、目的の融合ポリペプチドを発現しうるプラスミドは得られなかった。以上のことから、Ｆｄａｓｅ２のように発現産物が細胞の生育に大きな影響を与えるような遺伝子の場合、ｃｓｐＡプロモーターの機能が３７℃では十分に抑制されておらず、その下流にコードされた遺伝子産物が発現することが発現プラスミドを構築できない原因であることが明らかとなった。

実施例２． 低温誘導プラスミドベクターｐＭＭ０３７の構築及び誘導能の検討（１）プラスミドベクターｐＭＭ０３７の構築
ｃｓｐＡプロモーターの下流にｌａｃオペレーター領域を導入するために、プライマーＣＳＡ＋１ＲＬＡＣ（配列表の配列番号１１にプライマーＣＳＡ＋１ＲＬＡＣの塩基配列を示す）をデザインし、合成した。ＣＳＡ＋１ＲＬＡＣの５’末端をメガラベルキット（ＭＥＧＡＬＡＢＥＬ 、宝酒造社製）を用いてリン酸化した後、上記のプライマーＣＳＡ−６７ＦＮと共にプラスミドｐＪＪＧ０２を鋳型としたＰＣＲを行い、ｃｓｐＡ遺伝子のプロモーターの下流にｌａｃオペレーター領域を配したＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＮｃｏＩ（宝酒造社製）で消化した後、プラスミドｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）のＮｃｏＩ−ＳｍａＩサイト間に挿入してｐＭＭ０３４を構築した。該プラスミドをＮｃｏＩ及びＡｆｌＩＩＩで消化し、クレノウフラグメントを用いて末端を平滑化した後、セルフライゲーションを行ってｐＴＶ１１８Ｎ由来のｌａｃプロモーターを除いたプラスミドｐＭＭ０３５を得た。

次に、実施例１−（１）で得られたプラスミドベクターｐＭＭ０３１Ｆ１を鋳型として、プライマーＣＳＡ＋２０ＦＮ（配列表の配列番号１２にプライマーＣＳＡ＋２０ＦＮの塩基配列を示す）及びＭ１３プライマーＭ４（宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行い、該プラスミドベクター上のｃｓｐＡ遺伝子の転写開始点下流の１９塩基目からｐＭＭ０３１Ｆ１のマルチクローニングサイトまでを含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をプライマーＣＳＡ＋２０ＦＮ上に配したＮｈｅＩサイト、及びマルチクローニングサイト上のＸｂａＩサイトで切断した後、先に得られたｐＭＭ０３５のＮｈｅＩ−ＸｂａＩサイト間に、それぞれのサイトが再生する方向に挿入してプラスミドベクターｐＭＭ０３７を構築した。このｐＭＭ０３７は、ｃｓｐＡ遺伝子のプロモーター領域（６７塩基）、転写開始塩基（１塩基）、ｌａｃオペレーター由来５’非翻訳領域（３１塩基）、ｃｓｐＡ由来５’非翻訳領域（１４１塩基）、及びＣｓｐＡのＮ末端部分のコード領域（３８塩基）の下流にｐＴＶ１１８Ｎ由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩのマルチクローニングサイトをもつプラスミドである。プラスミドベクターｐＭＭ０３７上にコードされる５’−ＵＴＲ、すなわち転写開始点からＣｓｐＡ開始コドン直前の塩基までの塩基配列を配列表の配列番号２に示す。

（２）エンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素（Ｆｄａｓｅ２）をコードする遺伝子を用いた、低温誘導プラスミドベクターｐＭＭ０３７の誘導能の検討
実施例１−（３）と同様にして、プラスミドベクターｐＭＭ０３７を用いてＦｄａｓｅ２発現プラスミドを構築した。すなわち、実施例１−（３）で得たプラスミドｐＳＦＤＡ７をＳｎａＢＩで消化し、Ｆｄａｓｅ２の４番目のアミノ酸残基からＣ末端アミノ酸までをコードする領域を含む約２．５ｋｂのＳｎａＢＩ断片を単離した。このＤＮＡ断片を（１）で構築したプラスミドベクターｐＭＭ０３７のＢａｍＨＩサイトをクレノウフラグメントにより平滑末端化したところに挿入することにより、ｐＭＭ０３７上にあるＣｓｐＡのＮ末端配列と同じ読取り枠にＦｄａｓｅ２の４番目のアミノ酸残基以降が接続された融合ポリペプチド発現ベクターの構築を試みた。得られた形質転換体６個についてプラスミドを抽出精製して解析したところ、２個に約２．５ｋｂのＳｎａＢＩ断片が正しい向きに挿入されていた。そのうち１個の塩基配列を解析したところ、目的通りＣｓｐＡとＦｄａｓｅ２の読取り枠が一致した融合ポリペプチド発現ベクターであることが明らかとなった。こうして得られたプラスミドをプラスミドｐＭＦＤＡ１０２と命名した。

ｐＭＦＤＡ１０２及びｐＭＭ０３７を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。この時、プレート上に形成された両形質転換体のコロニーの大きさに差は見られなかった。得られた形質転換体をそれぞれ１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で好気的に一晩培養した。この培養液をそれぞれ２本ずつ新鮮な５ｍｌの同じ培地に１％ずつ植菌して３７℃で好気的に培養し、濁度がＯＤ６００＝０．６に達した時点で終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えた後、それぞれその一方の培養温度を１５℃とし更に４時間培養した。この培養中、誘導前の両形質転換体の生育速度はほぼ同じであった。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、細胞破砕用緩衝液〔２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．３Ｍ ＮａＣｌ〕１ｍｌに懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。これを遠心分離して上清を回収し、大腸菌抽出液とした。この大腸菌抽出液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、１５℃で培養したｐＭＦＤＡ１０２による形質転換体でのみ、分子量約９万のＣｓｐＡ−Ｆｄａｓｅ２融合ポリペプチドと考えられるバンドが観察された。以上のことから、ｌａｃオペレーターの導入により、Ｆｄａｓｅ２のようにその発現産物が細胞の生育に大きな影響を与えるような遺伝子についても発現プラスミドの構築が可能な低温誘導発現ベクターが構築されたことが示された。

次に、上記の大腸菌抽出液のエンド型フコース硫酸含有多糖分解活性を、ＷＯ９７／２６８９６号公報に記載の方法で調製したフコース硫酸含有多糖−Ｆを基質に用いた下記の操作により測定した。

１２μｌの２．５％のフコース硫酸含有多糖−Ｆ溶液、６μｌの１Ｍ ＣａＣｌ_２溶液、９μｌの４Ｍ ＮａＣｌ溶液、６０μｌの５０ｍＭの酢酸とイミダゾールとトリス−塩酸を含む緩衝液（ｐＨ７．５）、２１μｌの水、１２μｌの細胞破砕用緩衝液により適当に希釈した大腸菌抽出液とを混合し、３０℃、３時間反応させた。反応液を１００℃、１０分間処理した後、遠心分離によって得られた上清の１００μｌをゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣにより分析し、基質フコース硫酸含有多糖−Ｆの平均分子量と反応生成物の平均分子量を比較した。対照として、大腸菌抽出液を含まない細胞破砕用緩衝液を用いて同様の条件により反応させたもの及びフコース硫酸含有多糖−Ｆ溶液の代りに水を用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様にＨＰＬＣにより分析した。

１単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μｍｏｌのフコース硫酸含有多糖−Ｆのフコシル結合を切断する酵素量とする。切断されたフコシル結合の定量は下記式により求めた。
｛（１２×２．５）／（１００×ＭＦ）｝×｛（ＭＦ／Ｍ）−１｝×｛１／（１８０×０．０１）｝×１０００＝Ｕ／ｍｌ
（１２×２．５）／１００×ＭＦ：反応系中に添加したフコース硫酸含有多糖−Ｆ（ｍｇ）
ＭＦ：基質フコース硫酸含有多糖−Ｆの平均分子量
Ｍ：反応生成物の平均分子量
（ＭＦ／Ｍ）−１：１分子のフコース硫酸含有多糖−Ｆが酵素により切断された数
１８０：反応時間（分）
０．０１：酵素液量（ｍｌ）
なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０６（８ｍｍ×３００ｍｍ）（昭和電工社製）
溶離液：５ｍＭ ＮａＮ_３、２５ｍＭ ＣａＣｌ_２、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２５ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ８）
検出：示差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１、昭和電工社製）
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：２５℃

なお、反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−８２、昭和電工社製）を上記のＨＰＬＣ分析と同条件で分析し、プルランの分子量とＯＨｐａｋ ＳＢ−８０６の保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲線として用いた。その結果、１５℃で培養したｐＭＦＤＡ１０２による形質転換体の抽出液にのみ明らかなエンド型フコース硫酸含有多糖分解活性が検出され、該抽出液中のエンド型フコース硫酸含有多糖分解活性は４２．６ｍＵ／ｍｌであった。このことより、ｐＭＭ０３７が低温条件下で目的蛋白質を活性型として発現させることができることが示された。

実施例３． 低温誘導プラスミドベクターｐＭＭ０３７の改変及び誘導能の検討（１）プラスミドベクターｐＭＭ０３６の構築
ＳＤ配列の上流にＸｂａＩサイトが導入されているｃｓｐＡ遺伝子を含むプラスミドｐＪＪＧ２１［モレキュラー マイクロバイオロジー、第２３巻、第３５５〜３６４頁（１９９７）］を鋳型として、プライマーＣＳＡ＋２０ＦＮ及びＣＳＡ１３Ｒ２を用いたＰＣＲを行い、得られた増幅ＤＮＡ断片をＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）消化してｃｓｐＡ遺伝子のＳＤ配列から１３番目のアミノ酸残基をコードする領域を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を実施例２−（１）で得られたプラスミドベクターｐＭＭ０３７のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ間に挿入してプラスミドベクターｐＭＭ０３６を構築した。このｐＭＭ０３６は、配列表の配列番号２に示されたプラスミドｐＭＭ０３７上の５’−ＵＴＲをコードする塩基配列のうち、塩基番号３３〜１６１の配列が欠失しているほかはプラスミドｐＭＭ０３７と同じ構造である。

（２）プラスミドベクターｐＭＭ０３８の構築
ｐＭＭ０３７ではＣｓｐＡのＮ末端領域のコード領域（３８塩基）の下流にマルチクローニングサイトがあり、目的遺伝子はＣｓｐＡのＮ末端１２アミノ酸残基との融合ポリペプチドとして発現される。融合ポリペプチドの発現におけるＣｓｐＡのＮ末端アミノ酸残基の長さを検討するために、ＣｓｐＡの全コード領域（７０アミノ酸残基）の後ろにマルチクローニングサイトを配し、目的遺伝子がＣｓｐＡの７０アミノ酸残基と融合ポリペプチドの形で発現することのできるプラスミドベクターｐＭＭ０３８を構築した。すなわち、上記のプラスミドｐＪＪＧ０２を鋳型として、プライマーＣＳＡ＋２０ＦＮ及びＣＳＡ７０Ｒ（プライマーＣＳＡ７０Ｒの塩基配列を配列表の配列番号１３に示す）を用いてＰＣＲを行い、該プラスミド上のｃｓｐＡ遺伝子の転写開始点下流の１９塩基目からＣｓｐＡの７０番目のアミノ酸残基をコードする領域までを含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を各プライマー上に配したＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩサイトで切断した後、実施例２−（１）で得られたｐＭＭ０３７のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ間に挿入してプラスミドベクターｐＭＭ０３８を構築した。このｐＭＭ０３８は、ｐＭＭ０３７上のＣｓｐＡのＮ末端から１３アミノ酸残基までをコードする領域がＣｓｐＡの全アミノ酸配列（７０アミノ酸残基）をコードするものに置き換えられたプラスミドベクターである。

（３）プラスミドベクターｐＭＭ０４７の構築
プラスミドベクターｐＭＭ０３７上の５’−ＵＴＲをコードする領域に６塩基の変異を導入するために、プライマーＣＳＡ＋２７ＮＦ１（配列表の配列番号１４にプライマーＣＳＡ＋２７ＮＦ１の塩基配列を示す）を合成し、ｐＭＭ０３７の構築と同様な方法でｐＭＭ０４７を構築した。すなわち、実施例１−（１）で得られたプラスミドベクターｐＭＭ０３１Ｆ１を鋳型として、プライマーＣＳＡ＋２７ＮＦ１及びＭ１３プライマーＭ４を用いてＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＣＳＡ＋２７ＮＦ１上に配したＮｈｅＩサイト、及びマルチクローニングサイト上のＸｂａＩサイトで切断した後、実施例２−（１）で得られたｐＭＭ０３５のＮｈｅＩ−ＸｂａＩ間に、それぞれのサイトが再生する方向に挿入してプラスミドベクターｐＭＭ０４７を構築した。このｐＭＭ０４７は、ｐＭＭ０３７上の５’−ＵＴＲをコードする領域のうち、ｌａｃオペレーター由来の部分の下流に６箇所の塩基置換変異が導入されている。プラスミドベクターｐＭＭ０４７上にコードされる５’−ＵＴＲ、すなわち転写開始点からＣｓｐＡ開始コドン直前の塩基までの塩基配列を配列表の配列番号３に示す。

（４）プラスミドベクターｐＭＭ０４８の構築
プラスミドベクターｐＭＭ０４７の５’−ＵＴＲをコードする配列上に３０塩基の欠失変異を導入したプラスミドベクターｐＭＭ０４８を構築した。すなわち、ｐＭＭ０４７上に存在する天然のｃｓｐＡ遺伝子の転写開始点下流の＋５６から＋８５の領域に相当する部分が欠失するように、プライマーＤ３Ｆ及びＤ３Ｒ（プライマーＤ３Ｆ及びＤ３Ｒの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１５、１６に示す）デザインし、合成した。プラスミドｐＪＪＧ０２を鋳型として、プライマーＤ３ＲとＣＳＡ＋２７ＮＦ１の組合せ、及びプライマーＤ３ＦとＣＳＡ１３Ｒ２の組合せでそれぞれＰＣＲを行った。この反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、プライマーと分離された増幅ＤＮＡ断片をゲルより抽出、精製した。得られた各増幅ＤＮＡ断片をＰＣＲ反応緩衝液中で混合し、熱変性後、徐冷してヘテロ二本鎖を形成させた。この混合液にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を加え、７２℃で保温して二本鎖の合成を完結させた後、プライマーＣＳＡ＋２７ＮＦ１とＣＳＡ１３Ｒ２を加えて２度目のＰＣＲを行った。得られた増幅ＤＮＡ断片を各プライマー上に配したＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩサイトで切断した後、実施例２−（１）で得られたプラスミドベクターｐＭＭ０３７のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ間に挿入してプラスミドベクターｐＭＭ０４８を構築した。このｐＭＭ０４８は、ｐＭＭ０４７上の５’−ＵＴＲをコードする領域のうち、天然のｃｓｐＡ遺伝子由来５’−ＵＴＲの転写開始点から＋５６〜＋８５の領域に相当する部分が欠失したものである。プラスミドベクターｐＭＭ０４８上にコードされる５’−ＵＴＲ、すなわち転写開始点からＣｓｐＡ開始コドン直前の塩基までの塩基配列を配列表の配列番号４に示す。

（５）β−ガラクトシダーゼ遺伝子を用いた、改変型低温誘導ベクターの誘導能の検討
β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を含むプラスミドｐＫＭ００５［１９８３年、ニューヨーク アカデミック プレス発行、井上正順編集、エクスペリメンタル マニピュレーション オブ ジーン エクスプレッション、第１５〜３２頁］をＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ（共に宝酒造社製）で消化後、１％アガロースゲル電気泳動により分離し、ｌａｃＺ遺伝子を含む約６．２ｋｂのＤＮＡ断片を切出して抽出精製した。得られたＤＮＡ断片を上記のプラスミドベクターｐＭＭ０３６、ｐＭＭ０３８、ｐＭＭ０４７、ｐＭＭ０４８及び実施例２−（１）で得られたプラスミドベクターｐＭＭ０３７のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ間に挿入し、得られたプラスミドをそれぞれプラスミドｐＭＭ０３６ｌａｃ、ｐＭＭ０３８ｌａｃ、ｐＭＭ０４７ｌａｃ、ｐＭＭ０４８ｌａｃ及びｐＭＭ０３７ｌａｃと命名した。これらのプラスミドは、ｐＭＭ０３８ｌａｃを除いて、いずれもＣｓｐＡのＮ末端１２アミノ酸残基及びマルチクローニングサイト由来の１０アミノ酸残基がβ−ガラクトシダーゼの１０番目のアミノ酸残基のところでつながった融合β−ガラクトシダーゼをコードしている。また、ｐＭＭ０３８ｌａｃは、ＣｓｐＡ全長に当る７０アミノ酸残基及びマルチクローニングサイト由来の９アミノ酸残基がβ−ガラクトシダーゼの１０番目のアミノ酸残基のところでつながった融合β−ガラクトシダーゼをコードしている。

一方、同様にして実施例１−（１）で得られたｐＭＭ０３１Ｆ１を用いて融合β−ガラクトシダーゼ発現ベクターの構築を試みたが、得られた形質転換体のコロニーは非常に小さく、３７℃でも発現された遺伝子産物の影響が大きいと考えられたために以下の検討は行わなかった。また、ほかのプロモーターを持つ発現プラスミドとして、ｌａｃプロモーター−オペレーターを含有するプラスミドベクターｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）についても同様にしてＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ間にｌａｃＺ遺伝子を含む約６．２ｋｂのＤＮＡ断片を挿入したプラスミドｐＴＶ１１８Ｎｌａｃを構築し、誘導能の比較検討を行った。

上記の各プラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転換体をそれぞれ１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で好気的に一晩培養した。この培養液をそれぞれ新鮮な５ｍｌの同じ培地に１％ずつ植菌して３７℃で好気的に培養し、濁度がＯＤ６００＝０．６〜０．８に達した時点で一部サンプリングした後、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、培養温度を１５℃として更に培養した。これら誘導直前の３７℃培養液及び誘導後３時間後、１０時間後にサンプリングされた培養液を試料として１９７２年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｊ．Ｈ．ミラー（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ）著、エクスペリメンツ イン モレキュラー ジェネティクス、第３５２〜３５５頁に記載の方法でβ−ガラクトシダーゼ活性の測定を行った。

表１に示されるように、どのプラスミドを含有する形質転換体も、誘導前にはコントロールとして用いたｐＴＶ１１８Ｎｌａｃと同等、あるいはそれよりも低いβ−ガラクトシダーゼ活性しか発現しておらず、各プラスミドのｃｓｐＡプロモーターの作用が正確にコントロールされていることが示された。また誘導後はプラスミドｐＭＭ０３６ｌａｃを除くすべてのプラスミドを含有する形質転換体でｐＴＶ１１８Ｎｌａｃを含有するものの１０倍以上のβ−ガラクトシダーゼ活性を発現していた。

（６）３７℃での蛋白質発現能力の評価
実施例３−（５）で作製された形質転換体のうち、プラスミドｐＭＭ０３７ｌａｃで形質転換されたもの以外のものを使用して、各形質転換体の３７℃における蛋白質発現能力の評価を行った。培養にＭ９培地（１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．２％グルコース、０．２％カザミノ酸、０．０５ｍｇ／ｍｌトリプトファン、２μｇ／ｍｌチアミン、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するもの）を使用し、ＩＰＴＧ添加後も培養温度を３７℃に保ったほかは実施例３−（５）同様の操作で実験を行った。また、β−ガラクトシダーゼ活性は誘導直前、誘導２時間後の２点について測定した。得られた結果を表２に示す。

５’−ＵＴＲの大部分を欠失したプラスミドｐＭＭ０３６ｌａｃで形質転換された大腸菌の誘導２時間後のβ−ガラクトシダーゼ活性は、実施例３−（５）の結果とは逆にｐＭＭ０３８ｌａｃ、ｐＭＭ０４７ｌａｃを含有するものよりも高い。またｐＭＭ０４８ｌａｃとｐＴＶ１１８Ｎｌａｃでは、誘導後に発現される活性に差は見られない。このことは、ｐＭＭ０４８が低温条件下のみならず、３７℃における蛋白質発現にも有効であることを示している。

（７）１０℃及び２０℃での蛋白質発現能力の評価
実施例３−（５）で作製された形質転換体のうち、プラスミドｐＭＭ０３６ｌａｃで形質転換されたもの以外のものを使用して、各形質転換体の１０℃及び２０℃における蛋白質発現能力の評価を行った。実験はＩＰＴＧ添加後の培養温度を１０℃あるいは２０℃に保ったほかは実施例３−（５）同様の操作で行った。β−ガラクトシダーゼ活性は、１０℃の場合は誘導３時間後、及び誘導７時間後、誘導２１時間後の３点、２０℃の場合は誘導１時間後、誘導３時間後、及び誘導７時間後の３点について測定した。１０℃の結果を表３に、２０℃の結果を表４にそれぞれ示す。

表３に示されるように、１０℃のような低温条件下においても各プラスミドを含有するすべての形質転換体でｐＴＶ１１８Ｎｌａｃを含有するものよりはるかに高いβ−ガラクトシダーゼ活性の誘導発現が観察され、これらベクターの低温条件下での高発現性が確認された。中でもｐＭＭ０３８ｌａｃは発現量は他の構造物より発現量が高く、本発明のベクターに導入される目的遺伝子がＣｓｐＡの全コード領域との融合蛋白質として発現される場合、特に効果的であることを示している。一方、５’−ＵＴＲに３０塩基の欠失変異が導入されたｐＭＭ０４８ｌａｃでは、変異を持たないｐＭＭ０４７ｌａｃと比べて同等かあるいは若干高い発現量を示し、１０℃のような低温条件下における蛋白質発現にも有効であることを示している。また、表４に示されるように、 ２０℃の温度条件下ではｐＭＭ０４７ｌａｃの場合、他のプラスミドを含有する形質転換体より低いβ−ガラクトシダーゼ活性の誘導発現が観察された。

これらの実験結果と、実施例３−（５）及び（６）で示された１５℃及び３７℃におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の誘導量から、ｐＭＭ０４７は主に１５℃以下のような低温特異的な発現パターンを持つベクター、ｐＭＭ０４７の５’−ＵＴＲに３０塩基の欠失変異が導入されたｐＭＭ０４８は低温から常温（３７℃）までの広い温度範囲で効率的に目的蛋白質を発現することができるベクター、であることが示された。

実施例４． ｐＣｏｌｄ０１及びｐＣｏｌｄ０２シリーズプラスミドの構築および誘導能の検討
（１）ｐＣｏｌｄ０１シリーズプラスミドの構築
ｃｓｐＡ遺伝子を含むプラスミドｐＪＪＧ０２を鋳型として、合成ＤＮＡプライマーＣＳＡ−ｔｅｒ−ＦＨＸ及びＣＳＡ−ｔｅｒ−Ｒ（プライマーＣＳＡ−ｔｅｒ−ＦＨＸ及びＣＳＡ−ｔｅｒ−Ｒの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１７、１８に示す）を用いてＰＣＲを行い、ｃｓｐＡ遺伝子の転写ターミネーター領域を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を各プライマー上に配したＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉサイトで切断した後、実施例３−（２）で得られたｐＭＭ０３８のマルチクローニングサイトの最後にあるＨｉｎｄＩＩＩとその下流にあるＥｃｏＯ１０９Ｉサイト間に挿入してｐＭＭ０３９を構築した。次に、ｐＭＭ０３９のマルチクローニングサイト中にあるＫｐｎＩ−ＳａｌＩ間に、合成オリゴヌクレオチドＫＳ−ｌｉｎｋｅｒ１及びＫＳ−ｌｉｎｋｅｒ２（ＫＳ−ｌｉｎｋｅｒ１及びＫＳ−ｌｉｎｋｅｒ２の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１９、２０に示す）をアニーリングさせた合成ＤＮＡリンカーを挿入してｐＭＭ０４０を構築した。

一方、翻訳開始コドンの所にＮｃｏＩサイトを導入するために、プライマーＣＳＡ１ＮＣ−Ｆ及びＣＳＡ１ＮＣ−Ｒ（プライマーＣＳＡ１ＮＣ−Ｆ及びＣＳＡ１ＮＣ−Ｒの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号２１、２２に示す）を合成した。プラスミドｐＪＪＧ０２を鋳型としてプライマーＣＳＡ１ＮＣ−ＦとＣＳＡ７０Ｒの組合せで、プラスミドｐＭＭ０４７を鋳型としてプライマーＣＳＡ１ＮＣ−ＲとＣＳＡ＋２７ＮＦ１の組合せでそれぞれ１回目のＰＣＲ反応を行った。この反応液を３％アガロースゲル電気泳動に供し、プライマーと分離された増幅ＤＮＡ断片をゲルより抽出、精製した。得られた各増幅ＤＮＡ断片をＰＣＲ反応緩衝液中で混合し、熱変性後、徐冷してヘテロ二本鎖を形成させた。この混合液にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を加え、７２℃で保温して二本鎖の合成を完結させた後、プライマーＣＳＡ＋２７ＮＦ１とＣＳＡ１３Ｒの組合せで２回目のＰＣＲを行なった。得られた増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ベクター（ノバジェン社製）にサブクローニングして塩基配列を確認した後、各プライマー上に配したＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩサイトで切断して遊離するＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＭＭ０４０のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ間に挿入してプラスミドベクターｐＣｏｌｄ０１ＮＣ１を構築した。

さらに、プライマーＣＳＡ１３Ｒの代りにプライマーＣＳＡ１３Ｒ２あるいはＣＳＡ１３Ｒ３（配列表の配列番号２３にプライマーＣＳＡ１３Ｒ３の塩基配列を示す）を用いて２回目のＰＣＲ反応を行うことにより、ｐＣｏｌｄ０１ＮＣ１に挿入されたＣｓｐＡのＮ末端部分をコードする領域の３’末端を１塩基欠失させたプラスミドベクターｐＣｏｌｄ０１ＮＣ２および１塩基付加させたプラスミドベクターｐＣｏｌｄ０１ＮＣ３をそれぞれ同様にして構築した。

これら３種類のプラスミドは、各プラスミド上のｃｓｐＡ遺伝子の開始コドンのところにＮｃｏＩサイトがあり、そこから始まる読取り枠がマルチクローニングサイト上でそれぞれ異なるシリーズベクターである。また、これらプラスミドは、マルチクローニングサイトの下流には、３つの読み取り枠いずれにも終止コドンが出現する配列を持ち、さらに下流にはｃｓｐＡ遺伝子由来の転写ターミネーター領域を含む。なお、ｐＣｏｌｄ０１ＮＣ２では、この１塩基の欠失により、該プラスミドにコードされるＣｓｐＡのＮ末端から１３番目のアミノ酸残基はアスパラギンからリジンに置換される。

次に、ＣＳＡ１ＮＣ−ＦとＣＳＡ１ＮＣ−Ｒの代りにプライマーＣＳＡ１ＮＤ−Ｆ及びＣＳＡ１ＮＤ−Ｒ（プライマーＣＳＡ１ＮＤ−Ｆ及びＣＳＡ１ＮＤ−Ｒの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号２４、２５に示す）を用いて１回目のＰＣＲ反応をそれぞれ行うことにより、ｐＣｏｌｄ０１ＮＣシリーズプラスミドの翻訳開始コドンの所にあるＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに置き換えたｐＣｏｌｄ０１ＮＤシリーズプラスミド、ｐＣｏｌｄ０１ＮＤ１、ＮＤ２、及びＮＤ３を全く同様な方法で構築した。

このように構築された６種類のｐＣｏｌｄ０１シリーズプラスミドは、ｐＭＭ０４７を基本骨格とした発現システムを持ち、開始コドンのところに配した制限酵素サイト及びマルチクローニングサイト以降の配列以外はｐＭＭ０４７と同じである。

（２）ｐＣｏｌｄ０２シリーズベクターの構築
実施例４−（１）と同様の方法で、６種類のｐＣｏｌｄ０２シリーズプラスミドを構築した。すなわち、プライマーＣＳＡ１ＮＣ−ＲとＣＳＡ＋２７ＮＦ１の組合せあるいはプライマーＣＳＡ１ＮＤ−ＲとＣＳＡ＋２７ＮＦ１の組合せによる１回目のＰＣＲ反応において、プラスミドｐＭＭ０４７の代わりにプラスミドｐＭＭ０４８を鋳型として用いることにより、実施例４−（１）と全く同じ工程でｐＣｏｌｄ０２シリーズプラスミド、ｐＣｏｌｄ０２ＮＣ１、ＮＣ２、ＮＣ３、ＮＤ１、ＮＤ２、及びＮＤ３を構築した。

このように構築された６種類のｐＣｏｌｄ０２シリーズプラスミドは、ｐＭＭ０４８を基本骨格とした発現システムを持ち、開始コドンのところに配した制限酵素サイト及びマルチクローニングサイト以降の配列以外はｐＭＭ０４８と同じである。また、これらは、ｐＭＭ０４８に特徴的である天然のｃｓｐＡ遺伝子由来５’−ＵＴＲの転写開始点から＋５６〜＋８５の領域に相当する部分の欠失以外は、ｐＣｏｌｄ０１シリーズの相当するプラスミドとそれぞれ同じである。

（３）β−ガラクトシダーゼ遺伝子を用いた、ｐＣｏｌｄ０１及びｐＣｏｌｄ０２の誘導能の検討
実施例３−（５）と同様の方法により、ｐＣｏｌｄ０１及びｐＣｏｌｄ０２の誘導能をβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を用いて検討した。まず、ｐＣｏｌｄ０１ＮＣ２、ｐＣｏｌｄ０１ＮＤ２、ｐＣｏｌｄ０２ＮＣ２、及びｐＣｏｌｄ０２ＮＤ２のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ間にｌａｃＺ遺伝子を含む約６．２ｋｂのＤＮＡ断片を挿入し、得られたプラスミドをそれぞれプラスミドｐＣｏｌｄ０１ＮＣ２ｌａｃ、ｐＣｏｌｄ０１ＮＤ２ｌａｃ、ｐＣｏｌｄ０２ＮＣ２ｌａｃ、及びｐＣｏｌｄ０２ＮＤ２ｌａｃと命名した。これらのプラスミドは、いずれもＣｓｐＡのＮ末端１２アミノ酸残基及びマルチクローニングサイト由来の１０アミノ酸残基がβ−ガラクトシダーゼの１０番目のアミノ酸残基のところでつながった融合β−ガラクトシダーゼをコードしている。

上記の各プラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転換体について、実施例３−（５）同様の操作で１５℃における発現誘導実験を行った。β−ガラクトシダーゼ活性は誘導直前、誘導３時間後、及び誘導１０時間後の３点について測定した。ｐＣｏｌｄ０１ＮＣ２ｌａｃ、及びｐＣｏｌｄ０２ＮＣ２ｌａｃについての結果を表５に示す。なお、ＮＤシリーズベクターを用いた場合は、それに相当するＮＣシリーズベクターを用いた場合とほぼ同等の誘導能を示した。

表５に示されるように、各プラスミドを含有する形質転換体は、３７℃における誘導前では低いβ−ガラクトシダーゼ活性しか発現しておらず、各プラスミドのｃｓｐＡプロモーターの作用が正確にコントロールされていることが示された。また誘導後は実施例３−（５）で示されたｐＭＭ０４７ｌａｃ及びｐＭＭ０４８ｌａｃとそれぞれほぼ同様のβ−ガラクトシダーゼ活性の増加が見られる。従って、ｐＣｏｌｄプラスミドは、導入遺伝子の発現のために設計されたマルチクローニングサイトおよび転写ターミネーターを持つと共に、３７℃における発現がコントロールされ、低温条件下で高効率に導入遺伝子産物を発現させることができるシリーズプラスミドである。

実施例５ ｌａｃＩ遺伝子を導入したｐＣｏｌｄシリーズプラスミドの構築および宿主の検討
（１）ｐＣｏｌｄ０３シリーズ及びｐＣｏｌｄ０４シリーズプラスミドの構築
実施例４−（１）及び（２）で作製されたｐＣｏｌｄ０１シリーズ及びｐＣｏｌｄ０２シリーズプラスミドは、そのプラスミドベクター上にリプレッサー遺伝子を持たないため宿主としてｌａｃリプレッサー高発現の大腸菌株を使う必要があった。そこでｐＣｏｌｄ０１、０２をもとにして、これにｌａｃＩ遺伝子が導入されたプラスミドベクターｐＣｏｌｄ０３、０４、ならびにｌａｃＩ^ｑ遺伝子が導入されたプラスミドベクターｐＣｏｌｄ０５、０６をそれぞれ構築した。

まず実施例４−（１）で得られたｐＭＭ０４０をＥｃｏＴ２２Ｉで消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端を平滑化した。これにｐＥＴ２１ｂ（ノバジェン社製）をＳｐｈＩ、ＰｓｈＡＩ（共に宝酒造社製）で消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端を平滑化して得られたｌａｃＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入し、そのうちｌａｃＩ遺伝子の向きがｃｓｐＡプロモーターと逆方向に挿入されたプラスミドを構築し、ｐＭＭ０４０Ｉと命名した。同様に、プラスミドｐＭＪＲ１５６０［ジーン、第５１巻、第２２５〜２６７頁（１９８７）］をＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ（共に宝酒造社製）で消化して得られるｌａｃＩ^ｑ遺伝子を含むＤＮＡ断片の末端を平滑化し、これをｐＭＭ０４０の平滑化されたＥｃｏＴ２２Ｉサイトに導入した。ｌａｃＩ^ｑ遺伝子の向きがｃｓｐＡプロモーターと逆方向に挿入されたプラスミドを選んで、これをｐＭＭ０４０Ｉ^ｑと命名した。

実施例４−（１）及び（２）に記載されたｐＣｏｌｄ０１及び０２の構築の際と同様に、ｐＭＭ０４０Ｉ、ｐＭＭ０４０Ｉ^ｑのＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ間に各シリーズベクター用のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを挿入してすることにより、ｐＣｏｌｄ０３、ｐＣｏｌｄ０４、ｐＣｏｌｄ０５、ｐＣｏｌｄ０６各シリーズのプラスミドベクター、それぞれ６種類を構築した。このように構築されたｐＣｏｌｄ０３及びｐＣｏｌｄ０４シリーズプラスミドは、ｌａｃＩ遺伝子を持つ以外はそれぞれｐＣｏｌｄ０１シリーズ及びｐＣｏｌｄ０２シリーズプラスミドと同じ構造をしている。また、ｐＣｏｌｄ０５及びｐＣｏｌｄ０６シリーズプラスミドは、ｐＣｏｌｄ０３及びｐＣｏｌｄ０４シリーズプラスミドのｌａｃＩ遺伝子がそれぞれｌａｃＩ^ｑ遺伝子に置換されたものである。

（２）β−ガラクトシダーゼ遺伝子を用いたｌａｃリプレッサーの効果の検討
実施例３−（５）と同様に、プラスミドｐＫＭ００５をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化後、ｌａｃＺ遺伝子を含むＤＮＡ断片を抽出精製した。得られたＤＮＡ断片を、上記のプラスミドベクターｐＣｏｌｄ０３、０４、０５、０６シリーズのうちフレームの合うＮＣ２のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ間に挿入し、得られたプラスミドをそれぞれｐＣｏｌｄ０３ＮＣ２ｌａｃ、ｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ｌａｃ、ｐＣｏｌｄ０５ＮＣ２ｌａｃ、ｐＣｏｌｄ０６ＮＣ２ｌａｃと命名した。

実施例４−（３）で構築したｐＣｏｌｄ０１ＮＣ２ｌａｃ、ｐＣｏｌｄ０２ＮＣ２ｌａｃ及び上記プラスミドｐＣｏｌｄ０３ＮＣ２ｌａｃ、ｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ｌａｃ、ｐＣｏｌｄ０５ＮＣ２ｌａｃ、ｐＣｏｌｄ０６ＮＣ２ｌａｃの計６種類を用いて、ｌａｃリプレッサー遺伝子を保持していない大腸菌ＤＨ５α株（宝酒造社製）の形質転換を試みた。また、同時にｌａｃＺ遺伝子を持たないプラスミドベクターｐＣｏｌｄ０１ＮＣ２についてもコントロールとして形質転換を試みた。常法にしたがって、大腸菌ＤＨ５α株をコンピテントセル法で形質転換を行ったところｐＣｏｌｄ０２ＮＣ２ｌａｃ以外のプラスミドの場合はすべてコントロールと同等の形質転換効率で形質転換体が得られたが、ｐＣｏｌｄ０２ＮＣ２ｌａｃの場合は形質転換体が全く得られなかった。また、ｐＣｏｌｄ０１ＮＣ２ｌａｃの場合、得られた形質転換体のコロニーは他の形質転換体のものよりも小さかった。

次に、各プラスミドの目的蛋白質の発現制御の能力及び低温における目的蛋白質の発現能力を調べた。すなわち、得られた形質転換体をそれぞれ１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で好気的に一晩培養した。この培養液をそれぞれ新鮮な５ｍｌの同じ培地に２％づつ植菌して３７℃で好気的に培養し、濁度がＯＤ６００＝０．６前後に達した時点で一部サンプリングした後、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、培養温度を１５℃として更に培養した。これら誘導直前の３７℃培養液及び誘導後３時間後、７時間後、２４時間後にサンプリングされた培養液を試料として、実施例３−（５）と同様にしてβ−ガラクトシダーゼ活性の測定を行った。

表６に示されるように、ｌａｃＩ遺伝子を持たないｐＣｏｌｄ０１ＮＣ２ｌａｃを有する形質転換体は３７℃の非誘導状態においても高いβ−ガラクトシダーゼ活性を示し、ｌａｃＩ遺伝子あるいはｌａｃＩ^ｑ遺伝子を含むその他のプラスミドによる形質転換体では、低いβ−ガラクトシダーゼ活性を示した。このことは、プラスミド上にｌａｃＩやｌａｃＩ^ｑ遺伝子を有するｐＣｏｌｄ０３からｐＣｏｌｄ０６までのシリーズのプラスミドは、３７℃の培養条件において発現の抑制が実質上有効に行われていることを示している。さらに、このことは３７℃においてｃｓｐＡ遺伝子の５’−ＵＴＲをコードする領域の機能だけでは発現調節が不完全であり、これらプラスミド上に配したオペレーター配列が正常に機能することによって実質的な発現調節が初めて可能であることを示している。また、ｌａｃＩ^ｑ遺伝子を有するｐＣｏｌｄ０５ＮＣ２ｌａｃ、ｐＣｏｌｄ０６ＮＣ２ｌａｃの形質転換体のβ−ガラクトシダーゼ活性は、ｌａｃＩ遺伝子を有するｐＣｏｌｄ０３ＮＣ２ｌａｃ、ｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ｌａｃの形質転換体よりも低くなり、ｌａｃＩ^ｑ遺伝子の方が効果的に発現を制御できることが明らかとなった。

一方、低温への温度シフトと誘導剤の添加による発現誘導後は、ｌａｃＩ遺伝子あるいはｌａｃＩ^ｑ遺伝子を含むプラスミドによる形質転換体のいずれの場合も経時的なβ−ガラクトシダーゼ活性の上昇が見られた。これらの誘導レベルは、表５に示したｌａｃリプレッサー高発現大腸菌株をｐＣｏｌｄ０１ＮＣ２ｌａｃあるいはｐＣｏｌｄ０２ＮＣ２ｌａｃで形質転換した形質転換体の誘導パターンと良く一致しており、ｌａｃＩ遺伝子をベクター上に配置しても目的蛋白質の発現誘導能に影響を与えないことを示している。このことは、オペレーターとしてｌａｃオペレーターを用いた本発明のベクターの場合、ベクター上にｌａｃＩ遺伝子あるいはｌａｃＩ^ｑ遺伝子を導入することにより、ｌａｃＩ遺伝子に関する宿主の制限が無くなることを示している。

実施例６． 相補性の高いダウンストリームボックス配列と精製用のタグを持つ低温誘導ベクターｐＣｏｌｄ０７及びｐＣｏｌｄ０８シリーズプラスミドの構築および誘導能の検討
（１）プラスミドｐＣｏｌｄ０７ＮＣ２、ｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２の構築
ｐＣｏｌｄ０３シリーズあるいはｐＣｏｌｄ０４シリーズプラスミドでは、ＣｓｐＡのＮ末端コード領域の下流にマルチクローニングサイトがあり、目的蛋白質はＣｓｐＡのＮ末端１２あるいは１３アミノ酸残基との融合蛋白質として発現される。このＣｓｐＡのＮ末端コード領域中にはダウンストリームボックス配列が存在するが、大腸菌のアンチダウンストリームボックス配列を１６ＳリボソーマルＲＮＡ中の１４６７−１４８１の１５塩基と考えた場合、この配列は該１５塩基中１０塩基が結合する程度の相補性を示す。ＣｓｐＡのＮ末端をコードする塩基配列を上記の１５塩基の配列と完全に相補的な、配列表の配列番号２８に示される塩基配列に置換し、さらにその下流に精製用のタグ配列として６残基のヒスチジン残基をコードする配列、及びこれらの塩基配列にコードされるリーダーペプチドを切除するための、プロテアーゼファクターＸａの認識アミノ酸配列をコードする塩基配列を導入したプラスミドｐＣｏｌｄ０７ＮＣ２、ｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２を構築した。

まず、プラスミドｐＣｏｌｄ０３ＮＣ２をＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＣｏｌｄ０３ＮＣ２上のｃｓｐＡ遺伝子のＮ末端配列をコードする領域を除きベクター断片を調製した。次に、合成オリゴヌクレオチドＤＢ−３及びＤＢ−４（ＤＢ−３及びＤＢ−４の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号２６、２７に示す）を合成し、アニーリングさせた後、先に調製したｐＣｏｌｄ０３ＮＣ２のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ間に挿入して、プラスミドｐＣｏｌｄ０７ＮＣ２を構築した。また、全く同じ工程により、プラスミドｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２上のｃｓｐＡ遺伝子のＮ末端配列をコードする領域を該合成ＤＮＡリンカーで置き換えたプラスミドｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２を構築した。

（２）β−ガラクトシダーゼ遺伝子を用いた、改変型低温誘導ベクターの誘導能の検討
実施例４−（３）で構築したプラスミドベクターｐＣｏｌｄ０１ＮＣ２ｌａｃをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ消化後、ｌａｃＺ遺伝子を含む約６．２ｋｂのＤＮＡ断片を抽出精製した。得られたＤＮＡ断片を上記のプラスミドｐＣｏｌｄ０７ＮＣ２及びｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ間にそれぞれ挿入し、得られたプラスミドをｐＣｏｌｄ０７ＮＣ２ｌａｃ及びｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２ｌａｃとそれぞれ命名した。これらのプラスミドは、いずれもＮ末端に１６ＳリボソーマルＲＮＡ中のアンチダウンストリームボックス配列と完全に相補的なダウンストリームボックス配列にコードされる５アミノ酸残基、精製用のタグ配列として６残基のヒスチジン残基、ファクターＸａ認識アミノ酸配列である４アミノ酸残基、及びマルチクローニングサイト由来の１０アミノ酸残基の合計２５残基からなるＮ末端リーダーペプチドがβ−ガラクトシダーゼの１０番目のアミノ酸残基のところでつながった融合β−ガラクトシダーゼをコードしている。一方、ほかのプロモーターを持つ発現プラスミドとして、ｐＥＴ−システムプラスミドのｐＥＴ２１ｂ（ノバジェン社製）についても同様にしてＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ間にｌａｃＺ遺伝子を含む約６．２ｋｂのＤＮＡ断片を挿入したプラスミドｐＥＴ２１ｂｌａｃを構築し、誘導能の比較検討を行った。

上記の各プラスミド、実施例４で構築したｐＣｏｌｄ０１ＮＣ２ｌａｃ、及びｐＣｏｌｄ０２ＮＣ２ｌａｃを用いて大腸菌ＪＭ１０９［ｐＥＴ２１ｂｌａｃの場合は大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）、プロメガ社製］を形質転換し、得られた形質転換体について、実施例３−（５）と同様の操作で１５℃における発現誘導実験を行った。β−ガラクトシダーゼ活性は誘導直前、誘導３時間後、及び誘導１０時間後の３点について測定した。

表７に示されるように、ｐＣｏｌｄ０７ＮＣ２ｌａｃ、ｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２ｌａｃを含有する形質転換体は、３７℃における誘導前では低いβ−ガラクトシダーゼ活性しか発現しておらず、各プラスミドのｃｓｐＡプロモーターの作用が正確にコントロールされていることが示された。また誘導後７時間においてプラスミドｐＣｏｌｄ０７ＮＣ２ｌａｃを含有する形質転換体ではｐＣｏｌｄ０３ＮＣ２ｌａｃを含有するものの５倍以上のβ−ガラクトシダーゼ活性を、プラスミドｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２ｌａｃを含有する形質転換体ではｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ｌａｃを含有するものの４倍以上のβ−ガラクトシダーゼ活性を発現していた。また、既存の発現ベクターのなかで有力な発現ベクターであるｐＥＴシステムと比較して、ｐＣｏｌｄ０７シリーズ及びｐＣｏｌｄ０８シリーズプラスミドは特に低温誘導後短時間で高い発現能を有することが明らかとなった。

発明の効果
本発明により、常温での発現が制御可能であり、かつ低温条件において高い発現効率を示す発現ベクターが提供される。該ベクターを用いることにより、宿主に対して有害な作用を示すような蛋白質をコードする遺伝子を含有させた形質転換体を得ることができる。また該ベクターを利用して低温条件下で蛋白質発現を行うことにより、インクルージョンボディの形成を抑え、活性を保持した蛋白質を効率よく得ることが可能となる。

配列番号７はプライマーＣＳＡ−６７ＦＮの塩基配列を示す。
配列番号８はプライマーＣＳＡ１３Ｒの塩基配列を示す。
配列番号９はプライマーＣＳＡ１３Ｒ２の塩基配列を示す。
配列番号１１はプライマーＣＳＡ＋１ＲＬＡＣの塩基配列を示す。
配列番号１２はプライマーＣＳＡ＋２０ＦＮの塩基配列を示す。
配列番号１３はプライマーＣＳＡ７０Ｒの塩基配列を示す。
配列番号１４はプライマーＣＳＡ＋２７ＮＦ１の塩基配列を示す。
配列番号１５はプライマーＤ３Ｆの塩基配列を示す。
配列番号１６はプライマーＤ３Ｒの塩基配列を示す。
配列番号１７はプライマーＣＳＡ−ｔｅｒ−ＦＨＸの塩基配列を示す。
配列番号１８はプライマーＣＳＡ−ｔｅｒ−Ｒの塩基配列を示す。
配列番号１９は合成オリゴヌクレオチドＫＳ−ｌｉｎｋｅｒ１の塩基配列を示す。
配列番号２０は合成オリゴヌクレオチドＫＳ−ｌｉｎｋｅｒ２の塩基配列を示す。
配列番号２１はプライマーＣＳＡ１ＮＣ−Ｆの塩基配列を示す。
配列番号２２はプライマーＣＳＡ１ＮＣ−Ｒの塩基配列を示す。
配列番号２３はプライマーＣＳＡ１３Ｒ３の塩基配列を示す。
配列番号２４はプライマーＣＳＡ１ＮＤ−Ｆの塩基配列を示す。
配列番号２５はプライマーＣＳＡ１ＮＤ−Ｒの塩基配列を示す。
配列番号２６は合成オリゴヌクレオチドＤＢ−３の塩基配列を示す。
配列番号２７は合成オリゴヌクレオチドＤＢ−４の塩基配列を示す。

Claims (4)

1. 配列表の配列番号２〜４のいずれかに示される塩基配列のｍＲＮＡに対応するＤＮＡ配列であるＤＮＡ。
2. プロモーターと発現させようとする目的蛋白質をコードする遺伝子の開始コドンとの間に請求項１に記載のＤＮＡを配置することを特徴とする、低温での目的蛋白質の発現方法。
3. プロモーターと発現させようとする目的蛋白質をコードする遺伝子の開始コドンとの間に請求項１に記載のＤＮＡを配置させたプラスミドを作製し、該プラスミドで宿主を形質転換して得られた形質転換体を使用することを特徴とする、請求項２記載の目的蛋白質の発現方法。
4. 大腸菌を宿主として実施される請求項３記載の目的蛋白質の発現方法。