CN100379870C

CN100379870C - 冷诱导的表达载体

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Publication number: CN100379870C
Application number: CNB200380109675XA
Authority: CN
Inventors: 友野润; H·上野; 岸本真幸; 佐川裕章; 加藤郁之进
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2002-12-11
Filing date: 2003-12-11
Publication date: 2008-04-09
Anticipated expiration: 2023-12-11
Also published as: EP1582587A4; EP1582587B1; DE60323678D1; AU2003289023A1; CA2508808A1; EP1582587A1; AU2003289023B2; TWI316091B; TW200510534A; KR20050085190A; CN1748027A; JPWO2004053126A1; ATE408692T1; WO2004053126A1; US20060148033A1; US7244588B2

Abstract

具有编码冷休克蛋白基因mRNA-起源的5′-非翻译区的区域的载体，其特征在于，该5′-非翻译区具有一个转移到其中的突变，从而改变由该区域所形成的茎结构之间的距离。

Description

冷诱导的表达载体

技术领域

本发明涉及用于遗传工程的载体和用所述载体表达蛋白的方法。

背景技术

利用遗传工程来生产有用蛋白的技术如今已被广泛应用。其中，以大肠杆菌(Escherichia coli)为宿主的表达系统是最常用的表达系统。利用重组体已经生产了许多种蛋白。所谓的表达载体通常是为利用重组体生产有用蛋白而构建和使用的。在表达载体中，目的基因被置于由RNA聚合酶识别的启动子控制之下。用于以大肠杆菌为宿主的表达载体的示例性启动子是lac、trp、tac、gal和ara启动子。利用除直接由大肠杆菌RNA聚合酶识别的启动子之外的启动子的表达载体包括pET-系统(Novagen)。该pET-系统利用由来自感染大肠杆菌的T7噬菌体的RNA聚合酶识别的启动子(参见J.Mol.Biol.，189：113-130(1986)；Gene，56：125-135(1987))。对于pET-系统而言，T7 RNA聚合酶在大肠杆菌中表达，在表达载体中位于T7启动子下游的目的基因由T7 RNA聚合酶转录，且目的蛋白是利用宿主的翻译系统合成的。

然而，如果目的蛋白是利用包括pET-系统在内的诸多大肠杆菌表达系统之一进行高水平表达的，那么该目的蛋白在许多情况下可能会形成称作包函体的不溶性复合物。结果，大大减少了活性形式目的蛋白的量。对若干种多肽已经报导了通过包函体的溶解和重折叠来获得活性多肽。回收率在许多情况中常常是低的。此外，对于各种目的蛋白还需要研究适宜的重折叠条件。因此，现已需要一种直接在大肠杆菌中表达活性蛋白的系统。

有人认为，包函体是作为下述的结果形成的。翻译得到的多肽链中间体在折叠成其正确构象前由于分子间相互作用而与另一多肽链相互缠绕，从而形成一个巨大的不溶性复合物。在这种情况下，已知在低于常规37℃的温度下(20至30℃)培养重组大肠杆菌细胞可以提高活性形式蛋白的表达水平。猜测这是由于核糖体的缓慢翻译为中间体折叠成其正确结构提供了充足的时间，而且低温条件下细胞内蛋白水解酶的缓慢作用提高了所表达的活性蛋白的稳定性。因此，人们已经开始关注对于生产会形成包函体的蛋白来说有用的在低温条件下培养重组大肠杆菌细胞的方法。

如果在对数生长期将大肠杆菌细胞的培养温度从37℃下调至10～20℃，则大肠杆菌细胞的生长暂时停滞，期间诱导出一组称作冷休克蛋白的蛋白表达。根据诱导水平将这些蛋白分作两组：组I(10倍或更多)和组II(低于10倍)。组I中的蛋白包括CspA、CspB、CspG 和 CsdA(参见J.Bacteriol.，178：4919-4925(1996)；J.Bacteriol.，178：2994-2997(1996))。由于将温度从37℃调至10℃后1.5小时CspA(WO90/09447)的表达水平达到总细胞蛋白的13％(参见Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：283-287(1990))，所以已经尝试利用cspA基因的启动子来在低温下生产重组蛋白。

对于利用cspA基因在低温条件下表达重组蛋白的系统来说，除上述由该基因启动子在低温下的高度有效的转录起始之外，还显示出以下效果。

(1)如果从cspA基因转录且能够被翻译的mRNA不编码功能性的CspA蛋白(尤其是，如果它只编码CspA蛋白一部分N-末端序列)，则这样的mRNA会长时间抑制其它包括冷休克蛋白在内的大肠杆菌蛋白的表达。在此期间，该mRNA被优选翻译(J.Bacteriol.，178：4919-4925(1996)；WO98/27220)。这一现象称作LACE(截短的cspA表达的低温依赖性抗生素效应)效应。

(2)一段称作下游盒的由15个核苷酸组成的序列位于cspA基因起始密码子下游12个核苷酸处。由于该序列使得低温条件下的翻译效率变高。

(3)由159个核苷酸组成的5′-非翻译区位于cspA基因mRNA的转录起始位点和起始密码子之间。该区域对CspA在37℃的表达有负效应，而对其在低温条件下的表达有正效应。

尤其，在上述(1)中描述的现象暗示了利用cspA基因仅特异表达一种目的蛋白的可行性。因此，预期该系统可用于生产高纯度的重组蛋白或制备用于结构分析的同位素标记的蛋白。

已知培养含有表达载体的大肠杆菌细胞达到可以使细胞被诱导的水平比较困难，或者如果对基因启动子的表达控制是不完全的、而且基因产物对宿主有害，则甚至表达载体的构建也不太可能(参见，例如，美国专利号5654169)。

为了解决上述问题、进一步提高基因表达效率、以及容易地获得表达产物，已经尝试利用cspA基因的5′-非翻译区来修饰表达载体(WO 99/27117)。本文公开了通过导入操纵基因来严格控制表达或者通过向5′-非翻译区中导入突变以提高基因表达水平的修饰。

发明内容

如上所述，低温条件下的蛋白表达系统被认为是一种非常有效的系统，并且希望进一步提高表达效率等。

本发明的主要目的是构建一种在低温条件下更加优越的基因表达系统，例如，通过利用csp基因提高表达载体的基因表达效率。

为达到此目的，本发明人已经评估了向源自cxp基因的5′-非翻译区核苷酸序列中引入修饰的效果。结果是，本发明人已发现调整在mRNA 5′-非翻译区对应部分中形成的茎间的距离会提高下游序列所编码蛋白的表达水平。而且，本发明人已经构建了一个含有编码这样的修饰后5′-非翻译区的DNA的表达载体。因而，本发明已经完成。

本发明概述如下。本发明第一方面涉及具有编码源自冷休克蛋白基因mRNA的5′-非翻译区部分的载体，其中向5′-非翻译区中导入了突变，由此改变了在所述区域中形成的茎结构间的距离。

根据该第一方面，导入5′-非翻译区中的突变其例子有核苷酸的插入或缺失。在对应于SEQ ID NO：1中核苷酸593至核苷酸598的大肠杆菌cspA基因的一个区域中导入了突变的载体是一个特别优选实施方案的例子。

根据该第一方面的载体，编码5′-非翻译区的部分还可以带有一个操纵基因。具有SEQ ID NO：2、3或4的核苷酸序列的5′-非翻译区是一个特别优选的载体中的5′-非翻译区例子。

第一方面的载体可以具有一个位于5′-非翻译区编码部分上游的启动子。而且，它可以具有一段与所使用宿主的核糖体RNA中的反义-下游盒(anti-downstream box)序列互补的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列位于5′-非翻译区编码部分的下游。

例如，第一方面的载体可以是质粒载体。

本发明的第二方面涉及表达目的蛋白的方法，该方法包括：

(1)用已经整合有编码目的蛋白的基因的第一方面载体转化宿主以获得转化体；

(2)培养所述转化体；和

(3)将培养温度下调至低于常规温度以表达目的蛋白。

根据第二方面，在步骤(3)中或之后可以诱导启动子。

实施本发明的最佳方式

下文中将详细描述本发明。

如本文所使用的，“区域”指核酸区域(DNA或RNA)。如本文所使用的，“mRNA的5′-非翻译区”指不编码蛋白的区域，并位于由于转录DNA所合成的mRNA的5′侧。下文中，该区域还可以称为“5′-UTR(5′-非翻译区)”。除非另外指明，5′-UTR指大肠杆菌cspA基因mRNA的5′-非翻译区或其修饰。

如本文所使用的，“冷休克蛋白基因”指编码在将生物的生长温度从其生理温度下调后诱导发生表达蛋白的基因。

根据本发明所使用的编码冷休克蛋白mRNA 5′-UTR的部分是编码该基因mRNA中起始密码子5′侧区域的部分。这样的部分特有地发现在大肠杆菌冷休克蛋白基因(cspA、cspB、cspG、csdA等)中(J.Bacteriol.，178：4919-4925(1996)；J.Bacteriol.，178：2994-2997(1996))。在从这样一个基因所转录的mRNA中自5′末端的100个核苷酸或更多个核苷酸的部分不翻译成蛋白。这一部分对基因表达的冷应答是重要的。如果将这一5′-非翻译区加到任意蛋白mRNA的5′末端，则在低温条件下mRNA会翻译成蛋白。

根据本发明所使用的“mRNA 5′-非翻译区”不限于源自上述特定基因的mRNA 5′-非翻译区。根据本发明可应用源自冷休克蛋白基因并能够形成两个或更多个茎结构的5′-非翻译区。

可以将如上所列的来源于冷休克蛋白基因的5′-UTR的编码部分用于本发明的载体。尤其优选地可以使用源自大肠杆菌cspA基因的5′-UTR编码部分。大肠杆菌cspA基因的核苷酸序列根据登录号M30139登记在GenBank基因数据库中，且公众可以获得。核苷酸序列示于SEQ ID NO：1中。此外，根据本发明还可以使用核苷酸序列已经过部分修饰过的5′-UTR。例如，可以使用如WO 99/27117中所述包含在质粒pMM047或pMM048中、来自cspA基因的5′-UTR-编码部分。包含在质粒pMM048中、来自大肠杆菌cspA基因的5′UTR-编码部分的核苷酸序列示于SEQ ID NO：5。该序列与本说明书实施例中所使用的质粒pCold08NC2中所包含的5′-UTR编码部分的核苷酸序列相同。

本发明的特征在于，将突变导入5′-UTR-编码部分从而使得该突变调节茎(推测在5′-UTR内所形成的二级结构)之间的距离。例如，通过向对应于茎间区域的部分中插入核苷酸、或者通过缺失这样的部分中的一部分核苷酸，可以增大或者减小茎间的距离。对于导入突变的位置、或突变中所插入或缺失的核苷酸数目没有特定的限制，只要由于这一突变而导致下游所连接基因的表达水平与不带有该突变的基因相比被提高。不必说，该突变优选不干扰5′-UTR实现冷特异性基因表达的能力。

预计，源自大肠杆菌cspA基因的5′-UTR在核苷酸序列SEQ IDNO：1中自584至593位核苷酸之间的区域内和自598至608位核苷酸之间的区域内形成茎结构。因此，可以通过向上述区域之间的部分(从核苷酸593至核苷酸598)中、或者向被引入了突变的5′-UTR中对应于所述部分的部分中引入核苷酸插入或缺失来调节茎间的距离。本发明不限于上述的茎间距离调节。

根据本发明的缺失突变包括茎间的部分中一至全部核苷酸的缺失。插入突变的例子有插入1至100个核苷酸、优选3至60个核苷酸、更优选8至40个核苷酸。

尽管无意限制本发明，但实施例所述质粒载体pCold08s2、pCold08s12和pCold08s32中所包含的5′-UTR例示了本发明的优选实施方案。质粒载体中所包含的5′-UTR的核苷酸序列分别示于SEQID NOS：2、3和4。

本发明的表达载体可以用编码5′-UTR的部分来制备，该5′-UTR是根据本发明制备的而且其中茎间的距离做了如上所述的调节。具体地说，它可以按照下述进行制备。假定以由5′-UTR-编码DNA编码的mRNA形成的二级结构为起始材料。用已知方法将插入或缺失突变导入被推定对应于茎间部分的部分。将由此获得的DNA与适宜的启动子一同整合进载体。

本发明的载体可以是任何一个常用载体(例如，质粒、噬菌体或病毒载体)，只要可以用它实现作为载体的目的。本发明的载体在转移进宿主中后如果可能整合进基因组DNA，就不会带来不方便。

5′-UTR在本发明的载体中插入在启动子和编码目的蛋白的区域之间。根据本发明所使用的启动子例子包括但不限于源自冷休克蛋白基因(例如，cspA、cspB、cspG和cspA)的启动子，预计这些启动子在低温下具有高启动子活性。启动子可以是任何一个在所使用的宿主中具有起始转录成RNA活性的启动子。如果用大肠杆菌作为宿主，可以使用比如lac、irp、tac、gal或ara这样的启动子。

除了以上所提及的元件之外，关于所包含的区域，本发明的载体还可以具有，例如，复制起点、用作选择标记的药物抗性基因或调节序列比如操纵基因或终止子。

根据本发明可以使用存在于各种基因的表达调节区域中的操纵基因，比如来自大肠杆菌乳糖操纵子的lac操纵基因。可以通过利用合适的诱导物比如乳糖或其类似物(优选异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))来取消lac操纵基因的功能来使得启动子起作用。这样的操纵基因序列通常位于启动子下游以及转录起始位点附近。

本发明的载体还可以具有为操纵基因功能所必需的调节基因(例如，lac操纵基因的lacI^q基因)。

通过在5′-非翻译区下游除包含上述元件之外还包含一个互补于所使用宿主的核糖体RNA中的反义-下游盒序列的核苷酸序列，有可能提高表达效率。例如，对于大肠杆菌而言，反义-下游盒序列位于16S核糖体RNA的第1467位至第1481位(The EMBO Journal，15：665-674(1996))。有可能利用冷休克蛋白N-末端肽的编码区域，它包含了与所述序列高度互补的核苷酸序列。使反义-下游盒序列的互补序列从距离起始密码子约一至十五个核苷酸附近起始，这样的放置是有效的。可以将编码目的蛋白的基因整合进载体，这样该蛋白表达为具有N-末端肽的融合蛋白。作为选择，可以利用定点诱变导入碱基置换，从而使编码目的蛋白的基因互补于反义-下游盒序列。如果将编码目的蛋白的基因整合进载体从而使得目的蛋白表达为融合蛋白，则该肽可以是任意长度的肽，只要目的蛋白不丧失活性。用于表达融合蛋白的载体可以，例如，在连接位点进行遗传操作，由此可以用适宜的蛋白酶从融合蛋白中分离目的蛋白。作为选择，也可以进行这样的遗传操作，从而使得融合蛋白表达为与可以用于纯化或检测的肽融合的蛋白。可用于纯化所表达蛋白的肽的例子包括但不限于组氨酸标签(His-Tag)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。

例如，利用按照下述被构建为质粒的本发明载体来表达目的蛋白。表达目的蛋白的转化体可以通过将编码该蛋白的基因克隆进本发明的质粒载体、并用该质粒转化适宜的宿主来获得。通过降低培养温度，该转化体特异性表达目的蛋白。如果该载体带有一个操纵基因，则可以通过适宜的方法取消这一操纵基因的功能来诱导启动子。

如果用本发明的载体表达蛋白，则目的蛋白优选由于上述LACE效应而翻译。结果，培养物中的目的蛋白含量高于常规的重组蛋白表达，且因此，有可能制备高纯度的目的蛋白。在适宜同位素存在下表达目的蛋白可以制备同位素标记的蛋白。由此获得的高纯度标记蛋白适于利用NMR做结构分析。例如，培养的培养物或裂解物可以直接进行NMR分析。

实施例

以下实施例更详细地阐述了本发明，但是不应解释为限制本发明的范围。

在本文所述的方法中，基本方法包括质粒制备和限制酶消化，其根据T.Maniatis等人(eds.)，Molecular Cloning：A LaboratoryManual第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory中所述的方法来实施。除非另外指明，使用大肠杆菌JM109作为如下述质粒构建的宿主，并使用包含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、pH 7.0)、或使用向LB培养基中添加浓度为1.5％的琼脂并固化所得混合物而制备的LB琼脂培养基。

参考实施例：质粒pCold08NC2的构建

根据WO 99/27117的描述利用大肠杆菌JM109/pMM047(FERMBP-6523)(于1997年10月31日保藏(原始保藏日期)在独立行政法人产业技术综合研究所，特许生物寄托中心，AIST TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，日本)中所含的质粒pMM047为起始材料构建pCold08NC2。按照从上游至下游的顺序，质粒pCold08NC2中含有以下元件：lac启动子、经过修饰的大肠杆菌cspA基因-来源的5′-UTR和多克隆位点。此外，该质粒还带有lacI基因、与大肠杆菌16S核糖体RNA中的反义-下游盒序列完全互补的下游盒序列、由六个组氨酸残基组成的组氨酸标签和编码由因子Xa识别的氨基酸序列的核苷酸序列。

实施例1：载体pCold08s2的构建和蛋白表达水平研究

(1)质粒载体pCold08s2的构建

按照下述向获自参考实施例1的质粒pCold08NC2中的5′-UTR-编码部分中导入20个核苷酸的插入突变。

利用作为模板的质粒pCold08NC2和合成的引物Sp20F(SEQ IDNO：6)和引物CSPterR(SEQ ID NO：7)实施PCR。将含有50ngpCold08NC2、5μl Ex Taq缓冲液、8μl dNTP混合物、5 pmol引物Sp20、5 pmol引物CSPterR、0.5μlTakara Ex Taq(Takara Bio)和无菌水且总体积为50μl的反应混合物进行PCR(30个循环，每个循环中94℃1分钟(变性)，55℃1分钟(引物退火)和72℃1分钟(合成反应))。将全部PCR反应混合物在3％(w/v)的低熔点琼脂糖凝胶上进行电泳。从凝胶中纯化出约300-bp的扩增的DNA片段，将其悬浮于5μl无菌水中，并用作扩增的片段SC。

用合成的引物Sp20R(SEQ ID NO：8)和引物NheF2(SEQ IDNO：9)，以及以pCold08为模板在相似的条件下实施PCR。将全部PCR反应混合物在3％(w/v)的低熔点琼脂糖凝胶上进行电泳。从凝胶中纯化出约150-bp的扩增的DNA片段，将其悬浮于5μl无菌水中，并用作扩增的片段SN。

将总体积为50μl，含有扩增的片段SC和SN各1μl、5μlEx Taq缓冲液、5μldNTP混合物和无菌水的混合物于94℃加热10分钟，在60分钟内冷却至37℃，并在37℃温育15分钟。向其中加入0.5μlTakara Ex Taq，并于72℃下加热混合物3分钟。

向反应混合物中添加引物NheF2和CSPterR各5pmol、5μlExTaq缓冲液、5μl dNTP混合物和无菌水至总体积100μl。将所得反应混合物进行PCR(30个循环，每个循环中94℃1分钟，55℃1分钟和72℃2分钟)。将全部PCR反应混合物在3％(w/v)的低熔点琼脂糖凝胶上进行电泳。从凝胶中纯化出约400-bp的扩增的DNA片段，将其悬浮于5μl无菌水中，并用作扩增的片段Sp20-1。

Sp20-1用限制酶NheI和EcoRI(都来自Takara Bio)做双重消化。在1％的低熔点琼脂糖凝胶中通过电泳分离所得DNA片段，然后提取和纯化。将纯化的DNA片段和经过NheI和EcoRI消化的pCold08混合，并用DNA连接试剂盒(Takara Bio)将二者连接。用连接反应混合物转化大肠杆菌JM109，并使转化体在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长。从所得克隆制备质粒，并进行DNA测序。选择其中已经正确插入了 PCR产物的质粒，并命名为pCold08s2。在pCold08s2中，在pCold08NC2 5′-UTR(SEQ ID NO：5)的第+120和+121之间插入了核苷酸序列5′-GAGCGGATAACAATTTCACA-3′(SEQ ID NO：10)。将lac操纵基因的转录起始位点定义为+1。如SEQ ID NO：1所示，该位置对应于cspA基因核苷酸序列核苷酸597和核苷酸598间的位置。包含在pCold08s2中的5′-UTR的核苷酸序列示于SEQ ID NO：2。

(2)构建表达蛋白的质粒

(2)-1质粒载体pCold08s2-GFP的构建

如下所述将编码源自维多利亚水母(Aequorea victoria)的GFP蛋白的基因整合进pCold082。利用作为模板的质粒pQBI63(TakaraBio)和合成的引物GFP-F(SEQ ID NO：11)和引物GFP-R(SEQ IDNO：12)实施PCR。将含有50 ng pQBI63、5μlEx Taq缓冲液、8μldNTP混合物、引物GFP-F和GFP-R各5pmol、0.5μlTakara Ex Taq(Takara Bio)和无菌水且总体积为50μl的反应混合物进行PCR(30个循环，每个循环中94℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟)。将全部PCR反应混合物在3％(w/v)的低熔点琼脂糖凝胶上进行电泳。从凝胶中纯化出含GFP基因的约700-bp的扩增的DN A片段，将其悬浮于5μl无菌水中。用EcoRI和XbaI(Taka ra Rio)双重消化该DNA片段。在1％的低熔点琼脂糖凝胶中分离所得DNA片段，然后提取和纯化。将纯化的DNA片段和经过EcoRI和XbaI消化的pCold08s2混合，并用DNA连接试剂盒(Takara Bio)将二者连接。用连接反应混合物转化大肠杆菌JM109，并使转化体在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长。从所得克隆制备质粒，并进行DNA测序。选择其中已经正确插入了PCR产物的质粒，并命名为pCold08s2-GFP。此外，以类似的方式将含有GFP基因的扩增的DNA片段整合进在其5′-UTR中不带有插入序列的pCold08NC2，获得pCold08-GFP。

(2)-2质粒载体pCold08s2-H296的构建

H296片段蛋白是衍生自纤连蛋白的肝素结合多肽，按照下述将其编码基因整合进pCold082。

利用作为模板的质粒pCH102(美国专利号5198423)和合成的引物H296-F(SEQ ID NO：13)和引物H296-R(SEQ ID NO：14)实施PCR。将含有50ng pCH102、5μlEx Taq缓冲液、8μldNTP混合物、引物H296-F和H296-R各5pmol、0.5μlTakara Ex Taq和无菌水且总体积为50μl的反应混合物进行PCR(30个循环，每个循环中94℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟)。将全部PCR反应混合物在3％(w/v)的低熔点琼脂糖凝胶上进行电泳。从凝胶中纯化出约1-kbp的扩增的DNA片段并将其悬浮于5μl无菌水中。用EcoRI和BamHI(Takara Bio)双重消化该DNA片段。在1％的低熔点琼脂糖凝胶中分离所消化的DNA片段，然后提取和纯化。将含有H296基因的纯化的DNA片段和经过EcoRI和BamHI消化的pCold08s2混合，并用DNA连接试剂盒(Takara Bio)将二者连接。用连接反应混合物转化大肠杆菌JM109，并使转化体在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长。从所得克隆制备质粒，并进行DNA测序。选择其中已经正确插入了PCR产物的质粒，并命名为pCold08s2-H296.此外，以类似的方式将含有H296基因的扩增的DNA片段整合进在其5′-UTR中不带有插入序列的pCold08NC2，获得pCold08-H296。

(2)-3质粒载体pCold08s2-lac的构建

用BamHI和SalI(Takara Bio)消化包含了β-半乳糖苷酶(lacZ)基因 (M.Inouye(ed.)， Experimental Manipulation of GeneExpression，第15-32页，1983，New York Academic Press)的质粒DKM005。将反应混合物在1％(w/v)的低熔点琼脂糖凝胶上进行电泳。从凝胶中纯化出含有lacZ基因的DNA片段并将其悬浮于5μl无菌水中。将纯化的DNA片段和经过BamHI和SalI消化的pCold08s2混合，并用DNA连接试剂盒(Takara Bio)将二者连接。用10μl连接反应混合物转化大肠杆菌JM109，并使转化体在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长。从所得克隆制备质粒，并进行DNA测序。选择其中已经正确插入了 PCR 产物的质粒，并命名为pCold08s2-lac。此外，以类似的方式将含有lacZ基因的扩增的DNA片段整合进在其5′-UTR中不带有插入序列的pCold08NC2，获得pCold08-lac。

(3)评估表达水平

(3)-1评估利用pCold08s2-GFP和pCold08s2-H296的表达水平

用pCold08s2-GFP(实施例1-(2)-1中制备)或pCold08s2-H296(实施例1-(2)-2中制备)或作为对照的pCold08-GFP或pCold08-H296转化大肠杆菌BL21(Novagen)或CL83(J.Bacteriol.，180：90-95(1998))。在2.5ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中接种各转化体，并于37℃振荡培养过夜。将培养物以1％(v/v)的浓度接种于3ml相同的培养基中，并于37℃振荡培养。当混浊度(OD600 nm)达到0.2时，将培养温度下调至15℃，并在该温度下继续培养15分钟。然后，向其中添加终浓度为1mM的IPTG，将培养温度保持在15℃时继续振荡培养24小时。测定混浊度(OD600nm)后，将从2ml培养物离心收集的细胞悬浮于100μl细胞悬浮液(50mM tris-盐酸缓冲液(pH 7.5)，150mM氯化钠)中。将对应于约3.75x10⁶细胞(根据混浊度计算)的悬浮液在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。凝胶用考马斯亮蓝(CBB)染色，然后脱色。根据“Seibutsukagaku Jikken No Tebiki 2”(Kagakudojin)中所述的实施SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。用Total Lab ver.1.11(NonlinearDynamics)对凝胶做图像分析，以定量GFP和H296的表达水平。对带有PCold08s2-GFP和pCold08s2-H296的重组体测定的蛋白表达水平和对带有在其5′-UTR中没有插入片段的pCold08-GFP和pCold08-H296的重组体测定的蛋白表达水平之间的比率示于表1。

表1

^＊表达率：pCold08s2克隆的表达水平/pCold08克隆的表达水平，根据图像分析结果计算。

根据表1显示的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，用在其5′-UTR中插入有20个核苷酸的载体pCold08s2制备的克隆的表达水平，高于用pCold08NC2制备的克隆的表达水平。

(3)-2评估利用pCold08s2-lac的表达水平

用pCold08s2-lac(实施例1-(2)-3中制备的)或作为对照的pCold08-lac转化大肠杆菌BL21或CL83.在2.5 ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中接种各转化体，并于37℃振荡培养过夜。将培养物以1％(v/v)的浓度接种于3ml相同的培养基中，并于37℃振荡培养。当混浊度(OD600 nm)达到0.2时，从培养物中提取样品，将培养温度下调至15℃，并在该温度下继续培养15分钟。然后，向其中添加终浓度为1mM的IPTG以诱导表达，将培养温度保持在15℃时继续培养。根据J.H.Miller，Experiments in MolecularGenetics，PP.352-355，1972，Cold Spring Harbor Laboratory中所述的方法，将从临诱导前37℃的培养物以及诱导后3或24个小时的培养物中提取的样品进行β-半乳糖苷酶活性的测量。结果示于表2。

表2：β-半乳糖苷酶活性(单位)

如表2所示，诱导后24小时，包含在5′-UTR中插入有20个核苷酸的pCold08s2-lac的转化体的β-半乳糖苷酶活性高于(1.4倍(宿主：BL21)或2.3倍(宿主：CL83))包含pCold08-lac的转化体的β-半乳糖苷酶活性。

实施例2：载体pCold08s12和pCold08s32的构建以及蛋白表达水平的研究

(1)质粒载体pCold08s12的构建

除了用引物Sp12F(SEQ ID NO：15)和Sp12R(SEQ ID NO：16)替代引物Sp20F和CSPterR之外，按照实施例1-(1)所述构建质粒pCold08s12。在质粒pCold08s12中，向来自参考实施例1的质粒pCold08NC2 5′-UTR-编码部分中导入了12个核苷酸的插入突变。

在pCold08s12中，在pCold08NC2 5′-UTR(SEQ ID NO：5)的+120和+121间插入了核苷酸序列5′-ATGTTTTGTAGA-3′(SEQ IDNO：17)。包含在pCold08s12中的5′-UTR核苷酸序列示于SEQ IDNO：3。

(2)质粒载体pCold08s32的构建

除了用引物Sp32F(SEQ ID NO：18)和Sp32R(SEQ ID NO：19)替代引物Sp20F和Sp20R之外，按照实施例1-(1)所述构建质粒pCold08s32。在质粒pCold08s32中，向来自参考实施例1的质粒pCold08NC2 5′-UTR-编码部分中导入了32个核苷酸的插入突变。

在pCold08s32中，在pCold08NC2 5′-UTR(SEQ ID NO：5)的+120和+121间插入了核苷酸序列5′-ATGTTTTGTAGATTTGAAAGAGTAGATTAGTA-3′(SEQ IDNO：20)。包含在pCold08s32中的5′-UTR核苷酸序列示于SEQ IDNO：4。

(3)质粒载体pCold08s12-H296和pCold08s32-H296的构建

用EcoRI和BamHI双重消化如实施例1-(2)-1所述制备的、含有H296基因的约1-kbp的DNA片段。在1％的低熔点琼脂糖凝胶中分离所消化的DNA片段，然后提取和纯化。将纯化的DNA片段和经过EcoRI和BamHI消化的pCold08s12或pCold08s32混合，并用DNA连接试剂盒(Takara Bio)将二者连接。用连接反应混合物转化大肠杆菌JM109，并使转化体在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长。从所得克隆制备质粒，并进行DNA测序。选择其中已经正确插入了PCR产物的质粒，并命名为pCold08s12-H296和pCold08s32-H296。

(4)评估使用pCold08s12-H296和pCold08s32-H296的表达水平

用上述(3)中制备的pCold08s12-H296或pCold08s32-H296或作为对照的pCold08-H296转化大肠杆菌BL21或CL83。在2.5ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中接种各转化体，并于37℃振荡培养过夜。将培养物以1％(v/v)的浓度接种于3ml相同的培养基中，并于37℃振荡培养。当混浊度(OD600nm)达到0.2时，将培养温度下调至15℃，并在该温度下继续培养15分钟。然后，向其中添加终浓度为1mM的IPTG，将培养温度保持在15℃时继续振荡培养24小时。为如实施例1-(3)-1中所述获得的培养物定量各重组体的H296表达水平。对带有pCold08s12-H296和pCold08s32-H296的重组体测定的蛋白表达水平和对带有在其5′-UTR中没有插入片段的pCold08-H296的重组体测定的蛋白表达水平之间的比率示于表3。

表3

^＊表达率：pCold08s12或pColds32克隆的表达水平/pCold08克隆的表达水平，根据图像分析结果计算。

SDS聚丙烯酰胺凝胶分析结果证实，与用不带插入片段的载体观察到的表达水平相比，用在其5′-UTR中插入有12或32个核苷酸的载体观察到的表达水平得到提高。

工业实用性

本发明提供一种在低温条件下导致高表达效率的表达载体。利用该载体有可能特异性表达目的蛋白从而制备高纯度的蛋白制剂。此外，通过利用该载体在低温条件下表达蛋白，有可能有效地获得保持其活性的蛋白。

序列表说明

SEQ ID NO：2：修饰的cspA基因5′非翻译区

SEQ ID NO：3：修饰的cspA基因5′非翻译区

SEQ ID NO：4：修饰的cspA基因5′非翻译区

SEQ ID NO：5：修饰的cspA基因5′非翻译区

SEQ ID NO：6：合成的PCR引物

SEQ ID NO：7：合成的PCR引物

SEQ ID NO：8：合成的PCR引物

SEQ ID NO：9：合成的PCR引物

SEQ ID NO：10：插入cspA基因5′非翻译区中的合成的核苷酸

SEQ ID NO：11：合成的PCR引物

SEQ ID NO：12：合成的PCR引物

SEQ ID NO：13：合成的PCR引物

SEQ ID NO：14：合成的PCR引物

SEQ ID NO：15：合成的PCR引物

SEQ ID NO：16：合成的PCR引物

SEQ ID NO：17：插入cspA基因5′非翻译区中的合成的核苷酸

SEQ ID NO：18：合成的PCR引物

SEQ ID NO：19：合成的PCR引物

SEQ ID NO：20：插入cspA基因5′非翻译区中的合成的核苷酸

序列表

<110>TAKARA BIO INC.

<120>冷诱导的表达载体

<130>664200

<150>JP2002-359955

<151>2002-12-11

<160>20

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1209

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>1

aagcttcgat gcaattcacg atcccgcagt gtgatttgag gagttttcaa tggaatataa 60

agatccaatg catgagctgt tgagcagcct ggaacagatt gtttttaaag atgaaacgca 120

gaaaattacc ctgacgcaca gaacaacgtc ctgtaccgaa attgagcagt tacgaaaagg 180

gacaggatta aaaatcgatg atttcgcccg ggttttgggc gtatcagtcg ccatggtaaa 240

ggaatgggaa tccagacgcg tgaagccttc aagtgccgaa ctaaaattga tgcgtttgat 300

tcaagccaac ccggcattaa gtaagcagtt gatggaatag acttttatcc actttattgc 360

tgtttacggt cctgatgaca ggaccgtttt ccaaccgatt aatcataaat atgaaaaata 420

attgttgcat cacccgccaa tgcgtggctt aatgcacatc aacggtttga cgtacagacc 480

attaaagcag tgtagtaagg caagtcccct caagagttat cgttgatacc cctcgtagtg 540

cacattcctt taacgcttca aaatctgtaa agcacgccat atcgccgaaa ggcacactta 600

attattaaag gtaatacact atgtccggta aaatgactgg tatcgtaaaa tggttcaacg 660

ctgacaaagg cttcggcttc atcactcctg acgatggctc taaagatgtg ttcgtacact 720

tctctgctat ccagaacgat ggttacaaat ctctggacga aggtcagaaa gtgtccttca 780

ccatcgaaag cggcgctaaa ggcccggcag ctggtaacgt aaccagcctg taatctctgc 840

ttaaaagcac agaatctaag atccctgcca tttggcgggg atttttttat ttgttttcag 900

gaaataaata atcgatcgcg taataaaatc tattattatt tttgtgaaga ataaatttgg 960

gtgcaatgag aatgcgcaac gccgtaagta aggcgggaat aatttcccgc cgaagactct 1020

tactctttca atttgcaggc taaaaacgcc gccagctcat aactctcctg tttaatatgc 1080

aattcacaca gtgaatctct tatcatccag gtgaaaaata aaagcgtgaa acaaatcact 1140

attaaagaaa gtaatctata tttctgcgca ttccagctct gtgttgattt cacgagtatg 1200

tactgcacc 1209

<210>2

<211>164

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的cspA基因5’非翻译区

<400>2

aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat ccagtgtagt aaggcaagtc 60

ccttcaagag cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca 120

cgagcggata acaatttcac attaattatt aaaggtaata cacc 164

<210>3

<211>156

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的cspA基因5’非翻译区

<400>3

aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat ccagtgtagt aaggcaagtc 60

ccttcaagag cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca 120

catgttttgt agattaatta ttaaaggtaa tacacc 156

<210>4

<211>176

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的cspA基因5’非翻译区

<400>4

aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat ccagtgtagt aaggcaagtc 60

ccttcaagag cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca 120

catgttttgt agatttgaaa gagtagatta gtattaatta ttaaaggtaa tacacc 176

<210>5

<211>144

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的cspA基因5’非翻译区

<400>5

aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat ccagtgtagt aaggcaagtc 60

ccttcaagag cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca 120

cttaattatt aaaggtaata cacc 144

<210>6

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>6

gtgcggataa caatttcaca ttaattatta aaggtaatac 40

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>7

tgcgcattct cattgcaccc 20

<210>8

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>8

tgtgaaattg ttatccgctc gtgtgccttt cggcgatatg 40

<210>9

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>9

gttttcccgc tagccaaatt gtgagcggat a 31

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>插入cspA基因5’非翻译区中的合成的核苷酸

<400>10

gagcggataa caatttcaca 20

<210>11

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>11

aagataacaa aggaattcga gtaaaggaga agaacttt 28

<210>12

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>12

tctggacatt ctagattatt tgtatagttc atccatg 37

<210>13

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>13

ccatccatgg aattcggcta ttcctgcacc aactga 36

<210>14

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>14

gaaaacctag gatccttatg tggaaggaac atccaa 36

<210>15

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>15

catatcgccg aaaggcacac atgttttgta gattaattat taaaggtaat ac 52

<210>16

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>16

gtattacctt taataattaa tctacaaaac atgtgtgcct ttcggcgata tg 52

<210>17

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>插入cspA基因5’非翻译区中的合成的核苷酸

<400>17

atgttttgta ga 12

<210>18

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>18

atgttttgta gatttgaaag agtagattag tattaattat taaaggtaat ac 52

<210>19

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的PCR引物

<400>19

tactaatcta ctctttcaaa tctacaaaac atgtgtgcct ttcggcgata tg 52

<210>20

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>插入cspA基因5’非翻译区中的合成的核苷酸

<400>20

atgttttgta gatttgaaag agtagattag ta 32

Claims

1.具有编码源自冷休克蛋白基因mRNA的5′-非翻译区的部分的载体，其中向该5′-非翻译区中导入了突变从而使得在所述区域中形成的茎结构间的距离发生改变，其中所导入的突变是导入对应于SEQID NO：1的核苷酸593至核苷酸598的区域的核苷酸插入。

2.根据权利要求1的载体，其中编码5′-非翻译区的部分还具有操纵基因。

3.根据权利要求2的载体，其中编码5′-非翻译区的部分是编码由SEQ ID NO：2、3或4的核苷酸序列组成的5′-非翻译区的部分。

4.根据权利要求1至3之中任一项的载体，它具有位于编码5′-非翻译区的部分的上游的启动子。

5.根据权利要求1至3之中任一项的载体，它具有一段与所使用宿主的核糖体RNA中的反义-下游盒序列互补的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于编码5′-非翻译区的部分的下游。

6.根据权利要求1至3之中任一项的载体，它是质粒载体。

7.表达目的蛋白的方法，该方法包括：

(1)用根据权利要求1至6之中任一项所定义的载体转化宿主以获得转化体，在所述载体中已经整合了编码目的蛋白的基因；

(2)培养所述转化体；和

(3)将培养温度下调至低于常规温度以表达目的蛋白。

8.根据权利要求7的方法，其中在步骤(3)中或在步骤(3)后诱导启动子。