KR20040086424A - 이종 폴리펩티드의 한랭 쇼크 유도 발현 및 생산 - Google Patents

이종 폴리펩티드의 한랭 쇼크 유도 발현 및 생산 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한랭 쇼크 반응을 유도하는 조건하에서 숙주 세포에서 이종 폴리펩티드을 생산하기 위하여 사용할 수 있는 DNA 분자 또는 벡터 및 상기 DNA 분자 및 벡터를 포함하는 숙주 세포애 관한 것이다. DNA 분자 또는 벡터는 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 그를 발현시키는 한랭 쇼크 유도 유전자로부터 프로모터 및 5'-UTR를 포함한다. 또한, 한랭 쇼크 반응을 유도하는 조건하에서 해독을 증진하는 AT 풍부 서열은 이종 폴리펩티드의 코딩 서열에 존재하거나, 한랭 쇼크 유도 유전자 프로모터 및 5'-UTR 및 코딩 서열 사이에 삽입된 추가의 요소로 존재한다.

Description

이종 폴리펩티드의 한랭 쇼크 유도 발현 및 생산{COLD SHOCK INDUCIBLE EXPRESSION AND PRODUCTION OF HETEROLOGOUS POLYPEPTIDES}
37℃에서 배양시킨 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포를 15℃과 같은 저온으로 이동시킬 때 한랭-쇼프 단백질로 명명되는 한 세트의 단백질은 일시적으로 순응기로 명명되는 성장 지연기동안 매우 고수준으로 유도된다(Jones et al., 1987). 이들 한랭-쇼크 특이 단백질은 CspA, CspB, CspG, CspI, CsdA, RbfA, NusA, 및 PNP을 포함한다(참조: Phadtare et al., 1999, 2000 and 2002; Yamanaka et al., 1998). 그중, CspA는 70개의 아미노산 잔기로 구성된 주요 한랭-쇼크 단백질로서 확인되었다.
E. coli의 cspA 패밀리는 9개의 동종 단백질, CspA 내지 CspI로 구성되지만 그중 CspA, CspB, CspG 및 CspI만이 한랭-쇼크 유도성이다. 흥미롭게도,cspA유전자는 표준 온도 및 저온 모두에서는 없어도 된다(Bae et al., 1997). CspA 패밀리 구성원들은 기능상 서로 일치하므로 CspA 동족체중 어느 것도 한랭-쇼크 순응에 대하여 독특하게 반응하지 않는다(Xia et al., 2001). 실제로 △cspA△cspB△cspG3부(triple) 결실 균주는 여전히 생존가능한 반면, △cspA△cspB△cspG△cspE4부(4부) 결실 균주는 저온에서 콜로니를 형성할 수 없다. 흥미롭게도, CspD를 제외한 9개의 CspA 동족체로부터의 단일 유전자는 4부 결실 균주의 한랭-감수성을 보완할 수 있는 것으로 나타났다(Xia et al., 2001). CspA는 CspB, CspG 및 CspI 와는 상이하게 조절된다(Etchegaray et al., 1996 and Wang et al., 1999). 24℃ 및 10℃에서 CspA는 고수준으로 생산되는 반면, CspB 및 CspG는 20℃ 미만으로 온도를 바꾼 후에만 생산이 되며, 15℃에서 최대로 유도된다. CspI는 10-15℃ 사이에서 유도된다. CspA, CspB 및 CspG는 또한 단백질 합성이 완전히 차단되는 조건하의 저온에서 유도되는 것으로 나타났다(Etchegaray et al., 1999).
cspA발현은 복합 방식으로 조절, 즉 전사, mRNA 안정성 및 해독 효능 수준으로 조절된다(참조: Phadtare et al., 2000 and Yamanaka et al., 1998).cspA유전자는 159개의 염기로 구성된 특히 긴 5' 비해독 영역 (5'-UTR)을 갖는다.cspA5'-UTR 결실 분석을 통해 이 영역이 37℃하의 극도한 불안정성을 초래하고(반감기는 2초 미만이다), 저온에서 mRNA 안정화에 바람직한 효능을 갖는다고 나타났다(Jiang et al., 1996 and Mitta et al., 1997). cspAmRNA는 한랭 쇼크후 즉시 급격하게 안정화된다(반감기는 20분이상이다). 이러한 안정화는 일시적이며 일단 세포가 저온에 순응하게 되면 소멸한다. 결구 이것이cspA의 발현을 조절하게 된다.
cspA유도는 특정 전사 인자를 요하지 않기 때문에cspA의 한랭-쇼크 유도는 열-쇼크 유도와 매우 상이하다. 흥미롭게도, cspA프로모터는 37℃에서 활성이지만, cspAmRNA는 이러한 저온하에서는 극도로 불안정하기 때문에 CspA는 현저히 감소한다. 따라서, cspAmRNA의 5'-UTR은 한랭-쇼크 유도에 있어 중요한 역할을 한다. 최근, 초기 지수증식기동안 37℃에서 CspA가 생산되고 그의 mRNA는 중기- 내지 후기-지수증식기까지 불안정한 것으로 나타났다(Yamanaka et al., 2001 and Brandi et al., 1999). cspAmRNA의 5'-UTR 부위는 수개의 한랭-쇼크 mRNAs중 보존되는 "한랭 Box" 서열을 포함한다. 이 부위는 AU-풍부한 서열로 이어지는 안정한 스템-루프 구조를 형성한다(Fang et al., 1998). 본 발명자들의 실험을 통해 스템-루프의 결실은 mRNA를 아주 현저하게 불안정화시키고 한랭 쇼크-유도된cspAmRNA의 양을 대략 50%까지 감소시키기 때문에 이 부위는 한랭 쇼프후 정상적인cspAmRNA 유도에 필요하다고 나타났다. 그러나, AU-풍부 트랙은 mRNA를 약간 불안정화시킨다. 스템의 통합성(integrity)이 안정화 기능에 필수적이지만, ,루프 서열의 것은 덜 중요하다(Xia et al., 2001).
개시 코돈(AUG) 및 코딩 서열 모두 결여된 돌연변이cspAmRNA의 과잉발현으로 저온에서의 성장은 심각하게 저해되고 함께 염색체cspA발현을 탈억제된다. 추가로, 과잉발현된 RNA는 안정하게 30S 및 70S 리보솜과 관련된다. 본 발명자의 실험 결과를 통해 5'-UTR은 그 스스로도 저온에서 리보솜에 대하여 우수한 친화력을 갖는다는 것이 입증되었다. 15℃에서 5'-UTR이 과잉생산됨으로써 한랭-쇼크 반응의 유도를 지연시키고 CspA뿐만 아니라 CspB 및CspG의 합성도 지연된다 (Fang et al., 1998 and Jiang et al., 1996). 이 효과는 CspA와 함께 5'-UTR의 공동 생산에 의해 억제된다. cspA프로모터의 -35 부위의 상류에 바로 인접한 AT-풍부 서열은cspA전사를 증진시키는 UP 요소로서 작용하는 것으로 나타났다. UP 요소의 결실로 cspA프로모터의 활성은 감소되었다(Goldenberg et al., 1997 and Mitta et al., 1997). 프로모터의 활성을 더욱 증가시키는 또다른 중요한 인자는 -10 부위의 상류에 바로 인접한 TGn 모티프의 존재이다(Kumar et al., 1993). -10 부위와 함께 이 모티프가 신장된 -10 부위를 구성하고 -35 부위는 이 부위의 존재에 없어도 된다고 보고되었다. 중요하게는cspA의 발현은 또한 해독 수준으로 조절된다. 성장 지연기(순응기)동안의 한랭-쇼크 단백질의 우선적인 합성은 그 mRNAs는 대부분의 다른 세포(비-한랭-쇼크) mRNAs와는 달리 한랭-쇼크 리보솜 인자, 예로서 RbfA 및 CsdA 없이도 저온에서 해독 개시 복합체를 형성하는 메카니즘을 소유한다는 것을 제안한다. 본 발명의 최근 실험 데이타를 통해 CspA의 코딩 서열 서열내 저온에서 그의 해독을 증진하는 요소가 존재한다고 나타났다. 한랭-쇼크 단백질에 대한 mRNAs, 예로서 CspA, CspB, CspG, CspI, CsdA 및 RbfA가 해독 개시를 증진시키는 코딩 부위내 하류 박스(DB(로 불리는 요소를 갖는다고 제안되었다(Mitta et al., 1997). 본래, DB 서열은 16S rRNA의 두번째 스템의 부위에 상보적이고 개시 코돈으로부터 수개 염기만큼 하류에 위치한다고 제안되었다. 현재 DB가 해독 개시를 증진시키는 방법에 대하여 논의되고 있고(Etchegaray et al., 1999 and O'Connor et al., 1999) 16S rRNA와의 결합을 통해 해독 사전개시(pre개시) 복합체를 형성하는 것을 증진시키는 본래 제안되었던 기작은 정확한 기작인 아닐 수 있다고 논의되고 있다.
'LACE'(절단된cspA발현의 저온-항생제 효과)(low-temperatureantibiotic effect of truncated c spAexpression)으로 언급되는 현상은E. coli에서 관찰되었다(Jiang et al., 1996 and Xia et al., 2001). 절단된cspA유전자가 저온에서 과잉발현될 때 세포 성장은 완전하게 차단된다. 이는 절단된cspAmRNA에 의해 거의 모든 세포 리포솜을 막음으로써 유발될 있다고 입증되었다. 이 절단된 mRNA은 저온에서 비-순응 리보솜과 사전 개시 복합체를 형성할 수 있다. pUC 벡터에서 클로닝된 cspA유전자중 두번째(pA01S), 또는 7번째(pA10S) 또는 31번째(pA30S) 코돈에 종결 코돈을 삽입하므로써 절단된cspAmRNA에 의한 리보솜 차단을 명확하게 입증하였다(Xia et al., 2001). 37℃에서 이들 플라스미드를 수반하는 세포는 완벽하게 정상인 반면 한랭-쇼크시 세포는 성장을 완전히 멈췄다. 이는 15℃에서35S-Met를 포함하는 콜로니를 형성할 수 없고, 어떤 단백질도 표지되지 않았다. 이들 세포의 폴리좀 프로파일을 분석했을 때, 개시 코돈(pA01S) 만을 발현시키는 세포는 어느 폴리좀 피크도 없이 단 하나의 모노솜만을 포함하였다. pA10S를 포함하는 세포는 디- 및 모노솜을 나타냈고 pA30S를 포함하는 세포는 어느 거대 폴리좀 피크를 나타내지 않고 트리-, 디- 및 모노솜을 다시 나타냈다. 또한, 주요 세포 mRNA (lpp)은 절단된cspAmRNA로 전달되므로써 폴리좀으로부터 제외된다고 나타났다. 이 결과는 cspAmRNA의 강력한 해독 능력은 개시 단계에서 결정된다는 것을 입증한다. 본 연구에서, 본 발명자들의 실험을 통해 cspAmRNA의 5'-UTR내 상류 부위가 LACE 효과를 가져오는 해독 개시 복합체 형성에서 중요한 작용을 한다고 나타났다(Xia et al., 2001).
CspA 및 그의 동족체는 mRNAs의 2차 구조를 불안정화시켜 RNA 샤페론으로 제안되었다(Bae et al., 2000; Jiang et al., 1997 and Phadtare et al., 2001). 단일csp유전자는 한랭-감수성을 보완할 수 있는 반면 △cspA△cspB△cspG△cspE4부 결실 균주는 저온에서 성장하지 못하기 때문에(Xia et al., 2001), RNA 샤페론 작용은 mRNA 해독을 저해하는 안정적인 2차 구조의 형성을 차단하므로써 저온에서 세포 mRNAs을 효과적으로 해독시키는데 중요한 것으로 여겨지고 있다(Phadtare et al., 2001).
cspA프로모터를 포함하는 한랭-유도 벡터는 preS2-S'-β-갈락토시다제 및 TolAI-β-락타마제와 같은 응집하기 쉬운 단백질의 발현에 유용한 것으로 나타났다 (Mujacic et al., 1999; Vasina et al., 1997 and Vasina et al., 1996). U.S. Patent no. 6,333,191 B1에는 cspA 및 cspB의 프로모터 및 상기 프로모터를 수반하는 벡터가 기술되어 있다.
본 명세서에서 문헌을 인용하는 것은 상기 문헌이 적절한 선행 기술이거나, 본 출원의 청구범위의 특허성에 중요한 것으로 판단되는 것이다. 문헌의 내용 및 날짜에 대한 언급은 출원시 출원이이 이용할 수 있는 정보에 기초하고 그 언급에 대한 허용까지 포함하지는 않는다.
본 발명은 한랭 쇼크 유도 발현 및 이종 폴리펩티드 생산을 위한 DNA 분자, 벡터, 숙주 및 방법에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명은 숙주 세포에서 한랭 쇼크 반응을 유도하는 조건하에서 숙주 세포에서 이종 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 DNA 분자 및 벡터를 제공한다. 본 발명에 따른 DNA 분자는 숙주 세포에서 한랭 쇼크 반응을 유도하는 조건하에서 숙주 세포에서 이종 폴리펩티드를 발현 및 생산시킬 수 있는, 한랭 쇼크 유도 유전자 프로모터 및 5'-비해독 부위 (5'-UTR) 서열에 작동가능하게 연결된 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한, 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 개시 코돈으로부터 하류 4번째 내지 7번째 코돈에 AT 풍부 서열 (자연적으로 발생하거나 즉, 부위특이 돌연변이 기술 (site-directed mutagenesis)에 의해 형성)을 갖거나 해독 증진 요소는 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 한랭 쇼크 유도 프로모터 및 5'-UTR 서열 사이에 삽입된다. 이 해독 증진 요소는 개시 코돈 및 개시 코돈으로부터 하류 4번째 내지 7번째 코돈에 AT 풍부 서열을 포함하여 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 해독 인-플레임 융합을 형성한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 DNA 분자 또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 숙주 세포를 사용하여 한랭 쇼크 유도 조건하에서 이종 단백질을 생산하기 위한 방법, 예로서, 전체 세포 또는 세포 분해물 NMR 분광분석을 제공한다.
도 1은 프로토타입 한랭-쇼크 벡터 pCold의 구조를 나타내는 대표도이다.
도 2A 및 2B는 37℃(도 2A) 및 15℃(도 2B)에서 씨. 엘레강스(C. elegans) 단백질의 발현을 보여주는 겔이다. 도 2A에서, IPTG를 사용(+) 및 사용하지 않은(-) 각 경우에 대한 단백질 발현을 나타내었다. 도 2B에서, 한랭 쇼크 벡터를 사용하여 0, 12, 및 24 h 각 경우에 15℃에서의 씨. 엘레강스(C. elegans) 단백질의 발현을 나타내었다.
도 3은 한랭 쇼크 벡터를 사용한 씨. 엘레강스(C. elegans) 단백질 생산의 3개의 시간 프로파일을 나타내는 겔이다. 15℃에서 WR49, WR35, 및 WR26의 0, 24,48, 72, 96 및 120h째 발현을 나타낸다. 총 세포 분해물을 분석하였다. 겔을 Coomassie Blue 염료로 염색하였다.
도 4A 및 4B는 한랭 쇼크 벡터를 사용한 γ-인터페론의 SDS-PAGE 분석이다. SDS-PAGE의 Coomassie 염색을 도 4A에 나타낸다. 레인 1: IPTG전 15℃; 레인 2-5: 각각 24, 48, 72 및 96h째 발현, 15℃; 레인 6: 37℃에서 발현. 펄스-표지된 세포의 SDS-PAGE 분석을 도 4B에 나타낸다. 레인 1: 37℃에서 발현; 레인 2-4: 각각 1h, 3h 및 5h째 발현, 15℃.
도 5는 N12-하류 서열의 A/T 함량과 β-갈락토시다제 활성사이의 상관 관계를 나타내느 그래프이다. 57개의 무작위적으로 선택된 클론 각각에 대하여 A + T 의 수를 계수하고 상응하는 β-갈락토시다제 활성에 대하여 플랏팅하였다.
도 6은 선택된 클론의 β-갈락토시다제 활성과 단백질 수준 사이의 관계를 를 나타내는 그래프이다. 각 플라스미드를 포함하는 세포들을 37℃에서 0.5의 OD600nm으로 배양하고 1 mM IPTG로 유도하였다. 단백질 발현은 SDS-PAGE로 분석하고 밴드 밀도는 밀도 측정 분석을 통해 측정하였다.
도 7은 β-갈락토시다제 활성, 단백질 수준 및 선택된 클론의 lacZ mRNA 수준을 나타내는 결합형 막대 그래프 및 겔을 나타낸다.
도 8은 최고 및 최저 β-갈락토시다제 활성을 나타내는 클론의 폴리좀 프로파일의 lacZ 및 ompA mRNA 분포의 그래프 및 겔이다. 각 N12서열(서열번호:14 및 서열번호:26)을 나타낸다.
도 9는 cspA mRNA 5'-UTR의 구조를 나타내는 도이다. 매 10번째 염기를 점으로 표시한다. 상류 박스(UB)를 박스로 표시하고, SD 서열은 굵게 표시하고, 개시 코돈은 밑줄로 표시하고 cspA ORF은 굵게 박스로 표시한다. cspA ORF의 상류 5'-UTR 서열은 서열번호:48과 일치하고 cspA ORF의 하류 3'-UTR은 서열번호:49와 일치한다.
도 10A 및 10B는 5'-UTR cspA mRNA에서 SD 서열의 Epsilon-양 서열을 나타낸다. 도 10A는 Epsilon-양 서열의 돌연변이 분석이고, 야생형 서열은 Wt로 나타낸다(서열번호:28). Epsilon 서열은 굵게 나타낸다. 도 10B는 SD 서열의 돌연변이 분석 및 Epsilon 서열과 AUG 코돈의 거리를 나타내다. Epsilon-양 서열 1-16은 서열번호:29-44에 각각 나타낸다.
도 11A-11C는 pCold I, II 및 III 벡터의 대표도이다.
도 12A-12C는 HindIII 및 EcoRI로 절단된 pUC19 벡터내로 삽입되고 Klenow로 채워진 뉴클레오티드 서열, 서열번호:45 (도 12A), 서열번호:46 (도 12B), 및 서열번호:47 (도 12C)를 나타낸다.
도 13은 cspA, cspB, cspG 및 cspI의 처음 13개의 코돈 뉴클레오티드, 프로모터 및 5'-UTR의 서열 배열이다. cspI에 일치하는 뉴클레오티드를 점으로 나타낸다. 배열을 최대화하기 위하여, 일부 갭을 도입하고 대시로 표시한다. 전사 출발 부위를 볼드체로 표시하고 +1로 나타낸다. 해독 출발 코돈 ATG 또한 볼드체로 나타내고 밑줄로 표시하였다. 대부분의 동종 서열(UP 요소, -35 부위, -10 부위, 한랭 박스, 상류 서열, Shine-Dalgarno (SD) 서열, 및 하류 박스)를 박스로 표시하고 나타낸다.
도 14A 및 14B는 한외여과후 Coomassie Brillant Blue로 염색된 상등액(500 ml culture ofE. coliBL21 harboring pColdI-EnvZ ATP 결합 영역 incubated for 48 hrs동안 인큐베이션된 pColdI-EnvZ ATP 결합 영역을 포함하는E. coli배양액 500ml. 한랭 쇼크)의 SDS-PAGE 겔 (도 14A) 및E. coliBL21의 한랭쇼크후 전체 세포 분해물, 펠릿 및 상등액의 SDS-PAGE 겔(도 14B)을 나타낸다. EnvZ ATP-결합 영역은 단편 B로 공지되어 있다. 도 14B에서, 레인 1: 12h동안 한랭쇼크시킨 후 로딩된 50㎕의 전체 세포 분해물; 레인 2: 24h동안 한랭쇼크시킨 후 로딩된 50㎕의 전체 세포 분해물; 레인 3: 36h동안 한랭쇼크시킨 후 로딩된 50㎕의 전체 세포 분해물; 레인 4: 48h동안 한랭쇼크시킨 후 로딩된 50㎕의 전체 세포 분해물; 레인 5: 2회째 초음파 분해동안 30분간 15,000rpm에서 원심분리한 후 로딩된 2㎕의 펠릿(총 1ml); 레인 6: 2회째 초음파 분해동안 4시간동안 45,000rpm에서 한외 원심분리한 후 로딩된 2㎕의 펠릿(총 1ml); 레인 7: 2회째 초음파 분해동안 4시간동안 45,000rpm에서 한외 원심분리한 후 로딩된 1㎕의 상등액; 레인 8: 1회째 초음파 분해동안 4시간동안 45,000rpm에서 한외 원심분리한 후 로딩된 1㎕의 펠릿(NMR에 대한 샘플)
도 15A 및 15B는 정제하지 않은(도 15A) EnvZ ATP-결합 영역을 포함하는 세포 분해물 상등액의 (1H-15N) HSQC NMR 스펙트럼 및 정제된 EnvZ ATP-결합 영역 (도 15B)의 HSQC NMR 스펙트럼을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
모델 시스템으로서 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)을 사용한 본 발명자들의 실험을 통해 저온에서만 성장을 위해 요구되는 다수의 한랭-쇼크 단백질이 존재한다는 것을 발견하게 되었다. 이들 한랭-쇼크 단백질들 중, CspA는 주요 한랭-쇼크 단백질이고 이는 한랭 쇼크시 106분자/세포 (10-4M) 이상의 수준으로 유도된다. cspA mRNA 해독 개시는 저온에서 상당히 효율적인 것으로 나타났고, cspA mRNA는 모든 다른 세포 mRNA 해독을 억제시키는 능력을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 무의미(a nonsense) 코돈이 cspA의 개시 코돈 후 바로 첨가되는 경우, pUC 벡터내 절단된 cspA 유전자로부터의 mRNA는 한랭 쇼크시 다른 세포 단백질의 합성을 완전하게 차단하므로써 저온에서의 세포 성장을 완전하게 저해하여 모든 세포 리보솜을 막는다. 이러한 현상을 LACE 효과로 명명한다. 따라서, 그의 한랭-쇼크-유도 mRNA 안정화 및 그의 고효율 프로모터와 함께 cspA mRNA의 현저한 해독상의 장점을 사용하여 본 발명자들은 모든 세포 리보솜은 저온에서 클로닝되는 유전자의 산물의 생산을 목적으로 하는 한랭-쇼크 유도 벡터-숙주 시스템을 고안해냄으로써, 한랭 쇼크시 관심의 대상이 되는 유전자 산물/단백질을 고도로 발현시킬 수 있게 되었다
cspA 프로모터를 포함하는 한랭-유도 벡터는 preS2-S'-β-갈락토시다제 및 TolAI-β-락타마제와 같은 응집하기 쉬운 단백질의 발현에 유용한 것으로 나타난 반면(Mujacic et al., 1999; Vasina et al., 1997 and Vasina et al., 1996), 다른요소는 대부분 낮은 한랭 쇼크 유도성 온도에서 해독을 효율적으로 하기 위해서 대체로 중요하다.
따라서, 본 발명은 DNA 분자가 자가-복제 발현 벡터인 한랭 쇼크하에서 이종 폴리펩티드를 발현시킬 수 있느 DNA 분자를 제공한다. 본 발명에 따른 DNA 분자는 숙주 세포에서 한랭 쇼크 반응을 유도하는 조건하에서 숙주 세포에서 이종 폴리펩티드를 발현 및 생산시킬 수 있는, 한랭 쇼크 유도 유전자 프로모터 및 5'-비해독 부위 (5'-UTR) 서열에 작동가능하게 연결된 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 해독율을 증징시키기 위하여 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 개시 코돈으로부터 하류 4번째 내지 7번째 코돈에 AT 풍부 서열 (자연적으로 발생하거나 즉, 부위특이 돌연변이 기술 (site-directed mutagenesis)에 의해 형성)을 갖거나 해독 증진 요소는 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 한랭 쇼크 유도 프로모터 및 5'-UTR 서열 사이에 삽입된다. 이 해독 증진 요소는 개시 코돈 및 개시 코돈으로부터 하류 4번째 내지 7번째 코돈에 AT 풍부 서열을 포함하여 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 해독 인-플레임 융합을 형성한다.
본 발명자들은 AT 풍부 서열이 해독 개시 단계에서 해독을 증진시킨다는 것을 발견하게 되었다. 개시 코돈 하류의 2차 구조를 갖지 않는 AT 풍부 서열은 리보솜 엔트리를 증진시켜 해독 개시의 효율을 증진시키고 반응을 연장시킬 수 있다고 제안되었다. 결국 mRNA 안정성을 증가시켜 최종적으로는 폴리펩티드/단백질 생산을 증가시키게 된다. A 또는 A/T이 풍부한 메신저 RNA는 비구조성이고 이 용이하게 변성되는 mRNA는 리보솜에 효과적으로 조절되어 해독 개시 및/또는 조기 신장에 유리하다고 제안되었다.
용어 "이종 폴리펩티드"는 자연적으로 발생된 숙주 세포에서 한랭 쇼크 유도 프로모터로부터 비자연적으로 발현된 어느 폴리펩티드를 의미한다. 따라서 "이종 폴리펩티드"는 이 프로모터로부터 자연발생적으로 발현된 것이 아닌 한, 한랭 쇼크 유도 프로모터 및 5'UTR와 동일한 소스, 예를 들면,E. coli로부터의 폴리펩티드일 수 있고, 바람직하게 이 폴리펩티드는 한랭 쇼크 유도 프로모터 및 5'-UTR의 소스와 상이한 소스, 예로서 인간과 같은 비-E. coli소스에서 자연적으로 발생된다.
DNA 분자는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 "작동가능하게 연결된", 전사 및 해독 조절 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 한, 이종 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드를 발현시킬 있는 것으로 언급된다. 작동가능한 연결은 조절 DNA 서열 및 발현시키고자 하는 DNA 서열이 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 결합이다. 통상 유전자 발현을 요구되는 조절 부위는 프로모터 부위 및, RNA으로 전사될 때 단백질 합성의 개시를 시그날링 하는 DNA 서열을 포함한다. 그러한 부위는 전사 및 해독의 개시에 관여하는 5'-비-코딩 서열을 통상 포함할 것이다.
프로모터가 DNA 서열의 전사에 작용할 수 있다면 DNA 서열에 작동가능하게 연결될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바, "프로모터 서열"은 DNA상에서 발견되고 RNA 폴리머라제에 의해 전사되는 프로모터 서열이다. 따라서, 이종 폴리펩티드를 발현시키기 위해서는 숙주 세포에 의해 인식되는 전사 및 해독 시그날이 필요하다.
용어 "한랭 쇼크"는 숙주 세포를 인큐베이션/성장 온도를 정상 생리학적 성장 온도보다 적어도 약 13℃ 낮게 강하시키는 것을 의미한다.
뉴클레오티드 서열에 사용되는 용어 "AT-풍부"는 AT 염기 함량이 적어도 70%인 것을 의미한다.
한랭 쇼크 유도 프로모터 및 5'UTR 서열은 바람직하게E. colicspA, cspB, cspG 또는 cspI 유전자로부터의 한랭 쇼크 유도 프로모터 및 5'-UTR 서열중 하나이다. 상기E. coli한랭 쇼크 단백질의 프로모터 및 5'-UTR 부위 및 코딩 및 3'-UTR 부위의 뉴클레오티드 서열을 하기와 같이 표시한다: 코딩된 CspA 아미노산 서열로서 서열번호:2와 함께 서열번호:1 (cspA), 코딩된 CspB 아미노산 서열로서 서열번호:4와 함께 서열번호:3 (cspB), 코딩된 CspG 아미노산 서열로서 서열번호:6와 함께 서열번호:5 (cspG), 코딩된 CspI 아미노산 서열로서 서열번호:8와 함께 서열번호:7 (cspI). 서열은 또한 NCBI GenBank 데이타베이스로부터 수탁번호 AE000252 (CspB 및 CspI), AE000433 (CspA), 및 AE000201 (CspG)하에 사용할 수 있다. cspA, cspB, cspG, 및 cspI의 프로모터 및 5'-UTR 부위 서열은 각각 서열번호:1의 뉴클레오티드 22-441, 서열번호:3의 뉴클레오티드 11-214, 서열번호:5의 뉴클레오티드 12-213, 및 서열번호:7의 뉴클레오티드 11-201과 일치하고 이는 도 13에 배열로 나타낸다.
본 분야의 기술자는 이해하는 바와 같이, 본 발명의 DNA 분자로 사용하기 위한 한랭 쇼크 유도 프로모터 및 5'-UTR은 한랭 쇼크 유도 조건하에 발현 및 해독을효율적으로 시킬 수 있는 능력을 유지하는 한, cspA, cspB, cspG 또는cspI중 어느 하나의 프로모터 및 5'-UTR 서열의 단편 또는 변이체일 수 있다. 특정 서열이 결실, 치환 또는 삽입된 단편 및 변이체 또한 본 발명에 포함시키고자 하며 가이던스는 실시예에서 제공된다.
본 발명의 바람직한 일례는 해독 증진 요소로서 작용하는 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 4번째 내지 7번째 코돈에 이미 존재하고 있는 AT 풍부 서열에 있다. 이 AT 풍부 서열은 이종 폴리펩티드를 코딩하는 자연적으로 발생된 뉴클레오티드 서열에 존재하거나, 즉, 부위특이 돌연변이 기술에 의해 코딩 서열내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 4번째 내지 7번째 코돈 부위의 AT 함량은 각 코돈의 3번째 염기가 G 또는 C인 경우 A 또는 T로 대체하여 증가시킬 수 있다. 이는 코돈의 유용성을 변성시키기 때문에 이 부위의 아미노산 서열을 변형시키지 않고 수행될 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 일례는 첫번째 코돈은 개시 코돈이고 4번째 내지 7번째 코돈은 AT 풍부 서열을 형성하는 7개의 코돈의 뉴클레오티드 서열로 구성된 해독 증진 요소에 의해 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 한랭 쇼크 유도 프로모터 및 5'-UTR 서열에 있다. 그러한 해독 증진 요소의 한 예는 실시예 3에 기술된 pColdII 벡터의 NdeI 부위내로 클로닝시켜 형성될 수 있는 서열번호 9:의 뉴클레오티드 1-18의 뉴클레오티드 서열이다.
바람직하게, 본 발명의 DNA 분자는 또한 3'-UTR 서열, 예로서 cspA, cspB, cspG, 또는 cspI중 어느 하나로부터의 3'-UTR을 포함한다. 특히 바람직한 3'-UTR의예는 서열번호:1의 뉴클레오티드 442-539 또는 그의 단편을 포함하는 cspA 3'-UTR이다.
또다른 일례로, 본 발명의 DNA 분자는 임의로 한랭 쇼크 유도 프로모터의 전사 개시 부위로부터 하류에 바로 인접하게 서열번호:10의 뉴클레오티드 서열과 같은 lacI 오퍼레이터 서열을 포함할 수 있다. 비-유동성 조건하에서 낮은 발현 수준(a leaky low level)하에서도 이종 폴리펩티드가 정상 생리학적 온도에서의 숙주 세포의 성장에 대하여 독성을 나타내는 경우 lacI 오퍼레이터를 사용하여 문제들을 해결할 수 있다. 이러한 방식으로 이종 단백질은 한랭 쇼크 및 IPTG 존재하에서도 생산될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직하게, 벡터는 자가 복제하고 한랭 쇼크 반응을 유도하는 조건하에서 숙주 세포에서 이종 폴리펩티드의 발현을 시킨다. 본 발명의 벡터의 바람직한 예는 실시예 3에 기술된 pColdI, pColdII, 및 pColdIII 벡터이다. 이들 3개의 벡터 모두 동일한 pUC19 골격(HindIII 및 EcoRI에서 절단되고 Klenow으로 충진됨)을 갖지만 삽입 서열과는 상이하다. 도 12A-12C는 각각 pColdI, II, 및 III에 대한 삽입 서열을 나타낸다.
본 발명의 또다른 일면에서 본 발명에 따른 DNA 분자 또는 벡터로 형질전환된 원핵 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게, 숙주 세포는에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)이다. 본 명세서 실시예 4에서 논의된 바와 같이 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 활성 (pnp-)이 결여된 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 (pnpase) 돌연변이 또는 70s 리보솜 서브유니트를 제외한 유리 30s 리보솜 서브유니트과 결합한 15 kDa RbfA 단백질이 결여된 rbfA 돌연변이(rbfA-)가 바람직하다. 본 발명의 숙주 세포의 또다른 바람직한 예는 pnp-및 rbfA-모두 인 숙주세포이다. 추가의 예는 CsdA RNA 헬리카제 활성 (csdA-)이 결여된 csdA RNA 헬리카제 돌연변이인 숙주 세포 및 숙주 세포에서 CsdA RNA 헬리카제를 과잉발현시키는 벡터로 공-형질전환된 숙주세포를 포함한다. 이들 csdA-또는 CsdA 과잉발현 숙주 세포는 바람직하게 pnp-및/또는 rbfA-이다.
본 발명의 추가의 일면은 제한하는 것은 아니지만, 치료제 또는 표적으로서 유용한 인간 단백질과 같이 의학적으로 중요한 단백질, 열변성되기 쉬운 단백질, 표지된 단백질 및 NMR 연구에서 사용하기 위한 단백질을 포함하는 이종 폴립펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 DNA 분자 또는 벡터를 포함하는 본 발명의 숙주 세포를 숙주 세포의 정상 생리학적 성장 온도에서 영양 배지중에서 배양한 후 배양된 숙주 세포를
인큐베이션 온도를 숙주 세포의 정상 생리학적 성장 온도보다 적어도 13℃ 낮게 강하시켜 배양된 숙주 세포를 한랭 쇼크시켜 이종 폴리펩티드의 생산을 유도하는 것으로 포함한다. 한랭 쇼크받은 숙주 세포를 강하된 한랭 쇼크 온도에서 유지시켜 생산기동안 이종 폴리펩티드을 생산할 수 있도록 유도한다. 이어서 생산된 이종 폴리펩티드를 회수한다. 또다른 일례에서, 인큐베이션 온도를 숙주 세포의 정상 생리학적 성장 온도보다 적어도 20℃ 낮은 온도로 강하시킨다.
본 발명의 방법은 하기와 같은 장점을 갖는다:
1. 단백질 유도가 온도 강하에 의해 수행되기 때문에, IPTG와 같은 화학물질이 필요하지 않다.
2. 한랭 쇼크시, 세포는 관심의 대상이 되는 단일 단백질을 위한 단백질-합성 기관으로 전환된다. 모든 세포 리보솜이 벡터에서 클론된 단백질에 대하 mRNA로 차단되기 때문에 모든 다른 단백질의 합성은 세포세어 실질적으로 차단된다.
3. 따라서, 한랭 쇼크후 배지를 교환하여(예를 들면,12C-글루코스/14NH4Cl-염기 배지를13C-글루코스/15NH4Cl-염기 배지로 교환),13C,15N-동위원소 표지 샘풀에 대한 정제 과정을 생략하고 단지 관심의 대상이 되는 단백질만을 동위원소로 표지할 수 있다.
4. 분자량이 20 kDa인 단백질을 생산하는 경우(총 세포 단백질중 60% 수준, 이 단백질은 한랭 쇼크시 새로 합성된 것이라는 것에 주목), 1리터당 단백질의 총 수율은 대략 20mg이다. 단, 이 단백질중 80%가 (초음파 분해 후 원심분리에 의해 세포 조각 및 막 분획을 제거시킴)로부터 제조된 세포 분해물 또는 4ml 완충액중 세포 현탁액을 사용하여 가용 형태로 생산된 경우, 관심의 대상이 되는 단백질 용액 25 mg/ml 또는 1.25 mM을 수득할 수 있고, 이는 NMR 스페그럼에 직접 사용할 수 있다.
5. NMR 분광분석은 1ml 미만을 사용하여 수행되기 때문에 배양 크기는 250 ml로 감소시킬 수 있고, 이로써 값비싼13C-글루코스 및15N-NH4Cl[또는 (15NH4)2SO4]의 사용을 1/4로 줄일 수 있다. 또한, 제안된 조건하에서 한랭 쇼크시 세포가 성장할 수 없기 때문에 전체 탄소 이용도는 성장 세포의 것보다 훨씬 적어야 한다. 따라서, 배지내 클루코스의 농도는13C-글루코스 (0.2%)에 통상 사용되는 농도보다 적을 수 있다. 이는 값비싼13C-글루코스의 소비를 줄일 수 있다.
6. 일부 단백질은 열변성되기 매우 쉽다. 특히, 통상 저온 환경에서 사는 유기체(예:Caenorhabditis elegans)로부터E.coli의 단백질을 발현시키는 것은 고온에서 발현시키는 것은 문제가 된다. 제안된 한랭-쇼크-벡터-숙주 시스템을 통해 본 문제는 해결된다.
7. T7 벡터 시스템으로 몇몇 단백질 발현이 높을 수 있지만, 단백질 폴딩 문제, 및 전사 및 해독 조절 때문에 다른 단백질 발현은 제안된 한랭-쇼크-벡터-시스템으로만 수행될 수 있다. 이는 인간으로부터 박테리아까지의 아주 많은 유전자들이 이용가능하게 됨에 따라서 더욱더 명확해졌다.
8. 의학적으로 더욱더 중요한 인간 단백질이 확인되었기 때문에, 이들 단백질을 가용 형태로 다량 발현시키는 것이 중요하다. 본 발명의 한랭-쇼크 벡터 시스템은 통상의 T7 발현 시스템에 대한 대체 또는 보충 시스템이다.
본 분야의 기술자는 이해하는 바와 같이, 본 발명의 이종 폴리펩티드를 생산하는 방법을 사용하여 일반적으로 숙주 세포에서 무시할만한 양으로 발견되는 동위원소인13C 또는15N로 표지된 화합물과 같은 검출가능하게 표지된 화합물을 혼입시킨다. 검출가능하게 표지된 화합물이 예를 들면, NMR 분광 분석을 위해 본 발명에 의해 생산된 이종 폴리펩티드로 도입하기에 바람직한 경우 영양 배지를 이종 폴리펩티드를 검출가능하게 표지하기 위한 화합물을 포함하는 배지로 교환/대체한다. 검출가능하게 표지된 화합물은 바람직하게15NH4Cl, (15NH4)2SO4,13C-글루코스,15N로 표지된 아미노산 잔기,13C로 표지된 아미노산 잔기, 또는15N 및13C 모두로 표지된 아미노산 잔기이다.15NH4Cl, (15NH4)2SO4, 및13C-글루코스는 모든 생산된 이종 폴리펩티드에 비특이성 표지를 제공하는 반면,15N 및/또는13C로 표지된 아미노산 잔기, 즉, Glu는 특정 아미노산 잔기에 상응하는 이종 폴리펩티드내 잔기 위치에 특이적인 표지를 제공한다.
본 명세서에서 제시한 실시예 5에서 단백질을 정제하지 않고 세포 분해물 상등액을 NMR 분광분석에 사용하기 적절한 이종 폴립펩티드(EnvZ의 ATP-결합 영역)의 생산이 입증되었다. 실시예 5에서 숙주 세포로서 사용된E. coliB 균주 BL21은 주요 한랭 쇼크 단백질중 어느 것, 예로서 CspA이 결여된 돌연변이는 아니다. 그러나, NMR 분광분석에서 표지된 주요 한랭 쇼크 단백질의 존재에 의해 유발되는 배경 잡음이 적은 것이 바람직한 경우, 하나 이상의 주요 한랭 쇼크 단백질이 결여된 돌연변이 숙주 세포, 바람직하게 CspA 또는 CspA 및 또다른 한랭 쇼크 단백질의 조합물이 결여된 돌연변이 숙주 세포, 예로서, 4부 돌연변이 △cspA△cspB△cspG△cspE,가 대신 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 이종 폴리펩티드의 NMR 스펙트럼을 수득하는 방법을 제공한다. 본 발명은 영양 배지에서 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 한랭 쇼크에 반응하여 이종 폴리펩티드를 발현시키고 생산할 수 있는 핵산으로 형질전환된 원핵 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 이어서 배양된 숙주 세포를 인큐베이션 온도를 숙주 세포의 정상 생리학적 성장 온도보다 낮은 온도로 강하시켜 한랭 쇼크시킴으로써 이종 폴리펩티드의 생산을 유도한다. 한랭 쇼크후, 영양 배지를 이종 폴리펩티드를 검출가능하게 표지하기 위한 화합물을 포함하는 배지로 교환/대체한다. 한랭 쇼크받은 숙주 세포를 강하된 한랭 쇼크 온도에서 인큐베이션시켜 화합물로 검출가능하게 표지된 이종 폴리펩티드를 생산한후 분리한다. NMR 분광분석은 분리된 한랭 쇼크받은 숙주 세포 (전체 세포 NMR 분광분석) 또는 분리된 한랭 쇼크받은 숙주 세포의 세포 분해물 상등액에서 수행하여 이종 폴리펩티드의 NMR 스펙트럼을 수득한다.
통상적으로 본 발명을 기술한 바, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니라 설명하기 위하여 제공되는 하기의 실시예를 참고로 하여 본 발명은 더욱 용이하게 이해될 것이다.
프로토타입 벡터의 작제
오리지날 플라스미드를NdeI로 분해한 후 Klenow로 충진시켜NdeI 부위가 결여된 pUC19 벡터 (New England BioLabs, Beverly, MA)를 제조한 후 결찰물을 제조하였다. T7/cspA프로모터, CspA의 5'-UTR 부위, 및 그의 코딩 부위를 포함하는 PCR 산물을 pUC19NdeI 플라스미드EcoRI 및HindIII 부위에서 클로닝하였다. 이 두개의 제한 부위를 Klenow 충진에 의해 결실시켰다. 부위특이 돌연변이 기술에 의해 cspA종결 코돈 바로 인접하게SalI 및BamHI 부위를 제조하였다.
6개의 His-tag, 프로테아제 절단에 대한 인자-Xa 부위, 및NdeI,HindIII, 및KpnI를 포함하는 멀티플 콜로닝 부위 및cspA의 3' 부위를 포함하는 두번째 단편을 합성하고 벡터로 클로닝하였다. 프로토타입 플라스미드 벡터의 지도를 도 1에 나타낸다.
사에노햅디티스 엘레강스( Caenorhabditis elegans )로부터의 단백질 클로닝 및 발현
일부 단백질은 열변성되기 매우 쉽다. 특히, 통상 저온 환경에서 사는 유기체(예:C. elegans)로부터E.coli의 단백질을 발현시키는 것은 고온에서 발현시키는 것은 문제가 된다. 5개의C. elegans단백질을 선택하고 pET 벡터에서 클로닝되고 37℃에서는 잘 발현되지 않는 것을 Dr. G. Montelione에 의해 제공받았다 (WR49, WR35, WR26, WR27, 및 WR53로 표시, GENEbank 수탁번호: 각각 AV185320, AV183398, C50788, D71923 및 C48848(도 2A). 이들 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 인서트를 도 1에 기술된 한랭 쇼크 벡터에서 서브클로닝시켰다. 세포들을37℃에서 0.5의 OD600nm으로 배양하고 15℃로 이동시키고 1 mM IPTG (이소프로필 b-D 티오갈락토피라노시드, T7 프로모터를 유도하기 위하여)로 유도하고, 샘플을 0, 12 및 24h째 제거하고 단백질 발현을 SDS-PAGE로 분석하였다. 도 2A는 1mM IPTG를 사용하여 3h동안 유도시킨 후의 pET 벡터를 사용한 37℃에서의 모든 단백질의 발현 수준을 나타내고, 도 2B는 각 한랭-쇼크 벡터를 사용한 15℃에서의 이들의 발현을 나타낸다. 단백질 WR49 및 WR35는 pE발현 벡터을 사용한 경우 37℃에서는 전혀 발현될 수 없었다(각각 도 2A중 레인 2 및 4). 단백질 WR26의 발현은 불충분하였다(레인 6, 도 2A). 한랭 쇼크 벡터를 사용한 경우 이들 3개의 단백질 모두 15℃에서 다량 발현되었다. 한랭 쇼크 벡터를 사용한 경우 단백질 WR27 및 WR53의 발현 또한 현저히 높았다. 한랭-쇼크 벡터을 사용하여 통상의 벡터로는 잘 발현될 수 없었던 인간 단백질을 성공적으로 발현시킬 수 있다.
C . elegans 단백질 생산의 시간 프로파일
이후, 한랭-쇼크 벡터을 사용하여 단백질 생산의 시간 프로파일을 조사하였다. 통상의 T7 벡터를 사용한 경우 37℃에서는 전혀 발현될 수 없거나 매우 불충분하게 발현될 수 있는 WR49, WR35 및 WR26 단백질을 선택하였다(도 2A). 각 플라스밈드를 포함하는 세포들을 37℃에서 0.5의 OD600nm으로 배양하고 15℃로 이동시키고 1 mM IPTG로 유도하고, 샘플을 0-120h동안 24h 간격으로 제거하고 단백질 발현을 SDS-PAGE로 분석하였다. 도 3은 단백질 발현 수준을 나타낸다. 각 단백질의 발현은 3-4일내 나타났고, 그 이후로는 안정하게 유지되었다. 다음으로, 모든 다른세포 단백질의 발현은 현저히 감소하였고, 순도 약 85%의 관심의 대상이 되는 단백질이 생산되었다.
c spA 프로모터만을 포함하는 한랭 쇼크 벡터를 사용한 단백질 발현
본 발명자들의 특정 목적은 세포에서 90-95%의 해독율, 및 총 세포 단백질중 60-70% 이상의 단백질 수득율로 관심의 대상이 되는 단백질을 합성하는 것이다(여기에서, 세포 분해물 또는 직접 세포 현탁액을 직접 NMR 분광분석에 사용할 수 있다). NMR 분광분석 전에 CspA로부터의 관심의 대상이 되는 단백질을 분리 및 정제하여야 한다는 점에서 융합 단백질은 문제를 안고 있다. 그러므로, 본 발명자들은 실험을 통해 cspA코딩 부위는 포함하지 않고cspA프로모터를 포함하는 한랭-쇼크 벡터를 작제하였다. 벡터는 또한 cspA5'UTR 상류에lac오퍼레이터를 포함하여 관심의 대상이 되는 유전자를 IPTG에 의해 유도할 수 있다. 의학적 관점에서 중요한 단백질 γ-인터페론을 선택하였다.γ-인터페론을 코딩하는 유전자를 이 벡터에 클로닝하고 15℃에서의 생산을 상기 c.elegans단백질에 대하여 기술된 바와 같이 체크하였다. 도 4A는 37℃ 및 15℃에서의 γ-인터페론 단백질 발현을 나타낸다. cspA5'UTR은cspAmRNA의 불안정성의 원인이 되며 따라서 37℃에서의 발현은 부족하다는 사실과 일치하게 이 온도에서 어느 γ-인터페론 단백질도 관찰되지 않았다(레인 6). 한편, 15℃에서는 발현이 잘 되었다(레인 2-5). 그러나, 다른 세포 단백질은 37℃에서의 성장 결과로서 존재하는 것일 수 있다. 가능성을 체크하기 위하여 세포를 15℃에서 펄스-표지하였다. 표지 배지에서 세포를 대수기까징 배양하고 15℃로 이동시켰다. 1 분량의 배양액을 5 ml의35S-메티오닌을 사용하여 앞서 기술된 바와 같이 표지하였다(Xia et al., 2001). 비방사능성 메티오닌을 가하여 세포를 추적하였다. 세포를 20 mM 황산나트륨 완충액 (pH 7.0)으로 세척하고 100 ml SDS 샘플 완충액에 재현탁시켰다. 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. γ-인터페론가 세포 표지된 단백질중 90% 이상을 포함하는 것으로 밝혀졌다(도 4B, 레인 2). γ-인터페론은 한랭-쇼크 벡터을 사용하여 15℃에서도 거의 독점적으로 생산될 수 있음을 제안한다. 이러한 방법은 단백질을 정제하지 않고 전체 세포를 NMR 분광분석에 사용할 수 있도록 하는13C 및15N과 같은 동위원소로 단백질을 특이적으로 표지하는데 특히 유용할 것이다.
단백질 합성 개시를 돕는 mRNA 하류 cis -요소의 확인
본 한랭-쇼크 벡터 시스템을 추가로 개선시키기 위하여, 본 발명자들은 실험을 통해lacZ발현 시스템을 통해 분자 레퍼토리를 작제하여 단백질 합성 개시를 돕는 개시 코돈 하류의cis-요소를 조사하였다. 사용된 서열은 하기와 같았다: 5'- GGATCTAGAGGGTATTAATAATGACTGG TGCANNNNNNNNNNNN-lacZ-종결 시그날-3' (서열번호:11). 개시 코돈 및 랜던 삽입 서열을 밑줄로 표시한다. 이 서열을 IPTG-유도 pINIII 벡터에서 클로닝하고(Inouye, 1983) 플라스미드를 CL83 세포로 형질전환시켰다. 130개의 클론을 무작위로 선택하고 서열화하였다.
Miller의 방법에 따라(Miller, 1992) β-갈락토시다제 활성을 측정하여 130개의 클론중 57개를 선택하였다. 가장 흥미롭게도, β-갈락토시다제 활성 범위는1,500 내지 43,000 유니트이고, 이는 4번째 내지 7번 코돈의 코돈 부위는 유전자 발현에서 중요한 기능을 한다는 것을 암시한다. 고도한 효소 활성의 원인이 되는 어느 특정의 보존 서열이 존재하는 것은 아니지만(데이타로 제시하지 않음), 고도의 β-갈락토시다제 활성을 나타내는 클론에서 (A+T)/(A+T+G+C)의 비는 거의 70%였다(도 5).고도의lacZ발현을 나타내는 클론에서 가장 자주 사용되는 코돈은 Tyr, Thr, Leu 및 Ile과 같은 아미노산을 코딩하는 것이다. 고도한 β-갈락토시다제 활성을 갖는 4개의 클론을 선택하고 그 각각에 프레임-시프트를 돌연변이에 도입하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 종결 코돈을 도입시키는 2개의 돌연변이를 제외하고(표에서 밑줄로 표시) 어떤 돌연변이도lacZ발현에는 현저한 효능을 나타내지 않았다
표 1: β-갈락토시다제 활성에 대한 프레임 쉬프트 돌연변이에 대한 효과
따라서, 특정 코돈을 사용하는 것이lacZ발현에 대한 명확한 효능을 갖는 것은 아니다. 이는 높은 AT 함량이 발현을 증가시키는데 중요하다는 것을 증명한다. 따라서, 하류 박스의 해독 증진 효능은 16S RNA에 대하여 상보적인 서열보다는 그의 높은 AT(AU) 함량에 기인한다고 볼 수 있다. A/T-풍부 서열의 다소 덜 안정적인 2차 구조가 리보솜 개시의 수를 증가시킬 수 있기 때문에 개시 코돈 하류의 A/T-풍부 서열이E.coli에서 단백질 해독을 증진시킬 수 있다.
β-갈락토시다제 활성의 증가는 단백질 발현 증가에 기인한다.
57개의 상기 클론을 그의 단백질 프로파일 및 β-갈락토시다제 활성에 대하여 추가로 분석하였다. 각 플라스미드를 포함하는 세포를 37℃에서 0.5의 OD600nm으로 배양하고 1 mM IPTG로 유도시켰다. 단백질 발현은 SDS-PAGE로 분석하고 밴드 밀도는 밀도 측정 분석을 통해 측정하였다. β-갈락토시다제 활성은 상기 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, β-갈락토시다제 활성은 각 단백질 수준과 일치하였다. 본 발명자들은 β-갈락토시다제 활성의 증가는 단백질의 특성 활성 그 자체의 증가에 기인한다고 결론지었다.
증진된 해독 및 비 전사가 β-갈락토시다제 활성의 증가에 원인이 된다.
수득한 클론들은 그의 β-갈락토시다제 활성에 기초하여 범위가 (i) 43,000-35,000, (ii) 35,000-25,000, (iii) 25,000-10,000 및 (iv) 10,000 미만인 효소 유니트를 갖는 클론으로, 즉 4 그룹으로 구분할 수 있었다. 이들 4개 그룹을 대표하는 16개의 클론(각각 4개씩)을 선택하고 프라이머 신장에 의해lacZ에 상응한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 이들 클론에서lacZmRNA 수준을 체크하였다(Etchegaray et al., 1999). 도 7은 이들 클론에서의 β-갈락토시다제 활성, 단백질 수준 및lacZmRNA 수준을 나타낸다. 도 6에서 입증된 것과 유사하게, β-갈락토시다제 활성은 단백질 수준과 일치하였다. 그러나, 높은 수준 및 낮은 수준의 β-갈락토시다제 활성을 나타내는 클론을 유사한 수준의lacZmRNA을 나타내었고, 이는 β-갈락토시다제 활성의 증가는 전사의 상향조절에 기인하는 것이 아니라는 것을 언급한다. 따라서, 본 발명자들은 이것은 해독 증진 결과라고 결론지었다.
개시 코돈 하류의 A/T (A/U)-풍부 요소가 해독 개시를 증진시킨다
다음으로, 본 발명자들은 실험을 통해 해독 개시 또는 신장이 이 효능의 원인이 되는지를 조사하였다. 최고 및 최저 활성을 나타내는 두개의 클론을 선택하였따. 그의 서열, 서열번호:14 및 서열번호:26을 도 8에 나타낸다. β-갈락토시다제 활성이 42,440 유니트인 클론은 개시코돈 하류에 A/T-풍부 서열, ATTTATATATAT (서열번호:14)을 포함한 반면 β-갈락토시다제 활성이 4410 유니트인 클론은 상응하는 G/C-풍부 서열, CGGTCTCTCCGC (서열번호:26)을 포함하였다. 이들 두개의 클론의 리보솜 프로파일을 조사하였다. 리보솜을 제조하고 앞서 기술된 바와 같이 분별화시켰다(Etchegaray et al., 1996 and Xia et al., 2001). 프라이머 신장을 수행하여 폴리좀 및 70S, 50S 또는 30S 리보솜에서의lacZmRNA의 분포를 조사하였다.ompAmRNA 수준은 음성 대조군으로서 조사하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 활성이 증가된 클론은 β-갈락토시다제 활성이 저하된 클론과 비교하여 수크로스 구배에서폴리좀 및 70S 분획에서lacZ의ompAmRNA에 대한 비가 더욱 높게 나타났다. 이는 β-갈락토시다제 활성 증가는 A/T-풍부 서열에 의해 매개되는 해독 개시의 증가에 의한 것임을 제안한다.
실시예 2
LACE 효과의 원인이 되는 c spA mRNA중 해독 cis 요소의 확인
cspAmRNA는 LACE 효과에 가장 중요하게 작용하는 것으로 판단되는 159-염기 5'UTR (비해독 부위)를 포함한다. 본 발명자들은 실험을 통해 LACE 효과는 cspAmRNA에 의해 모든 세포 작용 리보솜을 차단하여 모든 다른 세포 mRNA가 해독을 위한 개시 복합체를 형성하지 못하도록 하므로써 유발된다. 모든 다른 mRNA가 30S 리보솜과 상호작용하지 못하도록 하는 cspAmRNA의 능력은 리보솜과 개시 복합체를 형성하는 그의 고도로 유효한 능력에 기인하는 것으로 추측된다.
원핵 생물에는 해독 개시를 위해 중요한 적어도 2개의 요소가 존재한다: 하나는 리보솜 결합 서열로 Shine-Dalgarano 서열 (SD)로 명명되며, 다른 하나는 개시 코돈 AUG이다. 또한, 해독 개시를 증진시키는 다수의 다른 요소가 보고되었다(Gold et al., 1988). 예를 들면, Epsilon로 명명되는 SD 서열 상류에 해독-증진 요소가 존재한다고 보고되었다(Olins et al., 1989). '하류 박스'로 명명되는 개시 코돈의 하류에 요소가 존재한다고 논의되고 있다(Etchegaray et al., 1999a and 1999b; O'Connor et al. 1999). 또한, 중요하게는 5'UTR의 2차 구조가 해독 개시의 조절에 관여하고 있음을 중시하고 있다. 특히 SD 서열에서 또는 그 주변에서 2차 구조를 형성하는 것이 개시 복합체를 형성하는 것을 저해한다(Yamanaka et al.,1999).
세포내 박테리아 mRNA의 안정성이 유전자 발현 조절에 있어서 또다른 중요한 인자이다. 특히, 특별히 긴 5'-UTR을 포함하는 cspAmRNA와 같은 mRNAs는 통상 엔도뉴클레아제가 개시(attack)되기 더욱 쉽다. 실제로, cspAmRNA는 고온에서 고도로 불안정하다. 37℃에서 그의 반감기는 단지 12초 미만이고, 이러한 불안정성은 SD 서열 상류에 바로 인접한 AU-풍부 서열에 기인하는 것으로 나타났다. 이 부위에서의 염기 치환 돌연변이는 cspAmRNA를 현저히 안정화시켜 37℃에서 CspA 생산을 구성하는 것으로 나타났다(Fang et al., 1998). 해독 개시 증진에 필수적인 cspA5'-UTR 요소가 확인될 것이다. 이러한 분석을 통해 해독 개시율을 추가로 개선시킬 수 있다. 하기 접근법을 취할 것이다.
(i) 해독 개시율을 평가하는 시스템 개발
LACE 효과는 cspAmRNA의 고도로 효과적인 해독 개시 능력에 의해 유발되는 것으로 증명되었다(Xia et al., 2001). LACE 효과를 (a) 15℃에서의 클론을 포함하는 세포의 콜로니 형성에 대한 클론의 항생 효능, (b)SDS-PAGE에 의해 분석될 수 있는 15℃에서 총 세포 단백질로의 [35S]메티오닌 혼입에 대한 클론의 효능, 및 (c) LACE-유발 클론을 포함하는 세포의 성장 곡선에 의해 정의한다.
각 클론에서의 LACE 효과의 세기를 평가하기 위하여, LACE 효과를 측량적으로 측정한. 예를 들면, cspA유전자에서 2, 11, 및 31번째 코돈에 각각 무의미 코돈을 삽입하여 초기에 작제된 pA01S, pA10S pA30S의 경우에 있어, 본 발명자들의실험을 통해 15℃에서 콜로니 형성은 완전히 저해되었고, 한랭 쇼크후 세포 단백질내로 [35S]메티오닌 혼입은 거의 완전하게 저해된 것으로 나타났다. 그러나, 콜로닝 형성 및 단백질 합성을 고온에서 측정한다면 LACE 효과의 효력에 의해이들 3개의 클론을 평가할 수 있다. 엄격한 LACE 효과를 수반하는 이들 클론은 20℃ 또는 25℃에서 유효한 LACE 효과를 계속하여 보유하는 반면, 약한 LACE 효과를 수반하는 것은 20℃에서 콜로니를 형성할 수 있고 이 온도에서 단백질 합성을 관찰할 수 있을 것이다. 따라서, 단순한 플레이팅 방법을 통해 각 LACE-유발 클론의 효능을 평가할 수 있다. 실험실의 본 발명자들은 실험실에서 사용가능한 LACE-유발 클론, pA01S, pA10S, 및 pA30S를 사용하여 이 방법을 시험할 것이다 (Xia et al., 2001). 이들 플라스미드를 포함하는 세포를 4개의 LB 아가 플레이트상에 플레이팅하고 37, 25, 20 및 15℃에서 각각 인큐베이션시켰다. LACE 효과 세기를 고온에서의 콜로니 형성 저해를 조사하고, 주어진 온도에서의 콜로니 크기에 의해 분류하였다. 이어서 [35S]메티오닌 혼입 및 성장 곡선에 의해 상이한 온도에서의 LACE 효과를 확인할 것이다. 이들 방법중 어느 하나에 의해 작제된 각개 클론에 대한 LACE 효과에 대하 평가 결과는 유사할 수 있다. 그러나, 세개중 가장 단순한 방법은 플레이팅이므로, 다른 것과 같이 유효하다고 입증된다며 이 방법이 사용될 것이다.
(ii) c spA mRNA의 5'-UTR 분석
주어진 RNA의 2차 구조는 여러 상이한 방식으로 도시화될 수 있고, 특히 세포내 하나의 mRNA에 의해 가정되는 정확한 2차 구조를 결정하기는 어렵다. 그럼에도 불구하고, 가능한 mRNA의 2차 구조를 예측하기 위하여 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있다. 도 9는 RNA 폴딩에 대한 Zuker 프로그램(버전 3.1, www.bioinfo.math.rpi.edu)을 사용한 컴퓨터 분석에 의한 cspAmRNA의 5'-UTR의 가장 안정적인 2차 구조를 나타낸다. I 내지 VI의 6개의 2차 구조가 존재하고 그의 안정성은 각각 -7.0, -14.8, -2.1, -8.3, 2.7, 1.5 Kcal로 산출되었다. VII로 표시된 2차 구조는 3' 말단에서 형성된 것이고 ρ-독립 전사 종력자인 것으로 판단된다.
이들 6개의 2차 구조중, 구조 I은 cspAmRNA의 안정성에 중요한 한랭 박스로 알려져 있고; 따라서, 제거될 수 없다. 다른 구조 II 내지 V의 기능을 연구하기 위한 본 접근법에서,cspA코딩 서열중 31번째 위치에 무의미 코돈을 갖는 pA30S를 사용하여 LACE 효과에 대한 결실 효과를 조사하기 위하여 하나씩 차례로 결실시킬 것이다(Xia et al., 2001). 결실에 대한 효능이 발견되면, 특히 구조 II의 경우에 이 거대 구조는 추가로 작은 단편으로 분할될 것이다. 스템 부위는 도 9에 나타낸 바와 같이, 추가로 3부, IIa, IIb 및 IIc로 분할될 수 있다. 하기 결실물이 작제될 것이다; △IIa, △IIb, △IIc, △IIb△IIc, △IIa△IIb, 및 △IIa△IIc. 섹션(i)에서 개발된 플레이팅 방법을 사용하여 pA30S의 결실물의 LACE 효과에 대하여 조사할 것이다.
구조 IV의 기능
이 부위는 초기에 해독능에서 중요한 기능을 하는 것으로 나타났다(Yamanaka et al., 1999). 본 발명자들은 실험을 통해cspA,cspB,cspG및cspI에서 고도로보존되고 SD 서열 상류로부터 11 염기에 위치하는 상류 박스로 명명되는 13-염기 서열(염기 123 내지 135: UB 서열)이 SD 서열외에 cspAmRNA의 해독능에 관여하는 또다른cis요소일 수 있다고 보고하였다(Xia et al., 2001 and Yamanaka et al., 1999). 구조내에서 더 작은 부위를 결실시키고 염기 치환하여 추가로 구조를 분할하므로써 이 구조의 정확한 필요물을 조사할 것이다.
구조 V의 기능
또한, 흥미롭게도 the 박테리오파지 T7내 유전자의 해독을 증진시키는 것으로 제안된 바 있는 "Epsilon"로 명명되는 SD 서열 상류에cis-요소가 존재한다고 주시되었다(Olins et al. 1989). Epsilon 서열, UUAACUUUA (서열번호:27)은 본래 박테리오파지 T7 유전자 10 리더 부위에서 발견되었다. 16S rRNA에 상보성이 확장될 때 epsilon는 인핸서로부터 독립적인 해독 개시자로 전환된다고 보고되었다. Epsilon는 16S rRNA에 상보적인 자연발생 9-뉴클레오티드 및 개신 코돈으로부터 16-뉴클레오티드 떨어진 위치에서 해독 개시자로서 최대 활성을 보였다고 나타났다. 이러한 조건하에서 그 효능은 보존 공통 Shine-Dalgarno 서열의 것과 견줄할 하였다(Golshani et al., 2000). 구조 V의 서열은 Epsilon의 것과 유사하다(도 9, 10A 및 10B).
우선, SD 서열 (AAGG) 상류에 바로 인접하게 위치한 10-염기 서열, UUAAUUAUUA (서열번호:28의 뉴클레오티드 16-25)의 LACE 효과에 대한 효능을 조사하였다. 이 Epsilon-양 서열은 단지 A 및 U 잔기로만 구성된다. 다양한 결실 돌연변이(도 10A에서 돌연변이 1, 2, 9, 10 및 11) 및 치환 돌연변이(돌연변이 3 내지8)를 작제할 것이다. 이들 돌연변이들의 LACE 효과에 대한 효능이 Epsilon 서열에 대하여 제안된 바와 같은 이 요소내 유일한 서열 필요물이 존재하는지를 밝혀낼 것이다. 본 발명자들은 실험에서 10-염기 서열이 해독을 증진(또는 LACE 효과)시키는데 있어 중요한 기능을 갖는지를 입증할 수 있다면, 서열은 SD 서열 없이도 그 스스로 해독을 개시할 수 있는지에 대하여 조사될 것이다. 이러한 목적을 위해, AACC로 돌연변이화하여(도 10B에서 돌연변이 12) cspASD 서열 (AAGG)을 제거할 것이다. 돌연변이 12가 LACE 효과에 작용한다면, 10-염기 서열을 결실시켜 이 부위가 실제 리보솜 결합에 필요한 것임을 확인할 수 있다(돌연변이 13). 연속하여, Epsilon-양 서열 및 개시 코돈 사이의 거리에 대한 필요조건은 돌연변이 14, 15 and 16에 나타낸 바와 같은 결실 돌연변이에 의해 결정할 것이다.
소위 Epsilon 서열은 어떤 서열 특이성도 없이 그의 AU-풍부에 기인하여 작용한다. 이러한 이유에서, 본 발명자들은 실험을 통해 현 길이가 10-염기인 AU 서열을 13-, 14- 및 16- 염기인 AU 서열로 스크램블(scrable) 또는 신장시켜 LACE 효과에 대한 그의 효능을 조사할 것이다. AU-풍부 서열이 실질적으로 해독을 증진시킬 수 있다면 , 폴리솜 패턴을 야생형cspARNA, 돌연변이 1(도 10A) 및 돌연변이 12 (도 10B)과 비교하므로써 LACE 효과는 세포 리보솜을 차단하므로써 유발된다는 것을 확인하게 될 것이다.
cspA프로모터, 5' UTR 및lacZ유전자에 융합된 13번째 코돈까지의cspA의 코딩 부위를 포함하는 이미 작제된 pAlacZ를 사용하여 해독 증진에 있어 구조 V의 기능을 확인할 것이다. pAlacZ벡터를 사용하여 상기 기술된 것과 유사한 결실 및치환 돌연변이를 제조할 것이다. cspA세포를 형질전환용 숙주로서 사용하여 염색체 유전자로로부터 생산된cspA의 효능이 자가조절되는 것을 막고, 이 플라스미드로부터 발현된cspA의 수준을 β-갈락토시다제 분석에 의해 조사할 것이다. 이 실험을 통해 해독 개시에 있어 구조 V의 정확한 기능을 결정할 것이다.
실시예 3
한랭-쇼크 벡터의 작제
3가지 형태의 한랭-쇼크 벡터를 작제할 것이다. 첫번째 형태, pColdI (도 11A)는 유전자의 코딩 부위가 CspA의 전 코딩 부위를 포함하는 융합 단백질로서 클로닝되는 벡터이다. 도 12A에 나타낸 바와 같은 서열번호:45는 pUC19의 둔화된(blunt) HindIII-EcoRI내 인서트로서 존재한다 (New England BioLabs, Beverly, MA). 두번째 벡터, pColdII (도 11B)는 관심의 대상이 되는 유전자의 코딩 부위가 7번째 Met 코돈에서 형성된 유일한NdeI 부위에서 7번째 코돈 후 클로닝되는 벡터이다(여기에서 코돈 1 내지 7은 MetAsnHisLysValHisMet (서열번호:50)이다). 이 추가의 서열은 cis-해독 증진 요소 (ATGAATCACAAAGTGCATATG; 서열번호:9,NdeI 부위는 밑줄로 표시)에 의해 코딩되며 이 서열을 포함하는 클로닝된 유전자 발현은 이 서열이 없는 클로닝보다 8-배 높게 나타났다(Etchegaray et al., 1999). 도 12B에 나타낸 서열번호:46은 pUC19의 둔화된 HindIII-EcoRI 부위내 인서트로서 존재한다. 세번째 형태 pColdIII (도 11C)는 코딩 부위가NdeI 부위를 사용하여 개시 코동에서 직접 클로닝되는 벡터이다. 이 벡터에서 도 12C에 나타낸 서열번호:47은 둔화된 HindIII-EcoRI 부위내 인서트로서 존재한다.
3가지 형태의 벡터, pColdI, pColdII, 및 pColdIII는 모두 cspA프로모터, cspA5'-UTR 부위 및 cspA3' 말단 전사 종결자 부위를 갖는 pUC19 갖는 골격을 갖는다는 점에서 일치한다. 이것외의 차이는 pColdI는cspA의 코딩 부위를 갖는 반면 pColdII는 AT 풍부 DB 서열을 갖는다는 점이다. pColdI내cspA의 코딩 부위를 포함시키므로써 그의 고유한 고도한 효율의 해독 개시 성질을 이용한다. 또한 N-말단의 cspA 영역의 폴딩은 MBP (말토스-결합 단백질)-융합 단백질의 경우에서 나타난 바와 같은 클로닝되는 유전자의 산물의 폴딩을 도울 수 있다고 볼 수 있다. 또한, 이 벡터로부터 생산된 산물을 Ni-NTA 칼럼에 의해 정제하고 N-말단 단편을 인자 X 절단에 의해 제거하는 방식으로 6-His 태그, 이어서NdeI 클로닝 부위 상류에 인자 Xa 절단 부위를 갖는 pColdI를 작제하였다.
pColdII 벡터를 사용하는 경우 6개의 아미노산 잔기, MetAsnHisLysValHis (서열번호 50에서 잔기 1-6)를 주어진 유전자의 개시 코돈 앞에 첨가한다는 점에 주목하는 것이 중요하다. 따라서, 각 경우에 있어 이 추가의 N-말단 신장부가 클로닝되 유전자 산물의 구조 및 기능에 영향을 주는지 여부를 체크하여야 한다. 이러한 추가 서열을 이용하여 이 서열에 대한 antisera를 개발할 수 있고, 산물의 동정 및 필요하다면 정제에 사용할 수 있다.
관심의 대상이 되는 유전자의NdeI-BamHI 단편은 동일한 리딩 프레임에서 클로닝될 수 있고, pCold 및 통상의 pET 벡터 사이에서 서로 교환가능한 방식으로 박싱으로 이 벡터들 모두를 고안한다. 관심의 대상이 되는 유전자가E.coli세포 성장에 대하여 독성인 경우 비록 낮은 수준으로 이 유전자가 leaky 발현되더라도 37℃에서 성장하는 동안 문제를 일으킬 수 있다. 이러한 이유에서, cspA전사 개시 부위 하류에 바로 인접한 위치에lacI오퍼레이터 서열, ATTGTGAGCGGATAACAATTGATGTG (서열번호:10)를 갖는 pColdI, pColdII 및 pColdIII를 작제하여 단지 IPTG 존재하의 저온에서도 클로닝된 유전자 발현을 유도할 수 있다. 이들 pCold 벡터를 각각 pColdIo, pColdIIo 및 pColdIIIo로 명명한다.
또한, 하기와 같이 더욱 고도한 한랭-소크 발현을 위한 가장 적절한 SD 서열 및 개시 코돈 하류의 서열(하류 박스)의 효능을 결정하기 위하여 시도될 것이다.
(i) SD 서열
cspAmRNA (AAGG)에서 발견된 SD 서열은 16S RNA의 3' 말단과 가장 상보적인 적절한 SD 서열과 비교하여 가장 적절한 SD 서열은 아니다. cspAmRNA중AGG를 삽입시켜 cspASD 부위를 더욱 장쇄의 공통 서열, 예를 들면, AAGGAGGU로 변형시키므로써 개선시킬 수 있다. SD 서열은 도 10A 및 10B에 나타낸 바와 같이 점돌연변이에 의해 염기를 염기로 바꿀 것이다. 마지막으로, 가장 적절한 SD 서열을 벡터에 대하여 결정될 것이다.
(ii) pColdIII내 AUG 하류 서열에 의한 해독-증진 효과
4번째 내지 7번째 코돈(12개의 염기 서열) 부위에 첨가된 램덤 서열 분석 시험으로부터 판단된 바 소위 하류 박스(DB) 효과는 실제로 해독 개시 효과에 대하여 작용한다. 실시예 1(도 5)에 나타낸 바와 같디, LACE 효과를 현저히 증진시키는 DB 서열은 기본적으로 AT-풍부 서열(본래 Sprengart 및 그의 동료에 의해 제안된 바와 같이(1996) 16S rRNA에 상보적인 서열은 아니다)로 구성된다. 흥미롭게도, 자기 자신의 개시 코돈으로부터 직접적으로 발현되는 경우에도 매우 고도한 수준으로 발현되는 γ-인터페론(도 4A 및 4B)은 이 부위에서 12개의 잔기중 9개의 A/T 잔기를 갖는다. pColdIII 벡터를 사용할 때, 각 코돈의 3번째 염기가 G 또는 C인 경우 그를 A 또는 T로 대체하여 코돈 4 내지 7 부위의 AT 함량을 증가시킬 수 있다. 이는 코돈의 유용성을 변성시키기 때문에 이 부위의 아미노산 서열을 변형시키지 않고 수행될 수 있다. 유전자가 pColdIII로 클로닝되면, 처음 7개 코돈에서의 AT 함량 변화가 각 클로의 유전자 산물 발현에 대하여 우수한 효과를 나타내는지를 조사할 것이다.
실시예 4
숙주 시스템 개선
상기 기술된 한랭-쇼크 벡터를 사용하여 발현되는 단백질을 최대 수득율로 수득하기 위하여, 본 발명자들은 숙주 시스템을 개선하고 저온에서의 성장 조건을 구축시키고자 하였다. 숙주 개선에 있어 중요하게 고려해야 할 사항은 (i) 클로닝되는 유전자에 대한 mRNA의 안정화, (ii) 한랭-쇼크 순응을 차단하기 위한 순응기의 연장 및 (iii) 해독 개시 및 단백질 합성을 증진시킬 수 있는 CsdA와 같은 한랭-쇼크 리보솜 인자의 생산 증가이다.
(i) 숙주 세포로서 pnp 결실 세포를 사용한 15℃에서 클로닝된 단백질 발현의 연장
한랭 쇼크시,E.coli세포 성장은 일시적으로 중단되고, 순응기동안 특정-한랭 쇼크 단백질은 고돌 유도된다. 순응기끝에 합성은 새로운 기본 수준으로 감소되는 반면, 비-한랭-쇼크 단백질 합성은 세포 성장을 재개시하는 것으로 간주된다. 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 (PNPase)는 한랭-쇼크-유도 엑소리보뉴클레아제이고 mRNA 분해에 관여하는 RNA degradosome 성분이다. 본 발명자들은 실험을 통해 PNPase는 순응기끝에 Csp 생산을 억제하기 위하여 필요한 것으로 나타났다. PNPase는 15℃에서cspmRNAs를 선택적으로 분해하는데 필수적인 것으로 밝혀졌다(Yamanaka et al., 2001).pnp돌연변이에서는 야생형 균주에서와 같이 한랭 쇼크시 Csps 유도가 정상적인 것으로 관찰된 반면; 그 생산은 더이상 자가조절되지 못하고 한랭-쇼크 처리를 통해 고수준으로 유지되었다. 이는 세포 성장을 개시(arrest)하고 25℃ 이하에서 콜로니 형성 능력은 현저시 감소시켰다. 결과적으로, 한랭 쇼크시, 24시간 후 세포를 고수준의 Csps로 유지시켰다. 폴리 (A) 폴리머라제 돌연변이 및 CsdA RNA 헬리카제 돌연변이에서, 한랭 쇼크시 Csp 발현은 현저히 연장되었고, 이는 폴리 (A) 폴리머라제 및 CsdA RNA 헬리카제와 관련하여 PNPase가 한랭-쇼크 순응에 중요한 작용을 한다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 한랭-쇼크 벡터에 대한 숙주로서pnp결실 균주를 사용하는 것이 더욱 장기간동안 클로닝된 유전자 발현을 유지시키는데 도움이 될 수 있다. 이 세포들을 이미 본 실험실에서는 사용할 수 있다. PNPase의 부재하에, 본 발명의 한랭-쇼크 벡터로부터의cspA발현 은 연장되어 관심의 대상이 되는 단백질 발현을 연장시킬 것이다.pnp결실 세포를 관심의 대상의 되는 단백질을 코딩하는 유전자에 상응하는 인서트를 포함하는 한랭-쇼크 벡터로 형질전환시키고 37℃에서 0.5의 OD600nm으로 배양하고 15℃로 이동시켰다. 샘플을 0-120h동안 12h 시간마다 제거하여 SDS-PAGE로 단백질 생산을 분석하였다.
(ii) 숙주 세포로서 rbfA 결실 세포를 사용한 15℃에서 클로닝된 단백질 발현의 연장
70S 리보솜 서브유니트를 제외한 30S와 결합하고 있는 15 kDa 단백질 (RbfA)를 유전자rbfA가 코딩한다(Dammel et al., 1995). 유전자는 본래 16S rRNA의 5' 헬릭스에 위치하는 우성 한랭-감수성 돌연변이의 멀티카피 억제자로서 분리되었다.rbfA결실 돌연변이는pnp결실 세포과 유사한 방식으로 저온에서 성장 장애를 나타낸다(Dammel et al., 1995). 본 발명자들은 실험을 통해 RbfA는 한랭-쇼크 단백질이고rbfA결실 균주에서 저온에서의 정상이 심각하게 저해됨에도 불구하고, 한랭-쇼크 단백질 및 리보솜 단백질은 고도로 유도되고pnp결실 세포의 것과 유사한 방식으로 그의 발현이 구성된다고 나타났다(Dammel et al., 1995). 본 발명자들은 실험을 통해 RbfA가 30S 리보솜 서브유니트의 돌연변이화 및 저온에서의 해독 개시에 관여한다는 점에서 이중 작용을 갖는다고 나타내었다.rbfA의 결실로 CspA와 같은 한랭-쇼크 단백질을 계속적으로 발현시킬 수 있다는 사실을 고려하여 15℃에서 한랭-쇼크 벡터를 사용하여 단백질을 발현시킴에 있어 이들 세포가 이상적일 것이다.
pnp및rbfA결실 균주는 이미 작제되었고, 한랭-쇼크 벡터를 사용하여 단백질을 발현시키기 위하여 이들 두 유전자의 결실 돌연변이를 중복시켜 만들었다. BX41로 명명되는rbfA돌연변이 균주는 분열된rbfA대리유전자를 균주 CD28로부터형질유도하여 작제하였다. Dammel 및 Noller (1995)에 기술된 바와 같이 C28을 그들의 실험실로부터 입수하고 P1 파지를 사용하여 MC4100로 형질유도시켰다. 논문 [Dr. Kushner's laboratory, Arraiano et al. (1988)]에 기술된pnp돌연변이 균주는 그의 실험실에서 입수하였다.
pnp균주를rbfA균주로 파지 P1vir-매기 형질유도(Miller, 1992)하여 이중 결실 돌연변이를 만들었다. 예를 들면, P1 파지를 사용하여rbfA돌연변이 균주 분해물을 만든 후rbfA분해물 및pnpase (pnp)돌연변이 균주를 사용하여 P1 형질유도에 의해rbfA, pnpase이중 돌연변이를 만들었다. P1 형질유도 후 각 콜로니의rbfAPCR 산물을 체크하여 그들이rbfA돌연변이임을 확인하였다. 이들 돌연변이 균주의 수용능력이 있는 세포를 제조한 후 pINrbfA플라스미드를 사용하여 수용능력이 있는 세포로 형질전환시키고 15℃에서 인큐베이션시키고 한랭 감수성에 대하여 체크하여 이중 돌연변이를 확인하였다.
(iii) 클로닝된 유전자 발현에 대한 CsdA의 작용
Far Western 분석을 통해E.coli의 폴리 (A) 폴리머라제가 RNA, RhlE, SrmB 및 CsdA의 RNase E 및 DEAD-박스 RNA 헬리카제와 상호작용한다고 보고되었다(Raynal et al., 1999). 이중 CsdA는 한랭 쇼크-유도 단백질이고 ATP 부재하에서 풀린(unwind) 더블-스트랜드 RNA에 대하여 활성을 갖는다(Jones et al., 1996). RbfA와 유사하게, CsdA는 저온에서의 성장에 필수적이다(데이타는 나타내지 않음). CsdA 작용이 저온에서 형성된 안정적인 2차 구조를 풀어냄으로써 mRNAs의 해독율을 증가시키는 리보솜 작용에 필수적인 것으로 제안되었다(Jones et al., 1996).
한랭-쇼크 유전자 발현이pnp및rbfA결실 균주에서의 것과 유사하게 연장된csdA결실 돌연변이를 작제하였다. pUC7Km(Pst)로부터의 카나마이신 내성 유전자 (1.3K HincII 단편)를 pKX164내 EcoRV 부위의 csdA유전자 (다르게는deadD및mssB)의 코딩 부위 중앙에 삽입하여 pKNJ9026를 수득하였다. 분열된csdA(csdA::Kan)을 포함하는 선형화된 pKNJ9026 DNA 단편을recD돌연변이 FS1576 염색체내로 도입하였다. 카나마이신-내성 형질전환체를 분리하고 써던 하이브리제이션에 의해 염색체상의csdA분열을 확인하였다. csdA::Kan돌연변이를 야생형 균주 MC4100로 형질유도하여 KNJ130를 수득하였다. 그러나,pnp및rbfA결실에서 예측된 바 csdA결실은 클로닝된 유전자의 발현을 보조할 수 없다. 이는 비-한랭 쇼크 단백질에 대한 mRNAs를 풀기 위해서는 CsdA가 필요할 수 있기 때문이다. 비-한랭-쇼크 단백질을 위해 한랭-쇼크-벡터 시스템을 사용하므로써 숙주 시스템내 CsdA가 클로닝된 유전자의 발현을 도울 수 있다. 해독 개시에 필요한 요소는cspA로부터의 것이므로 CsdA와는 달리 RbfA는 한랭-쇼크 벡터를 사용하여 클로닝 유전자 발현에 요구되는 것은 아니라는 점에 주목한다.
이러한 점을 고려하여csdA결실 및 CsdA 과잉발현이 본 벡터에서 클로닝된 다수의 유전자 발현에 미치는 효과에 대하여 조사하였다. pINIII 벡터에서 이들 유전자를 클로닝하여 CsdA를 과잉발현시키고(Inouye, 1983) 세포에서 한랭-쇼크 벡터와 함께 공-형질전환시켰다. pINIII 벡터를 사용하여, 한랭-쇼크전 IPTG를 사용하여 CsdA를 유도하고, 관심의 대상이 되는 유전자의 발현에 대한 한랭-쇼크 유도에 대한 효능에 대하여 평가할 수 있다.
(iv) 성장 배지 조건의 표준화
본 연구의 목적은 총 세포 단백질중 60-70%이상의 단백질 수율로 총 세포 단백질 합성중 90-95%의 수준으로 관심의 대상이 되는 단백질을 합성하는 것이다. 막 분획 및 리보솜 분획과 같은 불용성 물질을 원심분리하여 제거한 후 세포 분해물을 추가로 정제하지 않고, NMR 분광분석에 사용하였다. 이 경우, 분해하지 않고도 전체 세포 현탁액을 NMR 분광분석에 적용시킬 수 있다. 따라서, 한랭 쇼크후 배지를 교환한 후(예:12C-글루코스/14NH4Cl-염기 배지로부터13C-글루코스/15NH4Cl-염기 배지로), 정제 공정은 생략하고 관심의 대상이 되는 단백질만을 동위원소로 표지할 수 있다. 분자량 20kDa의 단백질이 총 세포 단백질의 60% 수준으로 생산되다고 가정하고(주의: 단지 이 단백질만이 한랭 쇼크시 새롭게 합성된다), 1리터당 단백질의 총 수율은 대략 120 mg인 것으로 예상된다. 이 단백질이 가용 형태로 생산되고 세포 분해물이 배양액 4 ml에서 제조되는 경우(초음파 분해된 후 초원심분리하여 세포 조각, 막 분획 및 리보솜 분획을 제거) 30 mg/ml 또는 1.5 mM의 관심의 대상이 되는 단백질 용액을 수득할 수 있고, 이를 직접 NMR 분광분석에 사용할 수 있다. 1ml 미만으로 NMR 분광분석을 수행할 수 있기 때문에, 배양액 크기는 250 ml로 줄일 수 있고, 이로써 값비싼13C-글루코스 and15N-NH4Cl[또는 (15NH4)2SO4]의 사용을 1/4로 줄일 수 있다.15N,13C 또는 둘 모두로 표지된 아미노산을 단일 또는 배합하여 사용할 수 있다. 또한, 세포는 제안된 조건하에서는 한랭 쇼크시 성장할 수 없기 때문에, 총 탄소이용율은 성장 세포의 것보다 더욱 더 작아야 한다. 따라서, 배지내 글루코스의 농도는 통상13C-글루코스 (0.2%)에 대하여 사용되는 농도 미만일 수 있다. 이로써 추가로 값비싼13C-글루코스의 소비를 줄일 수 있다.
LACE 효과에 영향을 받은 세포를 한랭-쇼크 인큐베이션하는 동안 얼마나 글루소크가 전환되는지를 측정하기 위하여 한랭 쇼크후 단백질 생산에 대한 글루코스 농도(0.2%, 0.15%, 0.1%, 0.05% 및 0.025%)의 효과에 대하여 시험하였다. 실시예 1에 기술된 발현 시스템을 포함하는 세포를 시험하였다. 한랭-쇼크전, 세포(10 ml 배양액)를 원심분리에 의해 회수하고 M9 배지로 세척하고 상이한 농도의 글루코스를 포함하는 10 ml의 M9 배지에 재현탁시켰다. 대조군 배양액(원심분리하지 않음: 총 6개의 배양액)과 함께 이 배양액을 15℃에서 인큐베이션시키고 5일동안 매일 24시씩 단백질 생산에 대하여 조사하였다. 이러한 패션으로, 단백질 수율은 감소시키지 않으면서 배지에 글루코스의 최소 요구량을 측정하였다. 글루코스 농도를 측정한 후, 이 조건을 이용가능한 몇몇 클론에 적용시키고, 고수율로 가용성 단백질을 생산하고 이를13C 및15N로 표지하였다. 세포 분해물을 사용하여 이들 단백질에 대한 NMR 분광분석을 수행하고 한랭-쇼크 벡터의 효능을 평가하였다.
실시예 5
단백질을 정제하지 않은 NMR 분광분석
단백질을 정제하지 않고 전체 세포 분해물로부터의 상등액을 사용하여 NMR분광분석 분석 [1H-15N)HSQC]을 수행하였다. 본 발명자들의 실험 및 Ontario Cancer Institute의 Dr. Ikura의 공동연구를 통해 그의 NMR 용액 구조가 이미 해결되었기 때문에(Nature 386:88-92, 1998) 이 실험을 위해E. coli의 삼투감지(osmosensing) 히스티딘 키나제의 EnvZ의 ATP-결합 영역(164 잔기)를 모델 시스템으로서 사용하였다.
M9 최소 배지중 pCold-EnvZ (ATP-결합 영역 또는 단편 B)를 포함하는E. coliBL21 배양액 500 ml를 0.6의 OD600nm으로 배양하였다. 세포를 원심분리하여 회수하고 사전 냉장된 0.1%15NH4Cl 및 0.4% 글루코스를 포함하는 M9 최소 배지 250ml에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 15℃에서 48h동안 배양한 후 세포를 원심분리하여 회수하고 냉각-해동을 반복하고 초음파분해하여 분해시켰다. 세포 조각 및 막 분획 (펠릿)을 초원심분리하여 분리시킨 후 생성된 상등액을 NMR 분석에 직접 사용하였다.
도 14A는 초원심분리한 후 Coomassie Brilliant Blue로 염색된 생성된 상등액의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 도 14A에서 EnvZ ATP-결합 영역은 총 단백질 샘플의 거의 80%를 나타낸다. 특히 도 14A의 겔에서 나타난 대부분의 마이너(minor) 밴드들 대부분은 37℃에서의 세포로부터의 단백질이고, 따라서,15N로 표지되지 않았다. 도 14B는 총 세포 분해물, 초원심분리후 생성된 펠릿 및 상등액의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다.
정제된 ATP-결합 영역의 스펙트럼(도 15B)과 비교할 만한 뚜렷한 (1H-15N) HSQC NMR 스펙트럼을 단백질 정제하지 않는 총 세포 분해물의 상등액으로부터 수득하였다(도 15A). 단일 막 단백질을15N 및/또는13C로 특이적으로 표지하기 위하여 한랭 쇼크 벡터 시스템을 사용하는 이 접근법에 의해 단백질을 정제하지 않고 동소에서 이종 단백질 및 막 단백질의 구조를 결정할 수 있었다.
본 명세서에서 전체적으로 기술하는 바, 본 분야의 기술자는 본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않고, 적절한 실험을 통해 광범위한 범위의 동등한 파라미터, 농도 및 조건을 사용하여 동일하게 수행될 수 있다.
본 발명은 그의 특정 일례와 관련하여 기술된 바, 이는 추가로 수정될 수 있다고 이해되어야 한다. 본 출원은 통상 본 발명의 원리를 따르고, 그를 포함하는 본 발명의 변형, 사용, 또는 적용을 모두 포함하고, 본 발명이 포함하는 본 분야의 공지 또는 통상의 원리내의 본 출원으로부터 출발하여, 하기 첨부되는 청구범위의 범위와 같은 상기 기술한 본질적인 성질에 적용될 수 있다.
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특정 일례의 상기 설명으로 본 발명의 일반적인 성질을 밝혀낼 수 있으며, 본 분야의 기술내 지식(본 명세서에서 인용되는 참조문헌의 내용 포함)을 적용하여 적절한 실험을 하지 않고도, 본 발명의 일반적인 개념으로부터 출발하지 않고도 특정 일례와 같은 다양한 적용을 위해 수정 및/또는 조절할 수 있다. 따라서, 그러한 조절 및 수정은 기술된 일면과 동등한 의미 및 범위내 있고, 이는 본 명세서에서 제시된 교시 및 가이던스에 기초한다. 본 명세서에서의 표현 및 용어는 제한하고자 나는 것이 아닌, 설명하기 위한 것이며 본 명세어상의 표현 및 용어는 본 명세서에서 제시된 교시 및 가이던스과 관련하여 본 분야의 기술자에 의해 그가 갖는 지식과 결부되어 해석되어야 한다.
참고 문헌
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<223> Synthetic <400> 8 Met Ser Asn Lys Met Thr Gly Leu Val Lys Trp Cys Asn Pro Glu Lys 1 5 10 15 Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Lys Glu Gly Ser Lys Asp Val Phe Val 20 25 30 His Phe Ser Ala Met Gln Ser Asn Asp Phe Lys Thr Leu Thr Glu Asn 35 40 45 Gln Glu Val Glu Phe Gly Ile Glu Asn Gly Pro Lys Gly Pro Ala Ala 50 55 60 Val His Val Val Ala Leu 65 70 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 9 atgaatcaca aagtgcatat g 21 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 10 attgtgagcg gataacaatt gatgtg 26 <210> 11 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (33)..(44) <223> n is a, c, g or t. <400> 11 ggatctagag ggtattaata atgactggtg cannnnnnnn nnnn 44 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (13)..(24) <223> n is a, c, g or t. <400> 12 atgactggtg cannnnnnnn nnnn 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (5)..(16) <223> n is a, c, g or t. <400> 13 tgcannnnnn nnnnnnccaa 20 <210> 14 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 atttatatat at 12 <210> 15 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 catttatata ta 12 <210> 16 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 tttatatata ta 12 <210> 17 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 acttttacaa ag 12 <210> 18 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 cacttttaca aa 12 <210> 19 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 cttttacaaa ga 12 <210> 20 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 acacatgaac ac 12 <210> 21 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 cacacatgaa ca 12 <210> 22 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 cacatgaaca ca 12 <210> 23 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 catagttttc aa 12 <210> 24 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 ccatagtttt ca 12 <210> 25 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 atagttttca aa 12 <210> 26 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 cggtctctcc gc 12 <210> 27 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 uuaacuuua 9 <210> 28 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 cgccgaaagg cacacuuaau uauuaaaggu aauacacuau gucc 44 <210> 29 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 cgccgaaagg cacacaaggu aauacacuau gucc 34 <210> 30 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 cgccgaaagg cacacuuaau uuuaaaggua auacacuaug ucc 43 <210> 31 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 cgccgaaagg cacacuugau uauuaaaggu aauacacuau gucc 44 <210> 32 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 cgccgaaagg cacacuuaac uauuaaaggu aauacacuau gucc 44 <210> 33 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 cgccgaaagg cacacuugac uauuaaaggu aauacacuau gucc 44 <210> 34 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 cgccgaaagg cacacuuaau uguuaaaggu aauacacuau gucc 44 <210> 35 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 cgccgaaagg cacacuuaac uguuaaaggu aauacacuau gucc 44 <210> 36 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 cgccgaaagg cacacuugac uguuaaaggu aauacacuau gucc 44 <210> 37 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 cgccgaaagg cacacauuau uaaagguaau acacuauguc c 41 <210> 38 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 cgccgaaagg cacacuuaau uaaagguaau acacuauguc c 41 <210> 39 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 cgccgaaagg cacacuuaau uaagguaaua cacuaugucc 40 <210> 40 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 cgccgaaagg cacacuuaau uauuaaaccu aauacacuau gucc 44 <210> 41 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 cgccgaaagg cacacaaccu aauacacuau gucc 34 <210> 42 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 cgccgaaagg cacacuuaau uauuaccuaa uacacuaugu cc 42 <210> 43 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 cgccgaaagg cacacuuaau uauauaauac acuaugucc 39 <210> 44 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 cgccgaaagg cacacuuaau uauuacacua ugucc 35 <210> 45 <211> 596 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 aaccgattaa tcataaatat gaaaaataat tgttgcatca cccgccaatg cgtggcttaa 60 tgcacatcaa cggtttgacg tacagaccat taaagcagtg tagtaaggca agtcccttca 120 agagttatcg ttgatacccc tcgtagtgca cattccttta acgcttcaaa atctgtaaag 180 cacgccatat cgccgaaagg cacacttaat tattaaaggt aatacactat gtccggtaaa 240 atgactggta tcgtaaaatg gttcaacgct gacaaaggct tcggcttcat cactcctgac 300 gatggctcta aagatgtgtt cgtacacttc tctgctatcc agaacgatgg ttacaaatct 360 ctggacgaag gtcagaaagt gtccttcacc atcgaaagcg gcgctaaagg cccggcagct 420 ggtaacgtaa ccagcctggt cgaccatcat catcatcatc atatcgaagg taggcatatg 480 aagcttggta ccggatcctc tctgcttaaa agcacagaat ctaagatccc tgccatttgg 540 cggggatttt tttatttgtt ttcaggaaat aaataatcga tcgcgtaata aaatct 596 <210> 46 <211> 365 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 aaccgattaa tcataaatat gaaaaataat tgttgcatca cccgccaatg cgtggcttaa 60 tgcacatcaa cggtttgacg tacagaccat taaagcagtg tagtaaggca agtcccttca 120 agagttatcg ttgatacccc tcgtagtgca cattccttta acgcttcaaa atctgtaaag 180 cacgccatat cgccgaaagg cacacttaat tattaaaggt aatacactat gaatcacaaa 240 gtgcatatga agcttggtac cggatcctct ctgcttaaaa gcacagaatc taagatccct 300 gccatttggc ggggattttt ttatttgttt tcaggaaata aataatcgat cgcgtaataa 360 aatct 365 <210> 47 <211> 350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 aaccgattaa tcataaatat gaaaaataat tgttgcatca cccgccaatg cgtggcttaa 60 tgcacatcaa cggtttgacg tacagaccat taaagcagtg tagtaaggca agtcccttca 120 agagttatcg ttgatacccc tcgtagtgca cattccttta acgcttcaaa atctgtaaag 180 cacgccatat cgccgaaagg cacacttaat tattaaaggt aatacactca tatgaagctt 240 ggtaccggat cctctctgct taaaagcaca gaatctaaga tccctgccat ttggcgggga 300 tttttttatt tgttttcagg aaataaataa tcgatcgcgt aataaaatct 350 <210> 48 <211> 162 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 acgguuugac guacagacca uuaaagcagu guaguaaggc aagucccuuc aagaguuauc 60 guugauaccc cucguagugc acauuccuuu aacgcuucaa aaucuguaaa gcacgccaua 120 ucgccgaaag gcacacuuaa uuauuaaagg uaauacacua ug 162 <210> 49 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 49 ucccugccau uuggcgggga uuuuu 25 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 50 Met Asn His Lys Val His Met 1 5

Claims (36)

  1. 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
    한랭 쇼크 반응을 유도하는 조건하에서 숙주 세포에서 이종 폴리펩티드의 발현 및 생산을 조절하는 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 한랭 쇼크 유도 유전자 프로모터 및 5'-비해독 부위 (5'-UTR) 부위를 포함하는(여기에서, (1) 개시 코돈으로부터 하류 4번째 내지 7번째 코돈에 12 뉴클레오티드의 AT 풍부 서열을 포함하는 해독 증진 요소는 한랭 쇼크 유도 프로모터 및 5'-UTR 및 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 사이에 위치하여 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 해독 인-플레임 융합을 형성하거나, (2) 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 개시 코돈으로부터 하류 4번째 내지 7번째 코돈에 AT 풍부 서열을 포함한다) DNA 분자.
  2. 제 1항에 있어서, 한랭 쇼크 유도 프로모터 및 5'-UTR이 서열번호:1의 뉴클레오티드 22-441, 서열번호:3의 뉴클레오티드 11-214, 서열번호:5의 뉴클레오티드 12-213, 및 서열번호:7의 뉴클레오티드 11-201, 그의 단편, 및 그의 변이체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 DNA 분자.
  3. 제 1항에 있어서, (1)이 존재하는 DNA 분자.
  4. 제 3항에 있어서, 한랭 쇼크 유도 프로모터 및 5'-UTR이 첫번째 코돈은 개시 코돈이고 4번째 내지 7번째 코돈은 AT 풍부 서열을 형성하는 7개의 코돈의 뉴클레오티드 서열로 구성된 해독 증진 요소에 의해 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 분자.
  5. 제 4항에 있어서, 해독 증진 요소가 서열번호:9의 뉴클레오티드 1-18을 포함하는 DNA 분자.
  6. 제 1항에 있어서, 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 개시 코돈으로부터 하류 4번째 내지 7번째 코돈에 AT 풍부 서열을 포함하는 DNA 분자.
  7. 제 1항에 있어서, 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로부터 하류에 위치하는 한랭 쇼크 유도 유전자의 3'-비해독 부위 (3'-UTR)를 추가로 포함하는 DNA 분자.
  8. 제 7항에 있어서, 3'-UTR 이 cspA, cspB, cspG, 및 cspI로 구성된 그룹의 3'-UTR으로부터 선택되는 DNA 분자.
  9. 제 7항에 있어서, 3'-UTR이 서열번호:1의 뉴클레오티드 442-539를 포함하는DNA 분자.
  10. 제 1항에 있어서, 한랭 쇼크 유도 프로모터 및 5'-UTR 부위 서열이 전사 개시 부위로부터 하류에 바로 인접하게 lacI 오퍼레이터를 포함하는 DNA 분자.
  11. 제 10항에 있어서, lacI 오퍼레이터 서열이 서열번호:10의 뉴클레오티드 서열인 DNA 분자.
  12. 제 1항에 있어서, 벡터인 DNA 분자.
  13. 제 12항에 있어서, 자가-복제 벡터인 벡터.
  14. 제 13항에 있어서, pColdI인 벡터.
  15. 제 13항에 있어서, pColdII인 벡터.
  16. 제 13항에 있어서, pColdIII인 벡터.
  17. 제 1항의 DNA 분자로 형질전환된 원핵 숙주 세포.
  18. 제 17항에 있어서, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인 숙주 세포.
  19. 제 17항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 활성이 결여된 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 돌연변이인 숙주 세포.
  20. 제 17항에 있어서, 70S 리보솜 서브유니트가 아닌 유리 30S 리보솜 서브유니트와 결합한 15kDa RbfA 단백질이 결여된 rbfA 돌연변이인 숙주 세포.
  21. 제 17항에 있어서, csdA RNA 헬리카제 활성이 결여된 csdA RNA 헬리카제 돌연변이인 숙주 세포.
  22. 제 17항에 있어서, 숙주 세포에서 csdA RNA 헬리카제를 과잉발현시키는 벡터로 공-형질전환된 숙주세포.
  23. 영양 배지중 제 17항의 숙주 세포를 숙주 세포의 정상 생리학적 성장 온도에서 배양하고;
    인큐베이션 온도를 숙주 세포의 정상 생리학적 성장 온도보다 적어도 13℃ 낮게 강하시켜 배양된 숙주 세포를 한랭 쇼크시켜 이종 폴리펩티드의 생산을 유도하고;
    한랭 쇼크받은 숙주 세포를 강하된 인큐베이션 온도에서 인큐베이션하여 이종 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 추가로 생산된 이종 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 제 23항에 있어서, 인큐베이션 온도를 숙주 세포의 정상 생리학적 성장 온도보다 적어도 13℃ 낮게 강하시키는 방법.
  26. 제 23항에 있어서, 추가로, 배양된 숙주 세포를 한랭 쇼크시킨 후, 영양 배지를 이종 폴리펩티드를 검출가능하게 표지하기 위한 화합물을 포함하는 배지로 교환하는 단계를 포함하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 화합물이 일반적으로 숙주 세포에서 무시할만한 양으로 발견되는 동위원소를 포함하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 동위원소가15N 또는13C인 방법.
  29. 제 27항에 있어서,15NH4Cl, (15NH4)2SO4,13C-글루코스,15N로 표지된 아미노산잔기,13C로 표지된 아미노산 잔기, 또는15N 및13C 모두로 표지된 아미노산 잔기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  30. 제 27항에 있어서, 숙주 세포가 하나 이상의 주요 한랭 쇼크 단백질이 결여된 돌연변이인 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 돌연변이 숙주 세포에 CspA가 결여되어 있는 방법.
  32. 제 30항에 있어서, 돌연변이 숙주 세포에 CspA, CspB, CspG, 및 CspE가 결여되어 있는 방법.
  33. 화합물로 검출가능하게 표지된 이종 폴리펩티드를 생산하기 위하여 강하된 인큐베이션 온도에서 제 26항의 방법으로 인큐베이션된 한랭 쇼크받은 숙주 세포를 분리하고;
    분리된 한랭 쇼크받은 숙주 세포에서 전체 세포 NMR 분광분석을 수행하거나, 분리된 한랭 쇼크받은 숙주 세포의 세포 분해물로부터의 상등액에서 NMR 분광분석을 수행하는 것을 포함하는, 이종 폴리펩티드의 NMR 스펙트럼을 수득하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 분리된 한랭 쇼크받은 숙주 세포에서 전체 세포 NMR 분광분석을 수행하는 방법.
  35. 제 33항에 있어서, 분리된 한랭 쇼크받은 숙주 세포의 세포 분해물로부터의 상등액에서 수행하는 방법.
  36. 영양 배지에서 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 한랭 쇼크에 반응하여 이종 폴리펩티드를 발현시키고 생산할 수 있는 핵산으로 형질전환된 원핵 숙주 세포를 배양하고;
    인큐베이션 온도를 숙주 세포의 정상 생리학적 성장 온도보다 낮은 온도로 강하시켜 배양된 숙주 세포를 한랭 쇼크시킴으로써 이종 폴리펩티드의 생산을 유도하고;
    배양된 숙주 세포를 한랭 쇼크시킨 후, 영양 배지를 이종 폴리펩티드를 검출가능하게 표지하기 위한 화합물을 포함하는 배지로 교환하고;
    한랭 쇼크받은 숙주 세포를 강하된 한랭 쇼크 온도에서 인큐베이션시켜 화합물로 검출가능하게 표지된 이종 폴리펩티드를 생산하고;
    분리된 한랭 쇼크받은 숙주 세포에서 전체 세포 NMR 분광분석을 수행하거나, 분리된 한랭 쇼크받은 숙주 세포의 세포 분해물로부터의 상등액에서 수행하는 것을 포함하는, 이종 폴리펩티드의 NMR 스펙트럼을 수득하는 방법.
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