TW200401029A - Cold shock inducible expression and production of heterologous polypeptides - Google Patents

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200401029 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關異源多肽之冷休克誘

凡透導表現與生產之DNA 分子、載體、宿主與方法。 【先前技術】 當將大腸桿菌細胞培養於37t並移轉至諸如饥之低溫 時，有_組名為冷休克蛋白之蛋白f會於稱為適應 (acclimation)期的生長遲滞期受短暫高量誘導（j〇nes等人· ’ 1987)。這些具冷休克專一性之蛋白包括：CspA、CspB 、CspG、CspI、CsdA、RbfA、NUSA與 PNp(其回顧請參照

Phadtare 等人.，1999、2000與 2〇〇2 ; Yamanaka 等人，Η%) 。其中，CspA已經過確認，係含7〇個胺基酸之主要的冷休 克蛋白。 大腸桿t之CspA家族包含9種同源蛋白，; 但疋，其中僅CSpA、CspB、CspG、CspI為冷休克誘導者¥ 有趣的是，該CSPA基因在正常與低生長溫度時皆是可有可 無的（Bae等人1997)。因為在細胞冷適應期時CspA家族 之功能有所重疊，故這些CspA同源物似乎無一單獨負責冷 休克適應（Xia 等人2001)。事實上，△cspAAcspBAcspG 三重删除品系仍可存活；然而，△cspAAcspBAcspGAcspE 四重刪除品系則無法於低溫下形成菌落。有趣的是，實驗 已顯示除了 CspD以外，源於這9個CspA同源物之任一單一 基因皆能補足該四重刪除品系之冷敏感性。（Xia等人.，2〇〇 i) 。經實驗顯示CspA與CspB、CspG以及CspI所受調節有差異 83736 200401029 (Etchegaray 等人.，！996與 Wang 等人.，1999)。於 24°C 〜10 °C之間可見高量之CspA生成，然而CspB與CspG僅在溫度轉 換至20 C以下才見產生，而其最高之誘導則在丨5它時。CspI 之誘導則在10〜15t時。亦經實驗顯示，CspA、 係蛋白貝5成經元全阻斷之低溫情形才受誘導（Etchegaray 等人.，1999)。 調節cspA之表現是很複雜的方式，亦即在轉錄層次、 mRNA安定性與轉譯效率（其回顧請參照phadtare等人.， 2000與Yam an aka等人·’ 1998)。該cspA基因具有包含159鹼 基之異常長度的5'未轉譯區域（5’-UTR)。該cspA 5'-UTR經 刪除分析顯示，此區域是其於371：時極度不安定之原.因（半 衰期少於1 2秒鐘）；然而，對低溫時mRNA之安定性有正面 效果（Jiang等人·’ 1996與Mi tta等人·，1997)。於冷休克後 ’該cspA mRNA立即戲劇性地安定化（半衰期大於2〇分鐘） 。這種安定.化屬暫時性，而且，一旦細胞適應低溫後即寶 失。其會反過來調節cspA之表現。 因cspA之冷休克誘導無需特定轉錄因子，故cSpA之冷休 克誘導與熱休克誘導相當不同。有趣的是，該csp A啟動子 於37°C很活躍，但當cspA mRNA在此溫度極度不穩時， CspA之量便大減。因此’ cspA mRNA之5，-UTR對其冷休克 誘導性扮演重要角色。最近，實驗顯示在早期指數生長期 Csp A於37 °C產生；而且’其mRNA在中至晚指數生長期變 得不安定（Yamanaka 等人2001 與 Brandi 等人.，1999)。cspA mRNA之5’-UTR包含一種保存於數種冷休克mRNA之”冷盒 83736 200401029 子π序列。此區域形成安定之莖-圈結構，後面尚跟隨富含 AU之序列（Fang等人.，1998)。本發明者之實驗室顯示，此 區域對冷休克後正常cspA mRNA之誘發很重要；因為，莖_ 圈結構刪除明顯使mRNA不安定，並降低冷休克誘發之 cspA mRNA的量約50%。然而，富含AU之轨跡稍微會使 mRNA不安定。（Xia等人.，2001)。 既無起始密碼子（AUG)亦無編碼序列之突變的cspA mRNA之過度表現，會造成低温生長的嚴重抑制，加上染色 體cspA表現之去壓抑。甚且，該過度表現2RNA係與30S 與70S核糖體穩定聯結。由本發明者之實驗室結果顯示， 5’-UTR本身在低溫時對核糖體具相當親和力。5，-UTR於15 °C時之過度表現，造成冷休克反應之延遲誘導；而且不只 造成CspA，亦包括CspB與CspG之延遲合成（Fang等人.， 1998與^1^等人.，1996)。這些效果因5|-11丁11加上€3?八之 共同產生而受壓制。實驗顯示cspA啟動子之-35區域密接上 游之富含AT序列可表現增強cspA轉錄之UP單位的功能。刪 除該UP單位使得cspA啟動子之活性減低（Goldenberg等人. ，1997與Mitta等人.’ 1997)。對較高啟動子活性貢獻的另 一個重要因素為在-10區域之直接上游之TGn排列 (m〇tif)(Kumar等人·，1993)。據報導，此排列加上該_1()區 域構成之延伸的-1 0區域與-3 5區域，對此區域之存在係可 有可無的。 重要地’ cspA之表現亦在轉譯階段調節。生長適應期時 冷休克蛋白的優選合成意謂其mRNA ’不像其他大部分之細 83736 200401029 具有無需諸如RbfA與CsdA之冷休克

CspB、CspG、CspI、 胞（非冷休克）mRNA， 核糖體因子，即可在. 低溢時之轉譯。有人提出諸如Csp A、 CsdA與RbfA之冷休克蛋白的mRNA在

其編碼區域有名為下游盒子（DB)之強化轉譯起始的單位 (Mitta等人· ’ 1997)。最初提出之該DB序列係與16S rRNA 倒數第一之！之某區域互補，且係位於起始密碼子幾個鹼 基下游。DB如何增強轉譯起始—直有爭等人 1999與 O’Connor 等人. ’ 1999)，而且，最初提出之經由 與1 6S rRNA結合利用促進轉譯預起始錯合物之形成的機制 可能非正確機制。 s玄現象名為’LACE’效應（切斷的cspA表現之低溫抗生素

效應（Low-Temperature antibiotic effect of truncated [spA express ion))在大腸桿菌可見（jiang等人，1996與xia等人^ ’ 200 1)。當切斷之CSpa基因於低溫過度表現時，細胞生長 完全被阻斷。實驗顯示’此係因細胞之核糖體幾乎全被切 斷的cspA mRNA所誘陷。此切斷之mRNA於低溫時仍能與 非適應之核糖體形成前起始錯合物。藉由將終止密碼子併 入選殖在pUC載體之cspA基因的第2(pA01S)或第11(PA10S) 或第31(pA30S)密碼子，可清楚顯示核糖體受切斷之CSpA mRNA所誘陷情形（Xia等人.，2001)。於37°C時，帶這些質 體的細胞非常正常；然而，在冷休克時細胞完全停止生長 。於151時’他們無法形成菌落而且利用35S-Met無法標定 83736 200401029 任何蛋白質。當分析這些細胞之多核糖體情形時，僅表現 起始密瑪子（pAO 1 S)之細胞只含有單核糖體而無任何多核 糖體波峰。含pAlOS細胞顯示di-與單核糖體，而具有pA3〇s 之細皰顯示三、雙與單核糖體’同樣，無任何多核糖體波 峰。甚且，結果顯示有一主要之細胞mRNA (1 pp)，因被切 斷之cspA mRNA接管所致，被排除在多核糖體之外。這些 結果清楚顯示cspA mRNA之強的可轉譯性係受起始步驟決 定。在此研究中’發明者之實驗室亦顯示cSpA mRNA 5 -UTR之上游區域在形成造成LACE效應之轉譯起始錯合 物時扮演重要角色（Xia等人.，2001)。

據推測，藉由將mRNAs之二級結構去安定化，cspA及其 同源物應為RNA之監護者（Bae等人.，2000 ; Jiang等人_， 1997 與 Phadtare 等人.，2001)。因為△cspAZicspBAcspGA cspE之四t刪除品系無法於低溫生長，然而單一之csp基因 即忐補足冷敏感性（Xia等人·，2〇〇 1 )，我們認為，藉由阻辭 對mRNA轉譯具抑制性之安定的二級結構之形成，其rna 監護者之功能對低溫時細胞mRNA之有效轉譯很重要 (Phadtare 等人.，2001)。 實驗顯不含cspA啟動子之冷誘導載體具有表現諸如，前 S2-S’-p-半乳糖酶與Το1ΑΙ_β·内醯胺酶之易聚集蛋白質之用

動子與帶此類啟動子之載體 na等人.，1997與Vasina等人· ，191 B1揭示cspA與cspB之啟

此文件與先前技藝係 83736 -10- )1029 屬_之用’或認為是本申請之任何專利申請範圍實質可 :二：利之用。任何有關文件之内容或時期之敘述皆根據 建檔時申請者可得之眘 ° 非做為承認本文任何敘述之正 確性之用。 【發明内容】 本电明提供能在誘發宿主細胞冷休克反應條件下，於宿 主細胞表現異源多肚之職分子與載體。根據本發明，該 刀子G 3扁碼丹源多趾之核答酸序列，其在操作上係 與冷休克誘發基因啟動子與於誘發冷休克反應之情形下指 V估主、，田胞表現與生產異源多肚之5、未轉譯區域（5、UTR) 序歹Η目連此外’右非編碼異源多趾之核菩酸序列於起始 密瑪子下游約第4與第7密碼子具有富含^之序列（自铁發 生或由即位置指導之突變形成所創造），即是在編碼里 源多肢之巧酸序列與冷休克誘發啟動子以及5MJTR序列 之間插入轉譯增強單位。此轉譯增強單位包含起始密碼爷 與於起始密碼子下游約第4與第7密碼子具有富含Μ序列 以與編碼異源多&之Π酸序列形成轉譯正位骨架融合 物。 本發明亦提供經根據本發明之dna分子與載體轉形之宿 主細胞’與利用此種宿主細胞於冷休克誘導條件下，生產 諸如供完整細胞或溶胞物之NMR分光光譜分析之異源蛋白 之方法。 【實施方式】 利用大腸桿菌做模型系統，本發明者之實驗室發現有一 83736 200401029 些冷休克蛋白僅於低溫才是生長所需。在這些冷休克蛋白 中’ CspA係主要者，且在冷休克時誘發之量大於ι〇6分子/ 細胞（10·4 M)。實驗顯示該cspA mRNA之轉譯起始於低温時 效率極高，且經發現該csp mRNA具有壓制其他全部的細胞 mRNA轉譯之能力。例如，當在cspA起始密碼子之直後加 一個無意義岔碼子，該位於pUC載體之切斷的cSpA基因之 mRNA誘捕全部細胞之核糖體，完全阻斷於冷休克時其他細 胞蛋白之合成，藉此完全抑制細胞於低溫時之生長。該現 象名為"LACE效應”。因而，利用該cspA mRNA之相當的轉 譯優點加上其冷休克誘導之mRNA安定性及其高效率之啟 動子，本發明者設計一種冷休克誘導載體-宿主系統，其中 所有細胞之核糖體僅投入低溫時選殖的基因產物之生產， 藉此提供冷休克時基因產物/喜愛的之蛋白極高之表現。 然而，绔果顯示含cspA啟動子之冷誘導載體可用以表現: 諸如前S2-S’j-半乳糖酶與TolAI β—内醯胺酶之易聚集的蛋 白（Mujacic等人·，1999; Vasina等人·，1996與 1997)，其他 單位對於低冷休克誘導溫度之有效轉譯最為重要。 本發明因此提供於冷休克條件下能表現異源多肽之dna 分子’其中該DMA分子以自我複製性載體較佳。根據本發 明之該DNA分子包含編碼異源多肽/喜愛的蛋白之核苷酸 序列與冷休克誘導啟動子以及操作上連接於控制與指導我 們喜愛的異源多肽在誘發冷休克反應條件下，於宿主細胞 表現與生產之5，-未轉譯區域（5，_UTR)。爲增強轉譯效率， 若非編碼異源多肽之核站酸序列於起始密碼子下游約第4〜 83736 12 200401029 第7密碼子有富含AT之序列（自然發生岑介p丄 乂亦即由位置指導突 變生成所創造），即是在多肽與冷休去 儿5男V啟動子以及 5，-UTR之間插入一個轉譯增強單位。此轉譯增強單位於始 密碼子下游約第4〜第7密碼子含有起始密碼子與富含Ατ之 序列，以與編碼異源多肽之核：y：酸序列形成轉譯正對骨架 融合物。 本發明者發現該富含AT序列可於轉譯起始階段增強轉譯 。有人提出該於起始密碼子下游無二級結構之富含AT的序 列，可能促進核糖體進入並藉此增強轉譯起始與後續增長 反應之效果。此反過來可增強定性與最終多肽與蛋 白負之生產。虽含A或A/T之傳#者RNA係無特定結構的， 而且，有人提出這種易變形之mRNA可被核糖體有效地包容 :因此對轉譯起始與/或早期延伸有所幫助。 異源夕之用語意指不是由冷休克誘導啟動子在自然 發生之宿主細胞自然表現的任何多肽。因此，儘管"異源灸 肽’’可能係與冷休克誘導啟動子與5,_UTR來源相同’例如大 腸4干菌，/、要其非由該啟動子自然表現，較佳時此多趾係 由與冷休克誘導啟動子及5’_UTR*同來源，例如諸如人之 非大腸桿菌來源所自然表現者。 一個DNA分子若含有包含轉錄與轉譯調節訊息，且此種 序列係”操作上連接"於編碼該多肽之核苷酸序列，即稱其 係此表現諸如異源多肽之多肚的核甞酸序列。操作上連 接’係调郎DNA序列與將表現之dna序列之連接方式正適 於基因表現的一種連接。基因表現所需之該調節區域通常 83736 • 13 - 200401029 包括，啟動子區域以及該DNA序列，其當轉錄入RNA時， 會發出蛋白質合成之起始信號。這種區域正常會包括那些 涉及轉錄與轉譯起始之5 非編碼序列。 若該啟動子能執行該DNA序列之轉譯，則啟動子區域會 在“作上與一 DNA序列連接。如本文所用，"啟動子序列" 係位於DN A且由rn A聚合酶所轉譯之啟動子序列。因此， 為表現異源多肽’由宿主辨識轉譯與轉錄之信號是必要的。 ”冷休克”之用語意指降低宿主細胞至遠低於正常生理生 長溫度之培育與生長溫度，諸如溫度至少降約13 °C。 ”富含AT11之用語指向核苷酸序列時之定義係指其AT鹼 基之量至少70%。 . 冷休克誘導啟動子與5'-UTR序列，以任何冷休克誘導啟 動子與源於大腸桿菌CSpA、cspB、cspG與cspl之5'-UTR較 佳。該啟兮子之核荅酸序列與51-UTR區域以及上述大腸桿 菌之冷休克蛋白的編碼與3'-UTR區域係列做序列編號七 l(cspA)以序列編號：2為編碼之CspA胺基酸序列，序列編 號：3(cspB)以序列編號：4為編碼之CspB胺基酸序列，序 列編號：5(cspG)以序列編號：6為編碼之CspG胺基酸序列 ，序列編號：7(cspl)以序列編號：8為編碼之Cspl胺基酸序 列。該序列亦得由NCBI GenBank資料庫於增加號碼 (accession number) AE000252 (CspB 與 Cspl)、AE000433 (CspA)與 AE000201 (CspG)。cspA、cspB ' cspG與 cspl之啟 動子與5，-UTR分別相當於序列編號：1之核22-441荅酸’序 列編號：3之11-214核苷酸，序列編號：5之12-213核苷酸 83736 -14 - 200401029 與序列編號：7之11-201核：y：酸，且列於圖13做為排列。 熟諳此藝者會明瞭，只要維持冷休克誘導條件之指導有 效表現與轉譯之能力，本發明DNA*子所用之冷休克誘導 啟動子與5i_UTR得為CSPA、CSPB、以1)0與cspl任何—個之 啟動子與5MJTR序列之片段或變體。纟中某些序列經刪除 、取代或插入之片段與變體皆為本發明所涵蓋且其方針= 在實例中提供。 本發明之一個較佳具體實施例為，在該編碼異源多肽之 核苷酸序列之第4與第7密碼子，有一富含AT之序列可做為 轉淳增強單位。此富含AT單位若非位於編碼異源多肚之自’ 然發生核苷酸序列中，即是利用位置指定突變形成導引入 編碼序列者。例如，每個密碼子之第三個鹼基若為〇或^ , 則利用取代將其改成入或τ，以增加第4至第7密碼子區域之 AT含量^ .為密碼子利用之退化情形，進行此是通常不需 改變胺基酸序列》 « · 另一較佳具體實施例，係其中之冷休克誘導啟動子與 5’-UTR為利用含第7密碼子之核苷酸序列之轉譯增強單位 連接於編蝎異源多肽之核甞酸序列者；其中，該第一個密 碼子為起始密碼子，而第4與第7密碼子間形成富含ΑΤ之序 列。此類轉譯增強單位之具體實施例之—為序列編號：9 之核馱序列之核苷酸丨〜丨8，其得如實例3所述，利用選殖 入pCoidii載體之NdeI位置而生成。 較佳者為根據本發明之DNA分子亦包括3,_UTR，諸如源 ;CSPA、cspB、cspG與 cspl任何一個之 3’-UTR。3'-UTR之 83736 -15- ^0401029 特佳具體實施例為cspA 3，_UTR，#包括序列編號：^或其 片段之核甞酸442-539。 在另一具體實施例，視情形本發明之dn a分子得在冷休 克誘導啟動子之轉譯起始位置之密接下游包含Ucl操作者 序歹]諸如序列編號· 1 〇之核苷酸序列。若該異源多址即 使在非誘導條件之漏出的低量表現時，對正常生理生長溫 度之宿主細胞生長有毒性，則這種lacI操作者可能用來解決 問題。在此情形，該異源多肽僅能在含IPTG情形，於冷休 克條件下產生。 本發明亦提供包含根據本發明之DNA分子的載體。較佳 情形，該載體為自我複製性並指導異源多肽於引發冷休克 反應條件下於宿主細胞表現。本發明的載體之較佳具體實 施例為實例3所述之pC〇idI、pC〇idimpC〇idm載體。這3 個載體皆是相同之pUcl9骨架（於切斷，然 後以Klenow填滿），但插入序列不同。圖12A_12C分別顯承 pColdl、II與in之插入序列。

本發明另一方面提供經本發明之DNA分子或載體轉形之 原核佰主細胞。較佳情形，該宿主細胞為大腸桿菌。如本 文貫例4所討論’該宿主細胞為無聚核苷酸磷酸化酶活性 (pnp )之聚核甞酸磷酸化酶（pnpase)突變體，或為缺少與游 離30s核糖體次單位而非7〇s核糖體次單位聯結之15 kDa RbfA蛋白質之rbfA突變體（rbfA-)e本發明宿主細胞之另一 較佳具體貫施例係既為ρηρ·且係rbfA·者。進一步之具體實 施例包括缺少CsdA RNA解螺旋酶活性（csdA-)之csdA RNA 83736 -16- 200401029 解螺旋酶突變體之宿主細胞與經由在宿主細胞過度表現 CsdA RNA解螺旋酶之載體共轉形之宿 或CsdA過度表現之宿主細胞較佳者係既為叩〆且/或為 rbfA·者。 本發明另-方面係針對生產異源多此之方法，包括但不 限於’諸如做為治療或做為目標用 鈿用途之人類蛋白之具醫療 重要性之蛋白、易於熱變性之蛋白、枵

丈曰h不之蛋白與做為NMR 研究之用的蛋白m涉及培養含本發明之職分子或 載體之本發明的宿主細胞於宿主細胞正常生理生長溫产之 營養基中’然後將培育溫度降至低於宿主細胞正二：生 長溫度1 3 C以上，使宿主細胞經歷冷休克，以誘導異源多 肽生成。冑該經過冷休克之宿主細胞保存於低的冷休克溫 度，以在生產期生產異源多& '然後，回復所生產之显源 多肢。在！一具體實施例，溫度至少是低於宿主細胞 正常生理生長溫度之20°C以上。 本發明方法之優點如下： 1 ·因為蛋白質之誘導係利用向下調整溫度，故無需諸如 IPTG之化學誘導物。 2.冷休克時，將細胞轉化成針對喜愛的單一蛋白之蛋白 合成機制。因為全部細胞之核糖體皆經選殖在載體之蛋白 的mRNA所誘捕，故細胞之其他全部蛋白之合成事實上全被 阻斷。 因而，在冷休克後改變培養液（例如由,2^葡萄糖 14NH4C1-基培養基改成i3c_葡萄糖基培養液）便 83736 •17- =有我們喜愛的蛋白標定同位素，減除4、叫_同位素標 疋之樣本的純化需要性。 ” 4.右產生20kDa之蛋白(總細胞蛋白量之6〇%，且須注咅 克時僅此蛋白為新合成者)’每公升之蛋白總產量： ’·.、匕笔克。假設此所生之蛋白有8〇%為可溶型 <，只要細 胞懸子於4毫升緩衝液或由該緩衝液製成之溶胞物（超音波 震I並經離心以去除細胞碎片與膜部分），我們可得Μ毫克 /宅升或1.25毫莫耳濃度喜愛的蛋白溶液，其可直接用於 NMR分光光譜分析。 ' 5·因可以使用少於丨毫升進行NMR分光光譜分析，培養 液體積可減至250毫升以下’其可將昂貴的％-葡萄糖與 N-NH4C1[或（NH4)2S〇4]用量減至四分之…甚且，當細 胞無法於所提條件下在冷休克時生長，整個碳使用量比生 長的=胞^很多。目而，培養基之葡萄糖濃度可比一般使 用之uc-葡萄糖濃度低(0.2%)。此進一步減少昂貴的13。餘 萄糖之消費。 6. 有些蛋白對熱變性高度敏感。特別是在大腸桿菌以高 溫表現那些來自通常生活在低溫環境的生物（諸如線蟲 Caenorhabditis elegans)蛋白會很有問題。本冷休克-載體-宿主系統可克服此問題。 7. 儘官以T7載體系統可較高量表現某些蛋白，其他蛋白 之表現亦可能僅能由在此提出之冷休克載體系統達成，不 僅因為蛋白纏繞問題，亦因轉錄與轉譯之調節。當我們可 得到從人到細菌之極多量的基因，此亦會愈清楚。 83736 -18- ，以二我們辨5戠出愈來愈多具治療重要性之人類蛋白時 之A i Γ型式亚大量表現這些蛋白非常重要。根據本發明 的:統克載體系統可做為傳統之㈣現系統之另外或互補 併：：此#者會了解，根據本發明生產異源多肽之方法可 常a二可偵測之標定化合物’諸如經在宿主細胞發現時經 將=略量之同位素Μ、標定之化合物。當我們想 諸如:：之經標定化合物併入以本發明方法生產之多肚， :、MR分先光譜分析時，我們以含在偵測上係欲標定 人物* ^之^養液父換/取代營養培養液。可 <貞測之標定化 5物較佳者為與15ΝΗ4α 15 13 ^ A ( NH4)2S04、 C-|j 萄糖、經 15n 不疋之單胺基酸殘基、破1 3 r伊a々如计

rt3 ,3 、，二C彳示疋之早基酸殘基或經15N c二者標定之置. 15 私基酸殘基。可是，i5NH4Cl、 L押，):s 〇、4 „葡萄糖卻提供整個生產之異源多肤非選 *疋，至於，單胺基酸殘基亦即Glu經15Ν與/或I3c於相砮 於特定單胺基酸殘基之里调# aJ_ — & w ^兵源多肷之殘基位置標定則提供選 擇性標定。 本文下述只例5顯不未經蛋白純化之溶胞物上澄液之適 於NMR分光光譜分析之異源多肽（EnvZ之ATP結合功能部 位)之生產If开y f例5中做為宿主細胞之大腸桿菌B品係 BL21非為缺乏任何主要冷休克蛋白例如cspA之突變體。秋 而’因為標定之主要冷休克蛋白存在，而需要較少背景雜 音之丽R分光光譜分析情形，得替代地使用缺少—或多種 主要冷休克蛋白’以缺φ Γ1 .

CspA較佳之突變體宿主細胞或亦 83736 -19-

可使用CspA與其他諸如例如△ CSpAA cspB△ cspGA 四重突變體之冷休克蛋白組合代替。 本發明進一步提供取得異源多肽NMr光譜之方法。此法 涉及在營養液培養經包括，編碼異源多肚與反應冷休克能 表現與生產異源多肽之核苷酸序列之經核酸轉形之原核宿 主細胞。隨之降低培育溫度至宿主細胞正常生理生長溫度 之下，將s亥培養之宿主細胞付諸冷休克，以誘發該異源多 肢之生產。冷休克後，以包含欲偵測標定該異源多肽之化 合物的培養液交換/取代該培養液。將經過冷休克之宿主細 胞培育於低的培育溫度，以生產經化合物偵測標定之異源 多肽’然後分離之。NMR分光光譜分析可針對分離出之經 冷休克的宿主細胞（完整細胞NMR分光光譜分析）或由分離 出之經冷休克的宿主細胞之溶胞上澄液以取得異源多肽之 NMR光譜二 本發明既經一般描述，經由參考下列經由說明提供而_ 限制本發明之實例亦可更容易瞭解。 實例1 原形載體之建構

利用N d e I消化原始質體’隨之為κ 1 e n 〇 w填滿並接合以創 造不含 Ndel 位置之 PUC19 載體（New England Biolabs, Beverly，MA)。PCR產物包括 T7/cspA啟動子 ' CspA之 5'-UTR 及其編碼區域係選殖入pUCl9ANdeI質體之EcoRI與Hindlll 位置。然後將這兩個限制位置經Klen〇w填滿而消除。利用 位置指定突變形成在cspA停止密碼子密接後方創造3&11與 83736 -20- 200401029

BamHI位置。合成含6個His-標籤、供蛋白酶切斷之_χα因子 位置與包括Ndel，Hindlll與ΚρηΙ之多重選殖位置與CSpA之 3’區域之DNA片段，並選殖入此載體。原形質體載體之圖 列於圖1。 線蟲蛋白之選殖與表現 有些蛋白對熱變性高度敏感。特別是在大腸桿菌中以高 溫表現那些通常源於低溫生活環境之生物（諸如線蟲）的蛋 白會很有問題。選取5種線蟲蛋白，並由G. MonteUone博士

提供（名為 WR49、WR35、WR26、WR27與 WR53，Genebank 增加號碼：分別為 AV1 85320、AVI 83398、C50788、D719U 與C48848)將之選殖入pET載體並無法於3Γ(：好好表現（圖 2A)。將含編碼這些蛋白的基因之插入物再選殖入圖丨所示 之冷休克載體。於37°C將細胞培養至〇]〇6〇〇11111為〇.5,然後 轉移入ΐ5ς並以莫耳濃度IPTG(異丙醇㈣硫半乳糖派 °南配糖體以誘導T7啟動子）料，並於G、12與24小時移際 樣本並經SDS-PAGE分析蛋㈣之表現。圖2錢示利用PET 載體，於37°C時’經1毫莫耳濃度㈣誘導3小時後全部這 白質之表現量而圖2B顯示其應用分別之冷休克載體於 ^表，。利用PET表現載體於3rc時，徽49與歡35 蛋白根本恶法表現（分別為 為圖2A之線2與4)。WR26蛋白則表 見的很差（圖2 A，線6)。全 於听時皆大大地表現。广二種蛋白利用冷休克載體， 蛋白質之表現亦明頻更V吏用冷休克載體’刪與则 現以傳統載體無法表現：：冷休克載體亦可成功地用來表 双現之人類蛋白。 83736 '21· 200401029 線蟲蛋白質生產之時間描述 下y利用冷休克載體檢驗蛋白質生產之時間描述。 選取利用傳統T7載體於37t時表現很差或幾乎不表現之 WR49、。WR3 5與WR26蛋白（圖2A)。將含分別質體之細胞培 養於37 C至OD600達〇.5，然後轉移入15π並以}毫莫耳濃度 IPTG誘導，並於(M料時間，每24小時間隔移除樣本，^ 經SDS-PAGE分析這些蛋白質之表現。圖3顯示此等蛋白質 之表現度。每種蛋白之最大表現可在3_4天内發現，其後即 維持穩定。第二，所有其他的細胞蛋白之表現受到明顯抑 制’使我們吾愛的蛋白質之表現純度約達8 5 0/〇。 利用僅含cspA啟動子之冷休克載體表現蛋白質 本电明者之特定目標係以細胞之轉譯效率9 〇 _ 9 5 %合成喜 炎的蛋白質’其蛋白產率高於總細胞蛋白之6〇_7〇%，其溶 胞物或直揍細胞懸浮液可直接進行Nmr分光光譜分析。在 此方面該融合蛋白產生一個問題，即經NMR分光光譜分挥-雨需將喜愛的蛋白與CspA分離並純化。因此，本發明者之 實驗室亦建構具cspA啟動子而無cspA編碼區域之冷休克載 體。§亥載體亦於CSpA5'-UTR上游包含lac操作者，因此，利 用IPTG可誘導喜愛的基因。我們選用以醫藥觀點很重要之 T -干擾素蛋白。將編碼7 -干擾素之基因選殖入此載體並 如上述檢驗線蟲蛋白般檢驗其於丨5 時之生產情形。圖4 A 顯示T -干擾素於37°C與15°C之表現。與事實一致者為， espA 5’-XJTR係負責cspA mRNA之不安定性及其於37°C無 法表現之原因，在此溫度未發現r -干優素之表現（線6)。另 83736 -22- 方面其於15 C時表現（線2-5)。然而，因帶過3VC之生長 。’ ^可能出現其他細胞蛋白。為檢查此可能，將細胞於15 :、每脈衝標$。將細胞培養於標定培養液至指數期並轉移 ^ C如如述，將培養液1毫升部份以5毫升3 5 s -甲硫胺酸 ，定（Xia等人200 1)。添加非放射性甲硫胺酸追蹤細胞。以 ^先莫耳γ農度填酸鈉緩衝液（pH 7.〇)洗細胞並再懸浮於1 〇〇 毛升樣本緩衝液。樣本經3£)3_1>八(}]£分析。經發現了 -干擾 素包括超過細胞標定之蛋白9〇%(圖4B，線2)。其意指以冷 休克載肚，於1 5 C時幾乎只生產7 _干擾素。因此，此法在 以諸如13C或l3N之同位素將蛋白特定標定時極有用，其允 許不需純化蛋白即可做NMR分光光譜分析。 辨識幫助蛋白質合成起始2mRNA下游的順_單位 為進一步改善本冷休克載體系統，本發明者之實驗室經 由利用lacZ表現系統建構分子目錄，開發幫助蛋白質合成 起始之起始密碼子下游mRNA順-單位。所用序列如下兰

S'-GGATCTAGAGGGTATTAATAATGACTGGTGCANNNNNN ί^ΝΝΝ-1 acΖ-終止k號_3 ’（序列編號：11)。起始密碼子與 任意插入序列下方皆標線。此序列係選殖在IpTG_誘導 PlNIII載體（Inouye，19S3)，而且該質體係轉形入CL83細胞 。任思選取1 3 0個純種系並定序。 130個純種系中，57個係根據?^11以所述方法（如11„，1992) 選來測定β-半乳糖酶活性。最有趣的是，β_半乳糖酶活性 之範圍係由1500〜43000單位，顯示密碼子4至密碼子7之編 碼區域在基因表現上扮演重要角色。儘管沒有任何特定共 83736 -23 · 200401029 識序列負責較高之酶活性（資料未顯示），在純種系中（A + T)/(A+ T + G+ C)之比值接近70%，顯示高的β-半乳糖酶活 性（圖5)。也很明顯的是，在顯示較高lacZ表現之純種系， 最常用之密碼子為編碼諸如Tyr、Thr、Leu與lie之胺基酸者 。選取四個具高β-半乳糖酶活性之純種系，而且，每一個 之骨架轉移皆導入突變。例如由表1所見，除了造成導入停 止密碼子（表中下標線）之兩個突變外，突變中無一對lacZ 表現有顯著效果。 表1 骨架轉移突變對β-半乳糖酶活性之效果。 插入序列 TGCAKKWiNNNNNNNNCCAA (序列編號 13) β-半乳糖酶(單位) 純種系1 : 原始岸列 ATT TAT ΑΤΑ TAT (序列編號 ：14) 42440 骨架轉移突變 CAT πΑ TAT ΑΤΑ (序夕1丨編会 :15) 41823 骨架轉移突變 TTT ΑΤΑ TAT ΑΤΑ (序列編號 ：16) 42220 純種系2 : 原始库列 > ACT TTT ACA AAG (序列編號 17) -42150 骨架轉移突變 CAC TTT TAC AAA (序列編號 18) 41823 骨架轉移突變 CTT TTA CAA AGA (序列編號 19) 43824 純種系3 : ..一 原始序列 ACA CAT GAA CAC (序列編號 2U) 37228 骨架#移突變 CAC ACA TGA ACA (序列編號 21) 519 骨架轉移突變 CAC ATG AAC ACA (序列編號 22) 35495 純種系4 : 原始序列 CAT AGT TTT CAA (序列編號 23) 35804 骨架轉移突變 CCA TAG TTT TCA (岸列編號: 24) 759 骨架轉移突變 ATA GTT TTC AAA (序列編號 25) 35100 因此，特定密碼子之用法對lacZ基因表現無任何效果。此 支持高AT含量對較高量表現是很重要的觀點。因而，下游 盒子之轉譯增強效果，似乎係因其較高之AT (AU)含量而非 因其與16S RNA之互補序列造成。因為富含A/T-序列較不安 定之二級結構可能造成核糖體起始數目之增加，起始密碼 83736 •24- ^υυ^υιυζν 田s Α/τ•序列或可增強大腸桿菌之蛋白質轉譯。 曰加之β-半乳糖酶活性係因增加之蛋白質表現 進一步分析上述之57個純種系之關於其蛋白質情形與β_ +礼糖_活性。將含個㈣體之細胞培養於坑至〇議 請達〇.5並以i毫莫耳濃度IPTG誘導。利用sds_page分析 蛋白之表I ’並利用密度儀分析測定蛋白質帶之密度。卜 半乳糖酶活性係如先前所述進行。如圖6可見，卜半乳糖酶 活性與個別蛋白質之量對應良好。本發日月者下結論為較高 ,β:半乳糖酶活性，係因蛋白質本身之較高專一活性。 車乂同之β-半乳糖酶活性係因增強之轉譯而非轉錄所致 根據其β_半乳糖酶活性，可將所得純種系分成四類，當 ”’屯種不具酶單位之範圍為⑴g，〇⑽_35,〇〇〇、⑴) ，、25’〇〇〇、（1^)25,0〇〇-1〇,〇〇〇與（1¥)1〇〇〇〇以下。選取 16個代表全〜部這四類（每類相）之純㈣，並借引子延伸， 利用相田於lacZ之寡核苷酸檢驗hcZ mRNA之量 ⑹chegaray等人.，1991)。圖7顯示這些純種系之卜半乳糖 酶活性、蛋白的量與lacZ mRNA之量。類似圖6所示，^半 礼糖_活性相當於蛋白質量。然⑥，該顯示高與低量卜半 礼糖酶活性之純種系，顯示類似之mRNA的量，顯示 車乂问之β-半礼糖酶活性非由於轉譯之向上調節。因此，本 發明者下結論此係轉譯增強之結果。 起始密碼子下游之富含α/τ(α/⑺單位增強轉譯之起始 接著本叙明者之實驗室探索是否轉譯起始或是延長負 貝此效果。$取兩個顯示最高與最低活性之純種系。圖8 83736 -25- 200401029 所示為其序列’序列編號：14與序列編號：26。具β-半乳 糖酶活性42,440單位之純種系在起始密碼子下游，具有富 含Α/Τ-序列’ ΑΤΤΤΑΤΑΤΑΤΑΤ(序列編號：1 4);至於，具44 1 0 單位之純種系具富含G/C-之對應單位CGGTCTCTCCGC(序 列編號：26)。檢驗這兩個純種系之核糖體情形。製備核糖 體並如先前所述加以區分（Etchegaray等人.，丨996與Xia等 人· ’ 200 1)。進行引子延長以檢驗iacz mRNA於多核糖體與 70S、5 0S或3 0S核糖體之分布。亦檢驗〇mpA mRNA之量做 為負面對照組。如圖8可見，具較高活性之純種系與較低 半乳糖酶活性之純種糸比較，於荒糖梯度之多核糖體與7 〇 s 部分顯示較高之丨acZ對ompA mRNA之比值。此建議較高之 β -半乳糖酶活性之表現係因起始密碼子下游之富含Α/τ_序 列所媒介之增強的轉譯起始所致。 ^ 實例2 負貝L A C E效應之c s p A m R N A之轉譯順單位之辨識 工

我們認為含159鹼基長度5，-UTR(未轉譯區域）之cspA mRNA係扮演負責LACE效應之必要角色。本發明者之實驗 至顯不，LACE效應係因cspA mRNA誘捕全部具細胞功能之 核糖體所造成’藉此抑制其他全部mRNA形成供轉譯之起始 錯合物。我們推測，cspA mRNA防止其他全部mRNA與 核瑭te作用，係因其具有與核糖體形成起始錯合物之高效 率能力。 在原核細胞至少有兩個重要的轉譯起始單位：一個為核 才。體'”Q 5序列，即所謂的Shine_Daigarano序列（sd);另一個 83736 -26- 200401029 為起始密碼子AUG。此外，亦有人報導一些其他增強轉譯 起始之單位（G〇ld等人.，1988)。例如，據報導在sd上游有 —轉譯增強單位名為”ε”（〇lins等人 1989)。亦有人辯論 ，起始密碼子下游是否亦有一個單位，名為"下游盒子" (EUhegaray 等人·，1999&與 1999b ; 〇,c〇nn〇r 等人 Η%)。 需注意，也很重要的*5,UTR之二級結構亦涉及轉譯起始之 調節1別是在或靠近SD序列形成之：級結構，通常對起 始錯合物之形成具抑制性（Yamanaka等人.，^ 。 細菌mRNA在細胞中之安定性亦為調節基因表現之另一 重要因素。特別是諸如具有不正常長度5,_utr之cspA mRNA通常更易遭受核酸内切酶攻擊。事實上，該“PA mRNA在較高溫度係高度不安定的。於37<>c時，其半衰期僅 有12秒，而且經顯示此不安定性與SD序列密接上游之富含 AU-序列有_關。結果顯示此區域之驗基取代突變，強列地 使cspAmRNA安定化，故於37t時CspA之產生變成結構侄 (Fang等人，1998)。我們將辨識出轉譯起始增強所需之cspA 5'-UTR中之單位。經由這些分析，可能會進一步改善轉譯 起始之效率。我們將採取下列方法。 ⑴發展評估轉譯起始效率之系統 經顯示LACE效應係因cspA mRNA之高效率的轉譯起始 能力（Xia等人.，2001)。LACE效應之定義為（3)於15°c時， 一個純種系對帶該純種系的細胞之菌落形成之抗;生素效果 ，（b)該純種系於丨5°C時對[35s]甲硫胺酸併入總細胞蛋白之 效果，其可利用SDS-PAGE分析與（c)帶有LACE-造成純種系 83736 -27- 200401029 的細胞之生長曲線 為評估個別純種系之應強度，若能定量評估 LACE效應是很重要的。例如’在稍早經由將無意義密碼子 刀別插第2第1 1與第3 1密石馬子所建構之pA〇ls、pAl〇s MpA30S之（f形’在espA基因之情形，本*明者之實驗室 顯示於15°C時完全抑制®落之形成’而且幾乎完全抑制冷 休克後於15t時[、甲硫胺酸之併人細胞蛋白。然而，若 囷洛形成與蛋白合成係在較高溫度測定，可能得藉由其 LACE效應之有效性評估此三個純種系。這些帶嚴苛 效應之純種系，可能在2〇1、甚至25t時仍維持其有效之 LACE效應；然而，帶較弱LACE效應之純種系可能在2〇t 時會開始形成菌落，且可能在此溫度亦可見蛋白合成。因 而，簡單的塗覆培養盤方式應該可以評估個別造成_lace 純種系之兔效性。本發明者之實驗室會以其實驗室可得之 造成LACE-純種系’ pA01s、pA1〇s與pA3〇s測試此方法 專人200 1)。會將帶有此質體之細胞塗覆於4個LB膠的培 養盤’並分別培育於37、25、20與15t。會藉檢查較高溫 時對菌落形成之抑制’亦藉特定溫度時之菌落大小，將 LACE效應之強度分類。 然後，會利用[35S]甲硫胺酸之併入與生長曲線，證實不 同溫度時之LACE效應。我們很可能可取得由這些方法任何 之一所建構之個別純種系之LACE有效性評估的類似結果 。然而’因為在這三者中培養盤塗覆最簡單，若其證實與 其他方法一樣有效我們便使用此方法。 83736 •28- 200401029 (ii) cspA mRNA之 5’-UTR分析 特定RNA之二級結構可採用多種方式晝出’特別是細胞 中之mRNA採用的正確二級結構很難決定。然而，可用電^ 程式預測某mRNA之可能、安定的二級結構。圖9顯示利用 Zuker 程式（3.m，可由 www.bi〇inf〇mathrpi.edu 取得）藉由 電腦分析之cspA mRNA之5，-UTR的RNA纏繞之最穩定二級 結構。其顯示由I至VI之6個二級結構，經計算其安定度分別 為-7.0、-14.8、-2.1、-8_3、2.7、1.5大卡。標示為 νπ之二 級結構係在3’端所形成者，且經認定為p_獨立之轉錄終止者。 這6個二級結構令，已知結構I為冷盒子，其對CSpAmRNA 安定性很重要；因此，不可將其消減。在本研究其他心至v 結構的角色之方法，係利用在其CSpA之編碼序列之第3 1位 置有一热意義狯碼子之p A3 〇S而逐一將其刪除，以檢查刪 除對LACE养應之效果（幻&等人·，2〇〇1卜若發現刪除產生: 任何效果，特別是結構π情形時，會進一步將此大結構解 剖成小片段。如圖9所示，可將莖區域進一步分成三部份， Ila、lib與lie。將建構下列刪除物八11&、、ahc、△ IlbA lie、△ Ila^ lib與△ iiaA IIc。將利用部分⑴發展出之 塗覆培養盤方法’檢驗pA3 〇s的這些刪除之lace效應。 結構IV之角色 稍早所不’此區域在轉譯效率扮演重要角色（Yamanaka 等人19 99)。本發明者之實驗室報導名為上游盒子之13 個鹼基序列（鹼基123至135 ; UB序列），其在cspA、cspB、 espG與cspl係經高度保存，且位於sd序列上游1H@鹼基， 83736 -29- 其可能是除了 SD序列 之順單元（Xia等人.， 一步藉由刪除該結構 用鹼基取代以檢驗此 結構V之角色 外，另一個涉及cspA mRNA轉譯效率 2 001 與 Yamanaka 等人，Μ”）。將進 内之較小結構來解剖該結構，以及利 結構之正確條件。 也很有趣來注意有人提出SD序列有—個順單位名為Y 可增強嗤菌體T7某基因之轉譯（〇Uns等人.，1989)。該時 列’ UUAACUUUA(序列編號：27)最初係在嗤菌肪基因 1〇之領導區域發現。據報導，t延長與⑽⑽故互補性 時’該ε會由增強者轉換成獨立之轉譯起始者。經顯示仏 其與16S irRNA之天然的9-核菩酸長之互補物與離起始密石馬 子長距離之核答酸扮演轉譯起始者時顯示最大活性。這 些條件下，其效率相當於共識的Shine_Daiga·序列 (Golshanif人· ’ 2000)。結構V之序列類似於ε序列。 首先，會分析SD序列密接上游之1〇_鹼基序列 UUAAUUAUUA(序列編號：28之核菩酸16_25)#lace效應 之角色。此類似ε-序列僅包含八與U殘基。將建構不同刪除 突變體（圖10Α之突變體1、2、9、1〇與η)以及取代突變體 之效果會透露此單位 (突變體3-8)。這些突變體對LACE效應 ，就我們提出之ε序列而言，是否有獨特序列需求。若本發 明者之實驗室能顯示該10·鹼基序列對增強轉譯（或lace 效應）扮演顯著角色’將檢驗該序列是否本身無需SD序列即 能起始轉譯。為此目的’會利用將〇邛八SD序列（AAGG)突 貪成AACC(圖10B之突變體12)而將其消減。若突變體12產 83736 •30- 200401029 生L A C E效應’可將該1 〇 _驗基序列刪除，俾證實此區域事 Λ上係核糖體結合所需（突變體1 3)。後續，會利用如突變 體1 4、1 5與1 6所示之刪除突變法已決定類似_ε序列與起始 密碼子間之距離需求。 很可能所謂ε序列之功能表現係因其富含ΑΤ，而非任何序 列專一性。為此理由，本發明者之實驗室亦會參雜或延長 本10-鹼基之AU-序列至長度為13_、14_與16_鹼基之AU_序 列，以檢查其對lace效應之效果。若該富含AU_序列事實 上會增強轉譯，將比較野生BcspARNA與突變體1(圖1〇A) 以及犬變體1 2(圖1 OB)之多核糖體型態，以證實LACE效應 係因誘捕細胞之核糖體而起。 進一步澄貫結構V在轉譯增強之角色，需以已經建構包含 cspA啟動子、5WTR與融合於丨^2基因達第u密碼子之cspA 編碼區域pJlacZ進行。上述之類似這些的刪除與取代突變. 物，亦會利用此pAlacZ載體來創造。將使用細胞餚 轉移之宿主，以避免由染色體基因產生之cspA的自調節效 果；而且，會利用β-半乳糖酶分析檢查這些質體表現之cspA 的量。經由這些實驗即可決定結構V在轉譯起始之正確角色。 實例3 冷休克載體之建構 會建構三種型式之冷休克載體。在第一型pC〇Mi(圖iia) 係一種基因之編碼區域係與CspA之整個編碼區域選殖做 融合蛋白載體。如圖UA所示，序列編號：45出現在puci9 (New England BioLabs Rpu Λ, A , ，

S ’ WveHy, MA)之鈍端 Hindlll-EcoRI 83736 ' 31 - 200401029 位置做為插入物。第二個載體1?(：〇1€111(圖nB)，係一種我們 喜愛的某基因的編碼區域係選殖在第7密碼子之後，其中密 碼子1-7為在第7個Met密碼子創造之獨特的Ndel位置之

MetAsnHisLysValHisMet(序列編號：50)之載體。此額外序 列係由順-轉譯增強單位(ATGAATCACAAAGTGCATATG ； 序列編號：9，其中該Ndel下標線）所編碼，經顯示採用它 時某種選殖之基因表現比無此序列之純種系的表現高8倍 (Etchegaray等人.，1999)。如圖12B所示，序列編號：46出 現在pUC1.9之鈍端Hindlll-EcoRI位置做為插入物。第三種 型態’ pColdlll(圖11C)，係一種使用Ndel位置直接將編碼 區域選殖在起始密碼子之載體。在此載體中，如圖12c所示 ’序列編號：47出現在PUC19之鈍端Hindlll-EcoRI位置做 為插入物。 此三個氣體pColdl、pColdll與pColdlll是一致的載體，因 為其具有pUC19背景’有cspA啟動子、cspA5，-UTR與cspAP 端轉錄終止位置。其差別為除了此點，^(^耵有cSpA之編 碼區域，而pColdll具有富含AT之DB序列。在pColdl包括 Csp A編碼區域之利益’係在建構天生之高效率轉譯起始性 質。亦可能CspA N-端功能部位之纏繞可幫助選殖的基因產 物之纏繞，如MBP(麥芽糖結合蛋白）_融合蛋白所示情形。 此外，pColdl係設計來含有6個His標籤，隨後為於Ndel選 殖位置上游之Xa因子斷裂位置，使得由此載體產生之產物 得利用Ni-NTA管柱純化；而且可利用X因子之斷裂去除N_ 端片段。 83736 -32- 200401029 需注意很重要的，當使用pColdll載體，需加6個胺基酸殘 基MetAsnHisLysValHis(序列編號：50之殘基卜6)於某基因 之起始密碼子前。因而，需檢驗是否此額外之N -端延長影 響每種情形之選殖的基因產物之結構與功能。得利用此額 外序列之優點以發展抗此序列之抗血清，其可用於產物之 辨識即必要時之純化。 全部這些載體之設計皆是使喜愛的基因之Ndel-BamHI 片段可選殖在相同骨架，且在pCold與傳統pET載體間可互 換。若喜愛的基因對大腸桿菌生長有毒性，即使該基因表 現之低量漏出亦會對37°C之生長帶來問題。為此理由，將 建構在其cspA轉錄起始位置之密接下游具有lacl操作者序 列，ATTGTGAGCGGATAACAATTGATGTG(序列編號：10) 之pColdl、pColdll與pColdlll，使該選殖基因之表現在低溫 時僅在IPT9存在時才被誘導。這些pCold載體將分別名為 pColdlo、pColdllo與 pColdlllo。 次外，將試著決定對較高之冷休克表現最可能之SD序列 ，而起始密碼子下游之序列（下游盒子）的效果如下： (i) SD序列 在cspA mRNA所見之SD序列（AAGG)與16S RNA之3’端具 最高互補性之可能的SD序列比較，並非最佳序列。利用改 變cspA SD區域成較長之共識序列可能改善，例如在cspA mRNA插入AGG成AAGGAGGU。如圖1 0A與1 0B，將利用逐 一鹼基之定點突變來改變該SD序列。最後，將決定載體之 最佳SD序列。 83736 -33- 200401029 (ii) pColdlll中某AUG之下游序列的轉譯增強效果 由加在第4至第7密碼子（12鹼基序列）區域之任意序列分 析之實驗判斷，所謂的下游盒子（DB)效果事實上在轉譯起 始時產生其效果。如實例}所示（圖5),顯著增aLACE效應 之DB序列，基本上包括富含AT_序列（但非最初由 及其同事（1 996)所提出之與丨6S rRNA &互補之序列）。有趣 地即使其直接由其起始密瑪子表現（圖4 A與4 B )，表現非 常高量之γ-干擾素，在此區域的12殘基中有9個為Α/τ殘基 。當使用pColdlll載體時，利用改變密碼子之第3個鹼基之 G或C成A或T，可由第4密碼子至第7密碼子增加該區域之 AT含1。因為密碼子用途之退化性，此改變並不會改變此 區域之胺基酸序列。一旦，將一個基因選殖入pC〇ldni，將 檢驗每個純種系是否改變其前7個密碼子之AT含量的效果 對基因產％之表現較好。 實例4 _ 宿主系統之改善 為取得使用上述冷休克載體欲表現之蛋白的最高產率， 本發明者想要改善宿主系統並建立低溫時之生長條件。該 宿主細胞之重要考慮為⑴選殖基因2mRNA安定性（ii)延長 適應期以阻斷冷休克適應與（iii)增加諸如CsdA之冷休克核 糖體因子之生產’其可増強轉譯起始與蛋白合成。 ⑴以pnp刪除細胞為宿主細胞於15它時之選殖蛋白的延長 表現 在冷休克時，大腸桿菌生長短暫停止，而且在此適應期 83736 -34- 200401029 特定冷休克蛋白受到高度誘導。在適應期結束時，其合成 降至新的基準量，然而，非冷休克蛋白合成繼續，造成細 胞生長再起始。聚核苷酸磷酸化酶（pNPase)為冷休克誘導 外核糖核酸酶且係涉及mRNA降解之RNA降解體 (degradosome)之成分。在本發明者之實驗室經顯示 係於適應期後期壓制Csp生產所需者。經發現pNPase係l5 。(：時csp mRNA之選擇性降解所需要者（Yamanaka等人，， 2001)。在某PnP突變體，冷休克時Csps之誘導可如於野生 型所見者般正常，然而，其生產不再是自我調節者，且在 整個冷休克處理期皆維持高量。此造成細胞生長逮捕，及 25°C以下之菌落形成能力劇減。結果是冷休克時即使在μ 小時後細胞仍維持高量之Cspse在某聚（A)聚合酶突變體與 某CsdARNA解螺旋酶突變體，冷休克時CsdA之表現明顯延 長，顯不PyPase協同聚（A)聚合酶，而CsdA RNA解螺旋酶— 在冷休克適應扮演重要角色。因而，使用pnp刪除品系做我 |門冷休克載體之宿主，可幫助較長期地維持選殖基因之表 現。這種細胞已可在我們實驗室取得。預期在無pNPase時 由本叙明之冷休克載體表現之CSpA可延長，造成喜愛的 蛋白之延長表現。該pnp刪除細胞將以含相當於編碼喜愛的 蛋白之基因的插入物之冷休克載體轉形；而且該細胞將於 37C培養至OD600達〇.5，然後轉移至15它。在〇_丨2〇小時期 間每12小時會移出樣本，利用SDS_pAGE分析蛋白生產情形。 (π)於1 5°C以rbfA刪除細胞做宿主細胞時選殖蛋白的延長 表現 83736 -35^ 200401029 rbfA基因編碼與游離3〇s但非7〇s核糠體次單位連結之15 kDa之蛋白（RbfA)(Dammei等人，1995)。該基因最初分離 時係做為位於1 6S之5’螺旋的主要冷敏感突變之多複製數 壓抑者。該rbfA刪除突變者顯示如同pnp刪除細胞之低溫的 受損生長之類似方式（Dammel等人.，1995)。本發明者之實 驗室顯示RbfA為冷休克蛋白且在rbfA刪除品系時，儘管期 低溫時之生長受嚴重抑制；但是，冷休克蛋白與核糖體蛋 白受岗度誘導’且其表現變成構造性’類似pnp刪除細胞之 方式（Damme 1等人.，1995)。本發明者之實驗室最近顯示 RbfA具雙重功能’因為其涉及30S核糖體次單位之成熟與 低溫之轉譯起始。考慮rbfA刪除造成諸如CspA之冷休克蛋 白的結構表現之事實，這些細胞對在1 5 °C時使用冷休克載 體之蛋白的表現會很理想。 已建構pnp與rbfA刪除品系，而且將創造這兩個基因之雙: 重刪除突變體以表現利用冷休克載體之蛋白。該rbfA突變 體品糸名為BX41，係經由CD2 8品系轉導破壞之rbfA對偶基 因建構成。Dammel與Noller (1995)揭示之CD28係取自其實 驗室，並利用P1噬菌體轉導至MC4100。由Kushner博士實 驗室的Arraiano等人之文章揭示的pnp突變品系係得自其實 驗室（1988)。 將使用以r b f A 〇口糸之电囷體Pivir -媒介之pnp品系的轉導 (Miller, 1992)以創造雙重刪除突變體。例如，使用ρι噬菌 體以生產rbfA突變品系之溶胞物，然後利用rbfA溶胞物與 pnpase (pnp)突變品系經P1轉導製成rbfA ' pnpase雙重突變 83736 -36- 200401029 體。檢查P 1轉導後每個菌落之rbfA PCR產物，以證實其是 否為rbfA突變體。製成這些突變品系之競爭細胞，然後將 p IN r b f A貝體轉形入競爭細胞’培育於15 並檢杳冷敏感 性以證實是否有雙重突變。 (iii) CsdA對選殖基因表現之角色 據報導，利用遠西方（Far Western)分析，大腸桿菌之聚（A) 聚合酶會與 RNA、RNase E與 RhlE、SrmB與 CsdA之 DEAD-盒子RNA解螺旋酶作用（Raynai等人·，1999)。其中CsdA為 冷休克誘導蛋白’且具有在無ATP時解旋雙股螺旋RNA之能 力。（Jones等人·’ 1996)。類似RbfA，CsdA係低溫生長所 必須（資料未顯示）。有人提出CsdA功能對核糖體利用低溫 時形成之安定的二級結構之增強mRNAs轉譯效率之功能係 必須的（Jones等人.，1996)。 我們建構其冷休克基因表現之延長類似pnp與rbfA刪陣· 品系之csdA刪除突變體。將來自puC7Km (Pst)之康黴素抵 抗基因（1.3K HincII片段）插入ρκΧ164中之EcoRV位置的 csdA基因（替代地deadD舆mssB)之編碼區域中間成為 pKNJ9026。然後將該含破壞的csdA (csdA: : Kan)之直線 化的PKNJ9026 DNA片段導入recD突變體FS1 576的染色體 中。分離具康黴素抗性之轉形體並利用南方雜合反應證實 染色體之csdA是否已破壞。將該csdA : : Kan突變體轉形 入野生品系MC4100，生成KNJ130。然而，該csdA删除可 能無法如對pnp與rbfA刪除時所預測者般幫助選殖基因表 現。因為CsdA可能是非冷休克蛋白mRNAs解旋所必須。因 83736 -37- 200401029 我們的冷休克系統將用於非冷休克蛋白，故宿主系統之 CsdA甚至可能幫助選殖基因之表現。因為轉譯起始所需之 單位係來自cspA，故需注意相對於CsdA，RbfA似乎非我們 的冷休克載體的選殖基因表現所必須。 以這些考慮為基礎，我們不 括CsdA過度表現對選殖入我們的載體之一些基因表現的 效果。其係經由將這些基因選殖入ρΙΝΠΙ載體，並與冷休克 載體共轉形入細胞來進行CsdA之過度表現（Inouye，1 983) °利用pINIII載體，可在冷休克之前以IPTG誘導CsdA，且 將評估其對喜愛的基因之表現的冷休克誘導效果。 (iv)生長培養液條件之標準化 . 本研究之目標係合成佔總細胞蛋白合成量達90-95%而蛋 曰產率高於總細胞蛋白60-70%之喜愛的蛋白。經離心去除 諸如膜部免與核糖體部分之不可溶物後之溶胞物， ^ …、而 進一步純化即進行NMR分光光譜分析。在此情形，即使為 〉谷解之總細胞懸浮液亦得進行NMR分光光譜分析。因而， 在冷休克後父換培養液（例如由nc_葡萄糖基培養 液改成13C-葡萄糖/HNH4Ci_基培養液）僅喜愛的蛋白會標 ° 京’可消減純化步驟。假設某分子量20 kDa之蛋白之 產生係總細胞蛋白量之6〇%(注意，於冷休克時僅此蛋白為 新0成者），該蛋白之每升總產率約為120毫克。若此蛋白 、K可/谷型式且係由培養液製成*毫升溶胞物 盈隨後並趙雜、、K 弋離〜以去除細胞碎片、膜部分與核糖體部分 我們可得3 0 , 于川笔克/耄升或1.5毫末耳濃度之喜愛的蛋白，其可 83736 -38- 200401029 直接進行NMR分光光譜分析。因nmr分光光譜分析可使用 少於1毫升來進行’培養體積可減至250毫升以下，其可將 昂貴的l3C-葡萄糖與bN_NH4C1[或（i5NHU)2S〇4]用量減至四 分之一。得單獨或組合使用經15N、！3C或二者標定之胺基 酸。甚且，當細胞無法於所提條件下冷休克生長時，整個 碳使用量應比生長的細胞少很多。因而，培養液之葡萄糖 濃度可比一般使用之13c-葡萄糖濃度低（0.2%)。此進一步減 少昂貴的13 C -葡萄糖之花費。 為決定在細胞冷休克培育期間葡萄糖轉化有多少受 LACE效應影響，將測試冷休克後葡萄糖濃度（〇 2%、〇15% 、0.1%、0.05%與0.025%)對蛋白生產之效果。將測試帶有 實例1所述的表現系統細胞。冷休克前離心收集細胞（1〇毫 升培養液），以M9培養液洗之，並再懸浮於含不同葡萄糖濃 度之10毫先的M9培養液。這些培養加上對照組培養（未離心 ，總數6個培養）將培育於15t，並每24小時檢驗其蛋白坐 產’共5天。以此方式，可在不減少蛋白產f情形決定培養 液所需之最低葡萄糖量。葡萄糖濃度決定後，該條件將應 用於所得之少數純㈣，其生產高產率之可溶蛋白以= 標定％與、。將使用溶胞物進行這些蛋白之n败分光光 譜分析，並將評估冷休克載體之有效性。 刀 未經蛋白純化之NMR分光光譜分析 利用未經蛋白純化之整個溶胞物的上澄 光譜分析[WMhsqc]。為此實驗，使用:NMR分光 種大腸桿菌之 83736 -39· 200401029 滲透壓感應組胺酸激酶EnvZ之ATP-結合功能部位（1 64個殘 基）’做模型系統，因其NMR溶液結構已在本發明者之實驗 室與安大略癌症研究所（Ontario Cancer Institute)之Ikur a博 士合作下被解出（Nature 386: 88-92，1998)。 令帶有pCold-EnvZ (ATP-結合功能部位或片段B)之大腸 桿菌BL21的500毫升M9最少培養液培養至〇〇60()_達0.6。離 心收集細胞並再懸浮於250毫升之含0.1 W15 NH4C1與0.4% 葡萄糖之預冷的M9最少培養液。在此再懸浮細胞於1 5。(：生 長4 8小時後，離心收集細胞並利用重複冷凍-解凍與超音波 震盪融解細胞。超離心分離細胞碎片與膜部分（凝塊）後， 上澄液直接進行NMR分析。 圖14A顯示超離心後生成之上澄液經SDS-PAGE膠後之 庫馬錫亮藍染色結果。圖14A之EnvZ的ATP-結合功能部位 代表幾達總二蛋白樣本之80%。應特別注意的是，圖14A之跑 膠皆果的大部分微小的帶係細胞於37°C生長時帶過的，B 此未標定13N。圖1 4B顯示超離心後總溶胞物、生成之凝塊 與上澄液之SDS-PAGE跑膠結果。 由總溶胞物上澄液未經任何蛋白純化步驟（圖丨5 A)取得 相當於純化之EnvZ的ATP-結合功能部位（圖15β)之光譜的 明顯（〖Η-^Ν) HSQC NMR分光光譜。此利用冷休克系統達 成的唯一 l3：N與/或13C之單一膜蛋白標定，使我們得不經蛋 白純化即就位決定異源多肽與膜蛋白之結構。 既經元全說明本發明’熟諳此藝者會了解可使用廣範圍 之相等的參數、濃度與條件進行相同做法而不偏離本發明 83736 -40 - 之精神與範圍亦無不適當之實驗。 儘營已聯合其特定具體實施例來說明本發明，應了解其 可再進一步修正。此應用係欲涵蓋通常遵照本發明原理之 任何本發明的改變、用途或修正；且包括儘管偏離本發明 之揭示卻為本發明所遵照之此藝範圍内已知或習慣操4法 涵蓋者，且可應用於先前所示之必要特徵以及如下之附屬 申請專利範圍的範疇。 本文所引用之全部參考資料，包括期刊文章或摘要，出 版的或相當的美國或外國之專利申請、簽署的美國或外國 專利，或任何其他參考資料，皆全文並列於本文供參考， 包括引用的參考資料中之全部資料、表格、圖形、與内容 。另外’參考文獻内引用之參考文獻全文亦全文並列於本 文供參考。 已知方％步驟、傳統方法步驟、已知方法或傳統方法之 d參考益非任何本發明在相關技藝揭示、教導或建議之方面 、說明或具體實施例之一種承認。 f寺疋具體貫施例之前述說明將完全透露本發明之一般性 質’使其他人能在應用此技藝的技術之知識的情形下（包括 本文引用參考資料之内容）方便地修正與/或改變以供不同 應用；使特定具體實施例’無不當之實驗，未偏離本發明 之一般概念。因而，根據本文所述之教導與指引的此種改 變與修正，係欲遵照揭示之具體實施例等同之意義與範圍 。應了解，本文之詞彙與用語係供說明而非限制之用途， 故本專利申請說明書之詞彙與用語係欲由熟練之技術人員 83736 -41 - 200401029 加上此藝之一般技藝者的知識來 參考本文之教導與指引 做詮釋。 【圖式簡單說明】 圖1顯示冷休克載體原型之結構表示圖。 圖2A與2B為C (2八）與15t： (2B)時線蟲叫叫蛋白 表現的跑膠結丨。圖2A顯示每個情形之具（+)或不呈 (-)IPTG之蛋白表現情形。圖 as.‘貝不於1 5 C ,母種情形於〇 、12與24小枯％ ’利用冷休克載體之線蟲蛋白的表現情形。 圖3顯示以冷休克載體之線蟲蛋白的3個生產的時間情形 跑膠結果。其顯示於15t時，職49、資35與觀6於〇、 24、48、72、96斑]r士々 * α /、 寸之表現。分析總溶胞物。以庫馬 錫染料染細胞。 圖4八與仙係利用冷休克載體表現丫-干擾素之SDS-PAGE =析。。圖咚線丄顯示SDS_PAGE之庫馬錫染色結果：於啊^ 月il 15 C線2-5 .分別為15。〇時於24、48、72與96小時之表 現線6，j7 C %之表現。脈衝標示細胞之SDS_pAGE分析 明見圖4B °線1 . 37 C時之表現’線2_4 :分別為！ 5〇c時】 、3與5小時時之表現。 圖5係N12-下游序列之Α/τ内容與β_半乳糖酶活性之相關 !生表不圖。對57個逢機選取之每一個純種系皆計算其a + τ 之放目，並畫出其對應β -半乳糖酶之圖。 圖6 ^所每知種糸之蛋白質與半乳糖酶活性之關係圖 。將含各別質體的細胞培養於37t；並以IpTG刺激至〇D6〇〇 達0.)。以SDS-PAGE分析蛋白表現並以密度儀分析測定帶 83736 -42- 200401029 之強度。 圖7係顯示所選之純種系之j3_半乳糖酶活性、蛋白量與 lacZ mRNA量之總合的長條圖與跑膠結果。 圖8係純種系之lacz與ompA mRNA之多核糖體情形的圖 形與跑膠結果’其分別顯示β _半乳糖酶之最高與最低活性 。其顯示各別之Ν12序列（序列編號：14與序列編號：26)。 圖9係cspA mRNA5’-UTR之結構示意圖。每一第十個鹼基 皆打點。上游盒子（UB)也晝格，SD序列為粗體字，起始密 碼子下方標線’而cspA ORF以粗體標示並晝格。cspA ORF 上游之5'-UTR序列相當於序列編號：48而cspA ORF下游之 3^UTR相當於序列編號：49。 圖10A與10B顯示在5'-UTR cspA mRNA之SD序列上游之 類似ε序列。ε序列以粗體字表示。圖10A為類似8序列之突 變分析’其：中該野生型序列係以Wt(序列辨識號碼：28)表 示。圖10B為SD序列之突變分析與5序列以及auG之距離》·-該類似ε序列1〜16分別為序列編號：29〜44。 圖11Α〜11C顯示pColdl、II與III載體之結構。 圖1 2 A〜12C顯示核苷酸序列，序列編號：45 (圖丨2a)、序 列編號：46(圖12B)序列編號：47(圖12C)，其係插入以 Hindlll與EcoRI切斷並以Klenow填滿之pUC19載體。 圖13仏啟動子、5UTR與cspA、cspB' cspG與cspl之序列 排列。與cspl —致之核苷酸以點表示。為將排列最大化， 其引入一些缺口並以虛線表示。轉譯開始位置以粗體字表 示，並以+ 1標示。轉譯起始密碼子ATGs亦以粗體字表示 83736 -43 - 200401029 並下畫線。同源性最高之序列（UP單位' -3 5區域、-1 〇區域 '冷盒子、上游序列、Shine-Dalgarno (SD)序列與下游盒 子）皆畫格並標示。 圖14 A與1 4B顯示上澄液（培育4 8小時，冷休克之帶有 pCold-EnvZ ATP結合功能部位之大腸桿菌B；L21的500毫升 培養液）經庫馬錫亮藍染色之SDS-PAGE，經超離心、庫馬 錫亮藍染色（圖1 4A)與大腸桿菌BL2 1經冷休克後之總溶胞 物、凝塊與上澄液之SDS-PAGE(圖14B)。EnvZ ATP結合功 能部位亦名為片段B。圖14B中，線1 :冷休克12小時後， 負載50微升之總溶胞物，線2 :冷休克24小時後，負載50 微升之總溶胞物，線3 :冷休克3 6小時後，負載5 〇微升之總 溶胞物，線4 :冷休克48小時後’負載50微升之總溶胞物， 線5 :於第二回合超音波震盪期間，經i5,〇〇〇 rpm、30分鐘 離心’負載2微升（總量1毫升）的凝塊，線6 :於第二回合超 音波震盪期間，經45,000 rpm、4小時超離心，負載2微 升（總量1毫升）的凝塊，線7 :於第二回合超音波震盪期間 ，經45,000 rpm、4小時超離心，負載1微升上澄液，線8 : 於第一回合超音波震盡期間，經45,000 rpm、4小時超離心 ，負載1微升上澄液（NMR之樣本）。 圖15A與15B顯示未純化之含EnvZ ATP-結合功能部位滲 胞物上澄液之（iH-^N^SQC NMR光譜（圖15A)與純化之 EnvZ ATP-結合功能部位之HSQC NMR光譜（圖1 5B)。 83736 -44- 200401029 參考文獻

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<130> INOUYE=2.1 PCT <140> 092104213 <141> 2003-02-27 <150> 60/361,069 <151> 2002-03-01 <150> 60/402,921 <151> 2002-08-14 <160> 50 <17〇>專利資料3.2版 <210> 1 <211> 539

<212> DNA <213> 大腸桿g <220>

<221> CDS <222> (229)..(441) <400> 1 aaccgattaa tcataaatat gaaaaataat tgttgcatca cccgccaatg cgtggcttaa tgcacatcaa cggtttgacg tacagaccat taaagcagtg tagtaaggca agtcccttca agagtcatcg ttgatacccc tcgtagtgca cattccrtta acgcttcaaa atctgtaaag cacgccatat cgccgaaagg cacacttaat tattaaaggt aatacact atg tcc ggt

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<212> DNA <213> 人工序列 <220> <223>合式的 <400> 46 aaccgattaa tcataaatat gaaaaataat tgttgcatca cccgccaatg cgtggcttaa 60 tgcacatcaa cggtttgacg tacagaccat taaagcagtg tagtaaggca agtcccttca 120 agagttatcg ttgatacccc tcgtagtgca cattccttta acgcttcaaa atctgtaaag 180 cacgccatat cgccgaaagg cacacttaat tattaaaggt aatacactat gaatcacaaa 240 gtgcatatga agcttggtac cggatcctct ctgcttaaaa gcacagaatc taagatccct 300 gccatttggc ggggattttt trarttgitt tcaggaaata aataatcgat cgcgtaataa 360 aatct 365 <210> 47 <211> 350 <212> DNA <213>人工序列 83736 200401029 <220> <223〉 合式的 <400> 47 aaccgattaa tcataaatat gaaaaataat tgttgcatca cccgccaatg cgtggcttaa 60 tgcacatcaa cggtttgacg tacagaccat taaagcagtg tagtaaggca agtcccttca 120 agagttatcg ttgatacccc tcgtagtgca cattccttta acgcttcaaa atctgtaaag 180 cacgccatat cgccgaaagg cacacttaat tattaaaggt aatacactca tatgaagctt 240 ggtaccggat cctctctgct taaaagcaca gaatctaaga tccctgccat ttggcgggga 300 tttttttatt tgttttcagg aaataaataa tcgatcgcgt aataaaatct 350 <210> 48 <211> 162 " <212> RNA <213> 人工序列 <220> <223> 合式的 <400> 48 acgguuugac guacagacca uuaaagcagu guaguaaggc aagucccuuc aagaguuauc 60 guugauaccc cucguagugc acauuccuuu aacgcuucaa aaucuguaaa gcacgccaua 120 ucgccgaaag gcacacuuaa uuauuaaagg uaauacacua ug 162 <210> 49 <211> 25 <212> RNA <213> 人工序列 <220> <223> 合式的 <400> 49 ucccugccau uuggcgggga uuuuu 25 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 合式的 <400> 50

Met Asn His Lys Val His Met 14· 83736

Claims (1)

1. 200401029 拾、申請專利範圍： !· 一種表現異源多肽之DNA分子，其包括： 一個編碼異源多胜之核苷酸序列，與 -操作上連接於編碼該異源多肽之核芬酸序列的冷 休克誘導啟動子與5，_未轉譯區域（5,_utr)，其係以在誘 導冷休克反應條件下，控制該異源多汰之表現舆生產， 其中，若非：⑴一種轉譯增強單位其包含在該冷休 克誘導啟動子與5,.UTR與該編瑪異源多肽之核芬酸序 列：間’配置位於起始密碼子下游約第4_第7密碣子間 之富含AT序列的12個核Ϋ酸，以與該，即是（2)編碼該 異源多1太之核#酸序列在起始密碼子下游約第心第7密 碼子間包括富含AT的序列。 2·根據申請專利範圍帛i項之DNA分子，其中該冷休克誘 導啟動子與5'-UTR係選自由序列編號·· 1之22_441核苷 Ss·序列'扁號.3之11 -2 1 4核钻酸、序列編號：5之} 2_2工3 核答酸與序列編號：7之u_2G1m、彼等之片段及 彼等之變異體所組成之群組。 3·根據申請專利範圍第！項之DNA分子，其中存在（1)。 4·根據申請專利範圍第3項之DNA分子’其中該冷休克誘 導啟動子與5'-UTR係利用該包括7個密碼子之核苷酸序 列的轉譯增強單位而連接於編碼該異源多肽之核甞酸 序列，其中該第一個密碼子為起始密碼子而該第4_第7 密碼子形成上述富含AT的序列。 5 .根據申請專利範圍第4項之DNA分子，其中該轉譯增強 83736 200401029 單位包括序列編號：9之卜1 8核菩酸。 6·根據申請專利範圍第1項之DNA分子，其中該編碼異源 多肽之核嘗酸序列在起始密碼子下游第4-第7密碼子間 包括富含AT的序列。 7·根據申請專利範圍第1項之DNA分子’其在編碼該異源 多肽之核苷酸序列下游進一步包括冷休克誘導基因之 3·-未轉譯區域（3，_UTR)。 ’根據申請專利範圍第7項之DNA分子，其中該3'_UTR係 選自由cspA ' cspB、cspG與cspl所組成之群組之3，_uTR。 •根據申請專利範圍第7項之DNA分子，其中該3'_UTR包 括序列編號：1之442-539核苷酸。 I 〇.根據申請專利範圍第丨項之DNA分子，其中該冷休克誘 導啟動子與5，-UTR區域序列在轉錄起始位置之下游緊 接包括--個lacl操作子序列。 II ·根據申請專利範圍第1 〇項之DNA分子，其中該1 acI操作 子序列係序列編號：1 〇之核：y：酸序列。 12. 根據申請專利範圍第1項之DNA分子，其為載體。 13. 根據申請專利範圍第12項之載體，其為自我複製之載 體。 14·根據申請專利範圍第13項之載體，其為pColdl。 15. 根據申請專利範圍第13項之載體，其為pC〇ldn。 16. 根據申請專利範圍第13項之載體，其為pC〇ldni。 17 ’—種經申請專利範圍第1項之DNA分子轉形之原核宿主 細胞。 83736 ^4〇1〇29 根據申請專利範圍第17項之宿主細胞，其為大腸桿菌。 1 9 ·根據申請專利範圍第丨7項之宿主細胞，其為欠缺聚核苷 酸碟酸化酶活性之聚核苷酸磷酸化酶突變體。 2 0 ·根據申請專利範圍第丨7項之宿主細胞，其為與游離3 〇 s 核糖體次單位而非70S核糖體次單位連結之欠缺丨5 kDa RbfA蛋白之rbfA突變體。 2 1 ·根據申請專利範圍第丨7項之宿主細胞，其為欠缺csdA RNA解螺旋酶活性之csdA RN.A解螺旋酶突變體。 22. 根據申請專利範圍第17項之宿主細胞，其為經在該宿主 細胞過度表現csdA RNA解螺旋酶之載體共轉形者。 23. 一種生產異源多趾之方法，其包括： 將申請專利範圍第1 7項之宿主細胞培養於宿主細胞 正常生理生長溫度之營養培養液中； 將宿主細胞以將培育溫度降至低於宿主細胞正常生 理生長溫度13 t以上之冷休克誘導生產異源多肽；及 將該經冷休克之宿主細胞培育於較低的培育溫度，以 生產異源多肢。 24. 根據申請專利範圍第23項之方法，其進一步包括回收所 生產之異源多肽的步驟。 25 ‘根據申請專利範圍第23項之方法，其中該培育溫度係降 至低於宿主細胞正常生理生長溫度2(rc以上。 26,根據申請專利範圍第23項之方法，其進—步包括將培養 之宿主細胞進行冷休克後，以含供偵測標定的異源多肽 之化合物的培養液交換營養培養液之步驟。 83736 200401029 27. 根據申請專利範圍第26項之方法，其中該化合物包含正 常時在宿主細胞僅發現可忽略量之同位素。 28. 根據申請專利範圍第27項之方法，其中該同位素為ι$Ν 或丨3C。 29. 根據申請專利範圍第27項之方法’其中該化合物係選自 包括15NH4a、（15NH4)2S〇4、13C-葡萄糖、經、標定之 胺基酸殘基、經i3C標定之胺基酸殘基以及經15N與！3c 二者標定之胺基酸殘基。 3 0.根據申請專利範圍第27項之方法，其中該宿主細胞係缺 少一或多種主要之冷休克蛋白的突變體。 3 1.根據申請專利範圍第3 〇項之方法，其中該突變體宿主細 胞缺少CspA。 3 2 ·根據申請專利範圍第3 〇項之方法，其中該突變體宿主細 胞缺少 CspA、CspB、CspG與 CspE。 3 3. —種取得異源多肽之NMr光譜的方法，其包括·· 分離培育於較低培育溫度之根據申請專利範圍第26 項之方法以生產經彳貞測標定該化合物之冷休克的宿主 細胞；及 針對分離出之冷休克的宿主細胞，進行全細胞Nmr 光譜分析，或由分離出之冷休克的宿主細胞之溶胞產物 上澄液進行NMR光譜分析，以取得異源多肽之 譜。 3 4 ·根據申請專利範圍第3 3項之方法，其中進行所分離之冷 休克的全細胞之全細胞NMR光譜分析。 83736 200401029 3 5 ·根據申請專利範圍第3 3項之方法，其中進行所分離之冷 休克的宿主細胞之溶胞產物上澄液的NMR光譜分析。 3 6. —種取得異源多肢之nmr光譜的方法’其包括： 在營養培養液培養原核宿主細胞，該宿主細胞係經包 括編碼異源多肽與反應冷休克時能表現與生產異源多 肚·之核誓酸序列的核酸轉形； 將戎經培養之宿主細胞以降低培育溫度至宿主細胞 正吊生理生長溫度下，之冷休克誘發該異源多肽之生 將伯主細胞付諸冷休克後，以包含供備測標定該異源 多肽用化合物之培養液交換營養培養液： 將經過冷休克之宿主細胞培育於低的培育溫度，以生 產經該化合物偵測標定之異源多肽； 之冷休克的宿主細胞；與

   分離培育於低的培育溫度 針對分離出之冷休克的宿 83736