JP2005518804A - 異種ポリペプチドのコールドショック誘導性発現および生産 - Google Patents
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Abstract
Description
1.タンパク質の誘導を温度低下によって実施するので、IPTGのような化学的誘導物質を必要としない。
2.コールドショックに際して、細胞は、単一の目的タンパク質にささげられたタンパク質合成装置に転換される。全ての細胞性リボソームがベクター中にクローン化されたタンパク質のmRNAに捕捉されるので、細胞中での他の全てのタンパク質の合成は実質的にブロックされる。
3.それゆえ、コールドショック後に培地を交換することによって(例えば、12C−グルコース/14NH4Clベースの培地から13C−グルコース/15NH4Clベースの培地)、目的のタンパク質のみを同位体で標識し、13C、15N−同位体標識した試料のための精製プロセスを除くことができる。
4.分子量20kDaのタンパク質を生産する場合(総細胞タンパク質の60%のレベル、このタンパク質のみがコールドショックに際して新たに合成されることに留意のこと)、1リットル当たりのタンパク質の総収量は約120mgである。このタンパク質の80%が可溶性形態で生産され、4mlの緩衝液中の細胞懸濁物またはこの懸濁物から調製される細胞溶解物(超音波処理し、次いで遠心分離して細胞片および膜画分を除去)を仮定すると、目的のタンパク質の25mg/mlまたは1.25mMの溶液を得ることができ、これをNMR分光法に直接使用することができる。
5.NMR分光法を1ml未満で行うことができるので、培養サイズを250mlに減じることができ、高価な13C−グルコースおよび15N−NH4Cl(または(15NH4)2SO4)の使用を4分の1に削減することができる。さらに、細胞は提唱する条件下でコールドショックに際して増殖することができないので、全体の炭素利用は増殖中の細胞よりずっと少ないはずである。それゆえ、培地中のグルコース濃度を13C−グルコースに通常使用する濃度(0.2%)より低くすることができる。これにより、高価な13C−グルコースの消費がさらに節約される。
6.いくつかのタンパク質は熱変成を非常に受けやすい。特に、より低い温度環境に通常生存する生物(例えば、Caenorhabditis elegans)由来のタンパク質の大腸菌中での発現は、より高い温度で発現させることに問題がある。提唱するコールドショックベクター−宿主系は、この問題を回避する。
7.いくつかのタンパク質の発現はT7ベクター系を用いた場合に、より高いかもしれないが、タンパク質の折り畳みの問題のみならず、転写および翻訳の調節のためにも、他のタンパク質の発現は提唱するコールドショックベクター系を用いてのみ達成されるかもしれない。これは、ヒトから細菌までの非常に多数の遺伝子が利用可能になると、ますます明らかになり得る。
8.ますます多くの医学上重要なヒトタンパク質が同定されているので、これらのタンパク質を可溶性形態で多量に発現させることは重要である。本発明のコールドショックベクター系は、従来のT7発現系の代替または相補系として作用する。
NdeI部位を有しないpUC19ベクター(New England BioLabs, Beverly, MA)を、もとのプラスミドをNdeIで消化し、次いでKlenowでのフィルインおよびライゲーションによって作製した。T7/cspAプロモーター、CspAの5’−UTR領域およびそのコード領域を含むPCR産物を、pCU19ΔNdeIプラスミドのEcoRIおよびHindIII部位にクローン化した。次いで、これら2つの制限部位をKlenowでのフィルインによって欠失させた。部位特異的変異誘発によって、SalIおよびBamHI部位をcspA終止コドンの直後に作製した。6Hisタグ、プロテアーゼ切断用の第Xa因子部位、NdeI、HindIIIおよびKpnIを含むマルチクローニング部位、ならびにcspAの3’領域を含む第2のDNAフラグメントを合成し、このベクター中にクローン化した。プロトタイププラスミドベクターの地図を図1に示す。
いくつかのタンパク質は熱変成を非常に受けやすい。特に、より低い温度環境に通常生存する生物(例えば、C.elegans)由来のタンパク質の大腸菌中での発現は、より高い温度で発現させることに問題がある。5つのC.elegansタンパク質を選択し、G.Montelione博士より提供を受けた(WR49、WR35、WR26、WR27およびWR53と称する、それぞれ、Genebank登録番号:AV185320、AV183398、C50788、D71923およびC48848)。これらをpETベクター中にクローン化し、37℃で十分に発現させることができなかった(図2A)。これらのタンパク質をコードする遺伝子を含む挿入断片を、図1に記載のコールドショックベクター中にサブクローニングした。細胞を37℃でOD600nmが0.5になるまで増殖させ、次いで15℃に移し、1mM IPTG(イソプロピルb−Dチオガラクトピラノシド、T7プロモーターを誘導するため)を用いて誘導し、試料を0、12および24時間で取り出し、タンパク質の発現をSDS−PAGEによって分析した。図2Aは、1mM IPTGを用いた誘導の3時間後のpETベクターを使用した37℃でのこれら全てのタンパク質の発現レベルを示し、図2Bは、それぞれのコールドショックベクターを使用した15℃でのそれらの発現を示す。タンパク質WR49およびWR35は、pET発現ベクターを使用して37℃で全く発現させることができなかった(それぞれ、図2A中レーン2および4)。タンパク質WR26は非常に弱く発現された(図2A、レーン6)。これら3つのタンパク質の全ては、コールドショックベクターを使用して15℃で大いに発現された。タンパク質WR27およびWR53の発現も、コールドショックベクターを使用した場合、有意に高かった。また、コールドショックベクターを使用して、従来のベクターを用いた場合に十分に発現させることができなかったヒトタンパク質の発現に成功した。
次に、コールドショックベクターを使用したタンパク質生産の時間プロフィールを検討した。従来のT7ベクターを使用して37℃で全く発現させることができなかったかまたは非常に弱く発現されたかのいずれかであるWR49、WR35およびWR26タンパク質を選択した(図2A)。それぞれのプラスミドを含む細胞を37℃でOD600nmが0.5になるまで増殖させ、次いで15℃に移し、1mM IPTGを用いて誘導し、試料を0時間から120時間まで24時間間隔で取り出し、タンパク質の発現をSDS−PAGEによって分析した。図3はこれらのタンパク質の発現レベルを示す。各々のタンパク質の最大発現は3〜4日以内に見られ、その後安定に維持された。次に、他の全ての細胞タンパク質の発現が有意に阻害され、その結果ほぼ85%純粋な目的のタンパク質が生産された。
本発明者らの特定の目的は、目的のタンパク質を細胞中90〜95%の翻訳効率で、総細胞タンパク質の60〜70%より高いタンパク質収率で合成し、細胞溶解物または直接細胞懸濁物をNMR分光法に直接使用し得るようにすることにある。NMR分光法の前にCspAからの目的のタンパク質の分離および精製が必要とされるので、融合タンパク質はこの局面で問題を引き起こす。従って、本発明者らの研究室は、cspAプロモーターを有しcspAコード領域は有しないコールドショックベクターも構築した。このベクターはcspA 5’UTRの上流にlacオペレーターも含み、従って、目的の遺伝子をIPTGによって誘導することができる。医学的展望から重要であるタンパク質γ−インターフェロンを選択した。γ−インターフェロンをコードする遺伝子をこのベクター中にクローン化し、15℃でのその生産をC.elegansタンパク質について上記したように確認した。図4Aは37℃および15℃でのγ−インターフェロンタンパク質の発現を示す。cspA 5’UTRが37℃におけるcspA mRNAの不安定性およびそのためのその発現の欠如の原因であるという事実に一致して、この温度ではγ−インターフェロンの発現は観察されなかった(レーン6)。他方、これは15℃ではよく発現された(レーン2〜5)。しかし、他の細胞タンパク質は、37℃での増殖からのキャリーオーバーの結果として存在するようである。この可能性を確認するために、細胞を15℃でパルスラベルした。細胞を標識培地中で対数期まで増殖させ、15℃に移した。以前に記載のように(Xia et al., 2001)培養物の1mlを5mlの35S−メチオニンを用いて標識した。細胞を非放射性メチオニンを添加することによってチェイスした。細胞を20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)で洗浄し、100mlのSDSサンプル緩衝液に再懸濁した。試料をSDS−PAGEによって分析した。ここで、γ−インターフェロンは標識細胞タンパク質の90%より多くを構成することが見出された(図4B、レーン2)。このことは、γ−インターフェロンがコールドショックベクターを用いて15℃でほぼ排他的に生産され得ることを示唆する。従って、この方法は、13Cおよび15Nのような同位体を用いて特異的にタンパク質を標識することにおいて非常に有用であり、タンパク質精製なしに全細胞NMR分光法を可能にする。
本発明のコールドショックベクター系をさらに改良するために、本発明者らの研究室は、lacZ発現系を介して分子レパートリーを構築することによって、タンパク質合成開始を促進する開始コドン下流のmRNAシスエレメントを探査した。使用した配列は以下のとおりである:5’−GGATCTAGAGGGTATTAATAATGACTGGTGCANNNNNNNNNNNN−lacZ−終止シグナル−3’(配列番号11)。開始コドンおよびランダム挿入配列に下線を付している。この配列をIPTG誘導性pINIIIベクター(Inouye, 1983)中にクローン化し、このプラスミドをCL83細胞中に形質転換した。130個のクローンをランダムに選択し、配列決定した。
上記57個のクローンを、それらのタンパク質プロフィールおよびβ−ガラクトシダーゼ活性に関してさらに分析した。それぞれのプラスミドを含む細胞を37℃でOD600nmが0.5になるまで増殖させ、1mM IPTGを用いて誘導した。タンパク質の発現をSDS−PAGEによって分析し、タンパク質バンド強度を濃度測定分析によって測定した。β−ガラクトシダーゼ活性を上記のように実施した。図6からわかるように、β−ガラクトシダーゼ活性はそれぞれのタンパク質レベルによく対応する。本発明者らは、より高いβ−ガラクトシダーゼ活性がタンパク質自体のより高い比活性に起因すると結論付ける。
得られたクローンを、それらのβ−ガラクトシダーゼ活性に基づいて、(i)43,000〜35,000、(ii)35,000〜25,000、(iii)25,000〜10,000および(iv)10,000未満の範囲の酵素単位を示すクローンとして4つのグループに分けることができた。これら4つのグループ全てを表す16個のクローン(各々から4個)を選択し、lacZ mRNAレベルをこれらのクローンにおいてlacZに対応するオリゴヌクレオチドを使用してプライマー伸長によって確認した(Etchegaray et al., 1999)。図7は、これらのクローンにおけるβ−ガラクトシダーゼ活性、タンパク質レベルおよびlacZ mRNAレベルを示す。図6において実証されたことと同様に、β−ガラクトシダーゼ活性はタンパク質レベルに対応した。しかし、高および低レベルのβ−ガラクトシダーゼ活性を示すクローンは同様のレベルのlacZ mRNAを示し、このことは、より高いβ−ガラクトシダーゼ活性が転写のアップレギュレーションには起因しないことを示す。従って、本発明者らは、それが翻訳増強の結果であると結論付ける。
次に、本発明者らの研究室は、翻訳の開始または延長がこの効果を担うかどうかを調べた。最高および最低の活性を示す2つのクローンを選択した。それらの配列、配列番号14および配列番号26を図8に示す。42,400単位のβ−ガラクトシダーゼ活性を示すクローンは開始コドンの下流にA/Tリッチ配列ATTTATATATAT(配列番号14)を有しており、一方4410単位の活性を示すクローンはG/Cリッチな対応する配列CGGTCTCTCCGC(配列番号26)を有していた。これらの2つのクローンのリボソームプロフィールを検討した。リボソームを調製し、以前に記載されたように分画した(Etchegaray et al., 1996およびXia et al., 2001)。プライマー伸長を実施して、ポリソームおよび70S、50Sまたは30SリボソームにおけるlacZ mRNAの分布を検討した。ネガティブコントロールとしてompA mRNAのレベルも検討した。図8からわかるように、より低いβ−ガラクトシダーゼ活性を示すクローンに比較して、より高い活性を示すクローンは、ポリソームおよびショ糖勾配の70S画分においてより高いlacZ/ompA mRNA比を示した。このことは、より高いβ−ガラクトシダーゼ発現が、開始コドン下流のA/Tリッチ配列によって媒介される翻訳開始の増強に起因することを示唆する。
cspA mRNAは、159塩基長の5’UTR(非翻訳領域)を含んでおり、これはLACE効果において最も本質的な役割を果たすと考えられる。本発明者らの研究室は、LACE効果が、cspA mRNAによって全ての機能的細胞性リボソームが捕捉され、それによって他の全ての細胞性mRNAの翻訳開始複合体の形成が阻害されることによって引き起こされることを実証した。他の全てのmRNAの30Sリボソームとの相互作用を妨げるこのcspA mRNAの能力は、その高度に効率的な、リボソームとの開始複合体を形成する能力に起因すると推測される。
LACE効果は、cspA mRNAの高度に有効な翻訳開始能力によって引き起こされることが実証されている(Xia et al., 2001)。LACE効果は以下によって規定される:(a)15℃でのクローンを保持する細胞のコロニー形成に対するクローンの抗生物質効果、(b)15℃での全細胞タンパク質中への[35S]メチオニン取り込みに対するクローンの効果(これはSDS−PAGEによって分析することができる)、および(c)LACE惹起クローンを保持する細胞の増殖曲線。
所定のRNAの二次構造をいくつかの異なる方法で得ることができる。特に、細胞中の1つのmRNAによって取られる正確な二次構造は決定するのが困難である。それにもかかわらず、コンピュータープログラムを使用して、mRNAの見込みのある安定な二次構造を予測することができる。図9は、RNA折り畳みのためのZukerプログラム(バージョン3.1、www.bioinfo.math.rpi.eduで利用可能)を使用したコンピューター解析によるcspA mRNAの5’−UTRの最も安定な二次構造を示す。これは、I〜VIの6つの二次構造が存在することを示し、それらの安定性はそれぞれ−7.0、−14.8、−2.1、−8.3、2.7、1.5Kcalと算出される。VIIで示される二次構造は3’末端で形成されるものであり、ρ非依存性転写ターミネーターであると考えられる。
この領域が翻訳効率に重要な役割を果たすことが以前に示された(Yamanaka et al., 1999)。本発明者らの研究室は、cspA、cspB、cspGおよびcspIにおいて高度に保存されており、SD配列の11塩基上流に位置する、アップストリームボックスと称する13塩基の配列(塩基123〜135;UB配列)が、SD配列に加えて、cspA mRNAの翻訳効率に関与する別のシスエレメントであるかもしれないことを報告した(Xia et al., 2001およびYamanaka et al., 1999)。この構造の正確な必要性を、構造内のより小さな領域の欠失および塩基置換によって構造をさらに切断して調べることによって検討する。
バクテリオファージT7中の遺伝子の翻訳を増強することが提唱されている「イプシロン」と称するSD配列上流のシスエレメントが存在することに留意することも興味深い(Olins et al. 1989)。エプシロン配列UUAACUUUA(配列番号27)は最初、バクテリオファージT7遺伝子10リーダー領域中に見出された。16S rRNAに対する相補性が拡張されると、イプシロンがエンハンサーから非依存性翻訳イニシエーターに転換されることが報告されている。イプシロンが、その天然の9ヌクレオチド長の16S rRNAに対する相補性および開始コドンへの16ヌクレオチド長の距離で翻訳イニシエーターとしての最大活性を示すことが示されている。これらの条件下で、その効率はコンセンサスシャイン・ダルガーノ配列の効率に匹敵した(Golshani et al., 2000)。構造Vの配列はイプシロンに類似している(図9、10Aおよび10B)。
3形態のコールドショックベクターを構築する。第1のタイプpColdI(図11A)は、遺伝子のコード領域がCspAのコード領域全体との融合タンパク質としてクローン化されるベクターである。図12Aに示す配列番号45は、pUC19(New England BioLabs, Beverly, MA)の平滑末端化したHindIII−EcoRI部位内の挿入断片として存在する。第2のベクターpColdII(図11B)は、目的の遺伝子のコード領域が7番目のコドンの後に(コドン1〜7はMetAsnHisLysValHisMet(配列番号50)である)、7番目のMetコドンに作製された唯一のNdeI部位でクローン化されるベクターである。この余分の配列はシス翻訳増強エレメント(ATGAATCACAAAGTGCATATG;配列番号9、NdeI部位に下線を付している)によってコードされ、これを用いてクローン化遺伝子発現がこの配列を有しないクローンより8倍高いことが示された(Etchegaray et al., 1999)。図12Bに示す配列番号46は、pUC19の平滑末端化したHindIII−EcoRI部位内の挿入断片として存在する。第3のタイプpColdIII(図11C)は、コード領域がNdeI部位を使用して開始コドンに直接クローン化されるベクターである。このベクターにおいて、図12Cに示す配列番号47は、pUC19の平滑末端化したHindIII−EcoRI部位内の挿入断片として存在する。
cspA mRNA中に見出されるSD配列(AAGG)は、16S RNAの3’末端との最高の相補性を有する可能なSD配列と比較すると、最良のSD配列ではない。これを、cspA SD領域をより長いコンセンサス配列に(例えば、cspA mRNA中にAGGを挿入することによってAAGGAGGUに)変化させることによって改良し得る。SD配列を塩基ごとに点変異によって図10Aおよび10Bに示すように変化させる。最後に最良のSD配列をベクターのために決定する。
いわゆるダウンストリームボックス(DB)効果は、4番目のコドンから7番目のコドンの領域(12塩基の配列)において付加したランダム配列の解析についての実験から判断したところ、実際、翻訳開始に対してその効果を発揮する。実施例1(図5)に示すように、LACE効果を有意に増強するDB配列は、基本的にATリッチ配列からなる(Sprengartおよびその共同研究者らによって最初に提唱されたような16S rRNAに対する相補的配列ではない)。興味深いことに、それ自体の開始コドンから直接発現させても非常に高レベルで発現されるγ−インターフェロンは(図4Aおよび4B)、この領域に12残基中9個のA/T残基を有する。pColdIIIベクターを使用する場合、コドン4からコドン7の領域のAT含量を、各コドンの第3の塩基がGまたはCであればそれをAまたはTに置き換えることによって増加させることができる。これは、コドン使用の縮重により、この領域のアミノ酸配列を変化させずに行うことができる。一旦遺伝子をpColdIII中にクローン化すれば、最初の7つのコドンにおける変化したAT含量の効果が各クローンの遺伝子産物の発現にとってより良好であるか否かを検討する。
上記コールドショックベクターを使用して発現しようとするタンパク質の最大収量を得るために、本発明者らは宿主系を改良して、低温での増殖条件を確立しようとする。宿主の改良についての重要な考慮は以下のとおりである;(i)クローン化遺伝子のmRNAの安定化、(ii)コールドショック適応をブロックするための馴化期の延長、ならびに(iii)翻訳開始およびタンパク質合成を増強し得るコールドショックリボソーム因子(例えば、CsdA)の産生の増加。
コールドショックに際して大腸菌細胞の増殖は一過性に停止し、この馴化期の間に特異的コールドショックタンパク質が高度に誘導される。馴化期の終わりにそれらの合成は新たな基底レベルまで低下し、その間に非コールドショックタンパク質合成が回復し、細胞増殖が再開する。ポリヌクレオチドホスホリラーゼ(PNPase)はコールドショック誘導性エキソリボヌクレアーゼであり、mRNA分解に関与するRNAデグラドソーム(RNA degradosome)の成分である。PNPaseは、馴化期の終わりにCsp産生を抑制するために必要とされることが、本発明者らの研究室において示されている。PNPaseは15℃でのcsp mRNAの選択的分解に重要であることが見出された(Yamanaka et al., 2001)。pnp変異体において、コールドショックに際してのCspの誘導は野生株と同様に正常に観察された;しかし、それらの産生はもはや自己調節されず、コールドショック処理を通して高レベルで維持された。これにより、25℃より低い温度での細胞の増殖停止および劇的なコロニー形成能の低下が生じた。その結果、コールドショックに際して、細胞は24時間後でも高レベルのCspを維持した。ポリ(A)ポリメラーゼ変異体およびCsdA RNAヘリカーゼ変異体において、コールドショックに際してのCsp発現は有意に延長される。このことはPNPaseがポリ(A)ポリメラーゼおよびCsdA RNAヘリカーゼと協力してコールドショック適応において重大な役割を果たすことを示す。それゆえ、本発明者らのコールドショックベクターのために宿主としてpnp欠失株を使用することは、ずっと長い期間のクローン化遺伝子発現の維持を補助すると考えられる。そのような細胞はすでに本発明者らの研究室において利用可能である。PNPaseの非存在下で、本発明のコールドショックベクターからのcspAの発現が延長され、その結果、目的のタンパク質の発現が延長されることが予想される。pnp欠失細胞を目的のタンパク質をコードする遺伝子に対応する挿入断片を含むコールドショックベクターを用いて形質転換し、細胞を37℃でOD600nmが0.5になるまで増殖させ、次いで15℃に移す。試料を0時間から120時間まで12時間間隔で取り出して、タンパク質生産をSDS−PAGEによって分析する。
遺伝子rbfAは、遊離30Sリボソームサブユニットとは結合するが、70Sリボソームサブユニットとは結合しない15kDaのタンパク質(RbfA)をコードする(Dammel et al., 1995)。この遺伝子は、最初、16S rRNAの5’へリックス中に位置する優性低温感受性変異のマルチコピーサプレッサーとして単離された。rbfA欠失変異体は、pnp欠失細胞と同様に、低温で増殖障害を示す(Dammel et al., 1995)。本発明者らの研究室は、RbfAがコールドショックタンパク質であり、そしてrfbA欠失株において低温での激しい増殖阻害にかかわらず、コールドショックタンパク質およびリボソームタンパク質が高度に誘導され、それらの発現がpnp欠失細胞と同様に構成的になることを示した(Dammel et al., 1995)。本発明者らの研究室は近年RbfAが、低温での翻訳開始および30Sリボソームサブユニットの成熟に関与する点で二重の機能を有することを示した。rbfAの欠失の結果CspAのようなコールドショックタンパク質の構成的発現が生じるという事実を考慮すると、これらの細胞は15℃でコールドショックベクターを使用するタンパク質の発現に理想的である。
大腸菌のポリ(A)ポリメラーゼは、ファーウエスタン分析によって、RNA、RNaseE、ならびにRhlE、SrmBおよびCsdAのDEAD−box RNAヘリカーゼと相互作用することが報告された(Raynal et al., 1999)。これらの中でCsdAはコールドショック誘導性タンパク質であり、ATP非存在下で2本鎖RNAを巻き戻す活性を有する(Jones et al., 1996)。RbfAと同様に、CsdAは低温での増殖に必須である(データは示さず)。CsdAの機能は、低温で形成された安定な二次構造を巻き戻すことによってmRNAの翻訳効率を増加させるリボソームの機能に必須であると提唱されている(Jones et al., 1996)。
本研究の目標は、目的のタンパク質を全細胞タンパク質合成の90〜95%のレベルで、総細胞タンパク質の60〜70%より高いタンパク質収率で合成することにある。従って、遠心分離による膜画分およびリボソーム画分のような不溶性物質の除去後の細胞溶解物を、さらに精製せずにNMR分光法に使用し得る。そのような場合、溶解していない全細胞懸濁物でさえもNMR分光法に適用し得る。それゆえ、培地をコールドショック後に交換することによって(例えば、12C−グルコース/14NH4Clベースの培地から13C−グルコース/15NH4Clベースの培地)、目的のタンパク質のみを同位体で標識し、精製プロセスを除くことができる。分子量20kDaのタンパク質を総細胞タンパク質の60%のレベルで生産すると仮定すると(このタンパク質のみがコールドショックに際して新たに合成されることに留意のこと)、1リットル当たりのタンパク質の総収量は約120mgであると予想される。このタンパク質が可溶性形態で生産され、細胞溶解物を培養物から4ml中に調製すると(超音波処理し、次いで超遠心分離して細胞片、膜画分およびリボソーム画分を除去)、目的のタンパク質の30mg/mlまたは1.5mMの溶液を得ることができ、これをNMR分光法に直接使用することができる。NMR分光法を1ml未満で行うことができるので、培養サイズを250mlに減じることができ、高価な13C−グルコースおよび15N−NH4Cl(または(15NH4)2SO4)の使用を4分の1に削減することができる。15N、13Cまたは両方で標識されたアミノ酸を単独でまたは組み合わせて使用することができる。さらに、細胞は提唱する条件下でコールドショックに際して増殖することができないので、全体の炭素利用は増殖中の細胞よりずっと少ないはずである。それゆえ、培地中のグルコース濃度を13C−グルコースに通常使用する濃度(0.2%)より低くすることができる。これにより、高価な13C−グルコースの消費がさらに節約される。
NMR分光分析[(1H−15N)HSQC]をタンパク質精製なしの全細胞溶解物由来の上清を使用して実施した。本発明者らの研究室とOntario Cancer InstituteのIkura博士との共同研究においてそのNMR溶液構造がすでに決定されているので(Nature 386:88-92, 1998)、この実験のために、大腸菌の浸透圧感知ヒスチジンキナーゼEnvZのATP結合ドメイン(164残基)をモデル系として使用した。
参考文献
Bae, W., P. G. Jones, and M. Inouye. 1997. CspA, the major cold shock protein of Escherichia coli, negatively regulates its own gene expression. J Bacteriol 179:7081-8.
Bae, W., B. Xia, M. Inouye, and K. Severinov. 2000. Escherichia coli CspA-family RNA chaperones are transcription antiterminators. Proc Natl Acad Sci U S A 97:7784-9.
Brandi, A., R. Spurio, C. O. Gualerzi, and C. L. Pon. 1999. Massive presence of the Escherichia coli 'major cold-shock protein' CspA under non-stress conditions. Embo J 18:1653-9.
Dammel, C. S., and H. F. Noller. 1995. Suppression of a cold-sensitive mutation in 16S rRNA by overexpression of a novel ribosome-binding factor, RbfA. Genes Dev 9:626-37.
Etchegaray, J. P., and M. Inouye. 1999. CspA, CspB, and CspG, major cold shock proteins of Escherichia coli, are induced at low temperature under conditions that completely block protein synthesis. J Bacteriol 181:1827-30.
Etchegaray, J. P., and M. Inouye. 1999. A sequence downstream of the initiation codon is essential for cold shock induction of cspB of Escherichia coli. J Bacteriol 181:5852-4.
Etchegaray, J. P., and M. Inouye. 1999. Translational enhancement by an element downstream of the initiation codon in Escherichia coli. J Biol Chem 274:10079-85.
Etchegaray, J. P., P. G. Jones, and M. Inouye. 1996. Differential thermoregulation of two highly homologous cold-shock genes, cspA and cspB, of Escherichia coli. Genes Cells 1:171-8.
Fang, L., Y. Hou, and M. Inouye. 1998. Role of the cold-box region in the 5' untranslated region of the cspA mRNA in its transient expression at low temperature in Escherichia coli. J Bacteriol 180:90-5.
Fang, L., W. Jiang, W. Bae, and M. Inouye. 1997. Promoter-independent cold-shock induction of cspA and its derepression at 37 degrees C by mRNA stabilization. Mol Microbiol 23:355-64.
Gold, L. 1988. Posttranscriptional regulatory mechanisms in Escherichia coli. Annu Rev Biochem 57:199-233.
Goldenberg, D., I. Azar, A. B. Oppenheim, A. Brandi, C. L. Pon, and C. O. Gualerzi. 1997. Role of Escherichia coli cspA promoter sequences and adaptation of translational apparatus in the cold shock response. Mol Gen Genet 256:282-90.
Golshani, A., V. Kolev, M. G. AbouHaidar, and I. G. Ivanov. 2000. Epsilon as an initiator of translation of CAT mRNA in Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun 273:528-31.
Inouye, M. 1983. Multipurpose expression cloning vehicles in Escherichia coli. New York Academic Press, NY.
Jiang, W., L. Fang, and M. Inouye. 1996. Complete growth inhibition of Escherichia coli by ribosome trapping with truncated cspA mRNA at low temperature. Genes Cells 1:965-76.
Jiang, W., L. Fang, and M. Inouye. 1996. The role of the 5'-end untranslated region of the mRNA for CspA, the major cold-shock protein of Escherichia coli, in cold-shock adaptation. J Bacteriol 178:4919-25.
Jiang, W., Y. Hou, and M. Inouye. 1997. CspA, the major cold-shock protein of Escherichia coli, is an RNA chaperone. J Biol Chem 272:196-202.
Jones, P. G., M. Mitta, Y. Kim, W. Jiang, and M. Inouye. 1996. Cold shock induces a major ribosomal-associated protein that unwinds double-stranded RNA in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 93:76-80.
Jones, P. G., R. A. VanBogelen, and F. C. Neidhardt. 1987. Induction of proteins in response to low temperature in Escherichia coli. J Bacteriol 169:2092-5.
Kumar, A., R. A. Malloch, N. Fujita, D. A. Smillie, A. Ishihama, and R. S. Hayward. 1993. The minus 35-recognition region of Escherichia coli sigma 70 is inessential for initiation of transcription at an "extended minus 10" promoter. J Mol Biol 232:406-18.
Kushner et al., Stabilization of discrete mRNA breakdown products in ams pnp rnb multiple mutants of Escherichia coli K-12, J. Bacteriol. 170:4625-4633 (1988)
Miller, J. H. 1992. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Mitta, M., L. Fang, and M. Inouye. 1997. Deletion analysis of cspA of Escherichia coli: requirement of the AT-rich UP element for cspA transcription and the downstream box in the coding region for its cold shock induction. Mol Microbiol 26:321-35.
Mujacic, M., K. W. Cooper, and F. Baneyx. 1999. Cold-inducible cloning vectors for low-temperature protein expression in Escherichia coli: application to the production of a toxic and proteolytically sensitive fusion protein. Gene 238:325-32.
O'Connor, M., T. Asai, C. L. Squires, and A. E. Dahlberg. 1999. Enhancement of translation by the downstream box does not involve base pairing of mRNA with the penultimate stem sequence of 16S rRNA. Proc Natl Acad Sci U S A 96:8973-8.
Olins, P. O., and S. H. Rangwala. 1989. A novel sequence element derived from bacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli. J Biol Chem 264:16973-6.
Phadtare, S., J. Alsina, and M. Inouye. 1999. Cold-shock response and cold-shock proteins. Curr Opin Microbiol 2:175-80.
Phadtare, S., and Inouye, M. 2002. Cold Shock in "Encyclopedia of Environmental Microbiology". John Wiley & Sons, New York.
Phadtare, S., Yamanaka, K, and Inouye, M. 2000. The Cold Shock Response in The Bacterial Stress Responses. ASM Press, Washington DC.
Phadtare, S. U., M. Inouye, and K. Severinov. 2001. The nucleic acid melting activity of Escherichia coli CspE is critical for transcription antitermination and cold-acclimation of cells. J Biol Chem 276.
Raynal, L. C., and A. J. Carpousis. 1999. Poly(A) polymerase I of Escherichia coli: characterization of the catalytic domain, an RNA binding site and regions for the interaction with proteins involved in mRNA degradation. Mol Microbiol 32:765-75.
Sprengart, M. L., E. Fuchs, and A. G. Porter. 1996. The downstream box: an efficient and independent translation initiation signal in Escherichia coli. Embo J 15:665-74.
Vasina, J. A., and F. Baneyx. 1997. Expression of aggregation-prone recombinant proteins at low temperatures: a comparative study of the Escherichia coli cspA and tac promoter systems. Protein Expr Purif 9:211-8.
Vasina, J. A., and F. Baneyx. 1996. Recombinant protein expression at low temperatures under the transcriptional control of the major Escherichia coli cold shock promoter cspA. Appl Environ Microbiol 62:1444-7.
Wang, N., K. Yamanaka, and M. Inouye. 1999. CspI, the ninth member of the CspA family of Escherichia coli, is induced upon cold shock. J Bacteriol 181:1603-9.
Xia, B., J. P. Etchegaray, and M. Inouye. 2001. Nonsense mutations in cspA cause ribosome trapping leading to complete growth inhibition and cell death at low temperature in Escherichia coli. J Biol Chem 276:35581-8.
Xia, B., H. Ke, and M. Inouye. 2001. Acquirement of cold sensitivity by quadruple deletion of the cspA family and its suppression by PNPase S1 domain in Escherichia coli. Mol Microbiol 40:179-88.
Xia, B., H. Ke, W. Jiang, and M. Inouye. 2001. The Cold Box stem-loop proximal to the 5'-end of the Escherichia coli cspA gene stabilizes its mRNA at low temperature. J Biol Chem.
Yamanaka, K., L. Fang, and M. Inouye. 1998. The CspA family in Escherichia coli: multiple gene duplication for stress adaptation. Mol Microbiol 27:247-55.
Yamanaka, K., and M. Inouye. 2001. Induction of CspA, an E. coli major cold-shock protein, upon nutritional upshift at 37 degrees C. Genes Cells 6:279-90.
Yamanaka, K., and M. Inouye. 2001. Selective mRNA degradation by polynucleotide phosphorylase in cold shock adaptation in Escherichia coli. J Bacteriol 183:2808-16.
Yamanaka, K., M. Mitta, and M. Inouye. 1999. Mutation analysis of the 5' untranslated region of the cold shock cspA mRNA of Escherichia coli. J Bacteriol 181:6284-91.
Claims (36)
- 異種ポリペプチドを発現可能なDNA分子であって:
異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;ならびに
コールドショック応答を誘発する条件下で異種ポリペプチドの発現および生産を制御するように異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、コールドショック誘導性プロモーターおよび5’非翻訳領域(5’−UTR)を含み、
ここで(1)開始コドンの下流4番目〜7番目のコドン付近に12ヌクレオチドのATリッチ配列を含む翻訳増強エレメントが、コールドショック誘導性プロモーターおよび5’−UTRと異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との翻訳インフレーム融合体を形成するように配置されているか、または(2)異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が開始コドンの下流4番目〜7番目のコドンにATリッチ配列を含むかのいずれかである、DNA分子。 - コールドショック誘導性プロモーターおよび5’−UTRが、配列番号1のヌクレオチド22〜441、配列番号3のヌクレオチド11〜214、配列番号5のヌクレオチド12〜213、配列番号7のヌクレオチド11〜201、そのフラグメント、およびそのバリアントからなる群より選択される、請求項1記載のDNA分子。
- (1)が存在する、請求項1記載のDNA分子。
- コールドショック誘導性プロモーターおよび5’−UTRが、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、7つのコドンのヌクレオチド配列からなる翻訳増強エレメントによって連結されており、ここで第1のコドンが開始コドンであり、4番目〜7番目のコドンがATリッチ配列を形成する、請求項3記載のDNA分子。
- 翻訳増強エレメントが配列番号9のヌクレオチド1〜18を含む、請求項4記載のDNA分子。
- 異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、開始コドンの下流4番目〜7番目のコドンにATリッチ配列を含む、請求項1記載のDNA分子。
- 異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流に配置されたコールドショック誘導性遺伝子の3’非翻訳領域(3’−UTR)をさらに含む、請求項1記載のDNA分子。
- 3’−UTRが、cspA、cspB、cspG、およびcspIからなる群の3’−UTRより選択される、請求項7記載のDNA分子。
- 3’−UTRが配列番号1のヌクレオチド442〜539を含む、請求項7記載のDNA分子。
- コールドショック誘導性プロモーターおよび5’−UTR領域配列が、翻訳開始部位のすぐ下流にlacIオペレーター配列を含む、請求項1記載のDNA分子。
- lacIオペレーター配列が配列番号10のヌクレオチド配列である、請求項10記載のDNA分子。
- ベクターである、請求項1記載のDNA分子。
- 自己複製ベクターである、請求項12記載のベクター。
- pColdIである、請求項13記載のベクター。
- pColdIIである、請求項13記載のベクター。
- pColdIIIである、請求項13記載のベクター。
- 請求項1記載のDNA分子で形質転換された原核生物宿主細胞。
- 大腸菌である、請求項17記載の宿主細胞。
- ポリヌクレオチドホスホリラーゼ活性を欠くポリヌクレオチドホスホリラーゼ変異体である、請求項17記載の宿主細胞。
- 遊離30Sリボソームサブユニットとは結合するが、70Sリボソームサブユニットとは結合しない15kDa RbfAタンパク質を欠くrbfA変異体である、請求項17記載の宿主細胞。
- csdA RNAヘリカーゼ活性を欠くcsdA RNAヘリカーゼ変異体である、請求項17記載の宿主細胞。
- 宿主細胞中でcsdA RNAヘリカーゼを過剰発現するベクターで同時形質転換された、請求項17記載の宿主細胞。
- 以下の工程を包含する異種ポリペプチドの生産方法:
請求項17記載の宿主細胞を、栄養培地中、宿主細胞の正常生理学的増殖温度で培養する工程;
インキュベーション温度を宿主細胞の正常生理学的増殖温度より少なくとも13℃低い温度に低下させることによって培養宿主細胞をコールドショックに供して、異種ポリペプチドの生産を誘導する工程;および
コールドショックに供した宿主細胞を低下させたインキュベーション温度でインキュベートして、異種ポリペプチドを生産する工程。 - 生産された異種ポリペプチドを回収する工程をさらに包含する、請求項23記載の方法。
- インキュベーション温度を宿主細胞の正常生理学的増殖温度より少なくとも20℃低い温度に低下させる、請求項23記載の方法。
- 培養宿主細胞をコールドショックに供した後に、栄養培地を、異種ポリペプチドを検出可能に標識するための化合物を含有する培地に交換する工程をさらに包含する、請求項23記載の方法。
- 化合物が、無視できる量が宿主細胞中に通常見出される同位体を含有する、請求項26記載の方法。
- 同位体が15Nまたは13Cである、請求項27記載の方法。
- 化合物が、15NH4Cl、(15NH4)2SO4、13C−グルコース、15Nで標識されたアミノ酸残基、13Cで標識されたアミノ酸残基、ならびに15Nおよび13Cの両方で標識されたアミノ酸残基からなる群より選択される、請求項27記載の方法。
- 宿主細胞が、1つ以上の主要コールドショックタンパク質を欠く変異体である、請求項27記載の方法。
- 変異宿主細胞がCspAを欠く、請求項30記載の方法。
- 変異宿主細胞がCspA、CspB、CspG、およびCspEを欠く、請求項30記載の方法。
- 以下の工程を包含する異種ポリペプチドのNMRスペクトルを得るための方法:
化合物で検出可能に標識された異種ポリペプチドを生産するように、低下させたインキュベーション温度で、請求項26記載の方法でインキュベートしたコールドショックに供した宿主細胞を単離する工程;および
単離したコールドショックに供した宿主細胞に対する全細胞NMR分光法、または単離したコールドショックに供した宿主細胞の細胞溶解物由来の上清に対するNMR分光法を実施して、異種ポリペプチドのNMRスペクトルを得る工程。 - 単離したコールドショックに供した全細胞に対する全細胞NMR分光法を実施する、請求項33記載の方法。
- 単離したコールドショックに供した宿主細胞の細胞溶解物由来の上清に対するNMR分光法を実施する、請求項33記載の方法。
- 以下の工程を包含する異種ポリペプチドのNMRスペクトルを得るための方法:
栄養培地中、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換され、コールドショックに応答した異種ポリペプチドの発現および生産が可能な原核生物宿主細胞を培養する工程;
インキュベーション温度を宿主細胞の正常生理学的増殖温度より低い温度に低下させることによって培養宿主細胞をコールドショックに供して、異種ポリペプチドの生産を誘導する工程;
培養宿主細胞をコールドショックに供した後に、栄養培地を、異種ポリペプチドを検出可能に標識するための化合物を含有する培地に交換する工程;
コールドショックに供した宿主細胞を低下させたインキュベーション温度でインキュベートして、化合物で検出可能に標識された異種ポリペプチドを生産する工程;
低下させたインキュベーション温度でインキュベートしたコールドショックに供した宿主細胞を単離する工程;および
単離したコールドショックに供した宿主細胞に対する全細胞NMR分光法、または単離したコールドショックに供した宿主細胞の細胞溶解物由来の上清に対するNMR分光法を実施して、異種ポリペプチドのNMRスペクトルを得る工程。
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---|---|
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JP2003573110A Expired - Fee Related JP4249031B2 (ja) | 2002-03-01 | 2003-02-25 | 異種ポリペプチドのコールドショック誘導性発現および生産 |
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007275010A (ja) * | 2006-04-11 | 2007-10-25 | Ehime Univ | アクチンの製造方法、それに用いるベクターおよび原核宿主細胞 |
JP2009531032A (ja) * | 2006-03-20 | 2009-09-03 | ユニヴァーシティ オブ メディシン アンド デンティストリ オブ ニュージャーシィ | タンパク質の可溶化のためのプロテインs融合の使用 |
JP2009273432A (ja) * | 2008-05-16 | 2009-11-26 | Takara Bio Inc | 逆転写反応用組成物 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW200510534A (en) | 2002-12-11 | 2005-03-16 | Takara Bio Inc | Cold-induced expression vector |
WO2005113768A1 (ja) * | 2004-05-21 | 2005-12-01 | Takara Bio Inc. | ポリペプチドの製造方法 |
CA2550133A1 (en) * | 2006-02-16 | 2007-08-16 | The Governors Of The University Of Alberta | Temperature regulated gene expression |
DE102006016023A1 (de) * | 2006-04-05 | 2007-10-11 | Basf Ag | Funktionale Expression von Triacylglycerol-Lipasen |
US20110306751A1 (en) * | 2008-10-04 | 2011-12-15 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Independently Inducible System of Gene Expression |
CN105238805A (zh) * | 2014-07-11 | 2016-01-13 | 上海市农业科学院 | 一种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的表达及制备方法 |
US10704051B2 (en) | 2014-12-29 | 2020-07-07 | Agricultural Technology Research Institute | Expression element, expression cassette, and vector containing the same |
EP3988659A1 (en) * | 2020-10-26 | 2022-04-27 | Wageningen Universiteit | Prokaryotic post stop-codon sequences |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5714575A (en) | 1989-02-13 | 1998-02-03 | The University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Nucleic acids sequence, stress-induced proteins and uses thereof |
DE4041836A1 (de) * | 1990-12-24 | 1992-06-25 | Behringwerke Ag | Protektive plasmodium falciparum hybridproteine, die teilsequenzen der malaria-antigene hrpii und serp enthalten, ihre herstellung und verwendung |
AU1914892A (en) * | 1991-05-03 | 1992-12-21 | Smithkline Beecham Corporation | Low temperature-regulated promoters in e. coli |
US5994526A (en) * | 1996-06-21 | 1999-11-30 | Plant Genetic Systems | Gene expression in plants |
AU1054699A (en) * | 1997-11-20 | 1999-06-15 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Cold-inducible expression vector |
TW200510534A (en) * | 2002-12-11 | 2005-03-16 | Takara Bio Inc | Cold-induced expression vector |
-
2003
- 2003-02-25 KR KR10-2004-7013064A patent/KR20040086424A/ko not_active Application Discontinuation
- 2003-02-25 CN CNB038049171A patent/CN100385004C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-02-25 JP JP2003573110A patent/JP4249031B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-02-25 US US10/506,192 patent/US7605000B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-02-25 EP EP03743693A patent/EP1478733A4/en not_active Withdrawn
- 2003-02-25 CA CA002477856A patent/CA2477856A1/en not_active Abandoned
- 2003-02-25 WO PCT/US2003/005531 patent/WO2003074657A2/en active Search and Examination
- 2003-02-25 AU AU2003216384A patent/AU2003216384A1/en not_active Abandoned
- 2003-02-27 TW TW092104213A patent/TW200401029A/zh unknown
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009531032A (ja) * | 2006-03-20 | 2009-09-03 | ユニヴァーシティ オブ メディシン アンド デンティストリ オブ ニュージャーシィ | タンパク質の可溶化のためのプロテインs融合の使用 |
JP2007275010A (ja) * | 2006-04-11 | 2007-10-25 | Ehime Univ | アクチンの製造方法、それに用いるベクターおよび原核宿主細胞 |
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