KR100596070B1

KR100596070B1 - 저온 유도성 발현벡터

Info

Publication number: KR100596070B1
Application number: KR1020007005452A
Authority: KR
Inventors: 다카야마마사노리; 노무라요시코; 가토이쿠노신
Original assignee: 다카라 바이오 가부시키가이샤
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 1998-11-17
Publication date: 2006-07-03
Also published as: DE69838680D1; EP1033408A1; AU1054699A; EP1033408A4; KR20010032249A; CA2309600C; KR20060032223A; WO1999027117A1; US6479260B1; EP1033408B1; DE69838680T2; CA2309600A1; ATE377647T1; JP4057237B2; KR100596071B1; US6897042B2; US20030082799A1

Abstract

하기 요소를 갖는 벡터: (1)사용될 숙주에서 기능을 띠는 프로모터, (2)프로모터(1)의 기능을 조절하기 위한 조절 영역, 및 (3)저온 쇼크 단백질 유전자 mRNA로부터 유도된 5′-비해독 영역을 암호화하는 영역, 또는 비해독 영역을 적어도 하나의 염기로 치환, 결실, 삽입 또는 첨가시킴으로써 형성되는 영역을 암호화하는 영역.

저온 쇼크 단백질 유전자, lac 오퍼레이터

Description

저온 유도성 발현벡터{COLD-INDUCIBLE EXPRESSION VECTOR}

본 발명은 재조합 DNA 기술에 사용되는 벡터 및 이러한 유전자를 사용하는 단백질의 발현방법에 관한 것이다.

재조합 DNA 기술을 이용한 유용 단백질의 생산은 현재 광범위하게 사용되고 있는 기술이다. 그중에서도, 이.콜라이를 숙주로 사용하는 발현 시스템이 가장 통용되는 발현 시스템이며 다수의 단백질이 재조합체에 의해 생산되어 왔다. 이러한 재조합체에 의한 유용 단백질의 생산에는 목적하는 유전자를 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 조절하에 배치함으로써 작제되는 소위 말하는 발현벡터를 사용하는 것이 일반적이다. 예를 들면, 이.콜라이가 숙주로 사용되는 경우, 발현벡터용으로 사용되는 프로모터의 예로는 lac, trp, tac, gal 및 ara가 있다. 이.콜라이의 RNA 폴리머라제에 의해 직접 인식되는 것이 아닌 프로모터를 이용하는 발현벡터의 예는 이.콜라이에 감염하는 박테리오파지 T7의 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터를 사용하는 pET-시스템(Novagen 제조)[참조문헌:J. Mol. Biol., volume 189, pages 113-130 (1986); Gene, volume 56, pages 125-135 (1987)]이다. pET-시스템의 경우에, T7RNA 폴리머라제는 이.콜라이에서 발현되고, 발현벡터 상의 T7 프로모터 하류에 배치되는 목적 유전자의 T7RNA 폴리머라제에 의한 전사가 일어난 다음 숙주의 해독 시스템에 의해 목적 단백질의 합성이 일어난다.

그러나, 목적 단백질이 pET-시스템을 포함한 다수의 이.콜라이 발현 시스템에서 고수준으로 발현될 때, 목적 단백질이 불용성 복합체(소위 봉입체)를 생성하고 활성형 목적 단백질의 양이 매우 적어지게 되는 일이 종종 일어난다. 일부 폴리펩타이드에 있어서, 봉입체를 가용화시킨 다음 재접힘(refolding) 작업에 투입하여 활성형 폴리펩타이드를 생성하는 예가 존재함이 보고되었다. 그러나, 일반적으로는, 이의 회수량이 종종 낮고, 아울러 목적 단백질 각각에 대한 적당한 재접힘 조건의 조사가 필요하다. 따라서, 활성형 단백질이 이.콜라이에서 직접 발현되는 시스템이 요구되어 왔다.

봉입체의 형성은 해독된 폴리펩타이드쇄가 정확한 입체 배치로 접히기 전에 중간체의 단계에서, 분자간 작용에 기인하여 다른 폴리펩타이드와의 상호감김이 일어나 매우 큰 불용성 복합체가 형성되는 식으로 발생하는 것으로 추측된다. 재조합 이.콜라이의 배양을 통용되는 온도인 37℃보다 낮은 온도(20-30℃)에서 수행하는 경우, 활성형 단백질의 발현량이 증가함이 알려졌다. 이러한 현상은 리보솜에 의한 해독 속도의 지연으로 인해 중간체가 정확한 구조로 접히는 데 충분한 시간이 이용될 수 있다는 사실 및 저온 조건하에서 세포내 프로테아제의 작용 지연으로 해서 활성형 발현 단백질의 안정성이 증가하는 사실에 기인하는 것으로 추정된다. 이와 같이, 봉입체를 생성하기 쉬운 단백질의 생산에서, 재조합 이.콜라이를 저온에서 배양하는 방법이 효과적인 수단으로서 세간의 주목을 받아왔다.

한편, 대수 증식기 중에 이.콜라이의 배양 온도를 37℃에서 10 내지 20℃로 하강시킬 때, 이.콜라이의 생장은 일단 정지하고, 그 기간 동안 저온 쇼크 단백질로 불리는 단백질 그룹의 발현이 유도된다. 이러한 단백질은 유도 수준에 따라 그룹 I(10배 이상)과 그룹 II(10배 이하)로 분류되며 그룹 I 단백질의 예는 CspA, CspB, CspG 및 CsdA이다. 그중 CspA의 경우에, 37℃에서 10℃로의 온도 변위 1.5 시간 후 발현된 양은 전체 세포 단백질의 13%에 달하며[참조문헌:Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volume 87, pages 283-287 (1990)], 따라서, 저온에서 재조합 단백질의 생성을 위한 cspA 유전자의 프로모터의 이용이 시도되었다.

cspA 유전자의 프로모터에 의한 저온에서 고효율 전사 개시의 전술한 장점 외에도, cspA 유전자를 사용하는 저온 조건하에서 재조합 단백질 발현 시스템에 대해 다음과 같은 효율이 나타났다.

(1)cspA 유전자로부터 전사된 해독가능한 mRNA가 기능을 갖는 CspA 단백질을 암호화하지 않는 경우, 구체적으로 말해서 CspA 단백질의 N-말단 서열의 일부만을 암호화하는 경우, 이러한 mRNA는 장기간 동안 저온 쇼크 단백질을 포함한 기타 이.콜라이 단백질의 발현을 억제하며, 그 기간 중에 mRNA의 해독이 우선적으로 수행된다[참조문헌:J. Bacteriol., volume 178, pages 4919-4925(1996)].

(2)cspA 유전자의 개시 코돈으로부터 12 염기만큼의 하류 위치에, 15개의 염기로 이루어진 다운스트림 박스로 불리는 서열이 존재하며, 이는 저온 조건하에서 해독을 효율적으로 증가시킨다.

(3)cspA 유전자 mRNA의 전사 개시점에서 개시 코돈에 걸쳐 존재하는 159개의 염기로 이루어진 5′-비해독 영역은 37℃ 및 저온에서의 발현에 각각 부정적인 영 향과 긍정적인 영향을 준다.

그러나, 비록 유전자의 프로모터가 저온에서의 전사를 고효율로 확실히 개시할 수 있지만 실질적으로는 통상적인 배양 온도(37℃)에서도 작용하며, 그 유전자로부터 전사된 mRNA의 안정성이 또한 그 유전자의 발현을 조절함을 암시한다[참조문헌:Molecular Microbiology, volume 23, pages 355-364 (1997)]. 따라서, cspA 유전자의 프로모터를 사용하여 작제된 발현벡터에서, 발현의 조절은 불완전하고, 산물이 숙주에 유해한 유전자의 경우에, 발현벡터를 함유하는 이.콜라이가 유도될 수 있는 그러한 상태로 배양하기가 곤란하거나 심지어는 발현벡터의 작제가 불가능한 일부 경우가 존재한다.

예를 들면, US 특허 5,654,169에는, 심지어 프로모터의 평가용으로 통용되는 β-갈락토시다제 유전자가 cspA 유전자의 프로모터를 이용하는 발현 플라스미드 중으로 삽입될 때 조차도, 발현산물에 기인하여 이.콜라이내에 작제된 산물을 유지시키는 것이 어렵다는 것이 기술되어 있다.

한편, cspA 유전자의 프로모터의 전사 개시능은 전사 개시점에서 -37만큼 하류에 있는 영역에서 유지되는 것으로 알려져 있지만, 필수 영역은 아직 확인되지 않았다. 또한, 상기 US 특허는 cspA 유전자의 프로모터로서의 기능을 위한 필수 영역으로서 상기 유전자에 대한 전사 개시점에서 -40 내지 +96의 영역을 보여주고 있다. 그러나, 상기 영역은 mRNA로 전사되고, 또한 단백질을 암호화하지 않는 거의 100개의 염기로 이루어진 영역을 함유한다. 저온에서 효율이 양호한 전사를 달성하는 데 필수적인 cspA 프로모터의 최소 영역 그 자체는 아직 규명되지 않았다.

발명이 해결하고자 하는 과제

따라서, 본 발명의 목적은 발현 시스템의 작제 또는 유전자 산물의 효율적인 생산이 선행기술에서 곤란한 유전자의 경우에도, 유전자 발현용 형질전환체가 제조될 수 있고 심지어 저온 조건 하에서도 고효율로 유전자 산물을 발현시킬 수 있는 벡터를 제공하는 것이다.

과제 해결 수단

본 발명자는 전술한 목적을 성취하기 위하여, lac 작동 서열을 cspA 유전자의 프로모터 하류에 삽입시켜 플라스미드를 작제하고 유도상태까지 배양하는 동안, 프로모터로부터의 유전자 발현이 조절되도록 시도하였다. 작제된 lac 오퍼레이터에 의해 조절될 수 있는 cspA 프로모터를 갖는 발현벡터를 사용함으로써, 본 발명자는 lac 오퍼레이터 서열이 없는 cspA 프로모터를 이용하는 발현벡터를 가지고 작제할 수 없었던 엔도설페이트화-퓨코스-함유 폴리사카라이드 분해효소(Fdase 2)를 작제하는 데 성공하였다. 본 발명자는 또한, lac 오퍼레이터가 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체의 배양 동안 불활성화되고 배양온도가 동시에 낮을 때, 효소가 발현 유도될 수 있음을 밝혀내었다. 이러한 사실은 오퍼레이터 서열의 도입 결과, 통상 온도(37℃)에서의 발현을 조절할 수 있는 저온 발현벡터의 작제가 비로서 가능하게 되었음을 보여준다.

본 발명자는 또한, 기능 유지를 위한 cspA 프로모터의 최소 필수 영역을 측정해내었고 이에 따라 본 발명이 완성되었다.

본 발명은 하기에 요약된다. 따라서, 본 발명의 제 1 특징은 하기 요소 각각 을 함유함을 특징으로 하는 벡터에 관한 것이다:

(1)사용하고자 하는 숙주에서 작용을 보이는 프로모터;

(2)(1)의 프로모터의 작용을 조절하기 위한 조절 영역; 및

(3)저온-쇼크 단백질 유전자 mRNA로부터 유도된 5′-비해독 영역을 암호화하는 영역 또는 비해독 영역에 적어도 하나의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 첨가되는 영역을 암호화하는 영역.

본 발명의 제 2 특징은 하기 단계를 포함함을 특징으로 하는 목적 단백질의 발현방법에 관한 것이다.

(1)숙주를 발현시키고자 하는 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 통합되는 본 발명의 제 1 특징의 벡터에 의해 형질전환시키는 단계;

(2)생성되는 형질전환체를 배양하는 단계; 및

(3)조절 영역의 기능을 통해 프로모터의 작용을 유도시키고, 동시에 배양 온도를 목적 단백질 발현에 통상적인 온도보다 낮게 하는 단계.

또한, 본 발명의 제 3 특징은 서열 목록의 서열번호 5에 나타낸 염기서열을 함유하고 135개 이하의 염기를 갖는 염기서열로 이루어짐을 특징으로 하는 분리된 cspA 프로모터에 관한 것이다.

발명의 실시 양식

이하, 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다.

본 발명의 제 1 특징(1)에서 프로모터에는 특별한 제한은 없으며 사용된 숙 주에서 RNA의 전사를 개시하는 활성이 있는 한 어떤 것이라도 사용될 수 있다. 그러한 프로모터가 상기(3)에서 저온-쇼크 단백질 유전자 mRNA로부터 유도된 5′-비해독 영역을 암호화하는 영역과 함께 사용될 경우, 저온에 반응하는 프로모터로서 사용될 수 있다. 발현 유도 동안 높은 형질전환 효율이 소망되는 경우, cspA, cspB, cspG, csdA 등과 같이 전술한 저온-쇼크 단백질 유전자로부터 유도된 프로모터가 본 발명에 적합하며, 그 중에서도 cspA 유전자로부터 유도된 프로모터가 특히 바람직하다.

상기(2)에 대한 조절 영역의 경우, (1)의 프로모터 하류에 위치한 유전자의 발현을 조절할 수 있는 한 특별한 제한은 없다. 예를 들면, 프로모터에 의해 전사된 mRNA에 상보적인 RNA(즉, 안티센스 RNA)를 전사하는 영역이 벡터 중으로 도입될 경우, 프로모터의 하류에 위치한 유전자로부터 목적 단백질의 해독은 억제될 수 있다. 안티센스 RNA의 전사가 (1)의 것과는 상이한 적당한 프로모터의 조절하에 이루어지는 경우, 목적 단백질의 발현이 조절될 수 있다. 이와 달리, 각종 유전자의 발현 조절 영역에 존재하는 오퍼레이터도 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 이.콜라이 락토스 오페론으로부터 유도된 lac 오퍼레이터가 본 발명에 사용될 수 있다. lac 오퍼레이터의 기능은 락토스 또는 유사 구조의 물질과 같은 적당한 유도성 물질, 또는 바람직하게는 이소프로필-β-D-티오갈락토사이드(IPTG)에 의해 취소될 수 있으며, 이에 따라 프로모터가 작동될 수 있다. 이러한 오퍼레이터 서열은 통상적으로 프로모터의 하류에 있는 전사 개시점 부근에 배치되어 있다.

(3)에 전술한 저온-쇼크 단백질 mRNA로부터 유도된 5′비해독 영역을 암호화하는 영역은 mRNA의 개시 코돈으로부터 5′의 영역을 암호화하는 영역이다. 이.콜라이의 저온-쇼크 단백질 유전자(cspA, cspB, cspG 및 csdA)에서, 이러한 영역이 특징적으로 발견되었으며[참조문헌:J. Bacteriol., volume 178, pages 4919-4925 (1996); J. Bacteriol., volume 178, pages 2994-2997 (1996)] 그러한 유전자로부터 전사된 mRNA 가운데 5′-말단으로부터 100개 이상의 염기로 된 영역은 단백질로 해독될 수 없다. 이러한 영역은 유전자 발현의 저온 의존성에 중요하며, 이러한 5′-비해독 영역이 단백질의 mRNA의 5′-말단에 첨가될 때, mRNA로부터 단백질로의 해독이 저온 조건에서 비로서 일어난다. 저온-쇼크 단백질 mRNA로부터 유도된 5′-비해독 영역은 기능이 유지될 수 있는 한 염기서열에 하나 이상의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가를 가한 것일 수 있다.

본 명세서에서, "영역"이란 용어는 핵산(DNA 또는 RNA) 상의 특정 범위를 나타낸다. 본 명세서에서 "mRNA의 5′-비해독 영역"이란 용어는 DNA로부터의 전사에 의해 합성된 mRNA 가운데, 이의 5′-에 존재하고 단백질을 암호화하지 않는 영역을 나타낸다. 본 명세서에서, 상기 영역은 5′-비해독 영역을 의미하는 "5′-UTR"로서 언급될 것이다. 첨언하면, 달리 규정하지 않는 한, 5′-UTR은 이.콜라이의 cspA 유전자의 mRNA 또는 이의 변형체의 5′-비해독 영역을 나타낸다.

본 발명의 벡터에 있어서, 전술한 저온-쇼크 단백질 유전자로부터 유도된 5′-UTR을 암호화하는 영역이 사용될 수 있으며 cspA 유전자로부터 유도된 것이 특히 적절하게 사용될 수 있다. 염기서열이 부분 변형되는 것이 또한 사용될 수 있으며, 예를 들면 상기(2)에서 언급된 오퍼레이터의 도입에 의해 이러한 영역의 염기 서열을 변형시킨 것도 사용될 수 있다. 실시예에서 보게 되는 바와 같이, 서열목록의 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 염기서열의 mRNA를 암호화하는 영역과 같이 서열목록의 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 염기서열을 함유하는 mRNA를 암호화하는 영역, 또는 이러한 서열이 변형되는 mRNA를 암호화하는 영역을 함유하는 영역을 사용하는 것도 가능하다. 저온-쇼크 단백질 유전자의 5′-UTR을 암호화하는 영역이 (1)의 프로모터와 발현시키고자 하는 단백질을 암호화하는 유전자의 개시 코돈 사이에 배치되거나 오퍼레이터가 상기 영역에 도입될 수 있다. 예를 들면, 서열목록의 서열번호 2 내지 4에 나타낸 바와 같은 염기서열의 5′-UTR은 염기서열에 lac 오퍼레이터 서열을 함유하며 저온에서 선택성을 가지는 목적 단백질의 발현에 효과적이다.

상기 구성 요소 외에, 사용된 숙주의 리보솜 RNA의 안티-다운스트림 박스 서열과 상보성을 갖는 염기서열이 5′-비해독 영역의 하류에 함유될 때, 발현 효율이 증가될 수 있다. 예를 들면, 이.콜라이의 경우에, 안티-다운스트림 박스 서열은 165 리보솜 RNA의 1467-1471 위치에 존재하며 그 서열과 높은 상보성을 보이는 염기서열을 함유하는 저온-쇼크 단백질의 N-말단 펩타이드를 암호화하는 영역을 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 서열목록의 서열번호 28에 나타낸 바와 같은 염기서열 또는 서열과 높은 상동성을 갖는 서열이 인위적으로 도입될 수 있다. 안티-다운스트림 박스 서열과 상보성을 갖는 서열은 개시 코돈으로부터 대략 첫번째 내지 15번째 염기인 위치로부터 개시하는 방식으로 배치되는 것이 효과적이다. 목적 단백질을 암호화하는 유전자는 벡터 중으로 통합되어, 단백질이 N-말단 펩타이드와의 융합 단백질로서 발현되거나 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 안티-다운스트림 박스 서열과의 상보성을 갖도록 부위-지향성 돌연변이발생에 의해 염기 치환이 도입된다. 목적 단백질을 융합 단백질로서 발현하도록 벡터 중으로의 통합이 수행될 때, 펩타이드는 목적 단백질이 자체 활성을 상실하지 않는 한 임의의 길이로 존재할 수 있다. 예를 들면, 그러한 융합 단백질의 발현용 벡터는 융합 단백질로부터 목적 단백질을 분리할 수 있도록 연결 부분이 개선된 것 또는 개선되어 정제 또는 검출용으로 사용될 수 있는 융합 단백질 및 펩타이드로서 발현되는 것일 수 있다. 또한, 전사 완료를 위한 서열(터미네이터)이 목적 단백질 유전자의 하류에 배치되는 벡터가 이의 안정성 향상으로 해서 목적 단백질의 고발현용으로 유리하다.

본 발명의 벡터는 벡터로서의 목적을 달성할 수 있는 한 플라스미드, 파지 및 바이러스 같이 통용되어온 임의 벡터일 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터에 함유된 전술한 구성 요소가 아닌 영역은 예를 들면, 복제 기원, 선별 마커로서 사용된 내약성 유전자, lac 오퍼레이터에 대한 lac I^q 유전자와 같은 오퍼레이터로서의 기능에 필수적인 조절 유전자 등을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 숙주 중으로 도입된 후 숙주의 게놈 DNA에 통합될 수 있다.

플라스미드로서 작제된 본 발명의 벡터를 사용하는 목적 단백질의 발현은 예를 들면, 하기 단계에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 적당한 숙주가 플라스미드에 의해 형질전환되도록 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 본 발명의 플라스미드 벡터에 클로닝될 때, 상기 단백질 발현용 형질전환체를 수득할 수 있다. 프로모터의 작동이 이러한 형질전환체에서 오퍼레이터에 의해 억제되므로, 상기 단백질은 비유도 상태하에서는 발현되지 않으며, 심지어 상기 단백질이 숙주에 유독할 때 조차도 상기 벡터는 안정한 방식으로 숙주에 유지될 수 있다.

상기 형질전환체가 비유도 상태하, 37℃와 같은 통상의 배양 온도에서 배양된 후, 오퍼레이터의 작용은 전사를 유도하도록 취소되어 목적 단백질이 발현된다. 이 경우에, 배양 온도를 전사 유도 전 또는 유도와 함께 낮출 때, 목적 단백질의 봉입체 형성이 억제될 수 있고 이에 따라 활성을 지닌 형태의 목적 단백질이 수득될 수 있다.

이하, 본 발명을 특이적 방식으로 플라스미드 벡터의 작제를 보여줌으로써 좀더 구체적으로 설명한다. 첨언하면, 본 명세서에서, 이.콜라이 CspA 단백질, 이 단백질의 발현에 관여하는 유전자 상의 영역 및 이 유전자의 프로모터 영역은 달리 규정하지 않는 한 각각 "CspA", "cspA 유전자" 및 "cspA 프로모터"로서 언급된다. 첨언하면, GenBank 유전자 데이터베이스에 Accession No. M30139로 등록되어 있는 천연 cspA 유전자에 대한 염기서열은 서열목록의 서열번호 6에 나타낸 바와 같이 공개되어 있다. 이 서열에서, 염기 번호 426-430 및 448-453은 프로모터의 코어 서열이고; 염기 번호 462는 전사를 위한 주요 개시점(+1)이며; 염기 번호 609-611은 SD 서열(리보솜 결합 서열)이며; 염기 번호 621-623 및 832-834는 각각 CspA의 개시 코돈 및 종결 코돈이다. 따라서, 상기 서열내 5′-UTR을 암호화하는 것은 염기 번호 462-620의 영역이다.

우선, cspA 유전자 자체를 사용하여 플라스미드 벡터 pMM031 시리즈(pMM031 및 pMM031F1)를 작제함으로써 제조된 cspA 유전자를 사용하는 발현 플라스미드로서 이종 유전자 발현 플라스미드의 작제를 서술한 다음 이 플라스미드를 사용하는 단백질 발현이 설명될 것이다.

이러한 발현 플라스미드의 상세한 작제방법이 실시예 1-(1)에 언급되어 있다. 예를 들면, 플라스미드 pMM031은 앰피실린-내성 유전자, pUC 플라스미드의 복제 기원 등을 함유하는 플라스미드 벡터 pTV118N(Takara Shuzo 제조)의 AflIII-EcoRI 부위 사이에 lac 프로모터를 함유하는 영역이 cspA 유전자의 프로모터 영역, 5′-UTR을 암호화하는 영역 및 13 아미노산 잔기로 이루어진 CspA의 N-말단부를 암호화하는 영역으로 구성된 영역으로 치환되는 구조를 갖는다. 첨언하면, 플라스미드 pMM031F1에서, CspA의 N-말단으로부터 13번째 것인 아스파라긴을 암호화하는 코돈이 라이신을 암호화하는 것으로 변하였다. 그러한 pMM031 시리즈에 사용된 cspA 유전자의 프로모터 영역은 기능에 필수적인 영역을 함유하는 유전자의 전사 개시점으로부터 계수하여 -67 및 그 뒤의 영역이다. 또한, CspA의 N-말단 13 아미노산 잔기를 암호화하는 영역은 저온 조건하에서 cspA 유전자의 고해독 효율을 발휘하는 다운스트림 박스 서열을 함유한다. 이러한 이유로부터, pMM031 시리즈는 저온 조건하에서 cspA 유전자의 높은 단백질-발현 효율을 반영할 수 있는 발현벡터이다.

pMM031 시리즈의 플라스미드가 저온 유도형 발현벡터로서 작용하고 활성형 단백질로서 유용 단백질을 발현할 수 있다는 사실은 실시예 1-(2)의 실시예로서 라우스-수반 바이러스 2(RAV-2)로부터 유도된 역전사효소의 사용에 의해 확인된다. 그러나, pMM031 시리즈의 사용에 의해 작제된 역전사효소-발현벡터에 의해 형질전환된 이.콜라이를 37℃에서 처리하였을 때, 어떠한 이종 유전자도 함유하지 않는 pMM031 시리즈의 플라스미드의 형질전환체와 비교하여, 생성되는 콜로니는 작고 세포 생장속도도 또한 느린 것으로 관찰되었다. 이러한 사실은 cspA 유전자(특히 이 유전자의 프로모터)가 사용될 때, 37℃에서의 발현 조절이 불충분하고 단백질 생산에 문제가 있음을 암시한다.

37℃에서 cspA 유전자의 발현조절 부정확성이 너무 심각하여, 발현시키고자 하는 단백질이 숙주에 너무 지나치게 유독할 때, 발현 플라스미드의 작제가 불가능한 것으로 나타났다. 실시예 1-(3)에 나타낸 바와 같이, pMM031 시리즈의 플라스미드 벡터를 사용하여 엔도-설페이트화-퓨코스-함유 폴리사카라이드 분해 효소(Fdase 2)를 발현하는 플라스미드의 작제가 시도될 때, 이 플라스미드의 작제는 숙주에 대한 발현산물의 독성에 기인하여 불가능하였다. 발현된 Fdase 2가 숙주에 영향을 미치고, 이에 따라 발현벡터의 작제가 불가능하다는 사실은 작제 작업 동안의 부산물로서, 효소를 암호화하는 유전자내 1 또는 2개의 염기의 결실로 인해 개방 판독 프레임이 정위치를 벗어나고 이에 따라 효소를 더 이상 발현할 수 없는 플라스미드가 수득된다는 사실로부터 쉽게 예측될 수 있다. 또한, 숙주 이.콜라이에 대한 Fdase 2의 독성의 경우, 선행기술의 하나로 도입된 pET-시스템(Novagen 제조)의 플라스미드 pET3d를 사용하여 상기 효소-발현벡터를 작제한 다음 T7RNA 폴리머라제 유전자를 갖는 발현용 숙주 이.콜라이 BL21 (DE3)을 형질전환시키려고 시도하였을 때 어떠한 형질전환체도 수득되지 않았다는 사실에 의해 보여진다.

본 발명에 이르러, 본 발명자는 이러한 결과를 바탕으로 하여 실제 사용시 효과적인 새로운 발현벡터를 개발해내었으며 본 발명의 플라스미드 벡터를 발견하 였다.

따라서, 본 발명자는 비유도 상태에서(37℃) 발현 수준을 저하시키고 목적 단백질의 발현을 조절할 수 있는 저온 발현 플라스미드 벡터 pMM037를 개발하였다. pMM037은 기능성 lac 오퍼레이터를 형성할 수 있도록 디자인되는 31 염기의 서열이 pMM031 시리즈의 pMM031F1상에 있는 전사 개시점(+1)의 하류의 +2 내지 +18의 영역 대신 삽입되는 것을 제외하고는 pMM01F1과 완전히 동일한 구조를 갖는다. 플라스미드 벡터 pMM037 상에 암호화된 5′-UTR의 염기서열, 즉 전사 개시점부터 CspA에 대한 개시 코돈 직전의 염기까지의 염기서열을 서열목록의 서열번호 2에 나타내었다.

본 발현 플라스미드 벡터의 작제방법이 실시예 2-(1)에 언급되어 있다. 따라서, cspA 프로모터의 하류에 기능성 lac 오퍼레이터를 형성하도록 디자인되고 cspA 유전자의 전사 개시점 상류의 영역 및 lac 오퍼레이터 영역의 서열을 함유하는 프라이머 CSA+1RLAC(프라이머의 염기서열을 서열목록의 서열번호 11에 나타내었다)를 합성할 수 있다. 5′-말단이 인산화되는 이러한 프라이머 및 pMM031 시리즈의 플라스미드 작제에 사용된 프라이머 CSA-67FN(이 프라이머의 염기서열은 서열목록의 서열번호 7에 나타내었다)이 사용되고 PCR이 야생형 cspA 유전자를 함유하는 플라스미드 pJJG02[참조문헌:J. Bacteriol., volume 178, pages 4919-4925 (1996)]를 주형으로 사용하여 수행될 때, cspA 유전자의 프로모터 하류에 lac 오퍼레이터 영역과 배치되는 DNA 단편이 수득될 수 있다. 제한 효소-인식 서열이 프라이머 CSA-67FN 상의 NcoI 부위 및 프라이머 CSA+1RLAC 상의 NheI 부위와 같이 그 때 사용된 프라이머의 말단 부근에 디자인될 때, 그 후에 작제 또는 변형이 편리하다. 생성되는 DNA 단편을 NcoI로 분해하여 플라스미드 pTV118N(Takara Shuzo 제조)의 NcoI와 SmaI 사이에 삽입시킴으로써 플라스미드 pMM034가 작제될 수 있다.

생성되는 pMM034는 NcoI 부위 및 pTV118N 상의 AflIII 부위에서 절단되고, 클레나우 단편을 이용하여 말단을 평활화하며 자가 연결을 수행하며 이에 따라 pTV118N으로부터 유도된 lac 프로모터가 제거되는 플라스미드 pMM035가 작제될 수 있다.

그 후에, pMM035의 lac 오퍼레이터 영역 하류의 cspA mRNA의 5′-비해독 영역을 암호화하는 서열이 삽입될 수 있다. 따라서, PCR은 주형으로서 실시예 1-(1)에서 작제한 pMM031F1을 주형으로 사용하고 프라이머 CSA+20FN(프라이머 CSA+20FN의 염기서열을 서열목록의 서열번호 12에 나타내었다) 및 M13 프라이머 M4(Takara Shuzo 제조)를 사용하여 수행하며, 이에 따라 cspA 유전자의 전사 개시점 하류의 19번째 염기서부터 pMM031F1의 다중 클로닝 부위까지를 함유하는 DNA 단편을 수득할 수 있다. DNA 단편을 CSA+20FN 상에 배치된 NheI 부위 및 다중 클로닝 부위 상 XbaI 부위에서 절단하고, 그 후 단편을 이미 제조한 pMM035의 NheI-XbaI 사이에 각각의 부위가 재생되도록 하는 방향으로 삽입시키며 이에 따라 pMM037이 작제될 수 있다.

생성되는 플라스미드 pMM037의 통상의 온도(37℃)에서 목적 단백질의 발현 조절능 및 저온에서의 목적 단백질 발현능은 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 pMM037 상의 pTV118N으로부터 유도된 다중 클로닝 부위 중으로 도입함으로써 시험될 수 있다.

전술한 엔도-설페이트화-퓨코스-함유 폴리사카라이드 분해효소(Fdase 2)를 암호화하는 유전자를 갖는 발현 플라스미드는 오퍼레이터를 갖지 않는 pMM031 시리즈의 플라스미드 벡터에 의해서도 작제될 수 없다. 그러나, CspA의 N-말단부를 암호화하는 서열에서와 같이 동일한 판독 프레임이 생성되도록 하는 방식으로 상기 유전자를 플라스미드 벡터 pMM037 중으로 삽입시켜 작제된 발현 플라스미드인 플라스미드 pMFDA102는 이.콜라이 JM109와 같이 lac 리프레서를 고도로 발현하는 균주인 이.콜라이에 안정한 방식으로 잔류될 수 있다. 이와 같이, 전술한 플라스미드 벡터가 실질적으로 효과적인 발현 조절능을 보유함이 명백해진다.

또한, 생성되는 형질전환체를 통상의 온도(37℃)에서 배양하며, 유도에 적합한 탁도가 달성될 때, 배양 온도를 15℃와 같이 더 낮게 하고, 동시에 이소프로필-β-D-티오갈락토사이드(이하, IPTG로 언급)와 같은 적당한 유도제를 최종 농도 1 mM로 가한 다음 적당한 기간 동안 배양한다. 배양액으로부터 수득된 세포를 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 발현 단백질에 대해 분석하여 융합 폴리펩타이드의 밴드를 검출하고 이에 따라 저온에서 목적 단백질의 발현에 대한 pMM037의 능력이 확인될 수 있다. 이와 달리, 생성되는 세포를 초음파처리 등을 하여 세포 추출물을 제조하고 세포 추추물에 함유된 목적 단백질의 생리활성을 측정하며, 활성형으로 발현된 목적 단백질의 양이 측정될 수 있다. 전술한 플라스미드 pMFDA102에 의해 형질전환된 이.콜라이는 상기 유도 작업에 의해 활성 Fdase 2 단백질을 발현하였다.

첨언하면, 상기 플라스미드 벡터 pMM037의 작제에서, lac 오퍼레이터가 cspA 유전자의 전사 개시점 바로 뒤의 위치(+2 및 그 뒤의 위치)에 도입된다는 사실에도 불구하고, 고유 기능인 저온에서의 전사를 개시하는 활성을 여전히 보유하였다. 이러한 사실로부터, cspA 프로모터가 전사 개시점까지의 영역에서 자신의 기능을 보유하고 있음이 이해된다.

따라서, cspA 프로모터의 기능을 위해서는, -37의 상기 위치에서 전사 개시점까지의 영역, 즉 환언하면, 서열목록의 서열번호 6에 나타낸 천연 cspA 유전자의 염기서열내 염기 번호 425-461의 영역이 필수적이다. cspA 프로모터에 대한 필수 영역의 염기서열을 서열목록의 서열번호 5에 나타내었다.

작제된 플라스미드 벡터 pMM037은 염기의 결실, 첨가, 삽입 및 치환과 같은 변화의 도입에 의해 변형될 수 있으며 변화가 본 발명의 구성 요소 중으로 도입되는 것도 본 발명에 포함된다. 이하에서는, 본 발명자에 의해 수행된, 기본 구조로서 pMM037을 사용하는 본 발명의 벡터의 변형예가 설명된다.

우선, 5′-UTR을 암호화하는 영역 중으로 결실 돌연변이를 도입시킬 수 있다. 실시예 3-(1)에서 언급되는 바와 같이, cspA 유전자의 SD 서열이 pMM037의 lac 오퍼레이터 영역 바로 뒤에 연결되는 플라스미드, 즉 다시 말해서, 서열목록의 서열번호 2에 나타낸 바와 같이 염기 번호 33-161 부분이 결손된, pMM037 상에 암호화된 5′-UTR을 암호화하는 플라스미드 벡터 pMM036을 작제할 수 있다. 이 pMM036은 5′-UTR을 암호화하는 서열에 도입된 결실 돌연변이를 제외하고는 pMM037과 완전히 동일한 구조를 갖는다.

이어서, 발현시키고자 하는 단백질과 융합될 CspA의 N-말단부의 아미노산 잔기의 길이를 변화시킬 수 있다. 실시예 3-(2)에 나타낸 바와 같이, pMM037 상의 CspA의 N-말단부를 암호화하는 영역이 전체 아미노산 서열 암호화 영역(70 아미노산 잔기)으로 사용되고, 다중 클로닝 부위가 그 뒤에 배치되어 목적 유전자가 CspA의 70 아미노산 잔기와의 융합 폴리펩타이드로서 발현되는 플라스미드 벡터 pMM038을 작제할 수 있다. 이 pMM038은 융합 폴리펩타이드로서 발현된 CspA를 암호화하는 서열의 전체 길이가 함유되어 있는 것을 제외하고는 pMM037과 완전히 동일한 구조를 갖는다.

5′-UTR을 암호화하는 서열에 치환 돌연변이의 도입도 가능하다. 실시예 3-(3)에서 언급되는 바와 같이, pMM037 상 5′-UTR을 암호화하는 영역 상의 천연 cspA 유전자의 전사 개시점으로부터 계수하여 +20 내지 +26에 상응하는 영역에 6 염기 치환에 의한 돌연변이가 도입되는 플라스미드 벡터 pMM047를 작제할 수 있다. 이 pMM047은 상기 치환 돌연변이를 제외하고는 pMM037과 완전히 동일한 구조를 갖는다. 첨언하면, 플라스미드 벡터 pMM047에 의해 형질전환된 이.콜라이 JM109를 이.콜라이 JM109/pMM047로서 명명하고, 1997년 10월 31일부로 National Institute of Bioscience and Human Technology, Ministry of Internal Trade and Industry(일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1 초메 1반 3고; 우편번호 305-8566)에 FERM P-16496으로서 및 동 기관에 FERM BP-6523으로서(국제 기탁기관으로의 이전 청구일: 1998년 9월 24일) 기탁되었다. 플라스미드 벡터 pMM047로 암호화된 5′-UTR의 염기서열 또는 전사 개시점에서 CspA에 대한 개시 코돈 바로 전의 염기까지의 염기서열을 서열목록의 서열번호 3에 나타내었다.

또한, 이러한 돌연변이 둘 이상이 동시에 도입될 수도 있다, 실시예 3-(4)에 나타낸 바와 같이, 30 염기의 결실 돌연변이가 상기 플라스미드 pMM047의 5′-UTR을 암호화하는 서열에 추가 도입되는 플라스미드 벡터 pMM048을 작제할 수 있다. 이 pMM048은 pMM047과 동일한 6 염기 치환 및 전사 개시점에서부터 계수하여 +56 내지 +85에 상응하는 영역의 결실과 천연 cspA 유전자, 즉 다시 말해서 서열목록의 서열번호 3에 나타낸 염기서열에서 염기 번호 70-99를 암호화하는 영역을 함유한다는 점을 제외하고는 pMM037과 완전히 동일한 구조를 갖는다. 플라스미드 벡터 pMM048로 암호화된 5′-UTR의 염기서열을 서열목록의 서열번호 4에 나타내었다.

전술한 플라스미드 벡터 pMM047 및 pMM048이 저온에서 단백질 발현능을 보유한다는 사실로부터, 그러한 두 유전자의 작제에서 cspA 유전자에 고유한 5′-UTR에 도입된 돌연변이는 기능에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 따라서, 저온에서 단백질 발현에 필수적인 cspA 유전자로부터 유도된 5′-UTR 상의 영역이 플라스미드 pMM048 상에 암호화된 천연 cspA 유전자의 전사 개시점에서부터 계수하여 +27 내지 +55 및 +86 내지 +159의 영역인 것으로 나타났다. 이 영역의 염기서열을 서열목록의 서열번호 1에 나타내었다.

pMM037의 변형된 플라스미드 벡터, 즉 pMM036, pMM038, pMM047 및 pMM48의 통상의 온도(37℃)에서 목적 단백질의 발현 조절능 및 저온에서의 목적 단백질에 대한 발현능의 효율은 예를 들면, 발현벡터의 발현능 평가에 잘 사용되는 β-갈락토시다제 유전자(lac Z 유전자)를 이용함으로써 평가될 수 있다.

따라서, 실시예 3-(5)에 언급된 바와 같이, 플라스미드 벡터 pKM005[참조문헌:Experimental Manipulation of Gene Expression, pages 15-32, edited by M. Inouye, published by Academic Press, New York, 1983]로부터 수득된 lac Z 유전자를 함유하는 약 6.2 kbp의 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pMM037 및 이의 변형된 플라스미드에 삽입함으로써, CspA의 N-말단에서의 12 아미노산 잔기 및 다중 클로닝 부위로부터 유도된 10 아미노산 잔기가 β-갈락토시다제의 10번째 아미노산 잔기에서 연결되는 융합된 β-갈락토시다제 발현벡터를 작제할 수 있다. pMM038의 경우에, CspA N-말단에서의 70 아미노산 잔기 및 다중 클로닝 부위로부터 유도된 9 아미노산 잔기는 β-갈락토시다제의 10번째 아미노산 잔기에서 연결된 융합된 β-갈락토시다제를 암호화한다. lac Z 유전자를 함유하는 생성되는 플라스미드는 pMM0371ac, pMM036lac, pMM038lac, pMM047lac 및 pMM048lac로 각각 명명한다.

각각의 플라스미드에 의해 형질전환된 이.콜라이 JM109를 통상의 온도(37℃)에서 배양하고, 유도에 적합한 탁도가 이용가능할 때, 배양 온도를 예를 들면 15℃로 낮추고, 동시에 IPTG와 같은 적당한 유도제를 최종 농도 1 mM로 첨가한 다음, 적당한 기간 동안 추가 배양하고 생성되는 배양용액내 β-갈락토시다제 활성을 측정함으로써 저온에서의 단백질 발현능을 비교할 수 있다. 유도 직전의 세포가 사용될 경우, 37℃에서 비-유도 상태에서 발현된 양도 비교할 수 있다.

β-갈락토시다제 활성은 문헌[참조:Experiments in Molecular Genetics", pages 352-355, edited by J. H. Miller and published by Cold Spring Harbor Laboratory in 1972]에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 플라스미드에 의해 형질전환된 이.콜라이의 37℃에서의 β-갈락토시다제 활성은 대조군으로 사용된, lac Z 유전자가 lac 프로모터 의 하류에 도입되는 pTV118Nlac와 동일한 수준을 가지며 37℃에서의 발현이 효과적으로 조절됨이 이해된다. 첨언하면, 그 시간에 검출된 37℃에서의 β-갈락토시다제 활성은 배양용으로 사용된 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물 및 0.5% NaCl; pH 7.0)에 오염된 락토스 등에 의해 다소 유도되는 그러한 수준에 있다.

한편, 플라스미드에 의해 형질전환된 이.콜라이에서, β-갈락토시다제 활성의 증가가 15℃로의 온도 변위에 의해 및 유도제의 첨가에 의해 관찰되었다. 이러한 결과는 각각의 플라스미드가 저온에서의 목적 단백질 고발현능을 지니고 있음을 보여준다. 첨언하면, cspA 유전자 mRNA로부터 유도된 5′-UTR의 대부분이 상실된 플라스미드 pMM036의 경우에, β-갈락토시다제의 발현량은 기타 플라스미드에 비해 낮다.

또한, pMM047lac 및 pMM048lac에 대해 수득된 결과는 그러한 플라스미드가 암호화하는 mRNA의 5′-UTR에 도입된 돌연변이가 저온에서의 단백질 발현에 악영향을 미치지 않거나 염기서열을 서열목록의 서열번호 1에 나타낸, 그러한 돌연변이가 도입되지 않은 영역이 자체 기능에 필수임을 보여준다.

또한, 그러한 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체에 대한 각각의 온도에서의 β-갈락토시다제의 발현량이 시험되고 10 또는 15℃ 같은 저온에서 플라스미드 pMM038lac, pMM037lac 및 pMM047lac 전부가 높은 발현량을 나타내었고, 20℃ 온도에서의 것들은 동수준의 발현량을 나타내었으며 37℃에서의 것들은 pTV118lac(대조군)에 비해 낮은 발현량을 나타낸 것으로 밝혀졌다. 결과는 그러한 플라스미드가 암호화하는 mRNA의 5′-UTR이 대부분 15℃ 이하와 같은 저온 상태에서 단백질의 발현에 효과적임을 보여준다. 한편, 플라스미드 pMM048lac는 20℃ 이하의 저온상태에서 비교적 높은 발현량을 나타내고 심지어 37℃에서도 pTV118Nlac에 비해 유사한 발현량을 나타내었다. 이러한 사실은 pMM048 중으로의 도입에 의해 초래된 돌연변이의 결과로, 플라스미드가 통상의 온도 및 저온 모두에서 단백질의 고발현능을 획득하였음을 보여준다.

한편, 두말할 필요도 없이, 본 발명의 벡터에서, 본 발명의 구성 요소가 아닌 영역도 다양한 기능을 지닐 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 벡터는 플라스미드의 안정화를 위해 종결 코돈 및 전사 터미네이터를 실질적으로 함유하지 않는 다중 클로닝 부위를 함유할 수 있다. 실시예 4에 언급된 바와 같이, cspA 유전자의 개시 코돈을 함유하는 부위가 NcoI 부위 또는 NdeI 부위로 전환되고, CspA의 N-말단을 암호화하는 영역에 연결되는 다중 클로닝 부위가 종결 코돈을 실질적으로 함유하지 않는 서열로 변화되고, 이의 하류에 종결 코돈이 3개의 개방 판독 프레임에 출현하는 서열을 갖고 이의 추가의 하류가 cspA 유전자로부터 유도된 전사 터미네이터 영역을 함유하는 다중 클로닝 부위 상에 각각의 상이한 개방 판독 프레임을 갖는 벡터 시리즈를 작제할 수 있다. 기본 골격으로서 pMM047을 함유하는 플라스미드를 pCold01NC 시리즈(NcoI 부위 포함) 또는 pCold01ND 시리즈(NdeI 부위 포함) 플라스미드로 명명하고, 반면에 기본 골격으로 pMM048을 함유하는 플라스미드를 pCold02NC 시리즈 또는 pCold02ND 시리즈 플라스미드로 명명한다. 실질적으로 종결 코돈을 함유하지 않고 각각의 개방 판독 프레임이 상이한 다중 클로닝 부위를 갖는 그러한 플라스미드 시리즈에서, 이종 유전자의 삽입이 용이하고 따라서 발현벡터가 용이하게 작제될 수 있다.

그러한 pCold01 시리즈 및 pCold02 시리즈 플라스미드가 이들의 기본 골격, 즉 플라스미드 pMM047 및 pMM048과 유사한 발현능을 갖는다는 사실은 lac Z 유전자를 사용함으로써 평가될 수 있다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 전술한 플라스미드에 lac Z 유전자를 삽입하여 제조되는 플라스미드에 의해 형질전환된 이.콜라이는 각각 표 1에 나타낸 pMM047lac 또는 pMM048lac에 의해 형질전환된 이.콜라이와 유사한 β-갈락토시다제 발현 패턴을 보이고, 상기 플라스미드는 각각 플라스미드 pMM047 또는 pMM048과 유사한 발현능을 보유하고 있음을 보여준다.

구체적으로 전술한 본 발명의 벡터 전부가 오퍼레이터로서 lac 오퍼레이터를 사용하므로, 유전자 발현이 목적일 때, 이.콜라이 JM109와 같은 lac 리프레서를 다량 발현하는 이.콜라이 균주(lac I^q 균주)를 사용하는 것이 필요하다. 기타 오퍼레이터가 본 발명의 벡터에 사용될 수 있으며, 그러한 경우에, 물론 오퍼레이터의 적합한 조절 방법이 사용된다. 또한, 당업자에 자명한 바와 같이, 심지어 lac 오퍼레이터가 상기 pCold 시리즈 플라스미드의 경우에서와 같이 사용될 때 조차도, 이 플라스미드에 lac 리프레서 유전자(lac I 유전자)의 도입에 의해 숙주에 대한 제한을 없앨 수 있다.

예를 들면, 실시예 5에서 언급되는 바와 같이, lac I 유전자를 함유하는 pCold03 시리즈 및 pCold04 시리즈를 작제하는 것이 가능하다. 각각의 이들 플라스미드는 각각 lac I 유전자가 함유되어 있는 것을 제외하고는 pCold01 시리즈 및 pCold02 시리즈와 완전히 동일한 구조를 갖는다. 또한, 이와 유사하게, lac I 유전 자 대신에 다량의 lac 리프레서를 발현하는 유전자인 lac I^q유전자를 이용하여 pCold05 시리즈 및 pCold06 시리즈 플라스미드와 같은 플라스미드도 작제할 수 있다.

그와 같이 작제된 lac I 유전자 또는 lac I^q 유전자를 함유하는 플라스미드의 목적 단백질 발현 조절능 및 또한 이의 저온에서의 목적 단백질 발현능의 효율이 이들 플라스미드 중으로 lac Z 유전자의 삽입에 의해 및 숙주로서 lac I 유전자를 갖지 않는 이.콜라이 DH5 α의 사용에 의해 용이하게 평가될 수 있다. 표 6은 lac I 및 lac I^q 유전자의 효과를 보여준다. 비유도 상태인 37℃에서, lac I 유전자를 갖지 않는 pCold01NC2lac의 경우에는 발현이 완전히 조절되지 않으며, 높은 β-갈락토시다제 활성이 관찰된다. 첨언하면, 37℃에서 pCold01보다 높은 발현능을 갖는 pCold02(pMM048의 유도체)의 경우에, 숙주로서 이.콜라이 DH5 α를 사용하여서는 어떠한 형질전환체도 수득되지 않는다. 이와는 대조적으로, lac I 유전자를 갖는 pCold03NC2lac 및 pCold04NC21ac의 경우에, 37℃에서의 발현은 효과적으로 조절되며, 또한, lac I^q 유전자가 존재하는 pCold05NC2lac 및 pCold06NC2lac의 경우에, 발현은 더욱 효과적으로 억제되어 효과적인 조절이 달성되는 것으로 나타난다. 또한, 그러한 플라스미드에 있어서, 유도 상태에서 목적 단백질에 대한 발현능면에서 실질적인 변화는 존재하지 않는다. 따라서, lac I 유전자 또는 lac I^q유전자가 구성 요소로서 lac 오퍼레이터를 함유하는 본 발명의 벡터 중으로 도입될 때, lac 리 프레서 존재 유무에 관계 없이 숙주에 대한 제한이 없는 것으로 나타났다.

또한, 목적 유전자의 발현 효율을 향상시키기 위하여, 16S 리보솜 RNA에 존재하는 안티-다운스트림 박스와 높은 상보성을 갖는 염기서열(다운스트림 박스 서열)을 본 발명의 벡터 중으로 도입시키는 것도 가능하다. 이.콜라이 CspA의 N-말단부를 암호화하는 영역에 존재하는 다운스트림 박스 서열은 전술한 안티-다운스트림 박스 서열과 단지 67%의 상보성만을 갖는다. 좀더 높은 상보성 또는 바람직하게는 80% 이상의 상보성을 갖는 염기서열로 만들 때, 이의 하류에 연결되는 유전자가 고효율로서 발현되는 것이 가능하다.

또한, 발현된 목적 유전자 산물의 정제를 더 용이하게 하기 위한 펩타이드인 태그 서열 또는 태그 서열과 같은 목적 유전자 산물내 잉여 펩타이드의 제거에 사용될 수 있는 프로테아제-인식 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열이 본 발명의 벡터 중으로 도입될 수 있다.

정제를 위한 태그 서열의 경우, 수 개의 히스티딘 잔기, 말토스-결합 단백질, 글루타치온-S-트랜스퍼라제 등으로 이루어진 히스티딘 태그가 사용될 수 있다. 히스티딘 태그가 첨가되는 단백질은 킬레이팅 칼럼을 이용하여 용이하게 정제할 수 있고, 다른 태그의 경우, 이들은 이들과의 특이적 친화성을 갖는 리간드를 이용하여 용이하게 정제할 수 있다. 잉여 펩타이드의 제거에 이용되는 프로테아제의 예는 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제이고, 그러한 프로테아제에 의해 특이적으로 절단되는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 본 발명의 벡터 중으로 도입시킬 수 있다.

예를 들면, 실시예 6에서, 16S 리보솜 RNA에 존재하는 안티-다운스트림 서열과 완전히 상보적인 다운스트림 박스 서열 및 인자 Xa의 인식 아미노산 서열 및 6개의 히스티딘 잔기로 이루어진 히스티딘 태그를 암호화하는 염기서열이 도입된 플라스미드(pCold07 시리즈 및 pCold08 시리즈)가 언급된다. 이러한 플라스미드의 단백질 발현능이 lac Z 유전자를 이용하여 평가될 때, 발현된 β-갈락토시다제 활성은 낮은 상보성을 보이는 다운스트림 박스 서열을 갖는 플라스미드에 비하여 상당히 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 비록 유도전 β-갈락토시다제의 발현된 양이 다소 증가하지만, 허용수준내에 있으며, 전술한 바와 같이 이들 플라스미드 상의 lac I 유전자를 lac I^q유전자로 변화시킴으로써 효율적으로 억제될 수 있다.

pCold07 시리즈 또는 pCold08 시리즈가 사용될 경우, 목적 단백질은 다운스트림 박스 서열, 히스티딘 태그 및 인자 Xa의 인식 아미노산 서열을 함유하는 리더 펩타이드로 암호화된 펩타이드와의 융합 단백질로서 발현된다. 융합 단백질은 히스티딘 태그를 함유하므로, 단일 단계에 의해 킬레이팅 칼럼을 이용하여 정제할 수 있다. 이후, 상기 단백질을 인자 Xa로 처리하여 목적 단백질로부터 리더 펩타이드를 절단한 다음, 킬레이팅 칼럼을 다시 1회 통과시켜 리더 펩타이드가 제거된 목적 단백질만을 수득할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예로 좀더 구체적으로 설명되며 본 발명은 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 언급된 작업 중에서, 플라스미드의 제조 및 제한 효소 분해 같은 기본적인 작업은 문헌[참조:"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Edition, edited by T. Maniatis, et al., published by Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]에 기재된 방법에 따라 수행된다. 또한, 하기 플라스미드의 작제시, 이.콜라이 JM109가 숙주로서 사용되고 100 ㎍/ml의 앰피실린을 함유하는 LB 배지(1% 트립신, 0.5% 효모 및 0.5% NaCl; pH 7.0) 또는 달리 언급하지 않는 한 한천 1.5%를 첨가하여 응고시킨 LB 배지를 사용하여 37℃에서 호기성 배양을 수행한다.

실시예 1. pMM031 시리즈의 저온 유도성 벡터의 작제 및 유도능의 조사

(1)플라스미드 벡터 pMM031 및 pMM031F1의 작제

주형으로서 cspA 유전자를 함유하는 플라스미드 pJJG02[참조문헌:J. Bacteriol., volume 178, pages 4919-4925 (1996)]를 사용하고 합성 프라이머 CSA-67FN 및 CSA13R(프라이머 CSA-67FN 및 CSA13R의 염기서열을 각각 서열목록의 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타내었다)을 사용하여 PCR을 수행하여 cspA 유전자의 프로모터로부터 13번째 아미노산 잔기를 암호화하는 영역까지를 함유하는 DNA 단편을 수득한다. DNA 단편을 전술한 프라이머 각각에 배치된 NcoI 및 EcoRI 부위에서 절단한 다음 플라스미드 pTV118N(Takara Shuzo 제조)의 NcoI와 EcoRI 사이의 영역에 삽입시켜 플라스미드 pMM030을 작제한다. 이어서, 플라스미드를 NcoI(Takara Shuzo 제조) 및 AflIII(NEB 제조)로 분해하고, 말단을 클레나우 단편(Takara Shuzo 제조)을 사용하여 평활화한 다음 자가 연결시켜 pTV118N으로부터 유도된 lac 프로모터가 제거된 플라스미드 pMM031을 수득한다. 플라스미드 pMM031은 cspA 유전자의 프로모터 영역(67 염기), 5′-비해독 영역(159 염기) 및 CspA의 N-말단 내지 13번째 아미노산 잔기까지를 암호화하는 영역(39 염기)의 하류에 pTV118N으로부터 유도된 EcoRI-HindIII의 다중 클로닝 부위를 갖는 플라스미드 벡터이다.

그 후, pMM031 상 cspA 유전자의 개시 코돈으로부터 시작하는 개방 판독 프레임을 다중 클로닝 부위로 변위시키기 위하여, pMM031 중으로 삽입된 CspA의 N-말단부를 암호화하는 영역의 3′-말단으로부터 하나의 염기가 결실된 플라스미드 벡터 pMM031F1이 작제된다. 플라스미드 pMM031F1은 프라이머 CSA13R 대신에 프라이머 CSA13R2(프라이머 CSA13R2의 염기서열을 서열목록의 서열번호 9에 나타내었다)가 사용되는 것을 제외하고는 pMM031의 작제에서와 완전히 동일한 방법에 의해 작제된다. 따라서, 생성되는 플라스미드는 3′-말단이 pMM031 상 CspA의 N-말단 영역의 암호화 영역에 하나 적은 염기를 갖는 것을 제외하고는 pMM031과 동일한 구조를 갖는다. 첨언하면, 그러한 1 염기의 결실로 인하여, 플라스미드 pMM031F1으로 암호화된 CspA의 N-말단으로부터 13번째 아미노산 잔기가 아스파라진에서 라이신으로 변하였다.

(2)라우스-수반 바이러스 2(RAV-2)로부터 유도된 역전사효소를 암호화하는 유전자를 사용하여 pMM031 시리즈의 저온 유도성 벡터의 유도능 조사

라우스-수반 바이러스 2(RAV-2)로부터 유도된 역전사효소를 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pT8RAV를 일본 공개 특허 평 07/039,378에 기재된 이.콜라이 JM109/pT8RAV(FERM P-13716)로부터 제조한다. 상기 플라스미드를 EcoRI 및 SalI(모두 Takara Shuzo 제조)로 분해하여 상기 역전사효소를 암호화하는 유전자 및 이의 다운스트림에 전사 종결 서열을 함유하는 DNA 단편을 수득한다. DNA 단편 을 (1)에서 수득된 pMM031F1의 EcoRI과 SalI 사이의 영역에 삽입시켜 플라스미드 pMM031RAV를 작제한다.

이.콜라이 JM109(Takara Shuzo 제조)를 pMM031RAV 및 pMM031을 사용하여 형질전환시켜 100 ㎍/ml의 앰피실린을 함유하는 LB 플레이트 상에 형질전환체 각각의 콜로니를 형성시키며 이에 따라 pMM031RAV에 의해 형질전환된 이.콜라이의 콜로니가 pMM031에 의한 형질전환체의 콜로니보다 명백히 더 작다는 것이 관찰된다. 이어서, 생성되는 형질전환체 각각을 100 ㎍/ml의 앰피실린을 함유하는 LB 배지에 접종하고 37℃에서 하룻밤 호기 배양한다. 배양액의 각각의 두 튜브를 새로 제조한 동일 배지 5 ml에 1% 농도로 접종하고, 37℃에서 호기 배양한 다음, 탁도가 OD600 = 0.6이 될 때, 이들 중 하나의 배양 온도를 15℃로 만들고 20 시간 이상 배양한다. 배양 중에 , pMM031RAV에 의한 형질전환체의 유도된 탁도에 도달하는 데 필요한 배양 시간은 pMM031에 의한 형질전환체의 경우의 약 두 배였다. 배양 완료 후, 배양액을 원심분리하여 세포를 수집하고 세포를 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석한다. 결과는 15℃에서 배양한 pMM031RAV에 의한 형질전환체에서만, 약 100,000 분자량의 역전사효소인 것으로 추정되는 밴드가 관찰되고 따라서 pMM031 상 cspA로부터 유도된 단백질 발현 시스템이 저온 유도형이었음이 확인된다.

그후, 이.콜라이의 추출물을 제조하여 이의 역전사효소 활성을 측정한다. 따라서, pMM031RAV에 의해 형질전환된 이.콜라이 JM109를 앰피실린 100 ㎍/ml를 함유하는 LB 배지에 접종하고 37℃에서 하룻밤 호기 배양한다. 배양액을 새로 제조한 동일한 배지 100 ml에 4% 농도로 접종하고 37℃에서 호기 배양하며, 탁도가 OD600 = 0.6에 도달할 때 배양 온도를 15℃로 만들고 5 시간 이상 배양을 수행한다. 배양 완료 후, 배양액을 원심분리하여 세포를 수집하고 세포를 용해 완충액[50 mM 트리스 하이드로클로라이드 (pH 8.3), 60 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM DTT 및 5 μM 4-아미노디페닐메탄설포닐 플루오라이드 하이드로클라이드] 4.7 ml에 현탁시켜 초음파 처리에 의해 세포를 붕괴시킨다. 이를 원심분리하여 상등액을 회수하며 이에 따라 이.콜라이의 추출물이 수득된다. 효소에 대한 희석 용액[50 mM 트리스 하이드로클로라이드 (pH 8.3), 10% 글리세롤, 0.1% NP-40 및 2 mM DTT]을 사용하여 추출물을 10배 정도로 희석시키고 일본 특허공개 평-07/039,378에 기재된 방법에 의해 역전사효소의 활성을 측정하여 대체로 역전사효소 활성의 1061 단위가 검출가능하였다. 이는 배양액 ml 당 역전사효소 활성 10 단위가 발현됨을 보여주고 이에 따라 저온에서 pMM031의 발현량이 높음이 자명하다.

(3)pMM031 시리즈의 저온 유도성 벡터를 사용한 엔도-설페이트화-퓨코스-함유 폴리사카라이드 분해효소(Fdase 2)의 유전자의 클로닝

앨터로모나스(Alteromonas) 종 SN-1009로부터 유도된 엔도-설페이트화-퓨코스-함유 폴리사카라이드 분해효소(ORF-2;이하 Fdase 2로 언급; 이 효소를 암호화하는 유전자의 염기서열은 서열목록의 서열번호 10에 나타내었다)를 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pSFDA7이 도입된 이.콜라이 JM109/pSFDA7(FERM BP-6340)으로부터 통상의 방법에 의해 플라스미드를 제조한다. 생성되는 pSFDA7을 HindIII(Takara Shuzo 제조)로 분해하고, 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리한 다음 Fdase 2의 C-말단 영역을 암호화하는 약 4.8 kb의 DNA 단편을 절단하고 추출한 다음 정제한다. DNA 단편을 pMM031의 HindIII 부위 중으로 삽입시켜 cspA 프로모터와 Fdase 2 유전자의 방향이 동일하게 되어 pMM031-Fdase 2C가 제조되도록 한다. 이어서, pSFDA7을 SnaBI(Takara Shuzo 제조)로 분해하여 Fdase 2의 4번째 아미노산 잔기에서 C-말단 아미노산까지를 암호화하는 영역을 함유하는 약 2.5 kb의 DNA 단편이 분리된다. DNA 단편을 앞서 제조한 pMM031-Fdase 2C의 SmaI와 SnaBI 사이의 영역 중으로 삽입시키고 Fdase 2의 4번째 아미노산 잔기 및 그 뒤부분이 pMM031 상의 CspA의 N-말단 서열로서 동일 개방 판독 프레임에 연결된 융합 폴리펩타이드 발현벡터를 작제하고자 시도하였다. 그러나, 플라스미드 26개의 생성되는 형질전환체에 대해 추출하여 정제하고 분석하였을 때, 약 2.5 kb의 SnaBI 단편이 21개의 플라스미드 중으로 삽입되었고, 그 중 2개에서만 상기 단편이 정확한 방향으로 삽입된 것으로 나타났다. 더욱이, 두 플라스미드를 연결된 부분의 염기서열에 대해 분석한 결과, SmaI의 절단된 부위에서 생긴 1 염기의 결실에 기인하여, CspA 및 Fdase2의 개방 판독 프레임이 변위된 것으로 나타났고 이들은 목적하는 융합 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 플라스미드가 아니었다.

상기 작제방법에서, 삽입될 DNA 단편은 평활말단이고 이들은 정상 방향 및 역전된 방향 모두로 삽입된다. 따라서, 융합 폴리펩타이드 발현벡터의 작제는 타 방법으로 시도되었다. 따라서, 플라스미드 pSFDA7을 SnaBI 및 XbaI(둘 모두 Takara Shuzo 제조)로 분해하여 수득한 Fdase 2의 4번째 및 그 이하의 아미노산 잔기의 약 절반을 암호화하는 약 1 kb의 DNA 단편이 분리된다. DNA 단편을 상기 수득한 pMM031-Fdase 2C의 SmaI과 XbaI의 사이에 삽입시켜 상기의 융합된 폴리펩타이드 발 현 플라스미드의 작제를 시도한다. 그러나, 플라스미드를 생성된 12개의 형질전환체로부터 추출하여 정제하고 분석하였을 때, 약 1 kb의 상기 DNA 단편이 삽입된 3개의 플라스미드만이 존재하였다. 더욱이, 이들의 염기서열 분석 결과는 예상대로 1-2 염기의 결실이 SmaI의 절단된 부위에서 일어나서, 목적하는 융합 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 어떠한 플라스미드도 수득되지 않았음을 교시한다. 이로부터, 발현 플라스미드가 작제되지 않는 이유는, Fdase 2의 발현 산물처럼 세포의 성장에 막대한 영향을 미치는 유전자의 경우에, cspA 프로모터의 기능이 37℃에서 잘 억제되지 않아서 암호화된 유전자 산물이 이의 하류에서 발현되기 때문임이 자명하다.

실시예 2. 저온 유도성 플라스미드 벡터 pMM037의 작제 및 이의 유도능 조사

(1)플라스미드 벡터 pMM037의 작제

cspA 프로모터의 하류에 lac 오퍼레이터 영역을 도입하기 위하여, 프라이머 CSA+1RLAC(서열목록의 서열번호 11에 프라이머 CSA+1RLAC의 염기서열을 나타내었다)를 디자인하여 합성한다. CSA+1RLAC의 5 ′-말단을 Megalabel Kit(Takara Shuzo 제조)로 인산화하고 상기 프라이머 CSA-67FN과 함께 주형으로 플라스미드 pJJG02를 사용하여 PCR을 수행하여 lac 오퍼레이터 영역이 cspA 유전자의 프로모터 하류에 배치된 DNA 단편이 수득된다. DNA 단편을 NcoI(Takara Shuzo 제조)로 분해하고 플라스미드 pTV118N(Takara Shuzo 제조)의 NcoI 및 SmaI 부위 사이의 영역 중으로 삽입시켜 pMM034를 작제한다. 이 플라스미드를 NcoI 및 AflIII으로 분해하고, 클레나우 단편을 사용하여 말단을 평활화한 다음 자가 연결시켜 pTV118로부터 유도된 lac 프로모터가 제거된 플라스미드 pMM035를 수득한다.

그 후, 실시예 1-(1)에서 수득한 플라스미드 벡터 pMM031F1 및 프라이머 CSA+20FN(프라이머 CSA+20FN의 염기서열을 서열목록의 서열번호 12에 나타내었다) 및 M13 프라이머 M4(Takara Shuzo 제조)를 사용하여 PCR을 수행하여 상기 플라스미드 벡터 상의 cspA 유전자의 전사 개시점 하류에 있는 19번째 염기서부터 pMM031Fl의 다중 클로닝 부위까지를 함유하는 DNA 단편을 수득한다. DNA 단편을 프라이머 CSA+20FN 상에 배치된 NheI 부위 및 다중 클로닝 부위 상에 배치된 XbaI에 의해 절단하고 앞서 제조된 pMM035의 NheI와 XbaI 부위 사이에 삽입시켜 각각의 부위가 생성되게 하여 플라스미드 벡터 pMM037을 작제한다. 이 pMM037은 cspA 유전자의 프로모터 영역(67 염기), 전사 개시 염기(1 염기), lac 오퍼레이터로부터 유도된 5′-비해독 영역(31 염기), cspA로부터 유도된 5′-비해독 영역(141 염기) 및 CspA의 N-말단 영역의 암호화 영역(38 염기)의 하류에 pTV118N으로부터 유도된 EcoRI-HindIII의 다중 클로닝 부위를 갖는 플라스미드이다. 플라스미드 벡터 pMM037 상에 암호화된 5′-UTR 또는 전사 개시점부터 CspA 개시 코돈 직전까지의 염기의 염기서열을 서열번호 2에 나타내었다.

(2)엔도-설페이트화-퓨코스-함유 폴리사카라이드 분해 효소(Fdase 2)를 암호화하는 유전자를 사용한 저온 유도성 플라스미드 벡터 pMM037의 유도능 조사

실시예 1-(3)에서와 동일한 방식으로 플라스미드 벡터 pMM037을 사용하여 Fdase 2 발현 플라스미드를 제조한다. 따라서, 실시예 1-(3)에서 수득된 플라스미드 pSFDA7을 SnaBI로 분해하여 Fdase 2의 4번째 아미노산부터 C-말단 아미노산까지의 영역을 암호화하는 영역을 함유하는 약 2.5 kb의 SnaBI 단편을 분리한다. DNA 단편을 클레나우 단편에 의해 평활 말단화된 (1)에서 작제한 플라스미드 벡터 pMM037 상의 BamHI 부위 중으로 삽입시켜 Fdase 2의 4번째 아미노산 잔기 및 그 뒷부분이 pMM037 상의 CspA의 N-말단 서열과 동일한 판독 프레임에 연결된 융합 폴리펩타이드 발현벡터의 작제를 시도한다. 플라스미드를 생성되는 6개의 형질전환체로부터 추출하여 정제하고 분석한 결과 약 2.5 kb의 SnaBI 단편이 이 중 둘 중으로 정확한 방향으로 삽입된 것으로 밝혀졌다. 이들 중 하나의 염기서열이 분석되었을 때, CspA 및 Fdase 2의 개방 판독 프레임이 목적하는 바와 동일한 융합 폴리펩타이드 발현벡터인 것으로 확인되었다. 이와 같이 제조된 플라스미드를 플라스미드 pMFDA102로 명명한다.

이.콜라이 JM109를 pMFDA102 또는 pMM037로 형질전환시킨다. 이 때, 플레이트 상에 형성된 두 형질전환체 간의 콜로니 크기에는 차이가 없었다. 생성되는 형질전환체 각각을 앰피실린 100 ㎍/ml를 함유하는 LB 배지에 접종하여 37℃에서 호기 배양한다. 배양액 각각의 두 튜브를 새로 제조한 동일 배지 5 ml에 각각 1%의 양으로 플랜팅하고, 37℃에서 호기 배양한 다음 IPTF를 가하여 탁도가 OD600 = 0.6에 도달하였을 때 최종 농도 1 mM가 되게 하고, 이들 중 하나의 배양 온도를 각각 15℃로 만든 후, 4 시간 더 배양한다. 배양하는 동안, 유도 전 두 형질전환체의 성장속도는 거의 동일하였다. 배양 완료 후, 배양액을 원심분리하여 세포를 수집하고 세포를 세포 용해용 완충제[20 mM 트리스 하이드로클로라이드 완충제(pH 7.5), 10 mM CaCl₂, 10 mM KCl 및 0.3 M NaCl] 1 ml에 현탁시키고 초음파 처리에 의해 붕괴시킨다. 이들을 원심분리하여 상등액을 수집하여 이.콜라이 추출물을 수득한다. 이. 콜라이 추출물을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석하며, 약 90,000의 분자량을 갖는 CspA-Fdase 2의 융합 폴리펩타이드로 생각되는 밴드가 15℃에서 배양한 pMFDA102에 의한 형질전환체에서만 관찰되었다. 상기 결과로부터, 발현 산물이 세포 성장에 막대한 영향을 미친 Fdase 2와 같은 유전자에 대해서도 발현 플라스미드를 작제할 수 있는 저온 유도성 발현벡터가 작제된 것으로 나타났다.

엔도-설페이트화-퓨코스-함유 폴리사카라이드에 대한 상기 이.콜라이 추출물의 분해 활성을, 기질로서 WO97/26896에 기재된 방법에 의해 제조된 설페이트화-퓨코스-함유 폴리사카라이드-F를 사용하여 하기 작업에 의해 측정한다.

이어서, 2.5% 설페이트화-퓨코스-함유 폴리사카라이드-F 용액 12 ㎕, 1 M CaCl₂ 용액 6 ㎕, 4 M NaCl 용액 9 ㎕, 아세트산, 이미다졸 및 트리스 하이드로클로라이드 50 mM를 함유하는 완충제 60 ㎕(pH 7.5), 물 21 ㎕ 및 세포 용해용 완충제로 적당히 희석한 이.콜라이 추출물 12 ㎕를 혼합하고 혼합물을 30℃에서 3 시간 동안 반응시킨다. 반응 용액을 100℃에서 10분간 처리하고 원심분리한 다음 생성되는 상등액 100 ㎕를 겔 여과 칼럼을 이용하여 HPLC에 의해 분석하여 설페이트화-퓨코스-함유 폴리사카라이드-F 기질의 평균 분자량을 반응 산물의 것과 비교한다. 대조군으로서, 이.콜라이 추출물을 함유하지 않는 세포 용해 완충제를 동일 조건하에서 반응시켜 수득한 산물 및 설페이트화-퓨코스-함유 폴리사카라이드-F 용액 대신 물의 사용에 의한 반응 산물을 제조하고 이들 각각을 HPLC에 의해 유사하게 분석한다.

설페이트화-퓨코스-함유 폴리사카라이드-F 1 μmol 중의 퓨코실 결합을 1분 에 절단할 수 있는 효소의 양을 1 U로 정한다. 절단된 퓨코실 결합을 하기 공식에 따라 계산한다:

활성 (U/ml) = {(12 x 2.5)/(100 x MF)} x {(MF/M)-1} x {1/(180 x 0.01)} x 1000

(12 x 2.5)/100 x MF: 반응 시스템에 첨가된 설페이트화-퓨코스-함유 폴리

사카라이드-F(mg);

MF : 기질(설페이트화-퓨코스-함유 폴리사카라이드-F)의 평

균 분자량;

M : 반응 산물의 평균 분자량;

(MF/M)-1 : 설페이트화-퓨코스-함유 폴리사카라이드-F 1 분자 중

의 효소 절단수;

180 : 반응 시간(분); 및

0.01 : 효소 용액의 용적(ml).

HPLC를 하기 조건하에서 수행한다:

장치 : 모델 L-6200(Hitachi, Ltd. 제조);

칼럼 : OHpak SB-806 (8 mm x 300 mm, Showa Denko K.K. 제

조);

용출제 : NaN₃ 5 mM, CaCl₂ 25 mM 및 NaCl 50 mM을 함유하는 이

미다졸 완충제 25 mM(pH 8);

검출 : 시차 굴절 검출기(Shodex RI-71, Showa Denko K.K.

제조);

유속 : 1 ml/분;

칼럼 온도 : 25℃.

반응 산물의 평균 분자량을 측정하기 위하여, 기지의 분자량을 갖는 시판 풀루란(STANDARD P-82, Showa Denko K.K. 제조)을 전술한 바와 동일한 조건하에서 HPLC에 의해 분석한다. 이어서, 풀루란의 분자량과 OHpak SB-806 상의 체류시간 간의 관계를 보여주는 곡선을 만들고 전술한 효소 반응 산물의 분자량 측정을 위한 표준곡선으로 사용한다. 결과는 15℃에서 배양한 pMFDA102에 의한 형질전환체의 추출물에서만 설페이트화-퓨코스-함유 폴리사카라이드에 대한 명백한 엔도형 분해활성이 검출되었고 설페이트화-퓨코스-함유 폴리사카라이드에 대한 엔도형 분해활성은 42.6 mU/ml였다. 이러한 결과로부터 pMM037이 저온 조건하에서 활성형의 목적 단백질을 발현할 수 있음이 보여진다.

실시예 3. 저온 유도성 플라스미드 벡터 pMM037의 변형 및 유도능의 조사

(1)플라스미드 벡터 pMM036의 작제

XbaI 부위가 SD 서열의 상류에 도입된 cspA 유전자를 함유하는 플라스미드 pJJG21[Mol. Biol., volume 23, pages 355-364 (1997)]를 주형으로 및 프라이머 CSA+20FN 및 CSA13R2를 사용하여 PCR을 수행하고 생성되는 증폭된 DNA 단편을 XbaI 및 EcoRI(Takara Shuzo 제조)로 분해하여 SD 서열에서 cspA 유전자의 13번째 아미노산까지를 암호화하는 영역을 함유하는 DNA 단편을 수득한다. DNA 단편을 실시예 2-(1)에서 수득한 플라스미드 벡터 pMM037의 NheI와 EcoRI 사이의 영역 중으로 삽 입하여 플라스미드 벡터 pMM036을 작제한다. 이 pMM036은 서열목록의 서열번호 2에 나타낸 플라스미드 pMM037 상의 5′-UTR을 암호화하는 염기서열로부터 염기번호 33-161의 서열이 결실된 것을 제외하고는 플라스미드 pMM037과 동일한 구조를 갖는다.

(2)플라스미드 벡터 pMM038의 작제

pMM037에서, CspA의 N-말단 영역의 암호화 영역(38 염기) 하류에 다중 클로닝 부위가 존재하고 목적하는 유전자는 CspA의 N-말단 12 아미노산 잔기와의 융합된 폴리펩타이드로서 발현될 수 있다. 융합 폴리펩타이드의 발현에서 CspA의 N-말단 아미노산 잔기의 길이를 조사하기 위하여, CspA의 전체 암호화 영역(70 아미노산 잔기) 뒤에 다중 클로닝 부위가 배치되며, 목적 유전자가 CspA의 70 아미노산 잔기와의 융합된 폴리펩타이드 형태로 발현될 수 있는 플라스미드 벡터 pMM038이 작제된다. 따라서, 상기 플라스미드 pJJG02를 주형으로 및 프라이머 CSA+20FN과 CSA70R(프라이머 CSA70R의 염기서열은 서열목록의 서열번호 13에 나타내었다)을 사용하여 PCR을 수행하여 cspA 유전자의 전사 개시점 하류에서 19번째 염기부터 플라스미드 상의 CspA 상의 70번째 아미노산 잔기까지를 암호화하는 영역을 함유하는 DNA 단편을 수득한다. DNA 단편을 각각의 프라이머 상에 배치된 NheI 및 EcoRI 부위에서 분해시킨 다음 실시예 2-(1)에서 수득한 pMM037의 NheI와 EcoRI 사이의 영역 중으로 삽입시켜 플라스미드 벡터 pMM038을 작제한다. 이러한 pMM038은 pMM037 상 CspA의 N-말단에서부터 13번째 아미노산 잔기까지를 암호화하는 영역이 CspA의 전체 아미노산 서열(70 아미노산 잔기)을 암호화한 것으로 치환된 플라스미드 벡터이다.

(3)플라스미드 벡터 pMM047의 작제

플라스미드 벡터 pMM037 상의 5′-UTR을 암호화하는 영역 중으로 6-염기 돌연변이를 도입하기 위하여, 프라이머 CSA+27NF1(프라이머 CSA+27NF1의 염기서열을 서열번호 14에 나타내었다)를 합성한 다음 pMM047을 pMM037의 작제에서와 동일한 방식으로 작제한다. 따라서, PCR은 실시예 1-(1)에서 수득한 플라스미드 벡터 pMM031F1을 주형으로 및 프라이머 CSA+27NF1과 M13 프라이머 M4를 사용하여 증폭된 DNA 단편을 수득한다. 생성되는 DNA 단편을 CSA+27NF1 상에 배치된 NheI 부위 및 또한 다중 클로닝 부위 상의 XbaI 부위에서 분해시킨 다음 실시예 2-(1)에서 수득한 pMM035의 NheI과 XbaI 사이의 영역 중으로 각각의 부위가 재생되는 방향으로 삽입시켜 플라스미드 벡터 pMM047을 작제한다. 이 pMM047에서, pMM037 상의 5′-UTR을 암호화하는 영역내 lac 오퍼레이터에서 유도된 부분의 하류에서, 염기-치환 돌연변이를 6곳의 장소에 도입시킨다. 플라스미드 벡터 pMM047 상에 암호화된 5′-UTR의 염기서열 또는 전사 개시점에서 CspA 개시 코돈 바로 앞의 염기까지의 염기서열을 서열목록의 서열번호 3에 나타내었다.

(4)플라스미드 벡터 pMM048의 작제

플라스미드 벡터 pMM047의 5′-UTR을 암호화하는 서열 상의 30 염기의 결실에 의해 돌연변이된 플라스미드 벡터 pMM048을 작제한다. 따라서, pMM047 상에 존재하는 천연 cspA 유전자의 전사 개시점 하류의 +56 내지 +85의 영역에 상응하는 부분을 결실하도록 프라이머 D3F 및 D3R(프라이머 D3F 및 D3R의 염기서열을 각각 서열목록의 서열번호 15와 16에 나타내었다)을 디자인하고 합성한다. 플라스미드 pJJG02를 주형으로 및 프라이머 D3R과 CSA+27NF1의 조합 및 프라이머 D3F와 CSA13R2의 조합 각각을 이용하여 PCR을 수행한다. 반응 용액을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여 프라이머로부터 분리된 증폭 DNA 단편을 겔로부터 추출하고 정제한다. 생성되는 증폭 DNA 단편을 PCR 완충제에서 혼합하고 열변성시킨 다음 점진적으로 냉각시켜 헤테로 이본쇄를 형성시킨다. Taq DNA 폴리머라제(Takara Shuzo 제조)를 이 혼합 용액에 가하고, 혼합물을 72℃에서 유지시켜 이본쇄의 합성을 완료한 다음 프라이머 CSA+27NF1과 CSA13R2를 가한 후 2차 PCR을 수행한다. 생성되는 증폭된 DNA 단편을 각각의 프라이머 상에 배치된 NheI 및 EcoRI 부위에서 분해한 다음 실시예 2-(1)에서 수득한 플라스미드 벡터 pMM037의 NheI와 EcoRI 사이의 영역 중으로 삽입시켜 플라스미드 벡터 pMM048을 작제한다. 이 pMM048은 pMM047 상의 5′-UTR을 암호화하는 영역에, 천연 cspA 유전자로부터 유도된 5′-UTR내 전사 개시점에서 계수하여 +56 내지 +85의 영역에 상응하는 부분이 결실된 플라스미드이다. 플라스미드 벡터 pMM048 상에 암호화된 5′-UTR의 염기서열 또는 전사 개시점에서 CspA 개시 코돈 바로 앞까지의 염기서열을 서열목록의 서열번호 4에 나타내었다.

(5)β-갈락토시다제 유전자를 사용하는 변형된 저온 유도성 벡터의 유도능 조사

β-갈락토시다제(lac Z) 유전자를 함유하는 플라스미드 pKM005("Experimental Manipulation of Gene Expression", pages 15-32, edited by M. Inoue, published by Academic Press, New York, 1983]를 BamHI 및 SalI(둘 모두 Takara Shuzo 제조)로 분해한 다음 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고 lac Z 유전자를 함유하는 약 6.2 kb의 DNA 단편을 절단, 추출 및 정제한다. 생성되 는 DNA 단편을 전술한 플라스미드 벡터 pMM036, pMM038, pMM047과 pMM048 및 실시예 2-(1)에서 수득한 플라스미드 벡터 pMM037 각각의 BamHI과 SalI 사이의 영역 중으로 삽입시킨 다음 생성되는 플라스미드를 각각 플라스미드 pMM036lac, pMM038lac, pMM047lac, pMM048lac 및 pMM037lac로 명명한다. pMM038lac를 제외하고는, 생성된 플라스미드 모두 N-말단 12 아미노산 잔기 및 다중 클로닝 부위로부터 유도된 10 아미노산 잔기가 β-갈락토시다제의 10번째 아미노산 잔기에서 연결되어 있는 융합된 β-갈락토시다제를 암호화한다. 또한, CspA의 전장에 상응하는 70 아미노산 잔기 및 다중 클로닝 부위로부터 유도된 9 아미노산 잔기가 β-갈락토시다제의 10번째 아미노산 잔기에서 연결되는 융합된 β-갈락토시다제를 암호화한다.

한편, 실시예 1-(1)에서 수득한 pMM031F1을 사용하는 융합된 β-갈락토시다제 발현벡터의 작제가 동일한 방식으로 시도되었지만, 생성되는 형질전환체의 콜로니는 매우 작았으며, 37℃에서 발현된 유전자 산물의 영향이 클 것으로 생각되었으므로 추가의 조사는 실행되지 않았다. 한편, 다른 프로모터를 갖는 발현 플라스미드로서, lac 프로모터-오퍼레이터를 함유하는 플라스미드 벡터 pTV118N(Takara Shuzo 제조)가, lac Z 유전자를 함유하는 약 6.2 kb의 DNA 단편이 BamHI과 SalI 사이의 영역 중으로 삽입된 플라스미드 pTV118Nlac의 작제에 유사하게 사용되어 유도능을 비교한다.

이.콜라이 JM109를 상기 플라스미드 각각을 사용하여 형질전환시키고 생성되는 형질전환체 각각을 앰피실린 100 ㎍/ml를 함유하는 LB 배지에 접종한 다음 37℃에서 하룻밤 호기 배양한다. 각각의 배양액을 새로 제조한 동일 배지 5 ml 상에 1% 의 양으로 플랜팅하고 37℃에서 호기 배양하며, 이의 일부를 탁도가 OD600 = 0.6-0.8에 도달할 때 샘플링한 다음, IPTG를 가하여 이의 최종 농도 1 mM로 만들고 15℃에서 추가 배양한다. 유도 직전 및 유도 3 시간 및 10 시간 후 37에서 배양한 배양액 각각으로부터 샘플링한 분취량을 문헌[참조:"Experiments in Molecular Genetics", pages 352-355, by J. H. Miller, published by Cold Spring Harbor Laboratory, 1972]에 기재된 방법에 의해 β-갈락토시다제 활성 측정을 위한 샘플로서 사용한다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 임의 플라스미드를 함유하는 모든 형질전환체는 유도 전 단계에서 대조군으로 사용된 pTV118Nlac와 동일하거나 심지어는 더 낮은 β-갈락토시다제 활성을 발현하였으며 따라서 각 플라스미드의 cspA 프로모터의 작용이 정확하게 조절되는 것으로 나타났다. 유도 후, 플라스미드 pMM036lac를 제외한 플라스미드를 함유하는 모든 형질전환체에서, pTV118Nlac를 함유하는 것들에 비해 10배 이상의 β-갈락토시다제 활성이 발현되었다.

플라스미드β-갈락토시다제 활성(단위) 유도 전 유도 3 시간 후 유도 10 시간 후

pMM037lac 186 7707 13193 pMM036lac 242 1201 3437 pMM038lac 311 17257 26203 pMM047lac 99 9263 10421 pMM048lac 472 10018 23133 pTV118Nlac 262 404 1218

(6)37℃에서 단백질 발현능의 평가

실시예 3-(5)에서 제조한 형질전환체에서, 플라스미드 pMM037lac에 의해 형질전환된 것을 제외한 것들을 사용하고 37℃에서의 단백질 발현능을 평가한다. 배지로서 M9 배지(1 mM MgSO₄, 1 mM CaCl₂, 0.2% 글루코스, 0.2% 카사미노산, 0.05 mg/ml 트립토판, 2 ㎍/ml 티아민 및 100 ㎍/ml 앰피실린 함유)가 사용되고, 심지어 IPTG 첨가 후에도, 배양 온도가 37℃에서 유지되는 것을 제외하고는 실시예 3-(5)에서와 동일한 작업으로 실험을 수행한다. β-갈락토시다제 활성을 유도 직전 및 유도 2 시간 후의 두 단계에서 측정한다. 결과를 표 2에 나타내었다.

5′-UTR의 대부분이 결실된 플라스미드 pMM036lac에 의해 형질전환된 이.콜라이의 유도 2 시간 후 β-갈락토시다제 활성은 실시예 3-(5)에서의 결과와는 달리 pMM038lac 및 pMM047lac를 함유하는 것들보다 높았다. 유도 후 발현된 활성면에서 볼 때 pMM048lac와 pTV118Nlac 간에는 차이가 없었다. 이러한 사실은 pMM048이 저온조건에서 뿐만 아니라 37℃에서도 단백질 발현에 유효함을 보여준다.

플라스미드β-갈락토시다제 활성(단위) 유도 전 유도 2 시간 후

pMM036lac 1515 24027 pMM038lac 2695 9947 pMM047lac 894 2637 pMM048lac 4527 48547 pTV118Nlac 5572 48051

(7)10℃ 및 20℃에서의 단백질 발현능 평가

플라스미드 pMM036lac를 갖는 형질전환체를 제외한 실시예 3-(5)에서 제조한 형질전환체를 사용하여, 단백질 발현을 위한 각 형질전환체의 능력을 10℃ 및 20℃에서 평가한다. IPTG 첨가 후 배양 온도를 10℃ 또는 20℃에서 유지시키는 것을 제외하고는 실시예 3-(5)에서와 동일한 작업으로 실험을 수행한다. β-갈락토시다제 활성을 10℃의 경우, 유도 후 3 시간, 7 시간 및 21 시간의 3 단계에서 측정하며, 20℃의 경우, 유도 후 1 시간, 3 시간 및 7 시간 후의 3 단계에서 측정한다. 10℃에서 수행한 결과는 표 3에 나타내었고 20℃에서의 것은 표 4에 나타내었다.

표 3에 나타난 바와 같이, 심지어 10℃ 정도의 저온 조건에서도, pTV118Nlac를 함유하는 경우보다 훨씬 높은 β-갈락토시다제 활성의 유도된 발현이 플라스미드를 함유하는 모든 형질전환체에서 관찰되어, 저온 조건하에서 이들 벡터의 높은 발현능이 확인되었다. 이들 가운데, pMM038lac는 다른 작제물보다 높은 발현량을 보이며 본 발명의 벡터 중으로 도입될 목적 유전자가 CspA의 전체 암호화 영역과의 융합 단백질로서 발현될 때 특별한 효율을 보인다. 한편, 30 염기의 결실이 5′-UTR 중으로 도입된 pMM048lac는 돌연변이가 없는 pMM047lac에 비하여 동일하거나 약간 더 높은 발현량을 보이는데, 이는 10℃ 같은 온도 조건에서 단백질 발현에 유효함을 시사한다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 20℃의 온도 조건하의 pMM047lac의 경우에서, 다른 플라스미드를 함유하는 형질전환체 보다 낮은 β-갈락토시다제 활성의 유도 발현이 관찰되었다.

실시예 3-(5) 및 실시예 3-(6)에 나타낸 바와 같은 이러한 실험 결과 및 15 ℃ 및 37℃에서의 β-갈락토시다제 활성의 유도량으로부터, pMM047이 15℃ 정도의 낮은 온도에 주로 특이성을 보이는 발현 패턴을 갖는 벡터이고 30 염기의 결실 돌연변이가 pMM047의 5′-UTR 중으로 도입된 pMM048이 저온에서 통상의 온도(37℃)에 걸쳐 광범위한 온도 범위내에서 목적 단백질을 효과적으로 발현할 수 있는 벡터임을 보여준다.

10℃에서

플라스미드β-갈락토시다제 활성(단위) 유도 3 시간 후 유도 7 시간 후 유도 21 시간 후

pMM037lac 6290 10279 12066 pMM038lac 9892 28399 33209 pMM047lac 9168 12927 12098 pMM048lac 8799 13021 18547 pTV118Nlac 905 981 836

20℃에서

플라스미드β-갈락토시다제 활성(단위) 유도 1 시간 후 유도 3 시간 후 유도 7 시간 후

pMM037lac 7737 13351 27117 pMM038lac 22840 27043 34171 pMM047lac 6881 9946 12272 pMM048lac 13423 27135 58333 pTV118Nlac 8914 22349 21238

실시예 4. pCold01 및 pCold02 시리즈의 작제 및 이들의 유도능 조사

(1)pCold01 시리즈 플라스미드의 작제

cspA 유전자를 함유하는 pJJG02를 주형으로 및 합성 DNA 프라이머 CSA-tert-FHX 및 CSA-tert-R(CSA-tert-FHX 및 CSA-tert-R의 염기서열을 각각 서열목록의 서 열번호 17과 18에 나타내었다)를 사용하여 PCR을 수행하여 cspA 유전자의 전사 터미네이터 영역을 함유하는 DNA 단편을 수득한다. DNA 단편을 각각의 프라이머 상에 배치된 HindIII 및 EcoO109I 부위에서 분해시킨 다음 실시예 3-(2)에서 수득한 pMM038의 다중 클로닝 부위의 말단에 위치한 HindIII와 이의 하류에 위치한 EcoO109I 부위 사이의 영역 중으로 삽입시켜 pMM039가 작제된다. 그 후에, 합성 올리고뉴클레오타이드 KS-링커 1과 KS-링커 2(KS-링커 1과 KS-링커 2의 염기서열은 각각 서열목록의 서열번호 19와 20에 나타내었다)의 어닐링에 의해 제조된 합성 DNA 링커를 pMM039의 다중 클로닝 부위 내 KpnI과 SalI 사이의 영역에 삽입시켜 pMM040을 작제한다.

한편, 해독 개시 코돈에 NcoI 부위를 도입하기 위하여, 프라이머 CSA1NC-F 및 CSA1NC-R(CSA1NC-F 및 CSA1NC-R의 염기서열을 각각 서열목록의 서열번호 21과 22에 나타내었다)을 합성한다. 1차 PCR은 플라스미드 pJJG02를 주형으로 사용하여 프라이머 CSA1NC-F와 CSA70R의 조합에 대해 및 또한 플라스미드 pMM047을 주형으로 사용하여 프라이머 CSA1NC-R과 CSA+17NF1의 조합에 대해서도 수행된다. 반응 용액을 3% 아가로스 겔 전기영동하고 겔로부터 분리된 증폭된 DNA 단편을 겔로부터 추출하고 정제한다. 증폭 DNA 단편을 PCR 완충제에서 혼합하고 열변성시킨 다음 점진적으로 냉각시켜 헤테로 이본쇄를 형성시킨다. Taq DNA 폴리머라제(Takara Shuzo 제조)를 이 혼합 용액에 가하고, 혼합물을 72℃에서 유지시켜 이본쇄의 합성을 완료한 다음 프라이머 CSA+27NF1과 CSA13R의 조합을 이용하여 2차 PCR을 수행한다. 생성되는 증폭된 DNA 단편을 pT7Blue T-벡터(Novagen 제조)에 아클로닝하여 염기서 열을 확인하고 각각의 프라이머 상에 배치된 NheI 및 EcoRI 부위에서 절단한 다음 유리된 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pMM040의 NheI와 EcoRI 사이의 영역 중으로 삽입시켜 플라스미드 벡터 pCold01NC1을 작제한다.

이어서, 2차 PCR을 프라이머 CSA13R2 또는 CSA13R3(프라이머 CSA13R3의 염기서열을 서열목록의 서열번호 23에 나타내었다)를 프라이머 CSA13R 대신 사용하여 유사하게 실행하여 pCold01NC1 중으로 삽입된 CspA의 N-말단부를 암호화하는 영역의 3′-말단부로부터 하나의 염기가 결실된 플라스미드 벡터 pCold01NC2 또는 하나의 염기가 말단에 첨가된 플라스미드 벡터 pCold01NC3를 각각 작제한다.

이들 3 종류의 플라스미드는 각 플라스미드 상 cspA 유전자의 개시 코돈에 NcoI 부위를 가지며, 이로부터 개시되는 개방 판독 프레임이 다중 클로닝 부위에서 각각 상이한 벡터 시리즈이다. 또한, 이들 플라스미드는 다중 클로닝 부위의 하류에 3개의 개방 판독 프레임 각각에 종결 코돈이 출현하는 서열을 가지며 추가의 하류에 cspA 유전자로부터 유도된 전사 터미네이터 영역을 함유한다. 첨언하면, pCold01NC2에서, 플라스미드 상에 암호화된 CspA의 N-말단에서 13번째 아미노산 잔기가 이러한 1 염기 결실에 의해 아스파라긴에서 라이신으로 바뀌었다.

따라서, 1차 PCR을 프라이머 CSA1ND-F 및 CSA1ND-R(프라이머 CSA1ND-F 및 CSA1ND-R의 염기서열을 서열목록의 서열번호 24와 25에 나타내었다)를 각각 CSA1NC-F 및 CSA1NC-R 대신 사용하여 수행하는 동일한 방법에 의해 각 pCold01NC 시리즈 플라스미드의 해독 개시 코돈에서의 NcoI 부위가 NdeI 부위로 치환된 pCold01ND 시리즈 플라스미드, pCold01 ND1, ND2 및 ND3를 작제한다.

이렇게 작제된 6종의 pCold01 시리즈 플라스미드는 pMM047이 기본 골격인 발현 시스템을 갖고, 개시 코돈에 배치된 제한 효소 부위 및 다중 클로닝 부위 뒤의 서열을 제외하고는 pMM047과 동일한 서열을 갖는다.

(2)벡터의 pCold02 시리즈의 작제

6종의 pCold02 시리즈 플라스미드를 실시예 4-(1)에서와 동일한 방법으로 작제한다. 따라서, 프라이머 CSA1NC-R과 CSA+27NF1의 조합 또는 프라이머 CSA1ND-R과 CSA+27NF1의 조합을 사용하는 1차 PCR에서, 플라스미드 pMM048이 플라스미드 pMM047 대신 주형으로 사용되어, pCold02 시리즈 플라스미드 pCold02 NC1, NC2, NC3, ND1, ND2 및 ND3가 실시예 4-(1)에서와 완전 동일한 단계로 작제된다.

이와 같이 작제된 6종의 pCold02 시리즈 플라스미드는 pMM048이 기본 골격인 발현 시스템을 가지고 개시 코돈에 배치된 제한 효소 부위 및 다중 클로닝 부위 뒤의 서열을 제외하고는 pMM048과 동일한 서열을 갖는다. 또한, 이들 각각은 pMM048에 특징적인 천연 cspA 유전자로부터 유도된 5′-UTR내 전사 개시점으로부터 +56 내지 +85의 영역에 상응하는 부분의 결실을 제외하고는 pCold01 시리즈의 상응하는 플라스미드와 동일하였다.

(3)β-갈락토시다제 유전자를 사용하는 pCold01 및 pCold02의 유도능 조사

pCold01 및 pCold02의 유도능을 실시예 3-(5)에서와 동일한 방법에 의해 β-갈락토시다제를 사용하여 조사한다. 우선, lac Z 유전자를 함유하는 약 6.2 kb의 DNA 단편을 pCold01NC2, pCold01ND2, pCold02NC2 및 pCold02ND2의 BamHI과 SalI 사이의 영역에 삽입시키고, 생성되는 플라스미드를 각각 플라스미드 pCold01NC2lac, pCold01ND2lac, pCold02NC2lac, 및 pCold02ND2lac로 명명한다. 이들 플라스미드 전부는 CspA의 N-말단의 12 아미노산 및 다중 클로닝 부위로부터 유도된 10 아미노산 잔기가 β-갈락토시다제의 10번째 아미노산 잔기에서 연결되는 융합된 β-갈락토시다제를 암호화한다.

이.콜라이 JM109를 각각의 상기 플라스미드로 형질전환시키고 생성되는 형질전환체를 실시예 3-(5)에서와 동일한 작업에 의해 15℃에서 발현 유도 실험에 투입한다. β-갈락토시다제 활성을 3 단계에서, 즉 유도 직전, 유도 3 시간 후 및 유도 10 시간 후에 측정한다. pCold01NC2lac 및 pCold02NC2lac에 대한 결과를 표 5에 나타내었다. 첨언하면, ND 시리즈 벡터가 사용될 경우, 상응하는 NC 시리즈 벡터의 사용시와 거의 동일한 유도능이 나타났다.

표 5에서 보여지는 바와 같이, 각각의 플라스미드를 함유하는 형질전환체는 37℃에서 유도 전에는 낮은 β-갈락토시다제 활성을 나타낼 뿐이며, 각각의 플라스미드의 cspA 프로모터의 작용이 정확히 조절됨을 보여준다. 유도 후, 실시예 3-(5)에서 보여준 바와 같이 pMM047lac 및 pMM048lac의 경우에서와 거의 동일한 β-갈락토시다제 활성 증가가 각각 관찰되었다. 따라서, pCold 플라스미드는 유도된 유전자의 발현을 위해 디자인된 전사 터미네이터 및 다중 클로닝 부위를 갖고 또한 37℃에서의 발현을 조절할 수 있어, 유도된 유전자 산물이 저온 조건하에서 고효율로 발현될 수 있는 플라스미드 시리즈이다.

pCold01NC2lac 95 6819 9173 pCold02NC2lac 256 7025 13529

실시예 5. lac I 유전자가 도입된 pCold 시리즈 플라스미드의 작제, 및 숙주에 대한 조사

(1)pCold03 시리즈 및 pCold04 시리즈 플라스미드의 작제

실시예 4-(1) 및 실시예 4-(2)에서 제조한 pCold01 시리즈 및 pCold02 시리즈 플라스미드는 이들의 플라스미드 벡터에 리프레서 유전자를 갖고 있지 않으며, 따라서 숙주로서 lac 리프레서를 고도로 발현할 수 있는 이.콜라이 균주를 사용하는 것이 필요하다. 이와 같은 관점에서, lac I 유전자가 pCold01 및 02에 도입된 플라스미드 벡터 pCold03 및 04 및 또한 lac I^q 유전자가 pCold01 및 02에 도입된 플라스미드 벡터 pCold05 및 06을 각각 작제한다.

우선, 실시예 4-(1)에서 수득한 pMM040을 EcoT22I로 분해하고 말단을 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 평활화한다. pET21b(Novagen 제조)를 SphI 및 PshAI(둘 모두 Takara Shuzo 제조)로 분해한 다음 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 평활말단으로 만들어 수득한 lac I 유전자를 함유하는 DNA 단편을 삽입하여 lac I 유전자의 방향이 cspA 프로모터의 역방향으로 삽입된 플라스미드를 작제하고 이를 pMM40I로 명명한다. 이와 유사하게, 플라스미드 pMJR1560[참조문헌:Gene, volume 51, pages 225-267 (1987)]를 KpnI과 PstI(둘 모두 Takara Shuzo 제조)로 분해한 다음 평활말단으 로 만들어 수득한 lac I^q유전자를 함유하는 DNA 단편을 pMM040의 평활말단 EcoT22I 부위에 도입시킨다. lac I^q 유전자가 cspA 프로모터의 방향으로부터 반대 방향으로 삽입된 플라스미드를 선별하여 pMM040I^q로 명명한다.

실시예 4-(1) 및 실시예 4-(2)에 기재된 pCold01 및 02의 작제를 위한 동일한 방법을 사용하여, 각 시리즈 벡터에 대한 NheI-EcoRI 단편을 pMM040I 및 pMM040I^q 사이의 영역에 삽입하여 시리즈 pCold03, pCold04, pCold05 및 pCold06의 6종의 플라스미드 벡터를 작제한다. 이와 같이 작제된 pCold03 및 pCold04 시리즈 플라스미드는 lac I 유전자의 존재를 제외하고는, 각각 pCold01 시리즈 및 pCold02 시리즈와 동일한 구조를 갖는다. 첨언하면, pCold05 및 pCold06 시리즈 플라스미드는 각각 pCold03 및 pCold04 시리즈 플라스미드내 lac I 유전자가 lac I^q유전자로 치환된 것들이다.

(2)β-갈락토시다제 유전자를 사용한 lac 리프레서의 영향 조사

실시예 3-(5)에서와 동일하게, 플라스미드 pKM005를 BamHI 및 SalI으로 분해하고, lac Z 유전자를 함유하는 DNA 단편을 추출하고 정제한다. 생성되는 DNA 단편을 전술한 각 시리즈의 플라스미드 벡터 pCold03, 04, 05 및 06 가운데 고정된 프레임을 갖는 NC2의 BamHI과 SalI 사이의 영역에 삽입시키고 생성되는 플라스미드를 각각 pCold03NC2lac, pCold04NC2lac, pCold05NC2lac, 및 pCold06NC2lac로 명명한다.

lac 리프레서가 없는 이.콜라이 DH5 α 균주(Takara Shuzo 제조)의 형질전환을 6종의 플라스미드, 즉 실시예 4-(3)에서 작제한 pCold01NC2lac 및 pCold02NC2lac 및 전술한 pCold03NC2lac, pCold04NC2lac, pCold05NC2lac, 및 pCold06NC2lac를 사용하여 시도한다. 동시에, 형질전환을 대조군으로서 lac Z 유전자를 함유하지 않는 플라스미드 벡터 pCold01NC2에 대해서 시도한다. 이.콜라이 DH5 α 균주를 통상적인 수단에 따라 컴피턴트 세포법에 의해 형질전환시켜, pCold02NC2lac를 제외한 플라스미드 모든 경우에서, 형질전환체가 대조군에서와 동일한 형질전환 효율로 수득된 반면에 pCold02NC2lac의 경우에는 형질전환체가 전혀 수득되지 않았다. 또한, pCold01NC2lac의 경우에, 생성되는 형질전환체의 콜로니는 다른 형질전환체의 것들보다 작았다.

그 후, 목적 단백질에 대한 각 플라스미드의 발현 조절능 및 저온에서의 목적 단백질에 대한 발현능을 조사한다. 따라서, 각각의 생성되는 형질전환체를 앰피실린 100 ㎍/ml를 함유하는 lB 배지에 접종하고 37℃에서 하룻밤 호기 배양한다. 배양액을 새로 제조한 동일 배지 5 ml에 2%의 양으로 플랜팅하고 37℃에서 호기 배양한다. 배양액의 탁도가 OD600 = 약 0.6에 도달할 때 이의 일부를 샘플링한 다음, IPTG를 가하여 이의 최종 농도 1 mM로 만들고 15℃의 배양 온도에서 배양한다. 유도 직전 37에서 배양한 배양액 및 유도 3 시간, 7 시간 및 24 시간 후의 것들로부터 샘플링한 배양액을 샘플로 사용하고 실시예 3-(5)에서와 동일한 방법으로 β-갈락토시다제 활성 측정을 한다.

표 6에 나타낸 바와 같이, lac I 유전자를 함유하지 않는 pCold01NC2lac를 갖는 형질전환체는 37℃에서 비유도 상태 하에서도 높은 β-갈락토시다제 활성을 보이는 반면에, lac I 유전자 또는 lac I^q 유전자를 함유하는 다른 플라스미드에 의한 형질전환체에서는, 낮은 β-갈락토시다제 활성을 보인다. 이는 플라스미드에 lac I 또는 lac I^q유전자를 갖는 pCold03 내지 pCold06 시리즈의 플라스미드가 37℃에서의 배양 조건하에 효과적인 방식으로 발현 억제를 실행하였음을 보여준다. 이는 또한, 37℃에서, 발현 조절이 cspA 유전자의 5′-UTR을 암호화하는 영역의 기능에 의해서만은 불완전하고, 이들 플라스미드 상에 배치된 오퍼레이터 서열이 정상적으로 기능할 때만, 실질적인 발현 조절이 성취됨을 보여준다. 또한, lac I^q유전자를 갖는 pCold05NClac 및 pCold06NC2lac의 형질전환체의 β-갈락토시다제 활성이 lac I 유전자를 갖는 pCold03NC2lac 및 pCold04NC2lac의 형질전환체 보다 낮아서, lac I^q 유전자가 발현을 더욱 효과적으로 조절할 수 있음이 자명해진다.

한편, 유도체의 첨가 및 저온으로의 온도 변위에 의한 발현 유도 후, 시간 경과에 따른 β-갈락토시다제 활성의 증가는 lac I 유전자 또는 lac I^q 유전자를 함유하는 플라스미드에 의한 형질전환체의 경우에 관찰된다. 이러한 유도성 수준은 표 5에서 보여주는 바와 같이 pCold01NC2lac 또는 pCold02NC2lac와 lac 리프레서를 고도로 발현하는 이.콜라이 균주의 형질전환체의 유도 패턴과 잘 일치하며 이러한 사실은 lac I 유전자가 벡터 상에 배치될 때에도 목적 단백질의 발현 유도능에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 이는 lac 오퍼레이터가 오퍼레이터로 사용되는 본 발명의 벡터의 경우에, lac I 유전자 또는 lac I^q 유전자가 벡터에 도입될 때 lac I 유전자와 관련한 숙주에 대한 제한이 없게됨을 의미한다.

플라스미드β-갈락토시다제 활성(단위) 유도 전 유도 3 시간 후 유도 7 시간 후 유도 24 시간 후

pCold01NC2lac 16672 12823 15866 22779 pCold03NC2lac 109 7469 9414 27055 pCold04NC2lac 190 6860 14523 45464 pCold05NC2lac 48 3107 3985 9734 pCold06NC2lac 52 4340 9324 23161 pCold01NC2 16 141 148 72

실시예 6. 고도로 상보성인 다운스트림 박스 서열 및 정제를 위한 태그를 갖는 저온 유도성 벡터 pCold07 및 pCold08 시리즈 플라스미드의 작제 및 조사

(1)플라스미드 pCold07NC2 및 pCold08NC2의 작제

pCold03 시리즈 또는 pCold04 시리즈 플라스미드에서, CspA의 N-말단 암호화 영역의 하류에 다중 클로닝 부위가 존재하고 목적 단백질은 CspA의 N-말단의 12 또는 13 아미노산 잔기와의 융합 단백질로서 발현된다. CspA의 N-말단 암호화 영역에는 다운스트림 박스 서열이 존재하고, 이.콜라이의 안티-다운스트림 박스 서열이 16S 리보솜 RNA내 1467-1481의 15 염기인 것으로 생각될 때, 이러한 서열은 상기 15 염기 중 10개가 어닐링되는 정도까지 상보성을 보인다. CspA의 N-말단을 암호화하는 염기서열을 15 염기로 이루어진 전술한 서열에 완전히 상보적인 서열목록의 서열번호 28에 나타낸 바와 같은 염기서열로 치환시키고 이어서 정제를 위한 태그 서열로서 6 잔기의 히스티딘 잔기를 암호화하는 서열과 이들 서열에 의해 암호화된 리더 펩타이드를 절단하기 위한 프로테아제 인자 Xa의 인식 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 이의 추가 하류에 도입시켜 플라스미드 pCold07NC2 및 pCold08NC2를 작제한다.

우선, 플라스미드 pCold03NC2를 NcoI 및 EcoRI으로 분해하여 pCold03NC2 상의 cspA 유전자의 N-말단 서열을 암호화하는 영역을 제거하여 벡터 단편을 제조한다. 이어서, 합성 뉴클레오타이드 DB-3 및 DB-4(DB-3 및 DB-4의 염기서열을 서열목록의 서열번호 26과 27에 나타내었다)를 합성하여 어닐링한 다음 앞서 제조한 pCold03NC2의 NcoI와 EcoRI 사이의 영역에 삽입시켜 플라스미드 Cold07NC2를 작제한다. 또한, 완전히 동일한 단계에 의해, 플라스미드 pCold04NC2 상의 cspA 유전자의 N-말단 서열을 암호화하는 영역이 상기 합성 DNA 링커로 치환된 플라스미드 pCold08NC2를 작제한다.

(2)β-갈락토시다제 유전자를 사용한 저온 유도성 벡터의 변형된 형태의 유도능에 대한 조사

실시예 4-(3)에서 제조한 플라스미드 벡터 pCold01NC2lac를 BamHI과 SalI으로 분해하고 lac Z 유전자를 함유하는 약 6.2 kb의 DNA 단편을 추출하고 정제한다. 생성되는 DNA 단편을 전술한 플라스미드 pCold07NC2 및 pCold08NC2의 BamHI과 SalI 사이의 영역에 삽입하고 생성되는 플라스미드를 pCold07NC2lac 및 pCold08NC2lac로 각각 명명한다. 이들 플라스미드 모두는 16S 리보솜 RNA내 안티-다운스트림 박스 서열에 완전히 상보적인 다운스트림 박스 서열에 의해 암호화된 5 잔기, 정제를 위한 태그 서열로서 히스티딘 잔기의 6 잔기, 인자 Xa에 의해 인식되는 아미노산 잔 기인 4 아미노산 잔기, 및 다중 클로닝 부위로부터 유도된 10 아미노산 잔기를 포함하는, 총 25 아미노산 잔기로 구성되는 N-말단 리더 펩타이드가 10번째 아미노산 잔기에서 β-갈락토시다제에 연결되는 융합된 β-갈락토시다제를 암호화한다. 한편, 다른 플라스미드를 갖는 발현 플라스미드로서, lac Z 유전자가 pET-시스템 플라스미드 pET21b(Novagen 제조)의 BamHI 및 SalI 사이의 영역에 삽입된 플라스미드 pET21blac를 작제하여 이의 유도능을 비교한다.

이.콜라이 JM109[pET21blac의 경우에 Promega에 의해 제조된 이.콜라이 JM109(DE3)]를 각각의 전술한 플라스미드와 실시예 4에서 작제한 pCold01NC2lac 및 pCold02NC2lac로 형질전환시키고, 생성되는 형질전환체를 실시예 3-(5)에서와 동일한 작업에 의해 15℃에서 발현 유도 실험을 한다. β-갈락토시다제 활성을 유도 직전, 유도 3 시간 후, 및 유도 10 시간 후에 측정한다.

표 7에 나타난 바와 같이, pCold07NC2lac 및 pCold08NC2lac를 함유하는 형질전환은 37℃에서 배양 전 단지 낮은 β-갈락토시다제 활성을 보였으며, 따라서 각 플라스미드의 cspA 프로모터의 작용이 정확하게 조절된 것으로 나타났다. 또한, 유도 7 시간 후에, 플라스미드 pCold07NC2lac를 함유하는 형질전환체의 경우에, pCold03NC2lac를 함유하는 것과 비교하여 5배 이상의 β-갈락토시다제 활성이 발현되었고, 플라스미드 pCold08NC2lac를 함유하는 형질전환체의 경우에, pCold04NC2lac를 함유하는 것에 비해 4배 이상의 β-갈락토시다제 활성이 발현되었다. 아울러, 공지의 발현벡터 가운데서 효과적인 발현벡터인 pET 시스템과 비교하였을 때, pCold07 시리즈 및 pCold08 시리즈 플라스미드는 특히 저온에서 유도 후 단기간 내에 더 높은 발현능을 보인 것으로 밝혀졌다.

플라스미드β-갈락토시다제 활성(단위) 유도 전 유도 3 시간 후 유도 7 시간 후

pCold03NC2lac 37 7253 9282 pCold04NC2lac 230 6311 12592 pCold07NC2lac 359 31335 53069 pCold08NC2lac 705 33863 55850 pET21blac 144 6103 32934

발명의 장점

본 발명에 따라, 통상의 온도에서의 발현이 조절될 수 있고 저온 조건하에서 고 발현 효능이 성취되는 발현벡터가 제공된다. 이러한 벡터를 사용함으로써, 숙주에 유해 작용을 보이는 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 형질전환체를 생성할 수 있다. 또한, 단백질 발현이 상기 벡터를 이용하여 저온 조건하에서 수행될 때, 봉입체의 형성이 억제되어, 활성을 지닌 단백질을 효율적으로 생성할 수 있다.

서열목록

서열번호 7: 프라이머 CSA-67FN의 염기서열.

서열번호 8: 프라이머 CSA-13R의 염기서열.

서열번호 9: 프라이머 CSA-13R2의 염기서열.

서열번호 11: 프라이머 CSA+1RLAC의 염기서열.

서열번호 12: 프라이머 CSA+20FN의 염기서열.

서열번호 13: 프라이머 CSA70R의 염기서열.

서열번호 14: 프라이머 CSA+27NF1의 염기서열.

서열번호 15: 프라이머 D3F의 염기서열.

서열번호 16: 프라이머 D3R의 염기서열.

서열번호 17: 프라이머 CSA-ter-FHX의 염기서열.

서열번호 18: 프라이머 CSA-ter-R의 염기서열.

서열번호 19: 합성 올리고뉴클레오타이드 KS-링커 1의 염기서열.

서열번호 20: 합성 올리고뉴클레오타이드 KS-링커 2의 염기서열.

서열번호 21: 프라이머 CSA1NC-F의 염기서열.

서열번호 22: 프라이머 CSA1NC-R의 염기서열.

서열번호 23: 프라이머 CSA13R3의 염기서열.

서열번호 24: 프라이머 CSA1ND-F의 염기서열.

서열번호 25: 프라이머 CSA1ND-R의 염기서열.

서열번호 26: 합성 올리고뉴클레오타이드 DB-3의 염기서열.

서열번호 27: 합성 올리고뉴클레오타이드 DB-4의 염기서열.

<110> TAKARA SHUZO CO., LTD <120> COLD-INDUCIBLE EXPRESSION VECTOR <130> 1998/05171 <150> JP 9/334792 <151> 1997-11-20 <160> 28 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 103 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 1 caguguagua aggcaagucc cuucaagagc cuuuaacgcu ucaaaaucug uaaagcacgc 60 cauaucgccg aaaggcacac uuaauuauua aagguaauac acu 103 <210> 2 <211> 173 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 2 aauugugagc ggauaacaau uugaugugcu agcauuaaag caguguagua aggcaagucc 60 cuucaagagu uaucguugau accccucgua gugcacauuc cuuuaacgcu ucaaaaucug 120 uaaagcacgc cauaucgccg aaaggcacac uuaauuauua aagguaauac acu 173 <210> 3 <211> 173 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 3 aauugugagc ggauaacaau uugaugugcu agcgcauauc caguguagua aggcaagucc 60 cuucaagagu uaucguugau accccucgua gugcacauuc cuuuaacgcu ucaaaaucug 120 uaaagcacgc cauaucgccg aaaggcacac uuaauuauua aagguaauac acu 173 <210> 4 <211> 143 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 4 aauugugagc ggauaacaau uugaugugcu agcgcauauc caguguagua aggcaagucc 60 cuucaagagc cuuuaacgcu ucaaaaucug uaaagcacgc cauaucgccg aaaggcacac 120 uuaauuauua aagguaauac acu 143 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 5 ttgcatcacc cgccaatgcg tggcttaatg cacatca 37 <210> 6 <211> 1209 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 aagcttcgat gcaattcacg atcccgcagt gtgatttgag gagttttcaa tggaatataa 60 agatccaatg catgagctgt tgagcagcct ggaacagatt gtttttaaag atgaaacgca 120 gaaaattacc ctgacgcaca gaacaacgtc ctgtaccgaa attgagcagt tacgaaaagg 180 gacaggatta aaaatcgatg atttcgcccg ggttttgggc gtatcagtcg ccatggtaaa 240 ggaatgggaa tccagacgcg tgaagccttc aagtgccgaa ctaaaattga tgcgtttgat 300 tcaagccaac ccggcattaa gtaagcagtt gatggaatag acttttatcc actttattgc 360 tgtttacggt cctgatgaca ggaccgtttt ccaaccgatt aatcataaat atgaaaaata 420 attgttgcat cacccgccaa tgcgtggctt aatgcacatc aacggtttga cgtacagacc 480 attaaagcag tgtagtaagg caagtccctt caagagttat cgttgatacc cctcgtagtg 540 cacattcctt taacgcttca aaatctgtaa agcacgccat atcgccgaaa ggcacactta 600 attattaaag gtaatacact atgtccggta aaatgactgg tatcgtaaaa tggttcaacg 660 ctgacaaagg cttcggcttc atcactcctg acgatggctc taaagatgtg ttcgtacact 720 tctctgctat ccagaacgat ggttacaaat ctctggacga aggtcagaaa gtgtccttca 780 ccatcgaaag cggcgctaaa ggcccggcag ctggtaacgt aaccagccta taatctctgc 840 ttaaaagcac agaatctaag atccctgcca tttggcgggg atttttttat ttgttttcag 900 gaaataaata atcgatcgcg taataaaatc tattattatt tttgtgaaga ataaatttgg 960 gtgcaatgag aatgcgcaac gccgtaagta aggcgggaat aatttcccgc cgaagactct 1020 tactctttca atttgcaggc taaaaacgcc gccagctcat aactctcctg tttaatatgc 1080 aattcacaca gtgaatctct tatcatccag gtgaaaaata aaagcgtgaa acaaatcact 1140 attaaagaaa gtaatctata tttctgcgca ttccagctct gtgttagttt cacgagtatg 1200 tactgcacc 1209 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 7 ccgttccatg gccgattaat cataaatatg 30 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 8 ggaattcgtt gaaccatttt acg 23 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 9 ggaattcttg aaccatttta cg 22 <210> 10 <211> 2442 <212> DNA <213> Alteromonas sp. <400> 10 atgaaaatac gtaatgtttg tcgtagtgcg gtgcttttag gcttgatgtc tttaaataca 60 tacgcagaaa caaaagctga ttggatgcaa ggtaactggg ggatcagtta tcgaatacct 120 ggaggagata ttaattactc aggtagtcat gttgcagaat acaatgtaag agccgcagtt 180 gaacaaatct cagcaattcc tggtttgaag tgggtacaaa ttaatttaac caacggtgca 240 tctggtgatc gttttatagt ccctgtaaca gaagttgaag ccattaatcc tttatccgct 300 cctaacagta ttaatgactt atacgatcct actttacctg ggcgagatct ttttgagcaa 360 ctggcattag ccttcaaagc taaaggcata agagttgttg cttatattgc gactcaaggg 420 cctggcatgc tcaagcatgg tgctgaaaac tcgatggatg aagatgactc cattactgac 480 tgtaaatcgt ctaagccatt agtaaccgat cttgatacac aagtttactg ttcagcaaat 540 atgaatcgct ggagagatta cgttttagaa caatacccat caaccagtct ttatagaagt 600 tttgaattgg caatggtcaa tattgtagaa acattatcac tgcgttatgg aagtacaatt 660 gatggctggt ggtttgatca ttcaggtttt ggtgacagtg aattacttca tgctgcggct 720 ctagctggaa ataatgatgc ggcagtagcc tttaatgaag gcgataaagt tcctttggta 780 aataacccag agacattaga cgattacacc tttggtcatc caacacctat aggtagtgag 840 gtttcttctg atgataaaaa cctacctatg ttaacgtcta tagaagctac tttagatggt 900 attttaactg gttcaggtga tgatgtaggc tctgtgggac atatgtttat gccacttcaa 960 gaaagttgga atggtggcac tgttgtattt tctgaagcga aaggatctga ctggcttaat 1020 cgagcattaa aagccggagg tgcatttaca tgggcactaa gccaagacag taatgatgag 1080 ttaggtggtg gcggagcaag attaatttca gaaccgcagg taaaaatgct tgaacgtatg 1140 agttttaata taggtaaaca attacatatg aatctagatg gttcagatgg tgatactgct 1200 tatgatgact ccgtcaacca atataccgct actgtaaacg gtgctaattt tgttgatgat 1260 gttacaagag gaaaagttgc aagttttact gaagacgacc agttagaact agacaattat 1320 caaggtattt caggtggaaa tgcgcgtaca accatggctt ggataaaaac ttcagacagc 1380 aaaggcgata ttattgattg gggtaataac acaacaagcg aacgttggtg gttacgttta 1440 gttgacggta aatttaaact gatattaaaa ggtcctaatc ttacaggaac tacaacactt 1500 aatgacgacc aatggcacca tattgctgtt gtagcttctg ataacgtagt tgctaatatc 1560 aaagtataca ttgatggtgt tttagaaact gttgctgtaa atgacaatgc ttcaactacc 1620 ttcgatacaa ccttaggtgg caatatacaa ataggtgggg cctacaccgg acttatcgat 1680 aaagtgcttg tgcatgatag agcattagat gaaagcgaga ttgagtatgt tgttaattca 1740 tccaatgctg atcttgattt agaggttgca ttagatgtgc gttttgaaga gtcagcaaac 1800 tcaactaaag taaccgataa ttctatatat ggacgtcatg gcacaaatcg aggtgctatt 1860 actggcgtgt ttgatgcaga acgtaacagc aatgtgtact cacttgatgg tgttgatagt 1920 ggcgaagata taaatgattt aaaagatagc gactacgaac atgaagttgt aatgacaaca 1980 gataattcta aagactcaaa aggttatagt ggagttaatg gtgcaggtcc gcgtactgta 2040 atggcatgga taaaaacaac ttttggcggt gctgttattg cccaatgggg taataaaaat 2100 tcagttgatg gcgaacaata tgaagttcgt ttaaaaaatg gtgcactgag attagatatt 2160 acaggtggca ttattaaagg cacaacatca attaatgatg gcgagtggca tcatattgct 2220 gtggtttcac ctgatgaaca gttagctaat actaaattgt atgttgatgg tgtactagaa 2280 acagcaacca cttcgggttc tcaagcaacg attgatacta aaactcttaa tggcgatagc 2340 aaagacgtaa taattggtag tacgtttgtt ggcgagatgg acgattttat tattcatcaa 2400 cgcgctttaa gacagtttga agtgaaaaac tcagcaggac tc 2442 <210> 11 <211> 55 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 11 cgctagcaca tcaaattgtt atccgctcac aatttgatgt gcattaagcc acgca 55 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 12 ggccgctagc attaaagcag tgtagtaagg c 31 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 13 gagaattcag gctggttacg ttacc 25 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 14 ggccgctagc gcatatccag tgtagtaagg caag 34 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 15 tcaagagcct ttaacgcttc aaaa 24 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 16 taaaggctct tgaagggact t 21 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 17 gggaagcttt ctagataggt aatctctgct taaaagcac 39 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 18 ccagggcctg cgcattctca ttgcaccc 28 <210> 19 <211> 11 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 19 ccggggatcc g 11 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 20 tcgacggatc cccgggtac 19 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 21 aatacaccat ggccggtaaa atg 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 22 tttaccggcc atggtgtatt acc 23 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 23 ggaattccgt tgaaccattt tacg 24 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 24 aataccatat gtccggtaaa atg 23 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 25 tttaccggac atatggtatt acc 23 <210> 26 <211> 46 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 26 catgaatcac aaagtgcatc atcatcatca tcatatcgaa ggtagg 46 <210> 27 <211> 46 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Artificial Sequence <400> 27 aattcctacc ttcgatatga tgatgatgat gatgcacttt gtgatt 46 <210> 28 <211> 15 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 28 atgaatcaca aagta 15

Claims

하기 요소 각각을 함유함을 특징으로 하는 벡터:

(1) 사용하고자 하는 숙주에서 작용을 나타내는 프로모터;

(2) (1)의 프로모터의 작용을 조절하는 조절 영역; 및

(3) 이.콜라이의 cspA 유전자 mRNA로부터 유도된 5′-비해독 영역을 암호화하는, 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 영역
제 1 항에 있어서, 프로모터가 이.콜라이의 cspA 유전자로부터 유도된 프로모터인 벡터.
삭제
제 2 항에 있어서, 이.콜라이의 cspA 유전자로부터 유도된 프로모터가 서열번호 5의 염기서열을 함유하는 프로모터인 벡터.
제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 조절 영역이 오퍼레이터인 벡터.
제 5 항에 있어서, 오퍼레이터가 lac 오퍼레이터인 벡터.
삭제
삭제
제 6 항에 있어서, 서열번호 2, 3 및 4의 염기 서열로 구성된 군으로 선택되는 염기 서열을 함유하고, 이.콜라이 cspA 유전자 mRNA로부터 유도된 5′-비해독 영역을 암호화하며, lac 오퍼레이터가 삽입된 영역을 함유하는 벡터.
제 1 항, 제 2 항, 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 5′-비해독 영역의 다운스트림에, 이.콜라이의 16S 리보솜 RNA내 위치 1467-1481에 존재하는 리보솜 RNA의 안티-다운스트림 박스 서열과 상보성을 갖는 염기서열을 추가로 포함하는 벡터.
삭제
제 10 항에 있어서, 5′-비해독 영역의 다운스트림에 서열번호 28에 나타낸 염기서열을 함유하는 벡터.
하기 단계를 포함함을 특징으로 하는, 목적 단백질의 발현방법:

(1) 숙주를 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 통합된 제 1 항, 제 2 항, 및 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 형질전환하는 단계;

(2) 생성된 형질전환체를 배양하는 단계; 및

(3) 조절 영역의 기능을 통해 프로모터의 작용을 유도시키고, 동시에 배양 온도를 상기 (2) 단계에서의 온도보다 낮게 하는 단계.
삭제