DE69838680T2 - Durch kälte induzierbarer expressionsvektor - Google Patents

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Description

  • Technischer Bereich der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Vektor, der bei einer rekombinanten DNA-Technik verwendet wird, und auch ein Verfahren für die Expression von Protein unter Verwendung des Gens.
  • Stand der Technik
  • Die Produktion von nützlichen Proteinen unter Verwendung einer rekombinanten DNA-Technik ist derzeit eine verbreitet angewendete Verfahrensweise. Dabei ist ein Expressionssystem, das Escherichia coli als Wirt verwendet, das am meisten verwendete Expressionssystem und viele Proteine wurden mit Hilfe von Rekombinanten produziert. Es ist für die Produktion geeigneter Proteine durch solche Rekombinanten üblich, den sogenannten Expressionsvektor zu verwenden, der durch Anordnen der gewünschten Gene unter der Kontrolle eines Promotors, der von RNA-Polymerase erkannt wird, konstruiert ist. Beispiele des für Expressionsvektoren verwendeten Promotors sind lac, trp, tac, gal und ara, wenn zum Beispiel E. coli als Wirt verwendet wird. Ein Beispiel eines Expressionsvektors, der einen anderen Promotor verwendet als den, der direkt von RNA-Polymerase von E. coli erkannt wird, ist ein pET-System (hergestellt von Novagen) [J. Mol. Biol., Band 189, Seiten 113–130 (1986); Gene, Band 56, Seiten 125–135 (1987)], das einen Promotor verwendet, der von RNA-Polymerase vom Bakteriophagen T7 erkannt wird, der E. coli infiziert. Im Falle des pET-Systems, wird T7RNA-Polymerase in E. coli exprimiert, es findet Transkription des gewünschten Gens, das downstream des T7-Promotors auf dem Expressionsvektor angeordnet ist, durch die T7RNA-Polymerase statt und es erfolgt Synthese des gewünschten Proteins mittels eines Translationssystems des Wirts.
  • Wenn jedoch das gewünschte Protein in vielen E. coli Expressionssystemen, darunter dem pET-System, in hohem Maße exprimiert wird, kommt es oft vor, dass das gewünschte Protein einen unlöslichen Komplex ergibt (den sogenannten Einschlusskörper) und die Menge an gewünschtem Protein eines aktiven Typs wird sehr gering. Es wurde berichtet, dass es bei einigen Polypeptiden Beispiele gibt, bei denen der Einschlusskörper solubilisiert wird, und dann einem Umfaltungsvorgang unterzogen wird, so dass ein Polypeptid eines aktiven Typs erhalten wird. Üblicherweise ist jedoch die gewonnene Menge oft gering und außerdem ist es notwendig, eine geeignete Umfaltungsbedingung für jedes der gewünschten Proteine zu untersuchen. Deshalb besteht ein Bedarf an einem System, bei dem das Protein eines aktiven Typs direkt in E. coli exprimiert wird.
  • Es wird angenommen, dass die Bildung eines Einschlusskörpers in der Weise stattfindet, dass auf der Stufe einer Zwischenverbindung, bevor die translierte Polypeptidkette in eine korrekte sterische Konfiguration gefaltet wird, aufgrund einer intermolekularen Wechselwirkung ein Verwinden mit anderen Polypeptiden stattfindet, worauf ein sehr großer unlöslicher Komplex gebildet wird. Es ist bekannt, dass in dem Fall, wenn eine Inkubation eines rekombinanten E. coli bei einer Temperatur (20–30°C) ausgeführt wird, die niedriger ist als die üblich verwendete Temperatur von 37°C, die exprimierte Menge an Protein eines aktiven Typs zunimmt. Es wird angenommen, dass dies durch die Tatsache bedingt ist, dass wegen einer Verzögerung der Translationsrate durch Ribosom ausreichend Zeit verfügbar ist, um die Zwischenstufe in eine korrekte Struktur zu falten, und dass wegen einer Verzögerung der Wirkung der intrazellulären Protease unter Bedingungen einer niedrigen Temperatur die Stabilität des exprimierten Proteins eines aktiven Typs zunimmt. Auf diese Weise hat bei der Produktion von Protein, bei der wahrscheinlich ein Einschlusskörper entsteht, ein Verfahren, bei dem rekombinante E. coli bei niedriger Temperatur inkubiert werden, als wirksames Mittel öffentliche Aufmerksamkeit erregt.
  • Wenn hingegen die Inkubationstemperatur von E. coli während einer logarithmischen Wachstumsperiode von 37°C auf 10 bis 20°C gesenkt wird, stoppt das Wachstum von E. coli und während dieser Periode wird die Expression einer Gruppe von Proteinen induziert, die Kälteschockproteine genannt werden. Die genannten Proteine werden in Abhängigkeit von ihren Induktionswerten in Gruppe I (10-fach oder mehr) und Gruppe II (weniger als 10-fach) klassifiziert und Beispiele der Proteine der Gruppe I sind CspA, CspB, CspG und CsdA. Darunter erreicht im Falle von CspA die exprimierte Menge nach 1,5 Stunden nach der Temperaturverschiebung von 37°C auf 10°C 13% des gesamten Zellproteins [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 87, Seiten 283–287 (1990)] und deshalb wurde die Verwendung eines Promotors des cspA-Gens für die Produktion von rekombinantem Protein bei niedriger Temperatur versucht.
  • Außer dem oben genannten Vorteil der Initiierung einer Transkription mit hoher Effizienz bei niedriger Temperatur durch einen Promotor des cspA-Gens, wurde für das rekombinante Proteinexpressionssystem unter Bedingungen einer niedrigen Temperatur unter Verwendung des cspA-Gens die folgende Wirksamkeit gezeigt.
    • (1) Wenn eine vom cspA-Gen transkribierte translierbare mRNA nicht für ein CspA-Protein mit einer Funktion kodiert, oder genauer, wenn sie nur für einen Teil der N-terminalen Sequenz des CspA-Proteins kodiert, inhibiert eine solche mRNA die Expression anderer E. coli Proteine, darunter das Kälteschockprotein, über eine lange Zeit und während dieses Zeitraums wird eine Translation der mRNA bevorzugt ausgeführt [J. Bacteriol., Band 178, Seiten 4919–4925 (1996)].
    • (2) In einer Position bei einer 12-Base downstream von einem Initiationskodon des cspA-Gens gibt es eine Sequenz, die Downstream-Box genannt wird und aus 15 Basen besteht und die Translationseffizienz unter Bedingungen einer niedrigen Temperatur erhöht.
    • (3) Eine untranslierte 5'-Region, die aus 159 Basen besteht, die ab dem Initiationspunkt der Transkription von cspA-Gen mRNA bis zum Initiationskodon vorliegt, ergibt einen negativen Einfluss und einen positiven Einfluss auf die Expression von CspA bei 37°C bzw. bei niedriger Temperatur.
  • Jedoch, obwohl der Promotor des Gens sicher in der Lage ist, die Transkription bei niedriger Temperatur mit hoher Effizienz zu initiieren, wirkt er tatsächlich selbst bei üblicher Inkubationstemperatur (37°C) und es wurde vorgeschlagen, dass die Stabilität von mRNA, die aus dem Gen transkribiert ist, die Expression des Gens ebenso reguliert [Molecular Microbiology, Band 23, Seiten 355–364 (1997)]. Deshalb ist bei einem Expressionsvektor, der unter Verwendung des Promotors des cspA-Gens konstruiert ist, die Regulation der Expression unvollständig und im Falle eines Gens, dessen Produkt für den Wirt schädlich ist, gibt es einige Fälle, bei denen es schwierig ist, zu einem solchen Zustand zu inkubieren, dass den Expressionsvektor enthaltende E. coli induziert werden können oder es ist sogar die Konstruktion des Expressionsvektors unmöglich.
  • Zum Beispiel wird in US-Patent 5,654,169 beschrieben, dass selbst wenn das β-Galactosidasegen, das üblicherweise zur Promotorbestimmung verwendet wird, unter Verwendung eines Promotors des cspA-gens in ein Expressionsplasmid insertiert wird, es aufgrund des exprimierten Produkts schwierig ist, das konstruierte Produkt in E. coli zu halten.
  • Hingegen ist bekannt, dass eine Fähigkeit des Promotors des cspA-Gens zum Initiieren einer Transkription in der Region vorliegt, die downstream von –37 vom Initiationspunkt der Transkription liegt, jedoch wurde eine essentielle Region bisher nicht bestätigt. Ferner zeigt das obige US-Patent eine Region von –40 bis +96 vom Initiationspunkt der Transkription für das Gen als essentielle Region für die Funktion als Promotor des cspA-Gens. Die genannte Region enthält jedoch eine Region von fast 100 Basen, die in mRNA transkribiert wird und außerdem nicht für das Protein kodiert. Daher ist die minimale Region des cspA-Promotors, die zum Erreichen einer Transkription mit guter Effizienz bei niedriger Temperatur notwendig ist, noch nicht aufgeklärt.
  • Durch die Erfindung zu lösende Probleme
  • Dementsprechend ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Vektor anzubieten, bei dem eine Transformante für die Expression des genannten Gens hergestellt werden kann und bei dem das Genprodukt in einer hohen Effizienz exprimiert werden kann, selbst unter Bedingungen einer niedrigen Temperatur, selbst im Falle eines Gens, mit dem Konstruktion eines Expressionssystems oder effiziente Produktion von Genprodukt im Stand der Technik schwierig ist.
  • Mittel zum Lösen der Probleme
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben um die obige Aufgabe zu lösen versucht, eine lac-Operationssequenz downstream (nachgeordnet) eines Promotors des cspA-Gens zu insertieren, wodurch bei der Konstruktion von Plasmid und Inkubation bis zum induzierbaren Zustand, Genexpression aus dem Promotor reguliert wird. Durch die Verwendung eines Expressionsvektors mit einem cspA-Promotor, der durch einen so konstruierten lac-Operator reguliert werden kann, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung erfolgreich ein endo-sulfatierte Fu cose enthaltendes Polysaccharid abbauendes Enzym (Fdase 2) konstruiert, das mit einem Expressionsvektor unter Verwendung eines cspA-Promotors ohne lac-Operatorsequenz nicht konstruiert werden konnte. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ferner gefunden, dass wenn der lac-Operator bei der Inkubation der Transformante, die durch das Plasmid transformiert ist, inaktiviert wird und die Inkubationstemperatur zu diesem Zeitpunkt gesenkt wird, die Expression des Enzyms induziert werden kann. Dies zeigt, dass als Folge der Einführung einer Operatorsequenz, die Konstruktion eines Niedertemperaturexpressionsvektors, der die Expression bei üblicher Temperatur (37°C) regulieren kann, nun möglich ist.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben außerdem die notwendige minimale Region des cspA-Promotors bestimmt, bei der die Funktion erhalten bleibt, worauf die vorliegende Erfindung erreicht wurde.
  • Die vorliegende Erfindung wird wie folgt zusammengefasst. Damit betrifft das erste charakteristische Merkmal der vorliegenden Erfindung einen Vektor der dadurch gekennzeichnet ist, dass er jedes der folgenden Elemente enthält:
    • (1) einen Promotor, der seine Wirkung im zu verwendenden Wirt zeigt,
    • (2) ein Regulatorregion zum Regulieren der Wirkung des Promotors von (1) und
    • (3) eine Region, die für die untranslierte 5'-Region kodiert, die aus Kälteschockproteingen-mRNA gewonnen ist oder eine Region, die für die Region kodiert, wo Substitution, Deletion, Insertion oder Addition mindestens einer Base bei der untranslierten Region vorgenommen ist.
  • Das zweite charakteristische Merkmal der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression des gewünschten Proteins, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:
    • (1) einen Schritt, worin ein Wirt mit dem Vektor des ersten charakteristischen Merkmals der vorliegenden Erfindung transformiert wird, wobei ein für das zu exprimierende gewünschte Protein kodierendes Gen integriert wird,
    • (2) einen Schritt, worin die erhaltene Transformante inkubiert wird, und
    • (3) einen Schritt, worin Promotorwirkung über eine Funktion einer Regulationsregion induziert wird und gleichzeitig die Inkubationstemperatur unter die gewöhnliche Temperatur gesenkt wird, um das gewünschte Protein zu exprimieren.
  • Ferner betrifft ein drittes charakteristisches Merkmal der vorliegenden Erfindung einen isolierten cspA-Promotor, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine Basensequenz wie in SEQ ID NO:5 des Sequenzprotokolls gezeigt enthält und aus einer Basensequenz mit 135 oder weniger Basen gebildet ist.
  • Beste Weise zum Ausführen der Erfindung
  • Nun wird die vorliegende Erfindung nachfolgend genauer erläutert.
  • Es gibt keine besondere Einschränkung für den Promotor in (1) des ersten charakteristischen Merkmals der vorliegenden Erfindung, sondern es kann Alles verwendet werden, so lange es eine Aktivität zum Initiieren der Transkription von RNA im verwendeten Wirt aufweist. Wenn ein solcher Promotor zusammen mit einer Region verwendet wird, die für die untranslierte 5'-Region kodiert, die aus Kälteschockproteingen-mRNA oben unter (3) gewonnen ist, kann er als Promotor verwendet werden, der bei niedriger Temperatur anspricht. Wenn eine hohe Transkriptionseffizienz bei der Expressionsinduktion gewünscht ist, ist für die vorliegende Erfindung ein Promotor geeignet, der aus dem oben genannten Kälteschockproteingen gewonnen ist, wie cspA, cspB, cspG, csdA usw. und darunter ist der Promotor aus dem cspA-Gen besonders bevorzugt.
  • In Hinblick auf die Regulationsregion für den obigen Punkt (2) gibt es keine besondere Einschränkung, so lange sie in der Lage ist, die Expression eines Gens zu regulieren, das downstream vom Promotor von (1) gelegen ist. Wenn zum Beispiel eine Region, die eine RNA transkribiert, die zur vom Promotor transkribierten mRNA komplementär ist (d. h. eine Antisense-RNA) in einen Vektor induziert wird, kann eine Translation des gewünschten Proteins aus dem downstream vom Promotor gelegenen Gen inhibiert werden. Wenn eine Transkription von Antisense-RNA unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors erfolgt, der sich von dem in Punkt (1) unterscheidet, kann eine Expression des gewünschten Proteins reguliert werden. Alternativ kann auch ein Operator verwendet werden, der in Expressionsregulationsregionen von verschiedenen Genen vorhanden ist. Zum Beispiel kann der lac-Operator vom E. coli Lactoseoperon bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Funktion des lac-Operators kann durch eine geeignete induzierbare Substanz gelöscht werden, wie durch Lactose oder eine Substanz, die eine ähnliche Struktur aufweist, oder bevorzugt Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG), wodurch der Promotor darauf gerichtet werden kann. Eine solche Operatorsequenz ist üblicherweise nahe dem Initiationspunkt für die Transkription downstream vom Promotor angeordnet.
  • Die Region, die für die untranslierte 5'-Region vom Kälteschockprotein-mRNA kodiert, wie in Punkt (3) angeführt, ist eine Region, die für den Bereich der 5'-Seite vom Initiationskodon von mRNA kodiert. Bei den Kälteschockproteingenen von E. coli (cspA, cspB, cspG und csdA) wurde eine solche Region charakteristisch gefunden [J. Bacteriol., Band 178, Seiten 4919–4925 (1996); J. Bacteriol., Band 178, Seiten 2994–2997 (1996)] und der Bereich von 100 oder mehr Basen vom 5'-Ende bei der von diesen Genen transkribierten mRNA kann nicht in Protein transliert werden. Diese Region ist für eine Tieftemperaturabhängigkeit der Genexpression von Bedeutung, und wenn die untranslierte 5'-Region am 5'-Ende von mRNA eines beliebigen Proteins eingefügt ist, findet eine Translation der mRNA in Protein nun unter Bedingungen einer niedrigen Temperatur statt. Die untranslierte 5'-Region von Kälteschockprotein-mRNA kann eine sein, bei der Substitution, Deletion, Insertion und/oder Addition bei der Basensequenz vorgenommen wurde(n), so lange die Funktion erhalten bleiben kann.
  • Bei der vorliegenden Beschreibung steht der Ausdruck "Region" für einen bestimmten Bereich von Nukleinsäure (DNA oder RNA). Der Ausdruck "untranslierte 5'-Region von mRNA" steht bei der vorliegenden Beschreibung für eine Region, die bei den durch Transkription von DNA synthetisierten mRNA, an ihrer 5'-Seite vorliegt und nicht für ein Protein kodiert. Bei der vorliegenden Beschreibung wird die genannte Region als "5'-UTR" bezeichnet, was eine untranslierte 5'-Region bedeutet. Sofern nichts anderes angegeben ist, steht 5'-UTR für eine untranslierte 5'-Region von mRNA des cspA-Gens von E. coli oder eine modifizierte Form davon.
  • Beim Vektor der vorliegenden Erfindung kann eine Region verwendet werden, die für die 5'-UTR vom oben angeführten Kälteschockproteingen kodiert, und die vom cspA-Gen kann besonders zweckmäßig verwendet werden. Diejenige, bei der die Basensequenz partiell modifiziert ist, kann ebenso verwendet werden und zum Beispiel kann auch die, bei der die Basensequenz dieser Region durch Einführung des oben unter (2) genannten Vorgangs modifiziert ist, verwendet werden. Wie später in den Beispielen gezeigt wird, ist es möglich, eine Region zu verwenden, die für mRNA kodiert, die eine Basensequenz enthält, wie sie in SEQ ID NO:1 im Sequenzprotokoll gezeigt ist, wie die Region, die für mRNA einer Basensequenz kodiert, wie sie in SEQ ID NO:2, NO:3 oder NO:4 im Sequenzprotokoll gezeigt ist, oder ferner eine Region zu verwenden, die die Region enthält, die für mRNA kodiert, wobei eine solche Sequenz modifiziert ist. Die Region, die für 5'-UTR des Kälteschockproteingens kodiert, ist zwischen einem Promotor von (1) und einem Initiationskodon eines Gens angeordnet, das für das zu exprimierende Protein kodiert, oder es kann ein Operator bei der Region induziert sein. Zum Beispiel enthält die 5'-UTR der Basensequenz, wie in SEQ ID NO:2 bis 4 im Sequenzprotokoll gezeigt, eine lac-Operatorsequenz in der Basensequenz und ist bei der Expression des gewünschten Proteins wirksam, die eine Selektivität bei niedriger Temperatur aufweist.
  • Wenn eine Basensequenz, die zu der Antidownstream-Boxsequenz von Ribosomen-RNA des eingesetzten Wirts komplementär ist, downstream der untranslierten 5'-Region zusätzlich zu den obigen Bestandteilselementen enthalten ist, kann die Expressionseffizienz erhöht werden. Zum Beispiel ist im Falle von E. coli eine Antidownstream-Boxsequenz an der Position 1467–1471 von 16S Ribosomen-RNA vorhanden und es ist möglich, eine Region, die für ein N-terminales Peptid des Kältschockproteins kodiert, die die Basensequenz enthält, die eine hohe Komplementarität mit dieser Sequenz aufweist. Zum Beispiel kann eine Basensequenz, wie sie in SEQ ID NO:28 des Sequenzprotokolls gezeigt ist oder eine Sequenz mit einer hohen Homologie zu dieser Sequenz, künstlich eingeführt werden. Es ist effektiv, dass die Sequenz mit einer Komplementarität mit der Antidownstream-Boxsequenz in einer Weise angeordnet ist, dass sie von der Stelle initiiert, die ungefähr die erste bis fünfzehnte Base vom Initiationskodon ist. Ein Gen, das für das gewünschte Protein kodiert, wird in den Vektor so integriert, dass das genannte Protein als fusioniertes Protein mit einem N-terminalen Peptid exprimiert wird oder dass eine oder mehrere Basensubstitution(en) mittels einer gerichteten Mutagenese eingeführt ist/sind, so dass das Gen, das für das gewünschte Protein kodiert, eine Komplementarität zur Antidownstream-Boxsequenz aufweist. Wenn eine Integration in einen Vektor so ausgeführt ist, dass das gewünschte Protein als fusioniertes Pro tein exprimiert wird, kann das Peptid eine beliebige Länge aufweisen, so lange das gewünschte Protein seine Aktivität nicht verliert. Ein Vektor zur Expression eines solchen fusionierten Proteins kann zum Beispiel der sein, bei dem der Verbindungsteil so verbessert ist, dass er in der Lage ist, das gewünschte Protein aus dem fusionierten Protein zu isolieren, oder der, bei dem eine Verbesserung vorgenommen ist, wodurch ein fusioniertes Protein und Peptid exprimiert wird, was für die Reinigung oder den Nachweis verwendet werden kann. Ferner ist der Vektor, in dem eine Sequenz zur Beendigung der Transkription (Terminator) downstream des gewünschten Proteingens angeordnet ist, wegen einer erhöhten Stabilität des Vektors für eine hohe Expression des gewünschten Proteins vorteilhaft.
  • Der Vektor der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiger Vektor sein, der üblicherweise verwendet wird, wie ein Plasmid, Phage und Virus, sofern er ein Ziel als Vektor erreichen kann. Ferner kann die Region, die sich von den oben genannten Bestandteilselementen, die im Vektor der vorliegenden Erfindung enthalten sind, unterscheidet zum Beispiel ein wirkstoffresistentes Gen des Replikationsursprungs enthalten, das als selektiver Marker verwendet wird, Regulationsgen, das zur Funktion als Operator notwendig ist, wie das lac-Iq-Gen am lac-Operator, usw. Außerdem kann der Vektor der vorliegenden Erfindung in Genom-DNA des Wirts integriert werden, nachdem er in einen Wirt eingeführt ist.
  • Die Expression des gewünschten Proteins unter Verwendung des Vektors der vorliegenden Erfindung, der als Plasmid konstruiert ist, kann zum Beispiel gemäß den folgenden Schritten erfolgen. Wenn daher ein Gen, das für das gewünschte Protein kodiert, zum Plasmidvektor der vorliegenden Erfindung so geklont wird, dass ein geeigneter Wirt von dem Plasmid transformiert wird, ist es möglich, eine Transformante für die Expression des Proteins zu erhalten. Da eine Operation des Promotors durch einen Operator in einer solchen Transformante unterdrückt wird, wird das obige Protein in einem nicht induzierbaren Zustand nicht exprimiert, und elbst wenn das obige Protein für den Wirt toxisch ist, kann der obige Vektor im Wirt stabil gehalten werden.
  • Nachdem die obige Transformante bei einer gewöhnlichen Inkubationstemperatur, wie 37°C, unter einem nicht induzierbaren Zustand inkubiert ist, ist die Operatorwirkung gelöscht, so dass eine Transkription induziert wird, wodurch das gewünschte Protein exprimiert wird. Wenn in diesem Fall vor oder während der Induktion der Transkription die Inkubationstemperatur gesenkt wird, kann die Bildung eines Einschlusskörpers des gewünschten Proteins unterdrückt werden, wodurch das gewünschte Protein in einer aktiven Form erhalten werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun durch Darstellung der Konstruktion eines Plasmidvektors in spezifischer Weise genauer erläutert. In der vorliegenden Beschreibung werden von E. coli das CspA-Protein, die Region des Gens, die an der Expression des Proteins beteiligt ist, und die Promotorregion des Gens als "CspA", "cspA-Gen" bzw. "cspA-Promotor" bezeichnet, sofern nichts anderes angegeben ist. Die Basensequenz für das natürliche cspA-Gen, das unter der Zugangsnummer M30139 bei der GenBank Gendatenbank hinterlegt wurde, ist im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:6 gezeigt. In dieser Sequenz sind die Basen mit den Nummern 426–430 und 448–453 Kernsequenzen des Promotors, die Base mit der Nummer 462 ist ein Hauptinitiationspunkt für die Transkription (+1); die Basen mit den Nummern 609–611 sind eine SD-Sequenz (Ribosombindungssequenz) und die Basen mit den Nummern 621–623 und 832–834 sind Initiationskodon bzw. Terminationskodon von CspA. Dementsprechend ist der Teil der für 5'-UTR dieser Sequenz kodiert, der Bereich der Basen mit den Nummern 462–620.
  • Zunächst wird die Konstruktion von Fremdgenexpressionsplasmiden als Expressionsplasmide unter Verwendung des cspA-Gens, die durch Konstruktion einer Serie von Plasmidvektoren pMM031 (pMM031 und pMM031F1) unter Verwendung des cspA-Gens per se hergestellt wurden, und dann wurde ein Fremdgen darin eingeführt und die Expression des Proteins unter Verwendung des Plasmids erläutert.
  • Ein detailliertes Verfahren zur Konstruktion solcher Expressionsplasmide ist in Beispiel 1-(1) angegeben. Zum Beispiel weist das Plasmid pMM031 eine solche Struktur auf, dass eine Region, die einen lac-Promotor zwischen den AfIIII-EcoRI-Stellen des Plasmidvektors pTV118N (hergestellt von Takara Shuzo) enthält, der ein Ampicillinresistenzgen, Replikationsursprung des pUC-Plasmids usw. enthält, durch eine Region substituiert wird, die aus einer Promotorregion des cspA-Gens, einer Region, die für 5'-UTR kodiert und einer Region, die für einen N-terminalen Teil von CspA kodiert mit 13 Aminosäureresten besteht. In einem Plasmid pMM031F1 verändert sich ein Kodon, das für Asparagin kodiert, das das 13-te vom N-Ende von CspA ist, in eines, das für Lysin kodiert. Die Promotorregionen des cspA-Gens, das für diese pMM031-Serie verwendet wird, sind die Regionen bei –67 und nachfolgend, gezählt ab dem Initiationspunkt der Transkription dieses Gens, das die Region enthält, die für die Funktion notwendig ist. Ferner enthält die Region, die für die N-terminalen 13 Aminosäurereste von CspA kodieren, die Downstream-Boxsequenz, die für eine hohe Translationseffizienz des cspA-Gens unter Bedingungen niedriger Temperatur verantwortlich ist. Aus diesen Gründen stellt die pMM031-Serie Expressionsvektoren dar, die die hohe Proteinexpressionseffizienz des cspA-Gens unter Bedingungen einer niedrigen Temperatur gut wiedergeben können.
  • Die Tatsache, dass die Plasmide der pMM031-Serie als Expressionsvektoren eines Niedertemperaturinduktionstyps wirken und in der Lage sind, das nützliche Protein als Proteine eines aktiven Typs zu exprimieren, wurde durch die Verwendung einer Umkehrtranskriptase bestätigt, die vom Rous-assoziierten Virus 2 (RAV-2) als Beispiel in Beispiel 1-(2) gewonnen ist. Wenn jedoch von einem Umkehrtranskriptaseexpressionsvektor, der durch die Verwendung der pMM031-Serie konstruiert ist, transformierte E. coli bei 37°C behandelt werden, wurde beobachtet, dass im Vergleich zu den Transformanten des Plasmids der pMM031-Serie, die kein Fremdgen enthalten, die erhaltenen Kolonien klein sind und die Wachstumsrate der Zellen ebenfalls gering ist. Dies legt nahe, dass wenn das cspA-Gen (insbesondere der Promotor des Gens) verwendet wird, eine Kontrolle der Expression bei 37°C ungenügend ist und dies ist ein Problem bei der Produktion des Proteins.
  • Es wurde gezeigt, dass die Unzulänglichkeit der Expressionskontrolle des cspA-Gens bei 37°C so stark ist, dass, wenn das zu exprimierende Protein für den Wirt sehr hochtoxisch ist, eine Konstruktion des Expressionsplasmids unmöglich ist. Wie in Beispiel 1-(3) gezeigt ist, wenn die Konstruktion eines Plasmids, das ein endo-sulfatierte Fucose enthaltendes Polysaccharid abbauendes Enzym (Fdase 2) exprimiert, unter Verwendung eines Plasmidvektors der pMM031-Serie versucht wird, ist die Konstruktion des Plasmids aufgrund der Toxizität des Expressionsprodukts für den Wirt unmöglich. Die Tatsache, dass die exprimierte Fdase 2 den Wirt beeinflusst, wodurch die Konstruktion des Expressionsvektors unmöglich war, kann leicht aus der Tatsache vorhergesagt werden, dass als Nebenprodukt bei der Ausführung der Konstruktion aufgrund einer Deletion von einer oder zwei Basen im Gen, das für das Enzym kodiert, ein offener Leserahmen aus der Position versetzt wurde, worauf das Plasmid erhalten wurde, das nicht mehr in der Lage ist, das Enzym zu exprimieren. Ferner wurde die Toxizität von Fdase 2 für den Wirt E. coli durch die Tatsache aufgezeigt, dass keine Transformante erhalten wurde, als der Enzym exprimierende Vektor unter Verwendung des Plasmids pET3d des pET-Systems (hergestellt von Novagen) konstruiert wurde, der als Vertreter aus dem Stand der Technik eingeführt wurde und dann wurde versucht, den Wirt E. coli BL21 (DE3) zur Expression mit dem T7RNA-Polymerasegen zu transformieren.
  • Nun haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung die neuen Expressionsvektoren entwickelt, die ausgehend von diesen Ergebnissen beim tatsächlichen Einsatz wirksam sind, und haben den Plasmidvektor der vorliegenden Erfindung gefunden.
  • Daher haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung einen bei niedriger Temperatur exprimierenden Plasmidvektor pMM037 entwickelt, der den Expressionsgrad unter den nicht induzierbaren Zustand (37°C) senkt und in der Lage ist, die Expression des gewünschten Proteins zu kontrollieren. Das pMM037 weist insgesamt die gleiche Struktur auf wie pMM01F1 mit der Ausnahme, dass eine Sequenz von 31 Basen, die so aufgebaut ist, dass sie in der Lage ist, einen funktionellen lac-Operator zu bilden, anstelle der Region von +2 bis +18 downstream des Initiationspunkts (+1) für die Transkription bei pMM031F1 der pMM031-Serie insertiert ist. Die Basensequenz der 5'-UTR kodiert auf dem Plasmidvektor PMM037, d. h. die vom Initiationspunkt der Transkription bis zur Base unmittelbar vor dem Initiationskodon für CspA ist in SEQ ID NO:2 des Sequenzprotokolls gezeigt.
  • Ein Verfahren für die Konstruktion dieses Expressionsplasmidvektors ist in Beispiel 2-(1) angegeben. Auf diese Weise ist es möglich, einen Primer CSA+1RLAC zu synthetisieren (die Basensequenz des Primers ist in SEQ ID NO:11 des Sequenzprotokolls gezeigt), der so aufgebaut ist, dass er einen funktionellen lac-Operator downstream des cspA-Promotors bildet und die Sequenz der Region upstream des Initiationspunkts der Transkription des cspA-Gens und die Region des lac-Operators enthält. Wenn dieser Primer, bei dem das 5'-Ende phosphoryliert ist und der Primer CSA-67FN (die Basensequenz des Primers ist in SEQ ID NO:7 des Sequenzprotokolls gezeigt) für die Konstruktion des Plasmids der PMM031-Serie verwendet wird und eine PCR unter Verwendung eines Plasmids pJJG02 als Templat durchgeführt wird, das ein cspA-Gen des Wildtyps enthält [J. Bacteriol., Band 178, Seiten 4919–4925 (1996)], können DNA-Fragmente erhalten werden, die mit der lac-Operatorregion downstream des Promotors des cspA-Gens angeordnet sind. Wenn eine Restriktionsenzymerkennungssequenz nahe dem Ende des Primers vorgesehen ist, der hierbei verwendet wird, wie die Ncol-Stelle beim Primer CSA-67FN und die Nhel-Stelle beim Primer CSA+1RLAC, sind Konstruktion und Modifikation danach einfach. Die erhaltenen DNA-Fragmente werden mit Ncol verdaut und zwischen Ncol und Smal des Plasmids pTV118N (hergestellt von Takara Shuzo) insertiert, wodurch ein Plasmid pMM034 konstruiert werden kann.
  • Das erhaltene pMM034 wird an der Ncol-Stelle und der AfIIII-Stelle am pTV118N gespalten und die Endstellen unter Verwendung von Klenow-Fragmenten abgestumpft und es wird eine Selbstligation ausgeführt, worauf ein Plasmid pMM035, aus dem der lac-Promotor vom pTV118N entfernt ist, konstruiert werden kann.
  • Danach kann eine kodierende Sequenz für eine untranslierte 5'-Region von cspA mRNA downstream der lac-Operatorregion von pMM035 insertiert werden. Auf diese Weise wird eine PCR unter Verwendung des in Beispiel 1-(1) konstruierten pMM031F1 als Templat und unter Verwendung eines Primers CSA+20FN (die Basensequenz des Primers CSA+20FN ist in der SEQ ID NO:12 des Sequenzprotokolls gezeigt) und eines M13 Primers M4 (hergestellt von Takara Shuzo) durchgeführt, worauf es möglich ist, ein DNA-Fragment zu erhalten, das von der 19-ten Base downstream des Initiationspunkts der Transkription des cspA-Gens zur Multi-Cloning-Site (MCS) von pMM031F1 enthält. Das DNA-Fragment wird an der auf CSA+20FN angeordneten Nhel-Stelle und an der Xbal-Stelle an der Multi-Cloning-Site gespalten, und danach wird das Fragment zwischen Nhel-Xbal des schon vorbereiteten pMM035 in der Richtung insertiert, dass jede Stelle regeneriert wird, worauf pMM037 konstruiert werden kann.
  • Die Fähigkeit zur Kontrolle der Expression des gewünschten Proteins bei üblicher Temperatur (37°C) und Wirksamkeit der Expressionsfähigkeit des gewünschten Proteins bei niedriger Temperatur des resultierenden Plasmids pMM037 kann durch Einführen des Gens, das für das gewünschte Protein kodiert, an einer Multi-Cloning-Site von pTV118N am pMM037 geprüft werden.
  • Ein Expressionsplasmid mit einem Gen, das für das oben genannte endo-sulfatierte Fucose enthaltendes Polysaccharid abbauendes Enzym (Fdase 2) kodiert, kann von einem Plasmidvektor der pMM031-Serie ohne Operator nicht konstruiert werden. Jedoch kann das Plasmid pMFDA102, das ein Expressionsplasmid ist, das durch Insertion des genannten Gens in den Plasmidvektor pMM037 in der Weise konstruiert ist, dass der gleiche offene Leserahmen wie in der Sequenz, die für den N-terminalen Teil von CspA kodiert, erhalten wird, stabil in E. coli eines Stammes gehalten werden, der den lac-Repressor stark exprimiert, wie E. coli JM109. Auf diese Weise wurde geklärt, dass der oben genannte Plasmidvektor eine Fähigkeit für im Wesentlichen effektive Kontrolle der Expression besitzt.
  • Ferner wird die erhaltene Transformante bei gewöhnlicher Temperatur (37°C) inkubiert und wenn eine für die Induktion geeignete Trübung erreicht ist, wird die Inkubationstemperatur gesenkt, etwa auf 15°C, und gleichzeitig wird ein geeignetes Induktionsmittel, wie Isopropyl-β-D-thiogalactosid (nachfolgend als IPTG bezeichnet) in einer Endkonzentration von 1 mM hinzugegeben, gefolgt vom Inkubieren über eine geeignete Zeitdauer. Die aus der Kulturflüssigkeit erhaltenen Zellen wurden mittels der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) auf das darin exprimierte Protein analysiert, um die Banden des fusionierten Polypeptids zu erfassen, wodurch die Fähigkeit von pMM037 zum Exprimieren des gewünschten Proteins bei niedriger Temperatur bestätigt werden kann. Alternativ kann, wenn die erhaltenen Zellen einer Ultraschallbehandlung oder dergleichen unterzogen werden, um einen Zellextrakt herzustellen und eine physiologische Aktivität des gewünschten Proteins, das in dem Zellextrakt enthalten ist, gemessen wird, die Menge an gewünschtem Protein, das als aktiver Typ exprimiert wird, bestimmt werden. E. coli, die durch das oben genannte Plasmid pMFDA102 transformiert sind, exprimierten das aktive Fdase 2 Protein durch den obigen Induktionsvorgang.
  • Außerdem hält der cspA-Promotor noch eine Aktivität zum Initiieren der Transkription bei niedriger Temperatur, die dabei eine inhärente Funktion ist, trotz der Tatsache, dass bei der Konstruktion des obigen Plasmidvektors pMM037 der lac-Operator in eine Position (die Position +2 und danach) unmittelbar nach dem Initiationspunkt für die Transkription des cspA-Gens eingeführt wurde. Aus dieser Tatsache versteht es sich, dass der cspA-Promotor seine Funktion in der Region bis zum Initiationspunkt für die Transkription behält. Dementsprechend ist für die Funktion des cspA-Promotors die Region von der obigen Position –37 zum Initiationspunkt für die Transkription, oder mit anderen Worten, der Bereich der Basen mit den Nummern 425–461 in der Basensequenz des natürlichen cspA-Gens, das in SEQ ID NO:6 im Sequenzprotokoll gezeigt ist, ist essentiell. Die Basensequenz der essentiellen Region für den cspA-Promotor ist in SEQ ID NO:5 des Sequenzprotokolls gezeigt.
  • Der derart konstruierte Plasmidvektor pMM037 kann durch Einführung von Veränderungen, wie Deletion, Addition, Insertion und Substitution von Basen modifiziert werden und die Sache, bei der eine solche Veränderung in das Bestandteilselement der vorliegenden Erfindung eingeführt wird, liegt ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Nachfolgend werden Beispiele der Modifikation des Vektors der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von pMM037 als fundamen tale Struktur dargestellt, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden.
  • Zunächst kann eine Deletionsmutation in die Region eingeführt werden, die für 5'-UTR kodiert. Wie in Beispiel 3-(1) angegeben ist, ist es möglich, ein Plasmid zu konstruieren, bei dem eine SD-Sequenz des cspA-Gens unmittelbar nach der lac-Operatorregion von pmM037 eingesetzt ist, oder mit anderen Worten, ein Plasmidvektor pMM036, der für die auf pMM037 kodierte 5'-UTR kodiert, wie in SEQ ID NO:2 des Sequenzprotokolls gezeigt, wo der Teil mit den Basennummern 33-161 fehlt. Dieses pMM036 weist insgesamt die gleiche Struktur auf wie pMM037 mit der Ausnahme, dass die Deletionsmutation in eine Sequenz eingeführt ist, die für 5'-UTR kodiert.
  • Danach kann die Länge der Aminosäurereste des N-terminalen Teils von CspA zur Fusion mit dem zu exprimierenden Protein verändert werden. Wie in Beispiel 3-(2) gezeigt ist, wird eine Region, die für den N-terminalen Teil von CspA auf pMM037 kodiert, als gesamte Aminosäuresequenz kodierende Region verwendet (70 Aminosäurereste) und eine Multi-Cloning-Site wird danach angeordnet, wodurch es möglich ist, einen Plasmidvektor pMM038 zu konstruieren, wo das gewünschte Gen als fusioniertes Polypeptid mit 70 Aminosäureresten von CspA exprimiert wird. Dieses pMM038 weist insgesamt die gleiche Struktur auf wie pMM037 mit der Ausnahme, dass die Gesamtlänge der Sequenz, die für CspA kodiert, das als fusioniertes Polypeptid exprimiert wird, enthalten ist.
  • Es ist auch möglich, eine Substitutionsmutation in eine Sequenz einzuführen, die für 5'-UTR kodiert. Wie in Beispiel 3-(3) angegeben, ist es möglich, einen Plasmidvektor pMM047 zu konstruieren, bei dem eine Mutation durch Substitution mit 6 Basen in eine Region eingeführt wird, die +20 bis +26 entspricht, gezählt vom Initiationspunkt für die Transkription des natürlichen cspA-Gens in der Region, die auf pMM037 für 5'-UTR kodiert. Dieses pMM047 weist mit der Ausnahme obigen Substitutionsmutation insgesamt die gleiche Struktur auf wie pMM037. Dabei wurde E. coli JM109, das vom Plasmidvektor pMM047 transformiert ist, als Escherichia coli JM109/pMM047 benannt und bezeichnet und am 31. Oktober 1997 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Ministry of Internal Trade and Industry (1–3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan; Postleitzahl: 305-8566) als FERM P-16496 hinterlegt und beim gleichen Institut als FERM BP-6523 (Tag des Antrags auf Übertragung zur internationalen Hinterlegung am 24. September 1998) hinterlegt. Eine Basensequenz der 5'-UTR kodiert am Plasmidvektor pMM047 oder die vom Initiationspunkt für die Transkription zu der Base unmittelbar vor dem Initiationskodon für CspA ist in SEQ ID NO:3 des Sequenzprotokolls gezeigt.
  • Es ist auch möglich, dass zwei oder mehr solche Mutationen gleichzeitig eingeführt werden können. Wie in Beispiel 3-(4) gezeigt ist, ist es möglich, einen Plasmidvektor pMM048 zu konstruieren, bei dem ferner eine Deletionsmutation von 30 Basen in eine Sequenz eingeführt ist, die für die 5'-UTR des obigen Plasmids pMM047 kodiert. Dieses pMM048 weist insgesamt die gleiche Struktur auf wie pMM037 mit der Ausnahme, dass es eine 6-Basensubstitution wie pMM047 enthält und eine Deletion einer Region, die von +56 bis +85 entspricht, gezählt vom Initiationspunkt für die Transkription und das natürliche cspA-Gen oder mit anderen Worten, der Bereich, der für die Basen mit den Nummern 70-99 in der Basensequenz kodiert, die in SEQ ID NO:3 des Sequenzprotokolls gezeigt ist. Eine Basensequenz der 5'-UTR kodiert am Plasmidvektor pMM048 ist in SEQ ID NO:4 des Sequenzprotokolls gezeigt.
  • Aus der Tatsache, dass die oben genannten Plasmidvektoren pMM047 und pMM048 die Fähigkeit zur Expression von Protein bei niedriger Temperatur beibehalten, wird gezeigt, dass die in die 5'-UTR eingeführte Mutation, die beim cspA-Gen inhärent ist, bei der Konstruktion dieser beiden Gene die Funktion nicht beeinflusst. Deshalb wurde gezeigt, dass die Region auf 5'-UTR vom cspA-Gen für die Expression von Protein bei niedriger Temperatur wesentlich ist, die Regionen +27 bis +55 und +86 bis +159, gezählt vom Initiationspunkt für die Transkription des natürlichen cspA-Gens kodiert auf dem Plasmid pMM048 umfasst. Die Basensequenz der Region ist in SEQ ID NO:1 des Sequenzprotokolls gezeigt.
  • Die Fähigkeit zur Kontrolle der Expression des gewünschten Proteins bei üblicher Temperatur (37°C) und die Wirksamkeit der Expressionsfähigkeit für das gewünschte Protein bei niedriger Temperatur des modifizierten Plasmidvektors pMM037, d. h. pMM036, pMM038, pMM047 und pMM048 kann zum Beispiel unter Verwendung von 1-Galactosidasegen (lac-Z-Gen) bestimmt werden, das für die Bestimmung der Expressionsfähigkeit von Expressionsvektoren verwendet wird.
  • Daher werden, wie in Beispiel 3-(5) angegeben, DNA-Fragmente von ungefähr 6.2 kbp, die das lac-Z-Gen enthalten, erhalten von einem Plasmid pKM005 [Experimental Manipulation of Gene Expression, Seiten 15–32, herausgegeben von M. Inouye, veröffentlicht von Academic Press, New York, 1983], in den Plasmidvektor pMM037 und modifizierte Plasmide davon insertiert, worauf es möglich ist, einen fusionierten β-Galactosidaseexpressionsvektor zu konstruieren, bei dem 12 Aminosäurereste am N-Ende von CspA und 10 Aminosäurereste von der Multi-Cloning-Site am zehnten Aminosäurerest von β-Galactosidase angesetzt sind. Im Falle von PMM038, sind 70 Aminosäurereste am N-Ende von CspA und 9 Aminosäurereste vom Multi-Cloning-Site-Kode für die fusionierte β-Galactosidase mit dem zehnten Aminosäurerest von β-Galactosidase verbunden. Die erhaltenen Plasmide, die das lac-Z-Gen enthalten, werden Plasmid pMM037lac, pMM036lac, pMM038lac, pMM047lac bzw. pMM048lac genannt.
  • E. coli JM109, die von jedem der Plasmide transformiert sind, werden bei üblicher Temperatur (37°C) inkubiert und wenn die für die Induktion geeignete Trübung verfügbar ist, wird die Inkubationstemperatur zum Beispiel auf 15°C gesenkt und gleichzeitig ein geeignetes Induktionsmittel wie IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM hinzugegeben, dann wird die Inkubation über eine geeignete Zeitdauer fortgesetzt und die β-Galactosidaseaktivität in der erhaltenen inkubierten Lösung wird gemessen, wodurch die Fähigkeit zur Expression des Proteins bei niedriger Temperatur verglichen werden kann. Wenn die Zellen direkt vor der Induktion verwendet werden, kann die Menge im nicht induzierbaren Zustand bei 37°C ebenso verglichen werden.
  • Die β-Galactosidaseaktivität kann nach einem Verfahren gemessen werden, das in "Experiments in Molecular Genetics", Seiten 352–355, herausgegeben von J. H. Miller und veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laborstory im Jahr 1972 beschrieben ist.
  • Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, weist die β-Galactosidaseaktivität bei 37°C von durch irgendeines der Plasmide transformierten E. coli die gleiche Höhe auf wie bei pTV118lac, wo des lac-Z-Gen downstream des lac-Promotors eingeführt ist, der als Kontrolle verwendet wird, und es ist nun verständlich, dass die Expression bei 37°C effektiv kontrolliert wird. Die zu diesem Zeitpunkt nachgewiesene β-Galactosidaseaktivität bei 37°C ist in einer solchen Höhe, die etwas durch Lactose usw. induziert ist, die als Fremdstoff in LB-Medium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt und 0,5% NaCl, pH 7,0) vorliegt, das für die Inkubation verwendet wird.
  • Hingegen wurde bei E. coli, die durch irgendeines der Plasmide transformiert wurden, eine Zunahme der β-Galactosidaseaktivität bei einer Temperaturverschiebung zu 15°C und durch Zusatz eines Induktionsmittels beobachtet. Dies zeigt, dass jedes Plasmid eine Fähigkeit zur starken Expression des gewünschten Proteins bei niedriger Temperatur aufweist. Im Falle des Plasmids pMM036, bei dem der Großteil der 5'-UTR von cspA-Gen mRNA verloren ist, ist die Expressionsmenge an β-Galactosidase im Vergleich zu anderen Plasmiden gering.
  • Ferner zeigen die für pMM047lac und pMM048lac erhaltenen Ergebnisse, dass die bei 5'-UTR von mRNA eingeführte Mutation, für die diese Plasmide kodieren, die Expression von Protein bei niedriger Temperatur nicht nachteilig beeinflussen, oder dass die Region, wo diese Mutation nicht eingeführt ist, deren Basensequenz in SEQ ID NO:1 des Sequenzprotokolls gezeigt ist, für ihre Funktion wesentlich ist.
  • Darüber hinaus wurde die Expressionsmenge von β-Galactosidase bei jeder Temperatur für die Transformanten, die durch diese Plasmide transformiert wurden, geprüft und es wurde gefunden, dass alle Plasmide pMM038lac, pMM037lac und pMM047lac bei niedriger Temperatur von 10°C oder 15°C eine höhere Expressionsmenge zeigten, die bei einer Temperatur von 20°C zeigten die Expressionsmenge in gleicher Höhe und die bei einer Temperatur von 37°C zeigten die niedrigere Expressionsmenge im Vergleich zu pTV118Nlac (eine Kontrolle). Das Ergebnis zeigt, dass die 5'-UTR von mRNA, für die diese Plasmide kodieren, für die Expression von Protein bei Temperaturzuständen von 15°C oder weniger wirksam ist. Hingegen zeigte das Plasmid pMM048lac die höhere Expressionsmenge beim Temperaturzustand von 20°C oder weniger und zeigte eine ähnliche Expressionsmenge auch bei 37°C im Vergleich zu pTV118Nlac. Dies zeigt, dass als Folge der Mutation, die durch Einführung in pMM048 bedingt ist, das Plasmid eine starke Fähigkeit zur Expression von Protein sowohl bei üblicher wie bei niedriger Temperatur erworben hat.
  • Hingegen versteht es sich von selbst, dass beim Vektor der vorliegenden Erfindung die Region, die sich vom Bestandteilselement der vorlie genden Erfindung unterscheidet, verschiedene Funktionen aufweisen kann. Zum Beispiel kann der Vektor der vorliegenden Erfindung eine Multi-Cloning-Site enthalten, die im Wesentlichen kein Terminationskodon und einen Transkriptionsterminator zur Stabilisierung des Plasmids aufweist. Wie in Beispiel 4 angegeben, ist es möglich, eine Serie von Vektoren zu konstruieren, die jeder einen anderen offenen Leserahmen an einer Multi-Cloning-Site aufweisen, wo die Stelle, die ein Initiationskodon des cspA-Gens enthält, zur Ncol-Stelle oder Ndel-Stelle umgewandelt wird, eine Multi-Cloning-Site, die mit der Region verbindet, die für das N-Ende von CspA kodiert, in eine Sequenz verändert wird, die im Wesentlichen kein Terminationskodon enthält, wobei downstream dazu eine Sequenz vorliegt, bei der ein Terminationskodon in jedem der drei offenen Leserahmen erscheint und ferner downstream eine Transkriptionsterminatorregion vom cspA-Gen enthält. Ein Plasmid, das pMM047 als fundamentales Gerüst enthält, wird als Plasmid der pCold01NC-Serie (mit der Ncol-Stelle) oder pCold01ND-Serie (mit der Ndel-Stelle) bezeichnet, während ein Plasmid, das pMM048 als fundamentales Gerüst enthält, als Plasmid der pCold02NC-Serie oder pCold02ND-Serie bezeichnet wird. In einer solche Serie von Plasmiden mit einer Multi-Cloning-Site, wo im Wesentlichen kein Terminationskodon enthalten ist und jeder offene Leserahmen anders ist, ist eine Insertion von Fremdgen einfach, wodurch ein Expressionsvektor leicht konstruiert werden kann.
  • Die Tatsache, dass diese Plasmide der pCold01-Serie und pCol02-Serie ähnliche Expressionseigenschaften aufweisen wie ihre fundamentalen Gerüste, d. h. Plasmid pMM047 bzw. pMM048, kann unter Verwendung des lac-Z-Gens bestimmt werden. Wie in Tabelle 5 gezeigt ist, zeigen E. coli, die durch ein Plasmid transformiert sind, das durch eine Insertion des lac-Z-Gens in das schon genannte Plasmid hergestellt ist, ein ähnliches Expressionsmuster für β-Galactosidase, wie E. coli, die durch pMM047lac oder pMM048lac transformiert sind, wie in Tabelle 1 gezeigt, und es wird gezeigt, dass das oben genannte Plasmid die ähnliche Expressionsfähigkeit wie das Plasmid pMM047 bzw. pMM048 behält.
  • Da alle Vektoren der vorliegenden Erfindung, die oben spezifisch als Beispiel angeführt sind, den lac-Operator als Operator verwenden, ist es notwendig, einen Stamm von E. coli zu verwenden, der eine hohe Menge an lac-Repressor exprimiert (lac-Iq-Stamm), wie E. coli JM109, wenn die Expression von Gen das Ziel ist. Andere Operatoren können als Vektor der vorliegenden Erfindung verwendet werden und in diesem Fall ist es selbstverständlich, dass ein für den genannten Operator geeignetes Kontrollverfahren verwendet wird. Ferner ist es für die Fachleute ersichtlich, dass selbst wenn ein lac-Operator verwendet wird, wie im Falle des obigen Plasmids der pCold-Serie, eine Einschränkung für den Wirt durch die Einführung eines lac-Repressorgens (lac-I-Gen) an diesem Plasmid nichtig gemacht werden kann.
  • Zum Beispiel ist es möglich, wie in Beispiel 5 angegeben, pCold03-Serien und pCold04-Serien zu konstruieren, die das lac-I-Gen enthalten. Jedes dieser Plasmide weist insgesamt die gleiche Struktur auf wie die pCold01-Serie bzw. die pCold02-Serie, aber mit der Ausnahme, dass das lac-I-Gen darin enthalten ist. Es ist auch möglich, gleichermaßen ein Plasmid unter Verwendung des lac-Iq-Gens, das ein Gen ist, das eine hohe Menge an lac-Repressor exprimiert, anstelle des lac-I-Gens zu konstruieren, wie die Plasmide der pCold05-Serie und der pCold06-Serie.
  • Die Fähigkeit zur Kontrolle der Expression des gewünschten Proteins der Plasmide, die das lac-I-Gen oder das lac-Iq-Gen enthalten, die derart konstruiert sind und ebenso die Effektivität der Fähigkeit zur Expression des gewünschten Proteins bei niedrigen Temperaturen kann leicht durch Insertion des lac-Z-Gens in diese Plasmide und unter Verwendung von E. coli DH5 α ohne lac-Iq–Gen als Wirt bestimmt werden. Tabelle 6 zeigt die Wirkung von lac-I- und lac-Iq-Genen. Bei 37°C, was ein nicht induzierbarer Zustand ist, ist die Expression im Falle von pCold01NC2lac ohne lac-I-Gen nicht vollständig kontrolliert und es wird eine hohe β-Galactosidaseaktivität festgestellt. Im Falle von pCold02 (einem Derivat von pMM048) mit einer höheren Expressionsfähigkeit als pCold01 bei 37°C wird unter Verwendung von E. coli DH5 α als Wirt keine Transformante erhalten. Hingegen wird im Falle von pCold03NC2lac und pCold04NC2lac mit dem lac-I-Gen die Expression bei 37°C effektiv kontrolliert und ferner ist im Falle von pCold05NC2lac und pCold06NC2lac, bei denen das lac-Iq-Gen vorliegt, die Expression effektiver unterdrückt, wodurch eine wirksame Kontrolle erreicht werden kann. Außerdem gibt es bei diesen Plasmiden keine wesentliche Veränderung bezüglich einer Expressionsfähigkeit für das gewünschte Protein in einem induzierbaren Zustand. Deshalb wird gezeigt, dass wenn das lac-I-Gen oder das lac-Iq-Gen in den Vektor der vorliegenden Erfindung eingeführt wird, der den lac-Operator als Bestandteilselement enthält, gibt es keine Einschränkung für den Wirt, ungeachtet, ob ein lac-Repressor vorhanden ist oder nicht.
  • Es ist auch möglich, dass um die Expressionseffizienz des gewünschten Gens zu verbessern, eine Basensequenz (Downstream-Boxsequenz) mit einer hohen Komplementarität zur Antidownstream-Boxsequenz in 16S Ribosomen-RNA in den Vektor der vorliegenden Erfindung eingeführt wird. Die in der Region vorhandene Downstream-Boxsequenz, die für den N-terminalen Teil von E. coli CspA kodiert, weist nur 67% der Komplementarität zur oben genannten Antidownstream-Boxsequenz auf. Wenn diese in eine Basensequenz mit einer höheren Komplementarität oder bevorzugt 80% oder mehr Komplementarität überführt wird, ist es möglich, dass das Gen, das mit dem Downstream verbunden ist, in höherer Effizienz exprimiert wird.
  • Ferner kann eine Basensequenz, die für eine Tag-Sequenz kodiert, die ein Peptid ist, das die Reinigung des exprimierten gewünschten Genprodukts erleichtert, oder eine Aminosäuresequenz zur Proteaseerkennung, die zur Entfernung eines überschüssigen Peptids im gewünschten Genprodukt einsetzbar ist, wie eine Tag-Sequenz, in den Vektor der vorliegenden Erfindung eingeführt werden.
  • In Hinblick auf die Tag-Sequenz für die Reinigung kann ein Histidin-Tag, das aus verschiedenen Histidinresten besteht, Maltose gebundenes Protein, Glutathion-S-transferase usw. verwendet werden. Ein Protein, dem ein Histidin-Tag angefügt ist, kann leicht unter Verwendung einer Chelatierungssäule gereinigt werden, und in Hinblick auf die anderen Tags, können diese unter Verwendung eines Liganden mit einer spezifischen Affinität dazu ebenso leicht gereinigt werden. Beispiele der Protease, die zur Entfernung eines überschüssigen Peptids verwendet werden, sind Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase und es ist möglich, eine Basensequenz in den Vektor der vorliegenden Erfindung einzuführen, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die spezifisch durch diese Proteasen gespalten werden.
  • Zum Beispiel wird in Beispiel 6 ein Plasmid (pCold07-Serie und pCold08-Serie) angegeben, in das eine Downstream-Boxsequenz eingeführt wird, die zur Antidownstream-Sequenz vollständig komplementär ist, die in 16S Ribosomen-RNA vorliegt und eine Basensequenz, die für eine Erkennungsaminosäuresequenz von Faktor Xa und Histidin-Tag kodiert, die aus sechs Histidinresten besteht. Wenn die Proteinexpressionsfähigkeit des genannten Plasmids unter Verwendung des lac-Z-Gens bestimmt wird, zeigt sich, dass die exprimierte β-Galactosidaseaktivität im Vergleich zu einem Plasmid, das eine Downstream-Boxsequenz aufweist, die eine geringe Komplementarität zeigt, signifikant erhöht ist. Außerdem, obwohl die exprimierte Menge an β-Galactosidase vor einer Induktion mehr oder weniger zunimmt, liegt dies in einem zulässigen Be reich, und wie oben erwähnt, kann sie durch Verändern des lac-I-Gens bei diesen Plasmiden in das lac-Iq-Gen effektiv unterdrückt werden.
  • Wenn die pCold07-Serie oder pCold08-Serie verwendet werden, wird das gewünschte Protein als fusioniertes Protein mit einem Peptid, das an einer Downstream-Boxsequenz kodiert ist, Histidin-Tag und einem Leaderpeptid, das die Erkennungsaminosäuresequenz des Faktors Xa enthält, exprimiert. Da das fusionierte Protein ein Histidin-Tag enthält, kann es unter Verwendung einer Chelatierungssäule in einem einzigen Schritt gereinigt werden. Danach wird das genannte Protein mit einem Faktor Xa behandelt, um das Leaderpeptid vom gewünschten Peptid abzuspalten und dann erneut durch eine Chelatierungssäule geschickt, worauf nur das gewünschte Protein erhalten werden kann, aus dem das Leaderpeptid entfernt ist.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele weiter erläutert, obwohl die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist.
  • Bei den in dieser Beschreibung angegebenen Verfahrensweisen wurden die fundamentalen Verfahren, wie die Herstellung von Plasmid und Verdauung mit Restriktionsenzym gemäß den in "Molecular Cloning: A Laborstory Manual", 2. Ausgabe, herausgegeben von T. Maniatis, et al., veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laborstory, 1989 beschriebenen Vorgehensweisen durchgeführt. Ferner wurden beim Konstruieren der folgenden Plasmide E. coli JM109 als Wirt verwendet und eine aerobe Inkubation wurde bei 37°C durchgeführt unter Verwendung von LB-Medium (1% Trypsin, 0,5% Hefe und 0,5% NaCl; pH 7,0), das 100 μg/ml Ampicillin enthält, oder LB-Medium, das durch Zusatz von 1,5% Agar verfestigt wurde, sofern nichts anderes angegeben ist.
  • Beispiel 1.
  • Konstruktion von bei niedriger Temperatur induzierbarem Vektor der pMM031-Serie und Untersuchung der Induktionsfähigkeit
  • (1) Konstruktion der Plasmidvektoren pMM031 und pMM031F1.
  • Eine PCR wurde unter Verwendung eines Plasmids pJJG02, das ein cspA-Gen enthält [J. Bacteriol., Band 178, Seiten 4919–4925 (1996)], als Templat und unter Verwendung von synthetischen Primern CSA-67FN und CSA13R (die Basensequenzen der Primer CSA-67FN und CSA13R sind in SEQ ID NO:7 bzw. NO:8 des Sequenzprotokolls angegeben) so durchgeführt, dass DNA-Fragmente erhalten werden, die bis zur Region, die für den 13-ten Aminosäurerest kodiert, von einem Promotor des cspA-Gens enthalten. Die DNA-Fragmente werden an den Ncol- und EcoRI-Stellen gespalten, die auf jedem der oben genannten Primer angeordnet sind, und dann in den Bereich zwischen Ncol und EcoRI eines Plasmids pTV118N (hergestellt von Takara Shuzo) insertiert, so dass ein Plasmid pMM030 konstruiert wird. Danach wird das Plasmid mit Ncol (hergestellt von Takara Shuzo) und AfIIII (hergestellt von NEB) verdaut, das Ende unter Verwendung von Klenow-Fragment (hergestellt von Takara Shuzo) abgestumpft und es wird eine Selbstligation ausgeführt, so dass ein Plasmid pMM031 erhalten wird, aus dem der von pTV118N gewonnene lac-Promotor entfernt ist. Das Plasmid pMM031 ist ein Plasmidvektor mit einer Multi-Cloning-Site von EcoRI-HindIII von pTV118N downstream der Promotorregion (67 Basen) des cspA-Gens, der untranslierten 5'-Region (159 Basen) und der Region (39 Basen), die für von der N-Endstelle von CspA zum 13-ten Aminosäurerest kodiert.
  • Danach wird zum Verschieben des offenen Leserahmens beginnend vom Initiationskodon des cspA-Gens auf pMM031 zur Multi-Cloning-Site, ein Plasmidvektor pMM031F1, bei dem eine Base vom 3'-Ende der Region, die für den N-terminalen Teil von CspA kodiert, deletiert ist, in pMM031 insertiert konstruiert. Das Plasmid pMM031F1 wurde nach insgesamt dem gleichen Verfahren konstruiert wie bei der Konstruktion von pMM031 mit der Ausnahme, dass ein Primer CSA13R2 (die Basensequenz des Primers CSA13R2 ist in SEQ ID NO:9 des Sequenzprotokolls gezeigt) anstelle des Primers CSA13R verwendet wird. Dementsprechend weist das erhaltene Plasmid die gleiche Struktur auf wie pMM031 mit der Ausnahme, dass das 3'-Ende eine Base weniger in der Kodierregion der N-terminalen Region von CspA auf pMM031 aufweist. Aufgrund einer solchen Deletion einer Base wird der 13-te Aminosäurerest vom N-Ende von CspA, das auf das Plasmid pMM031F1 kodiert ist, von Asparagin zu Lysin verändert.
  • (2) Untersuchung der Induktionsfähigkeit eines bei niedriger Temperatur induzierbaren Vektors der pMM031-Serie unter Verwendung des Gens, das für die Umkehrtranskriptase vom Rous-assoziierten Virus 2 (RAV-2) kodiert.
  • Ein Plasmid pT8RAV, das das Gen enthält, das für eine Umkehrtranskriptase vom Rous-assoziierten Virus 2 (RAV-2) kodiert, wurde aus Escherichia coli JM109/pT8RAV (FERM P-13716) hergestellt, das in der japanischen Patentoffenlegungsschrift Hei-07/039,378 beschrieben ist. Das Plasmid wird mit EcoRI und Sall (beide hergestellt von Takara Shizo) verdaut, so dass das Gen erhalten wird, das für die obige Umkehrtranskriptase kodiert, und DNA-Fragmente, die eine Transkriptionsterminationssequenz downstream enthalten. Das DNA-Fragment wird in den Bereich zwischen EcoRI und Sall vom in (1) erhaltenen pMM031F1 insertiert, so dass ein Plasmid pMM031RAV konstruiert wird.
  • E. coli JM109 (hergestellt von Takara Shuzo) wurden unter Verwendung von pMM031RAV und pMM031 transformiert, so dass Kolonien jeder der Transformanten auf einer LB-Platte gebildet werden, die 100 μg/ml Ampicillin enthält, worauf festgestellt wurde, dass die Kolonien von E. coli, die von pMM031RAV transformiert wurden, deutlich kleiner sind als die Kolonien der Transformante mit pMM031. Dann wurde jede der erhaltenen Transformanten auf LB-Medium aufgetragen, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, und aerob eine Nacht bei 37°C inkubiert. Jeweils zwei Röhrchen der inkubierten Flüssigkeit wurden auf 5 ml des frisch bereiteten gleichen Mediums bei einer Konzentration von 1% aufgebracht, aerob bei 37°C inkubiert und als die Trübung OD600 = 0,6 erreichte, wurde die Inkubationstemperatur des einen davon auf 15°C gebracht und die Inkubation weitere 20 Stunden durchgeführt. Während der Inkubation betrug die benötigte Inkubationszeit bis zum Auftreten der induzierten Trübung bei der Transformante von pMM031RAV ungefähr doppelt so lang wie im Falle der Transformante von pMM031. Nach Beendigung der Inkubation wurde die inkubierte Flüssigkeit zentrifugiert, so dass die Zellen gesammelt wurden und die Zellen wurden mittels einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Das Ergebnis zeigt, dass nur mit der bei 15°C inkubierten Transformante von pMM031RAV ein Band beobachtet wird, von dem angenommen wird, dass es eine Umkehrtranskriptase mit einem Molekulargewicht von ungefähr 100,000 ist, wodurch bestätigt wurde, dass das Proteinexpressionssystem, das von cspA auf pMM031 gewonnen ist, ein bei niedriger Temperatur induzierbarer Typ ist.
  • Danach wurde ein Extrakt von E. coli hergestellt und seine Umkehrtranskriptaseaktivität gemessen. Dazu wurden E. coli JM109 transformiert mit pMM031RAV auf LB-Medium aufgetragen, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, und aerob bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Kulturflüssigkeit wurde bei einer Konzentration von 4% auf 100 ml des gleichen frisch bereiteten Medium aufgebracht und aerob bei 37°C inkubiert, wobei die Inkubationstemperatur auf 15°C gesenkt wurde, als die Trübung OD600 = 0,6 erreicht hatte und die Inkubation weitere 5 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung der Inkubation wurde die inkubierte Flüssigkeit zentrifugiert, so dass die Zellen gesammelt wurden und die Zellen wurden in 4,7 ml eines Lysepuffers suspendiert [50 mM Trishydrochlorid (pH 8,3), 60 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM DTT und 5 μM 4-Aminodiphenylmethansulfonylfluoridhydrochlorid], so dass die Zellen mittels Ultraschallbehandlung zerstört werden. Es wurde zentrifugiert und die Überstandsflüssigkeit aufgenommen, worauf ein Extrakt von E. coli erhalten wurde. Der Extrakt wurde unter Verwendung einer Verdünnungslösung für Enzyme [50 mM Trishydrochlorid (pH 8,3), 10% Glycerin, 0,1% NF-40 und 2 mM DTT] auf das 10-fache verdünnt und die Aktivität der Umkehrtranskriptase nach dem Verfahren gemessen, das in der japanischen Patentoffenlegungsschrift Hei-07/039,378 beschrieben ist, worauf insgesamt 1061 Einheiten Umkehrtranskriptaseaktivität erfasst wurden. Dies zeigt, dass 10 Einheiten Umkehrtranskriptaseaktivität pro ml der Kulturflüssigkeit exprimiert wurden, wodurch nun ersichtlich ist, dass die Expressionsmenge von pMM031 bei niedriger Temperatur hoch ist.
  • (3) Klonen des Gens des endo-sulfatierte Fucose enthaltendes Polysaccharid abbauenden Enzyms (Fdase 2) unter Verwendung der pMM031-Serie des bei niedriger Temperatur induzierbaren Vektors.
  • Es wurde ein Plasmid nach einem herkömmlichen Verfahren aus E. coli JM109/pSFDA7 (FERM BP-6340) hergestellt, in die ein Plasmid pSFDA7, das das Gen enthält, das für ein endo-sulfatierte Fucose enthaltendes Polysaccharid abbauendes Enzym kodiert, (ORF-2; nachfolgend als Fdase 2 bezeichnet; eine Basensequenz des Gens, das für das Enzym kodiert, ist in SEQ ID NO:10 des Sequenzprotokolls gezeigt) von Alteromonas Spezies SN-1009. Das erhaltene pSFDA7 wurde mit HindIII (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, mittels einer 1% Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und DNA-Fragmente von ungefähr 4,8 kb, die für die C-terminale Region von Fdase 2 kodieren, ausgeschnitten, extrahiert und gereinigt. Das DNA-Fragment wurde in die HindIII-Stelle von pMM031 derart insertiert, dass die Richtungen von cspA-Promotor und Fdase 2-Gen gleich sind, worauf pMM031-Fdase 2C hergestellt wurde. Dann wurde pSFDA7 mit SnaBI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, worauf DNA-Fragmente von ungefähr 2,5 kb, die eine Region enthalten, die für den Bereich vom 4-ten Aminosäurerest bis zur C-terminalen Aminosäure von Fdase 2 kodieren, isoliert. Das DNA-Fragment wurde in einen Bereich zwischen Smal und SnaBI des zuvor hergestellten pMM031-Fdase 2C insertiert und es wurde versucht, einen fusioniertes Polypeptid exprimierenden Vektor zu konstruieren, bei dem der 4-te Aminosäurerest und danach von Fdase 2 mit dem gleichen offenen Leserahmen verbunden sind wie die N-terminale Sequenz von CspA auf pMM031. Als jedoch die Plasmide extrahiert, gereinigt und auf die 26 erhaltenen Transformanten analysiert wurden, zeigte sich, dass SnaBI-Fragmente von ungefähr 2,5 kb in 21 Plasmide insertiert waren und nur bei zweien davon waren die Fragmente in eine korrekte Richtung insertiert. Ferner wurden die beiden Plasmide einer Analyse der Basensequenz des verbundenen Teils unterzogen, worauf gefunden wurde, dass aufgrund einer Deletion einer Base am gespaltenen Teil von Smal, offene Leserahmen von CspA und Fdase2 verschoben wurden und sie nicht in den Plasmiden vorhanden sind, die in der Lage sind, das gewünschte fusionierte Polypeptid zu exprimieren.
  • Beim obigen Konstruktionsverfahren weisen die zu insertierenden DNA-Fragmente stumpfe Enden auf und sie werden sowohl in normale wie in umgekehrte Richtung insertiert. Deshalb wurde die Konstruktion eines fusioniertes Polypeptid exprimierenden Vektors nach anderen Verfahrensweisen versucht. Daher wurden DNA-Fragmente von ungefähr 1 kb, die für ungefähr eine Hälfte der Aminosäurereste der 4-ten und nachfolgenden von Fdase 2 kodieren, erhalten durch Verdauung des Plasmids pSFDA7 mit SnaBI und Xbal (beide hergestellt von Takara Shuzo) isoliert. Die DNA-Fragmente wurden an einen Ort zwischen Smal und Xbal von pMM031-Fdase 2C insertiert, das oben erhalten wurde, wodurch Konstruktion des obigen fusioniertes Polypeptid exprimierenden Plas mids versucht wurde. Als jedoch aus den erhaltenen 12 Transformanten Plasmide extrahiert, gereinigt und analysiert wurden, waren nur 3 Plasmide vorhanden, bei denen die obigen DNA-Fragmente von ungefähr 1 kb insertiert waren. Ferner lehrte das Ergebnis ihrer Basensequenzanalyse, dass eine Deletion von 1–2 Basen am gespaltenen Teil von Smal stattgefunden hat, wie es vorhergesagt war, wodurch kein Plasmid erhalten wurde, das in der Lage ist, das gewünschte fusionierte Polypeptid zu exprimieren. Aus dem obigen ist nun ersichtlich, dass der Grund, weshalb kein Expressionsplasmid konstruiert wurde, darin liegt, dass im Falle des Gens, das das Wachstum von Zellen stark beeinflusst, wie das exprimierte Produkt von Fdase 2, die Funktion des cspA-Promotors bei 37°C nicht richtig unterdrückt ist, wodurch das kodierte Genprodukt downstream exprimiert wird.
  • Beispiel 2. Konstruktion des bei niedriger Temperatur induzierbaren Vektors pMM037 und Untersuchung der Induktionsfähigkeit
  • (1) Konstruktion des Plasmidvektors pMM037
  • Zum Einführen einer lac-Operatorregion downstream des cspA-Promotors, wurde ein Primer CSA+1RLAC (die Basensequenz des Primers CSA+1RLAC ist in SEQ ID NO:11 des Sequenzprotokolls gezeigt) aufgebaut und synthetisiert. Das 5'-Ende von CSA+1RLAC wurde mit dem Megalabel Kit (hergestellt von Takara Shuzo) phosphoryliert und eine PCR unter Verwendung des Plasmids pJJG01 als Templat zusammen mit dem obigen Primer CSA-67FN durchgeführt, worauf ein DNA-Fragment, bei dem die lac-Operatorregion downstream vom Promotor des cspA-Gens angeordnet ist, erhalten wurde. Das DNA-Fragment wurde mit Ncol (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut und in einem Bereich zwischen die Stellen Ncol und Smal des Plasmids pTV118N (hergestellt von Takara Shuzo) insertiert, wodurch pMM034 konstruiert wurde. Das genannte Plasmid wurde mit Ncol und AfIIII verdaut, die Endstelle unter Verwendung von Klenow-Fragment abgestumpft und eine Selbstligation ausgeführt, worauf sich ein Plasmid pMM035 ergibt, aus dem der lac-Promotor vom pTV118N entfernt ist.
  • Danach wurde unter Verwendung des in Beispiel 1-(1) erhaltenen Plasmidvektors pMM031F1 und unter Verwendung von Primer CSA+20FN (die Basensequenz des Primers CSA+20FN ist in SEQ ID NO:12 des Sequenzprotokolls gezeigt) und M13 Primer M4 (hergestellt von Takara Shuzo) eine PCR durchgeführt, so dass ein DNA-Fragment erhalten wird, das von der 19-ten Base downstream des Initiationspunkts der Transkription des cspA-Gens auf dem Plasmidvektor bis zur Multi-Cloning-Site von pMM031F1 enthält. Das DNA-Fragment wurde von der Nhel-Stelle, die auf dem Primer CSA+20FN angeordnet ist, und Xbal auf der Multi-Cloning-Site gespalten und zwischen den Bereich der Nhel- und Xbal-Stellen des zuvor hergestellten pMM035 in der Weise insertiert, dass jede Stelle erzeugt wird, worauf ein Plasmidvektor pMM037 konstruiert wurde. Dieses pMM037 ist ein Plasmid mit Multi-Cloning-Sites von EcoRI-HindIII aus pTV118N downstream einer Promotorregion (67 Basen) des cspA-Gens, Transkriptionsinitiationsbase (eine Base), untranslierte 5'-Region (31 Basen) vom lac-Operator, untranslierte 5'-Region (141 Basen) vom cspA und Kodierregion (38 Basen) vom N-terminalen Bereich von CspA. Die Basensequenz von 5'-UTR kodiert auf dem Plasmidvektor pMM037 oder die Basen vom Initiationspunkt der Transkription bis unmittelbar vor dem CspA-Initiationskodon ist in SEQ ID NO:2 gezeigt.
  • (2) Untersuchung der Induktionsfähigkeit eines bei niedriger Temperatur induzierbaren Vektors pMM037 unter Verwendung eines Gens, das für ein endo-sulfatierte Fucose enthaltendes Polysaccharid abbauendes Enzym (Fdase 2) kodiert.
  • Fdase 2 Expressionsplasmid wurde unter Verwendung eines Plasmidvektors pMM037 auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1-(3) konstruiert. Dabei wurde das in Beispiel 1-(3) erhaltene Plasmid pSFDA7 mit SnaBI verdaut, um ein SnaBI-Fragment von ungefähr 2,5 kb zu isolieren, das eine Region enthält, die für einen Bereich vom 4-ten Aminosäurerest zur C-terminalen Aminosäure von Fdase 2 kodiert. Das DNA-Fragment wurde in die BamHI-Stelle auf dem in (1) konstruierten Plasmidvektor pMM037 insertiert, mit Klenow-Fragment abgestumpt, wodurch versucht wurde, einen Expressionsvektor für fusioniertes Polypeptid zu konstruieren, bei dem der 4-te Aminosäurerest und danach von Fdase 2 mit dem gleichen offenen Leserahmen verbunden ist wie die N-terminale Sequenz von CspA beim pMM037. Plasmide wurden aus den sechs erhaltenen Transformanten extrahiert, gereinigt und analysiert, worauf gefunden wurde, dass SnaBI-Fragmente von ungefähr 2,5 kb in zweien davon in einer korrekten Richtung insertiert sind. Als eine Basensequenz von einem davon analysiert wurde, wurde bestätigt, dass es ein Expressionsvektor für fusioniertes Polypeptid ist, bei dem offene Leserahmen von CspA und Fdase2 wie gewünscht gleich sind. Das so hergestellte Plasmid wurde als Plasmid pMFDA102 bezeichnet.
  • E. coli JM109 wurden mit pMFDA102 oder pMM037 transformiert. Zu diesem Zeitpunkt gibt es keinen Unterschied in der Größe der Kolonien bei den beiden auf der Platte gebildeten Transformanten. Jede der erhaltenen Transformanten wurde in LB-Medium überführt, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, und eine Nacht bei 37°C aerob inkubiert. Jeweils zwei Röhrchen der Kulturflüssigkeit wurden in einer Menge von jeweils 1% in 5 ml frisch bereitetes Medium platziert, aerob bei 37°C inkubiert, IPTG hinzugegeben, so dass eine Endkonzentration von 1 mM erreicht wird, wenn die Trübung OD600 = 0,6 erreicht und nachdem bei einem davon die Inkubationstemperatur auf 15°C gesetzt wurde, die Inkubation weitere 4 Stunden fortgesetzt. Bei der Inkubation war die Wachstumsrate bei beiden Transformanten vor der Inkubation nahezu gleich. Nach Be endigung der Inkubation wurde die Kulturflüssigkeit zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln und die Zellen wurden in 1 ml eines Lysepuffers für Zellen suspendiert [20 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), 10 mM CaCl2, 10 mM KCl und 0,3 M NaCl] und mittels Ultraschallbehandlung zerstört. Sie wurden zentrifugiert, um Überstandsflüssigkeit aufzunehmen, worauf Extrakte von E. coli erhalten wurden. Die Extrakte von E. coli wurden mittels einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert, eine Bande, die vermutlich das fusionierte Polypeptid von CspA-Fdase 2 mit einem Molekulargewicht von ungefähr 90.000 ist, wurde nur bei der Transformante mit pMFDA102 beobachtet, die bei 15°C inkubiert wurde. Aus dem obigen Ergebnis zeigt sich, dass ein bei niedriger Temperatur induzierbarer Expressionsvektor, der in Lage ist, Expressionsplasmide zu konstruieren, konstruiert wurde, sogar für das Gen wie Fdase 2, bei dem das Expressionsprodukt das Wachstum der Zellen stark beeinflusst.
  • Dann wurde die Abbauaktivität des obigen Extrakts von E. coli für ein endo-sulfatierte Fucose enthaltendes Polysaccharid durch die folgende Verfahrensweise unter Verwendung des sulfatierte Fucose enthaltenden Polysaccharids-F als Substrat, das nach dem in WO 97/26896 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, gemessen.
  • Dann wurden 12 μl einer 2,5% Lösung von sulfatierte Fucose enthaltendem Polysaccharid-F, 6 ml 1 M CaCl2-Lösung, 9 μl 4 M NaCl-Lösung 60 μl eines Puffers (pH 7,5), der 50 mM Essigsäure, Imidazol und Trishydrochlorid enthält, 21 μl Wasser und 12 μl Extrakt von E. coli, der in geeigneter Weise mit dem Puffer für die Zelllyse verdünnt ist, vermischt und die Mischung bei 30°C 3 Stunden lang umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde bei 100°C 10 Minuten lang behandelt und zentrifugiert und 100 μl drs erhaltenen Überstandsflüssigkeit mittels einer HPLC analysiert, wobei eine Gelfiltrationssäule verwendet wurde, wodurch ein mittleres Molekulargewicht des Substrats mit sulfatierte Fucose enthalten den Polysaccharid-F mit dem des Reaktionsprodukts verglichen wurde. Als Kontrollen wurden ein Produkt, das durch die Reaktion von Zelllysepuffer ohne Extrakt von E. coli unter den gleichen Bedingungen und ein Reaktionsprodukt unter Verwendung von Wasser anstelle der Lösung von sulfatierte Fucose enthaltendem Polysaccharid-F hergestellt, und dann wurde jedes auf gleiche Weise mittels einer HPLC analysiert.
  • Die Menge an Enzym, mit dem die Fucosylbindungen in 1 μmol des sulfatierte Fucose enthaltenden Polysaccharid-F in einer Minute gespalten werden können, wird als eine Einheit U angenommen. Die auf diese Weise gespaltenen Fucosylbindungen werden gemäß der folgenden Gleichung berechnet: Aktivität (U/ml) = {(12 × 2,5)/(100 × MF)} × {(MF/M) – 1} × {1/(180 × 0,01)} × 1000
    • (12 × 2,5)/100 × MF:
    dem Reaktionssystem zugegebenes sulfatierte Fucose enthaltendes Polysaccharid-F (mg)
    MF:
    mittleres Molekulargewicht des Substrats (sulfatierte Fucose enthaltendes Polysaccharid-F)
    M:
    mittleres Molekulargewicht des Reaktionsprodukts
    MF/M) – 1:
    Anzahl Spaltungen durch Enzym in einem Molekül des sulfatierte Fucose enthaltenden Polysaccharid-F
    180:
    Reaktionszeit (Minuten) und
    0,01:
    Volumen (ml) an Enzymlösung.
  • Die HPLC wird unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
    Gerät Modell L-6200 (hergestellt von Hitachi, Ltd.)
    Säule OHpak SB-806 (8 mm × 300 mm, hergestellt von Showa Denko K. K.)
    Elutionsmittel 25 mM Imidazolpuffer (pH 8) mit 5 mM NaN3, 25 mM CaCl2 und 50 mM NaCl
    Detektion Differential Refraktometerdetektor (Shodex RI-71, hergestellt von Showa Denko K. K.)
    Strömungsrate 1 ml/Minute
    Säulentemperatur 25°C.
  • Zur Messung des mittleren Molekulargewichts des Reaktionsprodukts wird handelsübliches Pullulan mit einem bekannten Molekulargewicht (STANDARD P-82, hergestellt von Showa Denko K. K.) durch HPLC unter denselben Bedingungen wie oben beschrieben analysiert. Dann wird eine Kurve erstellt, die die Beziehung zwischen dem Molekulargewicht von Pullulan und der Retentionszeit auf OHpak SB-806 zeigt, und als Standardkurve zur Bestimmung des Molekulargewichts des oben genannten enzymatischen Reaktionsprodukts verwendet. Das Ergebnis zeigt, dass eine deutliche Abbauaktivität des Endotyps für das sulfatierte Fucose enthaltende Polysaccharid nur im Extrakt der Transformante mit pMFDA102, die bei 15°C inkubiert wurde, gefunden wird und dass die Abbauaktivität des Endotyps für das sulfatierte Fucose enthaltende Polysaccharid 42,6 mU/ml beträgt. Aus dem obigen wurde gezeigt, dass pMM037 in der Lage ist, das gewünschte Protein in einem aktiven Typ unter Bedingungen niedriger Temperatur zu exprimieren.
  • Beispiel 3
  • Modifikation des bei niedriger Temperatur induzierbaren Vektors pMM037 und Untersuchung der Induktionsfähigkeit
  • (1) Konstruktion des Plasmidvektors pMM036
  • Es wurde eine PCR unter Verwendung des Plasmids pJJJG21 [Mol. Biol., Band 23, Seiten 355–364 (1997)], das cspA-Gen enthält, bei dem eine Xbal-Stelle upstream der SD-Sequenz eingeführt ist, als Templat und unter Verwendung der Primer CSA+20FN und CSA13R2 durchgeführt und das erhaltene amplifizierte DNA-Fragment wurde mit Xbal und EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, so dass ein DNA-Fragment erhalten wurde, das eine Region enthält, die von der SD-Sequenz zum 13-ten Aminosäurerest des cspA-Gens kodiert. Das DNA-Fragment wurde in einen Bereich zwischen Nhel und EcoRI des in Beispiel 2-(1) erhaltenen Plasmidvektors pMM037 insertiert, so dass ein Plasmidvektor pMM036 konstruiert wurde. Dieser pMM036 weist die gleiche Struktur auf wie das Plasmid pMM037 mit der Ausnahme, dass eine Sequenz der Basen mit den Nummern 33-161 aus der Basensequenz deletiert ist, die für 5'-UTR am Plasmid PMM037 kodiert, die in SEQ ID NO:2 des Sequenzprotokolls gezeigt ist.
  • (2) Konstruktion des Plasmidvektors pMM038
  • In pMM037 gibt es eine Multi-Cloning-Site downstream der Kodierregion (38 Basen) der N-terminalen Region von CspA und das gewünschte Gen kann als fusioniertes Polypeptid mit den N-terminalen 12 Aminosäureresten von CspA exprimiert werden. Zur Untersuchung der Länge des N-terminalen Aminosäurerests von CspA bei der Expression des fusionierten Polypeptids, wurde die Multi-Cloning-Site nach der gesamten Kodierregion (70 Aminosäurereste) von CspA angeordnet und ein Plasmidvektor pMM038, bei dem das gewünschte Gen in Form eines fusionierten Polypeptids mit 70 Aminosäureresten von CspA exprimiert werden kann, wurde konstruiert. Daher wurde eine PCR unter Verwendung des obigen Plasmids pJJG02 als Templat und unter Verwendung der Primer CSA+20FN und CSA70R (die Basensequenz des Primers CSA70R ist in SEQ ID NO:13 des Sequenzprotokolls gezeigt) durchgeführt, so dass ein DNA-Fragment erhalten wird, das eine Region enthält, die für den Bereich von der 19-ten Base downstream des Initiationspunkts für die Transkription von cspA-Gen zum 70-ten Aminosäurerest am CspA des Plasmids kodiert. Das DNA-Fragment wurde an den auf jedem der Primer angeordneten Nhel- und EcoRI-Stellen verdaut und dann in einen Bereich zwischen Nhel und EcoRI des in Beispiel 2-(1) erhaltenen pMM037 insertiert, so dass ein Plasmidvektor pMM038 konstruiert wurde. Dieser pMM038 ist ein Plasmidvektor, bei dem die Region, die für den Bereich vom N-terminalen zum 13-ten Aminosäurerest von CspA auf pMM037 kodiert, durch den substituiert ist, der für die gesamte Aminosäuresequenz (70 Aminosäurereste) von CspA kodiert.
  • (3) Konstruktion des Plasmidvektors pMM047
  • Zur Einführung einer 6-Basenmutation in die Region, die für 5'-UTR kodiert am Plasmidvektor pMM037, wurde ein Primer CAS+27NF1 (die Basensequenz des Primers CSA+27NF1 ist in SEQ ID NO:14 gezeigt) synthetisiert und dann pMM047 auf die gleiche Weise wie bei der Konstruktion von pMM037 konstruiert. Dabei wurde eine PCR unter Verwendung des in Beispiel 1-(1) erhaltenen Plasmidvektors pMM031F1 als Templat und unter Verwendung der Primer CAS+27NF1 und M13 Primer M4 so durchgeführt, dass ein amplifiziertes DNA-Fragment erhalten wurde. Das erhaltene DNA-Fragment wurde an der Nhel-Stelle angeordnet auf CSA+27NF1 und auch an der Xbal-Stelle an der Multi-CIning-Site verdaut und dann in einen Bereich zwischen Nhel und Sbal des in Beispiel 2-(1) erhaltenen pMM035 in eine solche Richtung insertiert, dass jede der Stellen regeneriert wird, worauf ein Plasmidvektor pMM047 konstruiert wurde. In diesem pMM047 wurden downstream des Teils vom lac-Operator in der Region, die für 5'-UTR am pMM03 kodiert, Basensubstitutionsmutationen an sechs Orten eingeführt. Eine Basensequenz von 5'-UTR am Plasmidvektor pMM047 kodiert oder die vom Initiationspunkt für die Transkription zur Base unmittelbar vor dem CspA-Initiationskodon ist in SEQ ID NO:3 des Sequenzprotokolls gezeigt.
  • (4) konstruktion des Plasmidvektors pMM048
  • Ein Plasmidvektor pMM048, bei dem eine Mutation durch Deletion von 30 Basen auf der Sequenz, die für 5'-UTR des Plasmidvektors pMM047 kodiert, wurde konstruiert. Dabei wurden Primer D3F und D3R (die Basensequenzen der Primer D3F und D3R sind in SEQ IN N: 15 bzw. NO:16 des Sequenzprotokolls gezeigt) aufgebaut und synthetisiert, so dass der Teil deletiert ist, der der Region von +56 bis +85 downstream des Initiationspunkts für die Transkription des natürlichen cspA-Gens entspricht, das auf pMM047 vorliegt. Es wurden PCRs unter Verwendung des Plasmids pJJG02 als Templat und unter Verwendung jeweils einer Kombination der Primer D3R und CSA+27NF1 und einer Kombination der Primer D3F und CSA13R2 durchgeführt. Die Reaktionslösungen wurden einer Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen und die von den Primern getrennten amplifizierten DNA-Fragmente wurden aus dem Gel extrahiert und gereinigt. Die erhaltenen amplifizierten DNA-Fragmente wurden in einem PCR-Puffer vermischt, durch Erwärmen denaturiert und langsam abgekühlt, so dass ein Heterodoppelstrang gebildet wird. Taq-DNA-Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo) wurde der Mischlösung zugesetzt, die Mischung bei 72°C gehalten, um die Synthese des Doppelstrangs abzuschließen und dann wurde die zweite PCR durchgeführt, nachdem die Primer CSA+27NF1 und CSA13R2 zugesetzt wurden. Das erhaltene amplifizierte DNA-Fragment wurde an den auf jedem der Primer angeordneten Nhel- und EcoRI-Stellen ver daut und in einen Bereich zwischen Nhel und EcoRI des in Beispiel 2-(1) erhaltenen Plasmidvektors pMM037 insertiert, so dass ein Plasmidvektor pMM048 konstruiert wurde. Dieser pMM048 ist der, bei dem in der Region, die für 5'-UTR auf pMM047 kodiert, ein Teil, der der Region von +56 bis +85 entspricht, gezählt vom Initiationspunkt für die Transkription in 5'-UTR vom natürlichen cspA-Gen, deletiert wurde. Eine Basensequenz der auf dem Plasmidvektor pMM048 kodierten 5'-UTR oder die vom Initiationspunkt für die Transkription unmittelbar vor dem CspA-Initiationskodon ist in SEQ ID NO:4 des Sequenzprotokolls gezeigt.
  • (5) Untersuchung der Induktionsfähigkeit von modifiziertem bei niedriger Temperatur induzierbarem Vektor unter Verwendung von β-Galactosidasegen
  • Ein Plasmid pKM005, das das β-Galactosidase(lac Z)-Gen enthält ["Experimental Manipulation of Gene Expression", Seiten 15–32, herausgegeben von M. Inoue, veröffentlicht von Academic Press, New York, 1983] wurde mit BamHI und Sall (beide hergestellt von Takara Shuzo) verdaut und mittels einer 1% Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und ein DNA-Fragment von ungefähr 6,2 kb, das das lac-Z-Gen enthält, wurde ausgeschnitten, extrahiert und gereinigt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in einen Bereich zwischen BamHI und Sall jedes der oben genannten Plasmidvektoren pMM036, pMM038, pMM047 und pMM048 und den in Beispiel 2-(1) erhaltenen Plasmidvektor pMM037 insertiert und die erhaltenen Plasmide wurden als Plasmid pMM036lac, pMM038lac, pMM047lac, pMM048lac bzw. pMM037lac bezeichnet. Mit Ausnahme von pMM038lac kodieren alle der erhaltenen Plasmide für eine fusionierte β-Galactosidase, bei der N-terminal 12 Aminosäurereste und 10 Aminosäurereste von der Multi-Cloning-Site mit dem 10-ten Aminosäurerest von β-Galactosidase verbunden sind. Außerdem kodiert pMM038lac für eine fusionierte β-Galactosidase, bei der 70 Aminosäurereste entsprechend der gesamten Länge von CspA und 9 Aminosäure reste von der Multi-Cloning-Site mit dem 10-ten Aminosäurerest von β-Galactosidase verbunden sind.
  • Andererseits wurde die Konstruktion eines Expressionsvektors für fusionierte β-Galactosidase unter Verwendung des in Beispiel 1-(1) erhaltenen pMM031F1 auf die gleiche Weise versucht, jedoch waren die Kolonien der erhaltenen Transformante sehr klein und da der Einfluss von bei 37°C exprimierten Genprodukten als hoch angenommen wurde, wurde keine weitere Untersuchung durchgeführt. Indessen wurde als Expressionsplasmid mit einen anderen Promotor, ein Plasmidvektor pTV118N (hergestellt von Takara Shuzo), der den lac-Promotor-Operator enthält, gleichermaßen für die Konstruktion von Plasmid pTV118Nlac verwendet, bei dem DNA-Fragmente von ungefähr 6,2 kb, die das lac-Z-Gen enthalten, in einen Bereich zwischen BamHI und Sall insertiert sind, wodurch die Induktionsfähigkeit verglichen wurde.
  • E. coli JM109 wurde unter Verwendung jedes der obigen Plasmide transformiert und jede der erhaltenen Transformanten wurde auf LB-Medium überführt, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, und bei 37°C eine Nacht aerob inkubiert. Jede Kulturflüssigkeit wurde in einer Menge von 1% auf 5 ml des frisch bereiteten gleichen Mediums gegeben, aerob bei 37°C inkubiert, ein Teil davon aufgenommen als die Trübung OD600 = 0,6 bis 0,8 erreicht, dann IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM zugegeben und die Inkubation bei 15°C weiter durchgeführt. Die von jeder der bei 37°C inkubierten Kulturen direkt vor der Induktion und nach 3 Stunden und 10 Stunden bei der Induktion genommenen Proben wurden als Proben zur Messung der β-Galactosidaseaktivität nach dem in "Experiments in Molecular Genetics", Seiten 352–355, von J. H. Miller, veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laborstory, 1972 beschriebenen Verfahren verwendet.
  • Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, exprimierten alle Transformanten, die eines der Plasmide enthalten, in der Stufe vor der Induktion die gleiche oder eine geringere β-Galactosidaseaktivität wie pTV118Nlac, das als Kontrolle verwendet wurde, wodurch gezeigt ist, dass die Wirkung des cspA-Promotors bei jedem Plasmid korrekt kontrolliert ist. Nach der Induktion wurde bei allen Transformanten, die Plasmid enthalten, mit Ausnahme des Plasmids pMM036lac, im Vergleich zu denen, die pTV118Nlac enthalten, eine β-Galactosidaseaktivität vom 10-fachen oder mehr exprimiert. Tabelle 1
    β-Galactosidaseaktivität (Einheit)
    Plasmid vor Induktion 3 Std. nach Induktion 10 Std. nach Induktion
    pMM037lac 186 7707 13193
    pMM036lac 242 1201 3437
    pMM038lac 311 17257 26203
    pMM047lac 99 9263 10421
    pMM048lac 472 10018 23133
    pTV118Nlac 262 404 1218
  • (6) Bestimmung der Proteinexpressionsfähigkeit bei 37°C
  • Von den in Beispiel 3-(5) hergestellten Transformanten wurden alle außer denen, die durch Plasmid pMM037lac transformiert wurden, verwendet und ihre Fähigkeit zur Expression von Protein bei 37°C bestimmt. Das Experiment wurde nach der gleichen Vorgehensweise wie in Beispiel 3-(5) durchgeführt, mit der Ausnahme, dass als Medium ein M9 Medium (das 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 0,2% Glucose, 0,2% Casaminosäure, 0,05 mg/ml Tryptophan, 2 μg/ml Thiamin und 100 μg/ml Ampicillin enthält) verwendet wurde und selbst nach Zusatz von IPTG die Inkubationstemperatur auf 37°C gehalten wurde. Die β-Galactosidaseaktivitäten wurden in zwei Stufen direkt vor der Induktion und 2 Stunden nach der Induktion gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 gezeigt.
  • Die β-Galactosidaseaktivität 2 Stunden nach Induktion bei mit Plasmid pMM036lac transformierten E. coli, bei denen der Großteil der 5'-UTR deletiert ist, war höher als bei denen, die pMM038lac und pMM047lac enthalten, was sich vom Ergebnis des Beispiels 3-(5) unterscheidet. Zwischen pMM048lac und pTV118lac zeigte sich kein Unterschied bezüglich der nach der Induktion exprimierten Aktivität. Diese Tatsachen zeigen, dass pMM048 zur Proteinexpression nicht nur unter Bedingungen einer niedrigen Temperatur, sondern auch bei 37°C wirksam ist. Tabelle 2
    β-Galactosidaseaktivität (Einheit)
    Plasmid vor Induktion 2 Std. nach Induktion
    pMM036lac 1515 24027
    pMM038lac 2695 9947
    pMM047lac 894 2637
    pMM048lac 4527 48547
    pTV118Nlac 5572 48051
  • (7) Bestimmung der Fähigkeit zur Proteinexpression bei 10°C und 20°C
  • Unter Verwendung der in Beispiel 3-(5) hergestellten Transformanten, mit Ausnahme der Transformante mit Plasmid pMM036lac, wurde die Fähigkeit jeder der Transformanten zur Expression von Protein bei 10°C und 20°C bestimmt. Das Experiment wurde nach der gleichen Vorgehensweise wie in Beispiel 3-(5) durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Inkubationstemperatur nach Zusatz von IPTG auf 10°C oder 20°C gehalten wurde. Die β-Galactosidaseaktivitäten wurden im Falle von 10°C in drei Stufen 3 Stunden, 7 Stunden und 21 Stunden nach der Induktion gemessen, im Falle von 20°C wurde in drei Stufen 1 Stunde, 3 Stunden und 7 Stunden nach der Induktion gemessen. Das bei 10°C erhaltene Ergebnis ist in Tabelle 3 gezeigt, während das bei 20°C in Tabelle 4 gezeigt ist.
  • Wie in Tabelle 3 gezeigt ist, induzierten selbst die Bedingungen einer niedrigen Temperatur wie 10°C, Expression einer viel höheren β-Galactosidaseaktivität als der Falle mit pTV118Nlac bei allen Transformanten, die das Plasmid enthalten, worauf die hohe Expressionsfähigkeit dieser Vektoren unter Bedingungen einer niedrigen Temperatur bestätigt wurde. Darunter zeigt pMM038lac eine höhere Expressionsmenge als die anderen Konstrukte und zeigt seine besondere Wirksamkeit, wenn das in den Vektor der vorliegenden Erfindung einzuführende gewünschte Gen als fusioniertes Protein mit vollständiger Kodierregion von CspA exprimiert wird. Hingegen zeigt pMM048lac, bei dem die Deletion von 30 Basen in 5'-UTR eingeführt wurde, im Vergleich zu pMM047lac ohne Mutation die gleiche oder eine etwas höhere Expressionsmenge, was anzeigt, dass es für eine Proteinexpression bei Temperaturbedingungen wie 10°C wirksam ist. Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, wird im Falle von pMM047lac unter Temperaturbedingungen von 20°C Induktionsexpression einer geringeren β-Galactosidaseaktivität als bei den Transformanten festgestellt, die andere Plasmide enthalten.
  • Aus diesen experimentellen Ergebnissen und der induzierten Menge an β-Galactosidaseaktivität bei 15°C und 37°C, wie in Beispiel 3-(5) und Beispiel 3-(6) gezeigt, ist zu sehen, dass pMM047 ein Vektor ist, der ein Expressionsmuster aufweist, das hauptsächlich für die Temperatur von 15°C oder weniger spezifisch ist und dass pMM048, bei dem eine Deletionsmutation von 30 Basen in 5'-UTR von pMM047 eingeführt ist, ein Vektor ist, der in der Lage ist, das gewünschte Protein in einem breiten Temperaturbereich von niedriger Temperatur bis zu üblicher Temperatur (37°C) effektiv zu exprimieren. Tabelle 3 (bei 10°C)
    β-Galactosidaseaktivität (Einheit)
    Plasmid 3 Std. nach Induktion 7 Std. nach Induktion 21 Std. nach Induktion
    pMM07lac 6290 10279 12066
    pMM038lac 9892 28399 33209
    pMM047lac 9168 12927 12098
    pMM048lac 8799 13021 18547
    pTV118Nlac 905 981 836
    Tabelle 4 (bei 20°C)
    β-Galactosidaseaktivität (Einheit)
    Plasmid 1 Std. nach Induktion 3 Std. nach Induktion 7 Std. nach Induktion
    pMM037lac 7737 13351 27117
    pMM038lac 22840 27043 34171
    pMM047lac 6881 9946 12272
    pMM048lac 13423 27135 58333
    pTV118Nlac 8914 22349 21238
  • Beispiel 4
  • Konstruktion der pCold01- und pCold02-Serien und Untersuchung ihrer Induktionsfähigkeit
  • (1) Konstruktion von Plasmid der pCold01-Serie
  • Eine PCR wurde unter Verwendung des Plasmids pJJG02, das das cspA-Gen enthält, als Templat und unter Verwendung der synthetischen DNA-Primer CSA-tert-FHX und CSA-tert-R (die Basensequenzen der Primer CSA-tert-FHX und CSA-ter-R sind in SEQ ID NO:17 bzw. NO:18 des Sequenzprotokolls gezeigt) durchgeführt, so dass ein DNA-Fragment erhalten wurde, das die Transkriptionsterminatorregion des cspA-Gens enthält. Das DNA-Fragment wurde an den HindIII- und EcoO109I-Stellen verdaut, die auf jedem der Primer angeordnet sind, und in einen Bereich zwischen HindIII am Ende der Multi-Cloning-Site von pMM038 gelegen, das in Beispiel 3-(2) erhalten wurde, und der EcoO109I-Stelle downstream davon insertiert, worauf pMM039 konstruiert wurde. Danach wurde ein synthetischer DNA-Linker hergestellt durch Behandlung von synthetischen Oligonukleotiden KS-Linker 1 und KS-Linker 2 (die Basensequenzen von KS-Linker 1 und KS-Linker 2 sind in SEQ ID NO:19 bzw. NO:20 des Sequenzprotokolls gezeigt) in einen Bereich zwischen KpnI und Sall an der Multi-Cloning-Site von pMM039 insertiert, um pMM040 zu konstruieren.
  • Dabei wurden zum Einführen einer Ncol-Stelle am Translationsinitiationskodon, die Primer CSA1NC-F und CSA1NC-R (die Basensequenzen von CSA1NC-F und CSA1NC-R sind in SEQ ID NO:21 bzw. NO:22 des Sequenzprotokolls gezeigt) synthetisiert. Die erste PCR wurde für eine Kombination der Primer CSA1NC-F und CSA70R unter Verwendung des Plasmids pJJG02 als Templat und auch für eine Kombination der Primer CSA1NC-R und CSA+17NF1 unter Verwendung des Plasmids pMM047 als Templat durchgeführt. Die Reaktionslösung wurde einer 3% Agarosegelelektrophorese unterzogen und die aus dem Gel abgetrennten amplifizierten DNA-Fragmente wurden aus dem Gel extrahiert und gereinigt. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden in einem PCR-Puffer vermischt, durch Erwärmen denaturiert und langsam abgekühlt, um einen Heterodoppelstrang zu bilden. Taq-DNA-Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo) wurde der Mischlösung zugesetzt, die Mischung bei 72°C gehalten, um die Synthese des Doppelstrangs abzuschließen und dann wurde die zweite PCR unter Verwendung einer Kombination der Primer CSA+27NF1 und CSA13R durchgeführt. Das erhaltene amplifizierte DNA-Fragment wurde an den pT7Blue-T Vektor (hergestellt von Novagen) subkloniert, um die Basensequenz zu bestätigen und an den Nhel- und EcoRI-Stellen gespalten, die auf jedem Primer angeordnet sind, und das freigesetzte DNA-Fragment in einen Bereich zwischen Nhel und EcoRI eines Plasmidvektors pMM040 insertiert, um einen Plasmidvektor pCold01NC1 zu konstruieren.
  • Dann wurde die zweite PCR gleichermaßen unter Verwendung der Primer CSA13R2 oder CSA13R3 (die Basensequenz von Primer CSA13R3 ist in SEQ ID NO:23 des Sequenzprotokolls gezeigt) anstelle des Primers CSA13R durchgeführt, so dass ein Plasmidvektor pCold01NC2, bei dem eine Base aus dem 3'-Ende der Region deletiert ist, die für den N-terminalen Teil von CspA kodiert, das in pCold01NC1 insertiert ist, oder ein Plasmidvektor pCold01NC3, bei dem eine Base am Ende hinzugeführt ist, konstruiert wurde.
  • Diese drei Arten von Plasmid weisen eine Ncol-Stelle am Initiationskoden des cspA-Gens an jedem Plasmid auf und bilden eine Serie von Vektoren, bei denen der dort beginnende offene Leserahmen an der Multi-Cloning-Site jeweils unterschiedlich ist. Ferner weisen diese Plasmide eine Sequenz auf, die in jedem der drei offenen Leserahmen ein Terminationskodon downstream der Multi-Cloning-Site zeigt und weiter downstream eine Transkriptionsterminatorregion vom cspA-Gen enthal ten ist. In pCold01NC2 ist durch die Deletion dieser einen Base der 13-te Aminosäurerest vom N-Ende des auf dem Plasmid kodierten CspA von Asparagin zu Lysin verändert.
  • Dann wurden die Plasmide der pCold01ND-Serie, pCold01ND1, ND2 und ND3, bei denen die Ncol-Stelle am Translationsinitiationskodon jedes der Plasmide der pCold01NC-Serie durch eine Ndel-Stelle substitutiert ist, nach dem gleichen Verfahren konstruiert, wobei die ersten PCRs unter Verwendung der Primer CSA1ND-F und CSA1ND-R (die Basensequenzen der Primer CSA1ND-F und CSA1ND-R sind in SEQ ID NO:24 und NO:25 des Sequenzprotokolls gezeigt) anstelle von CSA1NC-F und CSA1NC-R durchgeführt.
  • Die sechs Arten von Plasmiden der pCold01-Serie, die derart konstruiert wurden, weisen das Expressionssystem auf, bei dem pMM047 ein fundamentales Gerüst ist, und weisen die gleiche Sequenz auf wie pMM047 mit Ausnahme der Restriktionsenzymstelle, die am Initiationskodon angeordnet ist und der Sequenz nach der Multi-Cloning-Site.
  • (2) Konstruktion von Vektoren der pCold02-Serie
  • Sechs Arten von Plasmiden der pCold02-Serie wurden nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 4-(1) konstruiert. Dabei wurde in der ersten PCR unter Verwendung einer Kombination der Primer CSA1NC-R und CSA+27NF1 oder einer Kombination der Primer CSA1ND-R und CSA+27NF1 ein Plasmid pMM048 als Templat, anstelle eines Plasmids pMM047 verwendet, worauf Plasmide der pCold02-Serie, pCold02NC1, NC2, NC3, ND1, ND2 und ND3 durch insgesamt die gleichen Schritte wie in Beispiel 4-(1) konstruiert wurden.
  • Die sechs Arten von Plasmiden der pCold02-Serie, die derart konstruiert wurden, weisen das Expressionssystem auf, bei dem pMM048 ein fun damentales Gerüst ist, und weisen die gleiche Sequenz auf wie pMM048 mit Ausnahme der Restriktionsenzymstelle, die am Initiationskodon angeordnet ist, und der Sequenz nach der Multi-Cloning-Site. Ferner ist jedes von ihnen gleich dem entsprechenden Plasmid der pCold01-Serie mit der Ausnahme der Deletion des Teils, der der Region +56 bis +85 vom Transkriptionsinitiationspunkt in der 5'-UTR vom natürlichen cspA-Gen entspricht, was für pMM048 charakteristisch ist.
  • (3) Untersuchung der Induktionsfähigkeit von pCold01 und pCold02 unter Verwendung von β-Galactosidasegen
  • Eine Induktionsfähigkeit von pCold01 und pCold02 wurde unter Verwendung von β-Galactosidase nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 3-(5) untersucht. Zunächst wurde das DNA-Fragment von ungefähr 6,2 kb, das das lac-Z-Gen enthält, in einen Bereich zwischen BamHI und Sall von pCold01NC2, pCold01ND2, pCold02NC2 und pCold02ND2 insertiert und die erhaltenen Plasmide wurden als Plasmide pCold01NC2lac, pCold01ND2lac, pCold02NC2lac bzw. pCold02ND2lac bezeichnet. Alle diese Plasmide kodieren für die fusionierte β-Galactosidase, wobei 12 Aminosäurereste am N-Ende von CspA und 10 Aminosäurereste von der Multi-Cloning-Site mit dem 10-ten Aminosäurerest von β-Galactosidase verbunden sind.
  • E. coli JM109 wurden mit jedem der obigen Plasmide transformiert und die erhaltenen Transformanten wurden einem Expressionsinduktionsexperiment bei 15°C nach der gleichen Vorgehensweise wie in Beispiel 3-(5) unterzogen. Die β-Galactosidaseaktivitäten wurden in drei Stufen gemessen, d. h. direkt vor der Induktion, 3 Stunden nach der Induktion und 10 Stunden nach der Induktion. Das Ergebnis für p-Cold01NC2lac und pCold02NC2lac ist in Tabelle 5 gezeigt. Wenn ND-Serienvektoren verwendet wurden, zeigte sich fast die gleiche Induktionsfähigkeit wie im Falle der Verwendung des entsprechenden NC-Serienvektors.
  • Wie in Tabelle 5 gezeigt ist, weisen die Transformanten, die jedes der Plasmide enthalten, nur eine geringe β-Galactosidaseaktivität vor der Induktion bei 37°C auf und es wird gezeigt, dass die Wirkung des cspA-Promotors jedes Plasmids korrekt kontrolliert wird. Nach der Induktion wird jeweils fast die gleiche Zunahme an β-Galactosidaseaktivität wie im Falle der in Beispiel 3-(5) gezeigten pMM047lac und pMM048lac festgestellt. Dementsprechend ist das pCold-Plasmid eine Serie von Plasmiden mit dem Transkriptionsterminator und der Multi-Cloning-Site, die zur Expression des eingeführten Gens aufgebaut sind und ebenso in der Lage sind, die Expression bei 37°C zu kontrollieren, wodurch das induzierte Genprodukt unter Bedingungen einer niedrigen Temperatur in hoher Effizienz exprimiert werden kann. Tabelle 5
    β-Galactosidaseaktivität (Einheit)
    Plasmid vor Induktion 3 Std. nach Induktion 10 Std. nach Induktion
    pCold01NC2lac 95 6819 9173
    pCold02NC2lac 256 7025 13529
  • Beispiel 5
  • Konstruktion von Plasmiden der pCold-Serie, in die ein lac-I-Gen eingeführt wird, und Untersuchung am Wirt
  • (1) Konstruktion von Plasmiden der PCold03-Serie und der pCold04-Serie
  • Die in Beispiel 4-(1) und Beispiel 4-(2) hergestellen Plasmide der pCold01-Serie und der pCold02-Serie weisen kein Regressorgen an ih ren Plasmidvektoren auf und deshalb ist es notwendig, als Wirt einen Stamm von E. coli zu verwenden, der in der Lage ist, den lac-Repressor stark zu exprimieren. In Hinblick auf das oben angeführte, wurden die Plasmidvektoren pCold03 und 04, bei denen das lac-I-Gen in pCold01 und 02 eingeführt ist, und auch die Plasmidvektoren pCold05 und 06, bei denen das lac-Iq-Gen in pCold01 und 02 eingeführt ist, konstruiert.
  • Zunächst wurde in Beispiel 4-(1) erhaltenes pMM040 mit EcoT22I verdaut und die Endstellen unter Verwendung von T4 DNA-Polymerase abgestumpft. Ein DNA-Fragment, das lac-I-Gen enthält, erhalten durch Verdauung von pET21b (hergestellt von Novagen) mit SphI und PshAI (beide hergestellt von Takara Shuzo), gefolgt von Abstumpfen der Endstellen mit T4 DNA-Polymerase, wurde darin insertiert, so dass ein Plasmid konstruiert wurde, bei dem die Richtung des lac-I-Gens in der umgekehrten Richtung zum cspA-Promotor insertiert ist, und das als pMM40I bezeichnet wird. Gleichermaßen wurde ein DNA-Fragment, das das durch Verdauung von Plasmid pMJR1560 [Gene, Band 51, Seiten 225–267 (1987)] mit KpnI und PstI (beide hergestellt von Takara Shuzo) gefolgt von Abstumpfen der Endstellen erhaltene lac-Iq-Gen enthält, in die abgestumpfte EcoT22I-Stelle von pMM040 eingeführt. Ein Plasmid, bei dem das lac-Iq-Gen in die entgegengesetzte Richtung wie die Richtung des cspA-Promtors insertiert ist, wurde ausgewählt und als pMM040Iq bezeichnet.
  • Unter Verwendung des gleichen Verfahrens zur Konstruktion von pCold01 und 02, wie in Beispiel 4-(1) und Beispiel 4-(2) beschrieben, wurde ein Nhel-EcoRI Fragment für jeden Serienvektor in einen Bereich zwischen Nhel und EcoRI von pMM0401 und pMM040Iq insertiert, worauf jeweils sechs Arten von Plasmidvektoren der Serien pCold03, pCold04, pCold05 und pCold06 konstruiert wurden. Die derart konstruierten Plasmide der pCold03- und pCold04-Serie weisen die gleichen Strukturen auf wie die pCold01-Serie bzw. die pCold02-Serie, mit Ausnahme des Vorhandenseins des lac-I-Gens. Plasmide der pCold05- und pCold06-Serie sind die, bei denen das lac-I-Gen in Plasmid der Serie pCold03 und pCold04 durch das lac-Iq-Gen substituiert ist.
  • (2) Untersuchung der Wirkung des lac-Repressors unter Verwendung von β-Galactosegen
  • Ebenso wie in Beispiel 3-(5) wurde das Plasmid pKM005 mit BamHI und Sall verdaut und ein DNA-Fragment, das das lac-Z-Gen enthält, extrahiert und gereinigt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in einen Bereich zwischen BamHI und Sall von NC2 mit einem passenden Rahmen bei der oben genannten Serie von Plasmidvektoren pCold03, 04, 05 und 06 insertiert und die erhaltenen Plasmide wurden als pCold03NC2lac, pCold04NC2lac, pCold05NC2lac bzw. pCold06NC2lac bezeichnet.
  • Die Transformation des E. coli DH5 α Stamms ohne lac-Repressor (hergestellt von Takara Shuzo) wurde unter Verwendung von sechs Arten von Plasmiden versucht, d. h. pCold01NC2lac und pCold02NC2lac, wie in Beispiel 4-(3) konstruiert, und pCold03NC2lac, pCold04NC2lac, pCold05NC2lac und pCold06NC2lac, wie sie hier oben genannt sind. Gleichzeitig wird eine Transformation für einen Plasmidvektor pCold01NC2 ohne lac-Z-Gen als Kontrolle versucht. Der E. coli DH5 α Stamm wurde einer Transformation nach dem kompetenten Zellverfahren auf herkömmliche Weise unterzogen, worauf in allen Fällen von Plasmiden außer bei pCold02NC2lac, Transformanten mit der gleichen Transformationseffizienz erhalten wurden wie bei der Kontrolle, während in allen Fällen von pCold02NC2lac keine Transformanten erhalten wurden. Ferner waren im Falle von pCold01NC2lac die Kolonien der erhaltenen Transformante kleiner als die der anderen Transformanten.
  • Danach wurde die Fähigkeit zur Expressionskontrolle jedes Plasmids für das gewünschte Protein und die Expressionsfähigkeit für das ge wünschte Protein bei niedriger Temperatur untersucht. Daher wurde jede der erhaltenen Transformanten in LB-Medium überführt, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, und eine Nacht bei 37°C aerob inkubiert. Die Kulturflüssigkeit wurde in einer Menge von 2% zu 5 ml des gleichen frisch zubereiteten Medium gegeben und bei 37°C aerob inkubiert. Als die Trübung der Kultur OD600 von ungefähr 0,6 erreichte, wurde ein Teil davon als Probe genommen und IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM hinzugesetzt und eine Inkubation bei einer Inkubationstemperatur von 15°C durchgeführt. Die Kulturflüssigkeiten, die aus der bei 37°C inkubierten Kulturflüssigkeit direkt vor der Induktion, 3 Stunden nach, 7 Stunden nach und 24 Stunden nach der Induktion genommen wurden, wurden als Proben verwendet und einer Messung der β-Galactosidaseaktivität auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3-(5) unterzogen.
  • Wie in Tabelle 6 gezeigt ist, weist die Transformante mit pCold01NC2lac ohne lac-I-Gen eine hohe β-Galactosidaseaktivität selbst im nicht induzierbaren Zustand bei 37°C auf, während bei den Transformanten mit anderen Plasmiden, die das lac-I-Gen oder das lac-Iq-Gen enthalten, geringe β-Galactosidaseaktivitäten auftreten. Dies zeigt, dass die Plasmide der Serie von pCold03 bis pCold06 mit dem lac-I-Gen oder dem lac-Iq-Gen am Plasmid im Wesentlichen eine Suppression der Expression unter den Inkubationsbedingungen von 37°C in effektiver Weise ausführen. Dies zeigt ferner, dass bei 37°C die Expressionkontrolle nur durch die Funktion der Region, die für 5'-UTR des cspA-Gens kodiert, unvollständig ist und dass, nur wenn die Operatorsequenz, die bei diesen Plasmiden angeordnet ist, normal funktioniert, wird eine wesentliche Expressionskontrolle erreicht. Es wurde ebenso geklärt, dass die β-Galactosidaseaktivität der Transformanten von pCold05NC2lac und pCold06NC2lac mit dem lac-Iq-Gen geringer ist als bei den Transformanten von pCold03NC2lac und pCold04NC2lac mit dem lac-I-Gen, wodurch das lac-Iq-Gen in der Lage ist, die Expression wirksam zu kontrollieren.
  • Andererseits wird nach der Expressionsinduktion durch Zusatz des Induktionsmittels und einer Temperaturverschiebung zu niedriger Temperatur, eine Zunahme der β-Galactosidaseaktivität im Zeitverlauf in jedem der Fälle der Transformanten mit Plasmiden, die das lac-I-Gen oder das lac-Iq-Gen enthalten, festgestellt. Solche induzierbaren Werte decken sich mit dem Induktionsmuster der Transformante des E. coli Stamms, der den lac-Repressor mit pCold01NC2lac oder pCold02NC2lac stark exprimiert, wie es in Tabelle 5 gezeigt ist, und es zeigt, dass selbst wenn das lac-I-Gen am Vektor angeordnet ist, wird die Fähigkeit zur Induktion der Expression des gewünschten Proteins nicht beeinflusst. Dies bedeutet, dass im Falle des Vektors der vorliegenden Erfindung, bei dem der lac-Operator als Operator verwendet wird, eine Einschränkung des Wirts bezüglich des lac-I-Gens nichtig wird, wenn das lac-I-Gen oder das lac-Iq-Gen am Vektor eingeführt ist. Tabelle 6
    β-Galactosidaseaktivität (Einheit)
    Plasmid vor Induktion 3 Std. nach Induktion 7 Std. nach Induktion 24 Std. nach Induktion
    pCold01NC2lac 16672 12823 15866 22779
    pCold03NC2lac 109 7469 9414 27055
    pCold04NC2lac 190 6860 14523 45464
    pCold05NC2lac 48 3107 3985 9734
    pCold06NC2lac 52 4340 9324 23161
    pCold01NC2 16 141 148 72
  • Beispiel 6
  • Konstruktion und Untersuchung der Induktionsfähigkeit von bei niedriger Temperatur induzierbaren Vektoren pCold0-und pCold08-Serienplasmiden mit hoch komplementärer Downstream-Boxsequenz und Tag für die Reinigung
  • (1) Konstruktion von Plasmiden pCold07NC2 und pCold08NC2
  • Bei Plasmiden der pCold03-Serie oder der pCold04-Serie, liegt eine Multi-Cloning-Site downstream der N-terminalen Kodierregion von CspA vor und das gewünschte Protein wird als fusioniertes Protein mit 12 oder 13 Aminosäureresten der N-Endstelle von CspA exprimiert. Es liegt eine Downstream-Boxsequenz in der N-terminalen Kodierregion von CspA vor und, wenn angenommen wird, dass eine Antidownstream-Boxsequenz von E. coli 15 Basen von 1467–1481 in 16S Ribosomen-RNA ist, zeigt diese Sequenz eine Komplementarität in dem Maße, dass zehn der 15 Basen gelöscht werden. Diese Basensequenz, die für das N-Ende von CspA kodiert, wird durch eine Basensequenz substituiert, wie sie in SEQ ID NO:28 des Sequenzprotokolls gezeigt ist, die zur oben genannten Sequenz vollständig komplementär ist, die aus 15 Basen besteht und dann wird eine Sequenz, die für den Histidinrest kodiert, von 6 Resten als Tag-Sequenz für die Reinigung und eine Basensequenz, die für eine Erkennungsaminosäuresequenz des Proteasefaktors Xa kodiert, zum Ausschneiden des Leaderpeptids, das von diesen Sequenzen kodiert wird, weiter downstream davon eingeführt, worauf Plasmide pCold07NC2 und pCold08NC2 konstruiert wurden.
  • Zunächst wurde ein Plasmid pCold03NC2 mit Ncol und EcoRI verdaut, um eine Region zu entfernen, die für die N-terminale Sequenz des cspA-Gens am pCold03NC2 kodiert, worauf ein Vektorfragment hergestellt wurde. Die synthetischen Nukleotide DB-3 und DB-4 (die Basensequenzen von DB-3 und DB-4 sind in SEQ ID NO:26 und NO:27 des Se quenzprotokolls gezeigt) synthetisiert, behandelt und in einen Bereich zwischen Ncol und EcoRI des zuvor hergestellten pCold03NC2 insertiert, um ein Plasmid Cold07NC2 zu konstruieren. Außerdem wurde durch insgesamt die gleichen Schritte ein Plasmid pCold08NC2 konstruiert, worin die Region, die für die N-terminale Sequenz des cspA-Gens am Plasmid pCold04NC2 kodiert, durch den synthetischen DNA-Linker substituiert ist.
  • (2) Untersuchung der Induktionsfähigkeit des modifizierten Typs des bei niedriger Temperatur induzierbaren Vektors unter Verwendung von β-Galactosidasegen
  • Der im Beispiel 4-(3) konstruierte Plasmidvektor pCold01NC2lac wurde mit BamHI und Sall verdaut und ein DNA-Fragment von ungefähr 6,2 kb, das das lac-Z-Gen enthält, wurde extrahiert und gereinigt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in einen Bereich zwischen BamHI und Sall des oben genannten Plasmids pCold07NC2 und pCold08NC2 insertiert und die erhaltenen Plasmide als pCold07NC2lac bzw. pCold08NC2lac bezeichnet. Alle diese Plasmide kodieren für eine fusionierte β-Galactosidase, wobei ein N-terminales Leaderpeptid, das insgesamt aus 25 Aminosäureresten besteht, das fünf Reste umfasst, die von einer Downstream-Boxsequenz kodiert werden, die vollständig komplementär zur Antidownstream-Boxsequenz in einer 16S Ribosomen-RNA ist, sechs Reste vom Histidinrest als Tag-Sequenz zur Reinigung, vier Aminosäurereste, die die vom Faktor Xa erkannte Aminosäuresequenz darstellen, und zehn Aminosäurereste von der Multi-Cloning-Site mit der β-Galactosidase am 10-ten Aminosäurerest verbunden sind. Dabei wurde ein Expressionsplasmid mit einem anderen Plasmid, Plasmid pET21blac, worin das DNA-Fragment von ungefähr 6,2 kb, das das lac-Z-Gen enthält, in einen Bereich zwischen BamHI und Sall vom Plasmid des pET-Systems pET21b (hergestellt von Novagen) insertiert, konstruiert und seine Induktionsfähigkeit verglichen.
  • E. coli JM109 [E. coli JM109 (DE3) hergestellt von Promega im Falle von pET21blac] wurden mit jedem der oben genannten Plasmide und pCold01NC2lac und pCold02NC2lac, wie in Beispiel 4 konstruiert, transformiert und die erhaltenen Transformanten wurden einem Experiment zur Expressionsinduktion bei 15°C nach der gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 3-(5) unterzogen. Die β-Galactosidaseaktivität wurde in drei Stufen direkt vor der Induktion, 3 Stunden nach der Induktion und 10 Stunden nach der Induktion gemessen.
  • Wie in Tabelle 7 gezeigt ist, weisen die Transformanten, die pCold07NC2lac und pCold08NC2lac enthalten, nur geringe β-Galactosidaseaktivitäten vor der Induktion bei 37°C auf, wodurch gezeigt ist, dass die Wirkung des cspA-Promotors jedes Plasmids korrekt kontrolliert wird. Außerdem wurde 7 Stunden nach der Induktion im Falle der Transformante, die das Plasmid pCold07NC2lac enthält, im Vergleich zu pCold03NC2lac eine 5-fache oder höhere β-Galactosidaseaktivität exprimiert, und im Falle der Transformante, die das Plasmid pCold08NC2lac enthält, wurde im Vergleich zu pCold04NC2lac eine 4-fache oder höhere β-Galactosidaseaktivität exprimiert. Ferner wurde im Vergleich zum pET-System, das ein wirksamer Expressionvektor unter den bekannten Expressionsvektoren ist, gefunden, dass die Plasmide der pCold07-Serie und der pCold08-Serie eine höhere Expressionsfähigkeit aufweisen, insbesondere in einer kurzen Zeitspanne nach Induktion bei niedriger Temperatur. Tabelle 7
    β-Galactosidaseaktivität (Einheit)
    Plasmid vor Induktion 3 Std. nach Induktion 7 Std. nach Induktion
    pCold03NC2lac 37 7253 9282
    pCold04NC2lac 230 6311 12592
    pCold07NC2lac 359 31335 53069
    pCold08NC2lac 705 33863 55850
    pET21blac 144 6103 32934
  • Vorteile der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionsvektor ange boten, bei dem eine Expression bei üblicher Temperatur kontrolliert werden kann und eine hohe Expressionseffizienz unter Bedingungen einer niedrigen Temperatur erreicht wird. Durch die Verwendung des Vektors ist es möglich, eine Transformante zu bilden, die das Gen enthält, das für ein Protein kodiert, das eine schädliche Wirkung für den Wirt zeigt. Wenn außerdem eine Proteinexpression unter Bedingungen einer nied rigen Temperatur unter Verwendung des Vektors vorgenommen wird, wird die Bildung eines Einschlusskörpers unterdrückt, wodurch es möglich ist, ein Protein mit einer Aktivität effizient zu erhalten.
  • Freier Text des Sequenzprotokolls
  • SEQ ID NO:7 zeigt eine Basensequenz des Primers CSA-67FN.
  • SEQ ID NO:8 zeigt eine Basensequenz des Primers CSA-13R.
  • SEQ ID NO:9 zeigt eine Basensequenz des Primers CSA-13R2.
  • SEQ ID NO:11 zeigt eine Basensequenz des Primers CSA+1RLAC.
  • SEQ ID NO:12 zeigt eine Basensequenz des Primers CSA+20FN.
  • SEQ ID NO:13 zeigt eine Basensequenz des Primers CSA70R.
  • SEQ ID NO:14 zeigt eine Basensequenz des Primers CSA+27NF1.
  • SEQ ID NO:15 zeigt eine Basensequenz des Primers D3F.
  • SEQ ID NO:16 zeigt eine Basensequenz des Primers D3R.
  • SEQ ID NO:17 zeigt eine Basensequenz des Primers CSA-ter-FHX.
  • SEQ ID NO:18 zeigt eine Basensequenz des Primers CSA-ter-R.
  • SEQ ID NO:19 zeigt eine Basensequenz eines synthetischen Oligonukleotids KS-Linker 1.
  • SEQ ID NO:20 zeigt eine Basensequenz eines synthetischen Oligonukleotids KS-Linker 2.
  • SEQ ID NO:21 zeigt eine Basensequenz des Primers CSA1NC-F.
  • SEQ ID NO:22 zeigt eine Basensequenz des Primers CSA1NC-R.
  • SEQ ID NO:23 zeigt eine Basensequenz des Primers CSA13R3.
  • SEQ ID NO:24 zeigt eine Basensequenz des Primers CSA1ND-F.
  • SEQ ID NO:25 zeigt eine Basensequenz des Primers CSA1ND-R.
  • SEQ ID NO:26 zeigt eine Basensequenz eines synthetischen Oligonukleotids DB-3.
  • SEQ ID NO:27 zeigt eine Basensequenz eines synthetischen Oligonukleotids DB-4.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
  • Figure 00710001
  • Figure 00720001

Claims (7)

  1. Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er jedes der folgenden Elemente enthält: (1) einen Promotor, der vom cspA-Gen von E. coli gewonnen ist, (2) einen lac-Operator zum Regulieren der Wirkung des Promotors von (1) und (3) eine Region, die für die untranslierte 5'-Region kodiert, die aus Kälteschockproteingen-mRNA gewonnen ist, wobei die Region eine Basensequenz wie in SEQ ID NO:1 des Sequenzprotokolls gezeigt, enthält.
  2. Vektor nach Anspruch 1, bei dem ein vom cspA-Gen von E. coli gewonnener Promotor ein Promotor ist, der eine Basensequenz wie in SEQ ID NO:5 des Sequenzprotokolls gezeigt, enthält.
  3. Vektor nach Anspruch 1, der eine Region enthält, die für die untranslierte 5'-Region kodiert, die irgendeine der Basensequenzen enthält, wie sie in SEQ ID NO:2 bis 4 des Sequenzprotokolls gezeigt sind, wobei die Region den in (2) identifizierten lac-Operator umfasst.
  4. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, der ferner downstream der untranslierten 5'-Region eine Basensequenz enthält, die zur Antidownstream-Boxsequenz von Ribosomen-RNA des verwendeten Wirts komplementär ist.
  5. Vektor nach Anspruch 4, der downstream der untranslierten 5'-Region eine Basensequenz enthält, wie sie in SEQ ID NO:28 des Sequenzprotokolls gezeigt ist.
  6. Verfahren zur Expression des gewünschten Proteins, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst: (1) einen Schritt, worin ein Wirt mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5 transformiert wird, wobei ein für das gewünschte Protein kodierendes Gen integriert wird, (2) einen Schritt, worin die erhaltene Transformante inkubiert wird, und (3) einen Schritt, worin Promotorwirkung über eine Funktion einer Regulationsregion induziert wird und gleichzeitig die Inkubationstemperatur unter die gewöhnliche Temperatur gesenkt wird, um das gewünschte Protein zu exprimieren.
  7. Promotor enthaltend eine Basensequenz wie in SEQ ID NO:5 des Sequenzprotokolls gezeigt und gebildet aus einer Basensequenz mit 135 oder weniger Basen, worin der Promotor seine Wirkung zum Initiieren der Translation bei niedriger Temperatur behält.
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