KR20080113247A - 단백질 가용화를 위한 단백질 ｓ 융합물의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 믹소코커스 크산투스로부터 PrS 태그 또는 PrS2 태그를 포함하는 다중 클로닝 부위를 함유하는 벡터를 제공한다. 단백질 S 태깅된 표적 융합 단백질을 사용하여 표적 단백질의 용해도를 증가시키는 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 단백질의 생산성 및 용해도를 향상시키기 위한 시스템에 관한 것이다.
많은 수의 단백질이 다양한 통상적인 발현 시스템에서 발현되는 경우 불용성화되기 때문에, 단백질 발현은 의학 및 생물공학에서 주요 도전에 해당한다. 단백질 특히, 재조합 단백질을 생물학적 샘플의 다른 구성요소로부터 분리하고 정제하기 위한 많은 방법들이 개발되어 왔다. 이러한 정제 방법은 특히, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 및 친화 크로마토그래피를 포함한다. 친화 크로마토그래피는, 표적 단백질 또는 표적 단백질 태그의, 이들이 결합하는 정제 시약 특히, 항체 또는 리간드에 대한 특이성으로 인해 다른 방법 보다 더욱 효과적이다.
이의 친화 정제에 있어서 단백질 태깅은 수년 동안 단백질 정제를 위한 선택적인 방법이었으며, 최근에는 효모 및 좁게는, 이보다 고등의 진핵생물에서의 단백질체 연구에 사용되었다. 6개 아미노산 잔기 (His 태그) 정도의 짧은 소 펩티드 내지 40kDa (MBP) 정도의 큰 단백질의 많은 독특한 태그가 이용가능하다 (문헌 [Stevens, R.C., 2000. Structure Fold Des 8:R177-85] 참조). 사용된 태그중에는 His-태그가 가장 넓고 성공적으로 이용되고 있으며 그 이유는, His-태깅된 단백질은 Ni-NTA (니켈-니트릴로트리아세트산) 수지상에 특이적으로 트랩핑되며, 이는 EDTA 또는 이미다졸에 의해 용출될 수 있기때문이다. 기다 단백질 태그 예컨대, 말토오스-결합 단백질 (MBP), 스타필로코커스 단백질 A, 칼모둘린-결합 펩티드 (CBP) 및 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 (GST)가 또한 원핵생물 및 진핵생물 단백질 모두에 사용되었다. 그러나, 많은 이러한 친화 기법은 한 단계로 태깅된 단백질을 정제하는데 충분히 특이적이지 않는데, 그 이유는, 비-특이적 단백질이 또한 사용된 수지에 의해 빈번하게 트랩핑되기 때문이다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 단백질의 N-말단에 연속 융합되는 두개의 상이한 태그를 사용하는 친화 정제 시스템이 개발되었다 (Rigaut, G., et al. 1999, Nat Biotechnol 17:1030-2). 이러한 TAP 태그 (연속 친화 정제: Tandem Affinity Purification) 기법은 대상 단백질과의 복합물을 형성하는 단백질 인자를 식별하는데 매우 효과적인 것으로 입증되었다.
현 융합 태깅 시스템의 단점은 많은 단백질 정제 프로토콜에서 공통된 조건하에 태깅된 단백질의 정제 불능성 및 태깅된 융합 단백질의 저용해도를 포함한다. 게다가, 현 융합 태그는 단백질 구조의 분석 연구에 사용하기 어렵다. 예를 들어, His 태그는 NMR 구조 연구에 대해 고안된 실험에 있어서 사용될 수 없는데, 그 이유는 Ni++ 이온의 상자성 효과가 피크의 확대를 유도하고 데이타 수집을 방해하는 경우 Ni-NTA 수지가 NMR 분광기에 사용될 수 없기 때문이다.
이와 같이, 분석 기법 예컨대, 단백질 정제, NMR 및 x-선 결정학을 포함하는 단백질의 정제 및 연구, 및 특이적 단백질과 상호작용하는 단백질 인자의 확인을 위해, 태깅된 융합 단백질이 가요성 및 안정성을 유지하게 하는 개선된 태깅 시스템이 요구된다. 본 발명의 단백질 S 태그 기법은 불안정한 단백질의 발현을 개선시키기 위한 탁월한 융합 태그인 것으로 나타났다.
단백질 S는 영양 고갈시 다세포 자실체를 형성하는 발생적 그람-네거티즈 박테리아인 M. 산투스 (M. xanthus)의 스포어 코트 단백질이다 (문헌 [Dworkin, M., et al. 1985. Science 230:18-24, Shimkets, L.J. et al. 1990. Microbiol Rev 54:473-501] 참조). 자실체에서, 세포는 1㎛ 직경의 균일한 구형 스포어 (믹소스포어 (myxospores))로 전환되며, 이는 탈수 및 열에 고도로 내성을 띤다. 믹소스포어는 Ca++-의존성 방식으로 믹소스포어의 표면상에서 어셈블링되는 단백질 S로 불리는 주요 코어 단백질을 갖는 것으로 밝혀졌다 (Inouye, M., et al., 1979. Proc Natl Acad Sci USA 76:209-13).
믹소코커스 크산투스로부터의 단백질 S는 단백질의 N-말단에 융합되는 경우 이러한 단백질의 생산성 및 가용성을 현저하게 향상시킨다는 점에서 독특하다. 중요하게는, 본 발명과 관련된 실험 결과는 OmpR (전사 인자)와 단백질 S의 융합은 OmpR의 특성 (Harlocker, S.L., et al. 1995. J Biol Chem 270:26849-56)에 영향을 끼치지 않음을 보여주며, 이는 단백질 S 도메인이 독립적으로 폴딩되고, 대상의 표적 단백질과 상호작용하지 않을 것임을 나타낸다. 본 발명자들은 단백질 S 태깅된 단백질이 M. 크산투스의 자실체로부터 용이하게 정제되는 믹소스포어상에 특이적으로 포획될 수 있음을 발견하였다.
단백질 S는 수개의 독특한 특징이 있다. 단백질 S는 EDTA의 존재하에 또는 고염 농도하에서 용이하게 방출될 수 있다. 게다가, 정제된 단백질 S는 Ca++의 첨가시 믹소스포어의 표면상에서 용이하게 다시 어셈블링될 수 있다 (Inouye, M., et al., 1979. Proc Natl Acad Sci USA 76:209-13). 단일 믹소스포어는 이의 표면상에 어셈블링된 3.3 x 106 단백질 S 분자에 결합될 수 있다 (Inouye, M., et al., 1979. Proc Natl Acad Sci USA 76:209-13). 이의 NMR 용액상 구조는 173개의 아미노산 잔기로 이루어지며, 두개의 탠덤 Ca++-결합 도메인을 갖는 것으로 측정되었다 (도 1A: (Bagby, S., et al. 1994. Structure 2:107-22). 두개의 Ca++-결합 도메인은 연속중첩가능하고, 7개의 β-가닥 및 하나의 α 헬릭스로 이루어진다 (도 1A). 단백질 S 결정은 X-선 방사에 고도로 내성을 나타내는 것으로 입증되었다 (Inouye, S., 1980. J Biol Chem 255:3713-4). 단백질 S의 이러한 이점은 본 발명에서 입증된 바와 같이 매우 다양한 분야에 유용하다.
발명의 요약
본 발명은 믹소코커스 크산투스로부터의 PrS 태그 또는 PrS2 태그를 포함하는 다중 클로닝 부위를 함유하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 믹소코커스 크산투스로부터의 단백질 S의 하나 이상의 N-말 단 도메인(PrS 태그)을 엔코딩하는 핵산 서열을 표적 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열에 융합하여 PrS 태깅된 표적 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 생성시키고; 벡터로 단계 (a)의 단백질 S 태깅된 표적 단백질을 위치시키고; 벡터로 숙주 세포를 형질전화시키고; 유전자 발현에 적합한 조건하에 숙주 세포를 배양시켜, 발현된 PrS 태깅된 표적 단백질이 비태깅된 표적 단백질 보다 더욱 가용성을 띠게 하는 것을 포함하여, 표적 단백질의 용해도를 증가시키는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, PrS의 연속 반복 N-말단 도메인이 사용되며, PrS2 태그로 불린다.
본 발명은 추가로 믹소코커스 크산투스의 하나 이상의 믹소스포어에 결합된 PrS-태깅된 단백질 분자를 제공한다.
또한, PrS-태깅된 단백질을 믹소코커스 크산투스의 믹소스포어를 포함하는 친화성 수지와 접촉시켜 단백질 S 태깅된 단백질을 친화성 수지에 부동화시키는 것을 포함하여, PrS-태깅된 단백질을 정제하는 방법이 제공된다.
또한, PrS-태깅된 표적 단백질을 제조하고, 분석 연구를 수행하는 것을 포함하여, 분석 역구용 표적 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명은 추가로, 하나 이상의 PrS 태그 또는 PrS2 태그를 표적 단백질에 융합시키고, 핵자기공명법을 수행하고, 핵자기공명법으로부터의 데이타를 분석하는 것을 포함하여, 표적 단백질을 특징화시키는 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1. 단백질 S의 NMR 구조 및 PrS 태깅된 단백질의 개략도. A. Ca++ 이온 결합된 M. 크산투스 단백질 S의 NMR 구조 (Bagby, S., et al. 1994. Structure 2:107-22). B. PrS2-태그에 사용된 단백질 S의 N-말단 도메인 (1-92)이 도시됨. 단백질 S(1-92)(PrS2) (타원형)의 두개의 연속반복부가 대상 단백질 (백색 사각형)의 N-말단에 융합된다.
도 2. 야생형 OmpR과 PrS2-OmpR의 비교. A. EnvZc 및 PrS2-OmpS 간의 복합체 형성. EnvZc (4μM)과 PrS2-OmpR (4μM) (레인 4) 또는 OmpR (4μM) (레인 2)를 혼합하고, 실온에서 5분 동안 반응 완충제중에서 인큐베이션하였다. 샘플을 10% 천연 PAGE로 처리하였다. B. 포스포릴화된 EnvZc (EnvZc-P)로부터 PrS2-OmpR로의 포스포전달. 정제된 32P-라벨링된 EnvZc-P (2μM)을 반응 완충제 [50mM 트리스-HCl (pH 8.0), 50mM KCl, 5mM CaCl2, 5% 글리세롤]중에 OmpR (4μM), PrS2-OmpR (4μM), 또는 OmpR (2μM)와 PrS2-OmpR (2μM)의 혼합물과 혼합하였다. 최종 반응 혼합물을 실온에서 인큐베이션하였다. 분취물을 20, 40, 60 및 120초에서 제거하고, 반응을 5 x SDS 로딩 완충제로 중단시켰다. 샘플을 17.5% SDS-PAGE로 처리하였다. C. EnvZc에 의한 포스포릴화된 PrS2-OmpR (PrS2-OmpR-P)의 탈포스포릴화. 먼저, 정제된 32P-라벨링된 EnvZc-P (2μM)을 OmpR (4μM), PrS2-OmpR (4μM), 또는 OmpR (2μM)와 PrS2-OmpR (2μM)의 혼합물과 혼합하고, 반응 완충제 [50mM 트리스-HCl (pH 8.0), 50mM KCl, 5mM CaCl2, 5% 글리세롤]중에서 실온하에 2분 동안 인큐베이션시켜 OmpR-P 또는 PrS2-OmpR-P를 생성시켰다. 1mM의 최종 농도로 ADP를 첨가한 후, 분취물을 20, 40, 60 및 120초에서 제거하고, 반응을 5 x SDS 로딩 완충제로 중단시켰다. 샘플을 17.5% SDS-PAGE로 처리하였다. D. PrS2-OmpR-P의 DNA 결합. 겔의 상단에 나타난 바와 같이 OmpR-P과 PrS2-OmpR-P의 다양한 혼합물을 DNA 결합 완충제중에서 30-bp F1F2a DNA 단편과 혼합하였다. DNA 겔 이동도 분석 (gel mobility-shift assay)을 5'-말단 라벨링된 DNA 단편으로 수행하였다. a; 두개의 OmpR-P 분자/F1F2a 복합체, b; 하나의 OmpR-P 및 하나의 PrS2-OmpR-P 분자/F1F2a 복합체, 및 c; 두개의 PrS2-OmpR-P 분자/F1F2a 복합체. B, C 및 D로부터의 겔을 건조시키고, 오토라디로그래피를 위해 노출시켰다.
도 3. PrS2-OmpR의 믹소스포어로의 결합 특징화. A. 믹소스포어의 상 광학현미경 사진 (100 x 배율). B. PrS2-OmpR은 Ca++-의존 방식으로 믹소스포어에 결합한다. 정제된 PrS2-OmpR (3㎍)을 믹소스포어와 혼합하고, 20mM EDTA, 10mM MgCl2, 또는 10mM CaCl2의 존재하에 4℃에서 1시간 동안 50mM KCl을 함유하는 50mM 트리스-HCl 완충제중에서 인큐베이션시켰다. 세척 후, 믹소스포어를 원심분리에 의해 수집하고, SDS 로딩 완충제중에 현탁하였다. 샘플을 5분 동안 비등 수조에서 인큐베이션시키고, 이의 상청물을 17.5% SDS-PAGE로 처리하였다. 레인 1, 총 양의 정제 된 PrS2-OmpR을 사용하였다. C. EDTA는 믹소스포어에 결합된 PrS2-OmpR을 방출시킬 수 있다. 먼저, 믹소스포어로의 PrS2-OmpR 결합은 CaCl2의 존재하에 수행되었다. 믹소스포어는 원심분리에 의해 수집되고, 결합에 사용된 것과 동일한 완충제로 세척하였다. 수집된 믹소스포어를 20mM EDTA 또는 10mM CaCl2의 존재하에 15분 동안 50mM KCl을 함유하는 50mM 트리스-HCl 완충제중에 인큐베이션하였다. 레인 1, 사용된 총 양의 PrS2-OmpR, 레인 6, 믹소스포어에 결합된 총 PrS2-OmpR. D. E.coli 용해물에 첨가된 정제된 PrS2-OmpR은 특이적으로 믹소스포어에 의해 포획된다. 정제된 PrS2-OmpR (3㎍)을 E.coli BL21 (DE3) 용해물과 혼합하고, 믹소스포어로의 PrS2-OmpR의 특이적 결합을 시험하였다 (레인 5). 레인 1, 사용된 총 정제된 PrS2-OmpR; 레인 2, 정제된 PrS2-OmpR이 세포 용해물의 부재하에 첨가됨; 레인 3, 세포 용해물이 단독으로 사용됨; 레인 4, 세포 용해물이 PrS2-OmpR의 부재하에 첨가됨. E. PrS2-OmpR는 4M 우레아의 존재하에서도 믹소스포어에 결합할 수 있다. PrS2-OmpR 결합은 우레아 (2, 3 및 4M)의 존재하에 시험하였다. 레인 3-5, 세포 용해물 부재; 레인 7-9, 세포 용해물 존재; 레인 6, 사용된 E.coli BL21 (DE3) 용해물과 PrS2-OmpR의 혼합물.
도 4. DNA 풀-다운 (pull-down) 실험. A. ompF 프로모터 (ompF P )의 업스트 림 영역의 DNA 단편 및 정제된 EnvZc11 (OmpR를 포스포릴화시키는데 사용됨)를 혼합하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 PrS2-OmpR의 부재 (레인 3) 또는 존재 (레인 4)하에 50mM KCl, 10mM CaCl2, 및 1mM ATP를 함유하는 50mM 트리스-HCl (pH 8.0)중에서 인큐베이션하였다. 믹소스포어를 혼합물에 첨가하고, 이를 추가로 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 믹소스포어를 원심분리에 의해 수집하고, 샘플의 상청물을 1.7% 아가로스 겔 전기영동으로 처리하였다. 레인 1, 100-bp 마커 (Bio-Rad); 레인 2, ompF P DNA 단편. B. 상기 기술된 것과 동일한 시험을 두개의 상이한 선형 플라스미드의 혼합물을 이용하여 수행하였다; BamH I에 의해 분해된 pCR-ompF P 및 EcoR I에 의해 분해된 pET-EnvZc. 전자 플라스미드는 상기 A에 사용된 ompF P DNA 단편을 함유하는 반면, 후자 플라스미드는 OmpR 결합 부위를 함유하지 않는다. 샘플을 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 처리하였다. 레인 1, pCR-ompF P DNA 단편 및 pET-EnvZc DNA 단편; 레인 4, λ/Hind III 마커.
도 5. pCold(PST)III으로부터 유래된 pCold(PST) 벡터의 플라스미드 맵. A. pCold(PST)는 pColdIII 벡터로부터 유래된다 (Qing, G., et al. 2004. Nat Biotechnol 22:877-82). TEE: 번역 증강 엘리먼트. B. pCold(PST) 벡터에 대해 고안된 TEV 절단 부위, 다중 클로닝 부위, 트롬빈 절단 부위 및 His6 태그의 DNA 서열.
도 6. T-REx(PST)에 대해 고안된 TEV 절단 부위, 다중 클로닝 부위의 DNA 서열. c-myc 에피토프: [Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu].
도 7. pCold(PST)IV로부터 유래된 pCold(PST) 벡터의 플라스미드 맵. (a) 발현 벡터 pCold(PST)의 개략도. pCold(PST)는 저온 쇼크 벡터중 하나이며, 타카라 바이오 인크. (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)으로부터 입수가능한 pCold IV를 사용하여 작제된다. PrS 태그 또는 PrS2 태그의 DNA 단편이 삽입된 PrS 태그가 보여진다. PrS 태그는 Met1-Arg82와 Tyr93으로부터의 단백질 S의 N-말단 도메인으로 구성되며, PrS2 태그는 PrS 태그(Met1-Arg82)와 Tyr185의 두개의 연속 반복 서열로 이루어진다. (b) 다중 클로닝 부위 및 트롬빈 절단 부위의 서열. 트롬빈 절단 부위, LVPRGS; CTG GTG CCA CGC GGT AGT는 PrS 태그의 Tyr83 또는 PrS2 태그의 Tyr185 사이에 유입되며, 다중 클로닝 부위는 NdeI, SalI, XhoI, BamHI 및 XbaI 부위를 함유한다. cspA 3'-UTR, 번역 증강 엘리먼트, cspA 5'-UTR, lac 오퍼레이터 및 cspA 프로모터는 원래의 pCold IV 벡터로부터 기원한다.
본 발명은 단백질 S 태그 (PST)로 불리는 신규한 단백질 기법을 제공한다. 또한, 구조가 통상적인 방법에 의해 측정될 수 없는 단백질의 구조 연구에 대한 신규한 접근법을 제공한다.
본 발명자들은 인간 단백질을 포함하는 진핵생물 또는 원핵생물로부터의 단백질의 특징화를 위해 본 발명의 기법을 적용시킬 수 있다. 발현 시스템은 PrS 또는 PrS2 태그가 특이적 프로테아제 예컨대, TEV 프로테아제 또는 트롬빈에 의해 절단될 수 있는 방식으로 고안되기 때문에, 천연 형태와 동일한 가용성 단백질을 획득할 수 있다. 중요하게는, 본 발명자들은 PrS 및 PrS2 태그 둘 모두가 표적 단백질의 기능에 거의 영향을 끼치지 않음을 입증하였다 (Harlocker SL et al. J Biol Chem. 1995). 표적 단백질이 PrS 또는 PrS2 태그를 절단한 후에 불용성이 되는 경우, PrS 또는 PrS2 태그를 갖는 융합 단백질로서 표적 단백질의 기능을 여전히 특징화시킬 수 있다.
단백질이 믹소코커스 크산투스의 단백질 S의 N-말단 도메인과의 융합 단백질로서 발현되는 경우, 이들은 가용성 단백질로서 발현된다. 본 연구로부터의 결과는 인간, 드로소필라 (Drosophila), 카에노르하브디티스 엘레간스 (Caenorhabditis elegans)로부터의 진핵 단백질 및 E.coli로부터의 단백질의 많은 불용성의 또는 빈약한 발현의 용해도 및 발현 수준이 이들이 단백질 S와의 융합 단백질로서 발현되는 경우 현저하게 개선됨을 보여준다. 다르게는, 단백질은 불용성 형태로 발현된다. 이러한 적용 및 기타 적용을 위해, 믹소코커스 크산투스로부터의 단백질 S의 두개의 연속-반복된 N-말단 도메인 소위 "PrS2 태그" 및 단백질 S의 하나의 단일 N-말단 도메인 소위 "PrS 태그"가 상이하게 표적 단백질에 영향을 끼친다. 따라서, PrS 태그 또는 PrS2 태그를 갖는 표적 단백질을 발현시키는 발현 시스템이 본원에 제공된다. 본 발명은 M. 크산투스로부터의 단백질 S의 두개 초과의 N-말단 도메인을 갖는 발현 시스템을 또한 제공한다.
"키메라 분자 (chimeric molecule)"에서, 분리되어 존재할 수 있는 두개 또는 그 초과의 분자는 서로 연합되어 구성 분자 모두의 목적하는 작용성을 갖는 단일 분자를 형성한다. 키메라 분자의 구성 분자는 화학적 컨쥬게이션에 의해 합성적으로 연합되거나, 구성 분자가 모두 폴리펩티드인 경우, 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 단일 연속성 폴리펩티드가 발현되도록 함께 재조합적으로 융합될 수 있다. 이러한 키메라 폴리펩티드는 "융합 단백질"로서 불린다. "융합 단백질"은 구성 분자가 모두 폴리펩티드이며, 키메라 분자가 연속의 단일 사슬을 형성하도록 서로 부착 (융합)되는 키메라 분자이다. 다양한 구성 분자가 서로 직접적으로 부착될 수 있거나, 하나 또는 그 초과의 펩티드 링커를 통해 결합될 수 있다.
키메라 분자 예컨대, 본 발명의 융합 단백질에 관하여 사용된 "링커"는 키메라 분자의 구성 분자를 연결하거나 연합시키는 분자를 나타낸다. 키메라 분자가 융합 단백질인 경우, 링커는 융합 단백질을 포함하는 단백질을 연합시키는 펩티드일 수 있다. 링커는 일반적으로 단백질들을 연합시키거나 이들 단백질간의 최소 간격 또는 기타 공간적 관계를 유지시키는 것 이외에는 특이적인 생물학적 활성을 갖지 않지만, 펩티드 스페이서의 구성 아미노산은 분자의 특성 예컨대, 폴딩, 순전하, 또는 소수성에 일부 영향을 끼치도록 선택될 수 있다. 펩티드 링커는 선택적으로, 프로테아제에 의한 분해, 융합된 구성 폴리펩티드의 분리를 위한 부위를 선택적으로 포함할 수 있다. 하기 논의된 핵자기 공명 (Nuclear Magnetic Resonance) 연구를 위한 단백질 제조에 있어서, 바람직한 링커는 약 1 내지 약 20개 아미노산 잔기를 포함한다. 특히 바람직한 링커는 약 3 내지 약 10개 아미노산 잔기를 포함한다.
E.coli 및 포유동물 세포에서 단백질 S 태그 (PST) 발현 시스템의 작제
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터" 및 "발현 벡터"는 리플리콘 즉, 수송체 또는 트랜스포터로서 작용하는 제제 예컨대, 박테리오파아지 (파아지), 플라스미드, 파아지미드, 코스미드, 박미드 또는 바이러스를 나타내며, 여기에 다른 유전자 서열 또는 엘리먼트 (DNA 또는 RNA)가 부착되어 부착된 서열 또는 엘리먼트의 복제를 유발시킬 수 있으며, 이러한 서열 또는 엘리먼트를 숙주 세포로 운송할 수 있다. 본원에 기술된 E.coli 벡터 시스템은 pCold 벡터 (타카라 바이오, 인크.로부터 입수가능함)를 사용하며, 이는 저온에서 단백질 생성을 유도한다.
본 발명은 단백질 정제 및 NMR 구조 연구를 위한 pCold 저온 쇼크 벡터를 사용하는 E.coli 발현 시스템을 제공한다. 포유동물 테트라시클린-유도성 시스템은 생존하는 세포에서 대상 단백질과 함께 복합물을 형성하는 단백질 인자를 확인하는데 사용될 수 있다. 이러한 대상 단백질은 본원에서 "표적 단백질"로서 불리며, 이는 PrS 또는 PrS2 태그가 부착되는 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 단편을 나타낸다. 바람직한 구체예에서, 표적 분자는 단백질이다.
본 발명은 믹소코커스 크산투스로부터 PrS 태그 (SEQ ID NO:1) 또는 PrS2 태그 (SEQ ID NO:2)를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 함유하는 벡터를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 믹소코커스 크산투스로부터의 단백질 S의 N-말단 도메인으로부터 수득된 하나 또는 그 초과의 태그를 이용한다. PrS 및 PrS2 태그는 바람직하게는, 단백질 S의 아미노산 잔기 1-93 (SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO: 2)이나, 1-92 잔기 또는 1-94 잔기일 수 있거나, 단백질 S의 1 내지 173의 아미노산 잔기일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 벡터의 다중 클로닝 부위는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2를 포함한다. 벡터는 고발현 저온 쇼크 벡터 예컨대, pColdIII 또는 pColdIV 벡터일 수 있다. pColdIII 벡터는 E.coli에서의 발현에 바람직한데, 그 이유는 벡터 (도 5 참조)의 번역 증강 엘리먼트 (TEE)가 더욱 우수한 발현을 제공하기 때문이다. TEE 부재의 pColdIV 발현 (도 7)은 TEE가 번역에 부정적인 영향을 끼칠 경우 유용하다.
포유동물계에서, 바람직한 벡터는 PrS2-태깅된 단백질을 잠복시킨 인간 배아 신장 293 세포주 (TREx-PST)로부터 테트라시클린-유도성 PST 발현 시스템이다. 따라서, 본 발명은 인간 세포를 포함하는 포유동물 숙주 세포에서 발현된 벡터를 제공한다.
특정 핵산과 관련하여 본원에 사용된 용어 "엔코드", "엔코딩" 또는 "엔코딩된"은 특정 단백질로의 번역을 위해 핵산중에 저장된 정보를 나타낸다. 단백질을 엔코딩하는 핵산은 핵산의 번역된 영역내의 비번역된 서열 (예를 들어, 인트론)을 포함할 수 있거나, 이러한 중간의 비번역된 서열은 결여될 수 있다 (예를 들어, cDNA에서와 같이). 단백질이 엔코딩되는 정보는 코돈을 사용하여 구체화된다. 전형적으로, 아미노산 서열은 "유니버셜" 유전자 코드를 사용하여 핵산에 의해 엔코딩된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "코돈"은 폴리펩티드 사슬에서 아미노산 잔기를 함께 구체화시키는 누클레오티드의 트리플렛 (triplet)를 나타낸다. 대부분의 유기체는 단백질 또는 단백질 전구체인 이들의 폴리펩티드를 제조하는데 20 또는 21개 아미노산을 이용한다. DNA에는 네개의 가능한 누클레오티드 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C) 및 티민 (T)이 존재하기 때문에, 단지 20개 아미노산과 말단 시그널을 인지하는데는 64개의 가능한 트리플렛이 존재한다. 이러한 중복성으로 인해, 대부분의 아미노산은 1개 초과의 트리플렛에 의해 코딩된다. 단일 아미노산을 구체화하는 코돈이 동일한 빈도로 사용될 수 없다. 상이한 유기체는 종종 동일한 주어진 아미노산을 엔코딩하는 수개의 코돈중 하나에 대해 특정한 "선호"를 나타낸다. 코딩 영역이 높은 수준의 희귀 코돈 또는 희귀 코돈의 클러스터 (cluster)를 함유하는 경우, 유전자의 재합성 또는 돌연변이 유발에 의한 희귀 코돈의 제거는 발현을 증가시킬 수 있다. 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), at 15.12] 참조. 따라서, "코돈 선택"은 선택된 숙주에서 발현을 최적화시키는데 이용될 수 있다. 가장 바람직한 코돈은 고도로 발현된 유전자에서 주로 발견된 코돈이다. E.coli에서 "코돈 선호"는 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Konigsberg, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 80:687-91 (1983)] 참조.
당업자는 엔코딩 서열에서 단일 아미노산 또는 적은 분율의 아미노산을 변경, 첨가 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 첨가는 "보존적으로 변형된 변이체"이며, 여기서 변형은 아미노산의 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 초래한다. 용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열에 있어서, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 아미노산 서열을 엔코딩하거나 또는 아미노산 서열의 보존적으로 변형된 변이체를 엔코딩하는 핵산을 나타낸다. 유전자 코드의 겹침으로 인해, 많은 수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 엔코딩한다. 예를 들어, 코돈 UUA, UUG, CUU, CUC, CUA 및 CUG는 모두 아미노산 류신을 엔코딩한다. 따라서, 류신이 코돈에 의해 구체화된 모든 위치에서 코돈은 엔코딩된 폴리펩티드를 변형시키지 않으면서 기술된 상응하는 코돈중 어느 하나로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이"이며, 보존적으로 변형된 변이의 한 종류이다. 유전자 코드를 참조하여 폴리펩티드를 엔코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 당업자는 핵산의 각 코돈 (보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG; 및 보통 트립토판에 대해 유일한 코돈인 UGG 제외)은 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생성시킬 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 모든 침묵 변이는 본 발명의 범위내에 있다.
본 발명은 단백질 S의 생물학적 특성을 보유하는 단백질 S의 활성 부분, 단편, 유도체, 변이체 및 작용성 변이체를 포함한다.
결합쌍 중 하나의 구성원은 대상 단백질을 "태그"하는데 사용될 수 있으며, 다른 구성원은 친화성 리간드 또는 "친화성 수지"로서 사용된다. 이러한 단백질 "태그"는 재조합적으로 "융합"되고 발현되어 태그가 부착된 융합 단백질을 생성시킬 수 있다. 이어서, "태깅된" 융합 단백질은 태그의 결합 파트너와의 상호작용에 의해 친화 정제되고, 태그는 선택적으로 절단되어 순수한 단백질을 방출시킨다.
용어 "유전자"는 특이적 작용성 단백질 (즉, 단백질 또는 RNA 분자)를 엔코딩하는 DNA의 세그먼트상의 특정 위치에서 위치하는 누클레오티드의 정열된 서열을 나타낸다. 이는 코딩 DNA을 선행하고 후속하는 영역 및 엑손 사이의 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "유도" 또는 "유도성"은 전사 또는 합성이 세포를 유도인자 또는 조건 예를 들어, 열에 노출시킴으로써 증가되는 유전자 또는 유전자 생성물을 나타낸다.
용어 "유도 인자" 또는 "유도제"는 리프레서 단백질과 결합되어 오퍼레이터에 더 이상 결합할 수 없는 복합물을 형성하는 저분자량의 화합물 또는 물리적 제제를 나타낸다.
용어 "유도"는 일부 특정 결과 예를 들어, 특정 유전자 또는 오페론의 전사, 또는 특이적 자극으로의 노출 후 유기체에 의한 단백질의 생성을 초래하는 작용 또는 과정을 나타낸다.
세포로 핵산을 삽입시키는 내용에 있어서 용어 "유입된", "트랜스펙션", "형질전환" 및 "트랜스덕션"은 핵산의 원핵세포 또는 진핵세포로의 편입을 포함하며, 여기서, 핵산은 세포의 게놈 (예를 들어, 크로모좀, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA)으로 편입되거나, 독립적 레플리콘으로 전환되거나, 일시적으로 발현될 수 있다 (예를 들어, 트랜스펙션된 mRNA).
용어 "단리된"은 물질 예컨대, 핵산 또는 단백질을 나타내는 것으로서, 자연 발생 환경에서 발견되는 바와 같은 이들과 상호작용하거나 정상적으로 이들을 동반하는 성분들로부터 실질적으로 유리된 것을 나타낸다. 단리된 물질은 선택적으로, 이의 천연 환경에서의 물질과 발견되지 않는 물질을 포함하거나; 물질이 이의 천연 환경에서 존재하는 경우, 물질이 고의적인 인간 간섭에 의해 합성적으로 (비천연적으로) 변형된다. 예를 들어, "단리된 핵산"은 벡터 예컨대, 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 삽입되거나, 원핵세포 또는 진핵세포 또는 숙주 유기체의 게놈 DNA로 인테그레이팅된 DNA 분자를 포함할 수 있다. RNA에 적용되는 경우, 용어 "단리된 핵산"은 주로 상기 규정된 바와 같은 단리된 DNA 분자에 의해 엔코딩된 RNA 분자를 나타낸다. 대안적으로, 본 용어는 천연 상태 (즉, 세포 또는 조직)에서 일반적으로 결합된 다른 핵산으로부터 충분하게 분리된 RNA 분자를 나타낼 수 있다. 단리된 핵산 (DNA 또는 RNA)는 또한, 생물학적 또는 합성적 수단에 의해 직접 생상된 분자를 나타내며, 이러한 생성 동안 존재하는 다른 성분으로부터 분리될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 분자를 포함하며, 단일 가닥인 경우, 선형 또는 환형의 이의 상보적 서열 분자를 포함한다. 핵산 분자를 논의하는데 있어서, 특정 핵산 분자의 서열 또는 구조는 5' 내지 3' 방향의 서열을 제공하는 전형적인 관례에 따라 본원에 기술될 수 있다. 다르게 제한되어 있지 않는 한, 용어는 공지된 유사어를 포함한다.
용어 "올리고누클레오티드"는 포스포디에스테르 결합에 의해 연합된 두개 또는 그 초과의 바람직하게는, 3개 초과의 리보- 또는 데옥시리보누클레오티드로 이루어진 핵산 분자를 나타낸다.
용어 "오퍼레이터"는 유전자(들)의 업스트림 (5')이며, 하나 이상의 조절 단백질 (리프레서 또는 활성 인자)가 결합되어 유전자(들)의 발현을 조정하는 DNA의 영역을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "오페론"은 유전자 발현을 조정하기 위한 작용적으로 인테그레이팅된 유전자 유닛을 나타낸다. 이는 구조적 유전자의 전사를 조절함으로써 이의 발현을 조정하는 하나 또는 그 초과의 폴리펩티드(들) 및 인접 부위 (프로모터 및 오퍼레이터)를 엔코딩하는 하나 또는 그 초과의 유전자로 이루어진다. 용어 "발현 오페론"은 전사 및 번역 조정 서열 예컨대, 프로모터, 인핸서, 번역 개시 시그널, 폴리아데닐화 시그널, 종결 인자 등을 포함할 수 있으며, 숙주 세포 또는 유기체에서 폴리펩티드 코딩 서열의 발현을 촉진하는 핵산 세그먼트를 나타낸다.
문구 "작동적으로 연결된"은 프로모터와 이차 서열간의 작용성 연결을 포함하며, 여기서 프로모터 서열은 이차 서열에 상응하는 DNA 서열의 전사를 개시하고 중개한다. 일반적으로, 작동적으로 연결된다는 것은, 연결되는 핵산 서열이 연속적이며, 두개의 단백질 코딩 영역을 연결해야 하는 경우, 연속적이며 동일한 리딩 프레임내에 존재한다는 것을 의미한다.
약어 "ORF"는 "오픈 리딩 프레임"을 나타내며, 내부 중지 서열에 의해 저지되지 않으며, 펩티드 또는 단백질을 엔코딩할 잠재성을 갖는 염기 서열을 함유하는 유전자 서열의 부분이다. 오픈 리딩 프레임은 개시 코돈으로 출발하며 종료 코돈으로 종결된다. 종료 또는 중지 코돈은 폴리펩티드의 말단을 결정한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 나타내기 위해 혼용되어 사용된다. 본 용어는 아미노산 폴리머로서, 이의 하나 또는 그 초과의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학 유사체인 아미노산 폴리머 및 자연 발생 아미노산 폴리머에 적용된다.
약어 "PCR"은 중합효소 연쇄 반응을 나타내며, 이는 DNA의 양을 증폭시키기 위한 기법으로서, DNA를 더욱 용이하게 분리하고, 클로닝하고 시퀀싱하게 하는 기법이다. 예를 들어, 본원에 참고문헌으로서 인용된 U.S. 특허 5,656,493, 5,33,675, 5,234,824 및 5,187,083 참조.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 전사가 개시되는 DNA 업스트림 (5')의 영역을 포함하며, 전사를 개시하기 위한 RNA 폴리머라아제 및 기타 단백질의 인지 및 결합에 관여한다. 용어 "유도성 프로모터"는 특정 화합물 즉, 유도 인자 또는 유도제의 존재, 또는 규정된 외부 조건 예를 들어, 증가된 온도에 반응하여 활성화될 수 있는 프로모터를 나타낸다.
문구 "부위-특이적 돌연변이 유발"은 실험관내 기법으로서, 재조합 DNA 방법을 이용하여 특이적 부위에서 DNA 조각으로 염기 변화 즉, 변이가 유발되는 기법이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "비번역된 영역" 또는 UTR은 염기가 단백질 합성에 관련되지 않은 DNA의 부부을 나타낸다.
핵산의 특정 서열의 "변이체", "돌연변이" 및 "유도체"는 특정 서열에 밀접하게 관련이 있으나, 서열 또는 구조의 자연적인 또는 고의적인 변화를 포함할 수 있는 핵산 서열을 나타낸다. "밀접하게 관련된"은 서열의 누클레오티드의 약 60% 이상, 종종 85% 초과가 규정된 길이의 핵산 서열에 걸쳐서 정합되는 것을 의미한다. 밀접하게 관련된 핵산 서열간의 누클레오티드 서열의 변화 또는 차이는 특정 핵산 서열의 천연 듀플리케이션 또는 전형적인 복제 관정 동안 발생하는 서열의 누클레오티드 변화를 나타낼 수 있다. 기타 변화는 특이적으로 고안될 수 있으며, 특정 목적을 위해 서열로 유입될 수 있다. 이러한 특이적 변화는 다양한 돌연변이유발 기법을 이용하여 실험관내에서 이루어질 수 있다. 특이적으로 발생된 이러한 서열 변이체는 기원 서열의 "변이체" 또는 "유도체"로서 언급될 수 있다.
마찬가지로, 당업자는 단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실, 첨가 또는 대체된 단백질 변이체를 생성시킬 수 있다. 이러한 변이체는 특히 (a) 하나 또는 그 초과의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비보존적 아미노산으로 치환된 변이체; (b) 하나 또는 그 초과의 아미노산이 첨가된 변이체; (c) 하나 이상의 아미노산이 치환기를 포함하는 변이체; (d) 한 종으로부터의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비보존적 위치에서 다른 종의 상응하는 잔기로 치환되는 변이체; 및 (e) 표적 단백질이 또 다른 펩티드 또는 폴리펩티드 예컨대, 융합 파트너, 단백질 태그 또는 기타 화학 부분과 융합되며, 표적 단백질 예를 들어, 항체의 에피토프에 유용한 특성을 부여할 수 있는 변이체를 포함할 수 있다. 유전자 (억제, 결실, 변이 등), 화학적 및 효소 기법을 포함하는 이러한 변이체를 수득하기 위한 기법은 당업자에게 공지되어 있다.
친화 정제
친화 정제를 위한 믹소스포어의 사용
본 발명은 또한, 태깅된 단백질을 믹소코커스 크산투스의 믹소스포어를 포함하는 친화성 수지와 접촉시켜, 친화성 수지에서 PrS-태깅된 또는 PrS2-태깅된 단백질을 고정화시키는 것을 포함하여, PrS-태깅된 또는 PrS2-태깅된 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 믹소코커스 크산투스의 하나 또는 그 초과의 믹소스포어에 결합된 PrS-태깅된 또는 PrS2-태깅된 단백질 분자가 또한 제공된다. PrS 또는 PrS2 태그는 Ca2+ 또는 Mg2+의 존재하에 믹소스포어 (M. 크산투스의 스포어)의 표면에 결합할 수 있다. 이러한 정제 방법의 한 구체예에서, PrS-태깅된 또는 PrS2-태깅된 단백질은 Ca2+ 또는 Mg2+의 존재하에 친화성 수지와 접촉한다. PrS-태깅된 또는 PrS2-태깅된 단백질은 칼슘 또는 마그네슘을 킬레이트화시키는 시약을 첨가함으로써 친화성 수지로부터 방출된다. 따라서, 믹소스포어를 사용하여, PrS-태깅된 표적 단백질은, 믹소스포어의 표면에 결합하고, EDTA 또는 EGTA와 같은 킬레이트화제를 첨가함으로써 믹소스포어의 표면으로부터 용이하게 방출되기 때문에 특이적으로 분리될 수 있다.
단백질의 친화 정제에서 수지로서 사용하기 위해, 믹소스포어는 25mM EDTA로 세척되어 믹소스포어의 표면상에 존재하는 단백질 S 및 단백질 C를 제거하였다. 정제된 믹소스포어는 약 1㎛ 직경의 균일한 구형 입자로 구성된다. 이는 연장된 기간 동안 용액중에 균일하게 현탁될 수 있다. 특히, 믹소스포어는 단백질 S 에 대한 높은 흡수성 (3.3 x 106 분자/스포어)을 가지며, 이는 단백질의 친화 정제에 이상적이다.
본 발명의 친화 정제는 믹소스포어를 세포 용해물과 1시간 동안 4℃에서 단순하게 인큐베이션시키고, 저속 원심분리에 의해 이들 믹소스포어를 수집함으로써 용이하게 수행된다. 융합 단백질의 믹소스포어로의 친화도는 10-9M의 범위내에 있으며, 믹소스포어는 E.coli 세포에서 매우 낮은 수준으로 발현되는 융합 단백질을 특이적으로 포획할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 따라 정제된 단백질을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 정제된 단백질은 PrS-태깅된 또는 PrS2-태깅된 단백질이다.
본 발명은 또한, PrS-태깅된 단백질을 정제하는 방법에 사용하기 위한 설명서 및 친화성 수지를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 추가로, PrS-태깅된 단백질을 생성하는 요소를 포함한다.
용어 "친화성 리간드" 또는 "친화성 제제"는 높은 친화도로 동종 리간드에 특이적으로 결합하는 제제를 나타낸다. 이러한 제제는 지지체 소위, "기질", "수지" 또는 "매트릭스 물질"에 부착되어 "친화성 매트릭스" 또는 "수지 매트릭스" 또는 "친화성 수지"를 형성할 수 있다. 본 발명의 친화성 수지는 M. 크산투스의 스포어 소위, 믹소코커스 크산투스의 "믹소스포어", 또는 이의 각각의 동족 리간드에 결합할 수 있는 이의 유도체 또는 단편을 포함한다. 동종 리간드는 방출제와 방출될 때 까지 매트릭스상에 "고정화"되거나 "보유"되거나 "결합"될 수 있다.
"방출제"는 친화성 매트릭스로부터 고정화된 결합된 분자를 방출할 수 있는 조성물을 나타낸다 (예를 들어, 믹소스포어 친화성 수지 매트릭스로부터 결합된 PrS- 또는 PrS2-태깅된 분자를 방출). 본 발명의 방출제는 부착되는 분자로부터 결합된 태그를 분리하기 위해 프로테아제 분해, 이가 양이온 격리 및 단백질 변성을 포함하는 다양한 메카니즘을 통해 처리될 수 있다.
분석 기법:
본 발명의 방법은 인간 단백질을 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물로부터의 단백질의 특성 결정에 적용가능하다. 발현 시스템은 PrS 또는 PrS2 태그가 특이적 프로테아제 예컨대, TEV 프로테아제 또는 트롬빈에 의해 절단될 수 있는 방식으로 고안되기 때문에, 이의 천연 형태와 동일한 가용성 단백질을 획득할 수 있다. 이전에, 본 발명자들은 PrS 및 PrS2 태그 둘 모두가 표적 단백질의 기능에 전혀 영향을 끼치지 않거나 무시할 정도의 영향을 끼친다는 것을 입증하였다 (Harlocker SL et al. J Biol Chem. 1995). 따라서, 표적 단백질이 PrS 또는 PrS2 태그의 절단 후에 불용성이 되는 경우에도, PrS 또는 PrS2 태그와의 융합 단백질로서 표적 단백질의 기능을 특징화시키는 것이 가능하다.
중요하게는, 본 발명의 PrS 및 PrS2 태그는 프로테아제에 고도로 안정적이며 내성을 띤다. 게다가, 단백질 S의 구조는 NMR에 의해 측정되었으며 (Bagby S et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1994, Wenk M et al. J Mol Biol. 1999), 용이하게 결정을 형성하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 이점을 이용하여, 본 발명의 PrS 및 PrS2 태그는 구조 연구 예컨대, 고농도의 불안정한 단백질의 x-선 결정학 및 핵자기공명 (NMR)에 적용될 수 있다. 본 발명자들은 PrS2 태그와 융합된 표적 단백질의 NMR 스펙트럼이 PrS2 태그에 의해 영향을 받지 않음을 입증하였다. PrS2 태그는 표적 단백질이 이와 융합되는 경우, 표적 단백질의 결정 형성을 향상시켰다.
믹소스포어상에 포획된 단백질 S-태깅된 단백질의 NMR 구조 연구
용액중에서 약한 수용성을 나타내거나 불안정하기 때문에 통상적인 기법 (X-선 및 NMR)에 의해서는 삼차원 구조가 측정될 수 없는 많은 단백질이 존재한다. 본 발명에 의해 제공된 이러한 기법은 믹소스포어상에 포획된 PrS 또는 PrS2-태깅된 단백질을 사용하여 본 문제를 극복하였다.
믹소스포어의 표면에 결합하는 PrS2 태그의 이러한 특성을 이용하여, PrS2-태깅된 표적 단백질의 NMR 스펙트럼으로부터 PrS2 태그의 스펙트럼을 제거하는 것이 가능하다. PrS2 태그의 믹소스포어의 표면으로의 상호작용이 이의 움직임을 제한하기 때문에, 이의 시그널을 현저하게 저하시킬 것이다. 저하된 시그널을 유도하는 이러한 제한 효과는 확장된 효과로서 공지된다. 다른 한편, 호환성 링커에 의해 PrS2 태그에 융합된 표적 단백질은 이의 자유로운 회전 움직임을 보유하여, NMR 연구를 위한 만족할만한 시그널을 제공한다. PrS2 태그를 표적 단백질에 연결시키는 링커는 PrS2-태깅된 융합 단백질의 NMR 연구 및 결정화에서 중요한 역할을 갖는다. 따라서, 상이한 길이의 링커를 갖는 발현 시스템을 고안하는 것이 유용하다. 바람직한 링커는 약 1 내지 약 20개 아미노산 잔기를 포함한다. 특히 바람직한 링커는 약 3 내지 약 10개 아미노산 잔기를 포함한다. 청구항 1의 방법에서, PrS-태깅된 단백질은 단백질 S와 표적 단백질간의 링커를 포함한다.
본 발명의 방법은 PrS-태깅된 또는 PrS2-태깅된 표적 단백질을 제조하고, 분석 연구를 수행하는 것을 포함하여, 분석용 연구를 위한 표적 단백질을 제조하는 방법을 포함한다. NMR 이외의 본 발명에 유용한 기타 연구는 약물 스크리닝 검정, 결합 검정 및 X-선 결정학 또는 가용성 표적 단백질이 요구되는 기타 연구를 포함한다.
본원에 사용되고 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 다르게 명확히 지시되어 있지 않는 한 복수를 포함한다.
다르게 규정되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당해분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 지닌다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 하기에 기술되어 있다. 본원에 언급된 모든 공개 문헌은 본원에 참고문헌으로 인용되며, 공개문헌이 언급된 것과 관련하여 상기 방법 및/또는 재료를 기술한다.
하기 실시예는 본 발명을 어떻게 수행하고 이용하는지에 대한 전면적인 기재 및 기술을 당업자에게 제공하기 위해 기술되었으며, 발명자들이 발명에 대해 고려하는 범위를 제한하거나 하기 실험이 전부 또는 단지 수행된 실험만을 나타내는 것이 아니다. 이용된 수치 (예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확하게 하고자 노력을 기울였으나, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 다르게 지적되지 않는 한, 부는 중량부이며, 분자량은 중량평균 분자량이며, 온도는 섭씨이며, 압력은 대기압 또는 이와 유사한 압력이다.
범위 값이 본원에 제공된 경우, 본원에 다르게 분명히 지시되어 있지 않는 한, 하한값의 단위의 십의 자리까지의 각각의 중간 값은 이러한 범위의 상한값과 하한값 사이에 존재하며, 언급된 범위내의 기타 언급된 값 또는 중간 값 또한 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 더 좁은 범위에 독립적으로 포함될 수 있는 더 좁은 범위의 상한값 및 하한값 또한, 본 발명에 포함되며, 언급된 범위내에서 특정하게 제외된 한계값으로 처리된 본 발명에 포함된다. 언급된 범위가 이러한 한계치의 한쪽 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 이러한 포함된 한계치 둘 모두 를 제외한 범위 또한 본 발명에 포함된다.
본원에 논의된 공개문헌은 본 발명의 출원일 전에 발표된 것으로 제공된다. 본 발명이 종래 발명에 의해 이러한 공개 보다 먼저 발생하지 않았음을 인정한 것으로서 해석되지 않는다. 또한, 제공된 공개 날짜는 독립적으로 확인될 수 있는 실제적 공개일과 상이할 수 있다.
단백질 S-OmpR 융합물
OmpR은 주요 외막 단백질을 엔코딩하는 ompF 및 ompC 유전자의 상호 발현에 요구되는 E.coli의 전사 인자이다. 이전에는, 이를 단백질 S (PrS2-OmpR)의 N-말단 도메인 (잔기 1-92)의 두개의 연속 반복부에 융합시켜 ompF 프로모터의 업스트림 영역에서 정확한 수의 OmpR-결합 부위를 측정하였다 (Harlocker, S.L., et al. 1995. J Biol Chem 270:26849-56). OmpR의 N-말단에서 단백질 S의 이러한 융합은 OmpR의 DNA 결합 능력을 방해하지 않았으며, 따라서, OmpR 및 PrS2-OmpR이 상이한 비로 혼합되는 경우 DNA 지연 검정에서 래더 (ladder)의 형성을 허용한다.
최근에 본 발명자들은 DNA에 결합하는 OmpR의 상세한 분자 메카니즘을 추가로 특성 결정하였다. 이러한 실험 동안, 본 발명자들은 (a) PrS2-OmpR이 야생형 OmpR 보다 pET 발현시스템에서 현저하게 높은 수준으로 발현하고, (b) 용액중의 OmpR 용해도가 단백질 S 융합에 의해 극적으로 (20배 초과) 향상됨을 발견하였다.
의의
1. E.coli중의 pCold를 사용하여 제안된 단백질 S-태그 (PST) 벡터는 (a) 매 우 높은 수준의 발현, (b) 다른 발현시스템에 의해 용이하게 발현될 수 없는 단백질의 발현, (c) 불안정한 단백질의 발현, 및 (d) 단백질 용해도의 극적인 증가를 허용하는 가장 다능한 발현시스템이며, 다르게는, 봉입체내에서 발현될 것이다. 이러한 특징은 NMR 연구를 위해 이소토프 (15N 및 13C)로 표적 단백질을 라벨링하는데 있어서 대단한 이점을 제공한다.
2. 포유동물 세포에서 제안된 PST 벡터 시스템은 단백질 복합물의 형성 및 단백질-단백질 상호작용을 확인할 수 있게 해준다. 특히, 상기 벡터 시스템은 생세포에서만 복합물을 형성하는 단백질 인자를 확인가능하게 할 수 잇다.
3. 믹소스포어의 용도는 하기 세 관점에서 주목할만하다; (a) M. 크산투스 배양물을 제조하는 것이 매우 용이하며, 최종 정제된 믹소스포어는 비교적 저렴하다. (b) 이들은 균일하며, 방사선에 의해 완전하게 생물학적으로 불활성인 입자로 전환되어 (발육을 억제하기 위해) 이들은 무한하게 실험에 재사용될 수 있다. (c) 믹소스포어의 밀도는 비교적 낮아서 균질한 현탁액으로 더욱 용이하게 재현탁될 수 있다.
4. 본 발명자들은 단백질 S가 4M 우레아의 존재하에서도 믹소스포어에 결합할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 단백질 S에 융합된 일부 단백질이 봉입체를 형성하지만, 4M 우레아로의 용해 후 이들 단백질을 재폴딩하고 믹소스포어를 사용하여 정제하는 것이 가능하다. 실제로, 유사한 방법이 His-태깅된 단백질에 대해 성공적으로 이용된다.
5. 본 발명의 제안된 PST 기법은 신규하며 고도의 다용성을 지니며, 단백질 기법에 중대한 기여를 하는 것으로 예상된다.
C. 예비 연구
1. OmpR에 융합된 PrS
2
태그는 OmpR의 특성에 영향을 끼치지 않는다.
OmpR 즉, E.coli의 전사 인자를 단백질 S (PrS2-OmpR)의 N-말단 도메인 (잔기 1-92)의 두개의 연속 반복부에 융합하여 ompF 프로모터의 업스트림 영역에서 정확한 수의 OmpR-결합 부위를 측정하였다 (Harlocker, S.L., et al. 1995. J Biol Chem 270:26849-56). OmpR은 두 성분 시그널 트랜스덕션 시스템에 관련된 반응 조절 인자이며, 이의 동종의 히스티딘 키나아제는 EnvZ이다. EnvZ는 보존된 Asp 잔기 (D55)에서 OmpR을 포스포릴화시켜 포스포릴화된 OmpR (OmpR-P)를 생성시키고, 또한 OmpR-P를 탈포스포릴화시킬 수 있다. 본 발명자는 OmpR에 융합된 PrS2 태그가 (i) OmpR EnvZ (EnvZc) dml 및 세포질 도메인간의 복합물 형성, (ii) OmpR의 포스포릴화 및 OmpR-P의 탈포스포릴화, 및 (iii) Ompr의 DNA 결합을 모니터링함으로써 OmpR의 특성에 영향을 끼치는 지의 여부를 시험한다.
EnvZc/OmpR 복합물이 천연-PAGE에 의해 용이하게 검출될 수 있음은 공지되어 있다 (Yoshida, T., et al. 2002. Mol Microbiol 46:1273-82). 도 2A에 도시된 바와 같이, 정제된 OmpR 및 EnvZc가 혼합되고, 10% 천연-PAGE로 처리되는 경우, 이들은 복합물을 형성하며 (레인 2), 이는 OmpR 및 EnvZc (각각 레인 1 및 3) 보다 느리게 이동한다. 본 발명자들은 PrS2 태그가 EnvZc 및 OmpR간의 복합 형성에 영향을 끼치지는 지를 시험하였다. 정제된 EnvZc 및 PrS2-OmpR이 혼합되는 경우, 이들 둘은 복합물을 형성하며 (레인 4), 이는 OmpR에 융합된 PrS2 태그가 EnvZc 및 OmpR간의 복합물 형성을 방해하지 않음을 입증한다.
다음으로, 본 발명자들은 EnvZc 및 OmpR의 효소 특성이 OmpR과 PrS2 태그의 융합에 의해 영향을 받는지를 시험하였다. 먼저, EnvZc-P에 의한 PrS2-OmpR의 포스포릴화를 시험하였다. OmpR이 정제된 32P-라벨링된 포스포릴화된 EnvZc (EnvZc-P)와 혼합되는 경우, EnvZ상의 포스포릴기는 즉각 OmpR로 이동되며, 이러한 반응은 120초내에 완료된다 (레인 2-5, 도 2B). 이러한 반응이 PrS2-OmpR으로 수행되는 경우, EnvZc-P는 PrS2-OmpR을 포스포릴화시킬 수 있으며, 결과는 비태깅된 OmpR과 거의 동일하였다 (레인 7-10, 도 2B). 경쟁 실험은 OmpR과 PrS2-OmpR이 EnvZc-P에 대한 동일하게 우수한 물질임을 추가로 입증해준다 (레인 12-15, 도 2B). 두번째로, 포스포릴화된 PrS2-OmpR의 탈포스포릴화를 시험하였다. 상기 기술된 바와 같이 OmpR-P를 생성시킨 후, OmpR-P의 탈포스포릴화를 ADP의 첨가시 관찰하였으며, 상기 ADP는 이러한 반응에 대한 보조-인자로서 공지되어 있으며, EnvZc의 포스파타아제 활성을 자극한다. OmpR-P는 신속하게 탈포스포릴화되며, Pi는 도 2C의 레인 3-6에 도시된 바와 같이 방출된다. PrS2-OmpR의 경우, 이러한 반응이 PrS2 태그에 의해 느려지더라도, 포스포릴화된 PrS2-OmpR는 EnvZc에 의해 탈포스포릴화된다 (레인 9- 12). OmpR과 PrS2-OmpR간의 경쟁 실험은 또한, OmpR-P 및 PrS2-OmpR이 EnvZc에 대한 기질로서 동일하게 작용함을 입증한다.
최종적으로, 본 발명자들은 PrS2-OmpR의 DNA로의 결합이 PrS2 태그에 의해 영향을 받는지의 여부를 시험하였다. 두개의 OmpR-P 분자는 각 20-bp 결합 부위에 결합하여 DNA상의 다이머형 구조를 형성할 수 있다는 것은 공지되어 있다. OmpR-P가 20-bp F1 부위 및 F2 (F2a)의 절단 부위를 갖는 30-bp DNA 단편 (F1F2a)와 혼합되는 경우, OmpR-P/F1F2a 복합물이 검출되었다 [밴드 (a), 레인 2]. PrS2-OmpR이 혼합되는 경우, PrS2-OmpR/F1F2a 복합물은 OmpR-P/F1F2a 복합물보다 더욱 느리게 이동하며, PrS2-OmpR/F1F2a 복합물밴드의 이동은 더욱 지연되었다 [밴드 (c), 레인 8]. OmpR 및 PrS2-OmpR의 다양한 혼합물이 F1F2a와 혼합되는 경우, 또 다른 새로운 밴드가 밴드 (a)와 밴드 (c) 사이에 발생하였다 [레인 3-7에서 밴드 (b)]. 이러한 밴드는 하나의 OmpR 분자 및 하나의 PrS2-OmpR 분자의 F1F2a로의 결합으로부터 유도되며, 이는 PrS2 태그가 OmpR의 DNA 결합 능력 및 DNA상에 결합된 OmpR 분자간의 상호작용에 영향을 끼치지 않음을 나타낸다.
이들 데이타는 OmpR에 융합된 PrS2 태그가 OmpR의 특성을 변화시키지 않음을 입증하며, PrS2 태그 도메인이 OmpR에 독립적으로 폴딩됨을 시사한다.
2. 믹소스포어로의 PrS
2
-OmpR의 결합은 Ca
++
-의존적이다.
새로 작제된 PrS2 단편 (단백질 S의 N-말단 도메인의 두개의 연속 반복부) 및 PrS2-OmpR이 믹소스포어에 결합할 수 있는지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 M. 크산투스의 10일의 성숙한 봉입체로부터 믹소스포어를 제조하였다. 본 발명자들은 1.5-L 배양물로부터 약 2g의 정제된 믹소스포어를 채취할 수 있었다. 단백질 S (Inouye, M., et al., 1979. Proc Natl Acad Sci USA 76:209-13) 및 단백질 C (McCleary, W.R., et al. 1991. J Bacteriol 173:2141-5)를 사용전에 20mM EDTA로 이를 세척함으로써 믹소스포어로부터 완전하게 제거하였다.
먼저, 본 발명자들은 PrS2-OmpR이 Ca++-이온 의존성 방식으로 단백질 S 비함유 믹소스포어로 결합하는지를 시험하였다. 정제된 PrS2-OmpR (3㎍)을 20mM EDTA, 10mM MgCl2, 또는 10mM CaCl2의 존재하에 50mM KCl을 함유하는 100㎕의 50mM 트리스-HCl (pH 8.0) 완충제중에서 믹소스포어와 혼합하고, 최종 혼합물을 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 믹소스포어를 미세원심분리 (Biofuge Pico, SORVALL)를 이용하여 3분 동안 6,500rpm에서 원심분리에 의해 수집하고, 믹소스포어 펠렛을 각각의 결합 완충제로 1회 세척하였다. 최종 믹소스포어 펠렛을 20㎕의 SDS-로딩 완충제 [20mM 트리스-HCl (pH6.8), 40mM β-메르캅토에탄올, 0.8% (w/v) SDS, 4% 글리세롤 및 0.04% (w/v) 브로모페놀 블루]중에 현탁시켰다. 믹소스포어 현탁물을 5 분 동안 비등 수조에서 인큐베이션하였다. 이러한 처리에 의해, 믹소스포어 표면에 결합된 단백질만이 용해되며, 믹소스포어의 세포내 단백질에는 영향을 끼치지 않았다. 그 후, 이러한 샘플을 17.5% SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 도 3B에 도시된 바와 같이, PrS2-OmpR을 MgCl2 (레인 3) 및 CaCl2 (레인 4)의 존재하 및 EDTA의 부재(레인 2)하에 믹소스포어에 결합시켰다.
믹소스포어에 결합된 단백질 S가 EDTA의 첨가에 의해 방출될 수 있기 때문에, 본 발명자들은 또한, EDTA가 믹소스포어에 결합된 PrS2-태깅된 단백질을 방출할 수 있는지의 여부를 시험하였다. PrS2-OmpR을 1시간 동안 4℃에서 믹소스포어와 인큐베이션한 후, 믹소스포어 펠렛을 실온에서 15분 동안 EDTA 완충제 [50mM 트리스-HCl (pH6.8), 50mM KCl 및 20mM EDTA]중에서 인큐베이션하였다. PrS2-OmpR는 EDTA의 존재하에 (레인 2, 도 3C) 상청액으로 방출되는 반면, PrS2-OmpR는 Ca++의 존재하에 (레인 4, 도 3C) 믹소스포어에 결합된채 유지되었다. 이들 결과는 PrS2-태깅된 OmpR중의 PrS2 단편이 Ca++-의존적 방식으로 믹소스포어의 표면에 결합할 수 있는 능력을 충분히 보유함을 입증해준다. Mg++이온의 존재하 단백질 S가 믹소스포어에 결합할 수 있지만, 이의 결합은 Ca++의 존재하에서 보다 약한 것으로 공지되어 있음을 주목하라 (Inouye, M., et al., 1979, Proc Natl Acad Sci USA 76:209-13). 따라서, PrS2-태깅된 단백질로의 모든 실험에 있어서, Ca++ 이온이 결합 완충제에 포함된다.
본 발명자들의 다음 의문점은 PrS2-태깅된 단백질이 어떻게 믹소스포어에 특이적으로 결합하는지이다. 단백질의 일단계 친화 정제를 달성하기 위해, 믹소스포어로의 오염 단백질의 비특이적 결합을 최소화시키는 것이 매우 중요하다. 믹소스포어로의 PrS2-OmpR 결합을 E.coli BL21 (DE3) 세포 용해물의 존재하에 (레인 3, 도 3D) 시험하였다. 이러한 조건하에, PrS2-OmpR은 믹소스포어에 특이적으로 결합하며, 코마시에 블루 염색 (Commassie Blue staining)에 의해 단지 소량의 오염물이 관찰되었다 (레인 5, 도 3D). 흥미롭게는, 믹소스포어로의 PrS2-OmpR 결합이 4M 이하의 우레아의 존재하에도 영향을 받지 않았다.(도 5E)
PST 기법의 적용
친화성 단백질 정제의 이점중 하나가 친화-태깅된 단백질의 결합 및 용출이 생리학적 조건하에 수행될 수 있어, 단백질-DNA 또는 단백질-단백질 상호작용을 연구할 수 있다는 점이다. 본 발명자들은 PST (단백질 S 태그: Protein S Tag) 기법에 의해 PrS2-OmpR을 사용하여 단백질-DNA 상호작용이 검출될 수 있는지를 시험하였다.
PrS
2
-OmpR/DNA 복합물의 분리
OmpR이 도 2D에 도시된 바와 같이 DNA에 결합할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 PrS2-OmpR/DNA 복합물이 믹소스포어를 사용하여 분리될 수 있는지를 시험하였다. 이러한 목적을 위해, ompF 프로모터 (ompF P )의 업스트림 영역으로부터의 서열을 함유하는 500-bp DNA 단편을 사용하였다. 먼저, ompF P 의 DNA 및 PrS2-OmpR (3㎍)을 혼합하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 믹소스포어를 혼합물에 첨가하였다. 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 믹소스포어를 원심분리에 의해 수집하였다. 최종 펠렛을 우레아를 함유하는 DNA 로딩 완충제 [20mM 트리스-HCl (pH7.5), 5M 우레아, 40mM β-메르캅토에탄올, 0.8% (w/v) SDS, 4% 글리세롤 및 0.04% (w/v) 브로모페놀 블루]중에 현탁하고, 상청액을 아가로스 겔 전기영동에 의해 DNA에 대해 분석하였다. 도 4A에 도시된 바와 같이, ompF P DNA는, DNa 단편이 PrS2-OmpR의 존재하에 (레인 4) 믹소스포어와 혼합된 샘플중에서 검출된 반면, PrS2-OmpR의 부재하에 (레인 3) 수행된 반응에서 검출되지 않았다.
다음으로, ompF P 단편 (pCR-ompF P , 4.5kbp)을 함유하는 선형의 플라스미드 DNA를 pCR-ompF P 를 BamH I으로 분해함으로써 제조하고 [밴드 (b)], pET-EnvZc를 또한 EcoR I으로 분해하여 EnvZc 단편 (1.5kbp)를 방출시켰다 [밴드 (c)]. pET-EnvZc를 pET11a 벡터의 EcoR I 부위에서 EnvZc 단편을 삽입함으로써 작제하였다. 주목하라. 따라서, pET-EnvZc의 EcoR I 분해는 두개의 밴드 (a) pET11a 벡터 및 (c) EnvZc 단편을 생성시킨다. BamH I에 의해 분해된 pCR-ompF P 와 EcoR I에 의해 분해된 pET-EnvZc의 DNA 혼합물을 사용하여, 도 4A에 기술된 것과 동일한 실험을 PrS2-OmpR의 존재 또는 부재하에 수행하였다. 도 4B에 도시된 바와 같이, PrS2-OmpR의 존재하에서는 pCR-ompF P 단편에 상응하는 단지 하나의 밴드만이 믹소스포어 펠렛으로부터 검출된 반면 (레인 3), PrS2-OmpR의 부재하에서는, DNA는 검출되지 않았다 (레인 2). 이들 결과는 믹소스포어가 PrS2-OmpR/0.5-kbp ompF P DNA 복합물 및 PrS2-OmpR/4.5-kbp pCR-ompF P DNA 단편 복합물 모두를 포획할 수 있음을 입증한다. 특히, 본원에 사용된 공정은 본래의 단백질-DNA 복합물의 분리를 위해 사용되기에 충분히 완만하였다.
조사 설계 및 방법
상기 기술된 일차 결과에 기초하여, 본 발명자들은 하기 두 연구에 종사할 수 있었다. PST 기법에 의해 통상적인 X-선 및 NMR 기법에 의해 측정될 수 없는 단백질의 구조를 해결할 수 있다.
연구 #1. E.coli 및 포유동물 세포에서 단백질 S 태그 (PST) 발현 시스템의 작제 및 친화 정제를 위한 믹소스포어의 용도
본 실험에서, 본 발명자들은 두개의 PrS2-OmpR-태깅된 단백질 발현 시스템을 개발할 수 있었다; (1) E.coli PST-발현 시스템: 이는 본 실험실에서 최근에 개발 된 고발현 저온 쇼크 벡터 pCold를 사용하여 작제될 수 있다 (Qing, G., et al., 2004. Nat Biotechnol 22:877-82). 최종 생성물은 pCold (PST)로 불리며, 여기서 대상 단백질은 N-말단에 PrS2 태그로 융합되며, 융합 단백질의 발현은 저온 쇼크 처리시 매우 높은 수준으로 유도된다. (2) 포유동물 PST-발현 시스템: 이는 테트라시클린-유도성 벡터를 사용하여 작제될 수 있다. 이러한 시스템은 생세포에서 형성된 다중 단백질 복합물을 분리하도록 고안된다. PrS2-태깅된 단백질과 결합되는 복합물은 믹소스포어를 사용하여 포획될 수 있으며, 복합물중의 단백질은 질량 분광계에 의해 확인될 것이다. 이러한 목적의 세번째 방법에서, 본 발명자들은 PrS2-태깅된 단백질 및 단백질 복합물의 친화 단백질 정제의 이용을 위해 단백질 S 및 단백질 C가 결여된 고도로 정제된 믹소스포어의 제조 방법을 확립할 수 있었다.
방법 #1: E.coli에서 PST 발현 시스템
저온 쇼크 벡터 (pCold 벡터)를 본 실험실에서 최근 개발하였으며, 이는 pET 벡터 시스템에 상보적인 것으로 입증되었다 (Qing, G., et al., 2004. Nat Biotechnol 22:877-82). 대상 단백질의 발현은 저온 쇼크 (15℃)시 매우 높은 수준으로 유도되었다. 저온 쇼크 발현 시스템하의 대상 단백질은 세포 단백질의 낮은 배경 생성으로 생성된다. 따라서, 단백질은 세포가 15NH4Cl 및 13C-글루코오스를 함유하는 배지중에 성장시킬 경우 15N 및 13C 이소토프로 거의 배타적으로 라벨링될 수 있으며, 이로 인해 추가의 정제 없이 단순히 세포 용해물을 이용하여 단백질의 NMR 구조 연구를 수행할 수 있다 (Qing, G., et al. 2004. Nat Biotechnol 22:877-82). 본 발명자는 pCold 벡터 시스템을 E.coli에서 PST 시스템을 구성하는데 적용시킬 수 있다.
a. pCold (PST)의 작제
pColdIII 벡터 (Qing, G., et al. 2004. Nat Biotehcnol 22:877-82); 도 1 참조)는 cspA 프로모터 (cspA, E.coli에서 주요 저온 쇼크 유전자), cspA 5'-UTR (159 염기), 초기 코돈, 번역 증강 엘리먼트 (TEE) 및 멀티-클로닝 부위로 구성된다. 이러한 플라스미드를 사용하여, PrS2에 대한 DNA 단편 (184 잔기)은 TEE와 다중 클로닝 부위 사이에 삽입될 수 있다. 다중 크로닝 부위 다음에, His6 태그의 N-말단부에 트롬빈 절단 부위 (Leu-Val-Pro-Arg↓Gly-Ser)를 갖는 His6 태그가 삽입될 수 있어, His6 태그가 단백질로부터 용이하게 제거될 수 있다. 이러한 새롭게 작제된 벡터는 pCold (PST) (도5)로 칭하였다. 특히, His6 태그는 PrS2-태깅된 단백질의 C-말단에 첨가될 수 있으며, 이 경우, 대상 단백질에 대한 DNA 단편은 His6 태그를 갖는 프레임에 삽입될 수 있다. DNA 단편은 또한 C-말단에서 His6 태그를 제거하기 위해 종결 코돈을 갖도록 PCR에 의해 제조될 수 있다.
실험 #2에 기술된 단백질의 NMR 구조 연구에 있어서, 단백질 S와 대상 단백질간의 링커는, N-말단 PrS2 태그가 믹소스포어 표면상에 견고하게 고정되더라도 단백질이 자유롭게 이동할 수 있게 하기 위해 필수적이다 (실험 #2 참조). 단백질 S 단편 (잔기 1 내지 92)의 C-말단이 6개 아미노산 잔기로 구성된 불규칙 구조를 갖지만 (-87VPVQPR92-), 본 발명자들은 필요에 따라 링커의 길이를 최적화시킬 수 있다 (더욱 상세한 설명을 위해서는 특정 목적 #2 참조). TEV 절단 부위 (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly)는 PrS2의 C-말단 다음에 첨가되어, 클로닝된 유전자 생성물이 TEV 처리에 의해 PrS2로부터 검출될 수 있다. 최종 벡터는 pCold (PST)로 칭하였다.
b. pCold (PST)의 모델 단백질로의 적용
본 발명자들은 pCold(PST)를 사용하여 세 모델 단백질; CspA, EnvZ 도메인 A 및 EnvZ 도메인 B를 발현시킬 수 있다. CspA는 70개 잔기로 이루어지며, RNA 샤프롱으로서 작용하는 β-배럴 소단백질이며 (Jiang, W., 1997. J Biol Chem 272:196-202); 이의 구조는 NMR에 의해 이미 측정되었다 (Newkirk, K., et al., 1994. Proc Natl Acad Sci USA 91:5114-8). NMR에 의해 측정된 EnvZ 도메인 A (67개 잔기) 구조는 헤어-핀 구조를 형성하는 두개의 헬릭스로 이루어진다 (Tomomori, C., et al. 1999. Nat Struct Biol 6:729-34). 이러한 단편은 EnvZ에 대한 자동포스포릴화 부위로서 His 잔기를 갖는 중앙 이량체화 도메인이다. EnvZ는 E.coli에서 ompF 및 ompC 유전자의 오스모조절에 관련된 히스티딘 키나아제이다 (Egger, L.A., et al. 1985. Genes Cells 2:167-84, Forst, S.A. et al. 1994. Res Microbiol 145:363-373 참조). EnvZ 도메인 B는 α/β 단백질 (161 잔기)이며, EnvZ에 대한 ATP-결합 도메인으로서 작용한다. 이의 삼차원 구조는 NMR에 의해 이미 측정되었다 (Tanaka, T., et al., 1998. Nature 396:88-92).
모든 이러한 단백질 구조 (β,α 및 α/β)는 NMR에 의해 측정되기 때문에, 이들은 특정 목적 #2를 위한 이상적인 단백질 모델이다. pCold(PST)를 사용하여 이러한 단백질을 발현시키는 경우, 이들은 Ni-NTA 수지로 정제될 수 있다. 이들의 개별적인 생화학 특성 예컨대, CspA에 대한 RNA 결합, EnvZ 도메인 A에 있어서 EnvZ에 의한 포스포릴화 및 EnvZ 도메인 B에 있어서의 ATP 결합은 이들의 비태깅된 단백질과 비교하여 시험될 것이다. PrS2-OmpR로 수득된 결과에 기초하여 (일차 결과 부분 참조), 모든 이러한 단백질은 이들의 생화학 특성을 보유하는 것으로 예측된다. 생화학 특성에서 관찰된 변화는 C-말단에서 His6 태그로 인한 것일 것이다. 이러한 경우, 본 발명자들은 트롬빈에 의해 C-말단 Hig6 태그를 제거할 수 있으며, 이들의 생화학적 특성을 재시험할 수 있다. 이러한 단백질 모두는 저온 쇼크 처리[15℃에서 12시간 (Qing G., et al. 2004. Nat Biotechnol 22:877-82)]에 의해 매우 높은 수준 (전체 세포 단백질의 30-50%)으로 생성되는 것으로 예상된다. 특정 목적 #2에 있어서, 본 발명자들은 본 실험실에서 성립된 방법을 이용하여 15N로 이들 단백질을 라벨링시킬 수 있다 (Qing, G., et al. 2004. Nat Biotechnol 22:877-82).
c. 단백질 발현 및 용해도의 증가
OmpR의 발현 및 용해도는 PrS2 태그와의 융합에 의해 극적으로 향상되기 때 문에, 본 발명자들은 일반 단백질 발현 시스템으로서 이러한 PrS2 태그를 사용할 수 있다. 본 발명자들은 유전자 모델로서 사용된 유전자 세트의 발현을 위한 pCold(PST)의 효율을 시험할 수 있다. 이러한 세트는 "코어 50"으로 칭해지며, 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 캐노르하브디티스 엘레간스 (Caenorhabditis elegans), 드로소피올라 멜라노가스터 (Drosophiola melanogaster) 및 호모 사피엔스 (Homo sapiens)로부터의 유전자를 함유하며, 다양한 상이한 발현 시스템 예컨대, pET, pCold 및 밀배야 시스템을 시험하는데 사용되었다 (http://www-nmr.cabm.rutgers.edu/bioinformatics/ZebaView/). 따라서, "코어 50"의 사용은 pCold(PST)를 시험하는데 이상적이다. 본 발명자들은 pCold(PST)를 사용한 발현 및 용해도에 대해서 유전자 특히, 의이 생성물이 봉입체내에서 빈약하게 발현되거나 생성되는 유전자를 시험할 수 있다 (Qing, G., et al. 2004. Nat Biotechnol 22:877-82).
방법 #2: 포유동물 세포에서 PST 발현 시스템
본 발명자들이 상기에서 입증한 바와 같이, 단백질-DNA 복합물은 PrS2-태깅된 OmpR 및 믹소스포어를 사용하여 분리될 수 있으며 (도 4), 이러한 방법은 기타 단백질 복합물의 분리 및 단백질-단백질 상호작용의 확인에 적용될 수 있다. PST 기법은 포유동물 시스템에서 특히, 생세포에서만 형성되는 다중-단백질 복합물을 분리하기 위한 큰 가능성을 갖는다. 따라서, 본 발명자들은 테트라시클린-유도성 PrS2-융합 발현 시스템을 작제할 수 있으며, 이러한 시스템 모델로서 TATA-결합 단 백질 (TBP)을 갖는 시스템을 시험할 수 있다. 원핵생물 전사 개시에서 중요한 역할을 하는 다중단백질 복합물을 형성하는 것은 공지되어 있다.
a. 테트라시클리-유도성 PST 시스템의 구성: T-REx(PST)
테트라시클린-유도성 PST 시스템을 작제하기 위해, 본 발명자들은 플라스미드 벡터 pcDNA4/TO/myc-His (Invitrogen)를 사용할 수 있으며, 이는 테트라시클린-유도성 벡터이며, C-말단 myc 에피토프 및 His6 태그를 갖는다. PrS2 단편은 이러한 벡터의 다중 클로닝 부위에서 Hind III 및 Kpn I 부위를 이용하여 삽입될 수 있다. TEV 절단 부위 및 새로운 다중 클로닝 부위가 도 6에 도시된 바와 같이 다중 클로닝 부위에서 KpnI 및 XbaI 부위를 이용하여 삽입될 수 있어서, 대상 단백질에 융합된 PrS2 태그가 필요에 따라 제거될 수 있다. 이러한 PrS2-태깅된 단백질은 C-말단에서 c-myc 에피토프를 가지기 때문에, 이는 단순한 웨스턴 블롯에 의해 검출될 수 있다.
PrS2-태깅된 단백질을 발현하는 안정한 세포주를 성립시키기 위해, 본 발명자들은 숙주 세포로서 T-REx 293 세포주를 사용할 수 있다 (Invitrogen). 이러한 T-REx 293은 Tet 리프레서를 구성적으로 발현하는 인간 배아 신장 293 세포주이며, 이는 유도 인자 테트라시클린이 첨가될 때 까지 PrS2-태깅된 단백질의 전사를 억제할 수 있다. PrS2-태깅된 단백질을 잠복시키고 있는 T-REx(PST)는 PolyFect 트랜스펙션 시약 (QIAGEn)을 사용하여 T-REx 293 세포로 트랜스펙션될 수 있으며, 안정한 형질전환물이 10% 소태 혈청 및 약물, 5㎍/ml 블라스티딘 및 40㎍/ml 제오신이 보충된 둘베코 개질된 이글 배지 (DMEM)에서 2주 동안 선택될 것이다. 약물 내성 클론을 테트라시클린으로 유도한 후 PrS2-태깅된 단백질의 발현에 대해 분석하고, 가장 높은 수준으로 PrS2-태깅된 단백질을 발현하는 클론이 본 연구에 이용될 것이다.
b. 단백질 모델로의 T-REx(PST) 시스템의 적용
본 발명자들은 단백질 모델로서 인간 TATA-결합 단백질 (TBP)를 사용하여 포유동물 세포에서 PST 시스템을 시험할 수 있다. 전사 개시시 TBP의 관련은 잘 특징화되었으며, 이는 다중단백질-DNA 복합물을 형성하는 코어 단백질이다 (Hori, R., and M. CArey, et al. 1994. Curr Opin Genet Dev 4:236-44, Maldonado, E., et al. 1995. Curr Opin Cell Biol 7:352-61, Roeder, R.G., et al. 1991. Trends Biochem Sci 16:402-8). 이러한 다중단백질-DNA 복합물 형성은 TATA 엘리먼트로 TBP의 결합 및 일반적인 전사 인자중 하나인 전사 인자 IIB (TFIIB)와의 결합에 의해 개시되어 RNA 폴리머라아제 II 및 기타 공지된 일반적인 전사 인자를 함유하는 사전개시 복합물 (PIC)을 최종적으로 어셈블링한다 (Zawel, L., et al. 1993. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 44:67-108).
먼저, 본 발명자들은 상기 기술된 바와 같은 안정한 세포주를 준비하고, 유도된 세포 및 대조군으로서 비유도된 세포를 채취할 수 있다. 본 발명자들은 PrS2-TBP가 믹소스포어와 혼합됨으로써 세포 용해물로부터 분리될 수 있는지의 여부를 시험할 수 있다. PrS2-TBP가 믹소스포어에 의해 분리될 수 있음을 확인한 후, 본 발명자들은 유도된 세포 및 비유도된 세포로부터의 믹소스포어에 결합하는 단백질을 비교할 수 있다. PrS2-TBP 유도된 세포에서 검출된 단백질 밴드가 비유도된 세포에서의 밴드와 상이한 경우, 본 발명자들은 웨스턴 블롯 또는 질량분광 핑커프린팅에 의해 이러한 단백질을 확인할 수 있으며, 이는 본 실험실에서 정기적으로 사용한 다케시 요시다 (Takeshi Yoshida)에 의해 본 발명자들의 메디칼 스쿨 코어 설비에서 MALDI-TOF 질량 분석계로 수행될 수 있다.
PrS2-TBP 및 믹소스포어를 사용하여, 결합 인자가 성공적으로 분리되는 경우, 본 발명자들은 이러한 시스템을 히스톤 H3-H1 메틸트렌스퍼라아제 활성에 관련된 Su(z)12, 제스트-12의 억제인자와 상호작용하는 단백질(들) 연구에 본 시스템을 적용할 수 있다 (Kuzmichev, A., et al. 2002. Genes Dev 16:2893-905).
방법 #3: 고도로 정제된 단백질 S-고갈된 믹소스포어의 제조
PrS2-태깅된 단백질의 친화 정제 및 단백질 복합물의 분리에 있어서, 고도로 정제된 믹소스포어를 수득하는 것이 필수적이다. 이러한 방법에서, 본 발명자들은 표면상에 어셈블링된 단백질 S 및 단백질 C가 고갈된 디량의 정제된 믹소스포어를 제조하는 방법을 확립할 수 있다. 본 발명자들은 또한, 믹소스포어를 불활성화시키는 방법을 확립할 수 있으며, 이에 의해 임의의 조건하에서 발육되지 않게하여, 재사용가능한 생물질로서 사용될 수 있게 할 수 있다. 믹소스포어가 생물학적으로 제조되기 때문에, 정제된 믹소스포어의 제조 비용은 기타 친화성 수지 예컨대, Ni-NTA, 스트렙타비딘, 글루타티온, 아밀로오스 및 칼로둘린 수지와 비교하여 매우 경 제적이다. 게다가, M. 크산투스 및 이의 스포어는 병원성이 아니며, 조작하기에 완전하게 안전하다.
a. 믹소스포어의 제조
믹소코커스 크산투스 FB (DZF1)을 믹소스포어의 공급원으로 사용하였다. 세포를 성장시키기 위해, 카시톤(Casitone)-효모 추출물 (CYE) 배지 [1% 카시톤, 0.5% 효모 추출물, 10mM 트리스-HCl (pH 7.6), 및 8mM MgSO4]를 사용하고, 자실체 형성을 위해, 클론 플루이팅 (clone fruiting: CF) 아가 [0.015% 카시톤, 0.2% Na-시트레이트, 0.02% (NH4)2SO4, 10mM 트리스-HCl(pH 7,6), 8mM MgSO4, 0.1% Na-피루베이트, 1mM 칼륨 포스페이트 완충제 (pH 7.6) 및 1.5% 박토 아가] 플레이트를 사용하였다. 사용전에 플레이트를 30℃ 오븐에서 밤새 및 5일 동안 실온에서 건조시켰다.
세포가 대수기 (100Klett 유닛)에 도달할때 까지 30℃에서 성장시켰다. 세포를 10분 동안 실온에서 4000 x g에서 원심분리하여 채취하였다. 세포 펠렛을 동일 부피의 TM 완충제 [10mM 트리스-HCl (pH 7.6) 및 8mM Mg2SO4]로 세척하였다. 세포 펠렛을 TM 완충제중에 재현탁시켜 4000Klett 유닛/ml의 농도를 달성하였다. 이러한 농축된 세포 현탁물을 CF 아가 플레이트에 스팟팅시키고 (스팟당 4㎕, 플레이트당 144 스팟), 플레이트를 10일 동안 30℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트의 표면을 부드럽게 스크랩핑하여 자실체를 채취하고, 저온 TM 완충제에 현탁시켰다. 세포를 5분 동안 3회초음파 처리하여 생장 세포를 파괴하였다. 믹소스포어를 TM 완충제로 수차례 세척하고, 최종적으로 10mM 트리스-HCl (pH 7.6) 완충제중에 재현탁하였다. 믹소스포어를 사용할 때 까지 4℃에서 유지시켰다.
정제된 믹소스포어를 실온에서 25mM EDTA를 함유하는 10mM 트리스-HCl (pH 8.0) 완충제중에 인큐베이션시켜 천연 단백질 S (Inouye, M., et al., 1979. Proc Natl Acad Sci USA 76:209-13) 및 단백질 C (McCleary, W.R., et al. 1991. J Bacteriol 173:2141-5)를 1시간 동안 이들의 표면으로부터 제거하고, 수차례 세척 후, 이러한 단계를 한번 더 반복하였다. 그 후, 이러한 EDTA-처리된 믹소스포어를 10분 동안 60℃에서 가열하여 존재하는 경우 프로테아제를 불활성화시켰다. 도 3A에 도시된 바와 같이, 이렇게 처리된 믹소스포어를 균일한 구형을 가지며, 본 연구에 사용하였다.
b. 충분히 현탁된 믹소스포어의 유지
정제된 믹소스포어는 균일한 크기를 가지며 (1㎛의 직경; 도 3A 참조), 물보다 약간 밀도가 높았다 (따라서, 믹소스포어 현탁물을 장기간 동안 유지하는 경우, 이들은 완충 용액중의 튜브 바닥에 침적된다). 믹소스포어의 충분히 현탁된 상태를 유지시키기 위해, 본 발명자들은 믹소스포어 현탁물에 대한 수크로오스의 효과를 시험하였다. 믹소스포어를 실온에서 0.3ml의 0, 5, 10, 15 및 20% 수크로오스 용액중에 현탁시켰다. 이들은 5% 수크로오스의 가장 낮은 농도에서 침전 없이 충분히 현탁되었다 (데이타 미도시). 본 발명자들은 NMR 구조 연구를 위해 고안된 실험에 이러한 조건을 이용할 수 있다.
c. 믹소스포어의 불활성화
믹소스포어는 1mM Ca++ 이온 및 카시톤 배지의 존재하에서와 같은 특정 조건하에서 생장한다 (Otani, M., et al. 1995. J Bacteriol 177:4261-5). PST 기법에 있어서, 믹소스포어 생장을 억제하여 이들이 수차례 재사용될 수 있게 하는 필수적이다. 본 발명자들은 믹소스포어의 생장 능력을 완전하게 불활성화시킬 수 있는 하기 방법을 시험할 수 있다.
NaN 3 의 효과 - NaN3 (1mM)이 믹소스포어의 생장을 억제하는지를 측정하기 위해, 본 발명자들은 NaN3의 존재 및 부재하의 생장 배지 (1mM Ca++ 함유 0.2% 카시톤)에서 10시간 동안 30℃에서 믹소스포어를 인큐베이션시켰다. 생장 억제는 위상차 현미경하에 믹소스포어의 굴절을 모니터링함으로써 모니터링될 수 있다.
열 처리 효과 - 믹소스포어를 열처리 하는 경우 이의 생장을 억제할 수 있는지를 시험하기 위해, 본 밞명자들은 30분 동안 70, 80, 90 및 100℃에서 이들을 인큐베이션할 수 있다. 본 발명자들은 최적 열처리를 측정할 수 있으며, 이에 의해 믹소스포어는 이들의 생장 능력이 손실되고, 이들의 단백질 S 결합 특성은 보유하였다.
γ-선 조사의 효과 - 상기 기술된 두 방법이 믹소스포어의 생장 억제에 비효과적인 경우, 본 발명자들은 믹소스포어를 괴사시키기 위해 γ-선 조사를 이용할 수 있다. 믹소스포어는 UV 조사에는 내성을 띰을 주의하라.
연구 2 믹소스포어상에 포획된 단백질 S-태깅된 단백질의 핵자기공명 (NMR) 구조 연구
단백질이 호환성 링커에 의해 연결된 두개의 완전하게 독립적인 도메인 X 및 Y로 이루어지고, 두개의 도메인간에 상호작용이 존재하지 않는 경우, 본 발명자들은 도메인 X의 등방성 움직임을 제한함으로써 도메인 x로부터 NMR 시그널을 제거하는 것이 가능한 것으로 가정하였다. 이는 용액중에 충분히 현탁된 입자의 표면에 견고하게 결합하는 도메인 X에 의해 달성될 수 있다. 이러한 조건하에, 도메인 Y는 용액중의 이의 등방성 움직임을 여전히 보유하게 되는데, 그 이유는 도메인 Y는 고도로 유연한 링커(flexible linker)를 통해 도메인 X에 연결되기 때문이다. 따라서, 도메인 X의 HSQC 스펙트럼의 모든 피크가 확대될 수 있는 반면, 구조 분석을 위한 도메인 Y의 HSQC 스펙트럼의 모든 피크는 뾰족하게 유지될 수 있다. 성공적인 경우, 제안된 PST 기법은 하기 연구를 위한 신규한 흥미로운 수단을 개척하게 될 것이다:
1. 불충분한 용해도를 갖는 단백질의 NMR 구조 연구
NMR 구조 연구를 위해, 고농도의 대상 단백질은 높은 신호 대 잡음 비를 획득해야 한다. 반드시 응집물 또는 침전물 없이 단백질이 완전하게 용해되어야 한다. 대상 단백질이 고농도에서 안정적이지 않다면, 이러한 문제는 PST 기법을 이용하여 극복될 것으로 예측된다. PrS2-태깅이 단백질 용해도를 향상시킬 수 있다는 점 이외에, PrS2-태깅된 단백질의 믹소스포어로의 결합은 단백질의 응집을 회피할 수 있게 한다. 게다가, PrS2-태깅된 단백질의 농도는 비태깅된 단백질 보다 훨씬 더 높을 수 있다.
2. PrS
2
태그에 융합되는 경우에만 발현되는 단백질의 NMR 연구
3. 막 단백질의 구조 연구
막 단백질은 일반적으로 높은 수준으로 발현되지 않는다. 제안된 PST 기법을 이용하여, 적합한 세정제에 용해된 막 단백질의 일-단계 정제를 달성할 수 있다. 따라서, 믹소스포어-결합된 막 단백질이 이들의 NMR 구조 연구에 요구되는 매우 높은 농도로 제조될 수 있다.
실험 방법
본 발명자들은 실시예 1로부터의 15N-라벨링된 PrS2-태깅된 단백질 및 믹소스포어를 이용하여 상기 가정을 시험할 수 있다. 상기 가정에서, PrS2 태그는 도메인X로서 작용하고, PrS2 태그에 융합된 단백질은 단백질 Y로서 작용한다. 본 목적을 달성하기 위해서는, 실시예 1에 제안된 바와 같이 비용 효과적인 방식으로 재사용가능한 대량의 믹소스포어를 제조하는 방법을 확립시키는 것이 중요하다.
방법 #1: 단백질 S의 HSQC 스펙트럼에 대한 믹소스포어의 결합 효과
PrS2 단편 (184 잔기)은 pCold 벡터로 매우 높은 수준으로 발현될 수 있으며, 따라서, 20ml의 정제된 15N-라벨링된 PrS2 단편은 500ml 배양물로부터 용이하게 수득될 수 있다. 15N-라벨링된 PrS2 단편을 사용하여, 본 발명자들은 믹소스포어의 존재 및 부재하에 이의 이핵 단일 양자 간섭 (HSQC) 스펙트럼을 비교할 수 있다. 10mM CaCl2의 존재하에 믹소스포어의 첨가시, PrS2의 HSQC 스펙트럼의 모든 피크가 확대될 것인데, 그 이유는 PrS2의 분자 운동이 믹소스포어로의 결합에 의해 크게 제한될 것이기 때문이다. 본 발명자들은 이러한 믹소스포어의 첨가 효과가 10mM EDTA를 첨가함으로써 가역화됨을 확실히 할 수 있다. EDTA가 믹소스포어로부터 결합된 PrS2를 방출시키기 때문에, HSQC 스펙트럼의 모든 피크가 다시 뾰족하게 되어야 한다.
방법 #2: PrS
2
-태깅된 모델 단백질의 HSQC
믹소스포어가 PrS2의 HSQC 스펙트럼 피크의 확대를 초래하는 것이 확인되면, 본 발명자들은 믹소스포어의 존재 및 부재하에 특정 목적 #1로부터의 15N-라벨링된 PrS2-태깅된 CspA, EnvZ 도메인 A, 및 EnvZ 도메인 B의 HSQC 스펙트럼을 취할 수 있다. 그 후, 이러한 스펙트럼을 하기 기준에 따라 분석될 수 있다:
믹소스포어의 첨가 결과 모든 세개의 스펙트럼에서 확대된 이들 피크는 PrS2 태그로 인한 것으로 예측된다. 이러한 확대된 스펙트럼은 믹소스포어의 존재하의 PrS2의 스펙트럼과 매우 유사한 것으로 예측된다. 이러한 경우, 본 발명자들의 가설이 옳은 것으로 입증될 것이다. 따라서, 이러한 모든 피크를 믹소스포어의 존재하에 수득된 HSQC 스펙트럼으로부터 제거될 수 있다.
이렇게 수득된 HSQC (PrS2 태그로부터 모든 피크를 제거한 후)는 본 실험실에서 이용가능한 모든 개별 단백질의 HSQC 스펙트럼과 비교될 수 있으며, 상기 모든 개별 단백질은 G. 몬텔리온 (G. Montelione) [CspA에 있어서; (Newkirk, K., et al. 1994. Proc Natl Acad Sci USA 91:5114-8)] 및 Dr. 이쿠라 (Dr. Ikura) [EnvZ 도메인 B 및 A에 있어서; (Tanaka, T., et al. 1998. Nature 296:88-92, Tomomori, C., et al. 1999. Nat Struct Biol 6:729-34)]의 협조에 의해 측정된 것이다.
현재, 단백질 S의 어셈블리를 촉발하는 믹소스포어 표면상의 구성요소(들)은 공지되어 있지 않다. PrS2-태깅된 단백질의 표면 밀도가 어떻게 대상 단백질의 HSQC 스펙트럼에 영향을 끼치지는 시험되어야 한다. PrS2-태깅된 단백질의 표면 밀도가 너무 높으면, 단백질간의 분자간 상호작용이 있을 수 있으며, 이는 단백질의 자유로운 움직임을 제한하여 피크를 확대시킬 수 있다. 이는 NMR 분석을 위한 동일한 양의 PrS2-태깅된 단백질과 상이한 양의 믹소스포어를 사용함으로써 시험될 수 있다. 더 많은 믹소스포어의 첨가는 믹소스포어당 결합된 PrS2-태깅된 단백질 밀도를 저하시킬 것이며, 그 결과, 피크 확대 효과를 회피할 수 있다. HSQC 스펙트럼에 영향을 끼칠 수 있는 또 다른 중요한 인자는 유연한 링커의 길이이다. 본 발명자들은 한번에 하나의 (GGGGS)n(n= 1, 2, 3 ...)잔기를 첨가함으로써 링커 길이의 영향을 시험할 수 있다. 이러한 실험을 통해, PST 기술에 대한 최적 링커가 확립될 수 있다.
이들 방법이 성공적인 경우, 본 발명자들은 기법의 일반적인 적용가능성을 시험하기 위해 특정 목적 #1의 방법 #1에서 시험된 단백질 일부에 PST 기법을 적용할 수 있다. 특히, 본 발명자들은 (a) PrS2로 태깅되는 경우에만 잘 발현되는 단백질, (b) 낮은 수준으로만 발현되는 단백질 (이러한 경우, 믹소스포어로의 이들의 결합은 NMR 연구를 위한 이들의 농도를 실질적으로 증가시킬 수 있음), 및 (c) 4M 우레아에서만 용해되는 단백질을 시험할 수 있다. PrS2가 4M 우레아에서 믹소스포어에 충분히 결합될 수 있기 때문에, PrS2-태깅된 단백질이 4M 우레아의 존재하에 용이하게 정제된다 (일차 결과 부분 참조). 믹소스포어 현탁에 사용된 용액이 단순 원심분리에 의해 용이하게 대체될 수 있기 때문에, 4M 우레아 용액이 우레아 비함유 완충제 용액으로 용이하게 대체될 수 있음을 주목하라. 이렇게 용이한 완충제 대체에 의해 NMR 실험을 위한 최적 완충제 조건을 신속하게 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.
최적의 결과 획득
PrS2-태깅된 단백질의 스펙트럼이 비태깅된 단백질의 스펙트럼과 얼마나 유사한지가 단백질의 NMR 구조 연구를 위한 제안된 PST 기법의 실행가능성을 결정하는 주요 질문이다. 믹소스포어로의 PrS2-태깅된 단백질의 결합이 PrS2 HSQC 스펙트럼의 각각의 피크(확대 효과)에 예상치못한 영향을 끼칠 수 있지만, N-말단 Ca++-결합 도메인은 β-가닥으로 주로 이루어진 매우 안정한 구형의 구조로 이루어지며 (Bagby, S., et al. 1994. Proc Natl Acad Sci USA 91:4038-12), PrS2의 각 Ca++-결합 유닛은 티립신 분해 (Inouye, S., et al. 1981. J Bacteriol 148:678-83) 및 열 처리 (Bagby, S., et al. 1998. J Mol Biol 276:669-81)에 대해 내성이다. 따라서, 92-잔기 N-말단 도메인이 이의 Ca++-결합 부위를 통해 믹소스포어에 결합하는 경우, 전체 도메인이 믹소스포어 표면상에 견고하게 고정되는 것으로 여겨진다. 이는 PrS2 HSQC 스펙트럼의 모든 피크의 확대를 초래할 것이다. 그러나, 도메인 Y의 움직임이 PrS2 태그에 의해 제한되는 경우, PrS2에 융합된 도메인 (도메인 Y)의 HSQC 스펙트럼이 영향을 받을 수 있다.
이러한 이유로, PrS2 태그와 도메인 Y를 연결시키는 링커가 도메인 Y의 자유로운 움직임에서 중요한 역할을 하는 것으로 간주된다. 링커의 길이가 도메인 Y의 HSQC 스펙트럼에 어떻게 영향을 끼치는 지가 측정되어야 한다. 본 발명자들은 먼저 시스템 모델로서 PrS2-CspA를 사용하여 (GGGGS)n 링커 (n = 1, 2, 3 ...)를 첨가함으로써 이러한 문제를 시험할 수 있다. 한번에 하나의 4-잔기 서열을 첨가하는 경우 도메인 Y의 움직임을 더욱 자유롭게 할 것으로 예상되며, 따라서, CspA HSQC 스펙트럼의 피크는 더욱 뾰족해져야 한다. HSQC 스펙트럼을 정제된 CspA의 것과 비교함으로써, 본 발명자들은 유연한 링커의 길이를 최적화시킬 수 있다. 최적의 링커 길이를 확립한 후, 본 발명자들은 이러한 최적의 길이가 다른 모델 시스템에도 적용가능한지를 확인할 것이다.
본 발명은 이의 특정 구체예를 참조로 하여 기술되었지만, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 이루어질 수 있으며, 등가물로 치환될 수 있음이 당업자에게는 자명할 것이다. 또한, 본 발명의 목적, 사상 및 범위에 특정 상황, 재료, 조성물, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 적합하게 하기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 본원에 첨부된 청구범위의 범위내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> University of Medicine and Dentistry of New Jersey
<120> THE USE OF PROTEIN S FUSION FOR PROTEIN SOLUBILIZATION
<130> 19313-22
<150> PCT/US2007/064457
<151> 2007-03-20
<150> US 60/783,998
<151> 2006-03-20
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 99
<212> PRT
<213> Myxococcus xanthus
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(93)
<223> PrS tag, M1-Y93, 93 amino acid residues
<220>
<221> SITE
<222> (94)..(99)
<223> Thrombin cleavage site
<400> 1
Met Ala Asn Ile Thr Val Phe Tyr Asn Glu Asp Phe Gln Gly Lys Gln
1 5 10 15
Val Asp Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Ala Ala Leu
20 25 30
Gly Ile Glu Asn Asn Thr Ile Ser Ser Val Lys Val Pro Pro Gly Val
35 40 45
Lys Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Phe Ala Gly Asp Gln Ile Glu
50 55 60
Val Val Ala Asn Ala Glu Glu Leu Gly Pro Leu Asn Asn Asn Val Ser
65 70 75 80
Ser Ile Arg Val Ile Ser Val Pro Val Gln Pro Arg Tyr Leu Val Pro
85 90 95
Arg Gly Ser
<210> 2
<211> 191
<212> PRT
<213> Myxococcus xanthus
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(185)
<223> PrS2 tag: M1-Y185, 185 amino acid residues
<220>
<221> SITE
<222> (185)..(191)
<223> Thrombin cleavage site
<400> 2
Met Ala Asn Ile Thr Val Phe Tyr Asn Glu Asp Phe Gln Gly Lys Gln
1 5 10 15
Val Asp Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Ala Ala Leu
20 25 30
Gly Ile Glu Asn Asn Thr Ile Ser Ser Val Lys Val Pro Pro Gly Val
35 40 45
Lys Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Phe Ala Gly Asp Gln Ile Glu
50 55 60
Val Val Ala Asn Ala Glu Glu Leu Gly Pro Leu Asn Asn Asn Val Ser
65 70 75 80
Ser Ile Arg Val Ile Ser Val Pro Val Gln Pro Arg Met Ala Asn Ile
85 90 95
Thr Val Phe Tyr Asn Glu Asp Phe Gln Gly Lys Gln Val Asp Leu Pro
100 105 110
Pro Gly Asn Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Ala Ala Leu Gly Ile Glu Asn
115 120 125
Asn Thr Ile Ser Ser Val Lys Val Pro Pro Gly Val Lys Ala Ile Leu
130 135 140
Tyr Gln Asn Asp Gly Phe Ala Gly Asp Gln Ile Glu Val Val Ala Asn
145 150 155 160
Ala Glu Glu Leu Gly Pro Leu Asn Asn Asn Val Ser Ser Ile Arg Val
165 170 175
Ile Ser Val Pro Val Gln Pro Arg Tyr Leu Val Pro Arg Gly Ser
180 185 190
Claims (37)
- 믹소코커스 크산투스 (Myxococcus xanthus)로부터의 PrS 태그 또는 PrS2 태그를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 함유하는 벡터.
- 제 1항에 있어서, 다중 클로닝 부위가 SEQ ID NO:1을 포함하는 벡터.
- 제 2항에 있어서, 다중 클로닝 부위가 SEQ ID NO:2을 포함하는 벡터.
- 제 1항에 있어서, 고발현 저온 쇼크 벡터인 벡터.
- 제 4항에 있어서, 저온 쇼크 벡터가 pColdIII 벡터인 벡터.
- 제 4항에 있어서, 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli)에서 발현되는 벡터.
- 제 1항에 있어서, 테트라시클린-유도성 PST 발현 시스템인 벡터.
- 제 7항에 있어서, 포유동물 숙주 세포에서 발현되는 벡터.
- 제 8항에 있어서, 포유동물 숙주 세포가 TREx 293 인간 배아 신장 세포주로부터 유래되는 벡터.
- 표적 단백질의 용해도를 증가시키는 방법으로서;a) 믹소코커스 크산투스로부터의 단백질 S의 하나 이상의 N-말단 도메인 (PrS 태그)을 엔코딩하는 핵산 서열을 표적 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열에 융합하여, PrS 태깅된 표적 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 생성시키고;b) 단계 (a)의 단백질 S 태깅된 표적 단백질을 벡터내에 위치시키고;c) 숙주 세포를 벡터로 형질전환시키고;d) 유전자 발현에 적합한 조건하에 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하며,발현된 PrS 태깅된 표적 단백질은 비태깅된 표적 단백질 보다 더욱 가용성인 방법.
- 제 10항에 있어서, 핵산 서열이 단백질 S의 두개의 연속적으로 반복된 N-말단 도메인을 갖는 PrS2 태그를 엔코딩하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 단계 (d) 수행 후, PrS 태그가 프로테아제에 의해 표적 단백질로부터 절단되거나 비절단되는 방법.
- 제 10항에 있어서, 숙주 세포가 원핵 세포인 방법.
- 제 1항에 있어서, 표적 단백질이 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유래된 방법.
- 제 1항에 있어서, 벡터가 PrS 태깅된 표적 단백질을 엔코딩하는 핵산을 포함하는 다중 클로닝 부위를 함유하는 에스체리치아 콜라이 pCold 발현 시스템인 방법.
- 제 1항에 있어서, 숙주 세포가 진핵 세포인 방법.
- 제 1항에 있어서, 벡터가 포유동물 테트라시클린-유도성 시스템인 방법.
- 제 1항에 있어서, N-말단 도메인 핵산 서열이 85-100개의 아미노산 잔기를 엔코딩하는 방법.
- 제 1항에 있어서, N-말단 도메인 핵산 서열이 93개 아미노산 잔기를 엔코딩하는 방법.
- 믹소코커스 크산투스의 하나 또는 그 초과의 믹소스포어 (myxospore)에 결합된 PrS-태깅된 단백질 분자.
- 믹소코커스 크산투스의 믹소스포어를 포함하는 친화성 수지와 PrS-태깅된 단백질 또는 PrS2-태깅된 단백질을 접촉시켜, 친화성 수지에서 PrS-태깅된 단백질 또는 PrS2-태깅된 단백질을 부동화시키는 것을 포함하여, PrS-태깅된 단백질 또는 PrS2-태깅된 단백질을 정제하는 방법.
- 제 21항에 있어서, PrS-태깅된 단백질 또는 PrS2-태깅된 단백질이 Ca2+ 또는 Mg2+의 존재하에 친화성 수지와 접촉하는 방법.
- 제 22항에 있어서, PrS-태깅된 단백질 또는 PrS2-태깅된 단백질이 칼슘을 킬레이트화시키는 시약 첨가에 의해 친화성 수지로부터 방출되는 방법.
- 제 23항에 있어서, 칼슘을 킬레이트화시키는 시약이 EDTA 또는 EGTA인 방법.
- 제 21항의 방법에 따라 정제된 단백질.
- 제 25항에 있어서, 단백질이 PrS-태깅된 단백질 또는 PrS2-태깅된 단백질인 단백질.
- 제 21항에 따른 친화성 수지 및 PrS-태깅된 단백질 또는 PrS2-태깅된 단백질을 정제하는 방법에 이용하기 위한 설명서를 포함하는 키트.
- 제 27항에 있어서, PrS-태깅된 단백질 또는 PrS2-태깅된 단백질을 생성하기 위한 성분을 추가로 포함하는 키트.
- 제 1항에 있어서, PrS-태깅된 단백질 또는 PrS2-태깅된 단백질이 단백질 S와 표적 단백질 사이에 링커를 포함하는 방법.
- 제 29항에 있어서, 링커가 폴리펩티드인 방법.
- 제 30항에 있어서, 폴리펩티드가 3 내지 10개의 아미노산 잔기를 갖는 방법.
- PrS-태깅된 표적 단백질 또는 PrS2-태깅된 표적 단백질을 제조하고, 분석 연구를 수행하는 것을 포함하여, 분석 연구를 위한 표적 단백질을 제조하는 방법.
- 제 32항에 있어서, 분석 연구가 핵자기공명 분광학, 약물 스크리닝 검정, 결합 검정 및 X-선 결정학 또는 가용성 표적 단백질이 요구되는 연구로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 33항에 있어서, PrS-태깅된 표적단백질 또는 PrS2-태깅된 표적 단백질이 PrS 태그 또는 PrS2 태그와 표적 단백질 사이에 링커를 포함하는 방법.
- 제 34항에 있어서, 링커가 폴리펩티드인 방법.
- 제 33항에 있어서, 분석 연구가 핵자기공명 분광학인 방법.
- 하나 이상의 PrS 태그 또는 PrS2 태그를 표적 단백질에 융합시키고, 핵자기공명 분광법을 수행하고, 핵자기공명 분광법으로부터의 데이타를 분석하여 표적 단백질의 특성을 규명하는 것을 포함하여, 표적 단백질의 특성을 규명하는 방법.
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