CN102766601B

CN102766601B - 含有可诱导型癌基因的细胞系及其建立方法、应用

Info

Publication number: CN102766601B
Application number: CN201110365076.0A
Authority: CN
Inventors: 胡寓文; 宋鸣; 徐瑞华; 黄蓬
Original assignee: TUMOR PREVENTION AND THERAPY CENTER ZHONGSHAN UNIV
Current assignee: TUMOR PREVENTION AND THERAPY CENTER ZHONGSHAN UNIV
Priority date: 2011-11-17
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2031-11-17
Also published as: CN102766601A

Abstract

本发明提供了一种含有可诱导型癌基因的细胞系，所述的细胞系的保藏号为CCTCC？NO：C201192，所述的细胞系中K-ras^G12V蛋白的表达可被强力霉素所调控，所述的细胞系为TRex-K-ras^G12V-293细胞系。本发明还提供以此作为筛选模型建立特异性抗肿瘤药物高通量筛选平台。

Description

含有可诱导型癌基因的细胞系及其建立方法、应用

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物研发技术领域，尤其涉及一种可诱导K-ras^G12V癌基因表达的细胞系及以此作为筛选模型建立特异性抗肿瘤药物高通量筛选平台。

背景技术

肿瘤的发生与癌基因的突变关系密切。在大约30％左右的人类恶性肿瘤中，都可以发现RAS家族的基因突变。在某些肿瘤，如胰腺癌、结肠癌等，RAS家族基因突变的百分率更高达40％-90％。这些突变最常发生于K-ras基因。第12位氨基酸(G→V)突变(K-ras^G12V)是K-ras常见的激活性基因突变，特别在是胰腺癌中尤其常见。现代K-ras基因突变的肿瘤病人对化疗和放疗有明显的耐受性，一旦发生K-ras突变，可供选择的治疗方案十分有限，病人的预后通常较差。多年来，研究人员致力于寻找一种对K-ras突变肿瘤有较强细胞毒性的药物。虽然以K-Ras为靶标的抗肿瘤药物的研究取得了一定的进展，但目前临床上仍缺乏一种有效的针对K-ras突变肿瘤的选择性抗肿瘤药物。在技术领域，缺乏高效筛选和鉴定特异性针对K-ras癌基因的药物的方法是目前的主要技术缺陷之一。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足，建立一种特异性针对K-ras癌基因的选择性抗肿瘤药物高通量筛选平台，该平台可以筛选出对激活突变的K-ras基因有选择性杀伤作用的新型抗肿瘤药物。

不断发展的高通量化合物筛选技术为寻找以K-ras为靶标的新型抗肿瘤药物提供了新的可行途径。本发明基于高通量筛选技术，以分子和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对大量样品检测。这种技术具有微量、精确、快速的特点，通过短时间内对大量化合物库的筛选，快速发现先导化合物并对其进行进一步的研究，为临床抗肿瘤药物的研发提供了一条高效、快捷的途径。

以细胞为基础的高通量药物筛选平台的建立需要合适的细胞模型。四环素(Tet)操纵子调控系统是一种可诱导的基因表达系统。在没有四环素(或强力霉素)存在时，Tet阻遏因子(TetR)与Tet操纵因子序列(TetO)结合而阻断四环素抗性基因的表达；在四环素(或强力霉素)存在时，TetR对TetO的阻遏解除，下游基因转录启动。通过这个系统，不仅可以对靶基因的表达进行调控，同时也提供了良好的等基因细胞(isogenic)对照。因此，四环素操纵子调控的可诱导靶基因表达系统为高通量药物筛选提供了理想的细胞模型。

本发明提供一种可被强力霉素(doxycycline)诱导的、含有K-ras^G12V基因突变的基因表达系统，即TRex-K-ras^G12V-293细胞系，其保藏号为CCTCCNO：C201192。四环素诱导表达的TRex-K-ras^G12V-293细胞系，其保藏号为CCTCCNO：C201192，于2011年9月28日提交位于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，并经鉴定存活。在该系统中强力霉素发挥控制基因表达的“开关”作用，细胞内没有强力霉素存在时K-ras^G12V不表达，细胞内有强力霉素存在时K-ras高表达，且表达的程度与强力霉素作用的时间正相关。在激活性K-ras癌基因信号的作用下，细胞迅速出现代谢改变，其特征表现在线粒体呼吸功能的下调，糖酵解活跃，乳酸产生率增高等，与温博格效应(Warburgereffect)相符合。在长期Tet/on诱导K-ras^G12V表达的情况下，细胞呈现恶性转化，能在软琼脂中生长并形成克隆，在裸鼠体内形成肿瘤。因此，K-ras^G12V癌基因可诱导性表达细胞系在Tet/on合Tet/off两种情况下呈现两种不同的生物学表型(癌型、非癌型)，可用于筛选和鉴定能特异性针对携带K-ras癌基因的肿瘤细胞的化合物。

所述的细胞系中稳定转入了pcDNA6/TR质粒和含有K-ras^G12V癌基因的pcDNA4/TO-K-ras^G12V质粒。

所述的pcDNA4/TO-K-ras^G12V质粒上12位密码子含有K-ras^G12V突变的基因序列。

本发明还提供一种TRex-K-ras^G12V-293细胞作为高通量药物筛选平台细胞模型的用途。把在Tet/on和Tet/off两种状态下的TRex-K-ras^G12V-293细胞以相同细胞数各置于一块96孔板中，这一对96孔板的每一对对应孔接受同一的药物处理(96对孔接受96个不同药物的处理)。以Tet/off状态下细胞的结果做为对照，可以筛选出对K-ras^G12V高表达的Tet/on状态的细胞具有选择性细胞毒性的药物。

本发明进一步提供一种以TRex-K-ras^G12V-293为细胞模型的高通量药物筛选平台硬件系统的组成方案和数据分析方法。该高通量筛选平台的主要组成部分包括：(1)K-ras^G12V癌基因可诱导性表达细胞系；(2)化合物药库；(3)96孔板自动移液系；(4)96孔板自动酶标仪；(5)数据分析系统；详见下述技术方案。

本发明提供TRex-K-ras^G12V细胞系的建立方法，具体步骤如下：

(1)突变的K-ras^G12VcDNA全编码序列经PCR扩增后插入pcDNA4/TO载体的限制性酶切位点(如图1-A)，产生pcDNA4/TO-K-ras^G12V；

(2)经DNA测序，证实pcDNA4/TO-K-ras^G12V质粒确含编译G12V的密码子突变；

(3)将pcDNA4/TO-K-rasG12V质粒转入已稳定转入pcDNA6/TR质粒的TRex-293细胞；

(4)加入10ug/ml稻瘟菌素(blasticidin)和200ug/ml博来霉素(zeocin)以筛选出稳定转入pcDNA6/TR和pcDNA4/TO-K-ras^G12V两种质粒的细胞克隆；

(5)存活下来的细胞不断增殖发展为TRex-K-ras^G12V-293细胞系，培养于含有10％胎牛血清，10ug/ml稻瘟菌素和200ug/ml博来霉素的DMEM培养基中。该细胞系的K-ras^G12V表达可被Tet或强力霉素所控制。

TRex-K-ras^G12V-293细胞建立后即可应用于高通量抗肿瘤药物筛选平台。Tet/on和Tet/off两种状态下的TRex-K-ras^G12V-293细胞以相同的数目各置于一块九十六孔板中，这一对九十六孔板的相应孔接受相同的药物处理，以Tet/off状态下细胞的毒性结果为对照，可以筛选出对K-ras^G12高表达(Tet/on)状态的细胞具有选择性毒性的药物。据此可设计以TRex-K-ras^G12V-293细胞模型为基础的高通量药物筛选平台。如图2所示，以TRex-K-ras^G12V-293为细胞模型的高通量药物筛选平台主要组成部分包括：(1)K-ras^G12V癌基因可诱导性表达细胞系；在长期Tet/on诱导K-ras^G12V表达的情况下，细胞呈现恶性转化并具有癌型代谢特征(线粒体呼吸功能的下调，糖酵解活跃，乳酸产生率增高等)，而Tet/offcells不表达K-ras^G12V，做为非癌细胞对照。因为两组细胞具同等基因型，两者并用能提供一套用于筛选和鉴定针对携带K-ras癌基因的肿瘤细胞的特异性化合物的筛选系统。(2)化合物药库；该药库可以是小分子化合物、大分子生物制剂，或中草药有效成分等。(3)96孔板自动移液系；该工作站可以在筛选过程中实现液体的快速精确分配，以辅助药物稀释、细胞铺板、细胞加药等环节。(4)96孔板自动酶标仪；该酶标仪可以快速读出96孔板各孔的吸光值，提供细胞毒性的原始数据。(5)数据分析系统；该系统的数据处理下列计算模式：

T_on＝(Xⁱ _on-B)/(X⁰ _on-B)

S . I . = \frac{({X^{i}}_{off} - B) / ({X^{0}}_{off} - B)}{({X^{i}}_{on} - B) / ({X^{0}}_{on} - B)}

上式中,

T_off代表药物(i)对Tet/off细胞的毒性程度。

Xⁱ _off代表Tet/off细胞经药物(i)作用后的吸光值(MTS分析法)。

X⁰ _of代表Tet/off细胞经不含药物的溶剂(如DMSO)作用后的吸光值(MTS分析法)。

B代表96孔板的背景(空白)吸光值。

T_on代表药物(i)对Tet/on细胞的毒性程度。

Xⁱ _on代表Tet/on细胞经药物(i)作用后的吸光值(MTS分析法)。

X^O _on代表Tet/on细胞经不含药物的溶剂(如DMSO)作用后的吸光值(MTS分析法)。

S.I.代表药物特异性抗癌作用的选择性指数(selectivityindex。)

药物筛选数据的分析方法主要包括如下步骤：

(1)酶标仪测得各孔吸光值后，应用相应的软件首先自动扣除背景值(即空白对照孔吸光值B)；

(2)应用软件自动计算各个化合物的T_off值，T_on值，和S.I.值，其计算公式如上述。

(3)判断标准：如果T_off值接近1，说明该化合物对正常(非癌)细胞没有明显毒性，如果T_off值小于1，说明该化合物对正常(非癌)细胞有一定的毒性。如果T_on值接近1，说明该化合物对含K-ras癌细胞没有明显毒性，如果T_on值小于1，说明该化合物对含K-ras癌细胞有一定的毒性。T_on值越小，表示该化合物对癌细胞的杀伤作用越强。S.I.值越大，说明合物对含K-ras癌细胞的特异性杀伤作用越大，并且对正常细胞的毒性小。

本发明还提供一对作为高通量药物筛选平台板的标准对照板的设计方案。标准对照板含八种临床常用的抗肿瘤药物，用于与待测化合物比较抗癌活性和选择性，同时作为板间对照，用以评估和校正在不同时间检测可能存在的系统误差。如图3所示，标准对照板的96个孔被平均分为八个区域，各区域内各含3-4个浓度的标准药物。另外，对照板还设有三种对照孔(每种对照各三个孔)，第一种对照孔(Ctrl0)只含有TRex-K-ras^G12V-293细胞生长所需的培养液；第二种对照孔(Ctrl1)只含有细胞和培养液；第三种对照孔(Ctrl2)在第二种对照孔的基础上加入了DMSO，以判断溶剂本身是否有细胞毒性作用。在利用标准对照板进行测试时，别以Tet/on和Tet/off的TRex-K-rasG12V-293细胞作为实验所用细胞。所述的八种标准孔癌药物分别为5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、卡莫斯汀、顺铂、表阿霉素、吉西他滨、紫杉醇、长春新碱。所述的细胞毒药物的浓度如下表所示：

表1.对照板中八种细胞毒药物所需浓度

附图说明

图1A为突变的K-rasCDNA全编码序列经PCR扩增后插入pcDNA4/TO载体的限制性酶切位点后形成的质粒图；

图1B为强力霉素对稳定转入pcDNA4/TO和pcDNA6/TR两个质粒的TRex-293细胞中K-ras表达的调控示意图；

图2为特异性抗肿瘤药物高通量筛选平台的主要组成部分，包括：(1)K-ras^G12V癌基因可诱导型细胞系；(2)化合物药库；(3)96孔板自动移液系；(4)96孔板自动酶标仪；(5)数据分析系统；

图3为标准对照板布局方案示意图，A-H分别代表一种现有细胞毒药物处理区域，每种药物在横向各有三个复孔，纵向各有3-4种浓度。Ctrl0：只含有培养基的空白对照；Ctrl1：只含有细胞和培养基的阴性对照；Ctrl2：含有细胞、培养基和DMSO的阴性对照；

图4为20ng/ml强力霉素诱导下，不同时间点TRex-K-ras^G12V-293细胞K-ras表达量的变化；

图5为K-ras诱导的癌型代谢改变，表现于线粒体呼吸链受抑制，葡萄糖吸收增多，乳酸释放增多；

图6为K-ras抑制线粒体呼吸链复合物I的呼吸作用；

图7为K-ras诱导细胞恶性转化，表现于受K-ras诱导的细胞能在软琼脂中生长并形成克隆，而未经诱导的则不形成克隆；

图8为K-ras诱导细胞恶性转化，表现于受K-ras诱导的细胞在裸鼠体内成瘤率高于未经诱导的细胞。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下述实施例中的TRex-K-ras^G12V-293细胞系均为保藏号为CCTCCNO：C201192的细胞系。

实施例1可被强力霉素诱导的TRex293-K-ras细胞系的建立。

实验所用材料：pcDNA4/TO质粒，pcDNA6/TR质粒，T-REx-293细胞

实验具体步骤：突变的K-rasCDNA全编码序列经PCR扩增后插入pcDNA4/TO载体的限制性酶切位点(如图1A)，产生pcDNA4/TO-K-ras；经DNA测序，证实pcDNA4/TO-K-ras质粒在12位密码子发生了突变；将pcDNA4/TO-K-ras质粒转入已稳定转入pcDNA6/TR质粒的TRex-293细胞(如图1B)；加入10ug/ml稻瘟菌素(blasticidin)和200ug/ml博来霉素(zeocin)以筛选出稳定转入pcDNA6/TR和pcDNA4/TO-K-ras两种质粒的细胞克隆；存活下来的细胞不断增殖发展为TRex-K-ras^G12V-293细胞系，培养于含有10％胎牛血清、10ug/ml稻瘟菌素和200ug/ml博来霉素的DMEM培养基中，该细胞系的K-ras表达可被强力霉素控制。

实施例2强力霉素诱导TRex-K-ras细胞系中K-ras的高表达。

实验所用细胞：TRex-K-ras^G12V-293细胞，TRex-vector细胞

实验具体步骤：用含有强力霉素20ng/ml的培养液培养TRex-K-ras^G12V-293细胞，于培养0h，12h，24h，48h，72h五个时间点分别提蛋白；用含有强力霉素20ng/ml的培养液培养培养TRex-vector细胞，于培养0h，48h提蛋白；对上述各时间点的七种蛋白样品进行免疫印记分析，测得各样本中K-ras蛋白的相对表达量的多少。结果表明，与TRex-vector对照组相比，强力霉素可明显诱导TRex-K-ras^G12V-293中K-ras蛋白的异常高表达，这种高表达具有时间依赖性，随着时间的延长，K-ras蛋白的表达量也不断升高，结果见图4。

实施例3K-ras的表达引起细胞代谢的改变。

实验所用细胞：TRex-K-ras^G12V-293细胞

实验具体步骤：用含有强力霉素20ng/ml的培养液培养TRex-K-ras^G12V-293细胞，于培养24h，72h分别检测细胞的氧耗量，葡萄糖摄取量和乳酸含量。结果表明，与没有加入强力霉素诱导的Tet/off的TRex-K-ras^G12V-293细胞相比，Tet/on的TRex-K-ras^G12V-293细胞乳酸含量明显升高，且具有时间依赖性，细胞表现出明显的温博格(Warburgereffect)效应，结果见图5；用鱼藤酮抑制细胞呼吸复合体I结果表明与Tet/off的细胞相比，Tet/on的细胞呼吸速率明显降低，而加入地高辛和琥珀酸后，Tet/on的细胞和Tet/off的细胞呼吸速率差别不明显，表明Tet/on状态下细胞的代谢改变可能是因为细胞呼吸复合体I受到抑制。

实施例4：K-ras长期表达导致细胞的恶性转化。

实验所用细胞：TRex-K-ras^G12V-293细胞

实验具体步骤：在体外用含有强力霉素20ng/ml的培养液培养TRex-K-ras^G12V-293细胞，于培养30天，分别以相同数目的该细胞和Tet/off的TRex-K-ras^G12V-293细胞核进行琼脂糖凝胶克隆形成实验，两周后结晶紫染色，观察克隆形成数，可见Tet/on的TRex-K-ras^G12V-293细胞其克隆形成数明显多于Tet/off的TRex-K-rasG12V-293细胞，结果见图7；同时以裸鼠为模型的体内动物实验也显示，注射相同数目的Tet/on和Tet/off的TRex-K-rasG12V-293细胞，被注射Tet/on细胞的裸鼠成瘤率和形成的肿瘤体积明显大于注射Tet/off细胞的裸鼠，结果见图8。以上结果表明，K-ras长期表达可导致细胞的恶性转化。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种含有可诱导型癌基因的细胞系，其特征在于，所述的细胞系的保藏号为CCTCCNO：C201192，所述的细胞系中K-ras^G12V蛋白的表达可被强力霉素所调控，所述的细胞系为TRex-K-ras^G12V-293细胞系。

2.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于，所述的细胞系中稳定转入了pcDNA6/TR质粒和含有K-ras^G12V癌基因的pcDNA4/TO-K-ras^G12V质粒。

3.根据权利要求2所述的细胞系，其特征在于，所述的pcDNA4/TO-K-ras^G12V质粒上12位密码子含有K-ras^G12V突变的基因序列。

4.一种如权利要求1所述的含有可诱导型癌基因的细胞系作为高通量药物筛选平台模型的用途。

5.一种以细胞为基础的高通量药物筛选平台，其特征在于，所述的细胞为保藏号为CCTCCNO：C201192的细胞系，所述的高通量药物筛选平台包含TRex-K-ras^G12V-293细胞系。

6.一种以如权利要求1所述的TRex-K-ras^G12V-293细胞系为细胞模型的高通量药物筛选平台硬件系统，其特征在于，所述系统至少包含如权利要求1所述的TRex-K-ras^G12V-293细胞系、一台96通道高通量自动移液工作站和一台全自动酶标仪。

7.一对作为高通量药物筛选平台板间对照并包含如权利要求1所述的TRex-K-ras^G12V-293细胞系的对照板，其特征在于，所述的对照板分别使用Tet/on的保藏号为CCTCCNO：C201192的细胞系和Tet/off保藏号为CCTCCNO：C201192的细胞系。

8.根据权利要求7所要求的对照板，其特征在于，所述的一对对照板分别同时接受八种常用标准抗癌药物的处理，所述的一对对照板内各自包含空白对照、标准对照和溶剂对照等三种对照。

9.一种以细胞为基础的高通量药物筛选数据的分析方法，其特征在于，所述的细胞为保藏号为CCTCCNO：C201192的细胞系，所述的分析方法包括如下步骤：

(1)酶标仪测得各孔吸光值后，应用相应的软件首先自动扣除背景值；

(2)将所得各吸光值与DMSO对照组进行比较，得到某个化合物对Tet/on和Tet/off状态下TRex-K-ras^G12V-293细胞的活性分数；

(3)将某种化合物作用于Tet/off细胞所得活性分数与其作用于Tet/on细胞所得活性分数相除，即得到该种化合物的选择性指数；选择性指数越高，说明该种化合物对K-ras^G12V突变的细胞的选择性杀伤作用越强。