KR20170131567A - 살아있는 세포의 통합된 대사 베이스라인 및 포텐셜의 측정을 위한 방법 및 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 살아있는 세포의 대사 베이스라인 및 포텐셜을 신속하게 측정하는 방법에 관한 것이다. 일 양태는 세포 내의 2개의 주요 에너지-발생 경로(즉, 미토콘드리아 호흡 및 해당)를 베이스라인 조건 하에 먼저 측정하고, 증가된 에너지 공급을 요구하기 위해 세포에 스트레스를 가한 후에 다시 측정한다. 일부 양태에서, 스트레스는 세포를 2개의 화합물(미토콘드리아 탈공역제 및 ATP 신타제 억제제)의 조합에 노출시킴으로써 적용될 수 있다. 일 양태에서, 미토콘드리아 호흡 경로의 대사 에너지 생성 활성은 살아있는 세포에 의한 산소 소비 속도를 측정함으로써 결정되고, 해당 경로의 대사 에너지 생성 활성은 세포로부터의 양성자의 분비에 의해 야기된 세포외 산성화의 측정으로부터 결정된다. 다른 양태는 멀티-웰 플레이트의 웰에서 세포 샘플의 대사 포텐셜을 측정하기 위한 장치에 관한 것이다.
Description
본원은 2015년 3월 27일자 출원된 미국 가출원 제62/139,432호를 우선권 주장하고, 그 전체 내용은 본원에 참고로서 혼입된다.
시호스 바이오사이언스(Seahorse Bioscience)는 세포의 두 가지 주요 에너지 생성 경로 각각에 대해 대사 베이스라인(metabolic baseline)과 포텐셜(potential)에 대한 두 가지 독립적인 시험을 개발하였다. 각 시험은 3 가지 화학적 화합물의 첨가와 하나의 대사 경로의 활성 측정이 필요하다. 미토콘드리아 기능 시험에 관한 예시적인 문헌은 문헌[S.W. Choi, et al., J. Neurochem. (2009) 109, 1179-1191]; 문헌[L.S. Pike et al, Biochim. Biophys. Acta (2010), doi:10.1016/jbbabio.2010.10.022]; 문헌[B.B. Hill, Biochem. J. (2009) 424, 99-107]; 문헌[D.G. Nichols, et al., JoVE. (2010) 46. www.iove.com/details.php?id-2511. doi:10.3791/2511]; 문헌[B.P. Dranka et al., Free Radical Biology & Medicine 51 (2011) 1621-1635]을 포함한다. 해당(glycolysis) 기능 시험에 관한 예시적인 문헌은 문헌[Pike et al., and A. Ibrahim-Hashim, et al, J. Cancer Sci Ther. (November 19, 2011), Suppl 1 (4)]을 포함한다. 두 경로의 조합된 측정은 문헌[D.A. Ferrick, et al., Drug Discovery Today (March 2008) 13, 5/6]에 개시되어 있다.
본 발명의 양태는 살아있는 세포로의 조합된 화합물의 단일 노출을 동시에 사용하는, 대사 경로 베이스라인 및 포텐셜 둘 다를 측정하기 위한 특정 화학적 화합물의 조합을 포함한다. 놀랍게도, 이러한 실험으로부터 측정된 결과는 두 경로의 강력한 측정을 동시에 제공한다.
본 발명의 양태는 절실히 단일 주사에 의한 주요 대사/에너지 경로 둘 다의 자극뿐만 아니라, 단일 주사에 근거한 이들 주요 경로(즉, 미토콘드리아 호흡 및 해당)의 대사 포텐셜의 측정을 가능하게 한다. 미토콘드리아 및 해당은 ATP의 관점에서 세포의 에너지의 대부분을 생산하고, 바이오매스와 세포 구성물을 생성하는 생합성 반응에 필수적이다.
종래 접근법은 2개의 주요 에너지 경로를 개별적으로 자극하고 분석하는 것으로 제한되었다. 종래 접근법은 2개의 주요 에너지 경로를 동시에 자극할 수 있는 화합물을 동정하고 전달할 수 없었다. 또한, 종래 접근법은 스트레스에 대한 2개의 주요 에너지 경로의 동시 반응을 측정할 수 없었다.
적어도 4개의 이유로, 2개의 경로를 동시에 자극할 수 있는 화합물의 동정 및 전달은 당업자에게 자명하지 않다. 첫째로, 시호스 바이오사이언스가 세포외 플럭스(Extracellular Flux: XF) 기기를 상용화할 때까지는 살아있는 세포에서 두 경로를 모두 측정할 수 있는 기술이 없었기 때문에 이러한 문제를 고려한 사람은 거의 없었다. 둘째로, 당업자의 대다수는 미토콘드리아 전문가이거나 해당의 전문가이다. 대사는 미토콘드리아와 해당이 2개뿐인 많은 "서브시스템"의 거대한 수집물이다. 대사가 연구되는 대다수의 질병과 지식분야에서, 당업자는 연구와 가장 관련 있는 서브시스템에만 초점을 맞추기 때문에, 두 경로와 관련된 실험을 수행하는 방법과 이를 해석하는 방법을 알지 못한다.
셋째로, 본 발명의 양태에서 단일 주사로 전달된 2개의 화합물, 즉 탈공역제(uncoupling agent) 및 ATP 신타제 억제제(올리고마이신)는 해당이 아니라 미토콘드리아를 연구하기 위해 개발되었다. 많은 연구자들이 미토콘드리아 기능을 이해하는데 ATP 신타제 억제제를 사용했지만, 시호스 바이오사이언스는 해당 기능을이해하는데 ATP 신타제 억제제를 사용한 첫 번째 회사이다. 예를 들어, 시호스는 해당 스트레스 시험에서 해당 시스템의 스트레스 요인으로서 올리고마이신을 처음으로 사용하였다.
최종적으로, 당업자는 해당 및 산화성 인산화가 상호 보완적인 작용을 한다고 가정한다. 따라서, 종래 접근법은 일반적으로 하나의 경로를 자극하고 다른 경로를 감소시키는 전제에 기초한다. 본 발명의 양태는 두 경로가 동시에 자극될 것으로 예상되므로 근본적으로 다른 접근법을 포함한다.
시호스 바이오사이언스는 산소 소비 속도("OCR")와 세포외 산성화 속도("ECAR")를 동시에 측정할 수 있는 기술을 선보였다(페릭(Ferrick) 등의 문헌 참고). 그러나, 어느 누구도 동시에 탈공역제와 ATP 신타제 억제제를 동시에 주사하여 두 에너지 경로에 동시에 스트레스를 주어 대사 포텐셜 및 이에 따른 표현형의 단일 지표를 제공하지 못하였다. 2개의 별개 접근법 및 2개의 별개 샘플을 사용하여 스트레스에 대한 반응을 독립적으로 결정하고, 이어서 데이터를 수학적으로 조합하여 합계를 결정할 수 있다. 대조적으로, 본원에 기술된 본 발명의 양태에 따른 방법은 단일 샘플 및 단일 주사를 사용하고, 이에 의해, 사용자는 미토콘드리아 호흡 및 해당 모두를 나타내는 세포의 단일 대사 베이스라인 및 포텐셜을 측정할 수 있다.
본원에 기술된 본 발명의 양태에 따른 방법은 세포의 대사 능력을 결정하는 종래 기술의 방법에 비해 다수의 상당한 이점을 갖는다. 예를 들어, 탈공역제 및 ATP 신타제 억제제의 투여가 단일 주사를 통해 수행되므로, 데이터를 훨씬 더 신속하게 수집할 수 있어 대사 능력을 높은 처리량으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 종래 기술의 방법은 ATP 신타제 억제제의 투여와 탈공역제의 투여 사이에 20분 간격을 필요로 했지만, 이는 본원에 기재된 방법에서 제거된다. 대신에, 본원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 따른 방법은 ATP 신타제 억제제의 투여와 종래 기술의 방법의 탈공역제의 투여 사이에 20분 미만의 간격을 필요로 한다. 예를 들어, 본원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 따른 특정 방법은 ATP 신타제 억제제의 투여와 탈공역제의 투여 사이의 간격이 20분 미만, 15분 미만, 10분 미만, 5분 미만, 2분 미만 또는 1분 미만이다. 본원에 기술된 본 발명의 특정 양태에 따른 다른 방법은 ATP 신타제 억제제 및 탈공역제가 동시에 또는 본질적으로 동시에(예를 들어, 즉시 순차적으로) 투여될 수 있음을 입증한다.
유사하게, 소정 실험에서 사용된 세포 샘플의 수는, 별개 샘플에서 OCR 및 ECAR을 동시에 측정하는 종래 기술의 방법과 비교하여, 절반으로 감소될 수 있다. 이것은 세포 유형, 특히 1차 세포 배양물을 희귀하게 다루거나 어렵게 배양하는 연구자에게 중요한 이점이다. 탈공역제와 ATP 신타제 억제제를 단일 주사로 조합하면 분배 시스템의 구성요소가 유리되어 더 복잡한 실험을 가능하게 한다. 마지막으로, 탈공역제와 ATP 신타제 억제제의 비율이 각각의 반복검증에 대해 고정되기 때문에, 종래 기술의 방법과 비교하여 본원에 개시된 방법에 의해 수득된 데이터로부터 중요한 변동원이 제거된다.
일 양상에서, 본 발명의 일부 양태는 세포 샘플의 대사 포텐셜을 측정하는 방법을 포함한다. 세포 샘플의 초기 산소 소비 속도 및 초기 세포외 산성화 속도를 동시에 측정한다. 이어서, 미토콘드리아 탈공역제 및 ATP 신타제 억제제가 세포 샘플에 동시에 투여된다. 이어서, 세포 샘플의 후속 산소 소비 속도 및 후속 세포외 산성화 속도가 동시에 측정된다. 세포 샘플의 대사 포텐셜이 결정된다.
다음 특징 중 하나 이상이 포함될 수 있다. 미토콘드리아 탈공역제 중 1종 이상은 카보닐 시아나이드 p-트라이플루오로메톡시페닐하이드라존("FCCP"), 카보닐 시아나이드-m-클로로페닐하이드라존("CCCP") 또는 2,4-다이니트로페놀(DNP) 또는 BAM15를 포함할 수 있거나, ATP 신타제 억제제는 올리고마이신 또는 7-클로로-5-(4-하이드록시페닐)-1-메틸-3-(나프탈렌-2-일메틸)-4,5-다이하이드로-1H-벤조[b][1,4]다이아제핀-2(3H)-온(Bz-423)을 포함할 수 있다.
미토콘드리아 탈공역제는 카보닐 시아나이드 p-트라이플루오로메톡시페닐하이드라존("FCCP")을 포함할 수 있고, ATP 신타제 억제제는 올리고마이신을 포함할 수 있다.
세포 샘플은 배지에 배치된 복수의 세포를 포함할 수 있다. 초기 산소 소비 속도를 측정하고/거나 세포 샘플의 초기 세포외 산성화 속도를 측정하는 단계는 배지에 배치된 세포 구성물을 감지하는 단계를 포함한다.
배지에서 투여된 미토콘드리아 탈공역제의 농도는 약 0.1 내지 약 2.0 μM, 예를 들어 약 0.5 μM일 수 있다. 배지에서 투여된 ATP 신타제 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 2 μM, 예컨대 약 1.0 μM이다. 미토콘드리아 탈공역제 및 ATP 신타제 억제제는 세포 샘플에 투여하기 전에 혼합될 수 있다.
세포 샘플은 세포 샘플의 초기 산소 소비 속도 및 초기 세포외 산성화 속도의 동시 측정 전에 멀티-웰(multi-well) 플레이트의 웰에 배치될 수 있다. 미토콘드리아 탈공역제 및 ATP 신타제 억제제는, 상기 미토콘드리아 탈공역제 및 ATP 신타제 억제제를 동시에 하나 이상의 포트로부터 상기 웰에 동시에 도입함으로써, 투여될 수 있다.
세포 샘플의 대사 포텐셜을 측정하는 단계는 (i) 초기 산소 소비 속도, 초기 세포외 산성화 속도, 후속 산소 소비 속도 및 후속 세포외 산성화 속도를 소프트웨어 프로그램에 제공하는 단계; 및 (ii) 소프트웨어 프로그램을 사용하여 대사 포텐셜을 계산하는 단계를 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명의 양태는 멀티-웰 플레이트의 웰에서 세포 샘플의 대사 포텐셜을 측정하기 위한 장치를 포함한다. 상기 장치는 (i) 멀티-웰 플레이트를 지지하도록 구성된 스테이지; (ii) 멀티-웰 플레이트의 웰에서 세포 샘플과 회합(association)된 세포 구성물을 감지하도록 구성된 센서; 및 (iii) 유체를 웰 내로 도입하도록 구성된 분배 시스템을 포함한다. 상기 스테이지, 센서 및 분배 시스템은 함께 작동하여, 센서를 사용하여 세포 샘플의 초기 산소 소비 속도 및 초기 세포외 산성화 속도를 동시에 측정한다. 이어서, 분배 시스템을 사용하여 미토콘드리아 탈공역제 및 ATP 신타제 억제제를 세포 샘플에 동시에 투여한다. 이어서, 센서를 사용하여 세포 샘플의 후속 산소 소비 속도 및 후속 세포외 산성화 속도를 동시에 측정한다. 세포 샘플의 대사 포텐셜이 측정된다.
다음 특징 중 하나 이상이 포함될 수 있다. 분배 시스템은 웰 위에 배치된 하나 이상의 포트를 포함할 수 있다. 센서는 광학 센서를 포함할 수 있다. 센서는 형광단(fluorophore)을 감지하도록 구성될 수 있다. 상기 장치는 센서에 의해 컴퓨터 모듈에 전달된 정보에 기초하여 대사 포텐셜을 계산하도록 구성된 컴퓨터 모듈 및 소프트웨어를 포함할 수 있다.
도 1은 RAW 264.7 대식세포에서 올리고마이신의 존재 하에 FCCP 적정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 RAW 264.7 대식세포 세포에서 대사 포텐셜에 대한 LPS 처리의 효과를 나타낸 실험 결과를 제시한다.
도 3은 Hela 세포의 대사 포텐셜에 대한 DCA 처리의 효과를 나타낸 실험 결과를 제시한다.
도 4는 C2C12 근아세포 세포에 대한 UK5099 처리의 효과를 나타낸 실험 결과를 제시한다.
도 5는 A549 세포, 래트 성상세포, 일차 마우스 골수-유래 대식세포, BT474 세포, HCT116 세포 및 HepG2 세포의 대사 포텐셜을 나타낸 실험 결과를 제시한다.
도 6은 인간 제대 정맥 내피 세포, MDA-MB-231 세포, MCF-7 세포, 신생아 래트 심실 근세포, PC12 세포 및 SKBR-3 세포의 대사 포텐셜을 나타낸 실험 결과를 제시한다.
도 7은 C2C12 근관세포의 대사 포텐셜에 대한 에토목시르(Etomoxir)의 효과를 나타낸 실험 결과를 제시한다.
도 8은 주르카트(Jurkat) 세포의 대사 포텐셜에 대한 라파마이신 치료의 효과를 나타낸 실험 결과를 제시한다.
도 9는 본원에 기재된 본 발명의 양태에 따른 특정 방법에 의해 생성될 수 있는 예시적인 데이터의 그래프이다.
도 10은 본원에 기재된 본 발명의 특정 양태와 함께 사용될 수 있는 예시적인 사용자 인터페이스의 스크린샷이다.
도 2는 RAW 264.7 대식세포 세포에서 대사 포텐셜에 대한 LPS 처리의 효과를 나타낸 실험 결과를 제시한다.
도 3은 Hela 세포의 대사 포텐셜에 대한 DCA 처리의 효과를 나타낸 실험 결과를 제시한다.
도 4는 C2C12 근아세포 세포에 대한 UK5099 처리의 효과를 나타낸 실험 결과를 제시한다.
도 5는 A549 세포, 래트 성상세포, 일차 마우스 골수-유래 대식세포, BT474 세포, HCT116 세포 및 HepG2 세포의 대사 포텐셜을 나타낸 실험 결과를 제시한다.
도 6은 인간 제대 정맥 내피 세포, MDA-MB-231 세포, MCF-7 세포, 신생아 래트 심실 근세포, PC12 세포 및 SKBR-3 세포의 대사 포텐셜을 나타낸 실험 결과를 제시한다.
도 7은 C2C12 근관세포의 대사 포텐셜에 대한 에토목시르(Etomoxir)의 효과를 나타낸 실험 결과를 제시한다.
도 8은 주르카트(Jurkat) 세포의 대사 포텐셜에 대한 라파마이신 치료의 효과를 나타낸 실험 결과를 제시한다.
도 9는 본원에 기재된 본 발명의 양태에 따른 특정 방법에 의해 생성될 수 있는 예시적인 데이터의 그래프이다.
도 10은 본원에 기재된 본 발명의 특정 양태와 함께 사용될 수 있는 예시적인 사용자 인터페이스의 스크린샷이다.
세포 에너지 표현형 시험은 살아있는 세포의 대사 베이스라인 및 포텐셜을 신속하게 측정하는 방법이다. 이것은 세포 내에서 2개의 주요 에너지 생성 경로인 미토콘드리아 호흡 및 해당을 먼저 베이스라인 조건 하에 측정하고, 다시 증가된 에너지 공급을 요구하는 세포에 스트레스를 적용한 후에 측정함으로써 달성된다.
스트레스는 미토콘드리아 탈공역제 및 ATP 신타제 억제제의 두 화학적 화합물의 조합에 세포를 노출하여 적용할 수 있다. 이러한 화학적 화합물은 두 대사 경로에 대한 겉보기 에너지 요구량을 증가시켜 각 경로 내의 활성을 최대 용량만큼 증가시킨다.
스트레스를 받은 상태와 베이스라인 상태 사이의 측정된 에너지 생성 활성의 차이는 대사 포텐셜을 정의한다. 대사 베이스라인과 대사 포텐셜의 조합은 세포의 에너지 표현형을 구성한다.
일 양태에서, 미토콘드리아 호흡 경로의 대사 에너지 생성 활성은 살아있는 세포에 의한 산소 소비 속도를 측정함으로써 결정되고, 해당 경로의 대사 에너지 생성 활성은 세포로부터의 양성자의 분비에 의해 야기된 세포외 산성화의 측정으로부터 결정된다.
실험적 접근
본 발명의 양태에 따라서, 프로토타입(prototype) 탈공역제인 카보닐 시아나이드 p-트라이플루오로메톡시페닐하이드라존("FCCP")은 내부 미토콘드리아 막을 가로질러 양성자 구배를 소산시킴으로써 호기성 시스템에 스트레스를 가한다. 이것은 세포가 미토콘드리아 활성을 최대로 증가시키도록 한다. 올리고마이신은 복합체 V의 ATPase를 차단하여, 이러한 복합체를 통해 전자를 역방향으로 공급하여 FCCP의 효과를 방해하는 아데노신 트라이포스페이트(ATP)의 가수분해를 방지한다. 올리고마이신은 또한 해당 시스템에 "스트레스"를 가하여 보다 많은 ATP를 생산함으로써, 미토콘드리아 ATPase의 억제에 의해 야기된 ATP 손실을 방해한다.
필요한 재료
1. 본 발명의 양태에 따라 분석을 수행하기에 적합한 분석 도구는, 예를 들어, 다음의 기기들 중 어느 하나일 수 있다:
a. 시호스 바이오사이언스 XFp 세포외 플럭스 분석기
b. 시호스 바이오사이언스 XFe24 세포외 플럭스 분석기
c. 시호스 바이오사이언스 XFe96 세포외 플럭스 분석기
d. 시호스 바이오사이언스 XF24 세포외 플럭스 분석기
e. 시호스 바이오사이언스 XF24-3 세포외 플럭스 분석기
f. 시호스 바이오사이언스 XF96 세포외 플럭스 분석기
이들 각각의 장치는 멀티-웰 플레이트의 웰에서 세포 샘플의 대사 포텐셜을 측정할 수 있게 한다. 상기 장치는 (i) 멀티-웰 플레이트를 지지하도록 구성된 스테이지; (ii) 멀티-웰 플레이트의 웰에서 세포 샘플과 회합된 세포 구성물을 감지하도록 구성된 센서; 및 (iii) 유체를 웰 내로 도입하도록 구성된 분배 시스템을 포함한다. 장치의 컴포넌트는, 예를 들어 미국 특허 제7,276,351호 및 제8,658,349호에 기술되어 있고, 이들 모두는 이의 전체 내용이 본원에 참조로서 혼입된다.
하기 논의되는 바와 같이, 상기 스테이지, 센서 및 분배 시스템은 함께 작동하여, 센서를 사용하여 세포 샘플의 초기 산소 소비 속도 및 초기 세포외 산성화 속도를 동시에 측정한다. 이어서, 분배 시스템을 사용하여 미토콘드리아 탈공역제 및 ATP 신타제 억제제를 세포 샘플에 동시에 투여한다. 이어서, 센서를 사용하여 세포 샘플의 후속 산소 소비 속도 및 후속 세포외 산성화 속도를 동시에 측정한다. 세포 샘플의 대사 포텐셜이 결정된다.
2. 세포 배양 배지. 전형적으로, 10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 인비트로겐(Invitrogen)에서 시판 중인 둘베코의 개질된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's medium: "DMEM").
3. 어세이 배지(전형적으로 글루코스, 글루타민 및 피루베이트가 보충되었지만 나트륨 바이카보네이트가 제거된 DMEM; 시호스 바이오사이언스에서 XF 기본 배지(Base Medium)로서 시판 중이고 10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 첨가됨).
4. 사용되는 기기에 적합한 어세이 카트리지(예: XFe96 FluxPak).
5. 배양물 중 세포(전형적으로 포유류이지만 이에 국한되지는 않음). 필요한 세포의 수는 사용된 기기와 세포의 유형에 따라 변한다. 전형적으로, 그 수는 웰 당 10,000 내지 1,000,000개이다. RAW 264.7 대식세포 세포를 이용하는 프로토타입의 예에서, 80,000개의 세포가 XFp 미니플레이트의 웰 당 시딩될 수 있다.
6. 시약(a 또는 b).
a. 올리고마이신 및 FCCP(각각 시호스 바이오사이언스에서 시판 중).
b. XFp 기기의 경우, 올리고마이신 및 FCCP는 키트(즉, XFp 세포 에너지 표현형 시험 키트(Cell Energy Phenotype Test Kit))로서 제공됨.
일반적으로, 시약은 바람직하게는 미토콘드리아 탈공역제 및 ATP 신타제 억제제의 조합을 포함한다. 적합한 미토콘드리아 탈공역제는, 예를 들어 카보닐 시아나이드 p-트라이플루오로메톡시페닐하이드라존("FCCP"), 카보닐 시아나이드 m-클로로페닐하이드라존("CCCP") 또는 2,4-다이니트로페놀("DNP") 또는 BAM15를 포함한다. 적절한 ATP 신타제 억제제는 올리고마이신 또는 7-클로로-5-(4-하이드록시페닐)-1-메틸-3-(나프탈렌-2-일메틸)-4,5-다이하이드로-1H-벤조[b][1,4]다이아제핀-2(3H)-온(Bz-423)을 포함한다.
예시적인 프로토콜
1. 배양된 세포를 먼저 사용되는 기기(위에 기술된 바와 같음)에 적절한 마이크로플레이트(본원에서 멀티-웰 플레이트로 지칭됨)의 웰에 시딩한다.
2. 마이크로플레이트에 부착한 후, 세포를 원하는 대로 성장시키거나 즉시 대사 포텐셜을 어세이할 수 있다.
3. 어세이시, 세포 배양 배지는 배지에 배치된 복수의 세포를 포함하는 세포 샘플을 생성하는데 사용되는 마이크로플레이트에 적합한 부피의 에세이 배지로 교환된다. 마이크로플레이트를 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리한다.
4. 일부 세포에서, 리포폴리사카라이드("LPS")를 어세이 배지로 바꾸는 동안 1 μg/mL의 최종 농도까지 첨가할 수 있다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 배양할 수 있다. LPS 처리는 어세이 중에 제거되지 않을 수 있다.
5. 적절한 기기는, 예를 들어 3회의 측정을 수행하고, 웰 내의 세포 샘플 위에 배치된 카트리지의 포트로부터 용액을 주입하고, 이어서 5회의 추가 측정을 수행하기 위한 명령 지시에 의해 프로그래밍된다.
6. 올리고마이신 저장 용액은 어세이 배지에서 10 μM의 작동 농도로 제조된다. FCCP는 어세이되는 특정 세포 유형에 최적화된 작동 농도까지 상기 용액에 첨가된다. 예를 들어, RAW 264.7 대식세포에서 5 μM의 작동 용액을 제조한다.
7. 충분한 부피의 작동 용액을 어세이 카트리지에 첨가하여, 주입시 작동 용액을 어세이 배지에 최종 목적 농도로 희석시킨다. 예를 들어, RAW 264.7 대식세포에서, 최종 목적 농도는 1.0 μM 올리고마이신과 0.5 μM FCCP이다. 이들 농도 둘 다 최적 효과를 위해 적정에 의해 결정되었다.
8. XFe96 기기에서, 최적 FCCP 농도를 적정하기 위해, RAW 264.7 대식세포를 다양한 농도의 약물에 노출시키고, 생성된 OCR을 측정한다. 이러한 예에서, 세포를 먼저 1.0 μM 올리고마이신(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 처리하고, OCR을 측정한 후, 다음 농도의 FCCP를 첨가하였다: 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 또는 2.0 μM(222 μL 어세이 배지에서의 최종 농도). 이어서, 생성된 OCR을 예시적인 도면과 같이 플로팅하여 OCR의 최대 자극을 달성하는 최저 농도를 결정한다.
9. 올리고마이신 및 FCCP를 함유하는 수화된 어세이 카트리지를 기기에 로딩한다.
10. 어세이 카트리지 보정 후, 세포 배양 마이크로플레이트를 기기에 로딩한다. 이어서, 상기 기기는 상기 약술한 바와 같이 프로그래밍된 측정 단계를 수행한다.
11. 세포 샘플의 대사 포텐셜은 (i) 초기 산소 소비 속도, 초기 세포외 산성화 속도, 후속 산소 소비 속도 및 후속 세포외 산성화 속도를 소프트웨어 프로그램에 제공하는 단계; 및 (ii) 소프트웨어 프로그램을 사용하여 대사 포텐셜을 계산하는 단계에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 실험의 완료시, 각 경로의 자극 정도를 기준으로 대사 포텐셜을 계산하는 엑셀(Excel) 매크로를 사용하여 데이터를 분석할 수 있다. 엑셀 매크로는 임의의 XF 기기에 의해 생성된 데이터를 분석한다. 데이터 분석은 스트레스 요인을 주입하기 전에 마지막 측정에 의해 정의된 대로 산소 소비 및 세포외 산성화의 베이스라인 속도를 결정함으로써 시작된다. 스트레스가 가해진 데이터 포인트는 올리고마이신과 FCCP의 동시 주입 후에 최대로 자극되는 데이터 포인트를 사용하여 결정된다. 이러한 데이터는 Y-축이 OCR을 나타내고 X-축이 ECAR을 나타내는 그래프로 표시된다. 대사 포텐셜은, 베이스라인 위에, 스트레스 요인에 의한 각 경로(OCR 및 ECAR)의 자극률을 결정함으로써 각각의 구성요소에 대해 개별적으로 결정된다. 본원에 기술된 본 발명의 양태에 따른 특정 방법에 의해 생성될 수 있는 데이터 유형의 예는 도 9에 제시된다. 본원에 기술된 본 발명의 특정 양태와 함께 사용될 수 있는 예시적인 사용자 인터페이스의 스크린샷은 도 10에 제시된다.
적절한 어세이 키트는 올리고마이신과 FCCP의 튜브를 포함할 수 있다. 화합물은 바람직하게 예비측정되고 안정성을 위해 동결건조된다.
조합된 대사 포텐셜뿐만 아니라 베이스라인 및 스트레스를 받은 표현형을 결정하기 위해 시분해적 데이터(time-resolved data)에 대한 계산이 수행될 수 있다. 데이터는 단일 실험용 마이크로플레이트 내에서 다수의 기술 반복검증으로부터 평균될 수 있다.
실시예
실시예 1. RAW 264.7 대식세포 세포에서 올리고마이신의 존재 하의 FCCP 적정
RAW 264.7 대식세포 세포를 XFe96 마이크로플레이트(시호스 바이오사이언스)에 8.0 x 104 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. RAW 264.7 세포는 반-부착성이므로, 세포를 각 웰에 넣고, 이어서 마이크로플레이트를 300 x g에서 2분간 원심분리하여 웰 바닥에 세포를 침전시켰다. 세포를 25 mM 글루코스, 4 mM 글루타민, 1 mM 피루베이트 및 10% FBS가 보충된 DMEM에서 24시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다.
FCCP 적정은 XFe96 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFe96 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. 간략하게, 세포를 먼저 1.0 μM 올리고마이신(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 처리하고, OCR을 측정한 후, 다음의 농도의 FCCP 중 하나를 첨가하였다: 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 또는 2 μM(222 μL 어세이 배지에서의 최종 농도). 이어서, OCR의 최대 자극을 달성하는 최저 농도를 결정하기 위해 생성된 OCR을 예시적인 도면과 같이 플로팅하였다.
적정의 결과를 도 1에 제시한다. 데이터는 1.0 μM 올리고마이신과 표시된 농도의 FCCP의 존재 하에 RAW 264.7 대식세포 세포의 산소 소비 속도이다. 제시된 데이터는 치료군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다. 이러한 데이터는 1.0 μM 올리고마이신의 존재 하에 0.5 μM FCCP로 최대 OCR이 달성됨을 나타낸다.
실시예 2. RAW 264.7 대식세포 대사 포텐셜에 대한 LPS 처리의 효과
RAW 264.7 대식세포를 8.0 x 104 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다. RAW 264.7 세포는 반-부착성이므로, 세포를 각 웰에 첨가하고, 이어서 마이크로플레이트를 300 x g에서 2분간 원심분리하여 웰 바닥에 세포를 침전시켰다. 세포를 25 mM 글루코스, 4 mM 글루타민, 1 mM 피루베이트 및 10% FBS가 보충된 DMEM에서 24시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다. LPS로 처리된 세포는 1 μg/mL LPS를 함유하는 배지를 수용하였고, 대조군 세포는 어세이 배지를 수용하였다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, LPS- 처리된 세포 및 대조군 세포를 함유한 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 0.5 μM FCCP와 1.0 μM의 올리고마이신(200 μL의 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 동시에 처리하고, OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과는 도 2에 제시된다. 데이터는 치료군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다. 이러한 데이터는 LPS로 처리된 세포의 호기성 대사 포텐셜이 대조군 세포에 비해 증가하고, 해당성 포텐셜은 대체로 변하지 않음을 나타낸다.
실시예 3. Hela 세포의 대사 포텐셜에 대한 DCA 처리의 효과
Hela 세포를 1.2 x 104 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다. 세포를 5.5 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 10% FBS가 보충된 MEM에서 24시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다. 처리된 세포는 10 mM 다이클로로 아세테이트(DCA)를 함유하는 배지를 수용하였고, 대조군 세포는 어세이 배지를 수용하였다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, DCA-처리된 세포와 대조군 세포를 함유하는 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 0.75 μM FCCP와 1.0 μM 올리고마이신(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 동시에 처리하고, OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과를 도 3에 제시한다. 데이터는 치료군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다. 이러한 데이터는 처리된 세포의 호기성 대사 포텐셜이 대조군 세포에 비해 약간 증가하고, 해당성 포텐셜이 감소함을 나타낸다.
실시예 4. C2C12 근아세포 세포에 대한 UK5099 처리의 효과
C2C12 근아세포 세포를 1.2 x 104 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다. 세포를 25 mM 글루코스, 4 mM 글루타민, 1 mM 피루베이트 및 10% FBS가 보충된 DMEM에서 24시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다. 처리된 세포는 2 μM UK5099(미토콘드리아 피루베이트 담체의 강력한 억제제)를 함유하는 배지를 수용하였고, 대조군 세포는 어세이 배지를 수용하였다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, UK5099-처리된 세포 및 대조군 세포를 함유한 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 0.5 μM FCCP와 1.0 μM의 올리고마이신(200 μL의 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 동시에 처리하고, OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과를 도 4에 제시한다. 데이터는 처리군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다. 이러한 데이터는 UK5099로 처리된 세포의 호기성 및 해당성 대사 포텐셜이 대조군 세포에 비해 감소함을 나타낸다.
실시예 5
실시예 5A. A549 세포의 대사 포텐셜
A549 세포를 1.0 x 104 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다. 세포를 11 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 10% FBS가 보충된 RPMI 1640 배지에서 24시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, 세포를 함유하는 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM 올리고마이신(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 처리하였다. 올리고마이신 처리 후, 중간 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 20분 후, 처리 웰 및 대조군 웰을 0.5 μM FCCP(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)로 처리하고, 최종 OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과를 도 5에 제시한다. 데이터는 처리군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 5B. 대사 포텐셜 래트 성상세포
단리 후 14일의 래트 성상세포를 2.0 x 104 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다. 세포를 5.5 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 10% FBS가 보충된 DMEM에서 48시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, 세포를 함유하는 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM 올리고마이신(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 처리하였다. 올리고마이신 처리 후, 중간 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 20분 후, 처리 웰 및 대조군 웰을 2.0 μM FCCP(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)로 처리하고, 최종 OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과를 도 5에 제시한다. 데이터는 처리군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 5C. 1차 마우스 골수-유래 대식세포의 대사 포텐셜
일차 마우스 골수-유래 대식세포를, GM-CSF를 사용하여 분화시키고, 7일 동안 배양하였다. 세포를 8.0 x 104 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다.
세포를 10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민, 1 mM 피루베이트 및 10% FBS가 보충된 DMEM에서 24시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, 세포를 함유하는 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM 올리고마이신(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 처리하였다. 올리고마이신 처리 후, 중간 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 20분 후, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM FCCP(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)로 처리하고, 최종 OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과를 도 5에 제시한다. 데이터는 처리군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 5D. BT474 세포의 대사 포텐셜
BT474 세포를 2.0 x 104 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다. 세포를 10% FBS가 첨가된 ATCC 하이브리케어(Hybricare) 배지에서 24시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, 세포를 함유하는 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM 올리고마이신(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 처리하였다. 올리고마이신 처리 후, 중간 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 20분 후, 처리 웰 및 대조군 웰을 0.5 μM FCCP(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)로 처리하고, 최종 OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과를 도 5에 제시한다. 데이터는 처리군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 5E. HCT116 세포의 대사 포텐셜
HCT116 세포를 1.2 x 104 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다. 세포를 11 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 10% FBS가 보충된 RPMI 1640 배지에서 24시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, 세포를 함유하는 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM 올리고마이신(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 처리하였다. 올리고마이신 처리 후, 중간 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 20분 후, 처리 웰 및 대조군 웰을 0.25 μM FCCP(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)로 처리하고, 최종 OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과를 도 5에 제시한다. 데이터는 처리군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 5F. HepG2 세포의 대사 포텐셜
HepG2 세포를 2.0 x 104 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다. 세포를 11 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 10% FBS가 보충된 RPMI 1640 배지에서 24시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, 세포를 함유하는 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM 올리고마이신(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 처리하였다. 올리고마이신 처리 후, 중간 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 20분 후, 처리 웰 및 대조군 웰을 0.5 μM FCCP(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)로 처리하고, 최종 OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과를 도 5에 제시한다. 데이터는 처리군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 6
실시예 6A. 인간 제대 정맥 내피 세포의 대사 포텐셜
인간 제대 정맥 내피 세포를 1.2 x 104 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다. 세포를 EGM-2 불릿키트(Bulletkit) 배지(론자(Lonza))에서 24시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, 세포를 함유하는 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM 올리고마이신(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 처리하였다. 올리고마이신 처리 후, 중간 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 20분 후, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM FCCP(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)로 처리하고, 최종 OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과를 도 6에 제시한다. 데이터는 처리군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 6B. MDA-MB-231 세포의 대사 포텐셜
MDA-MB-231 세포를 2.0 x 104 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다. 세포를 11 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 10% FBS가 보충된 RPMI 1640 배지에서 24시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, 세포를 함유하는 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM 올리고마이신(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 처리하였다. 올리고마이신 처리 후, 중간 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 20분 후, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM FCCP(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)로 처리하고, 최종 OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과를 도 6에 제시한다. 데이터는 처리군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 6C. MCF-7 세포의 대사 포텐셜
MCF-7 세포를 2.0 x 104 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다. 세포를 11 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 10% FBS가 보충된 RPMI 1640 배지에서 24시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, 세포를 함유하는 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM 올리고마이신(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 처리하였다. 올리고마이신 처리 후, 중간 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 20분 후, 처리 웰 및 대조군 웰을 0.25 μM FCCP(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)로 처리하고, 최종 OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과를 도 6에 제시한다. 데이터는 처리군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 6D. 신생아 래트의 심실 근세포의 대사 포텐셜
신생아 래트 심실 근세포를 5.0 x 104 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다. 세포를 5.5 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 DMEM에서 48시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, 세포를 함유하는 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM 올리고마이신(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 처리하였다. 올리고마이신 처리 후, 중간 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 20분 후, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM FCCP(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)로 처리하고, 최종 OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과를 도 6에 제시한다. 데이터는 처리군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 6E. PC12 세포의 대사 포텐셜
PC12 세포를 8.0 x 104 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다. 세포를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 염기성 배지로서 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)에서 배양하였다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, 세포를 함유하는 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM 올리고마이신(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 처리하였다. 올리고마이신 처리 후, 중간 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 20분 후, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM FCCP(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)로 처리하고, 최종 OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과를 도 6에 제시한다. 데이터는 처리군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 6F. SKBR-3 세포의 대사 포텐셜
SKBR-3 세포를 2.0 x 104 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다. 세포를 11 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 10% FBS가 보충된 RPMI 1640 배지에서 24시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, 세포를 함유하는 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM 올리고마이신(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 처리하였다. 올리고마이신 처리 후, 중간 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 20분 후, 처리 웰 및 대조군 웰을 1.0 μM FCCP(200 μL 어세이 배지에서의 최종 농도)로 처리하고, 최종 OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과를 도 6에 제시한다. 데이터는 처리군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 7. C2C12 근관세포의 대사 포텐셜에 대한 에토목시르의 효과
C2C12 근아세포 세포를 1.2 x 104 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다. 세포를 25 mM 글루코스, 4 mM 글루타민, 1 mM 피루베이트 및 10% FBS가 보충된 DMEM에서 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 이러한 배지를 제거하고, 25 mM 글루코스, 4 mM 글루타민, 1 mM 피루베이트 및 2% 말 혈청이 보충된 DMEM으로 구성된 분화 배지로 대체하고, 4일 동안 근관세포로 분화되도록 하였다. 분화하는 동안, 배지는 2일에 1회 새로운 분화 배지로 대체되었다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다. 처리된 근관세포는 40 μM 에토목시르(지방산 산화에 관여하는 카르니틴-팔미토일 트랜스퍼라제-1의 억제제)를 함유하는 배지를 수용하였고, 대조군 근관세포는 어세이 배지를 수용하였다. 근관세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, 에토목시르-처리된 근관세포 및 대조군 근관세포을 함유하는 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 측정하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 0.5 μM FCCP와 1.0 μM의 올리고마이신(200 μL의 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 동시에 처리하고, OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과를 도 7에 제시한다. 데이터는 처리군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다. 이러한 데이터는, 대조군 근관에 비해, 에토목시르로 처리된 근관에서 호기성 대사 포텐셜이 증가하고 해당성 대사 포텐셜이 약간 감소함을 나타낸다.
실시예 8. 주르카트 세포의 대사 포텐셜에 대한 라파마이신 치료의 효과
주르카트 세포를 1.0 x 105 세포/웰의 밀도로 XFp 마이크로플레이트에 시딩하였다. 주르카트 세포는 반-부착성이므로, 세포를 각 웰에 첨가하고, 이어서 마이크로플레이트를 300 x g에서 2분간 원심분리하여 웰 바닥에 세포를 침전시켰다. 제네티신(Geneticin), 11 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 10% FBS가 보충된 RPMI 1640에서 24시간 동안 세포를 배양하였다. 처리군 내의 세포를 10 nM 라파마이신(mTORCl의 억제제)을 함유하는 배지에서 24시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 어세이 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루베이트가 보충된 XF 베이스 배지로서, 시호스 바이오사이언스에서 시판 중인, 나트륨 바이카보네이트를 생략한 개질된 DMEM)로 대체하였다. 세포를 어세이 전에 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다.
대사 포텐셜은 XFp 세포외 플럭스 분석기(시호스 바이오사이언스) 및 XFp 어세이 카트리지(시호스 바이오사이언스)를 사용하여 측정되었다. 간략하게, DCA-처리된 세포와 대조군 세포를 함유하는 마이크로플레이트를 XFp 세포외 플럭스 분석기에 위치시키고, 초기 OCR 및 ECAR 측정을 수행하였다. 이어서, 처리 웰 및 대조군 웰을 0.5 μM FCCP와 1.0 μM의 올리고마이신(200 μL의 어세이 배지에서의 최종 농도)으로 동시에 처리하고, OCR 및 ECAR 측정을 후속적으로 수행하였다.
실험 결과를 도 8에 제시한다. 데이터는 치료군 당 3회 반복검증의 평균 ± 표준 편차이다. 이러한 데이터는 라파마이신 치료가 대조군에 비해 주르카트 세포의 베이스 및 스트레스 OCR 및 ECAR 수준을 감소시키고 호기성 대사 포텐셜을 감소시키지만 해당성 포텐셜은 약간 증가시킴을 나타낸다.
본 발명의 여러 양상이 본원에 기술되고 도시되었지만, 동일한 목적을 달성하기 위해 당업자에 의해 대안적인 양상이 수행될 수 있다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상 및 범주에 속하는 그러한 모든 대안적인 양상을 포함하는 것으로 의도된다.
Claims (20)
- 세포 샘플의 초기 산소 소비 속도 및 초기 세포외 산성화 속도를 측정하는 단계;
이어서, 미토콘드리아 탈공역제(uncoupling agent) 및 ATP 신타제 억제제를 세포 샘플에 동시에 투여하는 단계;
이어서, 세포 샘플의 후속 산소 소비 속도 및 후속 세포외 산성화 속도를 동시에 측정하는 단계; 및
세포 샘플의 대사 포텐셜(metabolic potential)을 측정하는 단계
를 포함하는, 세포 샘플의 대사 포텐셜을 측정하는 방법. - 제1항에 있어서,
미토콘드리아 탈공역제 중 1종 이상이 카보닐 시아나이드 p-트라이플루오로메톡시페닐하이드라존("FCCP"), 카보닐 시아나이드 m-클로로페닐하이드라존("CCCP") 또는 2,4-다이니트로페놀("DNP") 또는 BAM15를 포함하고, ATP 신타제 억제제가 올리고마이신 또는 7-클로로-5-(4-하이드록시페닐)-1-메틸-3-(나프탈렌-2-일메틸)-4,5-다이하이드로-1H-벤조[b][1,4]다이아제핀-2(3H)-온(Bz-423)을 포함하는, 방법. - 제2항에 있어서,
미토콘드리아 탈공역제가 카보닐 시아나이드 p-트라이플루오로메톡시페닐하이드라존("FCCP")을 포함하고, ATP 신타제 억제제가 올리고마이신을 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
세포 샘플이 배지에 배치된 복수의 세포를 포함하는, 방법. - 제4항에 있어서,
초기 산소 소비 속도를 측정하는 단계가 배지에 배치된 세포 구성물(cell constituent)을 감지하는 단계를 포함하는, 방법. - 제4항에 있어서,
세포 샘플의 초기 세포외 산성화 속도를 측정하는 단계가 배지에 배치된 세포 구성물을 감지하는 단계를 포함하는, 방법. - 제4항에 있어서,
배지에서 투여된 미토콘드리아 탈공역제의 농도가 약 0.1 내지 약 2.0 μM인, 방법. - 제7항에 있어서,
배지에서 투여된 미토콘드리아 탈공역제의 농도가 약 0.5 μM인, 방법. - 제4항에 있어서,
배지에서 투여된 ATP 신타제 억제제의 농도가 약 0.1 내지 약 2 μM인, 방법. - 제9항에 있어서,
배지에서 투여된 ATP 신타제 억제제의 농도가 약 1.0 μM인, 방법. - 제1항에 있어서,
세포 샘플에 투여하기 전에 미토콘드리아 탈공역제 및 ATP 신타제 억제제를 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제1항에 있어서,
세포 샘플의 초기 산소 소비 속도 및 초기 세포외 산성화 속도를 동시에 측정하기 전에 세포 샘플을 멀티-웰(multi-well) 플레이트의 웰에 배치하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제12항에 있어서,
미토콘드리아 탈공역제 및 ATP 신타제 억제제를 투여하는 단계가 상기 미토콘드리아 탈공역제 및 ATP 신타제 억제제를 하나 이상의 포트로부터 웰 내로 동시에 도입하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
세포 샘플의 대사 포텐셜을 측정하는 단계가 (i) 초기 산소 소비 속도, 초기 세포외 산성화 속도, 후속 산소 소비 속도 및 후속 세포외 산성화 속도를 소프트웨어 프로그램에 제공하는 단계; 및 (ii) 상기 소프트웨어 프로그램을 사용하여 대사 포텐셜을 계산하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
세포 샘플의 초기 산소 소비 속도 및 초기 세포외 산성화 속도가 동시에 측정되는, 방법. - (i) 멀티-웰 플레이트를 지지하도록 구성된 스테이지;
(ii) 상기 멀티-웰 플레이트의 웰에서 세포 샘플과 회합(association)된 세포 구성물을 감지하도록 구성된 센서; 및
(iii) 유체를 웰 내로 도입하도록 구성된 분배 시스템
을 포함하는, 멀티-웰 플레이트의 웰에서 세포 샘플의 대사 포텐셜을 측정하기 위한 장치로서,
상기 스테이지, 센서 및 분배 시스템이 함께 작동하여, 상기 센서를 사용하여 세포 샘플의 초기 산소 소비 속도 및 초기 세포외 산성화 속도를 동시에 측정하고; 이어서, 상기 분배 시스템을 사용하여 미토콘드리아 탈공역제 및 ATP 신타제 억제제를 세포 샘플에 동시에 투여하고; 이어서, 상기 센서를 사용하여 세포 샘플의 후속 산소 소비 속도 및 후속 세포외 산성화 속도를 동시에 측정하고; 세포 샘플의 대사 포텐셜을 측정하는, 장치. - 제16항에 있어서,
분배 시스템이 웰 위에 배치된 하나 이상의 포트를 포함하는, 장치. - 제16항에 있어서,
센서가 광학 센서를 포함하는, 장치. - 제18항에 있어서,
센서가 형광단(fluorophore)을 감지하도록 구성된, 장치. - 제16항에 있어서,
센서에 의해 컴퓨터 모듈에 전달되는 정보에 기초하여 대사 포텐셜을 계산하도록 구성된 컴퓨터 모듈 및 소프트웨어를 추가로 포함하는 장치.
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