CN101405393A - 蛋白s融合用于蛋白增溶的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了含有多克隆位点的载体，所述多克隆位点包含来自黄色粘球菌的PrS标记或PrS2标记。提供了使用蛋白S标记的靶融合蛋白来提高靶蛋白的溶解度的方法。

Description

蛋白S融合用于蛋白增溶的用途
与相关申请的交叉引用
本申请要求Inouye等人在2006年3月20日提交的题为“The Useof Protein S Fusion for Protein Solubilization”的美国临时申请No.60/783,998的优先权。在本文通过引用将该申请的全部内容并入本文。
发明领域
本发明涉及用于增加蛋白的产生和溶解度的系统。
依据C.F.R.1.821(f)的声明
根据§1.821(f)，所附纸件拷贝和所附的分别根据37C.F.R.§1.821(c)和(e)提交的序列表的计算机可读拷贝″18622-12umdnj.st25.txt″的内容是一致的。
发明背景
蛋白表达是医学和生物技术中的主要挑战，因为大量蛋白当在多种不同的常规表达系统中表达时会变得不溶。已经为从生物样品的其它组分分离和纯化蛋白、尤其是重组蛋白开发了许多方案。这些纯化方法包括，尤其是，离子交换色谱，凝胶过滤，和亲和色谱。因为靶蛋白或靶蛋白的标记对其所结合的纯化试剂(例如抗体或配体)的特异性，亲和色谱比其它方法更有效。
多年来，为其亲和纯化而标记蛋白已经成为蛋白纯化的选择方法，目前用于酵母的蛋白组学研究，在更低的范围用于高等真核生物。可得到从短至6个氨基酸残基的小肽(His标记)至大至40kDa的大蛋白(MBP)的大量独特标记(参见综述：Stevens，R.C，2000.StructureFold Des 8：R177-85)。在使用的标记中，His-标记得到最广泛且成功的应用，因为His-标记的蛋白可以特异性地捕获在Ni-NTA(镍-次氮基三乙酸)树脂上，其可以用EDTA或咪唑洗脱。其它蛋白标记例如麦芽糖-结合蛋白(MBP)、葡萄球菌蛋白A、钙调蛋白-结合肽(CBP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)也已经用于原核生物和真核生物蛋白。但是，许多这样的亲和技术的特异性不足以在一个步骤中纯化标记的蛋白，因为非特异性蛋白也经常被使用的树脂捕获。为了克服该问题，已经开发了使用2种不同标记的亲和纯化系统，所述标记串联地融合至蛋白的N-末端(Rigaut，G.，等人1999.Nat Biotechnol 17：1030-2)。已经显示该TAP标记(串联亲和纯化)技术可以非常有效地鉴别与目标蛋白形成复合物的蛋白因子。
现有的融合标记系统的缺点包括，标记的融合蛋白的低溶解度和在许多蛋白纯化方案中常见的条件下不能纯化标记的蛋白。此外，现有的融合标记难以用于蛋白结构的分析研究。例如，His标记不能用于为NMR结构研究设计的实验，因为Ni-NTA树脂不能用于NMR波谱分析，这是因为Ni++离子的顺磁效应导致峰的增宽，并干扰数据收集。
因而，需要改良的标记系统，其允许标记的融合蛋白保持可溶和稳定而用于蛋白的纯化和研究，包括分析技术，例如蛋白纯化，NMR和x-射线晶体分析，和鉴定与特定蛋白相互作用的蛋白因子。本文证实本发明的蛋白S标记技术是用于改善不稳定蛋白的表达的优异融合标记。
蛋白S是黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)的芽胞外被蛋白，所述黄色粘球菌是一种进化的革兰氏阴性细菌，其在营养耗尽后形成多细胞的子实体(综述参见(Dworkin，M.等人1985.Science230：18-24，Shimkets，L.J.等人1990.Microbiol Rev 54：473-501))。在子实体中，细胞被转化成直径为1μm的均匀的球形孢子(粘孢子)，它们非常抗干燥和热。已经证实，粘孢子具有称作蛋白S的主要外被蛋白，所述蛋白S以Ca++依赖性的方式聚集在粘孢子表面上(Inouye，M等人，1979.Proc Natl Acad Sci USA 76：209-13)。
来自黄色粘球菌的蛋白S的独特之处是，当它与蛋白的N-末端融合时，会显著增强该蛋白的产生和溶解度。重要的是，与本发明有关的实验的结果表明，蛋白S与OmpR(一种转录因子)的融合不会影响OmpR的性质(Harlockcr，S.L.等人1995.J Biol Chem 270：26849-56)，表明蛋白S结构域独立地折叠且不会与目标靶蛋白相互作用。我们现在已经发现，蛋白S标记的蛋白可以被特异性地捕获在粘孢子上，后者可以容易地从黄色粘球菌的子实体纯化。
蛋白S具有几个独特的特征。在有EDTA存在下或在高盐浓度下，蛋白S可以容易地释放。此外，在加入Ca++后，纯化的蛋白S可以容易地重新集合在粘孢子表面上(Inouye，M.等人，1979.Proc NatlAcad Sci USA 76：209-13)。单个粘孢子可以在其表面结合最高达3.3x106个蛋白S分子(Inouye，M.等人，1979，Proc Natl Acad SciUSA 76：209-13)。已经测定了其NMR溶液结构(图1A；(Bagby，S.等人1994.Structure 2：107-22)，它由173个氨基酸残基组成，且具有2个串联的Ca++-结合域。2个Ca++-结合域可重叠，由7个β-链和1个α螺旋组成(图1A)。已经显示，蛋白S晶体高度抗X-射线辐射(Inouye，S.，1980.J Biol Chem 255：3713-4)。蛋白S的这些优点可用于多种应用，如本发明所示。
发明概述
本发明提供了含有多克隆位点的载体，所述多克隆位点包含来自黄色粘球菌的Pr S标记或PrS2标记。
本发明也提供了提高靶蛋白的溶解度的方法，其包括：使编码来自黄色粘球菌的蛋白S的至少一个N-末端结构域(PrS标记)的核酸序列与编码靶蛋白的核酸序列融合，以建立编码PrS标记的靶蛋白的核酸序列；将步骤(a)的蛋白S标记的靶蛋白置于载体中；用该载体转化宿主细胞；和在适合基因表达的条件下培养宿主细胞，由此表达的PrS标记的靶蛋白比未标记的靶蛋白更易溶。在一个实施方案中，使用串联重复的PrS的N-末端结构域，称作PrS2标记。
本发明另外提供了与一个或多个黄色粘球菌粘孢子结合的PrS-标记的蛋白分子。
也提供了纯化PrS-标记的蛋白的方法，其包括：使PrS-标记的蛋白接触包含黄色粘球菌粘孢子的亲和树脂，从而将蛋白S标记的蛋白固定化在亲和树脂上。
也提供了制备用于分析研究的靶蛋白的方法，其包括：制备PrS-标记的靶蛋白，和进行分析研究。
本发明另外提供了表征靶蛋白的方法，其包括：使至少一个PrS标记或PrS2标记与靶蛋白融合，进行核磁共振波谱分析，和分析来自核磁共振波谱分析的数据。
附图简述
图1.蛋白S的NMR结构和PrS2标记的蛋白的图示。A.结合有Ca++离子的黄色粘球菌蛋白S的NMR结构(Bagby，S.等人1994，Structure 2：107-22)。B.显示了用于PrS2标记的蛋白S的N-末端结构域(1-92)。蛋白S(1-92)的2个串联重复(PrS2)(椭圆形)融合在目标蛋白(白色框)的N-末端。
图2.野生型OmpR和PrS2-OmpR的对比。A.EnvZc和PrS2-OmpR之间的复合物形成。混合EnvZc(4μM)和PrS2-OmpR(4μM)(泳道4)或OmpR(4μM)(泳道2)，并在室温在反应缓冲液中温育5min。对样品进行10％非变性PAGE。B.从磷酸化的EnvZc(EnvZc-P)向PrS2-OmpR的磷酸转移。在反应缓冲液[50mM Tris-HCl(pH 8.0)，50mM KCl，5mM CaCl2，5％甘油]中，将纯化的32P-标记的EnvZc-P(2μM)与OmpR(4μM)、PrS2-OmpR(4μM)或OmpR(2μM)和PrS2-OmpR(2μM)的混合物混合。在室温温育最终的反应混合物。在20，40，60，和120秒取出等分试样，用5xSDS上样缓冲液停止反应。对样品进行17.5％SDS-PAGE。C.EnvZc对磷酸化的PrS2-OmpR(PrS2-OmpR-P)的去磷酸化。首先将纯化的32P-标记的EnvZc-P(2μM)与OmpR(4μM)、PrS2-OmpR(4μM)或OmpR(2μM)和PrS2-OmpR(2μM)的混合物混合，并在室温在反应缓冲液[50mM Tri-HCl(pH 8.0)，50mM KCl，5mM CaCl2，5％甘油]中温育2min，以产生OmpR-P或PrS2-OmpR-P。以终浓度1mM加入ADP后，在20，40，60，和120秒取出等分试样，用5xSDS上样缓冲液停止反应。对样品进行17.5％SDS-PAGE。D.PrS2-OmpR-P的DNA结合。在DNA结合缓冲液中，将凝胶顶部指示的OmpR-P和PrS2-OmpR-P的不同混合物与30-bp F1F2a DNA片段相混合。用5′-末端标记的DNA片段进行DNA凝胶迁移率变动分析，a；2个OmpR-P分子/F1F2a复合物，b；1个OmpR-P分子和1个PrS2-OmpR-P分子/F1F2a复合物，和c；2个PrS2-OmpR-P分子/F1F2a复合物。干燥来自B、C和D的凝胶，并曝光进行放射自显影。
图3.PrS2-OmpR与粘孢子的结合的表征。A.粘孢子的相差光学显微镜照片(100x放大率)。B.PrS2-OmpR以Ca++依赖性的方式结合粘孢子。将纯化的PrS2-OmpR(3μg)与粘孢子混合，在4℃，在有20mM EDTA、10mM MgCl2或10mM CaCl2存在下，在含有50mM KCl的50mM Tris-HCl缓冲液中温育1小时。洗涤后，离心收集粘孢子，并悬浮于SDS上样缓冲液中。在沸水浴中温育样品5min，对它们的上清液进行17.5％SDS-PAGE。泳道1，使用的纯化的PrS2-OmpR的总量。C.EDTA可以释放结合到粘孢子上的PrS2-OmpR。首先，在有CaCl2存在下，进行PrS2-OmpR向粘孢子的结合。离心收集粘孢子，使用与结合所用相同的缓冲液洗涤。在有20mM EDTA或10mM CaCl2存在下，在含有50mM KCl的50mM Tris-HCl缓冲液中温育所收集的粘孢子15min。泳道1，使用的PrS2-OmpR的总量，和泳道6，结合到粘孢子上的总PrS2-OmpR。D.加入大肠杆菌溶胞产物中的纯化的PrS2-OmpR被粘孢子特异性捕获。将纯化的PrS2-OmpR(3μg)与大肠杆菌BL21(DE3)溶胞产物相混合，检查PrS2-OmpR与粘孢子的特异性结合(泳道5)。泳道1，使用的PrS2-OmpR的总量；泳道2，加入纯化的PrS2-OmpR，没有溶胞产物；泳道3，使用单独的溶胞产物；泳道4，加入溶胞产物，没有PrS2-OmpR。E.甚至在有4M尿素存在下，PrS2-OmpR仍可以结合粘孢子。在有尿素(2，3，和4M)存在下，检查PrS2-OmpR结合。泳道3-5，没有溶胞产物；泳道7-9，有溶胞产物；泳道6，使用PrS2-OmpR和大肠杆菌BL21(DE3)溶胞产物的混合物。
图4.DNA pull-down实验。A.混合纯化的EnvZcl1(用于磷酸化OmpR)和ompF启动子(ompFp)的上游区域的DNA片段，在室温，在没有(泳道3)或有PrS2-OmpR(泳道4)存在下，在含有50mM KCl、10mM CaCl2和1mM ATP的50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中温育混合物30min。将粘孢子加入混合物，在4℃另外温育1小时。离心收集粘孢子，对样品的上清液进行1.7％琼脂糖凝胶电泳。泳道1，100-bp标志(Bio-Rad)；泳道2，ompFp DNA片段。B.使用2种不同的线性化的质粒(用BamH I消化的pCR-ompFp和用EcoR I消化的pET-EnvZc)的混合物，进行与上述相同的实验。前一种质粒含有在上面A中使用的ompFp DNA片段，而后一种质粒不含有OmpR结合位点。对样品进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。泳道1，pCR-ompFp DNA片段和pET-EnvZc DNA片段；泳道4，λ/Hind III标志。
图5.源自pCold(PST)III的pCold(PST)载体的质粒图谱。A.pCold(PST)源自pCold III载体(Qing，G.等人2004.NatBiotechnol 22：877-82)。TEE：翻译增强元件。B.TEV切割位点、多克隆位点、凝血酶切割位点和为pCold(PST)载体设计的His6标记的DNA序列。
图6.TEV切割位点、为T-REx(PST)设计的多克隆位点的DNA序列。c-myc表位：[Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu]
图7.源自pCold(PST)IV的pCold(PST)载体的质粒图谱。(a)表达载体pCold(PST)的图解。使用pCold IV构建pCold(PST)，所述pCold IV是冷激载体之一，可从Takara Bio Inc.，Shiga，Japan得到。PrS标记显示了插入PrS标记或PrS2标记的DNA片段的位置。PrS标记由蛋白S的N-末端结构域Met1-Arg82加上Tyr93组成，而PrS2标记由2个串联重复的PrS标记(Met1-Arg82)的序列加上Tyr185组成。(b)多克隆位点和凝血酶切割位点的序列。凝血酶切割位点，LVPRGS；CTG GTG CCA CGC GGT AGT，导入PrS标记的Tyr83或PrS2标记的Tyr185和含有NdeI、SalI、XhoI、BamHI和XbaI位点的多克隆位点之间。cspA 3′-UTR，翻译增强元件，cspA 5′-UTR，lac操纵基因，和cspA启动子来自原始pCold IV载体。
发明详述
本发明提供了一种新颖的蛋白技术，称作蛋白S标记(PST)。也提供了对不能通过常规方法测定其结构的蛋白的结构研究的新颖方案。
我们可以应用本发明的技术来表征蛋白，无论来自原核生物还是来自真核生物，包括人蛋白。因为表达系统被设计为PrS或PrS2标记可以被特定蛋白酶(例如TEV蛋白酶或凝血酶)切割掉，可以得到与它们的天然形式相同的可溶蛋白。重要的是，我们证实了PrS和PrS2标记对靶蛋白的功能几乎没有影响(Harlocker SL等人J Biol Chem.1995)。如果靶蛋白在切割PrS或PrS2标记后变得不溶，仍然可以表征靶蛋白(作为与PrS或PrS2标记的融合蛋白)的功能。
当将蛋白表达为与黄色粘球菌的蛋白S的N-末端结构域的融合蛋白时，它们变成表达为可溶蛋白。我们研究的结果表明，当表达为与蛋白S的融合蛋白时，可以显著提高来自人、果蝇(Drosophila)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的多种不溶或差表达的真核生物蛋白以及来自大肠杆菌(Escherichia coli)的蛋白的溶解度和表达水平。否则，蛋白以不溶形式表达。对于这些以及其它的应用，称作″PrS标记″的单一一个蛋白S的N-末端结构域和称作″PrS2标记″的2个串联重复的来自黄色粘球菌的蛋白S的N-末端结构域会不同地影响靶蛋白。因此，本文提供了用于表达含有PrS标记或PrS2标记的靶蛋白的表达系统。本发明也提供了具有超过2个来自黄色粘球菌的蛋白S的N-末端结构域的表达系统。
在″嵌合分子″中，将2个或多个能单独存在的分子连接到一起，形成具有其所有组成分子的希望的功能的单个分子。嵌合分子的组成分子可以通过化学缀合以合成方式连接，或者当组成分子都是多肽时，可以重组地将编码多肽的多核苷酸融合到一起，从而表达单个连续的多肽。这样的嵌合多肽称作″融合蛋白″。″融合蛋白″是一种嵌合分子，其中组成分子都是多肽且彼此结合(融合)，使得嵌合分子形成连续的单链。不同的组分可以直接彼此结合，或可以通过一个或多个肽连接物偶联。
提及嵌合分子(例如本发明的融合蛋白)时使用的″连接物″是指连接或结合嵌合分子的组成分子的任意分子。当嵌合分子是融合蛋白时，连接物可以是连接构成融合蛋白的蛋白的肽。尽管除了结合蛋白或在它们之间保持一定最小距离或其它空间关系以外，连接物通常不具有特定的生物活性，但可以选择肽间隔物的组成氨基酸，以影响分子的有些性质，例如折叠、静电荷或疏水性。肽连接物可以任选地包括蛋白酶消化位点，用于分离融合的组成多肽。为了制备下面讨论的用于核磁共振研究的蛋白，优选的连接物包含约1至约20个氨基酸残基。特别优选的连接物包含约3至约10个氨基酸残基。
构建大肠杆菌和哺乳动物细胞中的蛋白S标记(PST)表达系统
本文使用的术语″载体″和″表达载体″表示复制子，即作用为另一种遗传序列或元件(DNA或RNA)可以与之相连接以造成所连序列或元件的复制并因此可将该序列或元件运送到宿主细胞中的载体或转运物的任何物质，如噬菌体、质粒、噬菌粒、粘粒、杆粒或病毒。本文所述的大肠杆菌载体系统利用了pCold载体(可从Takara Bio Inc.，Shiga，Japan得到)，其在低温下诱导蛋白生成。
本发明提供了一种大肠杆菌表达系统，其使用pCold冷激载体来进行蛋白纯化和NMR结构研究。哺乳动物四环素诱导型系统可以用于鉴别会与活细胞中的目标蛋白形成复合物的蛋白因子。该目标蛋白在本文中称作″靶蛋白″，它是指PrS或PrS2标记与之结合的蛋白、多肽或其片段。在优选的实施方案中，靶分子是蛋白。
本发明提供了含有多克隆位点的载体，所述多克隆位点包含编码来自黄色粘球菌的PrS标记(SEQ ID NO：1)或PrS2标记(SEQ ID NO：2)的核酸序列。在其它实施方案中，本发明使用从来自黄色粘球菌的蛋白S的N-末端结构域得到的一种或多种标记。PrS和PrS2标记优选地是蛋白S的氨基酸残基1-93(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)，但是也可以是1-92残基或1-94残基，或可以是蛋白S的1-173之间的任意氨基酸残基。
在优选的实施方案中，本发明的载体的多克隆位点包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。该载体可以是高表达冷激载体，例如pColdIII或pColdIV载体。pColdIII载体对于在大肠杆菌中的表达是优选的，因为该载体的翻译增强元件(TEE)(参见图5)会提供更好的表达。在TEE对翻译具有负作用的情况下，没有TEE的pColdIV表达(图7)是有用的。
在哺乳动物系统中，优选的载体是携带PrS2-标记的蛋白的来自人胚肾293细胞系的四环素诱导型PST表达系统(TREx-PST)。因而，本发明提供了在哺乳动物宿主细胞、包括人细胞中表达的载体。
对于指定的核酸，本文使用的术语“编码”表示储存于核酸内的信息，用于翻译成指定的蛋白。编码蛋白的核酸可以在核酸的翻译区内包括有非翻译序列(例如内含子)，或者可以缺乏这些间插的非翻译序列(例如在cDNA中)。通过使用密码子指定编码蛋白的信息。通常核酸利用“通用的”遗传密码编码氨基酸序列。
本文使用的术语“密码子”表示核苷酸三联体，它们一起规定了多肽链中的氨基酸残基。大多数有机体都使用20或21个氨基酸来制备它们的多肽，所述多肽是蛋白或蛋白前体。因为DNA中有着四种可能的核苷酸，即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、和胸腺嘧啶(T)，所以存在64种可能的三联体来识别仅20种氨基酸加上终止信号。因为这种冗余性，大多数氨基酸由超过一种的三联体编码。规定单个氨基酸的密码子并不都是以均等频率使用的。不同的有机体常常表现出对编码相同的给定氨基酸的若干密码子中的一种的特别“偏爱”。如果编码区含有高水平的罕见密码子或罕见密码子簇，通过重新合成基因或者通过诱变去除罕见密码子可以增加表达。见J.Sambrook和D.W.Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)，15.12；通过引用将其并入本申请。因此可以进行“密码子选择”以优化在选定宿主中的表达。最优选的密码子是那些在高表达基因中经常能找到的密码子。对于大肠杆菌中的“密码子偏爱”，见Konigsberg，等人，Proc.Nat′1.Acad.Sci.U.S.A.80：687-91(1983)，在本文通过引用并入本申请。
技术人员将认识到，改变、添加或删除编码序列内的单个氨基酸或一小部分氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白序列的个别替换、删除或添加是“保守修饰变体”，其中改变造成了氨基酸被化学相似氨基酸替换。术语“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰变体表示那些编码相同的氨基酸序列或氨基酸序列的保守修饰变体的核酸。因为遗传密码的简并性，大量的功能相同的核酸编码任何给定的蛋白。例如，密码子UUA、UUG、CUU、CUC、CUA、和CUG都编码氨基酸亮氨酸。因此，在密码子规定为亮氨酸的每一个位置，密码子可以被改变成任何所述的相应的密码子，而不改变所编码的多肽。这些核酸变异是“沉默变异”，它们代表一类保守修饰变异。根据遗传密码，在本文编码多肽的每一种核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。本领域的普通技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子；和UGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)都可以被修饰而产生功能相同的分子。因此，编码本发明的多肽的核酸的每种沉默变异都是在本发明的范围之内。
本发明包括蛋白S的活性部分、片段、衍生物、突变体、和功能变体，它们保留蛋白S的任何生物学性质。
结合对的一个成员可以用于″标记″目标蛋白，另一个成员用作亲和配体或″亲和树脂″。这样的蛋白″标记″可以重组地″融合″和表达，以生成连有标记的融合蛋白。然后通过与标记的结合伴侣的相互作用，亲和纯化″标记的″融合蛋白，然后任选地切割标记，以释放纯蛋白。
术语“基因”表示位于编码特定功能产物(即蛋白或RNA分子)的DNA区段的特定位置上的有序的核苷酸序列。它可以包括在编码DNA之前和之后的区域以及在外显子之间的内含子。
术语“诱导”或“可诱导的/诱导型”表示通过将细胞暴露于诱导物或条件(例如热)增加其转录或合成的基因或基因产物。
术语“诱导物”或“诱导剂”表示低分子量的化合物或物理因子，其与阻遏蛋白相结合生成不再能与操纵基因相结合的复合物。
术语“诱导”表示引起一些特殊效应的行为或方法，例如特定基因或操纵子的转录、或在有机体暴露于特殊刺激之后的蛋白生成。
在向细胞内插入核酸的上下文中的术语“导入”、“转染”、“转化”和“转导”包括表示将核酸掺入到原核细胞或真核细胞内，其中核酸可以被整合到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，被转化成自主复制子，或者被短暂表达(例如转染的mRNA)。
术语“分离的”表示物质例如核酸或蛋白，其实质上从其天然存在的环境中所能发现的通常伴随于它的或与它相互作用的组分中游离。分离的物质任选地包括在物质的天然环境中未发现伴随其的物质，或者如果物质是处于其天然的环境中，那么该物质已经被有意的人为干涉所合成地(非天然地)改变。例如“分离的核酸”可以包括被插入到载体(例如质粒或病毒载体)内的DNA分子，或者被整合到原核或真核细胞或宿主有机体的基因组DNA内的DNA分子。当应用于RNA时，术语“分离的核酸”主要表示如上定义的分离的DNA分子所编码的RNA分子。或者，该术语可以表示已经被充分地与其天然状态(即细胞或组织内)中通常与其相伴的其它核酸分离开的RNA分子。分离的核酸(DNA或RNA)还可以表示用生物学或合成工具直接生成的并且与其产生过程中存在的其它组分分离开的分子。
本文使用的术语″核酸″或″核酸序列″包括任何DNA或RNA分子，单链或双链，以及如果是单链，包括它的线型或环型的互补序列分子。在讨论核酸分子时，在本文可以根据按5’到3’方向提供序列的正常约定描述特定核酸分子的序列或结构。除非有其它的限定，该术语包括已知的类似物。
术语“寡核苷酸”表示由经磷酸二酯键连接的两个或多个(优选地超过3个)核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成的核酸分子。
术语“操纵基因”表示位于基因上游(5’)的并且一种或多种调节蛋白(阻抑物或激活物)与其结合以控制基因表达的DNA区域。
本文使用的术语“操纵子”表示用于控制基因表达的功能整合的遗传单位。它是由一个或多个编码一种或多种多肽的基因以及通过调节结构基因的转录而控制其表达的邻近位点(启动子和操纵基因)组成。术语“表达操纵子”表示可以具有转录和翻译控制序列的核酸片段，所述序列例如启动子、增强子、翻译起始信号、多腺苷酸化信号、终止子等，其促进了多肽编码序列在宿主细胞或有机体内的表达。
短语“可操纵地连接”包括表示启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动并介导对应于第二序列的DNA序列的转录。一般而言，可操纵地连接意思是所连接的核酸序列是连续的，对于必须连接两个蛋白编码区的情况，所连接的核酸序列是连续的并位于相同的阅读框内。
缩写“ORF”代表“开放阅读框”，其是基因序列的一部分，它含有不被内在终止序列中断的碱基序列，并且它具有编码肽或蛋白的潜能。开放阅读框开始于起始密码子并终止于终止密码子。终止或末端密码子决定了多肽的末端。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文可互换使用，表示氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸的聚合物。
缩写“PCR”表示聚合酶链式反应，其是扩增DNA的量的技术，因此使得DNA更容易被分离、克隆和测序。见例如美国专利No.5,656,493、5,33,675、5,234,824、和5,187,083，在本文通过引用将每个专利的内容都并入本申请。
本文使用的术语“启动子”包括转录起点上游(5′)的DNA区域，其参与RNA聚合酶和其它蛋白的识别和结合，以便启动转录。术语“诱导型启动子”表示应答于特定化合物(即诱导物或诱导剂)的存在或应答于限定的外部条件(例如升高的温度)而激活的启动子。
短语“定点诱变”表示一种体外技术，其利用重组DNA方法将碱基变化即突变引入到一段DNA的特定位点。
本文使用的术语“非翻译区”或UTR表示其碱基不参与蛋白合成的DNA部分。
术语特定序列核酸的“变体”、“突变体”和“衍生物”表示与特定序列紧密相关的核酸序列，但是它们可以天然地或通过设计具有序列或结构上的变化。“紧密相关”意思是在限定长度的核酸序列上，序列的至少约60％，但是常常超过85％的核苷酸是匹配的。紧密相关的核酸序列之间的核苷酸序列的变化或差异可以代表在正常复制或该特定核酸序列性状被重复过程中生成的序列中的核苷酸变化。对于特殊的目的，可以特异地设计出其它的变化，并将其引入到序列内。利用各种诱变技术可以在体外生成这些特定的变化。这些特异生成的序列变体可以被称作原始序列的“突变体”或“衍生物”。
技术人员可以生成具有单个或多个氨基酸置换、缺失、添加或替换的蛋白变体。这些变体尤其可以包括：(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸替换的变体；(b)其中添加了一个或多个氨基酸的变体；(c)其中至少一个氨基酸包括取代基的变体；(d)其中在保守或非保守位点上来自一个物种的氨基酸残基被替换为另一个物种的相应残基的变体；和(d)其中靶蛋白与另一种肽或多肽例如融合伴侣、蛋白标记或其它可赋予靶蛋白有用的性能的化学部分例如抗体的表位融合的变体。技术人员已知用于获得这些变体的技术，包括遗传学的(抑制、缺失、突变等)、化学的和酶的技术。
亲和纯化
粘孢子用于亲和纯化的用途
本发明也提供了纯化PrS-标记的或PrS2-标记的蛋白的方法，其包括，使标记的蛋白接触包含黄色粘球菌粘孢子的亲和树脂，从而将PrS-标记的或PrS2-标记的蛋白固定化在所述亲和树脂上。也提供了结合到一个或多个黄色粘球菌粘孢子上的PrS-标记的或PrS2-标记的蛋白分子。在有Ca2+或Mg2+存在下，PrS或PrS2标记可以结合于粘孢子(黄色粘球菌的孢子)的表面。在该纯化方法的一个实施方案中，在有Ca2+或Mg2+存在下，使PrS-标记的或PrS2-标记的蛋白接触亲和树脂。通过加入螯合钙或镁的试剂，使PrS-标记的或PrS2-标记的蛋白从亲和树脂释放。因而，使用粘孢子，可以特异性地分离PrS2-标记的靶蛋白，因为它结合于粘孢子的表面，且可以通过加入EDTA或EGTA等螯合试剂而容易地从粘孢子的表面释放。
对于作为蛋白亲和纯化中的树脂的用途，用25mM EDTA洗涤粘孢子，以去除粘孢子表面上存在的蛋白S和蛋白C。纯化的粘孢子由直径约1μm的均一球形颗粒组成。它们可以长时间地均匀地悬浮于溶液中。值得注意地，粘孢子具有对蛋白S的高吸附能力(3.3x106分子/孢子)，这对于蛋白的亲和纯化也是理想的。
通过简单地在4℃将粘孢子与溶胞产物温育1小时，然后通过低速离心收集这些粘孢子，可以容易地实现本发明的亲和纯化。融合蛋白与粘孢子的亲和力是在10-9M的范围内，粘孢子可以特异性地捕获在大肠杆菌细胞中以非常低的水平表达的融合蛋白。
本发明也提供了根据本发明的方法纯化的蛋白。在一个优选的实施方案中，纯化的蛋白是PrS-标记的或PrS2-标记的蛋白。
本发明也提供了一种试剂盒，其包含亲和树脂和用于纯化PrS-标记的蛋白的方法中的说明书。试剂盒另外包含产生PrS-标记的蛋白的组分。
术语″亲和配体″或″亲和试剂″是指以高亲和力特异性地结合同源配体的试剂。这样的试剂可以结合到称作“基质”、“树脂”或“基质材料”的支持物上，形成″亲和基质″或″树脂基质″或″亲和树脂″。本发明的亲和树脂包含称作黄色粘球菌″粘孢子″的黄色粘球菌孢子或其衍生物或片段，其能结合它相应的同源配体。同源配体可以″固定化″或″保持″或″结合″在基质上，直到用释放剂释放。
″释放剂″是指一种组合物，其能从亲和基质释放固定化的、结合的分子(例如从粘孢子亲和树脂基质释放结合的PrS-或PrS2-标记的分子)。本发明的释放剂可以通过多种机制起作用，包括螯合二价阳离子，蛋白的变性，和蛋白酶消化以将结合的标记与它所连的分子分离。
分析技术：
本发明的方法适用于表征蛋白，无论来自原核生物还是来自真核生物的蛋白，包括人蛋白。因为表达系统被设计为PrS或PrS2标记可以被特定蛋白酶(例如TEV蛋白酶或凝血酶)切割掉，可以得到与它们的天然形式相同的可溶蛋白。以前我们已经证实了PrS和PrS2标记对靶蛋白的功能具有可忽略的影响或没有影响(Harlocker SL等人JBiol Chem.1995)。因此，如果靶蛋白在切割PrS或PrS2标记后变得不溶，仍然可以表征作为与PrS或PrS2标记的融合蛋白的靶蛋白的功能。
重要的是，本发明的PrS和PrS2标记对蛋白酶是高度稳定和抗性的。此外，已经通过NMR确定了蛋白S的结构(Bagby S等人Proc NatlAcad Sci USA.1994，Wenk M等人J Mol Biol.1999)，并已经证实其容易地形成晶体。通过使用这些优点，本发明的PrS和PrS2标记可以用于对高浓度的不稳定蛋白的结构研究，例如核磁共振(NMR)和X-射线晶体分析。我们已经证实，与PrS2标记融合的靶蛋白的NMR谱不受PrS2标记的影响。当靶蛋白与PrS2标记相融合时，PrS2标记改善靶蛋白晶体的形成。
捕获在粘孢子上的蛋白S-标记的蛋白的NMR结构研究
存在大量的不能通过常规技术(X-射线和NMR)来确定其三维结构的蛋白，因为这些蛋白不稳定或在溶液中溶解度差。通过使用捕获在粘孢子上的PrS-或PrS2-标记的蛋白，本发明提供的技术克服了该问题。
使用结合于粘孢子表面的PrS2标记的该性质，也可能从PrS2-标记的靶蛋白的NMR谱中消除PrS2标记的谱。因为PrS2标记与粘孢子表面的相互作用会限制它的移动，将显著减弱它的信号。这样的导致减弱的信号的限制作用称作增宽效应。另一方面，通过柔性连接物与PrS2标记融合的靶蛋白会保留它的自由旋转运动，导致产生令人满意的信号用于NMR研究。重要的是注意到连接PrS2标记和靶蛋白的连接物在PrS2-标记的融合蛋白的结晶和NMR研究中具有关键作用。因此，设计含有不同长度的连接物的表达系统是有用的。优选的连接物包含约1至约20个氨基酸残基。特别优选的连接物包含约3至约10个氨基酸残基。权利要求1的方法，其中所述PrS-标记的蛋白包含在蛋白S和靶蛋白之间的连接物。
本发明的方法包括制备用于分析研究的靶蛋白，其包括：制备PrS-标记的或PrS2-标记的靶蛋白，和进行分析研究。除了NMR以外，在本发明中有用的其它研究包括药物筛选测定、结合测定和X-射线晶体分析或需要可溶靶蛋白的任意研究。
在本文和所附的权利要求书中使用的单数形式“一/该”包括复数指示，除非在上下文中有清楚的其它说明。
除非另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。尽管在本发明的实践或测试中也可以使用与本文所述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料，现在描述优选的方法和材料。在本文通过引用将在本文所提及的所有出版物都并入本申请，用于公开和描述与所引用文献相关的方法和/或材料。
实施例
给出下面的实施例，以便为本领域普通技术人员提供关于如何制备和利用本发明的完整阐述和说明，这并不打算限制本发明人所视为本发明的范围，也不打算表示下面的试验是所能实施的全部或唯一的试验。已经努力保证所用数字(例如量、温度等)的准确性，但是一些试验误差和偏差应该考虑到。除非有其它不同的说明，份数是重量份，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
对于在本文所给出的数值范围，要明白到下限单位的1/10(除非上下文中有不同的说明)、该范围的上限和下限之间的每个间插数值以及任何其它在该指定范围内的指定的或间插的数值都包含在本发明的范围内。可能被独立地包含于较小范围内的这些较小范围的上限和下限也包括在本发明中，指定的范围中可有任何特别排除的极限。指定的范围包含极限值之一或两者时，排除了那些所包括的极限值之一或两者的范围也包括于本发明内。
在本文所讨论的出版物仅仅提供其在本申请提交日期之前的公开内容。本文的任何部分都不应被理解为承认本发明无权因在先发明而先于这些出版物。此外，在本文所提供的出版物的日期可能不同于实际的出版日期，这可能需要独立地验证。
蛋白S-OmpR融合
OmpR是大肠杆菌的一种转录因子，它是编码主要外膜蛋白的ompF和ompC基因的交互表达所必需的。以前，将它融合至蛋白S的N-末端结构域(残基1-92)的2个串联重复(称作PrS2-OmpR)，以测定在ompF启动子的上游区域中OmpR-结合位点的确切数目(Harlocker，S.L.等人1995.J Biol Chem 270：26849-56)。蛋白S在OmpR的N-末端的这种融合，没有妨碍OmpR的DNA结合能力，因而当以不同比例混合OmpR和PrS2-OmpR时，允许在DNA延滞测定中梯的形成。
最近，我们进行了对OmpR结合DNA的详细分子机制的进一步表征。在这些实验过程中，我们发现：(a)PrS2-OmpR在pET表达系统中以比野生型OmpR明显更高的水平表达，和(b)OmpR在溶液中的溶解度被蛋白S融合显著(超过20倍)提高。
意义
1.所提出的使用在大肠杆菌中的pCold的蛋白S-标记(PST)载体是一种最通用的表达系统，其允许：(a)非常高水平的表达，(b)不能由任何其它表达系统容易地表达的蛋白的表达，(c)不稳定蛋白的表达，和(d)否则会表达在包涵体内的蛋白的溶解度的显著提高。这些特征提供了在用同位素(15N和13C)标记靶蛋白用于NMR研究中的巨大优势。
2.所提出的在哺乳动物细胞中的PST载体系统允许鉴别蛋白复合物的形成和蛋白-蛋白相互作用。更具体地，该系统可以鉴别仅在活细胞中形成复合物的蛋白因子。
3.粘孢子的应用在下述3个方面值得注意：(a)制备黄色粘球菌培养物非常容易，最终的纯化的粘孢子相对便宜，(b)它们是均一的，可以通过辐射转化成完全无生物活性的颗粒(以预防萌发)，所以它们可以重复用于无限次数的实验，(c)粘孢子的密度相对低，使其更容易重悬于均质的悬浮液中。
4.我们发现，甚至在有4M尿素存在下，蛋白S仍然可以结合粘孢子。因此，尽管有些与蛋白S融合的蛋白形成包涵体，在用4M尿素溶解后，可以重新折叠这些蛋白，并使用粘孢子进行纯化。实际上，一个类似的方案成功地用于His-标记的蛋白。
5.所提出的本发明的PST技术是新颖的且非常通用的，预期会为蛋白技术作出重大贡献。
C.初步研究
1.与OmpR融合的PrS2标记不会影响OmpR的性质
将OmpR(大肠杆菌的一种转录因子)融合至蛋白S的N-末端结构域(残基1-92)的2个串联重复(称作PrS2-OmpR)，以测定在ompF启动子的上游区域中OmpR-结合位点的精确数目(Harlocker，S，L.，等人1995.J Biol Chem 270：26849-56)。OmpR是参与双组分信号转导系统的响应调节物，它的同源组氨酸激酶是EnvZ。EnvZ会在保守的Asp残基(D55)磷酸化OmpR，以产生磷酸化的OmpR(OmpR-P)，且也可以将OmpR-P去磷酸化。通过监测(i)EnvZ的胞质域(EnvZc)和OmpR之间的复合物形成，(ii)OmpR的磷酸化和OmpR-P的去磷酸化，和(iii)OmpR的DNA结合，我们检查了与OmpR融合的PrS2标记是否会影响OmpR的性质。
已知EnvZc/OmpR复合物可以通过非变性PAGE容易地检测到(Yoshida，T.等人2002.Mol Microbiol 46：1273-82)。如图2A所示，当混合纯化的OmpR和EnvZc并进行10％非变性PAGE时，它们形成复合物(泳道2)，其迁移得比OmpR和EnvZc(分别是泳道1和3)慢。我们测试了PrS2标记是否会影响EnvZc和OmpR之间的复合物形成。当混合纯化的EnvZc和PrS2-OmpR时，它们也形成复合物(泳道4)，表明与OmpR融合的PrS2标记不会妨碍EnvZc和OmpR之间的复合物形成。
接着，我们检查了EnvZc和OmpR的酶性质是否受OmpR与PrS2标记的融合的影响。首先，测试了EnvZc-P对PrS2-OmpR的磷酸化。当混合OmpR和纯化的32P-标记的磷酸化EnvZc(EnvZc-P)时，EnvZ上的磷酰基立即转移给OmpR，该反应在120秒内完成(泳道2-5，图2B)。当用PrS2-OmpR进行该反应时，EnvZc-P能磷酸化PrS2-OmpR，结果与未标记的OmpR几乎相同(泳道7-10，图2B)。竞争实验进一步证实，OmpR和PrS2-OmpR是EnvZc-P的同样好的底物(泳道12-15，图2B)。其次，检查了磷酸化PrS2-OmpR的去磷酸化。如上所述创建OmpR-P后，在加入ADP后观察OmpR-P的去磷酸化，ADP已知是该反应的辅因子并会刺激EnvZc的磷酸酶活性。OmpR-P被迅速地去磷酸化，释放出Pi，如图2C的泳道3-6所示。尽管在PrS2-OmpR的情况下，该反应被PrS2标记减慢，磷酸化的PrS2-OmpR被EnvZc去磷酸化(泳道9-12)。OmpR和PrS2-OmpR之间的竞争实验再次证实，OmpR-P和PrS2-OmpR等同地充当EnvZc的底物(泳道15-18)。
最后，我们测试了PrS2-OmpR与DNA的结合是否受PrS2标记的影响(图2D)。已知2个OmpR-P分子可以结合每个20-bp结合位点，在DNA上形成二聚体样结构。当混合OmpR-P和30-bp DNA片段(F1F2a，它具有20-bp F1位点和F2的半位点(F2a))时，检测到OmpR-P/F1F2a复合物[条带(a)，泳道2]。当混合PrS2-OmpR时，PrS2-OmpR/F1F2a复合物迁移得比OmpR-P/F1F2a复合物慢得多，PrS2-OmpR/F1F2a复合物条带的迁移被进一步延滞[条带(c)，泳道8]。一旦将OmpR和PrS2-OmpR的多种不同混合物与F1F2a相混合时，在条带(a)和条带(c)之间出现另一个新条带[在泳道3-7中的条带(b)]。该条带源自1个OmpR分子和1个PrS2-OmpR分子与F1F2a的结合，表明PrS2标记不会影响OmpR的DNA结合能力以及结合在DNA上的OmpR分子之间的相互作用。
这些数据清楚地证实，融合到OmpR上的PrS2标记不会改变OmpR的性质，表明PrS2标记域的折叠独立于OmpR。
2.PrS2-OmpR与粘孢子的结合是Ca++依赖性的
为了检查新构建的PrS2片段(蛋白S的N-末端结构域的2个串联重复)以及PrS2-OmpR是否能结合粘孢子，我们从黄色粘球菌的10天成熟子实体制备了粘孢子。我们从1.5L培养物能收获约2g纯化的粘孢子。通过在使用前用20mM EDTA洗涤它们，从粘孢子彻底去除蛋白S(Inouye，M.等人，1979.Proc Natl Acad Sci US A 76：209-13)和蛋白C(McCleary，W.R.等人1991.J Bacterial 173：2141-5)。
首先，我们测试了PrS2-OmpR是否以Ca++离子依赖性的方式结合无蛋白S的粘孢子。在有20mM EDTA、10mM MgCl2或10mM CaCl2存在下，在100μl含有50mM KCl的50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，混合纯化的PrS2-OmpR(3μg)和粘孢子，在4℃温育最终的混合物1小时。使用微量离心机(Biofuge Pico，SORVALL)，以6,500rpm离心3min收集粘孢子，用相应的结合缓冲液洗涤粘孢子沉淀一次。将最终的粘孢子沉淀悬浮于20μl SDS-上样缓冲液[20mM Tris-HCl(pH 6.8)，40mM β-巯基乙醇，0.8％(w/v)SDS，4％甘油，和0.04％(w/v)溴酚蓝]中。在沸水浴中温育粘孢子悬浮液5min。通过该处理，仅结合到粘孢子表面上的蛋白被溶解，但是粘孢子的胞内蛋白不受影响。然后通过17.5％SDS-PAGE分析这些样品。如在图3B中所示，在有MgCl2(泳道3)和CaCl2(泳道4)存在下，PrS2-OmpR结合到粘孢子上；但在EDTA(泳道2)存在下并非如此。
因为通过加入EDTA可以释放结合到粘孢子上的蛋白S，我们还检查了EDTA是否可以释放结合到粘孢子上的PrS2-标记的蛋白。在4℃与粘孢子一起温育PrS2-OmpR 1小时后，在室温在EDTA缓冲液[50mMTris-HCl(pH 8.0)，50mM KCl，和20mM EDTA]中温育粘孢子沉淀15min。在有EDTA存在下，PrS2-OmpR被释放到上清液中(泳道2，图3C)，而在有Ca++存在下，PrS2-OmpR仍然结合到粘孢子上(泳道4，图3C)。这些结果证实，PrS2-标记的OmpR中的PrS2片段完全保留了以Ca++依赖性的方式结合到粘孢子表面的能力。注意到，尽管在有Mg++离子存在下蛋白S可以结合到粘孢子，已知它的结合比在有Ca++存在下弱(Inouye，M.等人，1979.Proc Natl Acad Sci USA 76：209-13)。因此，对于使用PrS2-标记的蛋白的所有实验，在结合缓冲液中包含Ca++离子。
我们的下一个问题是，PrS2-标记的蛋白结合粘孢子有多特异。为了实现蛋白的一步亲和纯化，非常重要的是，使污染蛋白与粘孢子的非特异性结合最小化。在有大肠杆菌BL21(DE3)溶胞产物存在下，测试了PrS2-OmpR与粘孢子的结合(泳道3，图3D)。在该条件下，PrS2-OmpR特异性地结合粘孢子，通过考马斯蓝染色仅观察到极小量污染物(泳道5，图3D)。令人感兴趣地，甚至在有高达4M的尿素存在下，PrS2-OmpR与粘孢子的结合也不受影响(图5E)。
PST技术的应用
亲和蛋白纯化的优点之一是，亲和标记的蛋白的结合和洗脱可以在生理条件下进行，这可以允许研究蛋白-DNA或蛋白-蛋白相互作用。我们测试了PST(蛋白S标记)技术是否允许使用PrS2-OmpR来检测蛋白-DNA相互作用。
PrS 2 -OmpR/DNA复合物的分离
因为OmpR可以结合DNA，如图2D所示，我们测试了PrS2-OmpR/DNA复合物是否可以使用粘孢子来分离。为此目的，使用了含有来自ompF启动子(ompFP)的上游区域的序列的500-bp DNA片段。首先，混合ompFP DNA和PrS2-OmpR(3μg)，将混合物在室温温育30min。然后将粘孢子加入混合物。在4℃温育1小时后，离心收集粘孢子。将最终的沉淀悬浮于含有尿素的DNA上样缓冲液[20mM Tris-HCl(pH7.5)，5M尿素，40mM β-巯基乙醇，0.8％(w/v)SDS，4％甘油，和0.04％(w/v)溴酚蓝]中，然后通过琼脂糖凝胶电泳分析上清液的DNA结合。如图4A所示，在有PrS2-OmpR存在下将DNA片段与粘孢子混合的样品中，检测到ompFp DNA(泳道4)，而在没有PrS2-OmpR存在下进行的反应中没有检测到(泳道3)。
接着，通过用BamH I消化pCR-ompFp制备含有ompFp片段的线性化的质粒DNA(pCK-ompFp，4.5kbp)[条带(b)]，还用EcoR I消化pET-EnvZc，以释放EnvZc片段(1.5kbp)[条带(c)]。注意到，通过在pET11a载体的EcoR I位点插入EnvZc片段，构建pET-EnvZc。因此，对pET-EnvZc的EcoR I消化会产生2个条带：(a)，pET11a载体，和(c)，EnvZc片段。使用由BamH I消化过的pCR-ompFp和由EcoRI消化过的pET-EnvZc的DNA混合物，在有或没有PrS2-OmpR存在下进行与图4A所述相同的实验。如图4B所示，在有PrS2-OmpR存在下，从粘孢子沉淀仅检测到与pCR-ompFp片段相对应的1个条带(泳道3)，而在没有PrS2-OmpR存在下，没有检测到DNA(泳道2)。这些结果证实，粘孢子能够捕获PrS2-OmpR/0.5-kbp ompFp DNA复合物和PrS2-OmpR/4.5-kbp pCR-ompFp DNA片段复合物。值得注意，这里使用的方法足够温和而可用于分离完整的蛋白-DNA复合物。
研究设计和方法
在上述初步结果的基础上，我们可以进行下述的2个研究。PST技术可以使我们分析不能通过常规的X-射线和NMR技术来测定的蛋白的结构。
研究#1大肠杆菌和哺乳动物细胞中蛋白S标记(PST)表达系统的构建及粘孢子用于亲和纯化的应用。
在本实验中，我们可以开发2种PrS2-OmpR-标记的蛋白表达系统，(1)大肠杆菌PST-表达系统：这可以使用在我们实验室最近开发的高表达冷激载体pCold来构建(Qing，G.等人2004.Nat Biotechnol22：877-82)。最终的产物称作pCold(PST)，其中目标蛋白在N-末端融合至PrS2标记，在冷激处理后以非常高的水平诱导融合蛋白的表达。(2)哺乳动物PST-表达系统：这可以使用四环素诱导型载体来构建。该系统被设计用于分离在活细胞中形成的多蛋白复合物。使用粘孢子可以捕获与PrS2-标记的蛋白相关联的复合物，通过质谱法可以鉴别复合物中的蛋白。在该目的第三个方案中，我们可以建立制备高度纯化的不含有蛋白S和蛋白C的粘孢子的方法，所述粘孢子用于PrS2-标记的蛋白和蛋白复合物的亲和蛋白纯化。
方案#1：大肠杆菌中的PST表达系统
最近在我们实验室开发了冷激载体(pCold载体)，且已经证实与pET载体系统互补(Qing，G.等人2004.Nat Biotechnol 22：877-82)。在冷激(15℃)后，目标蛋白的表达以非常高的水平被诱导。在冷激表达系统下目标蛋白的产生仅伴随低背景产量的细胞蛋白。因而，当细胞生长在含有15NH4Cl和13C-葡萄糖的培养基中时，所述蛋白可以几乎专一地被15N和13C同位素标记，这允许不经进一步纯化而简单地使用溶胞产物进行对所述蛋白的NMR结构研究(Qing，G.等人2004.NatBiotechnol 22：877-82)。我们可以采用pCold载体系统来构建在大肠杆菌中的PST系统。
a.pCold(PST)的构建
pColdIII载体(Qing，G.等人2004.Nat Biotechnol 22：877-82)；参见图1)由cspA启动子(cspA，大肠杆菌中的主要冷激基因)、cspA5′-UTR(159个碱基)、起始密码子、翻译增强元件(TEE)和多克隆位点组成。使用该质粒，可以将PrS2(184个残基)的DNA片段插入TEE和多克隆位点之间。在多克隆位点之后，可以插入His6标记，凝血酶切割位点(Leu-Val-Pro-Arg↓Gly-Ser)在His6标记的N-末端，由此His6标记可以容易地从蛋白去除。该新构建的载体称作pCold(PST)(图5)。值得注意地，His6标记也可以添加在PrS2-标记的蛋白的C-末端，在该情况下，目标蛋白的DNA片段可以与His6标记符合读框地插入。DNA片段也可以通过PCR来制备，以具有终止密码子以在C-末端消除His6标记。
关于实验#2中所述的蛋白的NMR结构研究，在蛋白S和目标蛋白之间的连接物是使蛋白可自由运动所必需的，即使N-末端PrS2标记牢固地固定在粘孢子表面上(参见实验#2)。尽管蛋白S片段(残基1-92)的C-末端具有由6个氨基酸残基(-87VPVQPR92-)组成的随机结构，我们可以在必要时优化连接物的长度(细节参见特定目的#2)。将TEV切割位点(Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly)添加在PrS2的C-末端之后，使得克隆的基因产物可以通过TEV处理从PrS2脱离。最终的载体称作pCold(PST)。
b.pCold(PST)应用于模型蛋白
我们可以使用pCold(PST)来表达3种模型蛋白：CspA，EnvZ结构域A和EnvZ结构域B。CspA是一种由70个残基组成的小β-桶蛋白，起RNA陪伴分子的功能(Jiang，W.，1997.J Biol Chetn 272：196-202)；已经通过NMR测定了它的结构(Newkirk.K.等人1994.ProcNatl Acad Sci USA 91：5114-8)。通过NMR测定，EnvZ结构域A(67个残基)结构由2个形成发夹结构的螺旋组成(Tomomori，C.等人1999.Nat Struct Biol 6：729-34)。该片段是中央二聚化结构域，其具有His残基作为EnvZ的自磷酸化位点。EnvZ是参与大肠杆菌中的ompF和ompC基因的渗透调节的组氨酸激酶(综述参见Egger，L.A.等人1985.Genes Cells 2：167-84，Forst，S.A.等人1994.ResMicrobiol 145：363-373)。EnvZ结构域B是一种α/β蛋白(161个残基)，用作EnvZ的ATP-结合域。已经通过NMR测定了它的三维结构(Tanaka，T.等人1998.Nature 396：88-92)。
因为已经通过NMR测定了所有这些蛋白结构(β，α，和α/β)，它们是特定目的#2的理想模型蛋白。在使用pCold(PST)表达这些蛋白后，可以使用Ni-NTA树脂来纯化它们。与它们的未标记的蛋白相对比，检查它们各自的生化性质，例如对于CspA为RNA结合，对于EnvZ结构域A为EnvZ的磷酸化作用，和对于EnvZ结构域B为ATP结合。在用PrS2-OmpR得到的结果(参见初步结果部分)的基础上，预期所有这些蛋白保留它们的生化性质。观察到的生化性质的任何变化，将归因于在C-末端的His6标记。在该情况下，我们可以用凝血酶去除C-末端His6标记，并重新检查它们的生化性质。预期通过冷激处理[在15℃ 12小时；(Qing，G.等人2004.Nat Biotechnol 22：877-82)]，所有这些蛋白会以非常高的水平产生(总细胞蛋白的30-50％)。对于特定目的#2，我们可以使用在我们实验室建立的方法，用15N标记这些蛋白(Qing，G.等人2004.Nat Biotechnol 22：877-82)。
C.蛋白表达和溶解度的增强
由于OmpR的表达和溶解度被它与PrS2标记的融合显著增强，我们可以使用该PrS2标记作为通用的蛋白表达系统。我们可以检查pCold(PST)用于表达用作模型基因的基因集合的有效性。该集合称作″核心50″，含有来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和智人(Homo sapiens)的基因，且已经用于测试各种不同的表达系统，例如pET，pCold和小麦胚系统(http://www-nmr.cabm.rutgers.edu/bioinformatics/ZebaView/)。因此，″核心50″的使用对于测试pCold(PST)是理想的。我们可以使用pCold(PST)来测试基因、尤其是它们的产物差表达或产生在包涵体中的那些基因的表达和溶解度(方法参见Qing，G.等人2004.NatBiotechnol 22：877-82))。
方案#2：哺乳动物细胞中的PST表达系统
如我们上面已经证实的，使用PrS2-标记的OmpR和粘孢子可以分离蛋白-DNA复合物(图4)，该方法也可以用于分离其它蛋白复合物和鉴别蛋白-蛋白相互作用。PST技术在哺乳动物系统中具有巨大潜力，尤其用于分离仅在活细胞中形成的多蛋白复合物。因此，我们可以构建四环素诱导型PrS2-融合表达系统，并用TATA-结合蛋白(TBP)作为模型系统测试该系统。已知这会形成在真核生物转录起始中起重要作用的多蛋白复合物。
a.四环素诱导型PST系统：T-REx(PST)的构建
为了构建四环素诱导型PST系统，我们可以使用质粒载体pcDNA4/TO/myc-His(Invitrogen)，它是四环素诱导型载体，且具有C-末端myc表位和His6标记。使用该载体的多克隆位点中的HindIII和Kpn I位点，可以插入PrS2片段。如图6所示，使用多克隆位点中的Kpn I和Xba I位点，也可以插入TEV切割位点和一个新的多克隆位点，从而在必要时可以去除与目标蛋白融合的PrS2标记。因为该PrS2-标记的蛋白在C-末端具有c-myc表位，它可以通过简单的蛋白印迹法来检测。
为了建立表达PrS2-标记的蛋白的稳定细胞系，我们可以使用T-REx 293细胞系作为宿主细胞(Invitrogen)。该T-REx 293是组成型表达Tet阻遏蛋白的人胚肾293细胞系，所述Tet阻遏蛋白可以抑制PrS2-标记的蛋白的转录，直至加入诱导物四环素。使用PolyFect转染试剂(QIAGEN)，可以将携带PrS2-标记的蛋白的T-REx(PST)转染进T-REx 293细胞，在添加了10％小牛血清和药物(5μg/ml杀稻瘟素和40μg/ml Zeocin)的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)上选择稳定的转化体2周。分析抗药性克隆在用四环素诱导后PrS2-标记的蛋白的表达，将以最高水平表达PrS2-标记的蛋白的克隆用于该研究。
b.T-REx(PST)系统应用于模型蛋白
使用人TATA-结合蛋白(TBP)作为模型蛋白，我们可以在哺乳动物细胞中测试PST系统。TBP在转录起始中的参与被充分表征，它是形成多蛋白-DNA复合物的核心蛋白(Hori，R.和M.Carey等人1994.Curr Opin Genet Dev 4：236-44，Maldonado，E.等人1995.Curr OpinCell Biol 7：352-61，Roeder，R.G.等人1991.Trends Biochem Sci16：402-8)。该多蛋白-DNA复合物形成通过TBP与TATA元件的结合和它与转录因子IIB(TFIIB)(通用的转录因子之一)的关联来启动，最终装配含有RNA聚合酶II和其它已知的通用转录因子的前起始复合物(PIC)(Zawel，L.等人1993.Prog Nucleic Acid Res Mol Biol44：67-108)。
首先，我们可以如上所述制备稳定细胞系，可以收获受诱导的细胞，未诱导的细胞作为对照。我们可以检查通过与粘孢子混合是否可以从溶胞产物分离PrS2-TBP。证实可以通过粘孢子分离PrS2-TBP后，我们可以对比来自受诱导的和未诱导的细胞的与粘孢子结合的蛋白。如果在PrS2-TBP诱导细胞中检测到的蛋白条带不同于在未诱导的细胞中检测到的蛋白条带，我们可以通过蛋白印迹法或质谱指纹法鉴定这些蛋白，后一种方法可以由为我们实验室常规运行所述仪器的Takeshi Yoshida在医学院中心实验室的MALDI-TOF质谱仪上实现。
如果使用PrS2-TBP和粘孢子成功地分离了关联因子，我们可以应用该系统来研究与Su(z)12(zeste-12的抑制剂，其参与组蛋白H3-H1甲基转移酶活性)相互作用的蛋白(Kuzmichev，A.等人2002.GenesDev 16：2893-905)。
方案#3：高度纯化的耗尽蛋白S的粘孢子的制备
对于PrS2-标记的蛋白的亲和纯化和蛋白复合物的分离，必需得到高度纯化的粘孢子。在该方案中，我们可以建立制备大量纯化的粘孢子的方法，所示粘孢子被耗尽了聚集在表面上的蛋白S和蛋白C。我们还可以建立灭活粘孢子的方法，使得它们在任意条件下都不会萌发，因而可以用作可重复使用的生物材料。因为粘孢子通过生物方法制备，与其它亲和树脂(例如Ni-NTA，链霉抗生物素，谷胱甘肽，直链淀粉，和钙调蛋白树脂)相比，制备纯化的粘孢子的成本非常经济。此外，黄色粘球菌和它的孢子不是致病性的，操作完全安全。
a.粘孢子的制备
黄色粘球菌FB(DZF1)用作粘孢子来源。为了培养细胞，使用酪胨-酵母浸出物(CYE)培养基[1％酪胨，0.5％酵母浸出物，10mMTris-HCl(pH 7.6)，和8mM MgSO4]，对于子实体形成，使用克隆生成(clone fruiting)(CF)琼脂[0.015％酪胨，0.2％柠檬酸钠，0.02％(NH4)2SO4，10mM Tris-HCl(pH 7.6)，8mM MgSO4，0.1％丙酮酸钠，1mM磷酸钾缓冲液(pH 7.6)，和1.5％Bacto琼脂]平板。在使用前，在30℃干燥平板过夜，然后在室温干燥5天。
使细胞在30℃生长至它们达到指数期(100 Klett单位)。通过在室温以4000xg离心10min，收获细胞。用等体积的TM缓冲液[10mM Tris-HCl(pH 7.6)和8mM Mg2SO4]洗涤细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于TM缓冲液，达到4000 Klett单位/ml的浓度。将该浓缩的细胞悬浮液点种在CF琼脂平板上(每个点4μl，每个平板144个点)，在30℃温育平板10天。通过轻刮平板的表面，收获子实体，并悬浮于冷TM缓冲液。将细胞超声处理3次5min，以破坏营养细胞。用TM缓冲液洗涤粘孢子数次，最后重悬于10mM Tris-HCl(pH 7.6)缓冲液中。将粘孢子保存在4℃备用。
在室温在含有25mM EDTA的10mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中温育纯化的粘孢子1小时，以从它们的表面去除天然蛋白S(Inouye，M.等人，1979.Proc Natl Acad Sci USA 76：209-13)和蛋白C(McCleary，W.R.等人1991.J Bacterial 173：2141-5)，洗涤几次后，再重复该步骤一次。然后在60℃加热该经EDTA处理的粘孢子10min，以灭活任何可能存在的蛋白酶。如图3A所示，这些处理过的粘孢子具有均一的球形，并用于我们的研究中。
b.良好悬浮的粘孢子的维持
纯化的粘孢子的大小是均一的(直径1μm；参见图3A)，比水的密度略大(因而如果粘孢子悬浮液长时间放置，它们会在缓冲溶液中沉积到试管底部)。为了维持粘孢子的良好悬浮状态，我们测试了蔗糖对粘孢子悬浮液的影响。在室温将粘孢子悬浮于0.3ml的0，5，10，15，和20％蔗糖溶液中。在5％蔗糖的最低浓度，它们良好悬浮，没有沉积(数据未显示)。我们可以使用该条件进行为NMR结构研究设计的实验。
c.粘孢子的灭活
在诸如有1mM Ca++离子和酪胨培养基存在下等特定条件下，粘孢子会萌发(Otani，M.等，1995，J Bacterial 177：4261-5)。对于PST技术，必须阻止粘孢子萌发，以便可以重复使用它们多次。我们可以测试下述方法，以完全灭活粘孢子的萌发能力。
NaN3的作用——为了测试NaN3(1mM)是否会阻止粘孢子萌发，我们可以在有和没有NaN3存在下，在30℃在萌发培养基(含有1mM Ca++的0.2％酪胨)中温育粘孢子10小时。通过在相差显微镜下监测粘孢子的折射率，可以监测对萌发的抑制。
热处理的作用——为了测试用高温处理粘孢子是否会阻止它们的萌发，我们可以在70，80，90，和100℃温育它们30min。我们可以确定使粘孢子丧失它们的萌发能力、但是保留它们的蛋白S结合性能的最佳热处理。
γ-射线辐射的作用——如果上述2种方法在抑制粘孢子的萌发方面是无效的，我们可以使用γ-射线辐射来杀死粘孢子。应当指出，粘孢子是耐受UV辐射的。
研究2对捕获在粘孢子上的蛋白S-标记的蛋白的核磁共振(NMR)结构研究
如果蛋白由2个完全独立的通过柔性连接物相连的结构域X和Y组成，且2个结构域之间没有相互作用，我们假设通过限制结构域X的各向同性运动，可以消除来自结构域X的NMR信号。这可以通过结构域X牢固结合到颗粒表面来实现，所述颗粒良好地悬浮于溶液中。在该条件下，结构域Y仍然在溶液中保持它的各向同性运动，因为它通过高度柔性的连接物与结构域X相连。因此，结构域X的HSQC谱的每个峰可被增宽，同时结构域Y的HSQC谱的每个峰保持尖锐，用于结构分析。如果成功的话，所提出的PST技术因而将为下述研究打开一条新颖的令人兴奋的途径：
1.对溶解度差的蛋白的NMR结构研究。
对于NMR结构研究，需要高浓度的目标蛋白来达到高信噪比。绝对必要的是，蛋白是完全可溶的，没有任何聚集物或沉淀物。如果目标蛋白在高浓度时不稳定，预期该问题可通过使用PST技术来克服。除了PrS2-标记会增强蛋白溶解度这一事实以外，PrS2-标记的蛋白与粘孢子的结合可以避免蛋白的聚集。此外，PrS2-标记的蛋白的浓度可比未标记的蛋白更为浓缩得多。
2.对仅在与PrS2标记融合时才表达的蛋白的NMR结构研究。
3.对膜蛋白的结构研究。
膜蛋白通常不以高水平表达。使用所提出的PST技术，可以实现对溶于适当去污剂中的膜蛋白的一步纯化。因而可以以其NMR结构研究所需的非常高浓度制备粘孢子结合的膜蛋白。
实验方案
通过使用粘孢子和15N-标记的PrS2-标记的蛋白(来自实施例1)，我们可以测试上述假设。在上述假设中，PrS2标记用作结构域X，与PrS2标记融合的蛋白用作结构域Y。为了实现我们的目的，重要的是，以实施例1提出的成本有效的方式，建立制备大量可重复使用的粘孢子的方法。
方案#1：粘孢子的结合对蛋白S的HSQC谱的影响
PrS2片段(184个残基)可以用pCold载体以非常高的水平表达，因而20mg纯化的15N-标记的PrS2片段可以从500ml培养物容易地得到。使用15N-标记的PrS2片段，我们可以对比它在有和没有粘孢子存在下的异核单级量子相干(HSQC)谱。预期在有10mM CaCl2存在下加入粘孢子后，PrS2的HSQC谱的每个峰将变宽，因为PrS2的分子运动将受到与粘孢子结合的极大限制。我们可以确保，加入粘孢子的该作用可以通过加入10mM EDTA来逆转。因为EDTA会从粘孢子释放结合的PrS2，HSQC谱的每个峰应再次变尖。
方案#2：PrS2-标记的模型蛋白的HSQC谱
在证实粘孢子会造成PrS2的HSQC谱的峰增宽后，我们然后可以在有和没有粘孢子存在下，采取来自特定目的#1的15N-标记的PrS2-标记的CspA、EnvZ结构域A和EnvZ结构域B的HSQC谱。然后可以使用下述标准，分析这些谱：
预期加入粘孢子引起的在所有3个谱中增宽的那些峰是来自PrS2标记。预期这些增宽的谱非常类似于在粘孢子存在下PrS2的谱。如果确实如此，将证实我们的假设是正确的。因此，所有这些峰可以从在粘孢子存在下得到的HSQC谱中除去。
这样得到的HSQC谱(去除所有来自PrS2标记的峰后)可以与单个蛋白的HSQC谱相比较，所有都可以在我们实验室得到，因为我们已经与G.Montelione博士[CspA；(Newkirk，K.等人1994.Proc NatlAcad Sci USA 91：5114-8)]和Ikura博士[EnvZ结构域B和A；(Tanaka，T.等人1998.Nature 396：88-92，Tomomori，C，等人1999.NatStruct Biol 6：729-34)]协同测定了这些NMR结构。
目前，不知道粘孢子表面上会触发蛋白S的自装配的组分。有待检查PrS2-标记的蛋白的表面密度如何影响目标蛋白的HSQC谱。如果PrS2-标记的蛋白的表面密度过高，蛋白之间可能存在分子间相互作用，这会限制蛋白的自由移动，导致峰增宽。这可以通过使用不同量的粘孢子和相同量的PrS2-标记的蛋白进行NMR分析来检查。更多粘孢子的加入会降低每个粘孢子结合的PrS2-标记的蛋白的密度，结果可以避免增宽效应。可能影响HSQC谱的质量的另一个重要因素是柔性连接物的长度。通过一次一个添加(GGGGS)n(n＝1，2，3...)残基，我们可以检查连接物长度的影响。通过这些实验，可以建立PST技术的最佳连接物。
如果这些方案是成功的，我们可以将PST技术应用于在特定目的#1的方案#1中测试的有些蛋白，以便测试该技术的普遍适用性。更具体地，我们可以测试：(a)仅在用PrS2标记时才良好表达的那些蛋白，(b)仅以低水平表达的那些蛋白。在这些情况下，它们与粘孢子的结合可以实质上增加它们的浓度以用于NMR研究，和(c)仅在4M尿素中可溶的那些蛋白。由于在4M尿素中PrS2完全能结合粘孢子，在有4M尿素存在下可以容易地纯化PrS2-标记的蛋白(参见初步结果部分)。应当指出，由于用于粘孢子悬浮的溶液可以容易地通过简单离心替换，4M尿素溶液可以容易地替换为不含尿素的缓冲溶液。如此容易的缓冲液替换，也可以提供快速筛选用于NMR实验的最佳缓冲条件的方法。
得到最佳结果
PrS2-标记的蛋白的谱与未标记的蛋白的谱有多相似，是确定所提出的PST技术用于蛋白的NMR结构研究的可行性的关键问题。尽管PrS2-标记的蛋白与粘孢子的结合可能不可预知地影响PrS2 HSQC谱的每个峰的分辨度(增宽效应)，N-末端Ca++结合域由非常稳定的球形结构组成，该球形结构主要由β-链组成(Bagby，S.等人1994，ProcNatl Acad Sci USA 91：4308-12)，且PrS2的每个Ca++结合单位能抗胰蛋白酶消化(Inouye，S.等人1981.J Bacteriol 148：678-83)和热处理(Bagby，S.等人1998.J Mol Biol 276：669-81)。因此，当92个残基的N-末端结构域通过它的Ca++结合位点结合粘孢子时，可能整个结构域刚性地固定在粘孢子表面上。这会造成PrS2 HSQC谱的每个峰的增宽。但是，如果结构域Y的移动受到PrS2标记的限制，也可能与PrS2融合的结构域(结构域Y)的HSQC谱的质量可收到影响。
由于该原因，认为连接PrS2标记和结构域Y的连接物在结构域Y的自由运动中起重要作用。必须确定连接物的长度如何影响结构域Y的HSQC谱的质量。我们可以使用PrS2-CspA作为模型系统，通过添加(GGGGS)n连接物(n＝1，2，3...)，首先测试该问题。预期一次一个添加该4残基序列，会为结构域Y的运动增加更多的自由度，这又将使CspA HSQC谱的峰变尖锐。通过对比该HSQC谱和纯化的CspA的HSQC谱，我们应该能优化柔性连接物的长度。在确定最佳连接物长度后，我们将证实该最佳长度是否也适用于其它模型系统。
虽然已经参照特定的实施方案描述了本发明，本领域技术人员应当明白可以进行各种变化以及可以替换等同方案，而不脱离本发明的真实的精神和范围。另外，可以进行多种修饰以便使得特定的情形、材料、物质的组成、方法、方法步骤适应于本发明的目标、精神和范围。所有这些修饰旨在属于所附的权利要求书的范围之内。
序列表
<110>The University of Medicine and Dentistry of New Jersey
<120>蛋白S融合用于蛋白增溶的用途
<130>unknown
<140>unknown
<141>2007-03-20
<160>2
<170>Patentln version 3.3
<210>1
<211>99
<212>PRT
<213>黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(93)
<223>PrS标记，M1-Y93，93个氨基酸残基
<220>
<221>SITE
<222>(94)..(99)
<223>凝血酶切割位点
<400>1
Met Ala Asn Ile Thr Val Phe Tyr Asn Glu Asp Phe Gln Gly Lys Gln
1         5             10          15
Val Asp Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Ala Ala Leu
        20          25          30
Gly Ile Glu Asn Asn Thr Ile Ser Ser Val Lys Val Pro Pro Gly Val
     35           40              45
Lys Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Phe Ala Gly Asp Gln Ile Glu
  50             55           60
Val Val Ala Asn Ala Glu Glu Leu Gly Pro Leu Asn Asn Asn Val Ser
65            70           75           80
Ser Ile Arg Val Ile Ser Val Pro Val Gln Pro Arg Tyr Leu Val Pro
          85             90            95
Arg Gly Ser
<210>2
<211>191
<212>PRT
<213>黄色
粘球菌(Myxococcus xanthus)
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(185)
<223>PrS2标记，M1-Y185，185个氨基酸残基
<220>
<221>SITE
<222>(186)..(191)
<223>凝血酶切割位点
<400>2
Met Ala Asn Ile Thr Val Phe Tyr Asn Glu Asp Phe Gln Gly Lys Gln
1         5             10           15
Val Asp Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Ala Ala Leu
        20          25           30
Gly Ile Glu Asn Asn Thr Ile Ser Ser Val Lys Val Pro Pro Gly Val
     35           40             45
Lys Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Phe Ala Gly Asp Gln Ile Glu
   50            55           60
Val Val Ala Asn Ala Glu Glu Leu Gly Pro Leu Asn Asn Asn Val Ser
65           70            75           80
Ser Ile Arg Val Ile Ser Val Pro Val Gln Pro Arg Met Ala Asn Ile
          85             90            95
Thr Val Phe Tyr Asn Glu Asp Phe Gln Gly Lys Gln Val Asp Leu Pro
        100          105         110
Pro Gly Asn Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Ala Ala Leu Gly Ile G lu Asn
     115           120           125
Asn Thr Ile Ser Ser Val Lys Val Pro Pro Gly Val Lys Ala Ile Leu
  130            135            140
Tyr Gln Asn Asp Gly Phe Ala Gly Asp Gln Ile Glu Val Val Ala Asn
145           150          155            160
Ala Glu Glu Leu Gly Pro Leu Asn Asn Asn Val Ser Ser Ile Arg Val
          165           170          175
Ile Ser Val Pro Val Gln Pro Arg Tyr Leu Val Pro Arg Gly Ser
        180           185            190

Claims (37)

1.含有多克隆位点的载体，所述多克隆位点包含编码来自黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)的PrS标记或PrS2标记的核酸序列。
2.权利要求1的载体，其中所述多克隆位点包含SEQ ID NO：1。
3.权利要求2的载体，其中所述多克隆位点包含SEQ ID NO：2。
4.权利要求1的载体，其中所述载体是高表达冷激载体。
5.权利要求4的载体，其中所述冷激载体是pColdIII载体。
6.在大肠杆菌中表达的权利要求4的载体。
7.权利要求1的载体，其中所述载体是四环素诱导型PST表达系统。
8.在哺乳动物宿主细胞中表达的权利要求7的载体。
9.权利要求8的载体，其中所述哺乳动物宿主细胞来自TREx293人胚肾细胞系。
10.提高靶蛋白的溶解度的方法，其包括：
a)使编码来自黄色粘球菌的蛋白S的至少一个N-末端结构域(PrS标记)的核酸序列与编码靶蛋白的核酸序列融合，以建立编码PrS标记的靶蛋白的核酸序列；
b)将步骤(a)的蛋白S标记的靶蛋白置于载体中；
c)用该载体转化宿主细胞；和
d)在适合基因表达的条件下，培养宿主细胞，
由此表达的PrS标记的靶蛋白比未标记的靶蛋白更易溶。
11.权利要求10的方法，其中所述核酸序列编码PrS2标记，该PrS2标记具有2个串联重复的蛋白S的N-末端结构域。
12.权利要求10的方法，其中在执行步骤(d)后，任选地使用蛋白酶从靶蛋白切割掉PrS标记。
13.权利要求10的方法，其中所述宿主细胞是原核生物。
14.权利要求1的方法，其中所述靶蛋白来自原核生物或真核生物。
15.权利要求1的方法，其中所述载体是含有多克隆位点的大肠杆菌pCold表达系统，所述多克隆位点包含编码PrS标记的靶蛋白的核酸。
16.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞是真核生物。
17.权利要求1的方法，其中所述载体是哺乳动物四环素诱导型系统。
18.权利要求1的方法，其中所述N-末端结构域核酸序列编码85-100个氨基酸残基。
19.权利要求1的方法，其中所述N-末端结构域核酸序列编码93个氨基酸残基。
20.结合到一个或多个黄色粘球菌粘孢子上的PrS-标记的蛋白分子。
21.纯化PrS-标记的或PrS2-标记的蛋白的方法，其包括：使标记的蛋白接触包含黄色粘球菌粘孢子的亲和树脂，从而将PrS-标记的或PrS2-标记的蛋白固定化在所述亲和树脂上。
22.权利要求21的方法，其中在有Ca2+或Mg2+存在下，使所述PrS-标记的或PrS2-标记的蛋白接触亲和树脂。
23.权利要求22的方法，其中通过添加螯合钙的试剂，从亲和树脂释放所述PrS-标记的或PrS2-标记的蛋白。
24.权利要求23的方法，其中螯合钙的试剂是EDTA或EGTA。
25.根据权利要求21的方法纯化的蛋白。
26.权利要求25的蛋白，其中所述蛋白是PrS-或PrS2-标记的蛋白。
27.试剂盒，其包含根据权利要求21的亲和树脂和用于纯化PrS-或PrS2-标记的蛋白的方法中的说明书。
28.根据权利要求27的试剂盒，另外包含用于产生PrS-或PrS2-标记的蛋白的组分。
29.权利要求1的方法，其中PrS-或PrS2-标记的蛋白包含在蛋白S和靶蛋白之间的连接物。
30.权利要求29的方法，其中所述连接物是多肽。
31.权利要求30的方法，其中所述多肽是3-10个氨基酸残基。
32.制备用于分析研究的靶蛋白的方法，其包括：制备PrS-或PrS2-标记的靶蛋白，和进行分析研究。
33.权利要求32的方法，其中所述分析研究选自：核磁共振波谱分析，药物筛选测定，结合测定和X-射线晶体分析或需要可溶性靶蛋白的任意研究。
34.权利要求33的方法，其中所述PrS-或PrS2-标记的靶蛋白包含在PrS标记或PrS2-标记和靶蛋白之间的连接物。
35.权利要求34的方法，其中所述连接物是多肽。
36.权利要求33的方法，其中所述分析研究是核磁共振波谱分析。
37.表征靶蛋白的方法，其包括：使至少一个PrS标记或PrS2标记融合到靶蛋白上，进行核磁共振波谱分析，和分析来自核磁共振波谱分析的数据，从而表征靶蛋白。
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