CN103520165A - 茚并三嗪类化合物作为依赖nad(p)h的醌氧化还原酶底物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一系列茚并三嗪类化合物作为依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物的用途。这一系列茚并三嗪类化合物经依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶催化发生氧化还原循环反应，产生大量活性氧自由基，诱导强烈的氧化应激，从而对依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶表达的肺癌、肝癌、宫颈癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、肾透明细胞癌、口腔表皮样癌、慢性髓原白血病、肠癌、脑癌、胃癌和食管癌等多种癌细胞有显著杀伤作用。这一系列茚并三嗪类化合物作为依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶的底物还可用作放射治疗癌症的增敏剂，具有显著地抗癌协同作用。此外，这一系列茚并三嗪类化合物作为依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物也具有抗细菌和抗真菌活性。
Description
技术领域
本发明属于药物化学和生化药理学领域，具体涉及一系列茚并三嗪类化合物作为依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物的用途。
背景技术
与其正常组织来源的细胞不同，癌细胞内的代谢发生了显著的改变，目的是维持快速的增殖速率，抵制某些细胞死亡信号，尤其是那些诱导氧化应激损伤的信号。这就意味着癌细胞比正常细胞需要消耗更多的营养物质、排出更多的废物。为了维持细胞分裂，细胞不仅需要增加体积大小还需复制DNA，这样就产生了巨大的代谢需求，消耗大量的蛋白质、脂类、核酸还有能量。合成代谢方面的需求驱动细胞增加以葡萄糖和氨基酸为主的吸收，合成细胞增殖过程中所需的原料。在过去的近一个世纪中，癌细胞代谢的改变和适应性被广泛研究，发现癌细胞中一些关键的代谢途径如糖酵解和谷氨酰胺代谢发生改变。增加对肿瘤细胞代谢改变的本质的理解，通过控制这些代谢，使之回到正常细胞，将是一种全新的癌症治疗思路。近几年来，这方面的研究已经成为国际上的热点，多个研究表明，传统上用于控制代谢类疾病的药物具有显著的抗癌效果，其中有些药物已经进入临床实验，如针对糖酵解途径中己糖激酶(Hexokinase)的2-脱氧葡萄糖（2-deoxyglucose）、氯尼达明（Lonidamine）和3-溴丙酮酸（3-bromopyruvate）；针对糖酵解途径中丙酮酸激酶(Pyruvate kinase)的TLN-232；针对丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase1，PDK1）的二氯乙酸盐（Dichloroacetate，DCA）；针对谷氨酰胺代谢的Phenylacetate；针对天冬酰胺代谢的Asparaginase和Pegasparaginase；针对精氨酸代谢的Arginine deiminase等。这些研究表明开发一些针对肿瘤细胞代谢的药物有望治疗癌症，也为临床研究提供了广阔的前景。
目前主要通过筛选或基于理性设计寻找那些针对肿瘤代谢的化合物，一些传统的方法如酶循环分析、色谱、质谱和核磁共振被用来评价细胞内代谢。然而这些方法存在一些弊端如样品需要裂解，破坏了细胞的完整性，此外分析也较繁琐需耗费大量时间，因此不适合可定量的、实时动态的高通量筛选，在活细胞或活体动物水平进行这方面的筛选更是非常困难。遗传编码的荧光探针更加适合针对代谢物的化学小分子筛选，近年来开发了一系列这样的生物探针，如ATP探针、NADH探针、葡萄糖探针、谷氨酸探针、乳酸探针。在这些代谢物中，NADH和NAD+是最重要的辅酶参与了胞内重要的能量代谢过程。长久以来，研究者主要利用微弱的NAD(P)H内源荧光测定线粒体中能量代谢状态，然而这个方法不仅无法区分NADH和NADPH，还存在诸如低灵敏度、紫外线损伤或要求复杂的仪器等缺点。近来Yellen和我们分别开发了遗传编码的NADH探针，使我们可以实时动态监测胞内NADH水平变化（Zhao,Y.等,CellMetab.2011,V.14(4),pp.555-566.Hung,Y.P.等,Cell Metab.2011,V.14(4),pp.545-554.）。然而它们存在一些缺点如对pH敏感、折叠较差或亲和力太高，更无法检测NAD+水平变化，这样一些缺点使得亟需一种新型的NADH探针应用于高通量药物筛选。
依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶(NQO1)，又称D-硫辛酰胺脱氢酶(DT-diaphorase),是真核细胞内普遍存在的一类黄素蛋白酶，定位于人类染色体16p22（Vasiliou,V.等,Hum Genomics.2006,V.2(5),pp.329-335.）。该酶利用辅酶NADH或NADPH催化醌类及其衍生物发生双电子还原反应(Lind,C.等,Methods Enzymol.1990,V.186,pp.287-301.)。人源NQO1的晶体结构显示辅酶和底物结合在NQO1相同的位点，酶促反应的机制为乒乓机制(Bianchet,M.A.等,Methods Enzymol.2004,V.382,pp.144-174.)。NQO1主要定位在细胞质中，细胞核也有少量分布。与其他哺乳动物不同的是，NQO1在正常的人肝细胞中不表达，而在肝癌中表达（Cresteil,T.等,Biochem Pharmacol.1991,V.42(5),pp.1021-1027.）。此外，在许多人实体瘤如结肠癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌中，NQO1也是高表达的，因此NQO1也可作为一个抗癌化合物设计和筛选的靶标（Siegel,D.等,Free Radic Biol Med.2000,V.29(3-4),pp.246-253.Schlager,J.J.等,Int JCancer.1990,V.45(3),pp.403-409.）。许多研究显示经典的抗癌化合物β-拉帕醌（β-lapachone）是依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶的底物，经NQO1催化发生氧化还原循环反应（先还原为氢醌，再生成半醌，最后回到原始状态。）（见流程I），产生活性氧自由基，诱导氧化应激，显著地杀伤NQO1表达的癌细胞。目前该化合物已进入临床Ⅱ期(Trachootham,D.等,Nat Rev Drug Discov,2009,V.8(7),pp.579-591.)。
MadB（modulator of drug activity B）蛋白最初由于在大肠杆菌中过量表达时可以保护细菌免受DMP840、adriamycin和etoposide毒性作用而被鉴定出来（Chatterjee,P.K.等,Proc Natl Acad Sci U S A.1995,V.92(19),pp.8950-8954）。后来研究表明MadB蛋白也具有类似NQO1的功能，可以还原代谢menadione（2-甲基-1,4-萘醌）进行脱毒（Hayashi,M.等,Biochim Biophys Acta.1996,V.1273(2),pp.165-170.）。在0.2-0.3mM menadione存在的情况下，细菌胞质组分的MadB蛋白表达量增加20倍以上（Hayashi,M.等,Biochim Biophys Acta.1990,V.1035(2),pp.230-236.），进一步的研究也显示MadB也是一种依赖FAD和NADPH的蛋白（Hayashi,M.等,Biochim Biophys Acta.1996,V.1273(2),pp.165-170.）。在许多细菌中，都含有类似NQO1依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶，这些酶同样可以催化一些化合物发生氧化还原循环反应，产生氧化应激。
在真菌如酿酒酵母中，有5个基因可以响应低温条件增加蛋白表达量。X-射线晶体结构显示低温响应基因（Low Temperature Responsive，LOT）编码的一种蛋白，称为Lot6p，具有类似于哺乳动物细胞中NQO1的功能，以NADH和NADPH为电子供体，经“乒乓”机制催化还原醌类化合物（Sollner,S.等,Biochemistry.2009,V.48(36),pp.8636-8643.）。在许多真菌中，也含有类似NQO1依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶，这些酶同样可以催化一些化合物发生氧化还原循环反应，产生氧化应激。
由化学合成的PDK1/AKT/Flt3双通路抑制剂KP372-1，是一个可以穿透细胞膜的多靶标激酶抑制剂，它由6H-吲哚并[1,2-e]四氮唑并[1,5-b][1,2,4]三嗪-6-酮（KP372-1A）和10H-吲哚并[1,2-e]四氮唑并[1,5-b][1,2,4]三嗪-10-酮（KP372-1B）两个异构体组成（见表1）。体外激酶活性分析实验显示它呈剂量依赖性地抑制PDK1、AKT和Flt3激酶的活性。
表1
目前仅有的几篇文章报道，KP372-1是一种AKT抑制剂，被证明主要通过阻止AKT上473位丝氨酸和308位苏氨酸的磷酸化来抑制AKT活性，从而达到抑制甲状腺癌细胞、胶质母细胞瘤、急性骨髓性白血病细胞和头颈部鳞状细胞癌增殖的目的，并诱发细胞凋亡(Mandal，M.等，Br J Cancer.2005,V.92(10),pp.1899-1905.Koul，D.等，Mol Cancer Ther.2006,V.5(3),pp.637-644.Zeng，Z.等，Cancer Res.2006,V.66(7),pp.3737-3746.Mandal，M.等，Oral Oncol.2006,V.42(4),pp.430-439)。
先前的专利文献WO2002002562A2和US7196083B2针对蛋白激酶AKT合成了一系列茚并三嗪类化合物作为其抑制剂。
本发明人在利用NADH探针进行高通量筛选中，发现了一种以往被称作PDK1/AKT/Flt3双通路抑制剂的化合物——KP372-1可以显著降低癌细胞中NADH水平，从该化合物开始对大量茚并三嗪类化合物进行了研究，确认该类化合物可以作为醌氧化还原酶的底物，诱导细胞产生氧化应激，从而导致癌细胞的死亡。
因此，本发明的目的是提供茚并三嗪类化合物作为依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物的用途，进而提供该类化合物在制备抗癌、放疗增敏、抗细菌和抗真菌药物上的应用。
发明内容
本发明提供式I所示茚并三嗪类化合物作为依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物的用途
其中，w、v、x、y和z选自C或N，条件为它们不同时为C；
w、v、x、y和z形成的环是饱和的或不饱和的；
R1，R2，R3和R4各自独立地选自氢、低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基、卤素和芳基，或任何两个相邻的R1，R2，R3和R4结合在一起形成5、6或7元碳环。
本发明提供的式I所示茚并三嗪类化合物的用途中，优选的式I所示茚并三嗪类化合物中，w选自C或N；v和x为N，必要时带有一个H原子；y和z选自N和C，必要时带有一个H原子；w、v、x、y和z形成的环是不饱和五元环；R1，R2，R3和R4各自独立地选自氢、低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基、卤素和芳基，或任何两个相邻的R1、R2、R3和R4结合在一起形成5、6或7元碳环。
本发明提供的式I所示茚并三嗪类化合物的用途中，更优选的式I所示茚并三嗪类化合物中，w选自C或N；v和x为N；y和z中一个为N，另一个为C；w、v、x、y和z形成的环是不饱和五元环；R1，R2，R3和R4各自独立地选自氢、低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基、卤素和芳基，或任何两个相邻的R1、R2、R3和R4结合在一起形成5、6或7元碳环。
本发明提供的式I所示茚并三嗪类化合物的用途中，进一步优选的式I所示茚并三嗪类化合物中，w选自C或N；v和x为N；y和z中一个为N，另一个为C；w、v、x、y和z形成的环是不饱和五元环；R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、甲基、甲氧基、甲硫基、卤素和芳基，或任何两个相邻的R1、R2、R3和R4结合在一起形成一个六元碳环。
本发明提供的式I所示茚并三嗪类化合物的用途中，更进一步优选的式I所示茚并三嗪类化合物中，w选自C或N；v和x为N；y和z中一个为N，另一个为C；w、v、x、y和z形成的环是不饱和五元环；R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、甲基、甲氧基、甲硫基、卤素和苯基，或R2和R3结合在一起形成一个六元碳环。
上述式I所示茚并三嗪类化合物的定义中，低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基分别为C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和C1-C4烷硫基；较佳的为C1-C3烷基、C1-C3烷氧基和C1-C3烷硫基；更佳的为C1-C2烷基、C1-C2烷氧基和C1-C2烷硫基。在一些实施例中，分别为甲基、甲氧基和甲硫基。
本发明还提供式I所示茚并三嗪类化合物在制备针对依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物的氧化还原循环剂上的用途。
本发明还提供式I所示茚并三嗪类化合物在制备针对依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物的抗癌剂上的用途。
本发明还提供式I所示茚并三嗪类化合物在制备针对依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物的放疗增敏剂上的用途。
本发明还提供式I所示茚并三嗪类化合物在制备针对依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物的抗细菌剂上的用途。
本发明还提供式I所示茚并三嗪类化合物在制备针对依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物的抗真菌剂上的用途。
本发明克服了对茚并三嗪类化合物原有的认识(作为蛋白激酶抑制剂)，创新性地证明依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶是这些类似物的靶标，从而使这类化合物成为具有抗癌、放疗增敏、抗细菌和抗真菌等作用的先导化合物。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1-A显示NADH探针的胞浆定位；图1-B显示正常细胞和各种癌细胞内NADH的水平。
图2显示KP372-1显著降低癌细胞中NADH的水平。
图3显示KP372-1具有广谱抗癌作用。
图4-1显示KP372-1抗癌的分子机理—KP372-1诱导细胞产生强烈的氧化应激。
图4-2显示KP372-1抗癌的分子机理—KP372-1并非通过抑制PDK1、AKT和Flt3激酶活性诱导NADH氧化产生氧化应激。
图4-3显示KP372-1抗癌的分子机理—KP372-1依赖胞内靶标NQO1，诱导产生氧化应激导致细胞死亡。
图5显示一系列茚并三嗪类化合物也是NQO1的底物
图6显示在活体动物水平KP372-1也能显著抑制肿瘤的生长。
图7显示茚并三嗪类化合物具有潜在的抗细菌和抗真菌活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实验材料和试剂
细胞培养
人非小细胞肺癌细胞NCI‐H1299由华东理工大学熊志奇教授赠送，人肝癌细胞BEL‐7404由华东理工大学叶邦策教授赠送，人原位胰腺腺癌细胞BxPC‐3、人高转移肺癌细胞95‐D、人食管癌细胞TE‐1、人前列腺癌细胞PC‐3、人肺腺癌细胞SPC‐A‐1购自中科院上海细胞库，人肺腺鳞癌细胞NCI‐H596购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，人慢性髓原白血病细胞K‐562、人鼻咽癌细胞CNE‐1和CNE‐2、人肾透明细胞癌细胞CaKi‐2本实验保存，人胃癌细胞MKN‐45、人胃癌细胞MGC80‐3由华东理工大学刘建文教授赠送，人支气管上皮细胞BEAS‐2B购自上海拜力生物科技有限公司、人肝细胞QSG‐7701由华东理工大学史萍教授赠送，生长于含10%胎牛血清（Gibco）的RPMI‐1640培养基中；人胚肾细胞HEK293购自中科院上海细胞库，人脑星形胶质母细胞瘤U‐87、人宫颈癌细胞Hela由华东理工大学熊志奇教授赠送，人口腔表皮样癌细胞KB本实验室保存，人结肠腺癌细胞LS174T、人乳腺癌细胞MCF‐7购自中科院上海细胞库，人乳腺癌细胞MDA‐MB‐468由华东理工大学曹旭妮赠送，生长于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中；人肺癌细胞A549购自中科院上海细胞库，生长于含10%胎牛血清（Gibco）的F12K培养基中；人乳腺上皮细胞MCF‐10A由中科院生物物理研究所袁增强研究员赠送，生长于含5%马血清（Gibco），20ng/ml表皮生长因子（invitrogen），0.5mg/ml氢化可的松，100ng/ml霍乱毒素，10μg/ml胰岛素的DMEM/F12培养基中；人羊膜间充质干细胞hAMSC由华东理工大学谭文松教授提供，生长于含10%胎牛血清（Gibco）的a‐MEM培养基中，所有细胞培养于含5%CO2，37℃培养箱中，隔天换液，70‐80%融合度时传代。
其它材料和试剂：KP372‐1购自美国Echelon公司；细胞培养和转染所使用的胎牛血清、培养基、胰酶、青霉素/链霉素、Lipofectamine2000、Opti‐Mem、丙酮酸钠来自美国英俊公司（Invitrogen）；磷酸盐缓冲溶液（PBS）来自美国赛黙飞世尔公司（Thermo Scientific）；细胞培养皿、培养板和移液管来自美国康宁公司（Corning）；96孔全黑板来自德国葛莱娜公司（Greiner）；细胞增殖/毒性检测试剂盒CCK‐8购自日本同仁化学（Dojindo）；除特别标注，其他均来自上海国药集团化学试剂有限公司(中国上海)。
实施例1癌细胞胞浆中NADH水平明显较高
20世纪30年代，德国生物化学家奥托·瓦伯格发现，肿瘤细胞与正常细胞存在着代谢差异，它们通过糖酵解产生能量，并产生大量的副产品—乳酸（Warburg,O.等，Science.1956,V.123(3191),pp.309-314.）。这种代谢性质使得肿瘤细胞的耗糖速度远大于正常细胞。这种肿瘤细胞对糖酵解通路产能依赖增强的现象，称为“瓦伯格效应”，它会极快地促进细胞增生和肿瘤生长（Clower,C.V.等，Proc Natl Acad Sci USA.2010,V.107(5),pp.1894-1899.）。先前利用NADH自发荧光的方法，发现肿瘤细胞中NADH水平相对较高（Villette,S.等，Photochem Photobiol Sci.2006,5(5),pp.483-492.Uppal,A.等，Biotechnol ApplBiochem.2003,37(Pt1),pp.45-50.）。为了更好地理解和研究肿瘤细胞和正常细胞的能量代谢差异，我们转染NADH探针到不同细胞中。荧光遍布整个细胞，显示了很好的胞浆定位（图1-A）。利用微孔板酶标仪测定探针双激发单发射荧光比率时发现，4种正常细胞BEAS-2B、QSG-7701、HEK293和hAMSC的420/485荧光比率较低（图1-B），与纯化的蛋白质相似，这表明胞浆内NADH含量是非常的低的，这一结果与我们先前文章报道的一致（Zhao,Y.等,CellMetab.2011,V.14(4),pp.555-566.）。进一步实验也显示5种癌细胞H1299、U-87、MDA-MB-468、95-D和TE-1的荧光比率较高（图1-B）。综上实验结果显示：与4种正常细胞相比，癌细胞胞浆中NADH水平明显较高。这表明肿瘤细胞代谢类型可能已经发生转换，从依赖线粒体的氧化磷酸化转变为无氧糖酵解。
实施例2KP372-1显著降低癌细胞中NADH水平
我们利用NADH探针进行高通量筛选，发现了一种以往被称作PDK1/AKT/Flt3双通路抑制剂的化合物——KP372-1（表1）可以显著降低癌细胞中NADH水平（图2）。将稳定表达NADH探针的H1299细胞株与不同浓度的KP372-1混合（0μM、0.01μM、0.02μM、0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、1.0μM、2.0μM、5.0μM、10μM），添加到全黑的96孔板中，利用多功能酶标仪测定NADH探针420nm/485nm荧光变化，确定KP372-1在0.5μM即可将胞内NADH水平降到最低水平，且比常见的氧化剂H2O2、Aldrithiol-2和diamide强约2000倍（图2）。
实施例3KP372-1具有广谱抗癌作用
为了进一步分析KP372-1的抗癌效果，我们又分别测试了KP372-1对不同组织来源癌细胞细胞增殖的影响，这些癌细胞包括：人肝癌细胞BEL-7404、人脑星形胶质母细胞瘤U87、人高转移肺癌细胞95-D、人非小细胞肺癌细胞NCI-H1299、人肺腺癌细胞SPC-A-1、人肺癌细胞A549、人原位胰腺腺癌细胞BxPC-3、人慢性髓原白血病细胞K562、人乳腺癌细胞MCF-7、人乳腺癌细胞MDA-MB-468、人前列腺癌细胞PC-3、人口腔表皮样癌细胞KB、人食管癌细胞TE-1、人胃癌细胞MKN-45、人胃癌细胞MGC80-3、人结肠腺癌细胞LS174T、人鼻咽癌细胞CNE-1和CNE-2、人肾透明细胞癌细胞CaKi-2和人Hela宫颈癌细胞。试验中以人胚肾细胞HEK293、人羊膜间充质干细胞hAMSC、人肝细胞QSG-7701和人乳腺上皮细胞MCF-10A作为正常对照细胞。将各种细胞以每孔3×103的密度接种在96孔板中，培养18-20h后，按0，0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM最终浓度梯度加入KP372-1。药物处理48h后，用细胞增殖/毒性检测试剂盒CCK-8测不同孔A450nm吸收。实验结果显示，KP372-1能够大大抑制不同癌细胞的增殖，IC50值在100nM-400nM范围之内（图3）。实验结果表明，KP372-1是非常有效的抗癌先导化合物，具有广谱的抗癌作用和较低的毒性。
实施例4KP372-1抗癌的分子机理
（1）KP372-1诱导细胞产生强烈的氧化应激
为了研究KP372-1怎样调控癌细胞代谢，我们利用遗传编码的NADH探针、过氧化氢探针Hyper和对氧化还原敏感的绿色荧光蛋白（reduction-oxidationsensitive GFP，roGFP）系统检测KP372-1对H1299细胞内NADH、H2O2和巯基氧化水平的影响（Belousov,V.V.等，Nat Methods.2006,V.3(4),pp.281-286.Dooley,C.T.等，J Biol Chem.2004,V.279(21),pp.22284-22293.）。roGFP只有一对巯基，可通过巯基和二硫键之间的转换响应环境中氧化还原条件的变化，因此roGFP实际上反应的是蛋白质巯基的氧化即二硫键的形成。将pIRES-neo2-cyt-Hyper和pEGFP（roGFP1）-N1-cyt质粒分别转染H1299细胞，实验结果显示，KP372-1促使细胞产生大量过氧化氢（图4-1-A）、促进蛋白质巯基氧化形成二硫键（图4-1-B）。KP372-1的氧化能力比H2O2和已知报道的两种巯基强氧化剂Aldrithiol-2和Diamide高2-3个数量级（图4-1-A和图4-1-B）。动力学实验结果显示KP372-1诱发氧化应激事件的顺序依次是：首先降低胞浆内NADH水平，其次是增加H2O2生成，促使胞内巯基氧化形成二硫键。综上实验结果表明，KP372-1显著影响胞内氧化还原系统，且NAD(P)H氧化是首发事件（图4-1-C）。
（2）KP372-1并非通过抑制PDK1、AKT和Flt3激酶活性诱导NADH氧化产生氧化应激
先前研究报道，KP372-1是一个可以抑制PDK1、AKT和Flt3激酶活性的多靶标抑制剂（Zeng，Z.等，Cancer Res.2006,V.66(7),pp.3737-3746.）。为了验证KP372-1是否是通过抑制这3种激酶的活性而影响癌细胞代谢和氧化还原系统，我们利用已知的2种PDK1抑制剂（BX795和BX912）、9种Akt抑制剂（Akt-I-1、Akt-I-1,2、GSK690693、BML-257、Akt抑制剂IV、Akt抑制剂V、Akt抑制剂VIII、Akt抑制剂X、Akt抑制剂XII）和1种Flt3抑制剂（AC220）分别单独和组合处理H1299-Cyt-NADH探针、H1299—Cyt-cpYFP和H1299-Cyt-roGFP1细胞，每种药物浓度均为1μM，由于有个别组合药物改变胞内pH（图4-2-B），我们进行了pH矫正，结果显示所有单独或组合药物对NADH探针和roGFP1荧光值影响较小（图4-2-A-D）。综上实验结果表明，KP372-1并非通过抑制PDK1、AKT和Flt3激酶活性降低胞内NADH水平产生氧化应激。
（3）KP372-1依赖胞内靶标NQO1，诱导产生氧化应激导致细胞死亡
KP372-1可能通过激活依赖NAD(P)H的一些酶产生活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）。为了研究是否涉及这个机制，我们接下来探索若干个氧化酶的功能，这些酶涉及NAD(P)H的氧化产生ROS，包括NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、ENOX1、ENOX2、NQO1、NQO2等。实验结果显示只有过量表达NQO1可以显著增加KP372-1的作用：促使NADH氧化、H2O2生成、巯基氧化和细胞死亡（图4-3-A）。作为NQO1的特异性抑制剂，Dicumarol大大抑制KP372-1诱导的氧化应激事件，与之相反，NAD(P)H氧化酶、ENOX1、ENOX2、NQO2、线粒体复合体Ⅰ、黄嘌呤氧化酶、一氧化氮合成酶的抑制剂对KP372-1诱导的氧化应激事件影响较小（图4-3-B）。图3-A显示人乳腺癌细胞MDA-MB-468和人肺腺鳞癌细胞NCI-H596基本上对KP372-1不敏感，Western Blot实验显示这两种细胞不表达NQO1（图4-3-C）。通过过量表达NQO1，我们发现这两种细胞对KP372-1的敏感度大大增加，细胞死亡率显著提高（图4-3-D）。综上实验结果表明，KP372-1依赖胞内NQO1活性，诱导产生氧化应激导致细胞死亡。这不仅克服了目前对该化合物原有的认识---主要用作PDK1、AKT和Flt3激酶的抑制剂，还大大丰富了KP372-1这个先导化合物在抗癌方面的应用。
实施例5一系列茚并三嗪类化合物也是NQO1的底物
除了KP372-1A和KP372-1B，我们接下来测试专利文献WO2002002562A2和US7196083B2中公开的针对蛋白激酶AKT合成的一系列茚并三嗪类化合物。细胞活力分析显示NQO1过量表达对不符合通式I的29种化合物基本无影响，而显著增加符合通式I的34种茚并三嗪类化合物抑制H1299细胞增殖的能力（表2和表3）；另一方面NQO1特异性抑制剂Dicumarol与这34种化合物共同孵育显著降低了这些化合物对H1299的毒性，增加IC50值（表3）。利用纯化的NQO1蛋白质，我们发现这些化合物也显著依赖NQO1介导的NADH和NADPH氧化反应（图5）。
表2一系列不符合通式I的茚并三嗪类化合物与KP372-1比较
表3一系列符合通式I的茚并三嗪类化合物与KP372-1比较
综上实验结果表明，这些茚并三嗪类化合物也是NQO1底物，提示它们以NQO1为靶标，依赖NQO1进行氧化还原循环，产生氧化应激，也可作为潜在的先导化合物用于癌症的治疗。
实施例6KP372-1在活体动物水平也具有显著的抗癌效果
为了更好地评估KP372-1在活体动物水平的抗癌药效，我们首先进行了药物代谢动力学研究（图6-A），结果显示通过静脉注射或灌胃给药，KP372-1具有生物利用度高、清除率相对低、半衰期长和体内分布广等特点（表4）。
表4BALB/c小鼠静脉注射及灌胃给予KP372-1后的药物代谢动力学参数
*F=(AUClast-PO*DoseIV)/(AUClast-IV*DosePO)=(AUClast-灌胃*剂量静脉注射)/(AUClast-静脉注射*剂量灌胃)
AUClast:0点到末端时间点的血药浓度-时间曲线下面积
AUCINF:0点到无穷的血药浓度-时间曲线下面积
接下来我们研究KP372-1如何影响H1299细胞形成移植瘤。首先将24只BALB/c裸鼠每只皮下接种0.2ml含5×106的H1299细胞悬液，随机分成3组，每组8只，分别设为对照组、低剂量组（10mg/kg）、高剂量组（20mg/kg）。接种细胞的第二天即采用灌胃给药的方式开始给药，给药频率为每天1次。经过33天的治疗，发现中剂量组和高剂量组的肿瘤生长大大被抑制（图6-B），证明KP372-1在活体动物水平也具有很好的抗癌药效。
实施例7KP372-1对动物体没有毒性
为了测试KP372-1对活体动物的安全性,我们系统评价了其对小鼠体重、组织损伤、血液生化指标（如谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肌酐（Creatinine）、血红蛋白（Hemoglobin））等方面的影响。经过34天的给药，结果显示：1）与对照组相比，中剂量组和高剂量组的小鼠体重基本无变化；2）KP372-1对评价肝功能的ALT和AST水平、肾功能的肌酐水平、血液毒性的血红蛋白水平也影响较小（表5）。3）苏木精—伊红染色（HE染色）实验显示KP372-1对小鼠体内脏器如心脏、肝脏、肺和肾脏无任何损伤。综上所述，KP372-1对活体动物没有明显毒性，具有良好的生物安全性。
表5KP372-1对肝肾功能和血红蛋白的影响
以上生物化学、基础药理学、药代动力学、毒理学和实验治疗学的研究为进入临床试验提供了充分的依据。
实施例8茚并三嗪类化合物是潜在的抗癌放射治疗增敏剂
先前研究显示放射可以增加癌细胞中NQO1表达量和活性（Choi,E.K.等,Neoplasia.2007,V.9(8),pp.634-642.）。接下来我们测试了5个化合物在10-戈瑞X-射线放射条件下的抗癌作用。首先将BALB/c裸鼠每只皮下接种0.2ml含5×106的A549细胞悬液，待肿瘤体积达到100mm3左右，随机分成74组，每组4只，分别设为对照组、放疗组（10-戈瑞（Gy））、药物组（50mg/kg）、药物+放疗组（50mg/kg+10-戈瑞）。实验条件：放射治疗--采取肿瘤部位一次性10-戈瑞放射剂量；化学治疗--5种化合物采取50mg/kg单次灌胃给药；联合治疗：同时采取上述两种治疗。经过31天的观察，我们发现联合治疗起到最佳的抗癌效果（表6）。
表6茚并三嗪类化合物的放疗增敏作用
| 肿瘤体积（mm3） | 肿瘤体积（mm3） | ||
| 对照 | 959±30 | 10戈瑞 | 694±25 |
| KP372-1A | 350±10 | 10戈瑞+KP372-1A | 68±7 |
| KP372-1B | 350±12 | 10戈瑞+KP372-1B | 68±9 |
| KP372-1A-001 | 440±15 | 10戈瑞+KP372-1A-001 | 85±8 |
| KP372-1B-001 | 440±13 | 10戈瑞+KP372-1B-001 | 85±7 |
| KP372-1A-002 | 204±15 | 10戈瑞+KP372-1A-002 | 39±6 |
| KP372-1B-002 | 204±13 | 10戈瑞+KP372-1B-002 | 39±5 |
| KP372-1A-003 | 200±11 | 10戈瑞+KP372-1A-003 | 38±4 |
| KP372-1B-003 | 200±12 | 10戈瑞+KP372-1B-003 | 38±5 |
| KP372-1A-004 | 195±15 | 10戈瑞+KP372-1A-004 | 37±4 |
| KP372-1B-004 | 195±13 | 10戈瑞+KP372-1B-004 | 37±12 |
| KP372-1A-005 | 209±15 | 10戈瑞+KP372-1A-005 | 40±3 |
| KP372-1B-005 | 209±17 | 10戈瑞+KP372-1B-005 | 40±4 |
| KP372-1A-006 | 222±11 | 10戈瑞+KP372-1A-006 | 43±5 |
| KP372-1B-006 | 222±10 | 10戈瑞+KP372-1B-006 | 43±3 |
| KP372-1A-007 | 231±16 | 10戈瑞+KP372-1A-007 | 45±3 |
| KP372-1B-007 | 231±13 | 10戈瑞+KP372-1B-007 | 45±5 |
| KP372-1A-008 | 468±11 | 10戈瑞+KP372-1A-008 | 90±7 |
| KP372-1B-008 | 468±12 | 10戈瑞+KP372-1B-008 | 90±9 |
| KP372-1A-009 | 459±18 | 10戈瑞+KP372-1A-009 | 89±8 |
| KP372-1B-009 | 459±22 | 10戈瑞+KP372-1B-009 | 89±9 |
| KP372-1A-010 | 468±19 | 10戈瑞+KP372-1A-010 | 90±7 |
| KP372-1B-010 | 468±23 | 10戈瑞+KP372-1B-010 | 90±6 |
| KP372-1A-011 | 450±21 | 10戈瑞+KP372-1A-011 | 87±8 |
| KP372-1B-011 | 450±12 | 10戈瑞+KP372-1B-011 | 87±9 |
| KP372-1A-012 | 195±12 | 10戈瑞+KP372-1A-012 | 37±5 |
| KP372-1B-012 | 195±18 | 10戈瑞+KP372-1B-012 | 37±4 |
| KP372-1A-013 | 218±17 | 10戈瑞+KP372-1A-013 | 42±3 |
| KP372-1B-013 | 218±16 | 10戈瑞+KP372-1B-013 | 42±4 |
| KP372-1A-014 | 222±13 | 10戈瑞+KP372-1A-014 | 43±4 |
| KP372-1B-014 | 222±11 | 10戈瑞+KP372-1B-014 | 43±5 |
| KP372-1A-015 | 313±17 | 10戈瑞+KP372-1A-015 | 60±6 |
| KP372-1B-015 | 313±19 | 10戈瑞+KP372-1B-015 | 60±7 |
| KP372-1A-016 | 322±18 | 10戈瑞+KP372-1A-016 | 62±5 |
| KP372-1B-016 | 322±15 | 10戈瑞+KP372-1B-016 | 62±5 |
| KP372-1A-017 | 272±21 | 10戈瑞+KP372-1A-017 | 53±4 |
| KP372-1B-017 | 272±26 | 10戈瑞+KP372-1B-017 | 53±5 |
结果表明，茚并三嗪类化合物是潜在的放射治疗增敏剂。
实施例9茚并三嗪类化合物具有潜在的抗细菌和抗真菌活性
许多研究表明，大肠杆菌来源的MdaB蛋白（Adams,M.A.等,ActaCrystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.2005,V.61(Pt2),pp.235-238.）和真菌如酵母细胞来源的Lot6蛋白（Sollner,S.等,Biochemistry.2009,V.48(36),pp.8636-8643）与哺乳动物细胞来源的NQO1蛋白具有相似的功能。接下来我们研究茚并三嗪类化合物是否也能依赖MdaB或Lot6蛋白，产生大量活性氧自由基，诱导氧化应激，抑制细菌和真菌的生长。利用细菌来源的MdaB蛋白，发现茚并三嗪类化合物大大加速依赖MdaB的NAD(P)H氧化（图7-A），增殖实验显示这些化合物显著抑制细菌的生长（图7-B）。接下来我们对真菌增殖进行测试，发现茚并三嗪类化合物也可大大加速依赖Lot6的NAD(P)H氧化（图7-C），产生氧化应激，从而抑制真菌的生长（图7-D）。我们选取有代表性的7个化合物进一步评价对其他病原细菌和真菌增殖的作用，发现茚并三嗪类化合物具有广谱的抗菌作用（表7和表8）。综上实验结果表明，茚并三嗪类化合物作为依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物具有潜在的抗真菌和抗细菌的活性。
表7茚并三嗪类化合物具有抗细菌作用
表8茚并三嗪类化合物具有抗真菌作用
鉴于以上茚并三嗪类化合物对正常细胞和癌细胞优越的选择性、抗癌、抗细菌和抗真菌的有效性、施药的便利性、良好的生物安全性，将使其成为非常有前景的先导化合物。
其它实施方式
本说明书描述了许多实施方式。然而应理解，本领域技术人员通过阅读本说明书获知不背离本发明的构思和范围的各种改进。因此，这些其他实施方式也应包括在所附权利要求书的范围内。
Claims (11)
1.式I所示茚并三嗪类化合物作为依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物的用途
其中，w、v、x、y和z选自C或N，条件为它们不同时为C；
w、v、x、y和z形成的环是饱和的或不饱和的；
R1，R2，R3和R4各自独立地选自氢、低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基、卤素和芳基，或任何两个相邻的R1，R2，R3和R4结合在一起形成5、6或7元碳环。
2.如权利要求1所述的用途，其中式I所示茚并三嗪类化合物中，
w选自C或N；v和x为N，必要时带有一个H原子；y和z选自N和C，必要时带有一个H原子；w、v、x、y和z形成的环是不饱和五元环；R1，R2，R3和R4各自独立地选自氢、低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基、卤素和芳基，或任何两个相邻的R1、R2、R3和R4结合在一起形成5、6或7元碳环。
3.如权利要求1所述的用途，其中式I所示茚并三嗪类化合物中，
w选自C或N；v和x为N；y和z中一个为N，另一个为C；w、v、x、y和z形成的环是不饱和五元环；R1，R2，R3和R4各自独立地选自氢、低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基、卤素和芳基，或任何两个相邻的R1、R2、R3和R4结合在一起形成5、6或7元碳环。
4.如权利要求1所述的用途，其中式I所示茚并三嗪类化合物中，
w选自C或N；v和x为N；y和z中一个为N，另一个为C；w、v、x、y和z形成的环是不饱和五元环；R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、甲基、甲氧基、甲硫基、卤素和芳基，或任何两个相邻的R1、R2、R3和R4结合在一起形成一个六元碳环。
5.如权利要求1所述的用途，其中式I所示茚并三嗪类化合物中，
w选自C或N；v和x为N；y和z中一个为N，另一个为C；w、v、x、y和z形成的环是不饱和五元环；R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、甲基、甲氧基、甲硫基、卤素和芳基，或R2和R3结合在一起形成一个六元碳环。
6.式I所示茚并三嗪类化合物在制备针对依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物的生化试剂或药物上的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其中式I所示茚并三嗪类化合物用于制备针对依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物的氧化还原循环试剂。
8.如权利要求6所述的用途，其中式I所示茚并三嗪类化合物用于制备针对依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物的抗癌剂。
9.如权利要求6所述的用途，其中式I所示茚并三嗪类化合物用于制备针对依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物的放疗增敏剂。
10.如权利要求6所述的用途，其中式I所示茚并三嗪类化合物用于制备针对依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物的抗细菌剂。
11.如权利要求6所述的用途，其中式I所示茚并三嗪类化合物用于制备针对依赖NAD(P)H的醌氧化还原酶底物的抗真菌剂。
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