CN101611036A - 新的半胱氨酸蛋白酶四环抑制剂、其药物组合物和它们的治疗应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的式(I)的化合物、它们的制备方法和它们的治疗用途，式(I)其中R3、R4、R5、R6、Y、Het1、T、U、V、W、X、Ru、Rv和Rw如权利要求1所定义。
Description
本发明涉及新的半胱氨酸蛋白酶抑制剂、它们的制备方法和它们的治疗用途。
蛋白酶可以根据它们的底物特异性或催化机制进行分类。基于肽水解的机制，已知5种主要的蛋白酶类别：丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和金属蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶特别包括去泛素化酶、胱天蛋白酶、组织蛋白酶、钙蛋白酶以及病毒、细菌或寄生虫的半胱氨酸蛋白酶。
去泛素化酶包括泛素特异性蛋白酶(USP)和泛素羧基末端水解酶(Ubiquitin Carboxy Hydrolase)(UCH)。一般而言，泛素途径调节蛋白降解，更具体地，其涉及癌症、神经退行性疾病(例如阿尔兹海默氏病、帕金森病)、炎症、病毒传染性和潜伏(特别是对于单纯疱疹病毒-1、EB病毒和SARS冠状病毒)、或涉及心血管疾病(Chem.Rev.1997，97，p.133-171；Chem.Rev.2002，102，p.4459-4488；J.Biochem.2003，134，p.9-18；J.Virology，2005，79(7)，p.4550-4551；Cardiovasc.Res.2004，61，p.11-21)。
已表明，胱天蛋白酶涉及凋亡，因此是肝炎、肝衰竭、炎症、心肌缺血和衰竭、肾衰竭、神经退行性变、耳聋、糖尿病或卒中的靶点(J.Pharmacol Exp.Ther.，2004，308(3)，p.1191-1196，J.Cell.Physiol.，2004，200(2)，p.177-200；Kidney Int，2004，66(2)，p.500-506；Am.J.Pathol.，2004，165(2)，p.353-355；Mini Rev.Chem.，2004，4(2)，p.153-165；Otol.Neurotol.，2004，25(4)，p.627-632；Ref.7，21，22，23，24，25)。
已表明，组织蛋白酶一般涉及癌症和转移、炎症、免疫/免疫调节(Eur.Respir.J.，2004，23(4)，p.620-628)和动脉粥样硬化(Ageing Res.Rev..2003，2(4)，p.407-418)。更具体地，组织蛋白酶包括涉及癌症和转移以及关节炎的组织蛋白酶B和B样组织蛋白酶(Cancer Metastasis Rev.，2003，22(2-3)，p.271-286；Biol.Chem.，2003，384(6)，p.845-854和Biochem.Soc.Symp.，2003，70，p.263-276)、特别涉及癌症和转移的组织蛋白酶D(Clin.Exp.Metastasis，2004，21(2)，p.91-106)、在骨质疏松和关节炎中起作用的组织蛋白酶K(Int.J.Pharm.，2004，277(1-2)，p.73-79)、已表明在免疫学抗原呈递中起作用的组织蛋白酶S(Drug News Perspective，2004，17(6)，p.357-363)。
钙蛋白酶一般在衰老(Ageing Res.Rev.2003，2(4)，p.407-418)、以及更特别地在糖尿病(Mol.Cell.Biochem.，2004，261(1)，p.161-167)和白内障(Trends Mol.Med.，2004，10(2)，p.78-84)中起作用。
已在鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、腺病毒或SARS冠状病毒中鉴定出病毒半胱氨酸蛋白酶(Chem.Rev.1997，97，p.133-171；Chem.Rev.2002，102，p.4459-4488；J.Virology，2005，79(7)，p.4550-4551和Acta Microbiol.Immunol.Hung.，2003，50(1)，p.95-101)。
细菌半胱氨酸蛋白酶包括链球菌热源性毒素(streptopain)、葡萄球菌半胱氨酸蛋白酶、梭菌蛋白酶或牙龈菌蛋白酶；亦已表明，酵母菌例如黄曲霉表达半胱氨酸蛋白酶，其可以构成毒力因子(Chem.Rev.1997，97，p.133-171)。
寄生虫半胱氨酸蛋白酶已在例如Molecular & Biochemical Parasitology(2002，120，p.1-21)和Chem.Rev.(2002，102，p.4459-4488)中综述。值得注意的是，造成大多数主要的寄生虫病的寄生虫物质在它们的感染、滋养或生殖周期的某些时候会利用它们自己的半胱氨酸蛋白酶；这样的疾病包括疟疾、美洲锥虫病、非洲锥虫病、利什曼病、贾第虫病、滴虫病、阿米巴病、隐孢子虫病、弓形虫病、血吸虫病、片形吸虫病、盘尾丝虫病和由某些其它扁虫或线虫引起的其它感染。
因此，鉴别新类别的半胱氨酸蛋白酶抑制剂在多种疾病和病态情况中是非常重要的。
US 6514927、WO01/79209和WO02/02562公开了包含4个稠合的环的化合物。但是，并未提出它们作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂的用途。
根据第一个目的，本发明涉及式(I)的化合物：
其中：
适当时是单键或双键；
------适当时不存在或是单键；
其中
和
通过T和X稠合在一起；
Y是N-OR1、NR′1、CR2R′2；
R1是H、烷基、烯基、烷氧基烷基、芳氧基烷基、芳烷基、烷氧羰基烷基、羧烷基；
R′1是H、烷基、芳基或芳烷基；
R2、R′2各自相同或不同，且独立地选自H、烷基、芳基或芳烷基；
T、U、V、W、X相同或不同，且可选自C、N、O、S；
Ru、Rv、Rw相同或不同，且可选自H、CN、＝O、Hal、Alk、OAlk、OH、NRCN、C(CN)＝C(OH)(OAlk)、SR、NRR’、C(O)NRR’、杂环、芳基、杂芳基、环烷基，其中Alk、芳基、杂芳基、杂环、环烷基任选地被Hal、NRR’、CN、OH、CF3、芳基、杂芳基、OAlk取代；
R3、R4、R5、R6各自相同或不同，且独立地选自H、OAlk、Alk、Hal、NRR’、CN、OH、OCF3、CF3、芳基、杂芳基；
R和R’各自相同或不同，且独立地选自H、Alk，其中Alk任选地被Hal、NRR’、CN、OH、CF3、芳基、杂芳基取代；
或它们药学上可接受的盐、水合物、或水合盐、或者这些化合物的多晶型晶体结构或它们的旋光异构体、外消旋物、非对映体或对映体、或者它们的区域异构体、几何异构体(E和Z)或者它们的混合物。
优选地，T、U、V、W、X是C或N。
优选地，Y是N-OR1或NR′1，更优选是N-OR1、特别是N-OH、N-烷基、N-O烯基、N-O烷基-O-烷基、N-O-烷基-CO-O烷基、N-O-烷基-COOH。
应理解，当Y是CR2R2’时，R2和/或R2’不能与式(I)结构的其余部分形成稠环。
优选地，
包含2或3个杂原子；更优选地2或3个N。
最优选地，
是
优选地，
是未取代的。
优选地，Ru、Rv、Rw选自H、芳基、Alk、NRR′、Hal、-Alk芳基、-AlkOH、-AlkOAlk、环烷基。
优选地，
是
其中Rw是H。
优选地，R3、R4、R5、R6各自相同或不同，且独立地选自H、Hal、Alk、OAlk、OCF3。
优选地，R和R’各自相同或不同，且独立地选自H、Alk。
优选地，Rv、Rw是H或不存在。
优选的式(I)化合物是式(Ia)的化合物：
最优选的化合物特别是式(I1)-(I4)的化合物：
本发明优选的化合物选自以下：
-3-甲基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-甲基肟
-3-甲基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1-甲基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-3-丁基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1-丁基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-癸基肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-(2-甲氧基乙基)肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-(3-苯氧基丙基)肟
-1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-甲基肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-甲基肟
-1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-乙基肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-乙基肟
-1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-苄基肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-苄基肟
-[1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-亚基]苯胺
-(1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-亚基氨基氧基)乙酸乙酯
-(1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-亚基氨基氧基)乙酸锂盐，
或它们药学上可接受的盐、水合物、或水合盐、或者这些化合物的多晶型晶体结构或它们的旋光异构体、外消旋物、非对映体或对映体、或者它们的区域异构体、几何异构体(E和Z)或者它们的混合物。
最优选的化合物特别选自以下：
-3-甲基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-甲基肟
-3-甲基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-3-丁基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-癸基肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-(2-甲氧基乙基)肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-(3-苯氧基丙基)肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-甲基肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-乙基肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-(1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-亚基氨基氧基)乙酸乙酯
-(1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-亚基氨基氧基)乙酸锂盐，
或它们药学上可接受的盐、水合物、或水合盐、或者这些化合物的多晶型晶体结构或它们的旋光异构体、外消旋物、非对映体或对映体、或者它们的区域异构体、几何异构体(E和Z)或者它们的混合物。
如上文或下文所使用的：
Alk表示烷基、烯基或炔基。
“烷基”指可以是直链或支链的并在链中具有1-20个碳原子的脂族烃基。优选的烷基在链中具有1-12个碳原子。“支链的”指一个或多个低级烷基例如甲基、乙基或丙基连接到直链烷基链。示例性的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、3-戊基、辛基、壬基、癸基。
“烯基”指包含碳-碳双键的脂族烃基，其可以是直链或支链的，并在链中具有2-15个碳原子。优选的烯基在链中具有2-12个碳原子；更优选地在链中具有2-4个碳原子。示例性的烯基包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正戊烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基。
“炔基”指包含碳-碳三键的脂族烃基，其可以是直链或支链的，并在链中具有2-15个碳原子。优选的炔基在链中具有2-12个碳原子；更优选地在链中具有2-4个碳原子。示例性的炔基包括乙炔基、丙炔基、正丁炔基、2-丁炔基、3-甲基丁炔基、正戊炔基、庚炔基、辛炔基和癸炔基。
“烷氧基烷基”指烷基-O-烷基，其中所述烷基独立地如本文所定义。烷氧基烷基的例子是甲氧基乙基。
“烷氧羰基烷基”指烷基-O-CO-烷基-，其中所述烷基独立地如本文所定义。示例性的烷氧羰基烷基包括甲氧基-和乙氧基-羰基甲基和羰基乙基。
“卤素原子”指氟、氯、溴或碘原子；优选氟和氯原子。
“芳基”指6-14个碳原子、优选6-10个碳原子的芳族单环或多环烃环体系。示例性的芳基包括苯基或萘基。
“芳烷基”指芳基-烷基-，其中所述芳基和烷基独立地如本文所定义。芳烷基的例子是苄基。
“芳氧基烷基”指芳基-O-烷基-，其中所述芳基和烷基独立地如本文所定义。示例性的芳氧基烷基是苯氧基丙基。
如本文所用的，术语“杂环”或“杂环的”指饱和的、部分不饱和的或不饱和的、非芳族的、稳定的3-14、优选5-10元单、双或多环，其中至少一个所述环的成员是杂原子。一般地，杂原子包括但不限于氧、氮、硫、硒和磷原子。优选的杂原子是氧、氮和硫。
适合的杂环还在The Handbook of Chemistry and Physics，第76版，CRCPress，Inc.，1995-1996，p.2-25至2-26中公开，其公开内容通过引用结合于此。
优选的非芳族杂环包括但不限于吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、环氧乙烷基、四氢呋喃基、二氧戊环基、四氢吡喃基、二噁烷基、二氧戊环基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、吡喃基、咪唑啉基、吡咯啉基、吡唑啉基、噻唑烷基、四氢噻喃基、二噻烷基(dithianyl)、硫代吗啉基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢吡啶基、二氢吡啶基、四氢嘧啶基(tetrahydropyrinidinyl)、二氢噻喃基、氮杂环庚烷基(azepanyl)，以及得自与苯基缩合的稠合体系。
如本文所用的，术语“杂芳基”或芳族杂环指5-14、优选5-10元芳族杂、单、双或多环。例子包括吡咯基、吡啶基、吡唑基、噻吩基、嘧啶基、吡嗪基、四唑基、吲哚基、喹啉基、嘌呤基、咪唑基、噻吩基、噻唑基、苯并噻唑基、呋喃基、苯并呋喃基、1，2，4-噻二唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、咔唑基、苯并咪唑基、异噁唑基、吡啶基-N-氧化物、以及得自与苯基缩合的稠合体系。
“羧烷基”指HOOC-烷基-，其中所述烷基如本文所定义。优选的基团包括羧甲基和羧乙基。
“烷基”、“环烷基”、“烯基”、“炔基”、“芳基”、“杂芳基”、“杂环”等还指通过脱去两个氢原子而形成的相应“亚烷基”、“亚环烷基”、“亚烯基”、“亚炔基”、“亚芳基”、“亚杂芳基”、“亚杂环”等。
如本文所用的，术语“患者”指动物例如出于饲养、陪伴或保护目的的珍贵动物、或优选指人类或人类儿童，它们罹患或可能罹患一种或多种本文所述的疾病和病症。
如本文所用的，“治疗有效量”指本发明的化合物有效预防、减少、消除、治疗或控制本文所述的疾病和病症的症状的量。术语“控制”意指其中可以存在延缓、中断、阻止或停止本文所述的疾病和病症的进展的所有方法，但不一定表示全部消除所有的疾病和病症的症状，而且意在包括预防性治疗。
如本文所用的，术语“药学上可接受的”指这样的化合物、材料、赋形剂、组合物或剂型，它们在正确的医学判断的范围内适于与人类和动物的组织接触，而没有与合理的利益/风险比相当的过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题并发症。
如本文所用的，“药学上可接受的盐”指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸式盐或碱式盐来修饰。药学上可接受的盐包括常规的无毒盐或者由例如无毒的无机酸或有机酸形成的母体化合物的季铵盐。例如，所述常规的无毒盐包括得自无机酸的盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；和由有机酸制备的盐，所述有机酸例如乙酸、丙酸、丁二酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、苯磺酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲苯磺酸、草酸、富马酸、马来酸、乳酸等。其它加成酸包括铵盐，例如氨丁三醇、葡甲胺、羟乙基吡咯烷(epolamine)等；金属盐，例如钠、钾、钙、锌或镁。
本发明的药学上可接受的盐可由包含碱性或酸性基团的母体化合物通过常规的化学方法来合成。通常，这样的盐可以通过使游离酸或游离碱形式的这些化合物与化学计算量的适合的碱或酸在水或有机溶剂中或在二者的混合物中进行反应来制备。通常，优选非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。适合的盐的列表见于Remington′s PharmaceuticalSciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1985，p.1418，其公开通过引用结合于此。
具有几何异构体、区域异构体和立体异构体的通式(I)的化合物也是本发明的一部分。
根据另一个目的，本发明还涉及制备式(I)的化合物的方法。
本发明的化合物和方法可以多种本领域的技术人员公知的方法来制备。例如可以通过应用或调整下述方法或者对其进行改变来合成所述化合物，技术人员会理解这一点。对本领域的技术人员来说，适当的修饰和取代会是容易明白和熟知的或可以容易从科技文献中获取。
具体而言，所述方法可见于R.C.Larock，Comprehensive OrganicTransformations，Wiley-VCH Publishers，1999。
应理解，本发明的化合物可以包含一个或多个不对称取代的碳原子，而且可以以旋光或消旋形式被分离。因此，意在所有的手性形式、非对映形式、消旋形式、异构形式的结构，除非明确指出了具体的立体化学或异构形式。如何制备和分离所述旋光形式是本领域所公知的。例如，可以通过标准技术，包括但不限于通过拆分消旋形式、标准色谱法、反相色谱法和手性色谱法，优选通过成盐、重结晶等，或通过从手性原料手性合成，或通过刻意合成目标手性中心来分离立体异构体的混合物。
另外，本发明的方法可以产生几种区域异构体，它们也被本发明包括。区域异构体通常通过色谱法分离。
本发明的化合物可以通过许多种合成路线制备。试剂盒原料是可商购的，或可由本领域的普通技术人员通过公知的技术容易地合成。除非另外说明，所有的取代基都如前面所定义。
在下文中所述的反应中，可能有必要保护反应性官能团(例如羟基、氨基、亚氨基、硫基(thio)或羧基，这些基团在终产物中是期望的)，以避免它们不需要地参与到所述反应中。常规的保护基可以按照标准实践来使用，例如参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Chemistry，第3版，John Wiley and Sons，1999；J.F.W.McOmie，Protective Groups inOrganic Chemistry，Plenum Press，1973。
某些反应可以在碱的存在下进行。对要用于该反应的碱的性质没有特别的限制，而且任何常规地用于此类反应的碱在此都可以相同地使用，条件是它对分子的其它部分没有副作用。适合的碱的例子包括：氢氧化钠、碳酸钾、三乙胺、碱金属氢化物例如氢化钠和氢化钾；烷基锂化合物，例如甲基锂和丁基锂；以及碱金属醇盐，例如甲醇钠和乙醇钠。
通常，在适合的溶剂中进行反应。可以使用许多种溶剂，条件是它对所述反应或参与的试剂没有副作用。适合的溶剂的例子包括：烃，其可以是芳族、脂族或环脂族烃，例如己烷、环己烷、苯、甲苯和二甲苯；酰胺，例如二甲基甲酰胺；醇如乙醇和甲醇，以及醚如乙醚和四氢呋喃。
所述反应可以在宽的温度范围内进行。一般而言，发现在0℃-150℃(更优选大约室温-100℃)的温度便于进行所述反应。根据许多因素，特别是反应温度和试剂的性质，所述反应所需的时间也可以非常宽泛。但是，3小时-20小时的时间段一般足够，条件是在上述优选条件下完成所述反应。
由此制备的化合物可以通过常规方法从反应混合物中回收。例如，所述化合物可以通过从反应混合物中馏出溶剂，或者，如果需要，在从反应混合物中馏出溶剂后，将剩余物倾入水中，然后用水不混溶的有机溶剂萃取，然后从萃取物中馏出溶剂来回收。此外，如果需要，可以通过各种公知的技术，例如重结晶、再沉淀或各种色谱技术(特别是柱色谱法或制备薄层色谱法)来进一步纯化产物。
制备本发明的式(I)化合物的方法是本发明的另一个目的。
根据第一个方面，式(I)的本发明化合物可以通过使相应的式(II)和式(III)的化合物进行反应来得到：
其中R3、R4、R5、R6、T、U、V、W、X、Ru、Rv、Rw如在式(I)中所定义。
通常，所述反应在有机质子溶剂例如醇(优选乙醇)中、在酸例如乙酸的存在下进行。
可选择地和/或附加的，式(I)的化合物可以由相应的式(I′)的化合物通过使前体基团转化为期望的Ru、Rv或Rw基团的一个或多个步骤来得到：
其中R3、R4、R5、R6、Hetl、T、U、V、W、X、Ru、Rv、Rw如在式(I)中所定义，
其中Ru′、Rv′、Rw′各自与Ru、Rv、Rw相似或是相应的Ru、Rv、Rw的前体基团。
根据本发明，用语官能团的“前体基团”指任何能够用一种或多种适合的试剂通过一个或多个反应产生期望的官能的基团。所述反应包括脱保护反应以及通常的加成、取代或官能化反应。
式(I′)的化合物可以由相应的式(II)和式(III)的化合物如上所述地得到。
式(I)的化合物可以特别地由EP 05292612.8中公开的式(I′)的化合物得到。
上述反应可以由技术人员通过应用或调整示于下文的实施例中的方法来进行。
另外，本发明的方法还可以包括额外的分离式(I)的化合物的步骤。这可以由技术人员通过已知的常规方法例如上述回收方法来完成。
原料产品(II)和(III)是可商购的，或者可以通过应用或调整任何已知的方法或在实施例中描述的方法来获得。
所述合成也可用作为多组分反应的一锅法来进行。
根据另一方面，本发明还涉及药物组合物，其包含如下定义的式(I)的化合物、或它们药学上可接受的盐、水合物、或水合盐、或者这些化合物的多晶型晶体结构或它们的旋光异构体、外消旋物、非对映体或对映体、或者它们的区域异构体、几何异构体(E和Z)或者它们的混合物：
其中：
------适当时不存在或是单键；
其中
和
通过T和X稠合在一起；
Y是N-OR1、NR′1、CR2R′2；
R1是H、烷基、烯基、烷氧基烷基、芳氧基烷基、芳烷基、烷氧羰基烷基、羧烷基；
R′1是H、烷基、芳基或芳烷基；
R2、R′2各自相同或不同，且独立地选自H、烷基、芳基或芳烷基；
T、U、V、W、X相同或不同，且可选自C、N、O、S；
Ru、Rv、Rw相同或不同，且可选自H、CN、＝O、Hal、Alk、OAlk、OH、NRCN、C(CN)＝C(OH)(OAlk)、SR、NRR’、C(O)NRR’、杂环、芳基、杂芳基、环烷基，其中Alk、芳基、杂芳基、杂环、环烷基任选地被Hal、NRR’、CN、OH、CF3、芳基、杂芳基、OAlk取代；
R3、R4、R5、R6各自相同或不同，且独立地选自H、OAlk、Alk、Hal、NRR’、CN、OH、OCF3、CF3、芳基、杂芳基；
R和R’各自相同或不同，且独立地选自H、Alk，其中Alk任选地被Hal、NRR’、CN、OH、CF3、芳基、杂芳基取代。
优选地，T、U、V、W、X是C或N。
其它优选的式(I)的实施方案如以上关于本发明的化合物所述。
本发明优选的用于治疗用途的化合物选自以下：
-3-甲基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-甲基肟
-3-甲基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1-甲基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-3-丁基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1-丁基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-癸基肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-(2-甲氧基乙基)肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-(3-苯氧基丙基)肟
-1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-甲基肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-甲基肟
-1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-乙基肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-乙基肟
-1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-苄基肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-苄基肟
-[1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-亚基]苯胺
-(1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-亚基氨基氧基)乙酸乙酯
-(1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-亚基氨基氧基)乙酸锂盐，
或它们药学上可接受的盐、水合物、或水合盐、或者这些化合物的多晶型晶体结构或它们的旋光异构体、外消旋物、非对映体或对映体、或者它们的区域异构体、几何异构体(E和Z)或者它们的混合物。
本发明最优选的用于治疗用途的化合物特别选自以下：
-3-甲基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-甲基肟
-3-甲基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-3-丁基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-癸基肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-(2-甲氧基乙基)肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-(3-苯氧基丙基)肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-甲基肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-乙基肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-(1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-亚基氨基氧基)乙酸乙酯
-(1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-亚基氨基氧基)乙酸锂盐，
或它们药学上可接受的盐、水合物、或水合盐、或者这些化合物的多晶型晶体结构或它们的旋光异构体、外消旋物、非对映体或对映体、或者它们的区域异构体、几何异构体(E和Z)或者它们的混合物。
根据又一目的，本发明涉及如以上关于所述药物组合物所定义的式(I)的化合物用于制备用于抑制半胱氨酸蛋白酶的药物的用途。
本发明的化合物可用于抑制有此需要的患者的半胱氨酸蛋白酶，特别是去泛素化酶(例如USP和UCH)、胱天蛋白酶、组织蛋白酶(特别是组织蛋白酶B、D、K、S等)、钙蛋白酶以及病毒、细菌或寄生虫的半胱氨酸蛋白酶。
本发明的化合物具体可用于治疗和/或预防癌症和转移、更具体地是前列腺癌和/或结肠癌、神经退行性疾病例如阿尔兹海默氏病和帕金森病、耳聋、与衰老相关的病症、炎症、关节炎、骨质疏松、肝炎、肝衰竭、心肌缺血和衰竭、卒中、动脉粥样硬化、肾衰竭、糖尿病、白内障；由单纯疱疹病毒-1、EB病毒、SARS冠状病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、腺病毒等引起的病毒急性或潜在性感染；由属于链球菌属、葡萄球菌属、梭菌属、曲霉菌属等的致病体导致的细菌或真菌感染；由锥虫属、疟原虫属、利什曼原虫属、毛滴虫属、内阿米巴属、贾第虫属、弓形虫属、隐孢子虫属等种成员引起的原虫感染；由片形属、血吸虫属、盘尾丝虫属、蛔虫属、绦虫属、新杆状线虫属、弓蛔虫属、血矛线虫属、钩口线虫属、鞭虫属、毛线虫属、类圆线虫属、布鲁丝虫属等种成员引起的扁虫或线虫感染；以及免疫性、免疫调节性或抗原呈递性病症。
本发明还涉及相应的治疗方法，其包括将本发明的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂一起向有此需要的患者给药。
对需要治疗本文所述的疾病和病症的个体的鉴别也是本领域技术人员的能力范围之内的。具有本领域技术的兽医或医师能够容易地通过利用临床试验、体格检查、医疗史/家族史或生物学和诊断试验来鉴别那些需要所述治疗的个体。
治疗有效量可以容易地由作为本领域技术人员的主治诊断医生通过利用常规技术和通过观察得自类似情况下的结果来确定。在确定所述治疗有效量方面，所述主治诊断医生要考虑许多因素，包括但不限于：个体的物种、其尺寸、年龄和一般健康；有关的具体疾病；受累程度或疾病的严重性；个别个体的反应；给药的具体化合物；给药方式；给药的制剂的生物利用度特性；所选的给药方案；并行的药物治疗的使用；以及其它有关情况。
式(I)的化合物要获得期望的生物效应所需的量会根据许多因素而变化，包括所用的化合物的化学特性(例如疏水性)、所述化合物的效力、疾病类型、患者所属的物种、患者的患病状态、给药途径、所述化合物经所选途径的生物利用度、规定所需剂量的所有因素、递送和给药方案。
“药学上”或“药学上可接受的”指分子实体和组合物当(适当时)向动物或人类给药时不会产生副反应、过敏反应或其它不利反应。
如本文所用的，“药学上可接受的赋形剂”包括任何载体、稀释剂、辅剂或媒介物，例如防腐剂或抗氧化剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、助悬剂、溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。使用这些介质和药剂用于药物活性物质是本领域公知的。除了任何常规介质或药剂到了与所述活性成分不相容的程度之外，也考虑其在治疗组合物中的使用。也可以向所述组合物中引入补充的活性成分作为适合的治疗组合。
在本发明的范围内，如本文所用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指逆转、减轻、预防所述术语所应用于的疾病或病症或者所述疾病或病症的一种或多种症状、或者抑制它们的进展。
“治疗有效量”指本发明的化合物/药物有效预防或治疗需要抑制与其发病机制相关的激活的半胱氨酸蛋白酶的病理状态的量。
根据本发明，术语“患者”或“有此需要的患者”意指罹患或可能罹患在其发病机制中涉及激活的半胱氨酸蛋白酶的病理状态的动物或人类。优选地，所述患者是人类。
概括而言，本发明的化合物可以作为包含0.1-10％化合物的生理缓冲水溶液提供，用于肠胃外给药。一般的剂量范围是1μg/kg-0.1g/kg体重/天；优选的剂量范围是0.01mg/kg-0mg/kg体重/天或人类儿童的等效剂量。优选的待给药的药物的剂量可能要取决于这样的变量，例如所述疾病或病症的类型和进展的程度、具体患者的总体健康状况、所选的化合物的相对生物效力、所述化合物的制剂、给药途径(静脉内、肌内等)、所述化合物经所选递送途径的药代动力学性质、以及给药速度(推注或持续静脉点滴)和时间表(在特定时间段内的重复次数)。
本发明的化合物还能以单位剂量形式来给药，其中术语“单位剂量”指这样的单一剂量，其能向患者给药，且能被容易地处理和包装，同时保持作为物理和化学稳定的包含活性化合物本身的单位剂量或作为药学上可接受的组合物，如下文所述。如此，一般的总日剂量范围是0.01-100mg/kg体重。通过一般的指导，对于人类的单位剂量介于1mg-3000mg/天。优选地，所述单位剂量的范围是1-500mg，每天给药1-6次，甚至更优选10mg-500mg，每天给药1次。本文所提供的化合物可以通过与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合而配制成药物组合物。可以配制这样的单位剂量组合物，以通过口服给药来使用，特别是以片剂、普通胶囊或软胶囊的形式；或通过鼻内给药来使用，特别是以散剂、滴鼻剂或气雾剂的形式；或通过皮肤给药来使用，例如以软膏、乳膏、洗剂、凝胶或喷雾剂、或经透皮贴剂来局部给药。
所述组合物可以方便地以单位剂型的形式给药，而且可以通过制药领域公知的任何方法来制备，例如如Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第20版；Gennaro，A.R.著；Lippincott Williams & Wilkins：Philadelphia，PA，2000中所述。
优选的制剂包含这样的药物组合物，其中本发明的化合物被配制以用于口服或肠胃外给药。
对于口服给药，片剂、丸剂、散剂、胶囊、含片等可以包含一种或多种任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素或黄蓍树胶；稀释剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如淀粉和纤维素衍生物；润滑剂，例如硬脂酸镁；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如薄荷油或水杨酸甲酯。胶囊可以是硬胶囊或软胶囊(它们一般由任选地与成形剂掺合的明胶掺合物制备)以及淀粉胶囊的形式。此外，剂量单位形式可以包含各种其它的改变所述剂量单位的物理形式的材料，例如糖、虫胶或肠溶剂的包衣。其它口服剂型糖浆或酏剂可以包含甜味剂、防腐剂、染料、着色剂和调味剂。此外，所述活性化合物可以掺入到迅速溶解、控释(modified-release)或缓释配制品和制剂中，其中所述缓释制剂优选是双峰的。优选的片剂包含以任何组合形式的乳糖、玉米淀粉、硅酸镁、交联羧甲纤维素钠、聚维酮、硬脂酸镁或滑石。
用于肠胃外给药的液体制剂包括无菌水或非水溶液剂、混悬剂和乳剂。所述液体组合物可以包含粘合剂、缓冲剂、防腐剂、螯合剂、甜味剂、调味剂和着色剂等。非水溶剂包括醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和有机酯例如油酸乙酯。含水载体包括醇和水的混合物、缓冲介质和盐水。具体而言，生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以是有用的控制所述活性化合物的释放的赋形剂。静脉内媒介物可包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于Ringer葡萄糖的那些，等等。其它的可能有用的用于这些活性化合物的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输液系统和脂质体。
另一种给药方式包括供吸入的制剂，其包括例如干粉、气雾剂或滴剂的方式。它们可以是包含例如聚氧乙烯-9-十二烷基醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或用于以滴鼻剂给药的油性溶液，或鼻内施用的凝胶。用于含服给药的制剂包括例如锭剂(lozenge)或锭剂(pastille)，也可以包含调味基质(例如蔗糖或阿拉伯胶)和其它赋形剂(例如甘胆酸盐)。适于直肠给药的制剂优选作为具有固体系载体(例如可可脂)的单位剂量栓剂提供，而且可以包含水杨酸酯。用于局部施用到皮肤的制剂优选采用软膏、乳膏、洗剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油剂的形式。可以使用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇和它们的组合。适于经皮肤给药的制剂可以作为独立的贴剂提供，可以是溶解和/或分散在聚合物或粘合剂中的亲脂性乳剂或缓冲水溶液。
通过以下实施例中的描述来进一步说明但不是限制本发明。
本发明的代表性化合物概述于下表：
实验
本发明的代表性化合物可以根据以下方法合成：
一般方法A：五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮的合成：
将R1取代的(1，2，4)-三唑-3，4-二胺(8.8mmol)和茚三酮(1.57g，8.8mmol)在EtOH(10ml)和AcOH(1.5ml)中的混合物回流2-16小时。减压除去溶剂，将剩余物溶于EtOAc，用饱和K2CO3和盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机相，过滤，减压蒸去溶剂。如下纯化粗品：用硅胶快速色谱法(甲苯/MeOH 95∶5-8∶2或CH2Cl2/EtOAc 9∶1-1∶1)纯化区域异构体混合物，然后用中性氧化铝(II级)快速色谱法(CH2Cl2/EtOAc 7∶3至CH2Cl2/MeOH 1∶1+5％HCOOH或AcOH)分离区域异构体。
1-甲基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮(1b/A)
根据一般方法A制备，收率13％，为黄色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO d6)：δ8.23(d，1H)，8.02(m，2H)，7.89(ddd，1H)，2.72(s，3H)。ESI+MS：C12H7N5O的理论值：237.22；测量值：238.2(MH+)。
3-甲基-1.2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴9-酮(1b/B)
根据一般方法A制备，收率30％，为黄色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO d6)：δ8.16(d，1H)，8.05-7.95(m，2H)，7.85(ddd，1H)，2.77(s，3H)。ESI+MS：C12H7N5O的理论值：237.22；测量值：238.2(MH+)。
一般方法B：五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮的合成
根据Eur.J.Med.Chem.-Chim.Ther.1986，21，235报道的方法制备二氨基三唑。
搅拌二氨基胍盐酸盐(1g，8mmol)在过量(10g)的适合羧酸中的混合物，在120-130℃加热12-24小时。将溶液冷却至室温，加入37％HCl(10ml)。将混合物回流2-3小时，然后真空浓缩至干。获得的粗品用Et2O(×3)洗涤，在不经任何另外地纯化的情况下使用。
关于粗品二氨基三唑和茚三酮间的缩合，参见一般方法A。
1-丁基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮(1f/A)
根据一般方法B制备，收率6％，为黄色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO d6)：δ8.23(d，1H)，8.02(m，2H)，7.89(ddd，1H)，3.10(dd，2H)，1.81(m，2H)，1.42(m，2H)，0.94(t，3H)。ESI+MS：C15H13N5O的理论值：279.30；测量值：280.2(MH+)。
3-丁基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮(1f/B)
根据一般方法B制备，收率10％，为黄色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO d6)：δ8.16(d，1H)，7.99(m，2H)，7.85(dd，1H)，3.16(dd，2H)，1.87(m，2H)，1.44(m，2H)，0.96(t，3H)。ESI+MS：C15H13N5O的理论值：279.30；测量值：280.3(MH+)。
1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮(1g/A)
根据一般方法B制备，收率48％，为黄色固体。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.21(d，1H)，8.00(d，1H)，7.90(ddd，1H)，7.77(ddd，1H)，3.21(q，2H)，1.49(t，3H)。ESI+MS：C13H9N5O的理论值：251.25；测量值：252.1(MH+)。
3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮(1g/B)
根据一般方法B制备，收率32％，为黄色固体。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.12(d，1H)，8.02(d，1H)，7.88(ddd，1H)，7.75(ddd，1H)，3.25(q，2H)，1.53(t，3H)。ESI+MS：C13H9N5O的理论值：251.25；测量值：252.1(MH+)。
一般方法E：五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮的O-烷基肟衍生物的合成
a R1＝Me，R2＝Me-B区域异构体 5a-e
b R1＝Me，R2＝烯丙基-B区域异构体
c R1＝Me，R2＝烯丙基-A区域异构体
d R1＝Bu，R2＝烯丙基-B区域异构体
e R1＝Bu，R2＝烯丙基-A区域异构体
将1(1mmol)、O-烷基羟胺盐酸盐(3mmol)和分子筛在吡啶(10ml)中的悬浮液加热至60℃，保持2-12h。滤除不溶性的残留物，蒸去溶剂，通过硅胶快速色谱法(CH2Cl2/丙酮85∶15或甲苯/MeOH 9∶1或汽油/EtOAc 1∶1)纯化粗品。
3-甲基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-甲基肟(5a)
根据一般方法E由1b/B制备，收率55％，为黄色固体(2∶1E/Z混合物)。1H NMR(300MHz，DMSO d6)(异构体混合物)：δ8.43(m，1H)，8.16(m，1H)，7.81(m，2H)，4.34(s，3H)，2.75(s，3H)。8.05(m，1H)，7.92(m，1H)，7.72(m，2H)，4.30(s，3H)，2.75(s，3H)。ESI+MS：C13H10N6O的理论值：266.26；测量值：267.1(MH+)。
3-甲基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟(5b)
根据一般方法E由1b/B制备，收率65％，为黄色固体(1∶1E/Z混合物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)(异构体混合物)：δ8.02(d，1H)，7.95(d，1H)，7.75-7.56(m，2H)，6.26-6.08(m，1H)，5.50(dd，1H)，5.35(d，1H)，5.05(d，2H)，2.86(s，3H)。8.49(m，1H)，8.13(m，1H)，7.77-7.56(m，2H)，6.26-6.08(m，1H)，5.50(dd，1H)，5.39(d，1H)，5.12(d，2H)，2.86(s，3H)。ESI+MS：C15H12N6O的理论值：292.30；测量值：293.1(MH+)。
1-甲基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟(5c)
根据一般方法E由1b/A制备，收率76％，为黄色固体(7∶3E/Z混合物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)(异构体混合物)：δ8.16(m，1H)，7.95(m，1H)，7.77-7.60(m，2H)，6.26-6.08(m，1H)，5.54(ddt，1H)，5.37(ddt，1H)，5.04(ddd，2H)，2.84(s，3H)。8.49(m，1H)，8.26(m，1H)，7.77-7.60(m，2H)，6.26-6.08(m，1H)，5.49(ddt，1H)，5.40(ddt，1H)，5.09(ddd，2H)，2.88(s，3H)。ESI+MS：C15H12N6O的理论值：292.30；测量值：293.1(MH+)。
3-丁基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟(5d)
根据一般方法E由1f/B制备，收率93％，为黄色固体(6∶4E/Z混合物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)(异构体混合物)：δ8.42(m，1H)，8.06(m，1H)，7.64(m，2H)，6.19-6.00(m，1H)，5.41(m，1H)，5.31(m，1H)，5.03(ddd，2H)，3.17(dd，2H)，1.88(m，2H)，1.43(m，2H)，0.93(t，3H)。7.96(m，1H)，7.87(m，1H)，7.55(m，2H)，6.19-6.00(m，1H)，5.41(m，1H)，5.26(m，1H)，4.97(ddd，2H)，3.17(dd，2H)，1.88(m，2H)，1.43(m，2H)，0.93(t，3H)。ESI+MS：C18H18N6O的理论值：334.38；测量值：335.1(MH+)。
1-丁基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟(5e)
根据一般方法E由1f/A制备，收率95％，为黄色固体(1∶1E/Z混合物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)(异构体混合物)：δ8.45(m，1H)，8.22(m，1H)，7.69(m，2H)，6.22-6.02(m，1H)，5.45(m，1H)，5.35(m，1H)，5.05(ddd，2H)，3.21(dd，2H)，1.91(m，2H)，1.45(m，2H)，.95(t，3H)。8.12(m，1H)，7.91(m，1H)，7.62(m，2H)，6.22-6.02(m，1H)，5.49(m，1H)，5.32(m，1H)，4.99(ddd，2H)，3.18(dd，2H)，1.91(m，2H)，1.45(m，2H)，0.95(t，3H)。ESI+MS：C18H18N6O的理论值：334.38；测量值：335.2(MH+)。
1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟和/或其对应的区
域异构体四唑(6)的合成：
根据一般方法E由1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮(由茚三酮和四唑-1，5-二胺制备)的6∶4区域异构体混合物制备该化合物，收率89％，为黄色固体(E/Z和区域异构体混合物)。1HNMR(300MHz，CDCl3)(异构体混合物)：δ8.47(m，1H)，8.22(m，1H)，7.84-7.58(m，2H)，6.23-6.03(m，1H)，5.46(m，1H)，5.37(m，1H)，5.13(ddd，2H)。8.19(m，1H)，7，98(m，1H)，7.84-7.58(m，2H)，6.23-6.03(m，1H)，5.46(m，1H)，5.34(m，1H)，5.06(m，2H)。ESI+MS：C13H9N7O的理论值：279.26；测量值：280.2(MH+)。
1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮肟和/或其对应的区域异构体
四唑(7)的合成：
根据一般方法E由1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮(由茚三酮和四唑-1，5-二胺制备)的6∶4区域异构体混合物制备该化合物，收率44％，为黄色固体(E/Z和区域异构体混合物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)(异构体混合物)：δ13.87(bs，1H)，8.59(m，1H)，8.14(m，1H)，7.78-7.52(m，2H)。13.69(bs，1H)，8.05(d，1H)，7.91(d，1H)，7.78-7.52(m，2H)。ESI+MS：C10H5N7O的理论值：239.20；测量值：240.1(MH+)。
一般方法F：六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮的O-烷基肟的合成
在室温下搅拌7(48mg，0.20mmol)、烷基溴(0.6mmol)和K2CO3(55mg，0.4mmol)在DMF(2ml)中的混合物16h，然后减压蒸去溶剂。通过快速色谱法(CH2Cl2，以与MeOH或石油醚的可变混合物的形式)纯化粗品。
1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-癸基肟和/或其对应的区域异构体四唑(8a)
根据一般方法F制备，收率53％，为黄绿色固体(E/Z和区域异构体混合物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)(异构体混合物)：δ8.39(m，1H)，8.24和8.15(m，1H)，7.78-7.63(m，2H)，4.61-4.47(m，2H)，1.82(m，2H)，1.47-1.06(m，14H)，0.75(m，3H)。ESI+MS：C20H25N7O的理论值：379.47；测量值：380.2(MH+)。
1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-(2-甲氧基乙基)肟和/或其对应的区域异构体四唑(8b)
根据一般方法F制备，收率29％，为浅褐色固体(E/Z和区域异构体混合物)。1H NMR(300MHz，DMSO d6)(异构体混合物)：δ8.49(m，1H)，8.27(m，1H)，7.83-7.66(m，2H)，4.73(m，2H)，3.82(m，2H)，3.40(s，3H)。8.49(m，1H)，8.19(m，1H)，7.83-7.66(m，2H)，4.73(m，2H)，3.82(m，2H)，3.41(s，3H)。ESI+MS：C13H11N7O2的理论值：297.28；测量值：298.0(MH+)。
1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-(3-苯氧基丙基)肟和/或其对应的区域异构体四唑(8c)
根据一般方法F制备，收率42％，为黄色固体(E/Z和区域异构体混合物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)(异构体混合物)：δ8.41(m，1H)，8.15(m，1H)，7.76-7.58(m，2H)，7.18(m，2H)，6.83(m，3H)，4.87-4.70(m，2H)，4.18-4.07(m，2H)，2.42-2.27(m，2H)。8.26(m，1H)，7.89(d，1H)，7.76-7.58(m，2H)，7.18(m，2H)，6.83(m，3H)，4.87-4.70(m，2H)，4.18-4.07(m，2H)，2.42-2.27(m，2H)。ESI+MS：C19H15N7O2的理论值：373.38；测量值：374.1(MH+)。
一般方法K：乙基五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮的O-烷基肟衍生物的
合成
a R＝Me-A区域异构体
b R＝Me-B区域异构体
c R＝Et-A区域异构体
d R＝Et-B区域异构体
e R＝烯丙基-A区域异构体
f R＝烯丙基-B区域异构体
g R＝Bn-A区域异构体
h R＝Bn-A区域异构体
将1g/A或1g/B(1mmol)、O-烷基羟胺盐酸盐(2mmol)和分子筛在吡啶(10ml)中的悬浮液加热到60℃，保持2-3h。滤除不溶性的残留物，蒸去溶剂，通过硅胶快速色谱法纯化粗品。
1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-甲基肟(10a)
根据一般方法K(洗脱剂：CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80∶17∶3)由1g/A制备，定量收率，为黄色固体(7∶3E/Z混合物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.47(m，1H)，8.27(m，1H)，7.73(m，1H)，7.66(m，1H)，4.41(s，3H)，3.28(q，2H)，1.55(t，3H)和8.17(m，1H)，7，96(m，1H)，7.73(m，1H)，7.63(m，1H)，4.37(s，3H)，3.25(q，2H)，1.55(t，3H)。ESI+MS：C14H12N6O的理论值：280.29；测量值：281.1(MH+)。
3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-甲基肟(10b)
根据一般方法K(洗脱剂：CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80∶17∶3)由1g/B制备，定量收率，为黄色固体(7∶3E/Z混合物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.50(m，1H)，8.17(m，1H)，7.63(m，2H)，4.45(s，3H)，3.30(q，2H)，1.57(t，3H)和8.07(d，1H)，7.98(d，1H)，7.68(ddd，1H)，7.64(ddd，1H)，4.41(s，3H)，3.29(q，2H)，1.59(t，3H)。ESI+MS：C14H12N6O的理论值：280.29；测量值：281.1(MH+)。
1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-乙基肟(10c)
根据一般方法K(洗脱剂：CH2Cl2/EtOAc/MeOH 70∶25∶5)由1g/A制备，定量收率，为黄色固体(6∶4E/Z混合物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.17(m，1H)，7.96(m，1H)，7.73(m，1H)，7.65(ddd，1H)，4.60(q，2H)，3.26(q，2H)，1.55(t，3H)，1.55(t，3H)和8.47(m，1H)，8.27(m，1H)；7.72(m，1H)，7.63(ddd，1H)，4.66(q，2H)，3.30(q，2H)，1.54(t，3H)，1.51(t，3H)。ESI+MS：C15H14N6O的理论值：294.32；测量值：295.1(MH+)。
3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-乙基肟(10d)
根据一般方法K(洗脱剂：CH2Cl2/EtOAc/MeOH 70∶25∶5)由1g/B制备，定量收率，为黄色固体(1∶1E/Z混合物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.49(m，1H)，8.13(m，1H)，7.70(m，1H)，7.62(m，1H)，4.69(q，2H)，3.27(q，2H)，1.58-1.48(m，6H)，和8.03(m，1H)，7，96(m，1H)，7.70(m，1H)，7.62(m，1H)，4.62(q，2H)，3.27(q，2H)，1.58-1.48(m，6H).ESI+MS：C15H14N6O的理论值：294.32；测量值：295.1(MH+)。
1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟(10e)
根据一般方法K(洗脱剂：CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80∶16∶4)由1g/A制备，定量收率，为黄色固体(6∶4E/Z混合物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.17(d，1H)，7.95(d，1H)，7.65(m，2H)，6.26-6.07(m，1H)，5.54(m，1H)，5，37(m，1H)，5.04(ddd，2H)，3.26(m，2H)，1.54(m，3H)和8.49(d，1H)，8，27(d，1H)，7.73(m，2H)，6.26-6.07(m，1H)，5.49(m，1H)，5，40(m，1H)，5.09(ddd，2H)，3.26(m，2H)，1.54(m，3H)。ESI+MS：C16H14N6O的理论值：306.33；测量值：307.1(MH+)。
3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟(10f)
根据一般方法K(洗脱剂：CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80∶17∶3)由1g/B制备，收率96％，为黄色固体(65∶35E/Z混合物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.50(m，1H)，8.14(m，1H)，7.71(m，1H)，7.65(m，1H)，6.26-6.09(m，1H)，5.53(m，1H)，5.39(m，1H)，5.12(ddd，2H)，3.27(q，2H)，1.55(t，3H)和8.04(m，1H)，7.95(m，1H)，7.71(m，1H)，7.61(m，1H)，6.26-6.09(m，1H)，5.47(m，1H)，5.36(m，1H)，5.106(ddd，2H)，3.27(q，2H)，1.56(t，3H)。ESI+MS：C16H14N6O的理论值：306.33；测量值：307.2(MH+)。
1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-苄基肟(10g)
根据一般方法K(洗脱剂：CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80∶17∶3)由1g/A制备，收率86％，为黄色固体(65∶35E/Z混合物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.16(m，1H)，7.96(m，1H)，7.70(m，1H)，7.65(m，1H)，7.52(m，2H)，7.41(m，3H)，5.58(s，2H)，3.21(q，2H)，1.49(t，3H)和8.43(m，1H)，8，26(m，1H)，7.70(m，1H)，7.65(m，1H)，7.52(m，2H)，7.41(m，3H)，H)，5.62(s，2H)，3.29(q，2H)，1.56(t，3H)。ESI+MS：C20H16N6O的理论值：356.39；测量值：357.1(MH+)。
3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-苄基肟(10h)
根据一般方法K(洗脱剂：CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80∶17∶3)由1g/B制备，收率99％，为黄色固体(6∶4E/Z混合物)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.44(m，1H)，8，13(m，1H)，7.67(m，1H)，7.61(m，1H)，7.52(m，2H)，7.46-7.29(m，3H)，5.64(s，2H)，3.62(q，2H)，1.55(t，3H)和8.01(m，1H)，7，92(m，1H)，7.70(m，1H)，7.65(m，1H)，7.52(m，2H)，7.41(m，3H)，5，59(s，2H)，3.29(q，2H)，1.56(t，3H)。ESI+MS：C20H16N6O的理论值：356.39；测量值：357.1(MH+)。
[1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-亚基]苯胺(11)的合成；
向1g/A(200mg，0.79mmol)和分子筛在甲苯(4ml)中的悬浮液添加苯胺(72μl，0.79mmol)。将混合物在130℃搅拌4h，然后蒸去溶剂，通过快速色谱法(CH2Cl2/EtOAc/MeOH 80∶18∶2)纯化粗品，提供11(231mg，90％)，为黄色固体(非对映异构体比例1∶1)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.28(d，1H)，7.70(ddd，1H)，7.56-7.26(m，6H)，6.91(d，1H)，3.34(q，2H)，1.58(t，3H)和8.22(m，2H)，7.81(m，2H)，7.47(m，1H)，7.07(m，4H)，2.80(q，2H)，1.21(t，3H)。ESI+MS：C19H14N6的理论值：326.36；测量值：327.2(MH+)。
(1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-亚基氨基氧基)乙酸乙酯和/或其对应的区域异构体四唑(12)：
将肟7(560mg，2.34mmol)和碳酸铯(1.54g，4.68mmol)的混合物在DMF(12ml)中搅拌5min。滴加溴乙酸乙酯(1.2g，7.02mmol)，在滴加的最后，将深色的混合物在室温下搅拌3h。蒸去溶剂，将粗产物溶于二氯甲烷。经二氧化硅(silice)垫过滤后，蒸发，用环己烷/乙酸乙酯重结晶，用环己烷研磨，得到717mg(94％)化合物12，为绿色粉末。
1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)(异构体混合物)：δ(ppm)＝1.28(m，3H)；4，21(m，2H)；5.28(m，2H)；7；70-8.60(m，4H)。LC-MS(ES)：m/z＝651(2M+H+)，326(M+H+)。
(1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-亚基氨基氧基)乙酸锂盐和/或其对应的区域异构体四唑(13)
在室温下，将酯12(700mg；2.15mmol)和LiOH(451mg，10.75mmol)的甲醇(12ml)溶液搅拌12h。将深色的混合物冷却至-20℃，1h后，滤出形成的沉淀，用冷甲醇洗涤，剩余380mg(59％)化合物13，为绿色固体。
1H-NMR(400MHz，D2O)(异构体混合物)：δ(ppm)＝4.8(s，2H)；7.40-8.40(m，4H)。LC-MS(ES)：m/z＝296(M-H+)。
代表性的半胱氨酸蛋白酶
USP5活性测定
将USP5在USP缓冲液(50mM Tris HCl；0.5mM EDTA；5mM DTT；0.01％ Triton X-100；牛血清白蛋白0.05mg.ml-1 pH7.6)中稀释。化合物母液(100mM)在-20℃储存在DMSO中。在以下终浓度测试化合物：100μM；33.3μM；11.1μM；3.7μM；1.23μM；412nM；137nM；45.7nM；15.2nM；5nM。
在Black LJL 96孔板(HE微量培养板；Molecular Devices；20μl最终反应体积)中进行平行两份反应。USP5底物的浓度为400nM Ub-AMC(Boston Biochem)。酶(USP5)在特异性测定中的浓度为300pM。测定这些浓度，以便在固定的底物浓度下，在初速度下进行特异性测定。在25℃用酶预孵育化合物30分钟。通过向包含稀释在测定缓冲液中的酶(+/-化合物)的平板添加底物来启动反应。在37℃孵育反应物60分钟。通过加入乙酸终止反应(最终100mM)。在Pherastar Fluorescent Reader(BMG)上进行读数。发射λ380nm；激发λ＝460nm。将数据(平均值+/-标准偏差)分析为％对照(无化合物)，并使用GraphPad(Prism)作图(百分比-Log化合物浓度)。数据拟合成S形曲线模型(可变斜率)。
USP7的克隆和纯化
通过PCR扩增由胎盘mRNA获得编码USP7的cDNA。通过PCR将USP7 cDNA亚克隆到杆状病毒表达载体(pFastBac-HT；Invitrogen)中。通过PCR突变法产生编码突变的USP7的cDNA。相应的蛋白质编码223位残基的半胱氨酸至丙氨酸取代。通过测序全部可读框来确定序列。DH10bac转座后产生编码USP7的杆粒。将相应的杆粒转染到昆虫细胞(Sf9)中。从培养物上清液回收病毒并扩增两次。将昆虫细胞(Sf9或High Five；Invitrogen)感染72小时。收集全部细胞溶胞产物并在溶胞缓冲液(Tris HCl50mM pH7.6；0.75％ NP40；500mM NaCl；10％甘油；1mM DTT；10mM咪唑；蛋白酶抑制剂混合物；AEBSF 20μg.ml-1；抑肽酶10μg.ml-1)中溶解。在金属亲和树脂(Talon Metal Affinity Resin；BD Biosciences)上亲和纯化蛋白质。在洗涤缓冲液(50mM磷酸钠pH7.0；300mM NaCl；10mM咪唑；0.5％Triton X-100；10％甘油)中充分洗涤结合的物质，并在250mM包含咪唑的洗涤缓冲液中从该树脂洗脱。在透析缓冲液(Tris HCl pH 7.6 20mM；NaCl200mM；DTT 1mM；EDTA 1mM；10％甘油)中透析蛋白质。在4-12％NuPAGE(Invitrogen)上分析蛋白质纯化物。
USP7活性测定
将USP7在USP缓冲液(50mM Tris HCl；0.5mM EDTA；5mM DTT；0.01％ Triton X-100；牛血清白蛋白0.05mg.ml-1 pH7.6)中稀释。化合物母液(100mM)在-20℃储存在DMSO中。在以下终浓度测试化合物：100μM；33.3μM；11.1μM；3.7μM；1.23μM；412nM；137nM；45.7nM；15.2nM；5nM。
在Black LJL 96孔板(HE微量培养板；Molecular Devices；20μl最终反应体积)中进行平行两份反应。USP7底物的浓度为400nM Ub-AMC(Chem.Biol.，2003，10，p.837-846)(Boston Biochem)。酶(USP7)在特异性测定中的浓度为152pM。测定这些浓度，以便在固定的底物浓度下，在初速度下进行特异性测定。在25℃用酶预孵育化合物30分钟。通过向包含稀释在测定缓冲液中的酶(/-化合物)的平板添加底物来启动反应。在37℃孵育反应物60分钟。通过加入乙酸终止反应(最终100mM)。在PherastarFluorescent Reader(BMG)上进行读数。发射λ380nm；激发λ＝460nm。将数据(平均值+/-标准偏差)分析为％对照(无化合物)，并使用GraphPad(Prism)作图(百分比-Log化合物浓度)。数据拟合成S形曲线模型(可变斜率)。
USP8的克隆和纯化
通过PCR扩增由胎盘mRNA获得编码USP8的cDNA。通过PCR将USP8 cDNA亚克隆到杆状病毒表达载体(pFastBac-HT；Invitrogen)中。通过PCR突变法产生编码突变的USP8的cDNA。相应的蛋白质编码在786位残基的半胱氨酸至丙氨酸取代。通过测序全部可读框来确定序列。DH10bac转座后产生编码USP7的杆粒。将相应的杆粒转染到昆虫细胞(Sf9)中。从培养物上清液回收病毒并扩增两次。将昆虫细胞(Sf9或HighFive；Invitrogen)感染72小时。收集全部细胞溶胞产物并在溶胞缓冲液(TrisHCl 50mM pH7.6；0.75％ NP40；500mM NaCl；10％甘油；1mM DTT；10mM咪唑；蛋白酶抑制剂混合物；AEBSF 20μg.ml-1；抑肽酶10μg.ml-1)中溶解。在金属亲和树脂(Talon Metal Affinity Resin；BD Biosciences)上亲和纯化蛋白质。在洗涤缓冲液(50mM磷酸钠pH7.0；300mM NaCl；10mM咪唑；0.5％ Triton X-100；10％甘油)中充分洗涤结合的物质，并在250mM包含咪唑的洗涤缓冲液中从该树脂洗脱。在透析缓冲液(Tris HCl pH 7.6 20mM；NaCl 200mM；DTT 1mM；EDTA 1mM；10％甘油)中透析蛋白质。在4-12％NuPAGE(Invitrogen)上分析蛋白质纯化物。
USP8活性测定
将USP8在USP缓冲液(50mM Tris HCl；0.5mM EDTA；5mM DTT；0.01％ Triton X-100；牛血清白蛋白0.05mg.ml-1 pH8.8)中稀释。化合物母液(100mM)在-20℃储存在DMSO中。在以下终浓度测试化合物：100μM；33.3μM；11.1μM；3.7μM；1.23μM；412nM；137nM；45.7nM；15.2nM；5nM。
在Black LJL 96孔板(HE微量培养板；Molecular Devices；20μl最终反应体积)中进行平行两份反应。USP8底物的浓度为400nM Ub-AMC(Boston Biochem)。酶(USP8)在特异性测定中的浓度为630pM。测定这些浓度，以便在固定的底物浓度下，在初速度下进行特异性测定。在25℃用酶预孵育化合物30分钟。通过向包含稀释在测定缓冲液中的酶(+/-化合物)的平板添加底物来启动反应。在37℃孵育反应物60分钟。通过加入乙酸终止反应(最终100mM)。在Pherastar Fluorescent Reader(BMG)上进行读数。发射λ380nm；激发λ＝460nm。将数据(平均值+/-标准偏差)分析为％对照(无化合物)，并使用GraphPad(Prism)作图(百分比-Log化合物浓度)。数据拟合成S形曲线模型(可变斜率)。
UCH-L3活性测定
将Uch-L3在USP缓冲液(50mM Tris HCl；0.5mM EDTA；5mM DTT；0.01％ Triton X-100；牛血清白蛋白0.05mg.ml-1 pH7.6)中稀释。化合物母液(100mM)在-20℃储存在DMSO中。在以下终浓度测试化合物：100μM；33.3μM；11.1μM；3.7μM；1.23μM；412nM；137nM；45.7nM；15.2nM；5nM。
在Black LJL 96孔板(HE微量培养板；Molecular Devices；20μl最终反应体积)中进行平行两份反应。Uch-L3底物的浓度为400nM Ub-AMC(Boston Biochem)。酶(Uch-L3)在特异性测定中的浓度为13pM。测定这些浓度，以便在固定的底物浓度下，在初速度下进行特异性测定。在25℃用酶预孵育化合物30分钟。通过向包含稀释在测定缓冲液中的酶(+/-化合物)的平板添加底物来启动反应。在37℃孵育反应物60分钟。通过加入乙酸终止反应(最终100mM)。在Pherastar Fluorescent Reader(BMG)上进行读数。发射δ380nm；激发δ＝460nm。将数据(平均值+/-标准偏差)分析为％对照(无化合物)，并使用GraphPad(Prism)作图(百分比-Log化合物浓度)。数据拟合成S形曲线模型(可变斜率)。
胱天蛋白酶3的活性测定
将胱天蛋白酶3稀释在胱天蛋白酶3缓冲液(100mM Hepes pH 7.5；10％蔗糖；0.1％ CHAPS)中。化合物母液(100mM)在-20℃储存在DMSO中。在以下终浓度测试化合物：100μM；33.3μM；11.1μM；3.7μM；1.23μM；412nM；137nM；45.7nM；15.2nM；5nM。在Black LJL 96孔板(HE微量培养板；Molecular Devices；20μl最终反应体积)中进行平行两份反应。胱天蛋白酶3特异性测定的底物浓度为500nM(Ac-DEVD-AMC；Promega)。酶(胱天蛋白酶3)在特异性测定中的浓度为3.2nM。测定这些浓度，以便在固定的底物浓度下，在初速度下进行特异性测定。在25℃用酶预孵育化合物30分钟。通过向包含稀释在测定缓冲液中的酶(+/-化合物)的平板添加底物来启动反应。在37℃孵育反应物60分钟。通过加入乙酸终止反应(最终100mM)。在Pherastar Fluorescent Reader(BMG)上进行读数。发射δ380nm；激发δ＝460nm。将数据(平均值+/-标准偏差)分析为％对照(无化合物)，并使用GraphPad(Prism)作图(百分比-Log化合物浓度)。数据拟合成S形曲线模型(可变斜率)。
组织蛋白酶B的活性测定
将组织蛋白酶B稀释在组织蛋白酶B缓冲液(20mM Tris HCl pH 6.8；1mM EDTA；1mM DTT中。化合物母液(100mM)在-20℃储存在DMSO中。在以下终浓度测试化合物：100μM；33.3μM；11.1μM；3.7μM；1.23μM；412nM；137nM；45.7nM；15.2nM；5nM。在Black LJL 96孔板(HE微量培养板；Molecular Devices；20μl最终反应体积)中进行平行两份反应。组织蛋白酶B特异性测定的底物浓度为36μM(z-RR-AMC；Calbiochem)。酶(组织蛋白酶B)在特异性测定中的浓度为3.6nM。测定这些浓度，以便在固定的底物浓度下，在初速度下进行特异性测定。在25℃用酶预孵育化合物30分钟。通过向包含稀释在测定缓冲液中的酶(+/-化合物)的平板添加底物来启动反应。在37℃孵育反应物60分钟。通过加入乙酸终止反应(最终100mM)。在Pherastar Fluorescent Reader(BMG)上进行读数。发射δ380nm；激发δ＝460nm。将数据(平均值+/-标准偏差)分析为％对照(无化合物)，并使用GraphPad(Prism)作图(百分比-Log化合物浓度)。数据拟合成S形曲线模型(可变斜率)。
细胞生存和增殖方法
HCT116细胞生存和增殖测定
HCT116结肠癌细胞得自ATCC(美国典型培养物保藏中心)，并保持在含有10％ FBS、3mM谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的Mc Coy’s 5A培养基中。在含5％CO2的增湿气氛中，在37℃培养细胞。
在96孔培养板(CellTiter
Aqueous Non-Radioactive Cell ProliferationAssay，Promega)中，按照生产商的说明书，使用MTS技术测定细胞生存。MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓)是MTT衍生的四唑鎓，其在代谢活跃的细胞中被还原为可溶性的、可渗透细胞的甲
。甲
的量(通过其在492nm的吸光度来检测)与活的代谢活跃的细胞数成正比。
在每个孔中接种103个HCT116细胞。24小时后，更换培养基，用以下浓度的各个化合物平行三份地处理细胞：10μM-3.33μM-1.11μM-370nM-123nM-41nM-14nM和5nM。将化合物稀释在100％DMSO中，其对细胞的终浓度保持在0.5％。
用化合物培养细胞72小时，然后通过加入MTS测定它们的存活，进行2小时。直接由96孔培养板测量在492nm的吸光度。使用S形曲线可变斜率拟合(Prism 4.0，Graphpad Softwares)计算各个化合物的GI50(生长抑制50)浓度。值表示为3个独立实验的平均值。
PC3细胞生存和增殖测定
PC-3前列腺癌细胞得自ATCC，并保持在含有7％FBS和1％青霉素/链霉素的F-12K培养基中。在含5％CO2的增湿气氛中，在37℃培养细胞。
在96孔培养板(CellTiter
Aqueous Non-Radioactive Cell ProliferationAssay，Promega)中，按照生产商的说明书，使用MTS技术测定细胞生存。MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓)是MTT衍生的四唑鎓，其在代谢活跃的细胞中被还原为可溶性的、可渗透细胞的甲
。甲
的量(通过其在492nm的吸光度来检测)与活的代谢活跃的细胞数成正比。
在每个孔中接种2x103个PC3细胞。24小时后，更换培养基，用以下浓度的各个化合物平行三份地处理细胞：10μM-3.33μM-1.11μM-370nM-123nM-41nM-14nM和5nM。将化合物稀释在100％DMSO中，其对细胞的终浓度保持在0.5％。
用化合物培养细胞72小时，然后通过加入MTS测定它们的存活，进行2小时。直接由96孔培养板测量在492nm的吸光度。使用S形曲线可变斜率拟合(Prism 4.0，Graphpad Softwares)计算各个化合物的GI50(生长抑制50)浓度。值表示为3个独立实验的平均值。
结果
1.半胱氨酸蛋白酶活性的抑制
USP5 USP7
USP8 UCH-L3
组织蛋白酶B
| 实验N° | 组织蛋白酶B |
| 5a | 2.6μM |
| 5d | 6.7μM |
| 6 | 0.300μM |
| 7 | 0.890μM |
| 8a | 15.8μM |
| 8b | 2.1μM |
| 8c | 3.8μM |
| 12 | 0.694μM |
| 13 | 0.979μM |
2.细胞生存和增殖的抑制
HCT116 PC3
Claims (38)
1.式(I)的化合物：
其中：
------适当时不存在或是单键；
其中
通过T和X稠合在一起；
T、U、V、W、X相同或不同，且可选自C、N、O、S；
Y是N-OR1、NR′1、CR2R′2；
R1是H、烷基、烯基、烷氧基烷基、芳氧基烷基、芳烷基、烷氧羰基烷基、羧烷基；
R′1是H、烷基、芳基或芳烷基；
R2、R′2各自相同或不同，且独立地选自H、烷基、芳基或芳烷基；
Ru、Rv、Rw相同或不同，且可选自H、CN、＝O、Hal、Alk、OAlk、OH、NRCN、C(CN)＝C(OH)(OAlk)、SR、NRR’、C(O)NRR’、杂环、芳基、杂芳基、环烷基，其中Alk、芳基、杂芳基、杂环、环烷基任选地被Hal、NRR’、CN、OH、CF3、芳基、杂芳基、OAlk取代；
R3、R4、R5、R6各自相同或不同，且独立地选自H、OAlk、Alk、Hal、NRR’、CN、OH、OCF3、CF3、芳基、杂芳基；
R和R’各自相同或不同，且独立地选自H、Alk，其中Alk任选地被Hal、NRR’、CN、OH、CF3、芳基、杂芳基取代；
或它们药学上可接受的盐、水合物、或水合盐、或者这些化合物的多晶型晶体结构或它们的旋光异构体、外消旋物、非对映体或对映体、或者它们的区域异构体、几何异构体(E和Z)或者它们的混合物。
2.权利要求1的式(I)的化合物，其中T、U、V、W、X独立地是C或N。
3.权利要求1或2中任一项的式(I)的化合物，其中包含2或3个杂原子。
4.前述权利要求中任一项的式(I)的化合物，其中Ru、Rv、Rw中至少一个选自H、芳基、Alk、NRR′、Hal、-Alk芳基、-AlkOH、-AlkOAlk、环烷基。
5.前述权利要求中任一项的化合物，其中R3、R4、R5、R6各自相同或不同，且独立地选自H、Hal、Alk、OAlk、OCF3。
6.前述权利要求中任一项的化合物，其中Rv、Rw独立地是H或不存在。
7.前述权利要求中任一项的式(I)的化合物，其中它们是式(Ia)：
其中R3、R4、R5、R6、Y、T、U、V、W、X、Ru如在前述权利要求中任一项中所定义。
8.前述权利要求中任一项的化合物，其选自：
-3-甲基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-甲基肟
-3-甲基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1-甲基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-3-丁基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1-丁基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-癸基肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-(2-甲氧基乙基)肟
-1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-(3-苯氧基丙基)肟
-1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-甲基肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-甲基肟
-1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-乙基肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-乙基肟
-1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-烯丙基肟
-1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-苄基肟
-3-乙基-1，2，3a，4，10-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-酮O-苄基肟
-[1-乙基-2，3，4，10，10a-五氮杂环戊二烯并[b]芴-9-亚基]苯胺
-(1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-亚基氨基氧基)乙酸乙酯
-(1，2，3，3a，4，10-六氮杂环戊二烯并[b]芴-9-亚基氨基氧基)乙酸锂盐，
或它们药学上可接受的盐、水合物、或水合盐、或者这些化合物的多晶型晶体结构或它们的旋光异构体、外消旋物、非对映体或对映体、或者它们的区域异构体、几何异构体(E和Z)或者它们的混合物。
9.制备前述权利要求1-8中任一项的式(I)的化合物的方法，其包括通过使前体基团转化为期望的Ru、Rv或Rw基团的一个或多个步骤使相应的式(I′)的化合物反应，并任选地分离所述式(I)的化合物：
其中R3、R4、R5、R6、Hetl、T、U、V、W、X、Ru、Rv、Rw如在权利要求1-7中任一项中所定义，并且其中Ru′、Rv′、Rw′各自与Ru、Rv、Rw相似或是相应的Ru、Rv、Rw的前体基团。
10.制备前述权利要求1-8中任一项的化合物的方法，其包括使相应的式(II)和式(III)的化合物进行反应的步骤：
其中R3、R4、R5、R6、T、U、V、W、X、Ru、Rv、Rw如在权利要求1-7中任一项中所定义。
11.权利要求10的方法，其中所述反应在有机质子溶剂中在酸的存在下进行。
12.药物组合物，其包含式(I)的化合物
其中R3、R4、R5、R6、T、U、V、W、X、Hetl、Ru、Rv和Rw如在权利要求1-8中所定义。
13.如权利要求12中所定义的式(I)的化合物用于制备用于抑制一种或多种半胱氨酸蛋白酶的药物的用途。
14.权利要求13的用途，其中所述半胱氨酸蛋白酶属于去泛素化酶、胱天蛋白酶、组织蛋白酶、钙蛋白酶以及病毒、细菌、真菌或寄生虫的半胱氨酸蛋白酶中的一组或多组。
15.如权利要求12中所定义的式(I)的化合物用于制备用于治疗和/或预防癌症和转移、神经退行性疾病例如阿尔兹海默氏病和帕金森病、炎症、心血管疾病和/或病毒特别是单纯疱疹病毒-1、EB病毒或SARS冠状病毒的传染性和/或潜伏的药物的用途。
16.权利要求15的用途，其中所述化合物抑制一种或多种去泛素化酶。
17.如权利要求12中所定义的式(I)的化合物用于制备用于治疗和/或预防炎症、神经退行性疾病优选由卒中导致的神经细胞损害、由急性或慢性传染性、缺血性或化学性肝损伤导致的肝损害和肝衰竭、由急性或慢性传染性、缺血性或化学性肾损伤导致的肾损害和肾衰竭、由急性或慢性传染性、缺血性或化学性心脏损伤导致的心脏损害和心力衰竭、由对胰岛的胰岛素β细胞的急性或慢性自身免疫、化学性、氧化性或代谢性损伤导致的糖尿病的药物的用途。
18.权利要求17的用途，其中所述化合物抑制一种或多种胱天蛋白酶。
19.如权利要求12中所定义的式(I)的化合物用于制备用于治疗和/或预防癌症和转移、心血管疾病、免疫性病症、骨和关节疾病、骨质疏松和关节炎的药物的用途。
20.权利要求19的用途，其中所述化合物抑制一种或多种组织蛋白酶。
21.如权利要求12中所定义的式(I)的化合物用于制备用于治疗和/或预防与衰老相关的病症、迟发性糖尿病和白内障的药物的用途。
22.权利要求21的用途，其中所述化合物抑制一种或多种钙蛋白酶。
23.如权利要求12中所定义的式(I)的化合物用于制备用于治疗和/或预防病毒感染和疾病的药物的用途。
24.权利要求23的用途，其中所述病毒感染和疾病选自甲型肝炎、丙型肝炎、SARS冠状病毒感染和疾病、鼻病毒感染和疾病、腺病毒感染和疾病、脊髓灰质炎。
25.权利要求23或24的用途，其中所述化合物抑制一种或多种病毒半胱氨酸蛋白酶。
26.如权利要求12中所定义的式(I)的化合物用于制备用于治疗和/或预防细菌感染和疾病的药物的用途。
27.权利要求26的用途，其中所述细菌感染或疾病选自链球菌感染和疾病、由梭菌属细菌导致的感染和疾病、葡萄球菌感染和疾病、龈炎和牙周疾病。
28.权利要求26或27的用途，其中所述化合物抑制一种或多种细菌半胱氨酸蛋白酶。
29.权利要求26-28中任一项的用途，其中所述化合物抑制一种或多种选自链球菌热源性毒素、梭菌蛋白酶、葡萄球菌半胱氨酸蛋白酶、牙龈菌蛋白酶的细菌半胱氨酸蛋白酶。
30.如权利要求12中所定义的式(I)的化合物用于制备用于治疗和/或预防真菌感染和疾病的药物的用途。
31.权利要求30的用途，其中所述化合物抑制一种或多种真菌半胱氨酸蛋白酶。
32.如权利要求12中所定义的式(I)的化合物用于制备用于治疗和/或预防原虫寄生虫感染和疾病的药物的用途。.
33.权利要求32的用途，其中所述化合物抑制一种或多种原虫寄生虫的半胱氨酸蛋白酶。
34.如权利要求12中所定义的式(I)的化合物用于制备用于治疗和/或预防扁虫寄生虫感染和疾病的药物的用途。
35.权利要求34的用途，其中所述化合物抑制一种或多种扁虫寄生虫的半胱氨酸蛋白酶。
36.如权利要求12中所定义的式(I)的化合物用于制备用于治疗和/或预防线虫寄生虫感染和疾病的药物的用途。
37.权利要求36的用途，其中所述化合物抑制一种或多种线虫寄生虫的半胱氨酸蛋白酶。
38.权利要求15-37中任一项的用途，其中所述所述药物与一种或多种选自抗癌治疗药、神经治疗药、溶栓治疗药、抗氧化治疗药、抗感染药、抗高血压治疗药、利尿治疗药、溶栓治疗药、免疫抑制治疗药、心血管治疗药、免疫调节治疗药、抗炎治疗药、抗病毒治疗药、抗细菌治疗药、抗真菌治疗药、抗原虫治疗药、抗寄生虫治疗药的治疗药联合使用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130424 Termination date: 20191025 |