DE69913285T2

DE69913285T2 - DsbA/DsbB/DsbC/DsbD Expressionsplasmid

Info

Publication number: DE69913285T2
Application number: DE69913285T
Authority: DE
Inventors: Yoichi Shimogyo-ku Kurokawa; Hideki Takarazuka-shi Yanagi; Takashi Kyoto-shi Yura
Original assignee: HSP Research Institute Inc
Current assignee: HSP Research Institute Inc
Priority date: 1998-09-09
Filing date: 1999-09-09
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2019-09-10
Also published as: US6673569B1; CA2281035A1; ATE255637T1; EP0992588A1; EP0992588B1; JP2000083670A; DE69913285D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein DsbA/DsbB/DsbC/DsbD-Expressionsplasmid. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein künstliches Operon, umfassend Polynucleotide, die jeweils DsbA, DsbB, DsbC und DsbD codieren, wobei das Operon ein Fremdprotein in einer löslichen Form exprimieren kann, wobei es eine normale Konformation aufrechterhält, ein das Operon tragende Expressionsplasmid, eine das Expressionsplasmid tragende Cotransformante und einen Expressionsvektor für ein Fremdprotein sowie ein Verfahren zur Herstellung eines Fremdproteins, umfassend die Züchtung der Cotransformante.
Viele der von Eukaryonten abstammenden Proteine besitzen Disulfidbrücken und man erwartet normalerweise nicht, dass sie eine natürliche Tertiärstruktur besitzen, wenn sie im Cytoplasma von E. coli unter stark reduktiven Bedingungen exprimiert werden. Deshalb berücksichtigt man bei der Herstellung eines derartigen Proteins, damit es wirksam ist, dass eine sekretorische Expression in das Periplasma unter den für die Erzeugung der Disulfidbrücke geeigneten oxidativen Bedingungen erfolgt. Es ist nicht nur gut möglich, dass ein Protein exprimiert wird, das seine natürliche Konformation besitzt, sondern man kann auch verschiedene Vorteile durch die Expression über die Sekretion erwarten, einschließlich der Möglichkeit, ein für Zellen toxisches Protein zu exprimieren; der Möglichkeit, ein Protein zu exprimieren, bei dem Methionin nicht an dessen N-Terminus hinzugefügt ist und die Erleichterung der Reinigung aufgrund einer verringerten Menge kontaminierender Proteine. Jedoch gibt es verschiedene Berichte darüber, dass versucht wurde, heterologe Proteine in das Periplasma von E. coli zu sekretieren, jedoch können nicht alle heterologen Proteine in den Formen exprimiert werden, in denen sie ihre Aktivitäten zeigen. Dies ist insbesondere in dem Fall ein Problem, in dem ein Protein eine große Anzahl an Disulfidbrücken besitzt.
Andererseits wurde in E. coli mittels biochemischer Tests und Komplementaritätstests unter Verwendung entsprechender Deletionsstämme auf die Rolle von DsbA, DsbB, DsbC und DsbD geschlossen, die die Proteine der Dsb-Familie sind, welche an der Erzeugung von Disulfidbrücken beteiligt sind [Bardwell, J. C., Mol. Microbiol. 14, 199–205 (1994); Sone, M. et al., J. Biol. Chem., 272, 10349–10352 (1997); Rietsch, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13048–13053 (1996)].
Zuerst tritt DsbA in Aktion, so dass Disulfidbrücken in einer naszierenden Polypeptidkette erzeugt werden, die in das Periplasma übertragen wurde. Die in diesem Stadium gebildeten Disulfidbrücken sind nicht unbedingt korrekt und werden dann mittels Spaltung der Disulfidbrücken, gefolgt von einer erneuten Quervernetzung, indem DsbC in Aktion tritt, in richtige Disulfidbrücken berichtigt. DsbA und DsbC besitzen jeweils ein Thioredoxin-artiges Motiv im aktiven Zentrum (Cys-X-X-Cys). Man glaubt, dass im Cys-X-X-Cys-Motiv 2 Cys-Reste an der Reaktion beteiligt sind. Beim Vorgang der Erzeugung von Disulfidbrücken oxidieren die 2 Cys-Reste im aktiven Zentrum von DsbA eine Substratpeptidkette, während sie selbst reduziert werden. Zwei Cys-Reste im aktiven Zentrum von DsbC werden als Folge der Reduktion der Disulfidbrücken des einmal erzeugten Substrats gespalten, während sie selbst oxidiert werden. Da eine reduzierte Form von DsbA und eine oxidierte Form von DsbC keine katalytischen Aktivitäten mehr besitzen, ist ein Faktor zur Reaktivierung dieses DsbA und DsbC erforderlich. Das intrazelluläre Membranprotein DsbB reoxidiert DsbA bzw. das intrazelluläre Membranprotein DsbD reoxidiert DsbC, indem die Thioredoxin-artigen Motive in Aktion treten, die in der periplasmatischen Seite vorliegen.
Zum Zwecke der Verbesserung der Sekretion eines gewünschten Proteins ins Periplasma wurden mehrere Versuche unternommen, von denen man bisher nicht sagen konnte, ob sie erfolgreich waren, DsbA oder DsbC zusammen mit einem gewünschten Protein über zu exprimieren. Beispielsweise offenbaren Knappik et al., dass DsbA zur Faltung eines exprimierten Produkts bei der Sekretion eines Antikörperfragments erforderlich ist; jedoch blieb bis jetzt das Problem bestehen, dass sich die Effizienz der Faltung auch bei einer Überexprimierung nicht ändert [Knappik, A. et al., Bio/Technol., 11, 77–83 (1993)]. Außerdem offenbaren Wunderlich und Glockschuber, dass die Faltung eines α-Amylase/Trypsin-Inhibitors nicht durch die Überexprimierung von DsbA verbessert wird, aber in Gegenwart einer reduktiven Form von Glutathion 14-fach erhöht wird [Wunderlich, M. und Glockschuber, R., J. Biol. Chem., 268, 24547–24550 (1993)]. Ferner offenbaren Wulfing und Pluckthum, dass die Überexprimierung von DsbA einige Auswirkungen auf die Expression bei der löslichen Form eines T-Zellrezeptorfragments im Periplasma hat; es ist jedoch notwendig, zusätzlich zu DsbA gleichzeitig einen Hitzeschock-Sigmafaktor σ³² über zu exprimieren [Wulfing, C. und Pluckthum, A., J. Mol. Biol., 242, 655–669 (1994)]. Vor kurzem fanden Joly et al. heraus, dass die Überexprimierung von DsbA oder DsbC dazu dient, das Expressionsniveau eines insulinartigen Wachstumsfaktors I (IGF-I) im Periplasma um das Doppelte ansteigen zu lassen; jedoch gibt es immer noch den Nachteil, dass ein lösliches Expressionsprodukt entgegen den Erwartungen reduziert wird [Joly, J. C. at al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2773–2777 (1998)].
Ferner beschrieben Missiakas et al. [EMBO J., 14 (14), 3415–3425 (1995)] ein weiteres Mitglied der Dsb-Familie, DsbD. Es wird beschrieben, dass das Fehlen der DsbD-Funktion zu globalen Defekten bei der Erzeugung von Disulfidbrücken führt.
Somit besteht das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem darin, dass Mittel und Verfahren zur Verbesserung der Expression und/oder Sekretion von aktiven heterologen Proteinen in Prokaryonten bereitgestellt werden.
Die Lösung des technischen Problems wird durch Bereitstellung der durch die Ansprüche charakterisierten Ausführungsformen erreicht.
Folglich ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein künstliches Operon bereitzustellen, das Polynucleotide umfasst, die jeweils DsbA, DsbB, DsbC und DsbD codieren, wobei das Operon ein Fremdprotein in einer löslichen Form exprimieren kann, wobei es eine normale tertiäre Struktur aufrechterhält.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein künstliches Operon, das Polynucleotide umfasst, die jeweils DsbC und DsbD codieren.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Expressionsplasmid bereit, das das Operon trägt.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Cotransformante bereit, die das Plasmid und einen Expressionsvektor für ein Fremdprotein trägt.
In einer noch weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Fremdproteins bereit, umfassend die Züchtung der Cotransformante.
Diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung offensichtlich.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Befund, dass eine genaue Erzeugung der Disulfidbrücke im Periplasma überraschend effizient durchgeführt werden kann, und man ferner ein lösliches Expressionsprodukt effizient erhalten kann, wenn ein Expressionsvektor der Familie der Dsb-Proteine konstruiert wird, der ein Protein (DsbA oder DsbC) zur Erzeu gung isomerisierender Disulfidbrücken sowie ein Protein (DsbB oder DsbD) umfasst, das die Reaktivität von DsbA oder DsbC kontrolliert, und die Auswirkungen der gemeinsamen Expression dieser Proteine bei der Sekretion eines Fremdproteins untersucht werden.
Zusammengefasst betrifft die vorliegende Erfindung folgendes:

[1] ein künstliches Operon, das Polynucleotide umfasst, die jeweils DsbA, DsbB, DsbC und DsbD oder DsbC und DsbD codieren;
[2] ein das künstliche Operon tragendes Expressionsplasmid nach dem vorstehenden Punkt [1], das für die Expression von DsbA, DsbB, DsbC und DsbD oder DsbC und DsbD verwendbar ist;
[3] eine das Expressionsplasmid tragende Cotransformante nach dem vorstehenden Punkt [1], und einen Expressionsvektor für ein Fremdprotein und
[4] ein Verfahren zur Herstellung eines Fremdproteins, umfassend die Züchtung der Cotransformante nach dem vorstehenden Punkt [3].

Die vorliegende Erfindung ist anhand der nachstehend aufgeführten detaillierten Beschreibung und den begleitenden Zeichnungen, die ausschließlich als Beispiel dienen, und somit die vorliegende Erfindung nicht einschränken, besser zu verstehen, wobei:
1 eine schematische Ansicht ist, die pT7B/dsbA, pT7B/dsbB, pT7B/dsbC, pT7B/dsbD und pT7B/dsbABCD darstellt;
2 eine schematische Ansicht ist, die die Konstruktion eines Expressionsvektors darstellt;
3 eine schematische Ansicht ist, die einen Expressionsvektors darstellt, der pAR5/ dsbA, pAR5/dsbB, pAR5/dsbC, pAR5/dsbD und pAR5/dsbABCD enthält;
4 die analytischen Ergebnisse auf einer SDS-PAGE der exprimierten Proteine der Dsb-Familie darstellt;
5 die Änderungen bei einem Gesamtexpressionsniveau von NGF-β oder bei einem sich in jeder Fraktion ansammelnden Produktniveau hinsichtlich der Änderungen in der Arabinosekonzentration darstellt (G: Gesamtzellextrakt; P: Periplasma);
6 eine graphische Darstellung ist, die das Wachstum der Zellen bei der HRP-Expression zeigt;
7 die Änderungen bei einem Gesamtexpressionsniveau von HRP oder bei einem sich in jeder Fraktion ansammelnden Produktniveau hinsichtlich der Änderungen in der Arabinosekonzentration darstellt (G: Gesamtzellextrakt; P: Periplasma);
8 die Änderungen der OmpA-HRP-Spiegel nach 0, 30, 85, 150 und 240 Minuten nach der Zugabe von IPTG und die Lokalisierung darstellt (G: Gesamtzellfraktion; P: Periplasma-lösliche Fraktion und S: Sphäroblastenfraktion); und
9 eine Reihe graphischer Darstellungen ist, die die relativen Expressionsniveaus von OmpA-HRP zeigen, wie sie anhand der Ergebnisse in 8 bestimmt wurden, wobei die obere Zeichnung eine graphische Darstellung ist, die die Ergebnisse der Kontrolle zeigt und die untere Zeichnung eine graphische Darstellung ist, die die Ergebnisse von pAR5/dsbABCD zeigt.
Eines der wichtigsten Merkmale des künstlichen Operons der vorliegenden Erfindung beinhaltet, dass das künstliche Operon Polynucleotide umfasst, die jeweils DsbA, DsbB, DsbC und DsbD codieren, die Proteine der Dsb-Familie sind. Da das künstliche Operon, das Polynucleotide umfasst, die jeweils DsbC und DsbD codieren, ebenfalls ausgezeichnete Wirkungen hat, liegt es zusätzlich im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Das künstliche Operon, das Polynucleotide umfasst, die jeweils DsbA, DsbB, DsbC und DsbD codieren, wird unter dem Gesichtspunkt bevorzugt, dass es eine höhere Effizienz als das künstliche Operon aufweist, das Polynucleotide umfasst, die jeweils DsbC und DsbD codieren. Da das künstliche Operon die vorstehenden Polynucleotide umfasst, kann eine höhere Effizienz erzielt werden, so dass die Disulfidbrücken eines Fremdproteins richtig gebildet werden können, wenn sie zusammen mit dem Fremdprotein exprimiert werden, wobei ein lösliches Expressionsprodukt effizient erhalten werden kann.
In der vorliegenden Erfindung sind die Proteine der Dsb-Familie diejenigen, die an der Erzeugung von Disulfidbrücken beteiligt sind und die Proteine der Dsb-Familie schließen DsbA, DsbB, DsbC und DsbD ein. Man glaubt, dass DsbA die Funktion hat, Disulfidbrücken in einer naszierenden Polypeptidkette zu erzeugen, die in das Periplasma übertragen wurde, und DsbC die Funktion hat, die bereits durch DsbA erzeugten Disulfidbrücken in die richtigen Disulfidbrücken mittels Spaltung der Disulfidbrücken, gefolgt von erneuter Quervernetzung, zu berichtigen. Außerdem wird in Betracht gezogen, dass DsbB dazu dient, DsbA zu reoxidieren bzw. DsbD dazu dient, DsbC zu reoxidieren. Die dsbA-, dsbB-, dsbC-und dsbD- Gene, die jeweils die Proteine der Dsb-Familie codieren, bilden keine Operons, so dass man ihre jeweilige Expression als unabhängig reguliert erachten kann.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ein Operon, das Polynucleotide umfasst, die jeweils DsbC und DsbD codieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung das Operon, das ferner Polynucleotide umfasst, die jeweils DsbA und DsbB codieren.
Die vorstehend beschriebenen Proteine der Dsb-Familie schließen ein Protein ein, das von E. coli stammt, und deren Ursprung ist nicht besonders eingeschränkt, solange sie die gleichen vorstehend erwähnten Funktionen besitzen. Bespiele davon schließen Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae und dergleichen ein. Unter dem Gesichtspunkt der Expression eines Fremdproteins in einer stabilisierten und löslichen Form in E. coli werden die Proteine der Dsb-Familie bevorzugt, die von E. coli stammen.
Die Aminosäuresequenzen von DsbA, DsbB, DsbC und DsbD lauten wie in den SEQ ID NR: 1, 3, 5 bzw. 7 im Sequenzprotokoll dargestellt und die Nucleotidsequenzen der Gene, die DsbA, DsbB, DsbC und DsbD codieren, lauten wie in den SEQ ID NR: 2, 4, 6 bzw. 8 im Sequenzprotokoll dargestellt.
Die vorstehend erwähnten Aminosäuresequenzen von DsbA, DsbB, DsbC und DsbD können ferner eine Sequenz sein, in die eine Mutation wie eine Substitution, Deletion, Addition oder Insertion von einem oder mehreren Aminosäureresten in die jeweiligen Aminosäuresequenzen eingeführt wird, solange das sich ergebende Polypeptid eine gleiche Funktion wie vorstehend besitzt. Zusätzlich können zwei oder mehrere Arten von Mutationen in eine Sequenz eingeführt werden, solange das sich ergebende Polypeptid die gleiche Funktionen wie vorstehend besitzt. Die vorstehenden Mutationen können natürlich auftretende oder künstlich eingeführte Mutationen sein.
Die Nucleotidsequenzen der dsbA-, dsbB-, dsbC-und dsbD-Gene können auch eine Sequenz sein, in die eine Mutation als Substitution, Deletion, Addition oder Insertion von einer oder mehreren Basen in die jeweilige Nucleotidsequenz oder in die degenerierten Varianten eingeführt wird, solange die Nucleotidsequenz ein Polypeptid codiert, das die gleiche Funktion wie vorstehend besitzt. Zusätzlich können zwei oder mehrere Arten von Mutationen in eine Sequenz eingeführt werden, solange die Nucleotidsequenz die gleichen Funktionen wie vorstehend besitzt.
Polynucleotide, die jeweils DsbA, DsbB, DsbC oder DsbD codieren, können Polynucleotide sein, die sich von der SEQ ID NR: 2, 4, 6 oder 8 aufgrund eines degenerierten Codes unterscheiden. Zusätzlich kann die Nucleotidsequenz auch eine Nucleotidsequenz sein, die aus Genen besteht, die mit irgendeinem der Gene, wie in den SEQ ID NR: 2, 4, 6 und im Sequenzprotokoll dargestellt, oder degenerierte Varianten davon, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen hybridisiert, solange die Nucleotidsequenz ein Polypeptid codiert, das die gleiche Funktion wie vorstehend besitzt. Hier entsprechen die Hybridisierungsbedingungen beispielsweise denjenigen, die in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausg. (Sambrook, J. et al., herausgegeben von Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, herausgegeben 1989) und dergleichen beschrieben werden.
Hybridisierungen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen umfassen z. B. Inkubationsschritte in 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 65°C.
Ferner können die Polynucleotide Polypeptide codieren, die von einem Polynucleotid codiert werden, das mit dem Komplementärstrang der SEQ ID NR: 2, 4, 6 oder 8 hybridisiert.
Die vorstehend beschriebenen Gene können mittels gentechnischer Verfahren erhalten werden, die im zuvor erwähnten Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausg. und dergleichen beschrieben werden.
Konkret kann das vorstehend beschriebene Gen erhalten werden beispielsweise mittels eines Durchmusterungsverfahrens unter Verwendung einer Sonde, die mit dem vorstehend beschriebenen Gen hybridisiert; mittels eines Verfahrens, umfassend die Spaltung eines Fragments, das das gewünschte Gen enthält, mit einem geeigneten Restriktionsenzym und Clonierung des Fragments; mittels eines PCR-Verfahrens unter Verwendung eines Primerpaares mit einer Sequenz, das jedes der Gene amplifizieren kann, und dergleichen.
Das Verfahren, um das Gen mittels des PCR-Verfahrens unter Verwendung eines Primerpaares mit einer Sequenz zu erhalten, die jedes der Gene amplifizieren kann, wird hier nachstehend beschrieben.
Der in der PCR verwendete Primer schließt einen Primer mit einer Sequenz ein, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit der Nucleotidsequenz der vorstehend beschriebenen Gene oder einer dazu komplementären Sequenz hybridisieren kann. In dem vorstehend beschriebenen Primer kann dessen Nucleotidsequenz eine Restriktionsenzymerkennungsschnittstelle besitzen, um die Durchführbarkeit zu vereinfachen. Primer zur Amplifizierung des dsbA-Gens sind beispielsweise die Primer wie sie in den SEQ ID NR: 9 und 10 im Sequenzprotokoll dargestellt sind. Primer zur Amplifizierung des dsbB-Gens sind beispiels weise die Primer wie sie in den SEQ ID NR: 11 und 12 im Sequenzprotokoll dargestellt sind. Primer zur Amplifizierung des dsbC-Gens sind beispielsweise die Primer wie sie in den SEQ ID NR: 13 und 14 im Sequenzprotokoll dargestellt sind. Primer zur Amplifizierung des dsbD-Gens sind beispielsweise die Primer wie sie in den SEQ ID NR: 15 and 16 im Sequenzprotokoll dargestellt sind.
Die Matrize, die durch das PCR-Verfahren zur Clonierung verwendet wird, schließt beispielsweise pSK220, der die dsbA- und dsbB-Gene trägt [Kamitani, S. et al., EMBO J., 11, 57–62 (1992)]; pSS51, der die dsbA- und dsbB-Gene trägt [Kishigami, S. und Ito, K., Genes Cells, I, 201–208 (1996)]; die Kohara-Clone Nr. 468 und 648, die die dsbC- und dsbD-Gene tragen [Kohara, Y. et al., Cell, 50, 495–508 (1987)] und dergleichen ein.
Die Zusammensetzung für ein Reaktionsgemisch, der Thermozyklus für die Reaktion und dergleichen bei der Durchführung des PCR-Verfahrens können entsprechend eingestellt werden, indem das Vorhandensein oder die Abwesenheit des sich ergebenden amplifizierten Produkts beobachtet wird. Konkret können beispielsweise bei der Amplifizierung des dsbA-, dsbB- oder dsbC-Gens 25 Reaktionszyklen durchgeführt werden, wobei ein Zyklus aus 98°C, 5 Sekunden; 65°C, 2 Sekunden und 74°C, 30 Sekunden unter Verwendung von 50 μl eines Reaktionsgemisches mit der Zusammensetzung von 50 pmol Primer, 10 ng Matrizen- DNA, 1 U KOD-DNA-Polymerase (hergestellt von TOYOBO CO., LTD.), 0,2 mM dNTP, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 1 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 0,001% BSA, 1 mM MgCl₂ und 120 mM Tris-HCl (pH 8,0) besteht. Zusätzlich können bei der Amplifizierung des dsbD-Gens 25 Reaktionszyklen nach einer 1-minütigen Behandlung bei 94°C durchgeführt werden, wobei ein Zyklus aus 98°C, 20 Sekunden und 68°C, 3 Minuten unter Verwendung von TaKaRa-LA-Tag^TM (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) anstatt der KOD-DNA-Polymerase in den vorstehenden PCR-Bedingungen und ferner unter Verwendung eines Gesamtvolumens von 50 μl Reaktionsgemisch [Zusammensetzung: 10 pmol Primer, 2,5 ng Matrizen-DNA, 2,5 U Ta-KaRa-LA-Tag^TM, 0,4 mM dNTP und ×10 TaKaRa-LA-Puffer (pH 8,0)] besteht.
Im Operon der vorliegenden Erfindung ist die Reihenfolge der dsbA-, dsbB-, dsbC- und dsbD-Gene nicht besonders eingeschränkt, solange die Proteine der Dsb-Familie exprimiert werden. Ein Beispiel schließt ein polycistronisches Operon ein, bei dem die Gene hintereinander in der Reihenfolge dsbA-dsbB-dsbC-dsbD und dergleichen angeordnet sind. Übrigens ist die Nucleotidsequenz des polycistronischen Operons, in dem die vorstehend erwähnten Gene hintereinander in der Reihenfolge dsbA-dsbB-dsbC-dsbD angeordnet sind, in der SEQ ID NR: 17 im Sequenzprotokoll dargestellt.
Zusätzlich ist vorzuziehen, dass jedes der dsbA-, dsbB-, dsbC- und dsbD-Gene eine ribosomale Bindungsstelle (SD-Sequenz) stromaufwärts seines entsprechenden Strukturgens besitzt und es ist besonders vorzuziehen, dass jedes dieser Gene eine ribosomale Bindungsstelle 7 bis 10 bp stromaufwärts seines entsprechenden Strukturgens besitzt.
Im Operon der vorliegenden Erfindung können die Gene unter der Kontrolle eines Promotors vorliegen. Unter dem Gesichtspunkt der Regulierung des Expressionsniveaus der Proteine der Dsb-Familie ist vorzuziehen, dass der Promotor zur Transkriptionskontrolle des vorstehend beschriebenen Operons, das unter der Kontrolle eines Promotors vorliegt, ein induzierbarer Promotor ist. Beispiele eines induzierbaren Promotors schließen beispielsweise lac, tac, trc, trp, ara, Pzt-1, P_L und T7 ein. Die lac-, tac- und trc-Promotoren können unter Verwendung von Isopropyl-β-D-thio-galactopyranosid (IPTG) induziert werden; die trp-, ara- und Pzt-1-Promotoren können unter Verwendung von 3-Indolacrylsäure (IAS), L-Arabinose bzw. Tetracyclin induziert werden. Der P_L-Promotor kann bei hoher Temperatur (42°C) induziert werden. Es ist auch der T7-Promoter verwendbar, der von der T7-RNA-Polymerase spezifisch und im hohem Maße transkribiert wird. In dem Fall, in dem ein T7-Promotor verwendet wird, kann der T7-Promoter mit IPTG induziert werden, indem als Wirt ein E. coli-Samm verwendet wird, der einen lysogenen λ-Phagen trägt, der das T7-RNA-Polymerasegen trägt, das sich stromabwärts des lac-Promotors befindet. Unter dem Gesichtspunkt der Vereinfachung bei der Durchführbarkeit der Induktion sind die Promotoren lac, tac, trc, trp, ara, Pzt-1 und T7 zu bevorzugen. Der vorstehende Promotor ist in einem bekannten Vektor enthalten und kann verwendet werden, indem er entsprechend aus dem Vektor mit einem Restriktionsenzym und dergleichen herausgespalten wird.
Die Verwendung von Promotoren zur Kontrolle der Genexpression wurde z. B. von Sambrook et al. (Kapitel 17, Seite 10 bis 16 in „Molecular cloning, a laboratory manual", zweite Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor Laboratory press) beschrieben. Besonders induzierbare Promotoren wurden von verschiedenen Autoren beschrieben, z. B. der lac-Promotor von Yanisch-Peron et al. (Gene (1985), 33: 103–119), der tac-Promotor von deBoer et al. (Proc Natl Acad Sci USA (1983), 80: 21–25), der trc-Promotor von Brosius et al. (J Biol Chem (1985), 260: 3539–3541), der ara-Promotor von Perez-Perez und Guitierrez (Gene (1995), 158: 141–142) oder der Pzt-1-Promotor von Lutz und Bujard (Nucleic Acid Res (1997), 25: 1203–10).
Im Operon der vorliegenden Erfindung können die Proteine der Dsb-Familie stabiler exprimiert werden, wenn das Operon einen Terminator wie rrnBT1T2 trägt. Diese Terminatoren sind in einem bekannten Vektor enthalten und können durch geeignete Spaltung aus einem Vektor mit einem Restriktionsenzym oder dergleichen erhalten werden. Der Terminator rrnBT1T2 wird von Omori et al. (Plasmid (1994), 31: 297–99) beschrieben.
Eines der wichtigsten Merkmale des Expressionsplasmids der vorliegenden Erfindung beinhaltet, dass DsbA, DsbB, DsbC und DsbD vom Expressionsplasmid exprimiert werden können und dass das Expressionsplasmid das vorstehend beschriebene Operon trägt.
Wie vorstehend beschrieben, wird bevorzugt, dass das Expressionsplasmid der vorliegenden Erfindung die Proteine der Dsb-Familie nämlich DsbA, DsbB, DsbC und DsbD unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors exprimiert.
Wenn das Expressionsplasmid der vorliegenden Erfindung in einen Wirt eingeführt wird, kann zusätzlich ein Plasmid, das auf demselben Plasmid das vorstehend beschriebene Operon und ein Gen trägt, das ein gewünschtes Fremdprotein codiert, verwendet werden oder es können auch getrennte Plasmide, damit sie entweder das Operon oder das Gen tragen, das ein Fremdprotein codiert (hier nachstehend als Coexpressionsplasmid bezeichnet), verwendet werden. Unter dem Gesichtspunkt, dass es nicht notwendig ist, ein Plasmid für jedes Fremdprotein herzustellen sowie unter dem Gesichtspunkt der Stabilität des Plasmids in einem Wirt wird unter ihnen das Coexpressionsplasmid bevorzugt. Der hier verwendete Begriff „Fremdprotein" bezieht sich auf das gewünschte Protein mit Ausnahme von DsbA, DsbB, DsbC und DsbD.
Um das Expressionsniveau und die Wahl des richtigen Zeitpunkts der Expression der vorstehend beschriebenen Proteine der Dsb-Familie zu optimieren, ohne das Expressionsniveau eines Fremdproteins zu erniedrigen, ist es vorteilhafter, die Expression der Proteine der Dsb-Familie unabhängig von der Expression des gewünschten Proteins zu kontrollieren. Ein für die Expression der Proteine der Dsb-Familie verwendeter induzierbarer Promotor ist vorzugsweise einer, der sich von demjenigen unterscheidet, der bei der Expression des gewünschten Proteins verwendet wird.
Wenn ein Coexpressionsplasmid als das vorstehend beschriebene Expressionsplasmid verwendet wird, kann jedes Plasmid verwendet werden, solange das Plasmid ein Replikon besitzt, das mit einem Expressionsvektor für ein gewünschtes Protein in E. coli kompatibel ist, der als Wirt verwendet wird. Wenn beispielsweise ein Vektor mit einem ColE1-Replikon wie pBR322 als Expressionsvektor für ein gewünschtes Protein verwendet wird, kann das im pA-CYC-Vektor vorliegende p15A-Replikon für ein Plasmid zur Expression der Proteine der Dsb-Familie der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Konkrete Beispiele des Expressionsplasmids der vorliegenden Erfindung schließen ein Coexpressionsplasmid pARS/dsbABCD ein. Dieses pAR5/dsbABCD ist, wie in 3 dargestellt, ein Plasmid, das auf aufeinanderfolgende Insertionen von dsbA-, dsbB-, dsbC- und dsbD-Genen an der Multiclonierungsstelle von Plasmid pAR5 zurückzuführen ist, wobei pAR5 ein Chloramphenicol-Resistenzgen und den ara-Promotor trägt, der die Expression mit Arabinose induzieren kann, die von pAR3 einem Derivat des pACYC184-Vektors stammen [Perez et al., Gene, 158, 141–142 (1995)] sowie stromabwärts vom vorstehenden ara-Promotor die Multiclonierungsstelle und den rrnBT1T2-Terminator trägt, der von pTrc99A stammt (hergestellt von Pharmacia). pARS/dsbABCD kann die Expression der vorstehend beschriebenen Proteine der Dsb-Familie durch Zugabe von Arabinose induzieren. pAR5/dsbABCD kann auch zur richtigen Bildung von Disulfidbrücken in einem Fremdprotein zusammen mit einem anderen Plasmid beitragen, das ein Gen trägt, das das Fremdprotein codiert, wobei ein lösliches Expressionsprodukt mit hoher Effizienz hergestellt wird.
Das vorstehend beschriebene Plasmid kann durch ein Verfahren konstruiert werden, das beispielsweise im vorstehend erwähnten Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausg. beschrieben wird.
Ferner kann das Plasmid der vorliegenden Erfindung gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen enthalten, um die Selektion bei der Transformation zu erleichtern. Beispiele derartiger Selektionsmarkergene schließen Ampicillinresistenz (Amp^r)-Gene, Kanamycin-Resistenz (Km^r)-Gene, Chloramphenicol-Resistenz (Cm^r)-Gene und dergleichen ein. Es ist wünschenswert, dass sich im Coexpressionsplasmid das Selektionsmarkergen von dem Selektionsmarkergen unterscheidet, das im Expressionsvektor für ein Fremdprotein enthalten ist.
Eines der wichtigen Merkmale der Cotransformante der vorliegenden Erfindung beinhaltet, dass die Cotransformante das vorstehend beschriebene Expressionsplasmid (Coexpressionsplasmid) sowie einen Expressionsvektor für ein Fremdprotein trägt.
Die vorstehende Cotransformante kann erhalten werden, indem ein Expressionsplasmid (das Coexpressionsplasmid), das typischerweise durch das vorstehend beschriebene pAR5/dsbABCD beispielhaft angegeben wird, zusammen mit einem Expressionsvektor für ein Fremdprotein transformiert wird, das ein Gen trägt, das das Fremdprotein codiert.
Der Expressionsvektor für ein Fremdgen, der in der Cotransformante verwendet wird oder das Expressionsplasmid, das ein vorstehend beschriebenes Fremdprotein codiert, ist nicht besonders eingeschränkt, und sie können ein gewünschtes Fremdprotein in das Cytoplasma einer Zelle exprimieren oder können ein gewünschtes Fremdprotein in das Periplasma einer Zelle sekretieren, wobei der Vektor mit dem vorstehend beschriebenen Expressionsplasmid kompatibel ist. Besonders bevorzugt ist ein Vektor oder ein Expressionsplasmid, der/das ein Fremdprotein codiert, bei dem die Expression eines gewünschten Fremdproteins unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors induziert werden kann. Der induzierbare Promotor schließt Promotoren ein, die denjenigen ähneln, die vorstehend beschriebenen wurden. Die Proteine der Dsb-Familie und ein gewünschtes Protein können getrennt zur Expression induziert werden, indem ein anderer Promotor als der bei der Induktion verwendete zur Expression der Proteine der Dsb-Familie in der vorliegenden Erfindung gewählt wird.
Zusätzlich kann der Expressionsvektor oder das Plasmid für ein Fremdgen gegebenenfalls auch ein selektives Markergen umfassen. Das vorstehende Selektionsmarkergen schließt diejenigen ein, die vorstehend beschrieben wurden und die Doppelselektion der Cotransformante kann erreicht werden, indem ein Selektionsmarkergen verwendet wird, das ein anderes ist als das, welches im Expressionsplasmid (Coexpressionsplasmid) der vorliegenden Erfindung enthalten ist.
Das Expressionsplasmid, das Polynucleotide umfasst, die ein Fremdprotein oder den Expressionsvektor für ein vorstehend beschriebenes Fremdgen umfassen, können unter dem Gesichtspunkt der Bildung geeigneter Disulfidbrücken im sich ergebenden Fremdprotein vorzugsweise in das Periplasma einer Zelle sekretieren.
Beispiele des Vektors oder Plasmids schließen einen Vektor/ein Plasmid ein, der/das ein Gen trägt, das ein Polypeptid codiert, das durch Zugabe eines Signalpeptids OmpA, OmpT, MalE, β-Lactamase oder dergleichen in das gewünschte Fremdprotein erzeugt wird. Der vorstehende Vektor oder das vorstehende Plasmid können beispielsweise erhalten werden, indem man ein Polynucleotid, das das vorstehend erwähnte Signalpeptid codiert, mittels gentechnischer Verfahren einer Position auf einem Gen hinzufügt, das dem N-Terminus eines gewünschten Fremdproteins entspricht, und indem man das sich ergebende Gen in einen bekannten Vektor einbaut.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Expressionsplasmid oder einen Expressionsvektor, wobei das Fremdprotein ein Fusionsprotein ist.
Folglich kann der Expressionsvektor oder das Expressionsplasmid der vorliegenden Erfindung auch eine Sequenz enthalten, mit der ein Verfahren zur Reinigung eines gewünschten Fremdproteins durchgeführt werden kann, typischerweise beispielhaft angegeben durch beispielsweise die Expression als Fusionsprotein mit einem Protein wie β-Galactosidase, Glutathion-S-Transferase und Maltose-bindendes Protein; die Expression als Protein, das einen hinzugefügten Histidin-Tag besitzt und dergleichen, solange die Ziele der vorliegenden Erfindung nicht behindert werden.
In einer anderen Ausführungsform wird eine Wirtszelle mit dem vorstehenden Operon, Plasmid oder Vektor transformiert. Vorzugsweise ist die Wirtszelle, die das Operon, das Plasmid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung enthält, eine Bakterienzelle, besonders bevorzugt eine E. coli-, Streptomyces-, Pseudomonas aeruginosa-, Haemophilus influenzae- oder eine Salmonella typhimurium-Zelle.
Ferner schließen konkrete Beispiele von E. coli-Wirtszellen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, allgemein verwendete Stämme wie HB101, JM109, MC4100, MG1655 und W3110 und verschiedene Mutanten, einschließlich Proteasemutanten, wie degP-Mutanten, ompT-Mutanten, tsp-Mutanten, lon-Mutanten, clpPX-Mutanten, hslV/U-Mutanten, lon-clpPX-Doppelmutanten und Ion-clpPX-hslV/U-Dreifachmutanten; plsx-Mutanten; rpoH-Deletionsmutanten; rpoH-Fehlpaarungsmutanten und dergleichen ein.
In der vorliegenden Erfindung schließen konkrete Beispiele von Proteasemutanten degP-Mutanten, ompT-Mutanten, tsp-Mutanten, lon-Mutanten, lon-clpPX-Doppelmutanten ein, und Ion-clpPX-hslV/U-Dreifachmutanten sind unter dem Gesichtspunkt der stabileren Expression eines Fremdproteins zu bevorzugen.
Eine bevorzugte lon-clpPX-Doppelmutante ist hier der E. coli-Stamm KY2783, der vom E. coli-Stamm W3110 stammt, der durch Einführung von Doppeldeletionsmutantionen in den lon- und clpPX-Genen hergestellt wird [bezeichnet und identifiziert als E. coli KY2783 und unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6244 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, hinterlegt, dessen Adresse 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305–8566, Japan lautet; Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 3. Februar 1998].
Der Begriff „lon-clpPX-hslV/U-Dreifachmutante" bezieht sich auch auf eine Mutante, die durch eine weitere Einführung einer Mutation des hslV/U-Gens hergestellt wurde, das die HslV/U-Protease in der vorstehend beschriebenen lon-clpPX-Doppelmutante codiert. Eine bevorzugte lon-clpPX-hslV/U-Dreifachmutante ist der E. coli-Stamm KY2783, der vom E. coli-Stamm W3110 stammt, der durch Einführung von Dreifachdeletionsmutantionen in den lon- und clpPX- und hslV/U-Genen hergestellt wurde [bezeichnet und identifiziert als E. coli KY2783 und unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6244 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, hinterlegt, dessen Adresse 11–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305–8566, Japan lautet; Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 3. Februar 1998].
In der vorliegenden Erfindung kann das zu exprimierende Fremdprotein jedes Protein sein, solange es ein Fremdprotein ist, dass in nicht stabilisierter Form und/oder unlöslicher Form mit verringerter Aktivität in einem Wirt insbesondere in E. coli exprimiert wird. Derartige Fremdproteine schließen Interferone, Interleukine, Interleukinrezeptoren, Interleukinrezeptorantagonisten, Granulocyten-Kolonie-stimulierende Faktoren, Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktoren, Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktoren, Erythropoietin, Thrombopoietin, Leukämieinhibitoren, Stammzellenwachstumsfaktoren, Tumornekrosefaktoren, Wachstumshormone, Proinsulin, insulinartige Wachstumsfaktoren, Fibroblastenwachstumsfaktoren, von Thrombocyten abstammende Wachstumsfaktoren, transformierende Wachstumsfaktoren, Hepatocytenwachstumsfaktoren, knochenmorphogenetische Wachstumsfaktoren, Nervenwachstumsfaktoren, ziliäre neurotrophe Faktoren, vom Gehirn abstammende neurotrophe Faktoren, von Gliazelllinien abstammende neurotrophe Faktoren, Neurotrophine, Angiogeneseinhibitoren, Prourokinase, Gewebeplasminogenaktivatoren, Blutgerinnungsfaktoren, Protein C, Glucocerebrosidase, Superoxid-Dismutase, Renin, Lysozym, P450, Prochymosin, Trypsininhibitoren, Elastaseinhibitoren, Lipocortin, Reptin, Immunglobuline, Einzelketten-Antikörper, Komplementbestandteile, Serumalbumin, Zedernpollenallergene, hypoxie-induziertes Stressprotein, Proteinkinasen, Proto-Onkogenprodukte, Transkriptionsfaktoren und viruskonstitutive Proteine.
Als Verfahren zur Einführung des Expressionsplasmids der vorliegenden Erfindung in E. coli zusammen mit einem Expressionsvektor für ein Fremdprotein, können herkömmliche Verfahren wie das Calciumchlorid-Verfahren, Rubidiumchlorid-Verfahren, Elektroporationsverfahren oder andere herkömmliche Verfahren verwendet werden. Die Cotransformante kann durchmustert werden, indem Chemikalien gemäß der Selektionsmarkergene verwendet werden. Die Expression des Fremdproteins kann beispielsweise durch derartige Mittel wie Western Blot Analyse bestätigt werden.
Eines der wichtigen Merkmale des Verfahrens zur Herstellung eines Fremdproteins der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Züchtung der Wirtszelle oder der vorstehend beschriebenen Cotransformante. Das Herstellungsverfahren kann beispielsweise durch ein Verfahren erfolgen, umfassend die Züchtung der Wirtszelle oder der Cotransformante unter Induktionsbedingungen für die Proteine der Dsb-Familie, die für die Stabilisierung und/oder Solubilisierung eines gewünschten Fremdproteins geeignet sind, um die Expression der Proteine der Dsb-Familie und des Fremdproteins zuzulassen; das anschließende Sammeln der Zellen; die Zertrümmerung der gesammelten Zellen und die Isolierung und Reinigung des Fremdproteins gemäß eines Reinigungsverfahrens, das für das Fremdprotein geeignet ist.
Die vorstehend beschriebenen Induktionsbedingungen variieren mit den induzierbaren Promotoren, die im Expressionsplasmid der vorliegenden Erfindung und dem Expressionsvektor verwendet werden und die Bedingungen können so sein, dass das Expressionsniveau von DsbA, DsbB, DsbC und DsbD bei einem Niveau liegt, das für das Fremdprotein zur Solubilisierung geeignet ist. Beispielsweise können die Induktionsbedingungen folgendermaßen bestimmt werden. Zuerst wird ein Inducer für den Promotor zugegeben, wie vorstehend beschrieben, wobei dessen Konzentrationen und die Wahl der richtigen Zeitpunkte für die Zugabe variiert werden. Die Zellen, die ein Fremdprotein exprimieren, werden gesammelt, und die gesammelten Zellen werden zerstört und extrahiert, um Zellextrakte zu erhalten. Jedes der sich ergebenden Extrakte wird beispielsweise einer SDS-PAGE unterzogen und die Banden, die den Proteinen im Gel zugeordnet werden, werden durch Coomassie-Brilliantblau- oder Silberfärbung sichtbar gemacht. Unter den sichtbar gemachten Banden wird die Konzentration der Bande, die dem Fremdprotein zugeschrieben wird, beispielsweise mittels Densitometrie untersucht, wobei die geeigneten Induktionsbedingungen gefunden werden.
Da die Kulturbedingungen der Cotransformante mit dem als Wirt verwendeten Mikroorganismus variieren, sind sie nicht besonders eingeschränkt. Die optimalen Bedingungen können auf eine Weise bestimmt werden, die der Bestimmung der vorstehend beschriebenen Induktionsbedingungen ähnelt, indem das Expressionsniveau eines Fremdproteins untersucht wird, das jeweils unter den Kulturbedingungen exprimiert wird, wobei verschiedene Zeitpunkte der Züchtung und die Züchtungstemperaturen eingestellt werden.
Das Fremdprotein kann durch jedes bekannte Proteinreinigungsverfahren isoliert und gereinigt werden, einschließlich Aussalzen, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Affinitätschromatographie und Gelfiltrationschromatographie.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die das Operon oder das Expressionsplasmid der vorliegenden Erfindung umfasst.
Der Begriff „Zusammensetzung", wie gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, bezeichnet eine Lösung, z. B. einen Puffer, der mindestens eines der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung umfasst. Alternativ bezeichnet der Begriff „Zusammensetzung" eine Formulierung, die mindestens eines der Operons, Plasmide, Cotransformanten und/oder Wirtszellen der vorliegenden Erfindung und mindestens eine weitere Verbindung umfasst. Die Formulierung kann flüssiger, fester oder gasförmiger Natur sein.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform einen Kit, der das Operon oder das Expressionsplasmid der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die Bestandteile des Kits der vorliegenden Erfindung können in Behälter wie Phiolen, fakultativ in Puffern und/oder Lösungen verpackt werden. Wenn geeignet, können ein oder mehrere Bestandteile in ein und denselben Behälter verpackt werden. Zusätzlich können ein oder mehrere Bestandteil an einen festen Träger wie z. B. einen Nitrozellulosefilter oder eine Nylonmembran oder an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte adsorbiert werden.
Die vorliegende Erfindung wird hier nachstehend mittels der folgenden Beispiele weiter beschrieben, und die vorliegende Erfindung ist keineswegs auf diese Beispiele begrenzt.
Beispiel 1 Clonierung der Gene, die die Proteine der Dsb-Familie codieren
Jedes der Gene dsbA, dsbB, dsbC und dsbD, wobei jedes davon ein Strukturgen ist, das jeweils DsbA, DsbB, DsbC und DsbD codiert, die Proteine der Dsb-Familie sind, wurde mittels des PCR-Verfahrens cloniert. Als Primer wurden diejenigen verwendet, die so konstruiert waren, dass eine ribosomale Bindungsstelle bei 7 bis 10 bp stromaufwärts in jedem der Strukturgene lokalisiert sein sollte. Als Primer zur Amplifizierung des dsbA-Gens wurden die Primer verwendet, wie in den SEQ ID NR: 9 und 10 im Sequenzprotokoll dargestellt; als Primer zur Amplifizierung des dsbB-Gens wurden die Primer verwendet, wie in den SEQ ID NR: 11 und 12 im Sequenzprotokoll dargestellt; als Primer zur Amplifizierung des dsbC-Gens wurden die Primer verwendet, wie in den SEQ ID NR: 13 und 14 im Sequenzprotokoll dargestellt und als Primer zur Amplifizierung des dsbD-Gens wurden die Primer verwendet, wie in den SEQ ID NR: 15 und 16 im Sequenzprotokoll dargestellt. Übrigens wurden die Primer so kon struiert, dass sie Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme besaßen, wie nachstehend in den Nucleotidsequenzen angegeben.

Primer (SEQ ID NR: 9): SacI;
Primer (SEQ ID NR: 10): AvaI;
Primer (SEQ ID NR: 11): AvaI;
Primer (SEQ ID NR: 12): NdeI;
Primer (SEQ ID NR: 13): NdeI;
Primer (SEQ ID NR: 14); SalI;
Primer (SEQ ID NR: 15): SalI und
Primer (SEQ ID NR: 16): SphI.

Als Matrizen wurden pSK, der die dsbA- und dsbB-Gene trägt [Kamitani, S. et al., EMBO J., 11, 57–62 (1992)]; pSS51 [Kishigami, S. und Ito, K., Genes Cells, I, 201–208 (1996)] und die Kohara-Clone Nr. 468 und 648 verwendet, die die dsbC- und dsbD-Gene tragen [Kohara, Y. et al., Cell, 50, 495–508 (1987)], die von Dr. Yoshinori Akiyame, The Institute of Virus Research, Kyoto University zur Verfügung gestellt wurden.
Die PCR-Bedingungen sind hier nachstehend angegeben.
Es wurden 50 μl eines Reaktionsgemisches mit der Zusammensetzung von jeweils 50 pmol Primer, 10 ng Matrizen-DNA, 1 U KOD-DNA-Polymerase (hergestellt von TOYOBO CO., LTD.), 0,2 mM dNTP, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 1 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 0,001% BSA, 1 mM MgCl₂ und 120 mM Tris-HCl (pH 8,0) erhalten. Das sich ergebende Reaktionsgemisch wurde in das GeneAmp^TM PCR-System 2400 (hergestellt von Perkin-Elmer) eingesetzt und 25 Reaktionszyklen wurden durchgeführt, wobei ein Zyklus aus 98°C, 5 Sekunden; 65°C, 2 Sekunden und 74°C, 30 Sekunden bestand.
Als Ergebnis der Durchführung einer PCR unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen, wenn pSK220 und pSS51, die die dsbA- und dsbB-Gene tragen, als Matrizen verwendet wurden, fand man eine spezifische Amplifizierung von etwa 0,6 kb und etwa 0,5 kb-Fragmenten, von denen man annahm, dass sie den dsbA- bzw. dsbB-Genen entsprachen. Andererseits, wenn der Kohara-Clon Nr. 468, der das dsbC-Gen trägt, als Matrize verwendet wurde, fand man die spezifische Amplifizierung eines Fragments von etwa 0,7 kb, von dem man annahm, dass es dem dsbC-Gen entspracht. Alternativ wenn der Kohara-Clon Nr. 648, der das dsbD-Gen trägt, als Matrize verwendet wurde, fand man keine Amplifizierung des Fragments, das dem dsbD-Gen entspricht.
Deshalb können zur Clonierung des dsbD-Gens nach der 1-minütigen Behandlung bei 94°C 25 Zyklen durchgeführt werden, wobei ein Zyklus aus 98°C, 20 Sekunden und 68°C, 3 Minuten besteht, wobei TaKaRa-LA-Tag^TM (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) anstatt der KOD-DNA-Polymerase unter den vorstehenden PCR-Bedingungen verwendet wird und ferner ein Gesamtvolumen von 50 μl eines Reaktionsgemisches [Zusammensetzung: jeweils 10 pmol Primer, 2,5 ng Matrizen-DNA, 2,5 U TaKaRa-LA-TagTM, 0,4 mM dNTPs und ×10 TaKaRa-LA-Puffer (pH 8,0)] verwendet wird. Als Matrize wurde der Kohara-Clon Nr. 648 verwendet. Als Ergebnis fand man eine Amplifizierung eines Fragmentes von etwa 1,5 kb, von dem man annahm, dass es dem dsbD-Gen entsprach.
Die Nucleotidsequenz des so erhaltenen amplifizierten Fragmentes wurde bestimmt und als Ergebnis wurde aufgeklärt, dass jedes der Gene dsbA, dsbB, dsbC und dsbD erhalten wurde. Die Nucleotidsequenzen von dsbA, dsbB, dsbC und dsbD lauten wie in den SEQ ID NR: 2, 4, 6 bzw. 8 im Sequenzprotokoll dargestellt.
Anschließend wurde jedes der amplfizierten Fragmente, das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, in die Mulitclonierungsstelle von pT7Blue(R) (hergestellt von Novagen) ligiert, wobei jedes Plasmid konstruiert wurde, indem eines der dsbA-, dsbB-, dsbC- oder dsbD-Gene auf die einzelne Ligierung mit pT7Blue(R) (wobei jedes Plasmid als pT7B/dsbA, pT7B/dsbB, pT7B/dsbC bzw. pT7B/dsbD bezeichnet wird) zurückzuführen ist; sowie ein Plasmid, dass auf die Ligierung mit pT7Blue(R) zurückzuführen ist, einem Operon (SEQ ID NR: 17), das erhalten wurde, indem dsbA, dsbB, dsbC und dsbD (hier nachstehend als „pT7B/dsbABCD" bezeichnet) hintereinander verbunden wurden. Jedes der Plasmide ist in 1 dargestellt.
Beispiel 2 Konstruktion des Expressionsvektors
Man nimmt an, dass die 4 Gene (dsbA, dsbB, dsbC und dsbD), die die Proteine der Dsb-Familie codieren, kein Operon bilden und die Expression jedes Gens unabhängig reguliert wird. Folglich wurde ein Expressionsvektor konstruiert, in dem die 4 Gene ein polycistronisches Operon bilden und die Expression dieser Gene durch die Zugabe von Arabinose induzierbar ist. 2 zeigt die Konstruktionsstrategie.
Damit die Strukturgene für die Proteine der Dsb-Familie unabhängig von einem Strukturgen für ein Modellprotein exprimiert werden können, wurde die synthetische DNA (SEQ ID NR: 18) mit einer Erkennungssequenz verschiedener Restriktionsenzyme mit der PstI-HindIII-Schnittstelle von pAR3 ligiert, wobei pAR3 [Chloramphenicol-resistent und fähig zur Induzierung und Expression mit Arabinose] von pACYC 184 stammte, das von Perez et al. [vgl. Gene, 158, 141–142 (1995)] konstruiert wurde, so dass sich pAR4 mit einer Multiclonierungsstelle ergibt.
Anschließend wurde ein Fragment, das den rrnBT1T2-Terminator umfasst, durch Behandlung von pTrc99A (hergestellt von Pharmacia) mit PvuI herausgespalten, das sich ergebende Fragment mittels Mungbohnen-Nuclease mit stumpfen Enden versehen und danach das mit stumpfen Enden versehene Fragment mit SacI behandelt. Das sich ergebende Fragment wurde mit den SacI-NruI-Schnittstellen des vorstehend beschriebenen pAR4 ligiert, so dass sich pAR5 ergibt. Das vorstehend erwähnte pAR5 kann zusammen mit einem Plasmid exprimieren, das den ori von pBR322 trägt, so dass das Expressionsniveau eines Expressionsprodukts, das von einem Fremdgen stammt, das in die Multiclonierungsstelle eingebaut werden kann, durch Zugabe von Arabinose reguliert werden kann.
Beispiel 3 Konstruktion des Expressionsplasmids für die Proteine der Dsb-Familie und Bestätigung der Expression davon
Ein SacI-HindIII-Fragment wurde aus jedem der jeweils in Beispiel 1 erhaltenen Plasmide pT7Blue(R)/dsbA, pT7Blue(R)/dsbB, pT7Blue(R)/dsbC, pT7Blue(R)/dsbD und pT7Blue(R)/dsbABCD herausgespalten, und dann wurde das Fragment in die SacI-HindIII-Schnittstellen in der Multiclonierungsstelle des in Beispiel 2 erhaltenen pAR5 eingebaut. 3 zeigt die sich ergebenden Expressionsplasmide, mit denen jeweils DsbA, DsbB, DsbC bzw. DsbD ligiert wird (bezeichnet als pARS/dsbA, pARS/dsbB, pARS/dsbC bzw. pARS/dsbD), sowie das Expressionsplasmid, in dem diese 4 Insertionen hintereinander verbunden sind, so dass ein polycistronisches Operon (pARS/dsbABCD) erzeugt wird.
Man hat versucht, die Proteine der Dsb-Familie zu exprimieren, indem E. coli-JM109 mit jedem einzelnen Plasmid transformiert wurde, wie vorstehend beschrieben. Kompetente Zellen wurden von E. coli-JM109 durch das PEG-DMSO-Verfahren erhalten und mit 1,0 × 10^–2 μg von einem der vorstehenden Expressionsplasmide pARS/dsbA, pAR5/dsbB, pARS/dsbC, pARS/dsbD und pAR5/dsbABCD transformiert. Die Durchmusterung der Transformanten erfolgte unter Verwendung ihrer Resistenz gegenüber Chloramphenicol als Index.
Anschließend wurde jede der sich ergebenden Transformanten bei 37°C in 5 ml L-Medium gezüchtet, das 34 μg/ml Chloramphenicol enthielt. Arabinose wurde zugeben, um Endkonzentrationen von 0,200 bzw. 2000 μg/ml zu ergeben, wenn die Klett-Einheiten etwa 20 erreichten. Zwei Stunden später wurde von jeder Kultur eine Probe genommen und die in der sich ergebenden Kultur enthaltenen Zellen wurden geerntet. Die Zellen wurden einer Präzipitationsbehandlung mit TCA unterzogen, um Gesamtzellprotein zu ergeben. Das wie vorstehend erhaltene Gesamtzellprotein wurde einer SDS-PAGE-Analyse unterzogen. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Wie in 4 dargestellt, wurde bestätigt, dass bei Verwendung von pARS/dsbC und pARS/dsbABCD die Banden mit einem Molekulargewicht von etwa 24000, woraus man schloss, dass sie DsbC entsprechen, abhängig von der Arabinose-Konzentration signifikant erhöht waren.
Obwohl keine Banden, die den anderen Dsb-Produkten entsprachen, nachgewiesen werden konnten, wurde die Expression jedes Proteins der Dsb-Familie bestätigt, indem die Gegenwart oder Abwesenheit der Komplementierung jeder Deletionsmutation von dsbA, dsbB und dsbD untersucht wurde. Folglich konnte bestätigt werden, dass die Funktion für jedes Protein der Dsb-Familie in jeder Dsb-Deletionsmutante komplementiert war.
Beispiel 4 Konstruktion des Exuressionsplasmids pTrc-OmpA und pTrc-OmpT zur Sekretion des Fremdproteins
Ein Plasmid, das auf die Insertion eines synthetischen Oligonucleotids (5'-Ende: glattes Ende; 3-Terminus: NaeI- und EcoRI-Schnittstellen), das, wie nachstehend dargestellt, das Signalpeptid von OmpA oder OmpT codiert, in die NcoI- (mit glattem Ende mittels Mungbohnen-Nuclease versehen)-EcoRI-Schnittstellen des Expressionsplasmids pTrc99A für E. coli zurückzuführen ist, wurde als pTrc-OmpA oder pTrc-OmpT bezeichnet.
Oligonucleotid, das die OmpA-Signalsequenz codiert
Oligonucleotid, das die OmpT-Signalsequenz codiert
Beispiel 5 Konstruktion des Sekretionsplasmids für NGF-β
Ein EcoRI-BamHI-Fragment der cDNA (hergestellt von R&D Systems), das eine Aminosäuresequenz codiert, bei der der N-terminale Signalsequenzanteil des menschlichen Nerven-Wachstumsfaktors-β (NGF-β) deletiert wurde, wurde in die EcoRI-BamHI-Schnittstellen des in Beispiel 4 erhaltenen pTrc-OmpT eingebaut. Anschließend wurde der folgende, dem N-terminalen Anteil von NGF entsprechende, synthetische Oligonucleotidlinker (glattes Ende-EcoRI-Schnittstelle) mit Polynucleotidkinase behandelt und danach in die NaeI-EioRI-Schnittstelle des sich ergebenden Plasmids eingebaut, so dass sich ein Sekretionsplasmid pTrc-OmpT/NGF für NGF-β ergibt.
NGF-Linker:
Beispiel 6 Konstruktion des Sekretionsplasmids für HRP
Der Bereich, der dem Strukturgen entspricht, wurde durch das PCR-Verfahren unter Verwendung von Meerrettich-Peroxidase (HRP)-cDNA (hergestellt von R&D Systems) als Matrize amplifiziert. Das sich ergebende Fragment wurde mit BamHI und dann mit Polynucleotidekinase behandelt, und anschließend wurde das behandelte Fragment in die NaeI-EcoRI-Schnittstellen von pTrc-OmpA eingebaut, so dass sich ein Sekretionsplasmid pTrc-OmpA/HRP für HRP ergibt. Die im PCR-Verfahren verwendeten Primer lauten wie nachstehend dargestellt.
Primer:
Beispiel 7 Verstärkende Wirkung von DsbABCD auf die Expression des Fremdproteins im Periplasma
Die Wirkungen von DsbABCD (Einfluss auf das Wachstum der Zellen, Änderungen im Expressionsniveau und Lokalisierung des Produkts) wurden in den Zellen untersucht, die mit dem NGF-β-Sekretionsplasmid oder dem HRP-Sekretionsplasmid, das in Beispiel 5 oder 6 erhalten wurde, und pARS/dsbABCD zusammen transformiert wurden. DsbABCD wurde in allen bei 37°C im L-Medium gezüchteten Zellen induziert, indem Arabinose (0 bis 2000 μg/ml) zugegeben wurde, und NGF-β oder HRP wurden jeweils durch Zugabe von IPTG (50 μM) induziert. Die jeweils in den Zellen angesammelten Proteine wurden einer SDS-PAGE-Analyse und einem Western-Blot-Verfahren unterzogen. Der Gesamtzellextrakt wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 erhalten. Zusätzlich wurde die Periplasma-lösliche Fraktion durch ein Behandlungsverfahren der Zellen mit Lysozym in Gegenwart isotonischer Saccharose erhalten [Koshland, D. und Botstein, D., Cell, 20, 749–760 (1980)].
(1) Auswirkung auf die NGF-Expression
Wenn pTrc-OmpT/NGF und der Vektor pACYC184 ohne Insertionen gemeinsam vorhanden waren, stellte sich heraus, dass das Wachstum der Zellen nicht gehemmt war, auch wenn die Arabinosekonzentration auf bis zu 200 μg/ml erhöht wurde. Jedoch hatte das Wachstum der Zellen bei der Arabinosekonzentration von 2000 μg/ml die Tendenz, gehemmt zu werden. Wenn andererseits pTrc-OmpT/NGF und pAR5/dsbABCD gemeinsam vorhanden waren, wurde das Wachstum der Zelle überhaupt nicht gehemmt, und ihre Wachstumsrate erhöhte sich beim Anstieg der Arabinosekonzentration um etwa maximal 10%.
Um das Expressionsniveau von NGF-β in der Gesamtzell- oder die in der Periplasmalöslichen Fraktion angehäuften NGF-β-Menge zu untersuchen, wobei die Arabinosekonzentration variiert wurde, wurden anschließend 80 μl der Probe, die einem Kulturmedium mit 80 Klett-Einheiten der Gesamtzell- und der Periplasma-löslichen Fraktion entsprach, einer SDS-PAGE-Analyse unterzogen. Die Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse sind in 5 dargestellt.
Wie in 5 dargestellt, änderten sich in der Kontrolle, in der pTrc-OmpT/NGF und der Vektor pACYC184 gemeinsam vorhanden waren, sowohl das Expressionsniveau von NGF-β in der Gesamtzell- und in der Periplasma-löslichen kaum, auch wenn die Arabinosekonzentration von 0 bis 200 μg/ml verändert wurde und das Expressionsniveau des Produkts OmpT- NGF-β bei der Arabinosekonzentration von 2000 μg/ml signifikant erniedrigt wurde. Ein Gesamtexpressionsniveau von OmpT-NGF-β, der zusammen mit pTrc-OmpT/NGF und pARS/dsbABCD vorhanden war, wurde kaum verändert (etwa 1 bis 2 mg/l Kultur), auch wenn die Arabinosekonzentration von 0 auf 2000 μg/ml geändert wurde. Das Expressionsniveau von OmpT-NGF-β in der Periplasma-löslichen Fraktion hatte die Tendenz, sich zu erhöhen, wenn die Arabinosekonzentration erhöht wurde, so dass fast der gesamte exprimierte OmpT-NGF-β in der Periplasma-löslichen Fraktion nachgewiesen wurde.
(2) Auswirkung auf die HRP-Expression
Das Wachstum der Stämme, deren untersuchte HRP-Expression in Kletteinheiten gemessen wurde, ist in 6 dargestellt. Zusätzlich wurde eine Probe, die 60 μl Kultur mit 80 Klett-Einheiten von jeweils der Gesamtzell- oder der Periplasma-löslichen Fraktion enthielt, einer SDS-PAGE-Analyse unterzogen, um den Expressionsgrad von HRP in der Gesamtzelle oder die Menge der in der Periplasma-löslichen Fraktion angehäuften HRP mit variierenden Arabinosekonzentrationen zu messen. Die Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse sind in 7 dargestellt.
Wie in 6 dargestellt, hörte das Wachstum der Zellen etwa 2 Stunden nach der Zugabe von IPTG in dem Fall auf, in dem pTrc-OmpA/HRP und pARS/dsbABCD gemeinsam vorhanden waren, wenn keine Arabinose zugegeben wurde, und dadurch eine signifikante Hemmung des Wachstums der Zellen gezeigt wurde, und bei Zugabe der Arabinose (Endkonzentration 200 μg/ml) wurde die Wachstumshemmung der Zellen beseitigt, und das Wachstum der Zellen hörte auch 4 Stunden nach Zugabe von IPTG nicht auf. Wenn pTrc-OmpA/HRP und der Vektor pAR3 ohne Insertionen gemeinsam vorhanden waren, wurde das Wachstum der Zellen überhaupt nicht verbessert. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Beseitigung der Wachstumshemmung bei der Expression von OmpA-HRP von der Expression von DsbABCD abhängt.
Wie in 7 dargestellt, wenn pTrc-OmpA/HRP und pARS/dsbABCD gemeinsam vorhanden waren, war auch das Expressionsniveau von OmpA-HRP in der Gesamtzellfraktion etwa 2- bis 3-mal so hoch wie in dem Fall, in dem pTrc-OmpA/HRP und der Vektor pAR3 ohne Insertionen gemeinsam vorhanden waren. Wenn pTrc-OmpA/HRP und pARS/dsbABCD gemeinsam vorhanden waren, war die Periplasma-lösliche Fraktion ebenfalls entsprechend der Arabinosekonzentration erhöht.
Beispiel 8 Änderungen beim Expressionsniveau und Lokalisierung des HRP-Produktes bei der verlängerten Induktion
Um den Zeitverlauf des Expressionsniveaus und die Lokalisierung der Expressionsprodukte zu untersuchen, wurden Omp-HRP und DsbABCD induziert und durch Zugabe von IPTG auf dieselbe Weise wie in Beispiel 6, wenn pTrc-OmpA/HRP und pAR5/dsbABCD gemeinsam vorhanden waren, induziert und gemeinsam exprimiert. Als Kontrolle wurde das Expressionssystem verwendet, bei dem pTrc-OmpA/HRP und der Vektor pAR3 ohne Insertionen gemeinsam vorhanden waren. Nach Zugabe von IPTG wurde eine Probe der Kultur nach 0, 30, 85, 150 und 240 Minuten genommen, um die Änderungen beim Expressionsniveau und der Lokalisierung (Gesamtzell- und Periplasma-lösliche Fraktion oder die Sphäroblasten-Fraktion) von OmpA-HRP zu untersuchen, das in der Kultur enthalten war. Die Gesamtzell- und Periplasma-lösliche Fraktion wurden auf dieselbe Weise erhalten wie in den Beispielen 3 und 7. Zusätzlich wurde die Sphäroblasten-Fraktion als Fraktion erhalten, die nach Extraktion der Periplasma-löslichen Fraktion durch das Lysozymverfahren übrig blieb. Eine Probe, die die Gesamtzell- und die Periplasma-lösliche Fraktion oder die Sphäroblasten-Fraktion enthielt, was 60 μl der Kultur mit 80 Klett-Einheiten entsprach, wurde einer SDS-PAGE-Analyse und einem Western-Blot unterzogen, um das relative Expressionsniveau von OmpA-HRP zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in den 8 und 9 dargestellt. In 8 ist G die Gesamtzellfraktion; P ist eine Periplasma-lösliche Fraktion und S ist eine Sphäroblasten-Fraktion.
Aufgrund der Ergebnisse in 8 wird gezeigt, dass in dem System, in dem OmpA-HRP und DsbABCD gemeinsam exprimiert werden, die Anhäufung von OmpA-HRP etwa 30 Minuten nach der Zugabe von IPTG initiiert wird und anschließend das Maximum 150 Minuten nach Zugabe von IPTG erreicht. In diesem Expressionsniveau konnte HRP auch durch CBB-Färbung bestätigt werden. Die Ergebnisse in 9 zeigen auch, dass das Expressionsniveau von HRP in der Periplasma-löslichen Fraktion relativ zu den exprimierten HRP-Gesamtmengen nach 85 Minuten etwa 10% betrug, jedoch überraschenderweise nach 240 Minuten bis zu etwa 60%. Dagegen zeigen die Ergebnissen in 9, dass in dem System, in dem pTrc-OmpA/HRP und der Vektor pAR3 ohne Insertionen gemeinsam vorhanden waren, die Anhäufung von OmpA-HRP mindestens 150 Minuten nach der Zugabe von IPTG initiiert wurde (Übergangsphase von der logarithmischen Wachstumsphase zur stationären Phase) und die Anhäufung davon im Periplasma kaum auftritt, was die Anhäufung von etwa 3% in Gesamtexpressionsniveau zeigt. Ferner ist es aufgrund der Ergebnisse in 6 klar, dass die Wachstumshemmung zusammen mit der Expression von OmpA-HRP auftritt, wobei das Wachstum gestoppt wird.
Beispiel 9 Verstärkende Wirkung von DsbAB (DsbA und DsbB), DsbCD (DsbC und DsbD) oder DsbAC (DsbA und DsbC) auf die Expression von Fremdprotein im Periplasma
(1) Konstruktion des Expressionsplasmids für DsbAB, DsbCD und DsbAC
Ein Expressionsplasmid für DsbA und DsbB, pARS/dsbAB und ein Expressionsplasmid für DsbC und DsbD, pAR5/dsbCD wurden erhalten, indem die dsbA- und dsbB-Gene hintereinander verbunden wurden bzw. indem die dsbC- und dsbD-Gene hintereinander auf dieselbe Weise verbunden wurden wie in Beispiel 2. Zusätzlich wurde ein Expressionsplasmid für DsbA und DsbC auf dieselbe Weise wie vorstehend hergestellt.
(2) Auswirkung auf die NGF-Expression
Die Auswirkung von DsbAB oder DsbCD auf die Expression von NGF wurde bestimmt, indem das vorstehende Expressionsplasmid pARS/dsbAB oder pAR5/dsbCD auf dieselbe Weise wie in Beispiel 7 verwendet wurde.
Im Ergebnis wirkte sich die gemeinsame Expression der DsbAB-Familie kaum auf die Gesamt- oder periplasmatische Expression von NGF aus, während diejenige von DsbAC den Gesamtertrag um fast das Zweifache erhöhte, jedoch das periplasmatische Expressionsniveau kaum erhöhte. Dagegen verstärkte die gemeinsame Expression von DsbCD das Gesamtexpressionsniveau um etwa das Zweifache und das periplasmatische Expressionsniveau um etwa das Dreifache gegenüber der Vektorkontrolle; das periplasmatische Expressionsniveau von NGF beträgt etwa 60% des Gesamt-NGF.
Nach der vorliegenden Erfindung kann in hohem Maße effizient gezeigt werden, dass ein lösliches Expressionsprodukt effizient erhalten werden kann, da die Erzeugung von genauen Disulfidbrücken im Periplasma wirksam erfolgen kann.
Sequenzprotokoll

Claims

Operon, umfassend Polynucleotide, die jeweils DsbC und DsbD codieren, wobei das Polynucleotid, das DsbC codiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) Polynucleotiden, die das Polypeptid von SEQ ID NR: 5 codieren; (b) Polynucleotiden, die die Sequenz von SEQ ID NR: 6 umfassen; (c) Polynucleotiden, die an den Komplementärstrang des Polynucleotids aus (a) oder (b) hybridisieren; und (d) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, das von dem Polynucleotid aus (c) codiert wird, und wobei das Polynucleotid, das DsbD codiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (e) Polynucleotiden, die das Polypeptid von SEQ ID NR: 7 codieren; (f) Polynucleotiden, die die Sequenz von SEQ ID NR: 8 umfassen; (g) Polynucleotiden, die an den Komplementärstrang des Polynucleotids aus (e) oder (f) hybridisieren; und (h) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, das von dem Polynucleotid aus (g) codiert wird.
Operon nach Anspruch 1, weiterhin umfassend Polynucleotide, die jeweils DsbA und DsbB codieren, wobei das Polynucleotid, das DsbA codiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) Polynucleotiden, die das Polypeptid von SEQ ID NR: 1 codieren; (b) Polynucleotiden, die die Sequenz von SEQ ID NR: 2 umfassen; (c) Polynucleotiden, die an den Komplementärstrang des Polynucleotids aus (a) oder (b) hybridisieren; und (d) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, das von dem Polynucleotid aus (c) codiert wird, und wobei das Polynucleotid, das DsbD codiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (e) Polynucleotiden, die das Polypeptid von SEQ ID NR: 3 codieren; (f) Polynucleotiden, die die Sequenz von SEQ ID NR: 4 umfassen; (g) Polynucleotiden, die an den Komplementärstrang des Polynucleotids aus (e) oder (f) hybridisieren; und (h) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, das von dem Polynucleotid aus (g) codiert wird.
Operon nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin umfassend einen induzierbaren Promotor.
Operon nach Anspruch 3, wobei der induzierbare Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus lac, tac, trc, trp, ara, Pzt-1 und T7.
Expressionsplasmid, das das Operon nach einem der Ansprüche 1 bis 4 trägt.
Expressionsplasmid nach Anspruch 5, weiterhin umfassend Polynucleotide, die ein Fremdprotein codieren.
Cotransformante, die das Expressionsplasmid nach Anspruch 5 trägt sowie einen Expressionsvektor, umfassend Polynucleotide, die ein Fremdprotein codieren.
Expressionsplasmid nach Anspruch 6 oder Cotransformante nach Anspruch 7, wobei das Fremdprotein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Interferonen, Interleukinen, Interleukinrezeptoren, Interleukinrezeptor-Antagonisten, Granulocyten-Kolonie-stimulierenden Faktoren, Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktoren, Makrophagen-Kolonien-stimulierenden Faktoren, Erythropoietin, Thrombopoietin, Leukämieinhibitoren, Stammzellenwachstumsfaktoren, Tumornekrosefaktoren, Wachstumshormonen, Proinsulin, insulinartigen Wachstumsfaktoren, Fibroblastenwachstumsfaktoren, von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktoren, transformierenden Wachstums faktoren, Hepatocyten-Wachstumsfaktoren, knochenmorphogenetischen Faktoren, Nervenwachstumsfaktoren, CNTF (ciliary neurotrophic factor), vom Gehirn abstammenden neurotrophen Faktoren (BDNF), von Gliazelllinien abstammenden neurotrophen Faktoren, Neurotrophin, Angiogenese-Inhibitoren, Prourokinase, Gewebeplasminogenaktivatoren, Blutgerinnungsfaktoren, Protein C, Glucocerebrosidase, Superoxid-Dismutase, Renin, Lysozym, P450, Prochymosin, Trypsin-Inhibitoren, Elastase-Inhibitoren, Lipocortin, Reptin, Immunoglobulinen, einzelkettigen Antikörpern, Komplementbestandteilen, Serumalbumin, Zederpollen-Allergenen, hypoxieinduzierten Stressproteinen, Proteinkinasen, Proto-Oncogen-Produkten, Transkriptionsfaktoren und viruskonstitutiven Proteinen.
Expressionsplasmid nach Anspruch 6 oder 8 oder die Cotransformante nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Fremdprotein ein Fusionsprotein ist.
Wirtszelle, die das Expressionsplasmid nach Anspruch 5, 6, 8 oder 9 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 10 oder die Cotransformante nach Anspruch 7, die eine E. coli-, eine Streptomyces- oder eine Salmonella typhimurium-Zelle ist.
Cotransformante oder Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei ein E. coli-Protease-Mutant als Wirt verwendet wird.
Verfahren zur Herstellung eines Fremdproteins, umfassend das Züchten der Cotransformante nach einem der Ansprüche 7, 8, 11 oder 12 oder der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 10 bis 12.
Zusammensetzung, umfassend das Operon nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder das Expressionsplasmid nach Anspruch 5 oder 6.
Kit, umfassend das Operon nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder das Expressionsplasmid nach Anspruch 5 oder 6.
Verwendung der Cotransformante nach einem der Ansprüche 7, 8, 11 oder 12 oder der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 10 bis 12 für die Herstellung eines Fremdproteins.