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Hintergrund der Erfindung
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Die Steuerung oder Regulation der
Genexpression des genetischen Materials von zellulärem Material oder
eines Organismus zog die spezielle Aufmerksamkeit von Wissenschaftlern
auf sich und in bestimmten Fällen
wurde der Einsatz rekombinanter DNA und anderer Techniken erreicht.
Beispielsweise wird in der am 23. April 1983 veröffentlichten PCT Patentanmeldung
WO
83/01451 ein Verfahren offenbart, in dem ein Oligonucleotid,
vorzugsweise in Form eines phosphotriesters, mit einer im wesentlichen
zu einem Teil einer Boten-Ribonucleinsäure mRNA, die für eine biologische
Komponente eines Organismus codiert, komplementären Basensequenz verwendet
wird. Dieses Oligonucleotid wird in den Organismus eingebracht,
wobei, aufgrund der Komplementarität des Oligonucleotids zum Boten-Ribonucleotid, die
beiden Komponenten unter geeigneten Bedingungen hybridisieren um
so die Synthese der durch das Raten-Ribonucleotid codierten biologischen
Komponente zu steuern oder zu inhibieren. Wenn die biologische Komponente
für die
Lebensfähigkeit des
Organismus essentiell ist, könnte
das Oligonucleotid als Antibiotikum wirken. Eine verwandte Technik
zur Regulation der Genexpression in einem Organismus wird in einem
Artikel in Cell 34 September (1983), 683 beschrieben. Die Offenbarungen
der oben genannten Veröffentlichungen
werden hierin mit aufgenommen und sind Teil dieser Veröffentlichung.
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Wie hierin angedeutet, ist es bekannt,
daß die
Expression bestimmter Gene auf der Stufe der Transkription reguliert
werden kann. Transkriptionsregulation erfolgt durch einen Proteinfaktor
entweder negativ (Repressoren) oder positiv (Aktivatoren). Es ist
ebenso bekannt, daß bestimmte
spezifische Proteinfaktoren die Translation bestimmter mRNAs regulieren.
Ebenso wurde, wie hier angedeutet, offensichtlich, daß RNAs bei der
Regulation der Expression bestimmter Gene eine Rolle spielen, und
es wurde berichtet, daß Escherichia coli
bei Züchtung
in einem Medium mit hohem osmotischen Druck ein kleines RNA-Transkript
mit einer Länge von
174 Hasen herstellt, das die Expression des Gens für ein äußeres Membranprotein
(OmpF-Protein) codiert; siehe "Regulation
of Gene Expression by a Small RNA Transkription (micRNA) in E.Coli
K12, Proc. Jap. Acad. 59 (1983), 335-338. Die Inhibierung der Synthese
des OmpF-Proteins durch das kleine RNA-Transkript (micRNA, d. h.
mRNA inhibierende komplementäre
RNA) geht wahrscheinlich auf die Bildung eines Hybrids zwischen
der micRNA und der ompF-mRNA über
einen Bereich von etwa 80 Basen zurück, der die Shine - Dalgarno-Sequenz
und das Start-Codon umfaßt.
Eine ähnliche
Regulierung durch eine kleine komplementäre RNA wurde ebenfalls für die Tn10
Transposase beschrieben; siehe Simons et al. "Translational Control of IS10 Transposition", Cell 34 (1983),
683-691. In diesem Fall wird jedoch das Transposase-Gen und das
Gen für
die micRNA in entgegengesetzter Richtung, ausgehend von demselben
DNA-Fragment, transkribiert, so daß die 5'-Enden der Transkripte ein komplementäres Hybrid
ausbilden können.
Das Hybrid inhibiert höchstwahrscheinlich
die Translation der Transposase mRNA. Die Situation der Transposase
ist jedoch gegensätzlich
zu der des ompF, da das ompF-Gen und das micRNA Gen (micF) überhaupt
nicht miteinander verbunden sind, und bei 21 bzw. 47 Minuten auf
dem Chromosom von E.Coli lokalisiert sind.
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Es ist Aufgabe dieser Erfindung ein
Verfahren zur Regulierung der Genexpression des genetischen Materials,
das einen Organismus ausmacht bereitzustellen.
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Eine weitere Aufgabe der Erfindung
ist es, transformierte Organismen mit speziellen Eigenschaften in Bezug
auf die Genexpression des genetischen Materials, das den Organismus
ausmacht, zur Verfügung
zu stellen.
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Es ist ferner Aufgabe dieser Erfindung,
DNA oder anderes genetisches Material zur Verfügung zu stellen, wie DNA enthaltende
Plasmide, die in eine RNA transkribiert werden können, welche komplementär zu der
mRNA des genetischen Materials ist, in welches die DNA oder das
die DNA enthaltende Plasmid eingeführt wurde, und an diese mRNA
binden oder mit dieser hybridisieren können.
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Wie diese und andere Aufgaben dieser
Erfindung gelöst
werden, wird angesichts der beigefügten Offenbarung und unter
Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen offensichtlich, wobei:
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1 die
Konstruktion eines Subklons eines Gens und verschiedene Plasmide,
die dessen Promotorregion tragen beschreibt;
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2 die
Nucleotidsequenz der Promotor- und der Region stromaufwärts eines
Gens, insbesondere des ompF-Gens, zeigt; 3 die
Hybridbildung zwischen bestimmten RNAs in Übereinstimmung mit der Praxis
dieser Erfindung zeigt;
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4 die
homologen Sequenzen zwischen bestimmten Genen, insbesondere der
des micF- und des ompC-Gens zeigt; und
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5 ein
mögliches
Modell für
die Rolle der RNA, insbesondere der micF-RNA, die in der Erfindung, und
in Übereinstimmung
mit der Praxis dieser Erfindung von Nutzen ist, zeigt.
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6 zeigt
die Konstruktion des mit Vektors pJDC402 und mic(lpp).
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7 zeigt
die Homologie zwischen der ompC-mRNA und der lpp-mRNA.
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8 zeigt
die zur Konstruktion der mic(ompA)-Gene verwendeten Fragmente.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die Genexpression des genetischen
Materials von zellulärem
Material oder eines Organismus gemäß der Erfindung wird reguliert,
inhibiert und/oder gesteuert, dadurch daß DNA oder anderes genetisches
Material, das in RNA transkribiert wird, die komplementär zu der
mRNA des genetischen Materials des Organismus oder des zellulären Materials
ist, oder an diese binden oder hybidisieren kann, in das genetische
Material des zellulären
Materials oder Organismus, oder zusammen mit diesem eingebracht
wird. Durch Hinden an oder Hybridisieren mit der mRNA wird deren
Translation verhindert, mit dem Ergebnis, daß das Produkt, wie ein Protein,
das durch die mRNA codiert wird, nicht hergestellt wird. Wenn das
Translationsprodukt, z. B. das Protein, zum Wachstum des Organismus
oder des zellulären
Materials lebensnotwendig ist, wird der transformierte oder veränderte Organismus
oder das zelluläre
Material wenigstens attenuiert.
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Erfindungsgemäß wurde ein mic-System entworfen,
das die Expression eines Gens regulieren soll. Im Besonderen kann
erfindungsgemäß ein künstliches
mic-System zur Regulation der Expression irgendeines bestimmten
Gens in E.coli konstruiert werden.
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Weiterhin wird erfindungsgemäß ein micRNA-System
für ein
Gen konstruiert, indem ein kleines DNA-Fragment des Gens in umgekehrter
Orientierung hinter dem Promotor eingefügt wird. Ein derartiges System
liefert ein bis jetzt unbekanntes Verfahren, die Expression irgendeines
Gens spezifisch zu regulieren. Im Besonderen kann die Expression
irgendeines für
E.coli essentiellen Gens durch Insertion des micDNA-Fragmentes unter
der Kontrolle eines induzierbaren Promotors, insbesondere eines
in E.coli vorkommenden, reguliert werden. Offensichtlich kann erfindungsgemäß das auf
diese Weise induzierbare Absterben bei der Untersuchung essentieller
Gene hilfreich sein.
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Im folgenden wird erfindungsgemäß die Konstruktion
eines künstlichen
mic-Systems und der Nachweis seiner Funktionstüchtigkeit unter Verwendung
verschiedener E.coli Gene beschrieben. Das erfindungsgemäße mic-System
stellt einen wirksamen Weg zur Regulierung der Expression bestimmter
prokaryontischer Gene dar. Infolgedessen stellt diese Erfindung
die Grundlage zur Verfügung, ähnliche
Regulierung biologisch wichtiger Gene in Eukaryonten zu erreichen.
Beispielsweise kann das mic-System zur Blockierung der Expression
schädlicher
Gene, wie Oncogene und viraler Gene und zur Beeinflussung der Expression
von im wesentlichenjedem anderen schädlichen oder unschädlichem
Gen verwendet werden.
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Die Verfahren dieser Erfindung können sowohl
auf prokaryontisches wie auch auf eukaryontisches zelluläres Material
oder Microorganismen angewendet werden; einschließlich Bakterien
und Viren, und sind im allgemeiner auf Organismen anwendbar, die
genetisches Material enthalten, das exprimiert wird.
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Dementsprechend werden vom genetischen
Standpunkt her und wie durch Genexpression bewiesen wird, neue Organismen
ohne weiteres erfindungsgemäß hergestellt.
Weiterhin wird erfindungsgemäß ein leistungsfähiges System
oder Verfahren zur Veränderung
der Genexpression des einen Organismus ausmachenden genetischen
Materials und dergleichen bereitgestellt. Dadurch soll der Organismus
in seiner normalen Funktionsweise teilweise oder völlig beeinträchtigt werden
oder es sollen ihm bestimmte Eigenschaften vermittelt werden. Das
erfindungsgemäß verwendete
DNA-Material kann in den zu behandelnden oder herzustellenden Organismus
eingebracht werden, wie durch direktes Einbringen in den Kern eines
eukaryontischen Organismus oder im Falle eines prokaryontischen
Organismus mittels eines Plasmids oder eines geeigneten Vektors,
der die bestimmte erfindungsgemäße DNA enthält.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Es wurde bei weiterer Erforschung
des Umfeldes der Erfindung gefunden, daß die Expression der Gene für die äußeren Haupt-Membranproteine,
OmpF und OmpC von Escherichia coli einer osmotischen Regulation
unterliegen. Es wurde gefunden, daß der ompF-Locus unter hohen
osmotischen Bedingungen bidirectional transkribiert wird, und das
stromaufwärts
liegende, etwa 170 Basen lange RNA-Transkript die Produktion des
OmpF-Proteins inhibierte. Diese RNA (micRNA) besitzt eine lange
Sequenz, die komplementär
ist zu der 5'-Region
der ompF-mRNA, die die Ribosomen-Bindungsstelle und den codierenden
Bereich der ersten neun Aminosäuren
des OmpF-Proteins einschließt.
Infolgedessen wird angenommen, daß die micRNA die Translation
der ompF-mRNA durch Hybridisierung mit dieser verhindert. Dieser
neue Mechanismus kann verantwortlich dafür sein, daß die Gesamtmenge des OmpF-
und des OmpC-Proteins in E.coli immer konstant bleibt.
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Die äußeren Haupt-Membran-Proteine
von Escherichia coli, OmpF und OmpC sind essentielle Proteine, die
kleinen hydrophilen Molekülen
als passive Diffusionsporen dienen. Diese Matrix-Porin-Proteine
werden durch die Strukturgene ompF und ompC codiert, die bei 21
bzw. 47 Minuten auf dem E.coli Chromosom lokalisiert sind; siehe
Reeves, P. Bacterial Outer Membranes: Biogenesis and Function (Hrsg.
Inouye, M.) 255-291 (John Wiley and Sons, New York, 1979). Die Expression
dieser Gene wird durch die Innenkonzentration des Kulturmediums
reguliert. Die beiden Proteine werden so hergestellt, daß sie sich
genau kompensieren: wenn die Ionenkonzentration des Mediums zunimmt,
nimmt die Produktion des OmpF-Proteins ab und die des OmpC-Proteins
zu, so daß die
Gesamtmenge des OmpF- plus OmpC-Proteins konstant bleibt. Diese
Osmoseregulation der ompF- und ompC-Gene wird durch einen anderen,
mit oben genannten nicht verbundenen Locus gesteuert, dem ompB-Locus,
der bei 74 Minuten lokalisiert ist; siehe Hall, M. N. & Silhavy, T. J.,
J. Mol. Biol. 146 (1981), 23-43 und Hall, M. N. & Silhavy, T. J., J. Mol. Biol. 151
(1981), 1-15. Der ompB-Locus enthält zwei Gene, die ompB und
envZ genannt werden. Die DNA-Sequenz beider Gene wurde bestimmt
und ihre Genprodukte charakterisiert; siehe Wurtzel, E. T. et al.,
J. Biol. Chem. 257 (1982), 13685-13691 und Mizuno, T. et al. J.
Biol. Chem. 257 (1982) 13692-13698. Das EnvZ-Protein ist wahrscheinlich
ein Membranrezeptorprotein, das als Osmosesensor fungiert, und das
Signal von dem Kulturmedium an das OmpR-Protein weiterleitet. Das
OmpR-Protein dient
dann als positiver Regulator für
die Expression des ompF- und ompC-Gens. Das ompF-und ompC-Gen wurde
sequenziert, wobei sie in ihren codierenden Bereichen hohe Homologie
zueinander zeigten, während
in ihrer Promotor-Region
nur sehr wenig Homologie zu finden war. Im Zuge der Charakterisierung
des ompC-Gens wurde der neue Steuermechanismus zur Genexpression,
der durch eine neue Art von RNA in Gang gesetzt wird, die erfindungsgemäß mRNA inhibierende,
komplementäre
RNA (micRNA) genannt wird, entdeckt und/oder ans Licht gebracht.
MicRNA wird von einer unabhängigen
Transkriptions-Einheit (dem micF-Gen) synthetisiert. Dieses Gen
befindet sich unmittelbar stromaufwärts des ompC-Gens, wird jedoch
in entgegengesetzter Richtung transkribiert. Die 174 Basen lange
micRNA blockiert die Translation der ompF-mRNA indem sie mit ihr
hybridisiert. Da die Produktion der micRNA und der ompC-mRNA wahrscheinlich
proportional zueinander erfolgt scheint dieser Steuermechanismus
ein sehr wirksamer Weg zu sein, die Gesamtmenge an OmpF- und OmpC-Proteinen
konstant zu halten.
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Ein die ompF-Expression
supprimierendes DNA-Fragment
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Bei der Charakterisierung des ompC-Promotors
wurde gefunden, daß ein
stromaufwärts
des ompC-Promotors gelegenes etwa 300 bp langes DNA-Fragment die
Produktion des OmpF-Proteins
vollständig
blockierte, wenn ompF+-Zellen mit einem "multi-copy Plasmid", das dieses Fragment
enthielt, transformiert wurden. Für dieses Experiment wurde das
Plasmid pMY150 aus dem ursprünglichen
ompC-Clon, pMY111, konstruiert, indem die HpaI-Schnittstellen von
pMY111 zu XbaI- Schnittstellen
umgewandelt, und danach das 1,1 kb lange SalI-Fragment, wie in 1a von 1 beschrieben, entfernt
(wurde; siehe Mizuno, T. et al., J. Biol. Chem. 258 (1982), 6932-6940.
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In 1 wird
die Konstruktion des Subklons des ompC-Gens und verschiedener Plasmide,
die die ompC-Promotor-Region enthalten, gezeigt.
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- (a) Schematische Darstellung der Subclonierung des ompCGens.
Das Plasmid pMY111, das ein 2,7 kb großes E.coli chromosomales DNA-Fragment
in pBR322 trägt,
wurde zuvor beschrieben. Das Plasmid (1 μg DNA) wurde mit HpaI verdaut
und in Gegenwart eines XbaI-Linkers (CTCTAGAG, 150 pmol) wieder
ligiert. So wurde ein etwa 400 bp großes HpaI- Fragment entfernt,
und eine neue, einmal vorkommende XbaI-Schnittstelle geschaffen (pMY100). Das
Plasmid pMY100 (1 μg
DNA) wurde weiter mit SalI verdaut und, zur Entfernung eines 1,1
kb großen
SalI-Fragmentes, wieder ligiert (pMY150). Um ompC-Promotor Fragmente
verschiedener Größe zu erhalten,
wurde pMY150 nach Spaltung bei der einzigen HglII-Schnittstelle
(siehe 1b), mit Ba131-Nuclease verdaut,
und das Plasmid nachfolgend in Gegenwart eines XbaI-Linkers religiert.
Das so konstruierte Plasmid pCX28 gehört zu den Clonen, die das in 1b gezeigte, etwa 300 bp lange XbaI-XbaI-Fragment enthalten.
- (b) Vereinfachte Restriktionskarte des das gesamte ompC-Gen
enthaltenden Plasmids pMY150. Das 1,8 kb HindIII-SalI-Fragment (siehe umrahmten
Bereich) in pBR322 enthält
die gesamte codierende Region sowie die 5'- und 3'-nichtkodierenden Regionen des ompC-Gens.
Die Transkription des ompC-Gens geht in Pfeilrichtung vonstatten.
Ein Pfeil in zwei Richtungen zeigt ungefähr den bei Plasmid pCX28 entfernten
Teil (etwa 600 bp).
- (c) Verschiedene β-Galactosidase-(lacZ)-Genfusionen
mit den von dem ompC-Promotor und seiner stromaufwärts gelegenen
Region stammenden DNA-Fragmenten: Plasmid I, das 507 bp lange XbaI-RsaI-Fragment wurde
von pMY150 isoliert (eine RsaISchnittstelle befindet sich unmittelbar
stromabwärts
des ATG-Codons), und
zwischen die XbaI-SmaI-Schnittstellen des Plasmids pICIII, das von
dem das lacZ – Gen
enthaltende Plasmid pINIII abstammt, inseriert. Während der
Ligation wurde ein HindIII-Linker zwischen die RsaI- und SmaILigationsstelle
inseriert. Das XbaI-HindIII-Fragment wurde von dem so konstruierten
Plasmid isoliert, und in Plasmid pKM005 inseriert, um eine lacZ-Genfusion
im richtigen Leseraster zu schaffen. Charakteristische Merkmale
des Plasmids pICIII und pKM005 wurden zuvor beschrieben. Die Plasmide
II und IV, die das etwa 430 bp lange MspI-BamHI-Fragment enthalten,
wurden aus Clon I isoliert (eine HamHI-Schnittstelle befindet sich unmittelbar
stromabwärts
des ATGCodons für
die β-Galactosidase
codierende Sequenz in Plasmid I), und mit S1-Nuclease zur Schaffung
glatter Enden, behandelt. Nach Anfügen von XbaI-Linkern an beide
Seiten, wurde das erhaltene XbaI-XbaI-Fragment in Plasmid pKM005
an seiner XbaI Schnittstelle in zwei mögliche Orientierungen inseriert.
Plasmide III und V, ein etwa 300 bp langes Fragment, wurde aus Plasmid
pCX28 isoliert (siehe 1a), und in
Plasmid pKM005 in seine XbaI-Schnittstelle in zwei möglichen
Orientierungen inseriert. Diese Plasmide (I-V) wurden in einen lacZ-defizienten
Stamm SB4288 (F-,recA,thi-1,relA,ma124,spc12,supE-50,proB,lac)
transformiert, und die β-Galactosidaseaktivitäten auf
MacConkey-Platten (Difco) gemessen. Die Ergebnisse sind als LacZ+ oder LacZ- gezeigt.
Die Fähigkeit
dieser Clone, die Expression des OmpF-Proteins zu inhibieren, ist
ebenso als MicF+ oder MicF- aufgeführt.
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Das Plasmid pMY150 (1b)
enthält
die gesamte codierende Region des ompC-Gens und etwa 500 bp der
stromaufwärts
gelegenen Sequenzen, einschließlich
der des ompC-Promotors und der für
die 5'-nicht-translatierten
Region der ompC-mRNA codierenden DNA. Um ompC-Promotor-Fragmente
verschiedener Größe zu erhalten,
wurde pMY150 mit Hal31-Nuclease ausgehend von der einzigen BglII-Schnittstelle verdaut,
und nachfolgend XbaI-Linker angefügt. Die auf diese Weise konstruierten
Plasmide enthalten XbaI-Fragmente, die aufgrund der Entfernung der
XbaI-Schnittstelle von der SalI-Schnittstelle unterschiedlich groß sind (siehe 1b). Die verschiedenen XbaI-Fragmente
wurden anschließend
in einen PromotorClonierungs-Vektor eingefügt, pKM005, der das lacZ nur
bei korrekter Orientierung eines Promotorfragmentes in die einzige
XbaI-Schnittstelle zu exprimieren vermag. Diese Untersuchungen zeigten,
daß die
Transkription des ompC-Gens bei einer 390 bis 440 bp stromabwärts der
stromaufwärts
gelegenen XbaI-Schnittstelle (ursprünglich eine HpaI-Schnittstelle) gelegenen
Stelle beginnt. Überraschenderweise
verloren die mit den pKM005 Abkömmlingen
transformierten E.coli, einschließlich des Clons mit dem kürzesten,
nur 300 bp langen XbaI-Fragment, CX28 (von pCX28 subcloniert; 1a und b) die Fähigkeit, das OmpF-Protein herzustellen.
Das OmpF-Protein wurde eindeutig in den Wirtszellen (ompB+, ompF+, ompC+) hergestellt, während die gleichen Zellen das
OmpF-Protein nicht herstellen konnten, wenn sie das CX28-Fragment enthielten.
Das gleiche Ergebnis konnte bei Zellen, die längere Fragmente, wie Plasmid
I in 1c, enthielten, beobachtet werden.
In diesem Clon war das lacZ-Gen unmittelbar nach dem Start-Codon
des ompC-Gens mit diesem fusioniert worden, was einen lacZ+-Phänotyp
der Zellen, die dieses Plasmid enthielten, ergab. Bei Entfernung
des 87 bp langen XbaI-MspI-Fragmentes
aus Plasmid I, konnten die Zellen, die das resultierende Plasmid
(Plasmid II in 1c) enthielten, das
OmpF-Protein herstellen. Es sollte erwähnt werden, daß ein ähnliches
430 bp langes DNA-Fragment, das die stromaufwärts gelegene Region des ompF-Gens
enthielt, die Herstellung der ompF- und OmpC-Proteine nicht blockierte.
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DNA-Seauenz-Homolocrie
zwischen CX28 und dem ompF-Gen
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Die oben beschriebenen Ergebnisse
zeigen, daß der
etwa 300 bp lange, stromaufwärts
des ompC-Promotors gelegene Bereich der DNA die OmpF-Expression
zu verhindern vermag. Um die Funktion dieses DNA-Fragmentes (CX28)
klarzustellen, wurde die DNA-Sequenz dieser Region bestimmt.
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2 zeigt
die Nucleotid-Sequenz der Promotor- und der stromaufwärts des
ompC-Gens gelegenenen Region. Aus pMY111 oder pMY150 hergestellte
DNA-Restriktionsfragmente wurden an ihrem 3'-Ende gemäß der Methode von Sakano et
al., Nature 280 (1979), 288-294, unter Verwendung von [α-32P) dNTPs und dem großen Fragment der DNA-Polymerase
I (Klenow Fragment) markiert. Durch Verdau mit einem zweiten Restriktionsenzym
wurde dann ein nur an einem Ende markiertes DNA-Fragment erhalten.
Die DNA-Sequenz wurde nach der Methode von Maxam und Gilbert, Methods
in Enzymology 65 (1981), 499-560, unter Verwendung von 20%igen,
10%igen und 6%igen Polyacrylamidgelen in 7M Harnstoff bestimmt.
Die RNA-Polymerase-Erkennungsstelle (-35 Region) und die Pribnow
box (-10 Region) für
den ompC- und micF-Promotor, ebenso wie das Start-Codon des ompC-Gens
sind in 2 mit Kästchen gekennzeichnet. Die
Transkriptionsstartstellen der ompC- und micF-Gene wurden mittels
S1-Nuclease-Kartierung bestimmt.
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2 zeigt
die 500 bp lange DNA-Sequenz von der XbaI Schnittstelle (ursprünglich HpaI-Schnittstelle)
zu dem Start-Codon
ATG des ompC-Gens. Die stromabwärts
des Nucleinsäurerestes
88 gelegene DNA-Sequenz wurde bereits zuvor bestimmt. Es wurde gefunden,
daß die
Sequenz von Rest 99 bis 180 (2) zu
der 5'-Region der
ompF-mRNA zu 70% homolog ist, wobei die Shine-Dalgarno-Sequenz,
das Start-Codon und die Codons für
die ersten neun Aminosäurereste
des pro-OmpF-Proteins mit eingeschlossen sind (mit "+" gekennzeichnete Basen sind zu der ompF-Sequenz
homolog). Ein plausible Erklärung
der obigen Ergebnisse wäre,
daß das
300 by lange CX28-Fragment (Fig.lc) eine Transkriptionseinheit enthält, die
auf die Region stromaufwärts
des ompC-Gens gerichtet ist, so daß das RNA-Transkript dieser Region eine zu der
ompF-mRNA komplementäre
Sequenz besitzt. Somit supprimiert die Hybridisierung der beiden
RNAs miteinander die Produktion des OmpF-Proteins.
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Existenz einer neuen Transkriptionseinheit
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Um zu bestimmen, ob das CX28-Fragment
eine unabhängige
Transkriptionseinheit besitzt, die in einer dem ompC-Gen entgegengesetzten
Richtung orientiert ist, wurde das lacZ-Gen an zwei verschiedenen
Stellen innerhalb des CX28-Fragmentes mit diesem fusioniert. In
Plasmid V wurde das CX28-Fragment bezüglich Plasmid III (Fig. 1c)
in entgegengesetzter Richtung inseriert. Dieser Clon supprimierte
immer noch im vollem Umfang die Produktion des OmpF-Proteins, obwohl
keine β-Galactosidase (LacZ-)
hergestellt wurde (siehe Fig. 1c). Bei Verschieben der Fusionsstelle
auf die MspI-Schnittstelle bei Rest 88 (2,
siehe auch Fig. 1c) war der neu konstruierte Clon (Plasmid IV) in
der Lage, β-Galactosidase
herzustellen. Dieses Plasmid konnte jedoch nicht mehr die Herstellung
des OmpF-Proteins supprimieren. Obwohl dieses Plasmid stromaufwärts der
lacZ- und CX28-Sequenzen (von Rest 300 bis 500; 2)
zusätzlich
DNA enthielt (etwa 200 bp), sollte dies die Funktionen des CX28-Fragmentes
nicht beeinflussen, da das Plasmid V bei der Inhibierung der OmpF-Proteinsynthese voll
aktiv ist. Diese Ergebnisse zeigen, daß sich im CX28-Fragment eine
Transkriptionseinheit befindet, die von dem ompC-Gen-Promotor unabhängig ist
und daß das
CX28-Fragment und das ompC-Gen in gegenläufiger Richtung transkribiert
werden. Die Tatsache, daß Plasmid
IV β-Galactosidase herstellen
kann und Plasmid V nicht, zeigt, daß die CX28-Transkriptionseinheit
zwischen den Resten 1 und 88 endet (Fig. 1c). Tatsächlich kann
sich eine äußerst stabile "Stern-and-Loop"-Struktur zwischen
den Nucleotiden 70 und 92 (Pfeile mit dem Buchstaben a in 2) ausbilden, an die sich Oligo-[T] anschließt. Diese
Struktur ist für
die p-Faktor unabhängigen
Transkriptions-Abbruchstellen in Prokaryonten charakteristisch.
Der ΔG-Wert
dieser Struktur wurde zu -12,5 Kcal nach Salser, W., Cold Spring
Barbor Symp. Quant. Biol. 13 (1977), 985-1002, berechnet. Der Startpunkt
des CX28-Transkriptes wurde bei Position 237 (2)
mittels S1-Nuclease-Kartierung festgelegt. Dieses Ergebnis zeigt,
daß das
CX28-DNA-Fragment in ein 174 Nucleotide langes Transkript transkribiert
wird. Dies wurde weiter mittels Northern-Blot-Hybridisierungen bestätigt. In der
RNAPräparation
aus Zellen, die das Plasmid III enthielten (Fig. 1c) wurde deutlich
ein RNA-Transkript beobachtet, das mit dem CX28-Fragment hybridisiert
und etwas langsamer als die 5S-RNA wandert. In den Kontrollzellen
wurde nur eine geringe Menge dieser RNA nachgewiesen. Die Größe der RNA
(CX28-RNA) wurde auf dem Gel auf etwa 6S geschätzt, was weitgehend der Sequenz
(174 Basen) geschätzten
Länge entspricht.
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Funktion der CX28-RNA
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Wie zuvor angedeutet, weist das CX28-DNA-Fragment
umfangreiche Homologien mit einem Teil des ompF-Gens auf. Infolgedessen
ist ein Teil der CX28-RNA zu der ompF-RNA komplementär und kann,
wie in 3 gezeigt, mit der ompFmRNA
ein äußerst stabiles
Hybrid ausbilden. Der ΔG-Wert
dieser Hybridbildung wurde mit -55,5 Kcal berechnet. Vierundvierzig
Hasen der 5'-nicht-translatierten
Region der ompFmRNA, einschließlich
der zur Bindung der Ribosomen wichtigen Shine-Dalgarno-Sequenz,
und 28 Hasen des codierenden Bereichs sind an der Hybridbildung
beteiligt. Diese Hybridstruktur befindet sich zwischen den zwei
stabilen "Stern-and-Loop"-Strukturen der CX28-RNA; ein für das 3'-Ende p-unabhängiges Transkriptionsabbruch-Signal
(Loop a) und die andere an dem 5'-Ende
(Loop b). Die ΔG-Werte
der Loops a und b wurden mit 12,5 bzw. -4,5 Kcal berechnet.
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In 3 der
Zeichnungen wird die Hybridbildung zwischen der micF- und der ompF-mRNA
gezeigt. Die micF-RNA-Sequenz entspricht der Sequenz von Nucleotid
237 bis 64 in 2. Die ompF-mRNA Sequenz wurde
von Inokuchi, K. et al., Nucleic Acids Res. 10 (1982), 6957-6968,
angegeben. Die ΔG-Werte
der Sekundärstrukturen
a, b und c wurden mit -12,5, -4,5 bzw.
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+2,9 Kcal berechnet.
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In 3 ist
ein anderer Loop (Loop c) gezeigt. Die Ausbildung dieses Loops ist
jedoch aufgrund des ΔG-Wertes
(+2,9 Kcal) unwahrscheinlich. Es scheint, daß die Bildung des Hybrids die
Translation der ompF-RNA blockiert. Dies würde erklären, warum die Clone, die das
CX28-DNA-Fragment enthalten die OmpF-Proteinsynthese unterdrücken. Infolgedessen
wird die CX28-RNA als mRNA hindernde komplementäre RNA für ompF (mRNAinterfering complementary
RNA; micRNA für
ompF) und das Gen als micF bezeichnet. Es sollte erwähnt werden,
daß bei
Entfernung des Loops mittels Fusionieren des micF- mit dem LacZ-Gen,
die micF Funktion ebenfalls entfernt wurde (Plasmid IV, Fig. 1c).
Dies kann von der Stabilität
der micF-RNA oder alternativ von der Notwendigkeit der Anwesenheit
des Loops a für
die micF-Funktion herrühren.
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Es schien von Interesse zu sein,
zu prüfen,
ob das micF-Gen,
wie das ompC-Gen unter der Kontrolle des ompH-Locus steht. Verschiedene
lacZ-Clone wurden deshalb in vier verschiedene ompH-Mutanten eingebracht.
Im weiteren wird nun auf Tabelle I Bezug genommen.
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Verschiedene ompH-Mutantenstämme, MC4100
(F- ,lacV169,araD139,rspL,thiA,tibB,relA;
Wildtyp), MH1160 [ompB101,(ampRl) Mutante von MC4100], MH760 [amp,B427,(ompR2)
Mutante von MC4100], MH1461 [tpoll(envZ), Mutante von MC4100] wurden
mit verschiedenen Promotor-lacZ-Genfusions-Clonen transformiert.
Die Zellen wurden in 10 ml Nährmedium
bei 37°C
bis zur Klett-Einheit von 1,2 gezüchtet. 100 μl der Kulturen wurden für die Messung
auf β-Galactosidaseaktivität nach der
Methode von Miller, H. J., Experiments of Molecular Genetics (Hrsg.
Miller, H.J.) Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972), 352-355,
verwendet. Das Plasmid pK004 stammt vom Plasmid pKM005 ab und pKM004
enthält
den mit dem lacZ-Gen fusionierten lpp-Promotor (das Gen für das Lipoprotein
der äußeren Membran).
Plasmid I und IV werden in Fig.1c beschrieben. Plasmid pompFP-A1
enthält
das unter der Kontrolle des ompF-Promotors stehende LacZ-Gen.
-
Wie in Tabelle I gezeigt produziert
das unter der micF-Kontrolle stehende lacZ-Gen (Plasmid IV in Fig. 1c) β-Galactosidase
in dergleichen Art und Weise, wie das unter der Kontrolle des ompC-Promotor
stehende lacZ-Gen (Plasmid I in Fig. 1c): hohe β-Galactosidase-Aktivität wurde
sowohl im Wildtyp als auch in envZ--Stämmen gefunden,
hingegen geringe Aktivität
in den ompR1 – und
ompR2 -Mutanten. Andererseits wurde das unter der Kontrolle des
ompF-Promotors stehende lacZ-Gen in den ompR1--Zellen
nicht exprimiert. Zusätzlich
wurde das als Kontrolle verwendete, unter der Kontrolle des Lipoprotein-Promotors
stehende lacZ-Gen in allen Stämmen
exprimiert. Diese Ergebnisse zeigen, daß das micF-Gen durch den ompB-Locus in
der gleichen Art und Weise wie das ompC-Gen reguliert wird. Es ist
interessant, daß das
unter der Kontrolle des ompF-Promotors stehende lacZ-Gen in envZ--Stämmen (ompC+, ompF-) konstitutiv
exprimiert wird. Dies deutet darauf hin, daß der ompF--Phänotyp dieses
envZ--Stammes auf die Inhibierung der Translation
der ompF-mRNA durch micRNA zurückgeht.
-
Promotoren der micF- und
ompC-Gene
-
Da anscheinend sowohl die micF- als
auch die ompC-Gene
-
durch den ompB-Locus reguliert werden,
sollten die Promotorsequenzen dieser Gene Homologien aufweisen.
Um diese Homologien aufzufinden, wurde zuerst die Transkriptionsstartstelle
des ompC-Gens mittels S1-Nuclease-Kartierung bestimmt. Der hauptsächliche
Transkriptionsstart findet im T-Nucleotid
bei Position 410 und 411 statt (siehe 2; siehe auch 4).
-
In 4 werden
die Homologien der Sequenzen der micF- und ompC-Gene gezeigt. Die
Nucleotidnummern entsprechen denen in 2.
Die Sequenzen im Kästchen
zeigen die Homologien der Sequenzen der beiden Gene. Striche zwischen
den beiden Sequenzen weisen auf identische Basen hin. Die Pfeile
kennzeichnen die Transkriptionsstartstellen. Die -10- und - 35-Regionen
sind unterstrichen.
-
Die -10-Regionen der micF- und der
ompC-Gene wurden als AA-TAAT
(Nucleotide 250 bis 245 in 2) bzw.
als GAGAAT (Nucleotide 400 bis 405 in 2)
bezeichnet (4), wobei beide mit der
Konsensus-Sequenz TATAAT gut übereinstimmen.
Die RNA-Polymerase-Erkennungsstellen (-35 Bereiche) der micFund
ompC-Gene wurden als TAAGCA bzw. TTGGAT (4)
bezeichnet, wobei beide 50% Homologie zu der Konsensussequenz TTGACA
zeigen. Keine bedeutenden Sequenzhomologien wurden jedoch für den 63
bp langen micF-Promotor (Nucleotide 300 bis 238) und den ompC-Promotor
(Nucleotide 301 bis 409 in 2) gefunden.
Andererseits werden, wie in 4 gezeigt,
homologe Sequenzen in der 5'-Region
beider Transkripte gefunden. 28 von 44 Hasen sind homolog (64% Homologie),
wobei diese Regionen vermutlich die Erkennungsstellen für das OmpR-Protein darstellen.
Es ist interessant, daß eine
zu diesen Sequenzen homologe Sequenz ebenfalls in der 5'-nichttranslatierten
Region der ompF-mRNA gefunden wird. Bindungsexperimente des micF-Gens
und des ompC-Gens mit gereinigtem OmpR-Protein werden zur Zeit durchgeführt.
-
Wie vorstehend angedeutet, wird die
Regulierung der Genex pression in E.coli im allgemeinen auf der Stufe
der Transkription gesteuert. Es ist wohlbekannt, daß die Expression
einiger Gene durch ihre spezifischen Repressoren supprimiert oder
durch ihre spezifischen Aktivatoren gesteigert wird. Positive Proteinfaktoren
wie das cAMP-Rezeptor-Protein und das OmpR-Protein sind ebenfalls
als Regulatoren der Genexpression auf der Stufe der Transkription
bekannt. Ein anderer regulatorischer Mechanismus auf der Ebene der
Transkription ist die Attenuation, die eine wichtige Rolle bei der
Expressionskontrolle von Vorgängen,
die in der Biosynthese verschiedener Aminosäuren oder anderer Verbindungen
eine Rolle spielen; siehe Kolter, R. & Yanowsky, C., Ann.Rev.Genet. 16
(1982), 113-134.
-
Ferner wurde gezeigt, daß manche
Proteine die Genexpression auf der Stufe der Translation regulieren.
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen die Regulation bakterieller Genexpression
auf der Stufe der Translation, mittels eines zur Translationsstartregion
komplementären
RNA-Faktors. Dieser neue, durch die micRNA vermittelte regulatorische
Mechanismus ist in 5 dargestellt.
-
5 zeigt
ein mögliches
Modell für
die Rolle der micF-RNA.
Das OmpR-Protein bindet an das ompF-Gen bei Bedingungen geringer
Osmose und fördert
die Produktion von OmpF-Protein. Bei Bedingungen hoher Osmose bindet
das OmpR-Protein sowohl an die micF- als auch an die ompC-Gene.
Die so hergestellte micF-RNA hybridisiert mit der ompF-mRNA und
verhindert so deren Translation.
-
Die Möglichkeit, daß die micF-RNA
die Expression des ompF-Gens
auf der Stufe der Transkription verhindert, wurde nicht ausgeschlossen.
Dies ist jedoch höchst
unwahrscheinlich, da das mit dem ompF-Promotor fusionierte lacZ-Gen
in envZ--Zellen
(ompC+, ompF-; Tabelle 2) exprimiert wurde. In diesem Fall geht die
lacZ- Expression wahrscheinlich auf die Unfähigkeit der von dem Clon transkribierten
lacZ-mRNA zurück mit
der micF-RNA ein stabiles Hybrid auszubilden. Weiterhin würde es,
wenn die micRNA an den nicht codierenden Strang des ompF-Gens binden
kann, die Genexpression eher stimulieren als blockieren, da durch
das Binden das ompF-Gen für
die RNAPolymerase leichter zugänglich
wäre.
-
Die Regulierung mittels micRNA scheint
ein äußerst
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wirksamer Weg zu sein, die Produktion
eines bestimmten Proteins zu blockieren ohne dabei die Herstellung
anderer Proteine zu behindern. Das relative Verhältnis der micRNA zu der ompC-Produktion
ist gegenwärtig
nicht bekannt (β-Galactosidase-Aktivitäten in Tabelle.
I zeigen nicht notwendigerweise die genauen Promotor-Aktivitäten, da
die Promotorregionen nicht in der gleichen Art und Weise inseriert
wurden, siehe 1c). Es kann jedoch
zurecht angenommen werden, daß die
micRNA und die ompC-RNA koordiniert hergestellt werden. Infolgedessen
wird bei der Synthese des OmpC-Proteins micRNA in der gleichen Weise
hergestellt. Die micRNA blockiert daraufhin proportional die Synthese
des OmpF-Proteins, so daß die
Gesamtmenge aus OmpCplus OmpF-Protein konstant bleibt.
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Das Hinden der micRNA an die Ribosomen-Bindungsstelle
und an das Startcodon stellt einen äußerst wirksamen Weg zur Blockierung
der Translation der bestimmten mRNA dar. Ein ähnlicher Mechanismus wurde als
Erklärung
einer translationellen Blockierung in einem Mutanten des Bakteriophagen
T7 vorgeschlagen. Es wurde angenommen, daß die Sequenz des 3'-Endes einer mutierten
mRNA mit ihrer eigenen Ribosomen-Bindungsstelle hybridisiert, und
die Translation blockiert, siehe Saito, H. & Richardson, C. C., Cell 27 (1981), 533-542.
Es scheint einleuchtend, daß das
micRNA regulatorische System ein allgemeines regulatorisches Phänomen in
E.coli und in anderen Organismen, einschließlich Eukaryonten, darstellt.
Es stellt einen besonders geeigneten Mechanismus dar, mit dem sich
die Bildung eines Proteins sehr schnell beenden oder das Verhältnis eines
Proteins zu einem anderen steuern läßt. RNA-Arten können zusätzliche
Funktionen bei der Regulation verschiedener zellulärer Aktivitäten ausüben. Tatsächlich wurde
nachgewiesen, daß kleine RNA-Transkripte an der
Regulierung der DNA-Replication einiger Plasmide beteiligt sind.
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Anhand der vorliegenden Offenbarung
wird deutlich, daß erfindungsgemäß ein leistungsfähiges System
und Verfahren zur Regulierung der Genexpression bereitgestellt wird.
Die Genexpression wird erfindungsgemäß reguliert dadurch daß DNA, die
bei Transkription zusammen mit dem genetischen Material des Organismus
oder des zellulären
Materials eine Oligoribonucleotid- oder Polyribonucleotid-RNA produziert,
die komplementär
zu einer durch das genetische Material des Organismus oder des zellulären Materials
hergestellten mRNA ist und/oder in der Lage ist, mit dieser zu hybridisieren,
so daß die
Expression oder Translation der RNA inhibiert oder verhindert wird,
in, das genetische Material eines Organismus oder zellulären Materials
(das nur sein ursprüngliches
genetisches Material besitzt oder das durch Deletion von ursprünglichem
genetischen Material bzw. durch Hinzufügen fremden genetischen Materials
genetisch verändert
worden ist) eingebracht wird oder damit assoziiert wird.
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Die erfindungsgemäße Regulierung der Genexpression
eines Organismus oder zellulären
Materials wird in einem transformierten Organismus oder zellulärem Material
durchgeführt,
in dem zusammen mit dem genetischen Material des Organismus oder
zellulären
Materials DNA eingeführt
wurde oder damit assoziiert wurde, die bei Transkription zusammen
mit dem genetischen Material des Organismus oder zellulären Materials
eine Oligoribonucleotid- oder Polyribonucleotid-RNA produziert,
die komplementär
zu einer durch das genetische Material des Organismus oder des zellulären Materials
hergestellten mRNA ist und/oder in der Lage ist an diese zu binden
oder mit dieser zu hybridisieren, so daß die Expression oder Translation
der RNA inhibiert oder verhindert wird.
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Erfindungsgemäß produziert das DNA-Material
oder das Molekül
bei Transkription in einem transformierten Organismus oder zellulären Material,
das das DNA-Material oder das Molekül enthält, eine Oligoribonucleotid-
oder Polyribonucleotid-RNA, die komplementär zu einer durch das genetische
Material des Organismus oder des zellulären Materials hergestellten
mRNA ist und/oder in der Lage ist an diese zu binden oder mit dieser
zu hybridisieren, und kann in das genetische Material des zu transformierenden
Organismus eingebracht oder mit diesem assoziiert werden, indem
der Organismus oder das zelluläre
Material mit dem DNA-Material oder dem Molekül selbst direkt transformiert
wird, oder durch Einbringen des DNA-Materials in ein Plasmid, einen
Virus, oder viralen Vektor und anschließendes Transformieren des Organismus
der des zellulären Materials
mit dem Plasmid und/oder dem viralen Vektor. Das DNA-Material oder
Molekül
kann direkt in den Kern, der das genetische Material des Organismus
oder des zellulären
Materials enthält,
inseriert werden. Das DNA-Material
oder das Molekül,
das die Transformation des Organismus oder des zellulären Materials
bewirkt, kann in den Organismus durch dessen Membran in das Cytoplasma
oder den flüssigen
Inhalt des Organismus oder zellulären Materials inseriert werden,
um mit dem genetischen oder chromosomalen DNA-Material, das den
Organismus charakterisiert zu assoziieren. Auf Wunsch oder bei Bedarf
kann Microinjektion verwendet werden, um das DNA-Material oder das
Molekül
in den Organismus oder das zelluläre Material, das transformiert
werden soll, z. B. den Kern oder das Cytoplasma des Organismus,
einzubringen. Es ist gewöhnlich zweckdienlich,
das DNA-Material oder das Molekül
mit dem zu transformierenden genetischen Material des Organismus
oder zellulären
Materials zu assoziieren oder in dieses einzubringen, indem das
DNA-Material oder das Molekül
durch die Membran, die den Organismus oder das zelluläre Material
umgibt, eingebracht wird.
-
Konstruktion
eines künstlichen
mit-Gens
-
Das mit-Gen stellt eine 174 Hasen
lange RNA her, die die Herstellung des OmpF-Proteins verhindert. Diese
kleine RNA besitzt zwei "Stern-and-Loop"-Strukturen, eine
an ihrem 3'-Ende und die andere
an ihrem 5'-Ende.
Da angenommen wird, daß diese
Strukturen eine wichtige Rolle für
die Funktion der micRNA spielen, wurde versucht, diese Merkmale
bei der Konstruktion eines künstlichen
mic-Systems unter Verwendung des Gens für das äußere Haupt-Membran-Lipoprotein
(lpp), das in dem induzierbaren Expressionsvektor pIN-II vorlag,
zu verwenden; siehe Nakamura et al., "Construction of Versatile Expression
Cloning Vehicles Using the Lipoprotein Gene of Escherichia Coli", EMHO J. 1 (1982),
771-775. pIN-II-Vektoren sind starke Expressionsvektoren, die den
lacpo stromabwärts
des Lipoproteinpromotors besitzen, und so eine induzierbare starke
Expression eines inserierten Gens erlauben. Der pIN-II-Promotor wurde
mit dem lpp-Gen an der einzigen XbaI-Stelle unmittelbar stromaufwärts der
Shine-Dalgarno-Sequenz der lppmRNA fusioniert. Das daraus resultierende
Plasmid wurde pYM140 genannt. Sobald die Expression des lpp-Gens
in pYM140 mittels Isopropyl-β-D-Thiogalactosid
(IPTG), einem lac-induzierenden Mittel, induziert wird, hat das
von dem lpp-Gen herrührende
RNA-Transkript eine mögliche "Stem-and-Loop"-Struktur (an ihrem 5'-Ende). Unmittelbar stromaufwärts der
einzigen XbaI-Stelle, siehe 6-A, befindet
sich eine andere stabile "Stern-and-Loop"-Struktur an ihrem
3'-Ende. Der letzgenannte
Loop stammt - von dem p-unabhängigen
Transkriptions-Terminationssignal des lpp-Gens. Die Konstruktion
eines allgemeinen mic-Clonierungsvektors, pJDC402 wurde mittels
Entfernen des DNA-Fragmentes zwischen den zwei Loops in pMH044,
wie in 6-A gezeigt, erreicht. Eine RsaI-Schnittstelle unmittelbar
stromaufwärts
der Terminationsstelle wurde in eine EcoRI-Schnittstelle durch unvollständiges Spalten
von pYM140 gefolgt von Insertion eines EcoRI-Linkers geändert. Das
daraus resultierende Plasmid, pMHO44 wurde teilweise mit EcoRI gespalten,
gefolgt von vollständiger
Spaltung mit XbaI. Die einzelsträngigen
Teile des linearen DNA-Fragmentes wurden mit DNA-Polymerase (großes Fragment)
aufgefüllt,
und dann mit T4-DNA-Ligase behandelt, woraus sich das Plasmid pJDC402
ergab, das das Fragment zwischen der XbaI- und RsaI-Schnittstelle
verloren hatte. Als Ergebnis dieser Behandlung wurde sowohl eine
EcoRI- als auch eine XbaI-Schnittstelle an dieser Verbindung wieder
gebildet. So kann die einzige XbaI-Schnittstelle als Insertionsstelle
für ein
beliebiges DNA-Fragment dienen, und das RNA Transkript des künstlichen mit-Gens
stellt eine RNA her, die eine ähnliche
Struktur wie die micF-RNA besitzt; der Anteil der von der inserierten
DNA herrührt,
befindet sich zwischen den zwei Loop-Strukturen am 5'-Ende und am 3'-Ende.
-
Das Folgende stellt eine detailliertere
Beschreibung der 6-A und der 6-B dar. Wie in 6-A zur
Konstruktion von pJDC402 gezeigt, werden die Restriktionsschnittstellen
wie folgt gekennzeichnet: X, XbaI; P, PvuII; E, EcoRI. LppP und
lacpo stellen den Promotor für
das Lipoproteingen bzw. für
das Lactosegen dar. Ampr stellt das Ampicillin-Resistenzgen dar. Gekreuzte Schraffierungen
stellen den Promotor des Lipoproteingens dar. Schwarze Punkte stellen
den Promotor des Lactosegens dar. Striche zeigen die Lipoproteinsignalsequenz,
und der ausgefüllte
Balken stellt die codierende Region des reifen Teils des Lipoproteins
dar. Die Bereiche der Punkte stellen den Bereich des Abbruchs der
Transkription des lpp-Gens dar. Der offene Balken stellt die 5'-nicht translatierte
Region der Lipoprotein-mRNA dar.
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In 6-B stellen
bzgl. der Konstruktion von mic(lpp) pJD-C412 die ungemusterten Pfeile Promotoren dar.
Die PvuII-Schnittstelle
wurde mittels Insertion, eines XbaI-Linkers (TCTAGAG) in eine XbaI-Schnittstelle umgewandelt.
Dieses Fragment wurde in die einzige XbaI-Schnittstelle von pJDC402
in der umgekehrten Orientierung eingefügt, woraus sich pJDC412 ergab.
a und b zeigen die bei dem lpp- bzw. lac- Promotor beginnenden mic(lpp)-RNAs.
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Konstruktion des mic(lpp)-Gens
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sUm die Synthese des Lipoproteins
bei der Induktion des mic(lpp)-Gens zu blockieren, wurde zuerst versucht,
unter Verwendung dieses mic-Clonierungsvektors pJDC402 ein mic-System für das lpp-Gen
von E.coli herzustellen. Zu diesem Zweck war es zunächst notwendig,
das DNA-Fragment zu isolieren, das die Shine-Dalgarno-Sequenz zur
Bindung der Ribosomen und die codierende Region für die ersten
paar Aminosäuren
des Prolipoproteins enthält.
Dazu wurde die PvuII-Schnittstelle, die sich unmittelbar hinter
dem codierenden Bereich des Prolipoprotein-Signalpeptids befand,
durch Insertion eines XbaI-Linkers an dieser Stelle in eine XbaI-Schnittstelle
umgewandelt. Das daraus resultierende Plasmid wurde anschließend mit
XbaI gespalten und das 112 bp lange XbaI-XbaI-Fragment (ursprünglich PvuII-XbaI-Fragment)
aufgereinigt. Dieses Fragment, das die Shine-Dalgarno-Sequenz und
den codierenden Bereich für
die ersten 29 Aminosäuren
des Aminoterminus des Prolipoproteins enthielt, wurde aufgereinigt.
Das Fragment wurde anschließend
in die einzige XbaI-Schnittstelle von pJDC402 in zu dem normalen
lpp-Gen entgegengesetzter Richtung inseriert. Das daraus resultierende
Plasmid wurde pJCD412 genannt und kann nach Induktion mit IPTG mic(lpp)-RNA,
ein RNA-Transkript, das zu der lpp-mRNA komplementär ist, herstellen.
-
Es sollte darauf hingewiesen werden,
daß ein
weiteres wichtiges Merkmal des mic-Expressionsvektors pJCD402 dazu
besteht, daß er
eine HinfI-Schnittstelle besitzt, die sich unmittelbar stromaufwärts des lpp-Promotors
befindet, und eine weitere, die sich unmittelbar stromabwärts der
Transkriptionsterminationsstelle befindet. Diese zwei HinfI-Schnittstellen können zur
Entfernung eines DNA-Fragmentes, das die gesamte mic-Transkriptionseinheit
enthält,
verwendet werden, welche anschließend wieder in die einzige PvuII-Schnittstelle des
Vektors eingesetzt werden kann. Auf diese Weise kann das gesamte
mit-Gen in einem einzigen Plasmid
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verdoppelt werden. Man würde erwarten,
daß ein
Plasmid, das zwei identische mic-Gene enthält, doppelt so viel micRNA
produziert wie ein Plasmid, das nur ein einziges mit-Gen enthält. Ein
derartiges, zwei mic(lpp)-Gene enthaltendes Plasmid wurde konstruiert
und pJCD422 genannt.
-
Expression des mic(lpp)-Gens
-
Um die Auswirkungen der künstlichen
mic(lpp)-RNR zu untersuchen, wurden Zellen eine Stunde nach Induktion
der mic(lpp)-RNA mit 2mM IPTG eine Minute mit [35S]-Methionin pulsmarkiert.
Die Zellen, die den Vektor pJDC402 enthielten, stellen, wie durch
densitometrisches Abtasten des Autoradiogramms und Abgleichen gemessen
wurde, sowohl bei Abwesenheit, wie auch in Gegenwart des Induktors
IPTG jeweils die gleiche Menge Lipoprotein her. Die Lipoproteinsynthese
war in Zellen, die das Plasmid pJDC412 enthielten, in der Abwesenheit
von IPTG etwa 2-fach und in der Gegenwart von IPTG etwa 16-fach
geringer. Die Reduktion der Lipoproteinsynthese bei Abwesenheit
von IPTG wird auf die unvollständige
Unterdrückung
des mic(lpp)-Gens zurückgeführt. In
Zellen, die das Plasmid pJDC422 mit den zwei mic(lpp)-Genen enthielten,
war die Lipoproteinsynthese bei Abwesenheit von IPTG etwa 4-fach
geringer und in Gegenwart von IPTG etwa 31-fach. Diese Ergebnisse
zeigen deutlich, daß die
Herstellung der künstlichen
mic(lpp)-RNA die Lipoproteinsynthese inhibiert, wobei die Inhibierung
zu der Menge hergestellter mic(lpp)-RNR proportional ist. Es ist
festzustellen, daß die
mic(lpp)-RNA die Lipoproteinsynthese spezifisch blockiert, und die
Synthese anderer Proteine, mit Ausnahme des OmpC-Proteins, nicht
blockiert wird. Die Tatsache, daß die Induzierung des mic(lpp)-Gens
die Synthese des OmpC- und des OmpF-Proteins verringert, wird, wie
im folgenden beschrieben, auf die außergewöhnliche Homologie zwischen
dem lpp- und dem ompC-Gen zurückgeführt.
-
Es gibt mehrere Mechanismen wie die
mic-Inhibierung vonstatten gehen kann. Ein Mechanismus stellt die
Bindung der micRNA an die mRNA dar, wodurch die Bindung der Ribosomen
an die mRNA verhindert wird. Andere mögliche Mechanismen umfassen:
Destabilisierung der mRNA, Attenuation der mRNA infolge vorzeitiger
Beendigung der Transkription, oder Inhibierung des Transkriptionsstarts.
Wenn der inhibitorische Effekt der micRNA ausschließlich auf
der Stufe der Attenuation oder des Transkriptionsstarts stattfindet,
wäre zu
erwarten, daß die
mic-Auswirkung etwas verspätet
eintritt, da die funktionelle Halbwertszeit der Lipoprotein-mRNA
12 Minuten beträgt.
Infolgedessen wurde untersucht, wie schnell die Lipoproteinsynthese
nach Induzierung der mic(lpp)-RNA inhibiert wird, indem E.coli JA221/F'lacIq,
die das Plasmid pJDC412 enthielten, zu verschiedenen Zeitpunkten
nach Induzierung mit IPTG mit [35S]-Methionin pulsmarkiert wurden.
Es wurde gefunden, daß die
Lipoproteinsynthese innerhalb 5 Minuten nach Zugabe von IPTG maximal
16-fach inhibiert wurde. Dieses Ergebnis zeigt, daß die Inhibierung
der Lipoproteinsynthese hauptsächlich
auf die Bindung der mic(lpp)-RNA an die lpp-mRNA zurückgeht,
was zu einer Translationsinhibierung der lpp-mRNA und/oder Destabilisierung
der mRNA führt.
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lpp-mRNA-Synthese in Gegenwart
von mic(lpp)-RNA
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Es erschien interessant zu sein festzustellen,
ob die mic(lpp)-RNA ebenso die Menge der lpp-mRNA beeinflußt, da die
Expression des micF-Gens im wesentlichen die Menge der ompFmRNA
reduziert. Dazu wurde eine Stunde nach Induzierung des mic(lpp)-Gens
mittels IPTG zelluläre
Gesamt-RNA isoliert. Die RNA-Präparation
wurde nach Elektrophorese in einem Formaldehyd-Agarosegel analysiert,
und anschließend
auf Nitrocellulosefilter transferiert. Der Filter wurde dann mit
einer für
die mic(lpp)-mRNA oder die lpp-mRNA spezifischen Sonde hybridisiert.
Zusätzlich
wurde eine für
die ompA-mRNA spezifische Sonde als interne Kontrolle verwendet.
pJDC402 zeigt wiederum keinen Unterschied bei der Produktion der
lpp mRNA in An- oder Abwesenheit von IPTG. Da der doppelsträngige Primer,
der in diesen Experimenten zur Herstellung der Sonde verwendet wurde,
einen Teil des lac-Operons enthält,
hybridisieren die Sonden an jedes Transkript, das den lac-Promotor enthält, wie
die mic(lpp)-RNA von pJDC412 und das kürzeste nicht codierende Transkript
von pJDC402. Zellen, die pJDC412 enthalten, weisen in Abwesenheit
von IPTG eine geringere Menge und in Gegenwart von IPTG eine stark ' verringerte Menge
an lpp-mRNA auf. Die Herstellung der mic(lpp)-RNA in An- und Abwesenheit
von IPTG in Zellen mit pJDC412 wurde gezeigt. Daher werden sogar
in Abwesenheit von IPTG beträchtliche
Mengen mic(lpp)-RNA hergestellt, was mit den zuvor beobachteten
Ergebnissen der Lipoproteinsynthese übereinstimmt. Die Tatsache,
daß die
lpp-mRNA nach Induzierung der mic(lpp)-RNA verschwindet, zeigt,
daß der
Wirkungsmechanismus der micRNA sich nicht allein auf die Stufe der
Translation beschränkt.
Untersuchungen zeigten, daß es
zwei mic(lpp)-RNAs verschiedener Länge gibt. Die Längen dieser
Transkripte wurden auf 281 und 197 Basen geschätzt, was mit den Transkripten,
die bei dem Lipoprotein-Promotor (der größeren RNA) und dem lac-Promotor
(der kleineren RNA) beginnen, übereinstimmen.
-
Inhibierung der OmpC Synthese mit
dem mic(ompC) Gen Auch eine fast vollständige Inhibierung der OmpC-Synthese
durch künstliche
Konstruktion der mic(ompC)-Gene wurde erreicht. Das erste Konstrukt, pAM320
enthält
2 mic(ompC)-Gene und ergibt ein RNA-Molekül, das zu 20 Nucleotiden der
Leader-Region und
100 Nucleotiden des codierenden Bereichs der ompCmRNA komplementär ist. Dies
wurde durch Umwandlung der einzigen BglII-Schnittstelle in dem ompC-Strukturgen
und der MnlI-Schnittstelle
20 Nucleotide stromaufwärts
des ATG-Startcodons in XbaI-Schnittstellen erreicht. Das daraus
resultierende 128 by lange XbaI-Fragment wurde dann in pJDC402 in
zu dem ompC-Gen
entgegengesetzter Richtung inseriert, und eine zweite Kopie des
mic(ompC)-Gens wurde in ähnlicher
Art und Weise wie sie zur Konstruktion von pJDC422 beschrieben wurde,
eingeführt.
In dem daraus resultierenden Plasmid pAM320 befindet sich das zweite mic(ompC)-Gen
in zu dem ersten entgegengesetzter Orientierung. Die Umkehrung der
Orientierung des zweiten mit-Gens änderte die Expression oder
die Stabilität
des Plasmids nicht. Ein zweites Konstrukt, pAM321 wurde entworfen,
um die Region der Komplementarität
zwischen der micRNA und der ompC-mRNA zu vergrößern, wobei eine längere Leadersequenz
als im Fall von pAM320, 72 Nucleotide der Leader-Region anstelle
von 20, mit verwendet wurde. Dieses Plasmid wurde wie pAM320 konstruiert,
mit der Ausnahme, daß sich die
in eine XbaI-Schnittstelle umgewandelte MnlI-Schnittstelle 72 Nucleotide
stromaufwärts
des ompC-Startcodons befand.
-
Es wurden von E.coli JA221/F'lacIq, die den mic-Clonierungsvektor
pJDC402, pAM320 und pAM321 enhielten, isolierte, mit Commassie Brilliant
Blue gefärbte
Gelmuster der äußeren Membranproteine
erhalten. Die Auswirkung von IPTG-Zugabe war durch das Vorhandensein
von β-Galactosidase
klar ersichtlich. Die Induzierung der mic(ompC)-RNA von pAM320 verursachte,
verglichen mit pJDC402, eine wesentliche Abnahme (etwa 5-fach) der
OmpC-Synthese. Die Induzierung der längeren mic(ompC)-RNA aus pAM321
verringerte die Synthese noch weiter (etwa 20-fach verglichen mit
pJDC402). Die Synthese von OmpC in den Zellen, die pAM320 enthielten,
konnte bei einminütiger
Pulsmarkierung, 1 Stunde nach Induzierung mit IPTG kaum nachgewiesen
werden. In dem gleichen Experiment verringerte sich die OmpC-Synthese
etwa 7-fach, wenn das mic(ompC)-Gen in den Zellen, die pAM320 enthielten,
mit IPTG induziert wurde. Eine starke Abnahme der OmpC-Expression
wurde auch bei Induzierung von Plasmiden, die nur eine Kopie der
mic(ompC)-Gene enthielten, beobachtet. Wiederum zeigte das längere mic(ompC)-Gen
eine stärkere
Wirkung. Die wirksamere mic-vermittelte Inhibierung bei pAM321 könnte bedeuten,
daß die
Wirksamkeit der micRNA- Funktion
mit dem Grad der Komplementarität
zum 5'-Ende der
mRNA im Zusammenhang steht.
-
Interessanterweise konnte man feststellen,
daß die
Synthese von beiden oben beschriebenen mic(ompC)-RNAs zu einer Reduzierung
nicht nur der OmpC-Synthese sondern auch der Lipo:protein-Synthese
führte.
Dieser inhibitorische Effekt der mic ompC)-RNA auf die Produktion
von Lipoprotein scheint auf , die unerwartete Homologie der lpp-mRNA
zu der ompC-mRNA, wie in 7 gezeigt
zurückzugehen.
Dieses Merkmal erklärt,
warum pAM320 und pAM321 einen mic-Effekt auf die Herstellung von
Lipoprotein ausüben. Eine
solche Erklärung
würde bedeuten,
daß Induzierung
der mic(lpp)-RNA aus pJDC412 und pJDC422 die Synthese des ompC-Proteins
reduziert, was auch der Fall war.
-
In 7 wird
ein homologer Bereich zwischen der lpp-mRNA (obere Linie) und der
ompC-mRNA (untere Linie) gezeigt. Striche verbinden identische Hasen.
Heide mic ompC)-RNAs haben die Fähigkeit, über diese
homologe Region zu hybridisieren. Die Shine-Dalgarno-Sequenz (S.D.)
und das AUG-Startcodon sind mit Kästchen versehen.
-
Inhibierung
der ompA-Produktion mit der mic om(ompA)-RNA
-
Zur Bestimmung der Komponenten, die
zu der Wirksamkeit einer micRNA beitragen, wurden verschiedene mic-Gene
aus dem ompA-Gen konstruiert. Das ompA-Gen wurde dafür ausgewählt, da
die Leader- und die codierenden Bereiche der ompA-mRNA ausführlich charakterisiert
wurden. Fünf
DNA-Fragmente (siehe 8 I bis V) wurden
einzeln in die XbaI-Schnittstelle von pJDC402
in der die Produktion der mic(ompA)-RNAs fördernde Orientierung cloniert.
Die daraus resultierenden mic(ompA)-Plasmide, die die Fragmente I bis V
enthalten wurden pAM301, pAM307, pMA313, pAM314 bzw. pAM318 genannt.
Jedes Plasmid enthielt nur eine Kopie des beschriebenen mic(ompA)-Gens.
-
In B zeigt
die oberste Zeile die Struktur des E.coli ompA-Gens. Der Pfeil stellt
den Promotor und der Balken die für die 5'-Leader-Region der ompA-mRNA codierende
Region dar. Der gestrichelte und schattierte Balken repräsentiert
den Anteil des ompA-Gens, das die Signalsequenz bzw. das reife ompA-Gen
codiert. Das Restriktionsfragment I (HphI-HpIa) wurde zur Konstruktion
in die XbaI-Schnittstelle von pJDC402 (siehe 6-A),
in der zur hier gezeigten entgegengesetzten Orientierung inseriert,
wie in 6-H für mic(lpp) dargestellt. Die
anderen mic(ompA)-Plasmide wurden in ähnlicher Weise konstruiert
aus: Fragment II, pAM307; Fragment III, pAM313; Fragment IV, pAM314;
Fragment V, pAM318. Die Positionen der Shine-Dalgarno-Sequenz (SD),
des ATG-Startcodons (ATG), und der relevanten Restriktionsschnittstellen
sind dargestellt.
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E.coli JA221/F'lacIq, die jeweils
eines der mic(ompA)-Plasmide enthielten, wurden eine Minute, mit
und ohne einstündige
Vorinkubation mit IPTG, mit [35S]-Methionin
pulsmarkiert. Elektrophoretische Muster der aus diesen Kulturen
isolierten äußeren Membranproteine
wurden erhalten. Die Autoradiogramme zeigten, daß jedes der fünf mic(ompA)-Gene
in der Lage ist, die ompA-Synthese zu inhibieren. Die mic(ompA)-Gene schienen jedoch
weniger wirksam als die zuvor beschriebene mic(lpp)- und mic(ompC)-Gene
zu sein; dieses Problem wurde jedoch durch Erhöhung der Anzahl der mic(ompA)-Gene
umgangen.
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Das Plasmid pAM301, das eine mRNA
codiert, die zu einer 258 Hasen langen Region der ompA-mRNA, die
die Translation-Startstelle (Fragment I in 8)
umfaßt,
komplementär
ist, inhibiert die ompA-Synthese zu etwa 45g. Eine ähnliche
Inhibierung zu etwa 51% wurde mit pAM307 erhalten. Dieses Plasmid enthält das Fragment
II (siehe B), das keine zu dem ompA-Strukturgen korrespondierenden
DNA-Sequenzen enthält.
Die Inhibierung durch pAM307 war nicht überraschend, da die zuvor beschriebenen mic(ompC)-Versuche
zeigten, daß eine
zu der 5'-Leaderregion der
mRNA erhöhte
Komplementarität
bei der micRNA vermittelten Inhibierung wirkungsvoller war. Andererseits
konnte ebenso pAM313, das eine nur zu einem Teil des ompA-Strukturgens, das
durch Fragment III (siehe 8) abgedeckt ist,
komplementäre
micRNA produziert, die den codierenden Bereich für die Aminosäurereste
4 bis 45 des pro-ompA überdeckt,
wirksam die ompA-Synthese zu etwa 54% inhibieren, was zeigt, daß die micRNA
nicht mit der Startstelle der Proteinsynthese und/oder der 5'-Leaderregion der
Ziel-mRNA hybridisieren muß,
um wirksam zu sein. Dies wurde ebenfalls unter Verwendung der mic(lpp)-Gene
bestätigt.
Zwei mic(lpp)-RNAs,
die nur zu der codierenden Region der lpp-mRNA komplementär waren
konnten ebenfalls die Lipoproteinsynthese inhibieren. Die Auswirkung
der mic(lpp)-Gene in pJDC413 und pJDC414, die aus den die Aminosäurereste
3 bis 29 bzw. 43 bis 63 des Prolipoproteins codierenden lpp-Strukturgen-Fragmenten
konstruiert wurden, wurden untersucht. Sowohl pJDC413 als auch pJDC414
zeigten jedoch nur eine zweifache Inhibierung der Lipoproteinsynthese,
was zeigt, daß ein
DNA-Fragment, das die Translationsstartstelle (die eine 16-fache
Inhibierung bewirkte) abdeckt, im Falle der mic(lpp)-Gene wirkungsvoller
ist.
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Das Fragment IV (siehe 8) wurde ausgewählt, um die Wirksamkeit einer
micRNA, die nur zu der 5'-Leaderregion
der ompA-mRNA komplementär
ist, zu untersuchen. Das daraus resultierende Konstrukt pAM314 stellt
eine zu einem 68 Hasen langen Bereich des ompA-mRNA-Leaders, der
60 Hasen stromaufwärts des
AUG-Startcodons liegt, komplementäre micRNA her. pAM314 zeigte
nur sehr schwache mic-Wirkung und inhibierte die ompA-Synthese nur zu etwa
18%. Die deutlichen Unterschiede der mic-Wirkung bei den Fragmenten
II und IV (siehe B) zeigen deutlich,
daß die
komplementäre
Interaktion innerhalb der Region der mRNA, die mit dem Ribosom interagiert,
d. h. die Shine-Dalgarno-Sequenz und/oder der codierende Bereich, obwohl
nicht absolut notwendig, sehr wichtig für die Effektivität der mic-Funktion
ist. Interessant ist auch, daß die
Verkürzung
des mic ompA)-Gens, von Fragment I bis V, nur wenig Auswirkungen
auf die Wirksamkeit, 45%ige verglichen mit 48%iger Reduzierung,
besaß.
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Zur Konstruktion eines Plasmids,
das die Synthese von ompA effizienter als die oben beschriebenen inhibieren
kann, wurden Plasmide konstruiert, die mehr als ein ompA-Gen enthielten.
Das Plasmid, pAM307 und seine Abkömmlinge, pAM319 und pAM315
wurden verglichen. Die letztgenannten zwei Plasmide enthalten zwei
bzw. drei Kopien des mic ompA)-Gens in pAM307. Während pAM307 die OmpA-Synthese
zu etwa 47% inhibierte, wurde mit pAM315 und pAM319 eine Inhibierung
der OmpA-Synthese von 69% bzw. 73% erreicht.
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Die vorstehend aufgeführten Resultate
zeigen deutlich, daß das
künstliche
mic-System und die Techniken dieser Erfindung zu spezifischen Expressionsregulierung
eines bestimmten Gens verwendet werden kann. Im besonderen stellt
das induzierbare mic-System für
ein bestimmtes Gen einen neuen und äußerst wirksamen Weg dar, die
Funktion eines Gens zu untersuchen. Wenn dieses Gen lebensnotwendig
ist, kann eine von der Induzierung des mic-Systems abhängige Sterblichkeit
erreicht werden, ähnlich
einer temperatursensitiven Mutation. Es sollte jedoch erwähnt werden,
daß das
mic-System die Synthese des bestimmten Proteins selbst blockiert,
während
temperatursensitive Mutationen nur die Funktion des Proteins blockieren,
nicht aber die Synthese.
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Aus dieser Erfindung ergibt sich
Folgendes:
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- (a) Die Herstellung eines RNA-Transkriptes (micRNA), das
komplementär
zu einer bestimmten mRNA ist, inhibiert die Expression dieser mRNA.
- (b) Die Herstellung einer micRNA blockiert spezifisch die Expression
nur der Gene, die zu der micRNA komplementär sind.
- (c) Die Induzierung der micRNA-Produktion blockiert die Expression
des bestimmten Gens sehr schnell, in weniger als der Halbwertszeit
der mRNA.
- (d) Die micRNA reduziert ebenso die Menge der bestimmten mRNA
in der Zelle, wie bei der Expression des natürlichen micF-Gens sowie des
künstlich
hergestellten mic(lpp)-Gens in der vorliegenden Erfindung gefunden
wurde.
- (e)Es gab einen klaren Effekt der Gendosierung; je mehr micRNR
hergestellt wird, desto wirksamer wird die Expression des Zielgens
blockiert.
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In den erfindungsgemäßen Verfahren
scheinen die micRNAs, die zu Regionen der mRNA komplementär sind,
die bekanntermaßen
mit Ribosomen interagieren, am wirkungsvollsten zu sein. Beispielsweise
bei Verwendung des lpp-Gens
scheint es, daß eine
mic(lpp)-RNA, die mit der Shine-Dalgarno-Sequenz
und der Translationsstartstelle der lpp-mRNA hybridisieren kann,
die Lipoproteinsynthese wirksamer inhibieren kann als eine RNA,
die dazu nicht in der Lage ist. Bei dem ompA-Gen waren jedoch micRNAs,
die zu sowohl der Shine-Dalgarno-Sequenz als auch der Translationsstartstelle
komplementär
waren, sowie solche, die nur zu der Shine-Dalgarno-Sequenz oder nur zu dem Strukturgen
komplementär
waren, gleichermaßen
wirksam.
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Für
einige Gene, wie das ompC- und das lpp-Gen, kann der Bereich um
die Translationsstartstelle herum öfters vorkommende Sequenzen
enthalten, so daß Induzierung
der micRNA zur Inhibierung von mehr als einem Protein führt. In
diesen Fällen
kann ein anderer Bereich des Gens zur Konstruktion des mit-Gens
verwendet werden. Die Länge
der micRNA stellt eine andere Variable dar, die beachtet werden
muß. Die
längere mic(ompC)-RNA
war bei der Inhibierung der OmpC-Synthese 4-mal wirksamer als die
kürzere mic(ompC)-RNA.
Dies zeigt, daß bei
Verwendung längerer
micRNAs eine höhere
Spezifität
erreicht werden kann. Es sollte erwähnt werden, daß die Inhibierung
der Lipoproteinexpression mittels der mic(ompC)-RNA bei längeren mic(ompC)-RNAs
weniger wirksam war, obwohl der Bereich der beiden zu der Lipoprotein-mRNA komplementären mic(ompC)-RNAs
der gleiche war. Im Gegensatz zu den mic(ompC)-Genen schien die
Länge bei
der mic(ompA)-RNA vermittelten Inhibierung der OmpA-Synthese kein
wesentlicher Faktor zu sein. Zusätzlich
spielt die Sekundärstruktur
der micRNA höchstwahrscheinlich
eine wichtige Rolle bei der Funktion der micRNA.
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Es gibt mehrere Mechanismen durch
welche die micRNA die Expression des bestimmten Gens inhibieren
kann. Höchstwahrscheinlich
wirkt die micRNA hauptsächlich
durch Bindung an die mRNA, wobei, wie zuvor erläutert, die Interaktion mit
den Ribosomen verhindert wird. Diese Hypothese wird durch die Tatsache gestützt, daß die mic(lpp)-RNA
die Lipoproteinsynthese in kürzerer
Zeit inhibierte, als nötig
wäre für die Beeinflussung
der Transkription, basierend auf der Halbwertszeit der lpp-mRNA.
In Bezug auf die Frage wie die micRNA eine mengenmäßige Reduzierung
der Lipoprotein-mRNA herbeiführt,
stellt eine mögliche
Erklärung
dafür die
Tatsache dar, daß die
mRNA weniger stabil ist, wenn keine Ribosomen über die gesamte mRNA hinwegwandern.
Ein weiteres mögliches
Modell diese Reduzierung der mRNA-Menge zu erklären ist, daß die komplementäre Hybridbildung
zwischen der micRNA und der mRNA vorzeitige Terminierung der Transkription
oder Destabilisierung der mRNA verursacht. Alternativ kann die micRNA
die Initiierung der Transkription direkt verhindern oder die Elongation
der mRNA in einer Weise, ähnlich
wie für
die Funktion der kleinen komplementären RNA-Spezies bei der ColEl-Replikation
beschrieben zum Stillstand bringen, siehe Tomizawa et al., The importance
of RNA secondary structure in ColE1 primer formation, Cell 31 (1982),
575-583.
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Das mic-System dieser Erfindung bietet
große
Anwendungsmöglichkeiten
sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen Zellen, ständig, oder
nur bei Induzierung die Expression verschiedener toxischer oder
schädlicher
Gene wie Resistenzgene gegen Chemikalien, Oncogene, Phagen- oder
Virengene und die Expression anderer Gene zu blockieren.
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Bei der Entwicklung und Darstellung
der hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren wurden die folgenden
Materialien und Verfahren verwendet.
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Stamm und Medium
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E.coli JA221 (hsdr,leuB6,lacY,thi,recA,ΔtrpE5)F'(lacIq,pro-AB,lacZYA) wurde
in allen Versuchen verwendet. Dieser Stamm wurde in M9 Medium gezüchtet (J.H.
Miller, Experiments in Molecular Genetics; Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, New York (1972)), das, wenn nicht anders angegeben,
mit 0,4% Glucose, 2 μg/ml
Thiamin, je 40 μg/ml
Leucin und Tryptophan, und 50 μg/ml
Ampicillin ergänzt
wurde.
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Materialien
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Restriktionsenzyme wurden entweder
von Bethesda Research Laboratories oder von New England Biolabs
erworben. T4 DNA Ligase und E.coli-DNA-Polymerase I (großes Fragment)
wurde von Bethesda Research Laboratories bezogen. Alle Enzyme wurden
gemäß den vom
Hersteller gelieferten Instruktionen verwendet. XbaI-Linker (CTCTAGAG)
wurden von New England Biolabs erworben.
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Behandlung von
DNA
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Die Plasmide pJDC402, pJDC412 und
pJDC422 wurden wie hier beschrieben und in 6 gezeigt konstruiert.
Die Plasmide pJDC413 und pJDC414 wurden konstruiert durch Isolieren
des 80 by langen AluI-Fragmentes, das die Aminosäurereste 3 bis 29 des Prolipoproteins
codiert, aus dem lpp-Gen im Falle des Plasmids pJDC413 und des 58
by langen AluI-Fragmentes, das die Aminosäurereste 43 bis 63 des Prolipoproteins
codiert, im Falle des Plasmids pJDC414. Die Fragmente wurden mit
glatten Enden in pJDC402, das zuerst mit XbaI gespalten und nachfolgend
mit DNA-Polymerase I (großes
Fragment) behandelt wurde, ligiert. Die Isolierung der zur Konstruktion
von mic(ompC) geeigneten ompC-Fragmente umfaßte einen Subclonierungsschritt,
da keine geeigneten, nur einmal vorkommenden Restriktionsschnittstellen
zwischen dem ompC-Promotor und dem Strukturgen vorlagen. Zwei Abkömmlinge
des das ompC enthaltenden Plasmids pYM150, denen zwar das den ompC-Promotor
enthaltende 471 by lange XbaI-MnI-Fragment (pDR001 bzw. pDR002)
fehlte, die aber stattdessen eine XbaI-Schnittstelle aufwiesen,
wurden isoliert. Die einzige HglII-Schnittstelle in jedem dieser
Plasmide wurde mittels Behandlung mit DNA-Polymerase I (großes Fragment)
und Ligieren mit synthetischen XbaI-Linkern in XbaI-Schnittstellen
umgewandelt. Nach Spaltung mit XbaI wurden das 123 bp lange XbaI-Fragment
aus pDR001 und das 175 bp lange XbaI-Fragment aus pDR002 einzeln
isoliert und in die XbaI-Schnittstelle von pJDC402 cloniert, woraus
sich pAM308 bzw. pAM309 ergaben. pAM320 . enthält das HinfI-Fragment, das das
aus pAM308 isolierte, in die PvuII-Schnittstelle von pAM308 clonierte
mic(ompC)-Gen abdeckt. pAM321 wurde in ähnlicher Weise aus pAM309 konstruiert,
und enthält
ebenfalls zwei mic(ompC)-Gene.
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Die mic(ompA)-Plasmide pAM301, pAM307,
pAM313, pAM314 und pAM318 wurden in einer ähnlichen Art und Weise wie
für die
Konstruktion der mic(lpp)-Gene und der mic(ompC)-Gene beschrieben,
konstruiert. Um pAM319 zu konstruieren, wurde das HinfI-Fragment,
das das mic(ompA)-Gen enthielt, aus pAM307 isoliert und in die PvuII-Schnittstelle
von pAM307 inseriert. pAM315 wurde in der gleichen Weise wie pAM319
konstruiert, außer
daß es
zwei in die PvuII-Schnittstelle von pAM307 inserierte HinfI-Fragmente
enthält.
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Analyse der Synthese des äußeren Membranproteins
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sE.coli JA221/F'lacIq, die das
entsprechende Plasmid enthielten, wurden bis zu einem mittels eines Klett-Summerson
Colorimeter gemessenen Wertes von 30 gezüchtet. Bei diesem Wert wurde
IPTG bis zu einer Endkonzentration von 2mM zugegeben. Nach einer
zusätzlichen
einstündigen
Inkubation (Zellzahl ungefähr
einmal verdoppelt) wurden zu 1 ml der Kultur 50 μCi [35S]-Methionin
(Amersham, 1000 Ci/mMol) - gegeben. Das Gemisch wurde dann unter
Schütteln
eine Minute inkubiert, wonach das Markieren durch Zugabe von 1 ml
eiskalter Stoplösung
(20mM Natriumphosphat, pH 7,1, das 1% Formaldehyd und 1 mg/ml Methionin enthielt)
beendet. Die Zellen wurden einmal mit 10 mM Natriumphosphat, pH
7,1, ge waschen, in 1 ml desselben Puffers suspendiert, und mit einem
Heat Systems Ultrasonics Sonicator Modell W-220E mit einem Tassenhornadaptor
3 Minuten (in 30 Sekunden langen Pulsen) mit Ultraschall behandelt.
Nicht aufgebrochene Zellen wurden vor der Isolierung der äußeren Membran
durch Zentrifugation bei langsamer Geschwindigkeit entfernt. Die
cytoplasmatischen Membranen wurden mittels 30-minütiger Inkubation
bei Raumtemperatur in der Gegenwart von 0,5% Natriumlauroylsarcosin
solubilisiert und die Fraktion der äußeren Membran mittels zweistündiger Zentrifugation
bei 105.000xg ausgefällt.
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Lipoprotein und ompA wurden mittels
Tris-SDS-Polyacrylamidgelelectrophorese (SDS-PAGE) analysiert. Zur
Analyse der OmpC-Synthese wurden Harnstoff-SDS-Polyacrylamid-Gelelektorphorese
(Harnstoff-SDS-PAGE) verwendet. Die Proteine wurden in Probenpuffer
gelöst
und die Lösung
wurde vor Auftragen auf das Gel in einem kochenden Wasserbad 8 Minuten
inkubiert. Die Autoradiogramme der getrockneten Gele wurden direkt
mittels eines Shimazdu Densitometers abgetastet. Um die relativen
Mengen der betreffenden Bande zu bestimmen, wurde für jede Probe
das Verhältnis
des Bereichs des entsprechenden Peaks zu dem Bereich des Peaks eines
nicht betroffenen Proteins bestimmt.
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RNA-Analyse
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Die Zellen wurden gezüchtet und
mit [3H]-Uridin markiert, das Zellwachstum
anschließend
durch schnelles Abkühlen
der Kultur auf Eis höchstens
5 Minuten gestoppt. Die Zellen wurden mittels fünfminütiger Zentrifugation bei 8000
Upm gewonnen. Die RNA wurde unter Verwendung der folgenden Verfahren
isoliert. Die Zellen wurden schnell in heißem Lysis-Puffer (10mM Tris-HCl,
pH 8,0, 1 mM EDTA, 350 mM NaCl, 2% SDS und 7 M Harnstoff) resuspendiert
und eine Minute stark verwirbelt. Das Gemisch wurde sofort zweimal
mit Phenol : Chloroform (1 : 1) und zweimal mit Chloroform allein
extrahiert. Nach Zugabe von 1/10 des Volumens an Natriumacetat zu
dem Gemisch wurde durch Zugabe von 3 Volumen Ethanol die RNA ausgefällt. Das
Präzipitat
wurde anschließend
in TE-Puffer (10mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) gelöst. Bei
der Gelelektrophorese wurden gleiche Mengen an gezählten Zerfällen in
jeder Spur aufgetragen. Die RNA wurde auf einem 1,5%igen Agarosegel,
das 6% Formaldehyd enthielt, aufgetrennt. Der Laufpuffer war 20
mM MOPS (3-[N-morpholino]propansulfonsäure [Sigma]), 5mM Natriumacetat
und 1mM EDTA, pH 7,0.
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Die RNA wurde auf Nitrocellulosefilter übertragen.
Für die
mic(lpp)-RNA und lpp-mRNA spezifische M13-Hybridisierungssonden
wurde einzeln durch Clonierung des in 1-B gezeigten
112 by langen XbaI-Fragmentes in M13 mp9 in der geeigneten Orientierung
konstruiert. Eine für
die ompA-mRNA spezifische Sonde wurde mittels Insertion eines 1245
by langen XbaI-EcoRI-Fragmentes
(ursprünglich
ein EcoRV-PstI-Fragment) in M13 mp10 konstruiert, und die Sonden
wurden markiert.
