JP2694924B2 - 遺伝子発現を調節する方法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】細胞物質もしくは生物体の遺
伝物質の遺伝子発現は、該生物体の遺伝物質のｍＲＮＡ
と対になりそしてそれと結合することの出来る一つのＲ
ＮＡへの転写を行なうＤＮＡもしくは他の遺伝物質を細
胞物質もしくは生物体の遺伝物質の中へもしくはそれと
共に取り入れることによって調節されもしくは阻害され
る。一つの遺伝子の遺伝子発現もしくは調節は該遺伝子
の発現を調節もしくは阻害するために該遺伝子に関して
反対側の方向において一つのプロモーターの後に挿入さ
れるかもしくは位置される該遺伝子の一つのＤＮＡ断片
もしくは複製を発現することによって調節される。 【０００２】 【従来の技術】細胞物質もしくは生物体の遺伝物質の遺
伝子発現の調節もしくは調節は科学者の特別な注目を集
めそして特種な状況の下において、組換えＤＮＡおよび
その他の手法が用いられるようになった。例えば、１９
８３年４月２３日に刊行されたＰＣＴ特許出願ＷＯ８３
／０１４５１においては、生物体の一つの生物学的成分
に対するコードを行なうメッセンジャーリボヌクレイッ
クアシッド（ｍＲＮＡ）の一部と実質的に対をなす塩基
配列を有し、望ましくはホスホトリエステル型のオリゴ
ヌクレオチドを用いる一つの手法が開示されている。こ
のオリゴヌクレオチドは生物体の中へ導入され、そして
該オリゴヌクレオチドと該メッセンジャーリボヌクレオ
チドとが対をなす性質のために、該二つの成分は適当な
条件下において該メッセンジャーリボヌクレオチドによ
ってコードされている生物体の該生物学的成分の合成を
調節もしくは阻害するためにハイブリダイズされる。も
し該生物学的成分が該生物体の生活力に対して極めて重
要なものであれば、該オリゴヌクレオチドは抗生物質と
して作用することが出来るであろう。これに関連する生
物体における遺伝子発現の調節のための手法はＣｅｌ
ｌ、第３４巻、第６８３頁（１９８３年９月）に掲載さ
れている論文の中に記述されている。上記刊行物の開示
はこの中に取り入れられ、この開示の部分をなすもので
ある。上記したようにある遺伝子の発現は転写の水準に
調節されることが出来るということが知られている。転
写の調節は蛋白質因子によってネガチブ（抑制化）にも
ポジチブ（活性化）にも行われる。ある特定の蛋白質因
子が特定のｍＲＮＡの翻訳を調節することもまた知られ
ている。また上記したように、ＲＮＡは特定の遺伝子の
発現を調節することが明らかになり、そして高浸透圧モ
ル濃度の培地における大腸菌の培養にもとづいて、外層
膜蛋白質（ＯｍｐＦ蛋白質）に対する遺伝子の発現を阻
害する１７４個の塩基からなる小さいＲＮＡ転写が生成
されると云うことが報告されている。Ｐｒｏｃ Ｊａ
ｐ．Ａｃａｄ．第５９巻、第３３５〜３３８頁（１９８
３年）、「大腸菌Ｋ１２の中の小さなＲＮＡ転写（ｍｉ
ｃＲＮＡ）による遺伝子発現の調節」を参照。小さいＲ
ＮＡ転写（ｍｉｃＲＮＡ、即ち対になるＲＮＡを妨害す
るｍＲＮＡ）によるＯｍｐＦ蛋白質保護の阻害はシャイ
ン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列および開始コドン
を含む約８０個の塩基の領域にわたって該ｍｉｃＲＮＡ
と該ｏｍｐＦ ｍＲＮＡとの間にハイブリッドが形成さ
れることによるものと思われる。小さい対になるＲＮＡ
による同様な調節はまたＴｎ１０トランスポサーゼに対
して記述されている。Ｃｅｌｌ、第３４巻、第６８３〜
６９１頁（１９８３年）「ＩＳ１０互換の翻訳調節」を
参照。しかしながらこの場合、トランスポサーゼに対す
る遺伝子とｍｉｃＲＮＡに対立する遺伝子は例えば該転
写の５'−末端が対になるハイブリッドを形成すること
が出来るようにＤＮＡの同じセグメントを離れた反対側
の方向に転写される。該ハイブリッドは該トランスポサ
ーゼｍＲＮＡの翻訳を阻害するものと考えられている。
しかしながら、トランスポサーゼ位置は該ｏｍｐＦ遺伝
子と該ｍｉｃＲＮＡ遺伝子（ｍｉｃＦ）とが完全に切り
離されており、そして各々大腸菌染色体上の２１および
４７分に地図がかゝれるｏｍｐＦの位置と対照である。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、生物
体を組み立てている遺伝物質の遺伝子発現の調節のため
に有用な手法を提供することにある。 【０００４】本発明の他の目的は、該生物体を組み立て
ている遺伝物質の遺伝子発現に関して特殊な性質を有す
る形質転換された生物体を提供することにある。 【０００５】本発明の更に他の目的は、ＤＮＡもしくは
該ＤＮＡを含むプラスミドがその中へ導入されている該
遺伝物質の該ｍＲＮＡと相補的でありそして結合もしく
はハイブリダイズすることの出来る一つのＲＮＡを転写
する該ＤＮＡを含むプラスミドのようなＤＮＡもしくは
他の遺伝物質を提供することにある。 【０００６】本発明の目的をより具体的に述べると、本
発明は、遺伝子を有する細胞内に存在するときに、該遺
伝子によって生産されるＲＮＡ転写物の少なくとも一部
に相補的なポリヌクレオチド配列を生産し、該遺伝子に
よって生産される該ＲＮＡ転写物に相補的な該ポリヌク
レオチド配列が、該遺伝子の機能を調節する、非天然の
ポリヌクレオチド構成物を提供することにある。 【０００７】また、本発明は、遺伝子を有する細胞内に
存在するときに、該遺伝子の機能を調節するリボヌクレ
オチド配列を生産し、該構成物は、プロモーターセグメ
ントおよびＤＮＡセグメントを有し、該ＤＮＡセグメン
トの転写によって、該遺伝子から生産されるＲＮＡ転写
物の少なくとも一部に相補的な該リボヌクレオチド配列
を生産する、非天然のポリヌクレオチド構成物を提供す
ることにある。 【０００８】本発明のこれらおよび他の目的が如何に達
成されるかは付随する開示からみて、そしてそれに添付
される図面を参照して明らかになるであろう。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明の実施による細胞
物質もしくは生物体の遺伝子発現は、該生物体もしくは
細胞物質の該遺伝物質のｍＲＮＡと対になりそして結合
もしくはハイブリダイズすることの出来る一つのＲＮＡ
への転写を行なうＤＮＡもしくは他の遺伝物質を細胞物
質もしくは生物体の遺伝物質の中へもしくはそれと共に
取り入れることによって調節、阻害、および（または）
調節される。該ｍＲＮＡとの結合もしくはハイブリダイ
ズにもとづいてｍＲＮＡの翻訳は、例えば該ｍＲＮＡに
よってコードされる蛋白質物質のような生成物が生成さ
れないと云う結果によって妨げられる。例えば蛋白質の
ようなｍＲＮＡ翻訳生成物が生物体もしくは細胞物質の
成長にとって極めて重要な場合において、このように形
質転換され改変された生物体もしくは細胞物質は少なく
とも無能になる。 【００１０】本発明の実施により遺伝子の発現を調節す
るために設計された一つのｍｉｃシステムが組み立てら
れた。更に詳しく述べれば、本発明の実施により大腸菌
の中のいかなる特定の遺伝子の発現を調節するための人
工ｍｉｃシステムを組み立てることが出来る。 【００１１】更に本発明の実施により一つの遺伝子に対
する一つのｍｉｃＲＮＡシステムが該遺伝子からのＤＮ
Ａ小断片を一つのプロモーターの後で反対側の方位の中
へ挿入することによって組み立てられる。このようなシ
ステムはいかなる遺伝子の発現を明確に調節するための
これまでには知られていない方法を提供する。更に詳し
く述べれば、特に大腸菌において具体化されるのである
が、一つの誘導可能なプロモーターの調節下において該
ｍｉｃＤＮＡ断片を挿入することによって、不可欠な大
腸菌遺伝子の発現が調節されることが出来る。それ故に
本発明の実施により、このようにして作り出された誘導
される致死は必須とされる遺伝子の研究において有効な
道具であろう。 【００１２】これ以後に、本発明の実施により、人工ｍ
ｉｃシステムの組み立てと数種の大腸菌遺伝子を用いる
その機能の実証が記述される。本発明による該ｍｉｃシ
ステムは、特定の原核遺伝子の発現を調節するための有
効な方法である。したがって本発明は真核細胞における
生物学的に重要な遺伝子の同様な調節を成し遂げるため
の基礎を提供する。例えば、該ｍｉｃシステムは腫瘍遺
伝子およびウィルス遺伝子のような有害な遺伝子の発現
を妨害するために、そして有害なもしくは無害な他のい
かなる遺伝子の発現に実質的に影響を与えるために用い
られることが出来る。 【００１３】本発明の実施は、イースト，ウィルスを含
む原核および真核細胞もしくは微生物の両方に適用され
ることが出来、そして一般的には、発現される遺伝物質
を含む生物体に適用されることが出来る。 【００１４】したがって、遺伝子発現によって立証され
るように、遺伝的観点から本発明の実施においては、新
しい生物体が容易に生成される。更に、本発明の実施
は、正常に作用することもしくはその中へ特殊な性質を
与える能力をなくし、もしくは不可能にされたこのよう
な生物体を作るために、生物体等を組み立てている遺伝
物質の遺伝子発現を改変するための有力な道具または手
段を提供する。本発明の実施において用いられる該ＤＮ
Ａ物質は、例えば真核生物体の核の中に直接導入するこ
とにより、または原核生物体の場合では本発明の特殊な
ＤＮＡを含むプラスミドもしくは適当なベクターを介し
て処理もしくは影響されるべき生物体の中へ取り入れら
れることが出来る。 【００１５】 【発明の実施の形態】本発明の実施の更なる背景を介し
て、大腸菌の大きい外層膜蛋白質ＯｍｐＦおよびＯｍｐ
Ｃに対する遺伝子の発現は浸透圧により調節されること
が判明した。該ｏｍｐＣ位置は高浸透圧モル濃度の条件
下において二方向性に転写されることが見出され、そし
て約１７０個の塩基の上流の転写ＲＮＡがＯｍｐＦ蛋白
質の生成を阻害することが見出された。このＲＮＡ（ｍ
ｉｃＲＮＡ）はリボゾーム結合場所と前ＯｍｐＦ蛋白質
の最初の９個のアミノ酸残基のコードを行なう領域を含
む該ｏｍｐＦ ｍＲＮＡの５'−末端領域と対になる長
い鎖を有する。かくして、ｍｉｃＲＮＡはそれとハイブ
リダイズすることによってｏｍｐＦ ｍＲＮＡの翻訳を
阻害することが提案されている。この新規なメカニズム
は、ＯｍｐＦとＯｍｐＣ蛋白質の全量が大腸菌中におい
ていつも一定であると云う観察の説明をすることが出来
る。 【００１６】大腸菌の大きい外層膜蛋白質ＯｍｐＦおよ
びＯｍｐＣは小さい親水性の分子に対する受動的な拡散
孔として機能する不可欠な蛋白質である。これらマトリ
ックスリン蛋白質は各々大腸菌染色体上２１および４７
分に地図がかかれる構造遺伝子ｏｍｐＦおよびｏｍｐＣ
によってコード化される。バクテリア外層膜：生物発生
と機能（井上，エム（Inouye, M）による編集）第２５
５〜２９１頁中のリーブス，ピー．（Reeves, P.）（ジ
ョン ワィリーアンドサンズ（Joun Wiley andSons），
ニューヨーク，１９７９）を参照。これら遺伝子の発現
は培地の浸透圧モル濃度によって調節される。両方の蛋
白質の厳密な補償生成が存在し、培地の浸透圧モル濃度
が増大するとＯｍｐＦ蛋白質の生成が減少し、一方Ｏｍ
ｐＣ蛋白質の生成は増大し、その結果ＯｍｐＦプラスＯ
ｍｐＣ蛋白質の総量は一定である。該ｏｍｐＦおよびｏ
ｍｐＣ遺伝子のこの浸透圧調節は７４分に地図がかかれ
る他の結合されていない位置，ｏｍｐＢによって調節さ
れる。ホール，エム．エヌ．(Hall, M .N.）およびシル
ハビー，テー．ジェー．(Silhavy, T. J.），Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ． 第１４６巻第２３〜４３頁（１９８１
年）、およびホール，エム．エヌ．(Hall, M. N.）およ
びシルハビー，テー．ジェー．(Silhavy,T. J.），Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１５１巻第１〜１５頁（１９８１
年）を参照。該ｏｍｐＢ位置はｏｍｐＲおよびｅｎｖＺ
と呼ばれる二つの遺伝子を含んでいる。両方の遺伝子の
ＤＮＡ配列は決定され、そしてこれら遺伝子生成物は特
徴づけが行われている。ブルツェル，イー．テー．(Wur
tzel, E. T.）等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５７
巻，第１３６８５〜１３９１頁（１９８２年）および水
野，テー（Mizuno, T）等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
第２５７巻，第１３６９２〜１３６９８頁（１９８２
年）を参照。該ＥｎｖＺ蛋白質は一つの浸透圧センサー
としての役割をし、そして培地からの信号を該ＯｍｐＲ
蛋白質へ伝える膜受容体蛋白質と考えられている。該Ｏ
ｍｐＲ蛋白質はそれから該ｏｍｐＦおよびｏｍｐＣ遺伝
子の発現に対するポジティブな調節体としての役割をす
る。該ｏｍｐＦおよびｏｍｐＣ遺伝子は配列決定され、
そして広範囲な相同性がそれらのコードしている領域に
おいて見出されるが、一方これらのプロモーターの領域
においては非常に僅かな相同性しか存在しない。本発明
による相補的なＲＮＡを妨害するｍＲＮＡ（ｍｉｃＲＮ
Ａ）と呼ばれるＲＮＡの新しい種類によって仲介される
遺伝子発現の新規な調節メカニズムが発見され明らかに
されたのは該ｏｍｐＣ遺伝子の特徴づけの過程において
である。ＭｉｃＲＮＡは一つの独立した転写単位（該ｍ
ｉｃＦ遺伝子）から生成される。この遺伝子は該ｏｍｐ
Ｃ遺伝子の上流に直接に位置づけられるが、反対側の方
向に転写される。該１７４−塩基ｍｉｃＲＮＡはそれと
ハイブリダイズすることによって該ｏｍｐＦ ｍＲＮＡ
の翻訳を妨害する。ｍｉｃＲＮＡの生成はｏｍｐＣ ｍ
ＲＮＡの生成に比例すると考えられるので、この調節メ
カニズムはＯｍｐＦとＯｍｐＣ蛋白質の総量を一定に維
持するに極めて効果的な方法であると思われる。ｏｍｐＦ発現を抑制する一つのＤＮＡ断片 該ｏｍｐＣプロモーターを特徴づけしている間に、該ｏ
ｍｐＣプロモーターの上流に位置づけられている約３０
０ｂｐの一つのＤＮＡ断片は、ＯｍｐＦ+細胞がこのＤ
ＮＡ断片を有している多重コピープラスミドによって形
質転換される時に、ＯｍｐＦ蛋白質の生成を完全に阻害
することが判明した。この実験のためにプラスミドｐＭ
Ｙ１５０が原ｏｍｐＣクローンからｐＭＹ１１１のＨｐ
ａＩ部位をＨｂａＩ部位に変換し次いで第１図の第１図
ａ中に記載されるように１．１ｋｂ ＳａｌＩ断片を除
去することによって組み立てられた。水野，テー．（Mi
zuno, T.）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２５８
巻、第６９３２〜６９４０（１９８２）を参照。 【００１７】第１図においては、該ｏｍｐＣ遺伝子のサ
ブクローンの構造と該ｏｍｐＣプロモーター領域を担持
している種々のプラスミドの構造が示されている。 【００１８】（ａ）ｏｍｐＣ遺伝子のサブクローン化の
図式表示。ｐＢＲ３２２中の２．７Ｋｂ大腸菌染色体Ｄ
ＮＡを担持しているプラスミドｐＭＹ１１１は先に記述
された。該プラスミドＤＮＡの１μｇはＨｐａＩによっ
て分解され、そしてＸｂａＩリンカー（ＣＴＣＴＡＧＡ
Ｇ，１５０ｐ ｍｏｌｅ）の存在下で再結合された。か
くして、約４００ｂｐ ＨａｐＩ断片が除去され、そし
て唯一のＸｂａＩ部位が新らしく作られた（ｐＭＹ１０
０）。プラスミドｐＭＹ１００（ＤＮＡの１μｇ）は更
にＳａｌＩで分解されそして１．１ｋｂ ＳａｌＩ断片
（ｐＭＹ１５０）を除去するために再結合された。種々
のサイズのｏｍｐＣプロモーター断片を得るために、プ
ラスミドｐＭＹ１５０は唯一のＢｇｌＩＩ部位の開裂の
後Ｂａｌ３１ヌクレアーゼによって分解され（第１図ｂ
を参照）、続いて該プラスミドはＸｂａＩリンカーの存
在下に再結合された。このようにして組み立てられたプ
ラスミドｐＣＸ２８は第１図ｂに示されるように約３０
０−ｂｐ ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片を担持するクローン
の一つである。 【００１９】（ｂ）完全なｏｍｐＣ遺伝子を担持するプ
ラスミドｐＭＹ１５０の単純化された制限地図。ｐＢＲ
３２２中の１．８Ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ断片
（箱に入れられている領域）は５'−および３'−非コー
ド領域のみならず完全なｏｍｐＣコード領域をも含んで
いる。該ｏｍｐＣ遺伝子の転写は矢印に示される方向に
進行する。二方向矢印はプラスミドｐＣＸ２８に対する
削除されたおよその領域（約６００ｂｐ）を示してい
る。 【００２０】（ｃ）ａｍｐＣプロモーターおよびその上
流領域から誘導されたＤＮＡ断片に対する種々のβ−ガ
ラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子融合：プラスミド
Ｉ、５０７−ｂｐ ＸｂａＩ−ＲｓａＩ断片はｐＭＹ１
５０から単離され（一つのＲｓａＩ部位はＡＴＧコドン
の丁度下流に存在する）、そしてｌａｃＺ遺伝子を担持
しているプラスミドｐＩＮＩＩＩから誘導されるプラス
ミドｐＩＣＩＩＩのＸｂａＩ−ＳｍａＩ部位の間に挿入
された。該結合の間、一つのＨｉｎｄＩＩＩリンカーが
ＲｓａＩとＳｍａＩ結合部位の間に挿入された。該Ｘｂ
ａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片はこのようにして組み立てら
れたプラスミドから単離されそしてプラスミドｐＫＭ０
０５の中へ再挿入されて右側に示されている枠の中のｌ
ａｃＺ遺伝子融合を生じた。プラスミドｐＩＣＩＩＩと
ｐＫＭ００５の特色は先に記述された。約４３０−ｂｐ
ＭｓｐＩ−ＢａｍＨＩ断片を担持しているプラスミド
ＩＩとＩＶはクローンＩから単離され（一つのＢａｍＨ
Ｉ部位はプラスミドＩの中のβ−ガラクトシダーゼコー
ド配列に対するＡＴＧコドンの丁度下流に存在する）、
そしてＳ１ヌクレアーゼで処理されてブラントエンドを
生成した。両端にＸｂａＩリンカーを添加した後、この
ようにして得られたＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片は可能な二
つの方向においてプラスミドｐＫＭ００５のＸｂａＩ部
位に挿入された。プラスミドＩＩＩとＶ、約３００ｂｐ
ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片はプラスミドｐＣＸ２８から
単離され（第１図ａ）そして二つの可能な方向において
プラスミドｐＫＭ００５のＸｂａＩ部位に挿入された。
これらプラスミド（Ｉ−Ｖ）はｌａｃＺ欠損株ＳＢ４２
８８（Ｆ-ｒｅｃＡ ｔｈｉ−１ ｒｅｌＡ ｍａｌ２
４ｓｐｃ１２ ｓｕｐＥ−５０ ｐｒｏＢ ｌａｃ）の
中へ形質転換され、そしてこれらのβ−ガラクトシダー
ゼ活性はマッコンキープレート（Difco）上で試験され
た。結果はＬａｃＺ+もしくはＬａｃＺ-として示され
る。ＯｍｐＦ蛋白質の発現を阻害するこれらクローンの
能力はまたＭｉｃＦ+もしくはＭｉｃＦ-として示されて
る。 【００２１】得られたプラスミドｐＭＹ１５０（第１図
ｂ）はｏｍｐＣ遺伝子の完全なコード領域とｏｍｐＣプ
ロモーターとｏｍｐＣ ｍＲＮＡの５'−末端非翻訳領
域をコード化しているＤＮＡとを含んでいる上流配列の
約５００ｂｐを含んでいる。種々のサイズのｏｍｐＣプ
ロモーター断片を得るために、ｐＭＹ１５０が唯一のＢ
ｇｌＩＩ部位でＢａｌ３１ヌクレアーゼによって分解さ
れ、次いでＸｂａＩリンカーが添加された。この方法で
組み立てられたプラスミドはＳａｌＩ部位から最も遠い
ＸｂａＩ部位の位置のために種々なサイズを有するＸｂ
ａＩ断片を担持している。種々なＸｂａＩ断片がそれに
続いて一つのプロモーター断片がその特殊ＸｂａＩ部位
の右側の方向へ挿入される時のみｌａｃＺ遺伝子を発現
することが出来る一つのプロモーター−クローン化ベク
ター、ｐＫＭ００５へと移された。これらの実験は該ｏ
ｍｐＣ遺伝子の転写は上流ＸｂａＩ部位（原ＨｐａＩ部
位）から３９０から４４０ｂｐ下流の間に位置する部位
で開始することを明らかにした。驚ろくべきことには、
これらｐＫＭ００５誘導体によって形質転換された、た
った３００ｂｐの最短ＸｂａＩ断片、ＣＸ２８のクロー
ン（ｐＣＸ２８からのサブクローン化、第１図ａおよび
ｂ）を含む大腸菌はＯｍｐＦ蛋白質を生成する活性を失
なっていた。ＯｍｐＦ蛋白質は明らかに宿主細胞（ｏｍ
ｐＢ+ ｏｍｐＦ+ ｏｍｐＣ+）の中で生成されるが、
一方該ＣＸ２８断片のクローンを担持している同じ細胞
はＯｍｐＦ蛋白質を生成することが出来なかった。同様
な効果が例えば第１図ｃ中のプラスミドＩのようなより
長い断片のクローンを有している細胞で観察された。こ
のクローンにおいて、該ｌａｃＺ遺伝子はｏｍｐＣ遺伝
子の開始コドンの後に直接に融合され、その結果このプ
ラスミドを担持している細胞のＬａｃＺ+発現型を生じ
た。しかしながら８７ｂｐのＸｂａＩ−ＭｓｐＩ断片が
プラスミドＩから除去された時、得られたプラスミド
（第１図ｃ中のプラスミドＩＩ）を担持している該細胞
はＯｍｐＦ蛋白質を生成することが出来た。該ｏｍｐＦ
遺伝子の上流領域を含む４３０ｂｐの長さの同様なＤＮ
Ａ断片はＯｍｐＦおよびＯｍｐＣの両方の蛋白質の生成
を妨害しなかったことは注目されるべきである。 【００２２】ＣＸ２８とｏｍｐＦ遺伝子との間のＤＮＡ
配列相同 上記の結果は、該ｏｍｐＣプロモーターの上流に位置す
る約３００ｂｐの長さのＤＮＡの拡がりはｏｍｐＦ発現
を妨げることが出来ることを示す。このＤＮＡ断片（Ｃ
Ｘ２８）の機能を解明するために、この領域のＤＮＡ配
列が決定された。 【００２３】該プロモーター領域と該ｏｍｐＣ遺伝子の
上流とのヌクレオチド配列を第２図に示す。ｐＭＹ１１
１もしくはｐＭＹ１５０から調製された制限酵素処理し
たＤＮＡ断片は〔α−32Ｐ〕ｄＮＴＰおよびＤＮＡポリ
メラーゼＩ大断片（クレナウ断片）を用いて坂野等の方
法、ネイチャー（Nature）、第２８０巻、第２８８〜２
９４頁（１９７９年）、によってこれらの３'−末端に
ラベルされた。別々に末端ラベルされたＤＮＡ断片は第
２の制限酵素によって分解することにより得られた。Ｄ
ＮＡ配列は７Ｍ尿素中２０％，１０％および６％ポリア
クリルアミトゲルを用いてマキサム（Maxam）およびギ
ルバート（Gilbert）の方法：Methods inEnzymology
第６５巻、第４９９〜５６０頁（１９８１年）、によっ
て測定された。該ｏｍｐＣ遺伝子の開始コドンのみなら
ずＲＮＡポリメラーゼ認識部位（−３５領域）およびｏ
ｍｐＣとｍｉｃＦプロモーターに対するプリブノーボッ
クス（−１０領域）もまた箱に囲われている。転写開始
部位はｏｍｐＣおよびｍｉｃＦ遺伝子に対して地図を作
成するＳｌヌクレアーゼによって決定される。 第２図は該ｏｍｐＣ遺伝子のＸｂａＩ部位（もとはＨｐ
ａＩ）から開始コドン、ＡＴＧ、までの５００ｂｐのＤ
ＮＡ配列を示す。残基８８のＤＮＡ配列下流は先に測定
された。残基９９から１８０までの配列（第２図）はシ
ャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列、開始コド
ン、および前ＯｍｐＦ蛋白質（＋印が付けられた塩基は
該ｏｍｐＦ配列と相同である）の最初の９個のアミノ酸
残基に対するコドンとを含むｏｍｐＦ ｍＲＮＡの５'
−末端領域と７０％相同性を有していることが判明し
た。上記結果を説明するための考えられ得るモデルでは
３００−ｂｐ ＣＸ２８断片（第１図ｃ）がｏｍｐＣ遺
伝子の領域下流の方へ向けられ、その結果この領域から
のＲＮＡ転写は該ｏｍｐＦ ｍＲＮＡと対をなす配列を
有する転写単位を含む。このようにして該二個のＲＮＡ
間のハイブリダイズによりＯｍｐＦ蛋白質の生成を妨害
する。 【００２４】新らしい転写単位の存在 該ＣＸ２８断片がｏｍｐＣ遺伝子とは反対側の方向に配
置されている１つの独立した転写単位を含むかどうかを
決定するために、該ｌａｃＺ遺伝子がＣＸ２８断片の中
で二個の異なった部位で融合された、プラスミドＶにお
いて、該ＣＸ２８断片はプラスミドＩＩＩに関して反対
の方向に挿入された（第１図ｃ）。このクローンはβ−
ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ-）を生成しないけれど
も、ＯｍｐＦ蛋白質の生成の抑制においていまだ完全に
活性であった。融合結合がＭｓｐＩ部位のヌクレオチド
８８にシフトされる時（第２図、まだ第１図ｃを参
照）、新しく組み立てられたクローン（プラスミドＩ
Ｖ）はβ−ガラクトシダーゼを生成することが出来た。
しかしながら、このプラスミドはもはやＯｍｐＦ蛋白質
の生成を抑制することが出来なかった。 【００２５】このプラスミドはｌａｃＺとＣＸ２８配列
（残基３００から５００、第２図）の上流で付加ＤＮＡ
（約２００ｂｐ）を含んでいるけれども、これはプラス
ミドＶがＯｍｐＦ蛋白質生成の抑制において完全に活性
であるので、ＣＸ２８断片の機能に影響しない。これら
の結果は、該ｏｍｐＣ遺伝子プロモーターから独立して
いる該ＣＸ２８断片の中の転写単位が存在すること、お
よび該ＣＸ２８断片と該ｏｍｐＣ遺伝子が互いに相違す
る方向に転写されることを示している。プラスミドＩＶ
がβ−ガラクトシダーゼを生成することが出来そしてプ
ラスミドＩＶがそれを生成しないと云う事実は、該ＣＸ
２８転写単位が残基１および８８の間で終わることを示
唆している（第１図ｃ）。事実、非常に安定した幹およ
びループ構造がオリゴ−Ｔが後に続くヌクレオチド７０
と９２との間に形成され得る（第２図中文字ａを付した
矢印）。この構造は原核細胞の中のｐ−因子非依存性転
写終結部位の特性である。この構造に対する△Ｇ値はサ
ルサー，ダブリュー．（Salser, W.），コールドスプリ
ングハーバーシンポジウム，Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．第
１３巻第９８５〜１００２頁（１９７７年）、によって
−１２．５Ｋｃａｌであることが計算された。 【００２６】該ＣＸ２８転写に対する開始部位はＳｌ−
ヌクレアーゼマッピングによってヌクレオチド２３７に
位置される（第２図）。この結果は該ＣＸ２８ ＤＮＡ
断片が転写されて１７４ヌクレオチドの転写を生成する
ことを示すものである。このことは更にノーザーンブロ
ットハイブリダイゼーションによって証明された。プラ
スミドＩＩＩ（第１図ｃ）を担持する細胞から抽出され
たＲＮＡ調製物において、一つのＲＮＡ種が該ＣＸ２８
断片とハイブリダイズすることが明らかに観察され、そ
してそれは５Ｓ ＲＮＡより若干遅い速度で移行する。
調節細胞において、同じＲＮＡの少量のみが検出され
た。該ＲＮＡ（ＣＸ２８ ＲＮＡ）のサイズはゲル上で
約６Ｓであると見積もられ、それは配列（１７４塩基）
から見積もられるサイズと非常に良く一致する。 【００２７】ＣＸ２８ ＲＮＡの機能 前に指摘したように、該ＣＸ２８ ＤＮＡ断片はｏｍｐ
Ｆ遺伝子の一部分と広範囲にわたる相同性を有してい
る。かくして、ＣＸ２８ ＲＮＡの部分は該ｏｍｐＦ
ｍＲＮＡと対をなしており、そして第３図に示されるよ
うにｏｍｐＦ ＲＮＡと非常に安定したハイブリッドを
形成することが出来る。このハイブリッド形成に対する
△Ｇ値は−５５．５Ｋｃａｌであると計算された。リボ
ゾーム結合のためのシャイン−ダルガノ（Shine-Delgar
no）配列とコード領域からの２８個の塩基を含んでいる
ｏｍｐＦ ｍＲＮＡの５'−末端非翻訳領域の４４個の
塩基は、ハイブリッド形成に関与している。このハイブ
リッド構造はＣＸ２８ ＲＮＡの二個の安定した幹およ
びループ構造（一つは３'−末端ｐ−非依存性転写終結
シグナル（ループａ）に対し、もう１つは５'−末端
（ループｂ）に位置する）、によってサンドイッチされ
ている。ループａとｂに対する△Ｇ値は各々−１２．５
および−４．５Ｋｃａｌであると計算された。 【００２８】図面の第３図を参照すると、そこにはｍｉ
ｃＦとｏｍｐＦ ｍＲＮＡとの間のハイブリッド形成が
示されている。ｍｉｃＦ ＲＮＡの配列は第２図におい
て残基２３７から６４までの配列と一致している。該ｏ
ｍｐＦ ｍＲＮＡ配列は井之口、ケイ．（Inokuchi
K.）等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．第１０
巻、第６９５７〜６９６８頁（１９８２年）、から引用
された。第二次構造ａ、ｂおよびｃに対する△Ｇ値は各
々−１２．５，−４．５および＋２．９Ｋｃａｌである
と計算された。第３図には他のループ（ループｃ）が示
されている。しかしながらこのループはその△Ｇ値（＋
２．９Ｋｃａｌ）のために形成されそうにもない。ハイ
ブリッドの形成はｏｍｐＦ ｍＲＮＡの翻訳を妨げるよ
うに思われる。このことは何故にＣＸ２８ ＤＮＡ断片
を担持しているクローンがＯｍｐＦ蛋白質の生成を抑制
するかを説明するものであろう。かくしてＣＸ２８ Ｒ
ＮＡはｏｍｐＦに対するｍＲＮＡ-interfering complem
entary ＲＮＡ（ｏｍｐＦに対するｍｉｃＲＮＡ）と称
され、そして該遺伝子はｍｉｃＦと称される。ループａ
がｍｉｃＦ遺伝子をｌａｃＺ遺伝子と融合することによ
って削除される時、該ＭｉｃＦ機能は消滅される（プラ
スミドＩＶ．第１図ｃ）と云うことは注目されるべきで
ある。このことはｍｉｃＦ ＲＮＡの安定性のためであ
るが、さもなければＭｉｃＦ機能に対するループａの要
求のためであろう。 【００２９】該ｍｉｃＦ遺伝子がｏｍｐＣ遺伝子のよう
にｏｍｐＢ遺伝子座の支配下にあるかどうかを調べるこ
とは興味あることのように思われる。参考は第１表に作
られている。 【００３０】 【表１】 【００３１】種々のｏｍｐＢミュータント細胞、ＭＣ４
１００（Ｆ-ｌａｃＶ１６９，ａｒａＤ１３９，ｒｓｐ
Ｌ，ｔｈｉＡ，ｔｉｂＢ，ｒｅｌＡ：ワイルドタイ
プ）、ＭＨ１１６０〔ＭＣ４１００からのｏｍｐＢ１０
１（ｏｍｐＲ１）ミュータント〕ＭＨ７６０〔ＭＣ４１
００からのａｍｐＢ４２７（ｏｍｐＲ２）ミュータン
ト〕、ＭＨ１４６１〔ＭＣ４１００からのｔｐｏｌｌ
（ｅｎｖＺ）ミュータント〕が種々のプロモーター−ｌ
ａｃＺ遺伝子融合クローンによって形質転換された。細
胞は３７℃で１．２のクレット（Klett）単位で栄養ス
ープの１０ｍｌ中で培養された。該培地の１００μｌは
ミラー，エイチ・ジェー．（Miller, H. J.）の方法、E
xperiments of Molecular Genetics〔ミラー，エイチ．
ジェー．（Miller, H. J.）編集〕，コールドスプリン
グハーバーラボラトリー、ニューヨーク（１９７２年）
第３５２〜３５５頁、によってβ−ガラクトシダーゼ活
性測定のために用いられた。プラスミドｐＫ００４はｐ
ＫＭ００５から誘導され、そしてｐＫＭ００４はｌａｃ
Ｚ遺伝子に融合されているｌｐｐ（外層膜リポ蛋白質に
対する遺伝子）を含んでいる。プラスミドＩとＩＶは第
１図ｃに記載されている。プラスミドｐＯｍｐＦ Ｐ−
ＡｌはｏｍｐＦプロモーターの支配下においてｌａｃＺ
遺伝子を含んでいる。 【００３２】第１表に示されるように、ｍｉｃＦ支配下
のｌａｃＺ遺伝子（第１図ｃ中プラスミドＩＶ）はｏｍ
ｐＣプロモーター支配下のｌａｃＺ遺伝子（第１図ｃ中
のプラスミドＩ）と同様な方法でβ−ガラクトシダーゼ
を生成する。β−ガラクトシダーゼの高活性がワイルド
タイプとｅｎｖＺ-細胞の両方で見出されたが、ｏｍｐ
Ｒ１-およびｏｍｐＲ２-ミュータントでは低い活性しか
観察されなかった。一方、ｏｍｐＦプロモーターの支配
下のｌａｃＺ遺伝子はｏｍｐＲ１-細胞においては発現
されなかった。さらにコントロールとして用いられたリ
ポ蛋白質プロモーターの支配下のｌａｃＺ遺伝子はすべ
ての細胞において発現された。これらの結果は該ｍｉｃ
Ｆ遺伝子が該ｏｍｐＣ遺伝子と同様な方法においてｏ
ｍｐＢ遺伝子座によって調節されると云うことを示す。
該ｏｍｐＦプロモーターの支配下のｌａｃＺ遺伝子がｅ
ｎｖＺ-1（Ｏｍｐｃ+ ＯｍｐＦ-）細胞の中に構成的に
発現されていると云うことに注目することは興味のある
ことである。このことはこのｅｎｖＺ-細胞のＯｍｐＦ-
発現型がｍｉｃＲＮＡによるｏｍｐＦ ｍＲＮＡの翻訳
を阻害しているためであることを暗示する。 【００３３】ｍｉｃＦおよびｏｍｐＣ遺伝子のプロモー
ター ｍｉｃＦおよびｏｍｐＣ遺伝子の両方がｏｍｐＢ遺伝子
座によって調節されているように見えるので、これら遺
伝子のプロモーターは配列相同性を有するべきである。
相同性に対する調査のために、ｏｍｐＣ遺伝子に対する
転写開始部位はＳｌ−ヌクレアーゼマッピングによって
まず決定された。主な転写開始はＴ残基の４１０および
４１１位置で起る（第２図、また第４図を参照）。 【００３４】第４図においては、ｍｉｃＦとｏｍｐＣ遺
伝子の間の相同配列が示されている。ヌクレオチドの数
は第２図のものと一致する。箱の中の配列は二つの遺伝
子の間の相同配列を示す。二つの配列間の棒は同一の塩
基を示す。矢印は転写開始部位を示す。−１０と−３５
の領域はアンダーラインされている。 【００３５】かくして、ｍｉｃＦとｏｍｐＣ遺伝子に対
する−１０の領域はＡＡＴＡＡＴ（第２図のヌクレオチ
ド２５０から２４５）およびＧＡＧＡＡＴ（第２図のヌ
クレオチド４００から４０５）として各々割り当てられ
（第４図）、その両者はコンセンサス配列ＴＡＴＡＡＴ
と良好な相同性を示す。ｍｉｃＦとｏｍｐＣ遺伝子に対
するＲＮＡポリメラーゼ認識部位（−３５領域）はまた
ＴＡＡＧＣＡおよびＴＴＧＧＡＴとして各々割り当てら
れ（第４図）、その両者はコンセンサス配列、ＴＴＧＡ
ＣＡと５５％相同性を示す。しかしながら、６３ｂｐの
ｍｉｃＦプロモーター（ヌクレオチド３００から２３
８）とｏｍｐＣプロモーター（第２図のヌクレオチド３
０１〜４０９）との間には重要な配列相同性が見出され
ない。一方、相同配列は第４図に示されるように両方の
転写の５'−末端領域において見出される。４４個の塩
基から離れた２８個が相同であり（６４％相同性）、そ
してこれらの領域は多分ＯｍｐＲ蛋白質によって認識さ
れる部位である。これらの配列と相同である一つの配列
はまたｏｍｐＦ ｍＲＮＡの５'−末端非翻訳領域にお
いて見出されることに注目することは興味あることであ
る。ｍｉｃＦ遺伝子とｏｍｐＣ遺伝子とを精製されたＯ
ｍｐＲ蛋白質によって結合する実験が現在進められてい
る。 【００３６】上記のように、大腸菌中の遺伝子発現の調
節は転写のレベルで一般に支配される。ある遺伝子の発
現はこれらに特異的なリプレッサーによって抑制され、
これらに特異的なインデューサーによって活性化され
る。例えばｃＡＭＰ受容体蛋白質およびＯｍｐＲ蛋白質
のようなポジティブな蛋白質因子はまた転写のレベルで
遺伝子発現を調節することが知られている。他の転写調
節機構はアテニュエーションであり、他の化合物の種々
のアミノ酸の生合成に関与する機能の発現を調節するこ
とにおいて重要な役割を果している。コルター，アー
ル．（Kolter, R.）およびヤノフスキー，シー．（Yano
fsky, C.）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．第１６巻第
１１３〜１３４頁（１９８２年）を参照。 【００３７】加うるに、ある種の蛋白質は翻訳のレベル
で遺伝子発現を調節することが示された。その結果はこ
こに翻訳開始領域と相補的なＲＮＡ因子による翻訳のレ
ベルでバクテリアの遺伝子発現の調節を示す。ｍｉｃＲ
ＮＡによって仲介されるこの新規な調節機構は第５図に
示されている。 【００３８】第５図はｍｉｃＦ ＲＮＡの役割の可能な
モデルを示すものである。ＯｍｐＲ蛋白質は低浸透圧モ
ル濃度下においてｏｍｐＦ遺伝子と結合し、そしてＯｍ
ｐＦ蛋白質の生成を促進する。高浸透圧モル濃度下にお
いては、ＯｍｐＲ蛋白質はｍｉｃＦおよびｏｍｐＣ遺伝
子の両方に結合する。かくして生成されたｍｉｃＦＲＮ
ＡはｏｍｐＦ ｍＲＮＡとハイブリダイズしてその翻訳
を制止する。ｍｉｃＲＮＡが翻訳のレベルでｏｍｐＦ遺
伝子の発現を抑制する可能性はありえないとされてき
た。しかしながら、該ｏｍｐＦプロモーターと融合され
るｌａｃＺ遺伝子はｅｎｖＺ-細胞（ＯｍｐＣ+ Ｏｍｐ
Ｆ-：第１図）の中に発現されたのでこのことは殆んど
ありそうにないことになる。この場合は、ｌａｃＺ発現
は恐らくクローンから転写されたｌａｃＺ ｍＲＮＡが
ｍｉｃＲＮＡと安定したハイブリッドを形成することが
出来ないためであろう。更にもしｍｉｃＲＮＡがｏｍｐ
Ｆ遺伝子の無意味な鎖と結合することが出来るならば、
結合がＲＮＡポリメラーゼにもっと接近し得るｏｍｐＦ
遺伝子を作るであろうから、遺伝子発現を妨げるよりは
むしろ活性化させることの方がよりありそうなことであ
る。 【００３９】ｍｉｃＲＮＡによる調節は他の蛋白質生成
を妨げることなくして特異的な蛋白質の生成を妨げるの
に非常に効果的な方法であるように思われる。現在、ｍ
ｉｃＲＮＡとｏｍｐＣとの間の相対的比率は知られてい
ない（第１表のβ−ガラクトシダーゼ活性は、プロモー
ター領域が同じ様相で挿入されなかったので（第１図ｃ
を参照）、それらの正確なプロモーター活性を当然反映
してはいない）。 【００４０】しかしながら、ｍｉｃＲＮＡとｏｍｐＣが
対等に生成されると仮定することは理由のあることであ
る。それ故に、ＯｍｐＣ蛋白質が生成される時、ｍｉｃ
ＲＮＡが同様な方法で生成される。ｍｉｃＲＮＡはそれ
からＯｍｐＦ蛋白質を比例的に妨害して、その結果Ｏｍ
ｐＣプラスＯｍｐＦ蛋白質の総量は一定になる。 【００４１】リボゾーム結合部位と開始コドンヘのｍｉ
ｃＲＮＡの結合は特定のｍＲＮＡの翻訳を妨げるために
非常に効果的な方法である。同様なメカニズムがバクテ
リオアァージＴ７のミュータントの中の翻訳の妨害を説
明するために提供されている。ミュータントｍＲＮＡの
３'−末端の配列はそれ自身のリボゾーム結合部位とハ
イブリダイズして翻訳を妨げることを暗示した。斉藤，
エイチ．（Saito, H.）およびリチャードソン，シー．
シー．（Richardson, C. C.）、Ｃｅｌｌ 第２７巻、
第５３３〜５４２頁（１９８１年）を参照。ｍｉｃＲＮ
Ａ調節システムが大腸菌において、そして真核細胞を含
む他の生物体において一般的な調節現象であろうことは
理由のあることと思われる。一つの蛋白質の形成を非常
に急速に停止すること、もしくは一つの蛋白質の比率を
他のもので調節することは特に好ましいメカニズムであ
る。ＲＮＡ種は種々の細胞活性の調節において付加的な
役割を有するであろう。事実、小さいＲＮＡ種はある種
のプラスミドのＤＮＡ複製の調節を行なうことが示され
ている。 【００４２】付随する開示において、本発明の実施によ
って遺伝子発現を調節するための有力な道具と手法が提
供される。本発明の実施による遺伝子発現は、その生来
の遺伝物質のみを所有するかまたは生来の遺伝物質の欠
失もしくは外来遺伝物質、即ち、該生物体もしくは細胞
物質の遺伝物質とを併なう転写にもとづいて該生物体も
しくは細胞物質の遺伝物質によって生成される一つのｍ
ＲＮＡと相補的でありそして（または）それとハイブリ
ダイズすることが出来、その結果該ＲＮＡの発現もしく
は翻訳が阻害もしくは妨害されるオリゴリボヌクレオチ
ドもしくはポリリボヌクレオチドＲＮＡを生成するＤＮ
Ａの付加によって遺伝的に改変せられた一つの生物体も
しくは細胞物質の遺伝物質に取り入れるかもしくはそれ
と結合することによって調節される。 【００４３】本発明の実施による生物体もしくは細胞物
質の遺伝子発現の調節は、形質転換された生物体もしく
は細胞物質の中で行われ、それにおいては、該生物体も
しくは細胞物質の遺伝物質を併なって該生物体もしくは
細胞物質の遺伝物質を併なう転写にもとづいて該生物体
もしくは細胞物質の遺伝物質によって生成された一つの
ｍＲＮＡと相補的かもしくはそれと結合もしくはハイブ
リダイズすることが出来、その結果該ｍＲＮＡの発現も
しくは翻訳が阻害もしくは妨害せられる一つのオリゴリ
ボヌクレオチドもしくはポリリボヌクレオチドＲＮＡを
生成するＤＮＡをその中に取り入れるかもしくはそれと
結合する。 【００４４】本発明の実施において、ＤＮＡ物質もしく
は分子を含む形質転換された生物体もしくは細胞物質に
おける転写にもとづいて該生物体もしくは細胞物質の遺
伝物質によって生成されるｍＲＮＡと相補的であり、そ
して（または）それと結合もしくはハイブリダイズする
ことの出来るオリゴリボヌクレオチドもしくはポリリボ
ヌクレオチドを生成するところのＤＮＡ物質もしくは分
子は、該生物体の遺伝物質に取り込まれもしくは結合さ
れ、その結果該生物体もしくは細胞物質を該ＤＮＡ物質
もしくはその分子自体と直接に形質転換させることによ
って、もしくは一つのプラスミドもしくはウィルスもし
くはウィルスベクターの中に該ＤＮＡ物質を取り込みそ
れから該生物体もしくは細胞物質を該プラスミドおよび
（または）ウィルスベクターで形質転換することによっ
て形質転換される。該ＤＮＡ物質もしくは分子は該生物
体もしくは細胞物質の遺伝物質を含む核の中に直接挿入
されるであろう。該生物体もしくは細胞物質の形質転換
をもたらす該ＤＮＡ物質もしくは分子は、該生物体を特
徴づける遺伝子または染色体ＤＮＡとの関連において該
生物体もしくは細胞物質の細胞質もしくは流動性内容物
の中へ生物体の膜を通して挿入されるであろう。簡便さ
と実際上のために望ましいことであるが、該ＤＮＡ物質
もしくは分子を該生物体もしくは細胞物質、例えば該生
物体の核もしくは細胞質の中に挿入して形質転換させる
ためにマイクロインジェクションが用いられる。それは
該ＤＮＡ物質もしくは分子を該生物体もしくは細胞物質
の遺伝物質に取り込まれるかそれと結合して該生物体も
しくは細胞物質を取り囲む膜を通して該ＤＮＡ物質もし
くは分子を移すことによって形質転換させるために通常
便利なものである。 【００４５】人工Ｍｉｃ遺伝子の組み立て 該ｍｉｃ遺伝子はＯｍｐＦ蛋白質の生成を妨げる一つの
１７４−塩基ＲＮＡを生成する。この小さなＲＮＡは二
つの幹およびループ構造（一つは３'−末端、もう一つ
は５'−末端）を有する。これらの構造は該ｍｉｃＲＮ
Ａの機能に対する重要な役割を果たすものと考えられる
ので、一つの誘導性の発現ベクターにクローン化される
大きい外層膜リポプロティンに対する遺伝子を用いる人
工ｍｉｃシステムの組み立てにこれらの特徴を用いるこ
とが試みられた。中村等「大腸菌のリポプロティン遺伝
子を用いた多方面の発現クローン化媒介物の構造」ＥＭ
ＢＯ．Ｊ．第１巻，第７７１〜７７５頁（１９８２年）
を参照。ｐＩＮベクターはリポ蛋白質プロモーターのｌ
ａｃpo下流を有する高発現ベクターであり、かくして一
つの挿入された遺伝子の高レベルの誘導可能な発現が出
来るようになる。ｐＩＮプロモーターはｌｐｐ遺伝子に
おいて、ｌｐｐｍＲＮＡのシャイン−ダルガノ（Shine-
Dalgarno）配列の直接上流の特殊ＸｂａＩ部位に融合さ
れた。得られたプラスミドはｐＹＭ１４０として示され
た。ｐＹＭ１４０の中のｌｐｐ遺伝子の発現がイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、一つの
ｌａｃ誘導体によって誘導される時、ｌｐｐ遺伝子から
誘導されるＲＮＡ転写は可能な幹およびループ構造
（５'−末端に）を有する。唯一のＸｂａＩ部位の直接
上流はその３'−末端でのもう一つの安定した幹および
ループ構造である。後者のループはｌｐｐ遺伝子のｐ−
非依存性転写終結シグナルから誘導される。一般的なｍ
ｉｃクローン化ベクター，ｐＪＤＣ４０２の組み立て
は、第６図に示されるように二つのループの間のｐＭＨ
Ｏ４４中のＤＮＡ断片を除去することによって達成され
る。終結部位の直接上流のＲｓａＩ部位は、ｐＹＭ１４
０の部分的分解に続いてＥｃｏＲＩリンカーを挿入する
ことによってＥｃｏＲＩ部位に移された。得られたプラ
スミド，ｐＭＨＯ４４はＥｃｏＲＩで部分的に分解さ
れ、続いてＸｂａＩで完全に分解された。線状ＤＮＡ断
片の一本鎖部分はＤＮＡポリメラーゼＩ（大きい断片）
によって充たされ、それからＴ４ＤＮＡリガーゼで処理
されて、その結果ＸｂａＩとＲｓａＩ部位の間に断片を
有しないプラスミド，ｐＪＤＣ４０２が形成された。こ
の方法の結果として、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩの両部位が
結合点で再生産された。かくして唯一のＸｂａＩ部位は
いかなるＤＮＡ断片に対する挿入部位としての役割を果
たし、そして人工ｍｉｃ遺伝子からのＲＮＡ転写は該ｍ
ｉｃＲＮＡと似た構造を有するＲＮＡを生成する。挿入
されるＤＮＡから誘導される部分は二つのループ構造
（その一つは５'そしてもう一つは３'−末端）によって
サンドイッチされる。 【００４６】以下に第６図および第７図のより詳細な説
明を行なう。ｐＪＤＣ４０２の組み立てにかかる第６図
に示されるように、制限部位は下記の通りに示される。
Ｘ，ＸｂａＩ；Ｐ，ＰｖｕＩＩ；Ｅ，ＥｃｏＲＩ．ｌｐ
ｐpおよびｌａｃpoは各々リポ蛋白質プロモーターおよ
びラクトースプロモーターオペレーターである。Ａｍｐ
rはアンピシリン耐性遺伝子である。交差平行線はリポ
蛋白質プロモーターを表わす。黒丸はラクトースプロモ
ーターオペレーターを表わす。斜線はリポ蛋白質シグナ
ル配列を表わし、そして黒棒はリポ蛋白質の成熟部分に
対するコード領域を表わす。白丸はｌｐｐ遺伝子から誘
導される転写終結領域を表わす。白枠はリポ蛋白質ｍＲ
ＮＡの５'非翻訳領域を表わす。 【００４７】ｍｉｃ（ｌｐｐ）ｐＪＤＣ４１２の組み立
てにかゝる第７図において、白矢印はプロモーターを表
わす。該ＰｖｕＩＩ部位はＸｂａＩリンカー（ＴＣＴＡ
ＧＡＧ）を挿入することによってＸｂａＩ部位に変換さ
れる。この断片はｐＪＤＣ４１２を形成する逆向き方向
においてｐＪＤＣ４０２の唯一のＸｂａＩ部位の中に挿
入された。ａおよびｂは各々ｌｐｐとｌａｃプロモータ
ーの位置で開始するｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡを示す。 【００４８】ｍｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子の組み立て このｍｉｃクローン化ベクター，ｐＪＤＣ４０２を用い
て、ｍｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子の誘導にもとづくリポ蛋白
質の合成を阻害するために大腸菌のｌｐｐ遺伝子に対す
るｍｉｃシステムを作ることがまず第一に試みられた。
この目的のために、リボゾーム結合のためのシャイン−
ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列を含むＤＮＡ断片とプ
ロリポ蛋白質の最初の数個のアミノ酸残基に対するコー
ド領域を先づ単離することが必要である。これを行なう
ために、プロリポ蛋白質シグナルペプチドのコード領域
の直後のＰｖｕＩＩ部位はこの位置にＸｂａＩリンカー
を挿入することによってＸｂａＩ部位に移された。得ら
れたプラスミドはそれからＸｂａＩで分解され、そして
１１２−ｂｐ ＸｂａＩ−ＸｂａＩ（元来ＰｖｕＩＩ−
ＸｂａＩ）断片は精製された。シャイン−ダルガノ（Sh
ine-Dalgarno）配列とプロリポ蛋白質のアミノ基末端か
らの最初の２９個のアミノ残基に対するコード領域を取
り囲むこの断片が精製された。この断片はそれから正常
ｌｐｐ遺伝子から反対の方向でｐＪＤＣ４０２唯一のＸ
ｂａＩ部位の中へ挿入された。得られたプラスミドはｐ
ＪＤＣ４１２として示され、ＩＰＴＧでの誘導にもとづ
いてｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡ，ｌｐｐｍＲＮＡと対にな
る一つのＲＮＡ転写を生成することが出来る。 【００４９】該ｍｉｃ発現ベクター，ｐＪＤＣ４０２の
もう一つの重要な特徴はｌｐｐプロモーターの直接上流
のＨｉｎｆＩ部位と転写終結部位の直接下流のもう一つ
のＨｉｎｆＩ部位とを含むことであることが指摘される
べきである。これら二つのＨｉｎｆＩ部位はベクターの
唯一のＰｖｕＩＩ部位の中に挿入されることが出来る完
全なｍｉｃ転写単位を含むＤＮＡ断片を除去するために
用いられることが出来る。このようにして、完全なｍｉ
ｃ遺伝子は単一プラスミド中に複製されることが出来
る。２つの同一なｍｉｃ遺伝子を含むプラスミドが、単
一のｍｉｃ遺伝子を含むプラスミドに比べて２倍のｍｉ
ｃＲＮＡを生成すると云うことが予想される。このプラ
スミドは二つのｍｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子を含んで組み立
てられｐＪＤＣ４２２として示された。 【００５０】ｍｉｃ遺伝子の発現 人工ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの効果を試験するために、
ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの２ｍＭＩＰＴＧによる誘発の
１時間後に細胞は〔35Ｓ〕−メチオニンで１分間パルス
ラベルされた。ベクター，ｐＪＤＣ４０２を有している
該細胞は放射線写真の濃度測定走査および標準化によっ
て定量されたのであるが、誘導体，ＩＰＴＧの不存在下
もしくは存在下のいづれにおいても同量のリポ蛋白質を
生成する。リポ蛋白質の生成はＩＰＴＧの不存在下でｐ
ＪＤＣ４１２を担持している細胞の場合の約２倍、そし
てＩＰＴＧの存在下では約１６倍減少した。ＩＰＴＧの
不存在下でのリポ蛋白質合成の減少は、ｍｉｃ（ｌｐ
ｐ）遺伝子の不完全な抑制のためであると考えられる。
ｍｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子が複製されたｐＪＤＣ４２２を
担持する細胞の場合では、リポ蛋白質生成がＩＰＴＧ不
存在下では４倍、ＩＰＴＧ存在下では３１倍減少され
る。これらの結果は、人工ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの生
成がリポ蛋白質生成を阻害していること、そして該阻害
が生成されるｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの量と比例するこ
とを明らかに示している。該ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡは
特異的にリポ蛋白質の生成を妨害していること、および
それはＯｍｐＣ蛋白質を除いては他のいかなる蛋白質の
生成をも妨害しないことは注目されるべきである。該ｍ
ｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子の誘導がＯｍｐＣプラスＯｍｐＦ
蛋白質の生成を減少すると云う事実は、以下に検討され
るようにｌｐｐとｏｍｐＣ遺伝子との間の通常ではない
相同性のためであることが判明した。 【００５１】ｍｉｃ阻害が惹起されるいくつかのメカニ
ズムがある。一つのメカニズムは、該ｍｉｃＲＮＡはリ
ボゾームがｍＲＮＡと結合することを阻止することであ
る。その他の可能なメカニズムは、ｍＲＮＡの不安定
化，転写の早過ぎる終結または転写の開始の阻害のため
に起こるｍＲＮＡのアテニュエーションを含む。該ｍｉ
ｃＲＮＡの阻害効果が単にアテニュエーションもしくは
転写開始のレベルであったならば、該ｍｉｃ効果は該リ
ポ蛋白質ｍＲＮＡの機能の半減期は１２分であると云う
事実のために、幾分かは延ばされることが予期せられる
であろう。それ故に、ＩＰＴＧによる誘導の後の種々な
時点においてｐＪＤＣ４１２を有しているパルスラベル
された大腸菌ＪＡ２２１／Ｆ'ｌａｃＩqによるｍｉｃ
（ｌｐｐ）ＲＮＡの誘導にもとづいて、いかに迅速にリ
ポ蛋白質生成が阻害されるかが測定された。リポ蛋白質
生成はＩＰＴＧ添加後５分以内で最大１６倍にまで阻害
された。この結果は、リポ蛋白質生成の阻害が最初はｍ
ｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡのｌｐｐｍＲＮＡに対する結合の
ためであり、該結合は結果としてｌｐｐｍＲＮＡの翻訳
の阻害および（または）ｍＲＮＡの不安定化を惹き起す
ことを示している。 【００５２】ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの存在下での１ｐ
ｐｍＲＮＡ生成 該ｍｉｃＦ遺伝子の発現が実質的に該ｏｍｐＦ ｍＲＮ
Ａの量を減少させるので、該ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡが
また該ｌｐｐｍＲＮＡのレベルに影響するかどうかを試
験することは興味のあることのように思われる。この目
的のために、該ｍｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子をＩＰＴＧで誘
導した１時間後に全細胞ＲＮＡが単離された。該ＲＮＡ
調製物はホルムアルデヒドアガロースゲル中での電気泳
動に続いてニトロセルロースペーパー上への移行を行な
った後に分析された。該ペーパーはそれから該ｍｉｃ
（ｌｐｐ）ＲＮＡもしくは該ｌｐｐｍＲＮＡに対して特
異的な一つのプローブによってハイブリダイズされた。
該ｏｍｐＡ ｍＲＮＡに対して特異的な一つのプローブ
もまた内部コントロールとして用いられた。ＩＰＴＧの
不存在下もしくは存在下において、ｐＪＤＣ４０２がも
はやｌｐｐｍＲＮＡの生成にいかなる相違も示さない。
これらの実験のための該プローブを作るために用いられ
た二重らせん構造のプライマーはｌａｃオペロンの一部
を含むと云う事実のために、該プローブは、例えばＪＤ
Ｃ４１２からのｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡおよびｐＪＤＣ
４０２の短い無意味な転写のようなｌａｃプロモーター
を含むいかなる転写ともハイブリダイズする。ｐＪＤＣ
４１２を有する細胞はＩＰＴＧの不存在下では該ｌｐｐ
ｍＲＮＡの減少された量を含み、ＩＰＴＧの存在下では
ｌｐｐｍＲＮＡの大巾に減少された量を含む。ｐＪＤＣ
４１２を宿している細胞中のＩＰＴＧの不存在および存
在下において該ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの生成が示され
た。それ故に、ＩＰＴＧの不存在下においても、該ｍｉ
ｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの可成りの量が生成され、そしてそ
れは以前に観察されたリポ蛋白質生成の結果と一致して
いる。該ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの誘導によってｌｐｐ
ｍＲＮＡが消滅すると云う事実は、該ｍｉｃＲＮＡの作
用のメカニズムが単に翻訳のレベルにとどまらないこと
を示している。試験はことなったサイズの二つのｍｉｃ
（ｌｐｐ）ＲＮＡが存在することを示した。これら転写
のサイズは２８１から１９７個の塩基であると決定さ
れ、そしてそれはリポ蛋白質プロモーター（大きい方の
ＲＮＡ）での開始およびｌａｃプロモーター（小さい方
のＲＮＡ）で開始する転写と一致する。 【００５３】ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子によるＯｍｐＣ
生成の阻害 人工的に組み立てられるｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子によ
ってＯｍｐＣ合成の殆んど完全な阻害を達成することが
また可能であった。二つのｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子を
担持する第１次構造（ｐＡＭ３２０）は該ｏｍｐＣ ｍ
ＲＮＡのリーダー領域の２０個のヌクレオチドおよびコ
ード領域の１００個のヌクレオチドと対になる一つのＲ
ＮＡ分子のもとになる。このことはｏｍｐＣ構造遺伝子
中の唯一のＢｇｌＩＩ部位およびＡＴＧ開始コドンの上
流の２０個のヌクレオチドをＸｂａＩ部位に移すことに
よって達成された。得られた１２８−ｂｐ ＸｂａＩ断
片はそれから該ＯｍｐＣ遺伝子とは逆の方向のｐＪＤＣ
４０２の中へ挿入され、そして該ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺
伝子の第２コピーは、ｐＪＤＣ４２２組み立てに対して
記述されたと同様な方法で導かれた。得られたプラスミ
ド（ｐＡＭ３２０）は第１のものと反対側の方向に挿入
される第２ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子を有する。第２ｍ
ｉｃ遺伝子の配位を逆にすることはプラスミドの発現も
しくは安定性を変化させなかった。第２次構造ｐＡＭ３
２１，はｍｉｃＲＮＡとｏｍｐＣ ｍＲＮＡとの間の相
補性を拡大して、ｐＡＭ３２０の場合よりも長いリーダ
ー配列、２０個の代りに７２個のヌクレオチドのリーダ
ー領域を含むように設計されたものである。このプラス
ミドは、ＸｂａＩ部位に移されたＭｎｌＩ部位にｏｍｐ
Ｃ開始コドンの上流７２個のヌクレオチドｂｐが位置せ
られたことを除いては、ｐＡＭ３２０に対して記述され
たと同様に組み立てられた。 【００５４】ｍｉｃクローンベクターｐＪＤＣ４０２，
ｐＡＭ３２０およびｐＡＭ３２１を有している大腸菌Ｊ
Ａ２２１／Ｆ'ｌａｃＩqから単離された外層膜蛋白質の
クマーシー ブリリアント ブルー（Commassie Brilli
ant B1ue）染色ゲルパターンが得られた。ＩＰＴＧの添
加の効果が、β−ガラクトシダーゼの出現によって明ら
かにみられた。ｐＡＭ３２０からのｍｉｃ（ｏｍｐＣ）
ＲＮＡの誘導はｐＪＤＣ４０２と比較して、ＯｍｐＣ生
成における実質的な減少（約５倍）を惹起こした。ｐＡ
Ｍ３２１からの長い方のｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡの誘
導はＯｍｐＣの合成をよりドラマチックに減少した（ｐ
ＪＤＣ４０２と比較して約２０倍）。ＯｍｐＣ生成はそ
れらがＩＰＴＧでの１時間誘導の後１分でパルス−ラベ
ルされた時、ｐＡＭ３２１を有する細胞において殆ど検
出されなかった。同様な実験においてＯｍｐＣ合成は、
ｐＡＭ３２０を有する細胞中のｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝
子がＩＰＴＧで誘導された時約７倍減少した。ＯｍｐＣ
発現の著しい減少はまたｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子の単
一コピーを含むプラスミドが誘導された時観察された。
また長い方のｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子はより大きな効
果を有していた。ｐＡＭ３２０によるｍｉｃ−媒介阻害
の増大された効率は該ｍｉｃＲＮＡ機能の効果がｍＲＮ
Ａの５'−末端と対になる拡がりと関連していることを
示すであろう。 【００５５】上記の該ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡのいず
れかの合成がＯｍｐＣ合成のみならずリポ蛋白質合成の
減少をも惹起すことに注目することは興味あることであ
った。リポ蛋白質生成における該ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）Ｒ
ＮＡのこの阻害効果は、第８図に示されるようにｌｐｐ
ｍＲＮＡ配列とｏｍｐＣ ｍＲＮＡとの間の予期せざる
相同性によるものであると思われる。この特徴は、何故
ｐＡＭ３２０とｐＡＭ３２１がリポ蛋白質生成に対する
ｍｉｃ効果を働かせているかを説明するものである。こ
のような説明は、ｐＪＤＣ４１２とｐＪＤＣ４２２から
のｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの誘導がＯｍｐＣ蛋白質の合
成を減少する筈であることを予言し、そしてこのことは
その場合であることが見出された。 【００５６】第８図において、ｌｐｐｍＲＮＡ（最上
線）とｏｍｐＣ ｍＲＮＡ（最下線）との間の相同領域
が示されている。棒は同一の塩基を結んでいる。両方の
ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡはこの相同領域を横断してハ
イブリダイズする能力を有する。該シャイン−ダルガノ
（Shine-Dalgarno）配列（Ｓ．Ｄ）とＡＵＧ開始コドン
は箱で囲われる。 【００５７】ｍｉｃ（ｏｍｐＡ）ＲＮＡによるＯｍｐＡ
生成の阻害 いかなる成分がｍｉｃＲＮＡの効果に寄与するかを測定
する努力において、いくつかのｍｉｃ遺伝子が該ｏｍｐ
Ａ遺伝子から組み立てられた。該ｏｍｐＡ ｍＲＮＡの
リーダー領域とコード領域が広範囲にわたって特徴づけ
られていたので、該ｏｍｐＡ遺伝子はこのことのために
選択された。５個のＤＮＡ断片（第９図のＩからＶを参
照）は、ｍｉｃ（ｏｍｐＡ）ＲＮＡの生成を促進する方
向でｐＪＤＣ４０２のＸｂａＩ部位の中へ個別的にクロ
ーン化された。結果として得られた断片Ｉ−Ｖを含むｍ
ｉｃ（ｏｍｐＡ）プラスミドは、各々ｐＡＭ３０１，ｐ
ＡＭ３０７，ｐＡＭ３１３，ｐＡＭ３１４，およびｐＡ
Ｍ３１８として示された。各々のプラスミドは記述され
たｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子の唯一つのコピーを含む。 【００５８】第９図において、最上線は大腸菌ｏｍｐＡ
遺伝子の構造を示す。矢印はプロモーターを表わし、白
色棒は該ｏｍｐＡ ｍＲＮＡの５'−リーダー領域をコ
ード化する領域を表わす。斜線を付した棒および影を付
けた棒は各々シグナル配列と成熟したＯｍｐＡ蛋白質と
をコード化するｏｍｐＡ遺伝子の部分を表わす。制限断
片Ｉ（ＨｐｈＩ−ＨｐａＩ）は、ｍｉｃ（ｌｐｐ）に関
する第７図において略図がかゝれているように、こゝに
記されたところから反対側の方向においてｐＪＤＣ４０
２のＸｂａＩ部位の中に挿入されて（第６図を参照）、
プラスミドｐＡＭ３０１を作る。他のｍｉｃ（ｏｍｐ
Ａ）プラスミドは同様に、断片ＩＩ，ｐＡＭ３０７；断
片ＩＩＩ，ｐＡＭ３１３；断片ＩＶ，ｐＡＭ３１４：断
片Ｖ，ｐＡＭ３１８から組み立てられた。シャイン−ダ
ルガノ（Shine-Dalgarno）配列（ＳＤ），ＡＴＧ開始コ
ドン（ＡＴＧ），および関連する制限部位の位置が示さ
れている。 【００５９】該ｍｉｃ（ｏｍｐＡ）プラスミドの各々を
含む大腸菌ＪＡ２２１／Ｆ'ｌａｃＩqは、ＩＰＴＧによ
る１時間前に前処理を行なうかまたは行なうことなくし
て〔35Ｓ〕−メチオニンで１分間パルス−ラベルされ
た。これらの培地から単離された外層膜蛋白質の電気泳
動パターンが得られた。放射線写真は５個のｍｉｃ（ｏ
ｍｐＡ）遺伝子の各々がＯｍｐＡ合成を阻害することが
出来ることを明らかにした。該ｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝
子は先に述べられたｍｉｃ（ｌｐｐ）およびｍｉｃ（ｏ
ｍｐＣ）遺伝子よりも小さい効果を有するものと思われ
るが、この問題はｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子投与量の増
加によって妨げられる。翻訳開始部位を取り囲む該ｏｍ
ｐＡ ｍＲＮＡの２５８個の塩基領域（第９図の断片
Ｉ）と相補的な一つのｍＲＮＡをコード化しているプラ
スミドｐＡＭ３０１は、約４５％までＯｍｐＡ合成を阻
害することが判明した。約５１％までの同様な阻害がｐ
ＡＭ３０７によって得られた。このプラスミドはｏｍｐ
Ａ構造遺伝子と一致するいかなるＤＮＡ配列をも含んで
いない断片ＩＩ（第９図を参照）を含む。ｐＡＭ３０７
による阻害は以前に述べられたｍｉｃ（ｏｍｐＣ）実験
がｍＲＮＡの５'−リーダー領域との増大された相補性
がｍｉｃＲＮＡ−媒介阻害においてより効果を有するこ
とを示したので驚くにはあたらない。一方、４５個の前
−ＯｍｐＡを介して４個のアミノ酸残基に対するコード
領域にわたる断片ＩｌＩ（第９図を参照）によって被覆
されているｏｍｐＡ構造遺伝子の部分とのみ対になる一
つのｍｉｃＲＮＡを生成するｐＡＭ３１３はまた約５４
％までＯｍｐＡ合成を阻害することが効果的に出来、こ
のことは機能を果すために蛋白質合成に対する開始部位
および（または）ターゲットｍＲＮＡの５'−リーダー
領域とハイブリダイズする必要がないことを示してい
る。このことはまたｍｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子を用いるこ
とが確認された。ｌｐｐｍＲＮＡのコード領域とのみ対
をなす二つのｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡはまたリポ蛋白質
生成を阻害することが判明した。アミノ酸残基３から２
９、およびプロリポ蛋白質の４３から６３の各々に対し
てコードを行なうｌｐｐ構造遺伝子断片から組み立てら
れたｐＪＤＣ４１３とｐＪＤＣ４１４におけるｍｉｃ
（ｌｐｐ）遺伝子の効果が観察された。しかしながらｐ
ＪＤＣ４１３とｐＪＤＣ４１４の両方がリポ蛋白質合成
のたった２倍の阻害しか示さず、このことは翻訳開始部
位を被覆している一つのＤＮＡ断片（それは１６倍阻害
を惹起する）が該ｍｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子の場合により
効果を有することを示している。 【００６０】断片ＩＶ（第９図を参照）は該ｏｍｐＡ
ｍＲＮＡの５'−リーダー領域とのみ対をなす１つのｍ
ｉｃＲＮＡの効果を試験するために選択された。結果と
して組み立てられたｐＡＭ３１４は、ＡＵＧ開始コドン
の上流６０個の塩基が位置するｏｍｐＡ ｍＲＮＡリー
ダー領域の６８−塩基区域と対になる１つのｍｉｃＲＮ
Ａを合成する。ｐＡＭ３１４はたった約１８％までしか
ＯｍｐＡ合成を阻害する非常に弱いｍｉｃ効果を示す。
断片ＩＩとＩＶ（第９図を参照）の間のｍｉｃ効果にお
ける重要な相違はリボゾーム、即ちシャイン−ダルガノ
（Shine-Dalgarno）配列および（または）コード領域と
相互作用するｍＲＮＡの領域の範囲での相補相互作用が
絶対的に必要とはされないながらも、効果的なｍｉｃ機
能のために非常に重要であることを明白に示している。
断片ＩからＶのｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子を短縮するこ
とはその能率にもたらす影響が少なく、各々４８％減少
に比して４５％であることに注目することはまた興味の
あることである。 【００６１】上記に検討したよりもより効果的にＯｍｐ
Ａ合成を阻害し得る一つのプラスミドを組み立てるため
に、プラスミドが２つ以上のｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子
を含んで組み立てられた。これらのプラスミド、ｐＡＭ
３０７とその誘導体ｐＡＭ３１９およびｐＡＭ３１５と
が比較せられた。前記のうちの後の２つのプラスミドは
各々ｐＡＭ３０７中にｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子の２つ
および３つのコピーを含んでいる。ｐＡＭ３０７は約４
７％までＯｍｐＡ合成を阻害したのであるが、ｐＡＭ３
１５とｐＡＭ３１９は各々６９％までＯｍｐＡ合成を阻
害した。 【００６２】上に提出された結果は明らかに本発明の人
工ｍｉｃシステムと手法とが目的とする１つの遺伝子の
発現を明確に調節するために用いることが出来ることを
はっきり示している。特に、ある特定の遺伝子に対する
誘導性のｍｉｃシステムは、ある遺伝子の機能を研究す
るために新規でかつ非常に効果的な方法である。もし該
遺伝子が不可欠のものであれば、条件付きの致死率は温
度感受性突然変異と幾分か同様にｍｉｃシステムの誘導
にもとづいて達成せられるであろう。しかしなから該ｍ
ｉｃシステムが特定の蛋白質それ自体の合成を妨害する
一方では、温度感受性突然変異はその合成を妨害するこ
となくして蛋白質の機能のみを妨害すると云うことは注
目されるべきである。 【００６３】本発明から、下記のことが明らかになっ
た。 【００６４】（ａ）１つの特定のｍＲＮＡと対になる１
つのＲＮＡ転写（ｍｉｃＲＮＡ）の生成はそのｍＲＮＡ
の発現を阻害する。 【００６５】（ｂ）１つのｍｉｃＲＮＡの生成は該ｍｉ
ｃＲＮＡと相補性を分け合うこれらの遺伝子のみについ
ての発現を妨害する。 【００６６】（ｃ）該ｍｉｃＲＮＡ生成の誘導はｍＲＮ
Ａの半減期よりもずっと速く特定の遺伝子の発現を妨害
する。 【００６７】（ｄ）該ｍｉｃＲＮＡはまた人工的に組み
立てられたｍｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子が本発明の中で発現
される時のみならず、天然のｍｉｃＦ遺伝子が発現され
る時にも見出されるように、細胞中の特定のｍＲＮＡの
量を減小する。 【００６８】（ｅ）遺伝子投与量によって明らかな影響
がある。ｍｉｃＲＮＡがより多く生成される程、ターゲ
ット遺伝子の発現がより効果的に妨害される。 【００６９】本発明の実施において、リボゾームと相互
作用を行なうことが知られているｍＲＮＡの領域と対に
なるｍｉｃＲＮＡが最とも効果を有するものと思われ
る。１つの例としてｌｐｐ遺伝子を用いると、シャイン
−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列およびｌｐｐｍＲＮ
Ａの翻訳開始部位にハイブリダイズ出来る１つのｍｉｃ
（ｌｐｐ）ＲＮＡはそれが出来ないものよりもより能率
的にリポ蛋白質合成を阻害するものと思われる。しかし
ながらｏｍｐＡ遺伝子、シャイン−ダルガノ（Shine-Da
lgarno）配列と翻訳開始部位の両者と対になるｍｉｃＲ
ＮＡに対しては、まさしくシャイン−ダルガノ（Shine-
Dalgarno）配列もしくは構造遺伝子のみが等しく効果的
であった。 【００７０】例えばｏｍｐＣおよびｌｐｐのようないく
らかの遺伝子に対して、翻訳開始部位を取り囲む遺伝子
の領域は特定の配列を含まず、そしてｍｉｃＲＮＡ誘導
は２つ以上の蛋白質の生成を阻害する結果となる。これ
らの場合において、遺伝子の他の領域はｍｉｃ遺伝子を
組み立てるために用いられるであろう。ｍｉｃＲＮＡの
長さはもう１つの考慮に入れられるべき変化因子であ
る。長い方のｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡはＯｍｐＣ生成
の阻害において短かい方のｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡよ
りも４倍効果を有した。該ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡに
よるリポ蛋白質発現の阻害は、リポ蛋白質ｍＲＮＡと対
になる２つのｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡの領域が同じで
あると云う事実にも拘らず、長い方のｍｉｃ（ｏｍｐ
Ｃ）ＲＮＡの領域によっては殆んど影響されなかったこ
とは注目されるべきである。このことはより高い特性が
長い方のｍｉｃＲＮＡを用いることによって達成される
ことを示している。該ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子と対比
して、長さはＯｍｐＡ生成のｍｉｃ（ｏｍｐＡ）ＲＮＡ
媒介阻害に対しての重要な因子であるとは思われなかっ
た。加うるに、該ｍｉｃＲＮＡの第２次構造はｍｉｃＲ
ＮＡ機能においてある重要な役割を果している可能性が
大である。 【００７１】ｍｉｃＲＮＡが特定の遺伝子の発現を阻害
するために機能するであろういくつかのメカニズムが存
在する。該ｍｉｃＲＮＡが最初に該ｍＲＮＡと結合する
ことによって作用し、それによって先に提示されたよう
にリボゾームとの相互作用を妨害すると云うことは最と
もありそうに思われる。この仮説は該ｍｉｃ（ｌｐｐ）
ＲＮＡがもし転写がｌｐｐ ｍＲＮＡの半減期のみにも
とづいて影響されると仮定した場合よりもずっと速くリ
ポ蛋白質の生成を阻害したと云う事実によって支持され
る。ｍｉｃＲＮＡがリポ蛋白質ｍＲＮＡの量の減少をい
かに惹き起こすかにてついて、この減少を説明するため
に考えられ得るモデルは、リボゾームがｍＲＮＡ全域を
横切っていない時に該ｍＲＮＡがより安定していないと
云うことである。ｍＲＮＡレベルにおいてのこの減少を
説明するための他の可能なモデルは、ｍｉｃＲＮＡとｍ
ＲＮＡとの間の相補ハイブリッド形成が、ｍＲＮＡの転
写の早過ぎる終結もしくは不安定化を惹き起すと云うこ
とである。それに代えて、該ｍｉｃＲＮＡは直接転写の
開始を阻害するか、もしくはＣｏｌＥｌ複製における小
さい相補ＲＮＡ種の機能に対して記述されたと同様な方
法でｍＲＮＡ伸長の中断を惹き起こす。富沢（Tomizaw
a）等、ＣｏｌＥｌプライマー形成におけるＲＮＡ第２
次構造の重要性、Ｃｅｌｌ 第３１巻、第５７５〜５８
３頁（１９８２年）を参照。 【００７２】本発明のｍｉｃシステムはその応用におい
ては、真核細胞のみならず原核細胞において、例えば薬
剤耐性遺伝子、腫瘍遺伝子、およびファージもしくはウ
ィルス遺伝子のような種々の有毒あるいは有害な遺伝子
の発現およびその他の遺伝子の発現を永久的に、もしく
は誘導に際して妨害するために大きな可能性を有する。 【００７３】 【実施例】ここに記述されるような本発明の実施の開発
と表示において、下記の材料と方法が用いられた。 【００７４】細胞と培地 大腸菌ＪＡ２２１（ｈｓｄｒ，ｌｅｕＢ６，ｌａｃＹ，
ｔｈｉ，ｒｅｃＡ，△ｔｒｐＥ５）Ｆ'（ｌａｃＩq，ｐ
ｒｏＡＢ，ｌａｃＺＹＡ）がすべての実験において用い
られた。特に記述されていない場合には、この細胞はグ
ルコール０．４％，チアミン２μｇ／ｍｌ，ロイシンと
トリプトファンの各々の４０μｇ／ｍｌ，およびアンピ
シリン５０μｇ／ｍｌを補充されたＭ９培地〔ジェー．
エイチ．ミラー（J. H. Miller）、Experiments in Mol
ecular Genetics、コールドスプリングハーバーラボラ
トリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールド
スプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨ
ーク（New York）１９７２年〕の中で培養された。 【００７５】材料 制限酵素はベセスダ リサーチ ラボラトリー（Bethes
da Research Laboratories）またはニューイングランド
バイオラボラトリー（New England BioLabs）のいず
れかから購入された。Ｔ４ＤＮＡリガーゼと大腸菌ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（大きい断片）はベセスダ リサーチ
ラボラトリー（Bethesda Research Laboratories）か
ら購入された。すべての酵素は製造者によって提供され
た指示によって用いた。ＸｂａＩリンカー（ＣＴＣＴＡ
ＧＡＧ）はニューイングランドバイオラボラトリー（Ne
w England BioLabs）から購入した。 【００７６】ＤＮＡ操作 プラスミドＰＪＤＣ４０２，ｐＪＤＣ４１２，およびｐ
ＪＤＣ４２２はこゝおよび第９図に記載されたように組
み立てられた。プラスミドｐＪＤＣ４１３とｐＪＤＣ４
１４は、ｐＪＤＣ４１３に対するプロリポ蛋白質の３か
ら２９個のアミノ酸残基をコード化しているｌｐｐ遺伝
子，およびｐＪＤＣ４１４に対するプロリポ蛋白質の４
３から６３個のアミノ酸残基をコード化している５８−
ｂｐ ＡｌｕＩ断片から８０−ｂｐ ＡｌｕＩ断片を単
離することによって組み立てられた。該断片は先づＸｂ
ａＩで分解せられ、次いでＤＮＡポリメラーゼＩ（大き
い断片）によって処理されるｐＪＤＣ４０２の中へ結び
つけられているブラントエンドであった。 【００７７】ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）組み立てのために適当
なｏｍｐＣ断片の単離は、ｏｍｐＣプロモーターと構造
遺伝子との間の適当な特定の制限部位がないためにサブ
クローン化ステップを含んでいた。プラスミド，ｐＭＹ
ｌ５０，を含み、断片（ｐＤＲ００１とｐＤＲ００２の
各々）を含む４７１−ｂｐ ＸｂａＩ−ＭｎＩＩ ｏｍ
ｐＣプロモーターのいずれかを欠き、しかしその場所に
ＸｂａＩ部位を含むｏｍｐＣの２つの誘導体が単離され
た。これらプラスミドの各々の中の特定のＢｇｌＩＩ部
位はＤＮＡポリメラーゼＩ（大きい断片）による処理と
合成ＸｂａＩリンカーによる結び付けによってＸｂａＩ
部位に移された。ＸｂａＩ分解に続いて、ｐＤＲ００１
からの１２３−ｂｐ ＸｂａＩ断片とｐＤＲ００２から
の１７５−ｂｐ ＸｂａＩ断片とが個々に単離され、そ
してｐＪＤＣ４０２のＸｂａＩ部位の中ヘクローン化さ
れて、ｐＡＭ３０８とｐＡＭ３０９の各々を作成した。
ｐＡＭ３２０はｐＡＭ３０８のｐｖｕＩＩの中ヘクロー
ン化されているｐＡＭ３０８から単離されたｍｉｃ（ｏ
ｍｐＣ）遺伝子を被覆しているＨｉｎｆＩを含んでい
る。ｐＡＭ３２１は同様にｐＡＭ３０９から組み立てら
れて２つのｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子を含んでいる。 【００７８】ｍｉｃ（ｏｍｐＡ）プラスミドｐＡＭ３０
１，ｐＡＭ３０７，ｐＡＭ３１３，ｐＡＭ３１４，およ
びｐＡＭ３１８は、ｍｉｃ（ｌｐｐ）とｍｉｃ（ｏｍｐ
Ｃ）遺伝子の組み立てと類似した方法で述べられたよう
にして組み立てられた。ｐＡＭ３１９を組み立てるため
に、ｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子を含むＨｉｎｆＩ断片は
ｐＡＭ３０７から単離され、そしてｐＡＭ３０７のＰｖ
ｕＩＩ部位の中へ再び挿入された。ｐＡＭ３１５は、そ
れがｐＡＭ３０７のＰｒｕＩＩの中へ挿入されている２
つのＨｉｎｆＩを含んでいることを除いては、ｐＡＭ３
１９と同様な方法で組み立てられた。 【００７９】外層膜蛋白質生成の分析 適当なプラスミドを担持する大腸菌ＪＡ２２１／Ｆ'ｌ
ａｃＩqがクレット−サマーソン（Klett-Summerson）比
色計が３０を示す点まで培養され、その時点においてＩ
ＰＴＧは２ｍＭの最終濃度になるよう添加された。更に
１時間の培養の後（約２倍の時間）、〔35Ｓ〕−メチオ
ニンの５０μＣｉ〔アマーシャム（Amersham），１００
０Ｃｉ／ｍモル〕が１ｍｌの培地に添加された。該混合
物はそれから１分間振盪しつつ処置され、この時点でラ
ベル化は１ｍｌの氷冷停止溶液（１％ホルムアルデヒド
と１ｍｇ／ｍｌメチオニンを含んでいる２０ｍＭ燐酸ソ
ーダ〔ｐＨ７．１〕）の添加によって終結された。細胞
は１０ｍＭ燐酸ソーダ（ｐＨ７．１）によって１度洗浄
され、同じバッファーの１ｍｌ中に懸濁され、そしてカ
ップホーンアダプター付きのヒートシステム超音波発振
器モデルＷ−２２０Ｅによって３分間（３０秒パルス
で）超音波破壊された。破壊されなかった細胞は外層膜
を採集するに先立って低速遠心分離によって除去され
た。細胞質膜は０．５％ソジウムラウロイルサルコシネ
ートの存在下で室温で３０分の処置の間に可溶化され、
そして外層膜フラクションは１０５，０００Ｘｇで２時
間の遠心分離によって沈澱させた。 【００８０】リポ蛋白質とＯｍｐＡはトリス−ＳＤＳポ
リアクリルアミトゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に
よって分析した。ＯｍｐＣ生成を分析するために、尿素
−ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素−ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）が用いられた。蛋白質は試料バッファー
中に溶解され、そして該溶液はゲル塗布に先立って８分
間沸騰ウォータバス中で処置された。乾燥ゲルの放射線
写真は島津濃度計によって直接走査された。目的とする
バンドの相対量を測定するために、目的物のピークの面
積の１つの影響を受けていない蛋白質のピークに対する
比率が各々の試料に対して測定された。 【００８１】ＲＮＡ分析 細胞を培養しそして〔3Ｈ〕−ウリジンでラベルされ、
それから細胞の増殖を氷上で培地を５分間以内に急速に
冷却することによって停止した。該細胞は８０００ｒｐ
ｍ，５分間の遠心分離によって集められた。ＲＮＡは下
記の方法を用いて単離された。該細胞を１分間激しくボ
ーテックスして熱細胞溶解溶液（１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ〔ｐＨ８．０〕，１ｍＭ ＥＤＴＡ，３５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，２％ ＳＤＳおよび７Ｍ尿素）の中へ急速に再
分散した。該混合液は直ちにフェノール：クロロホルム
（１：１）で２回、クロロホルム単独で２回抽出され
た。１／１０容量の３Ｍ酢酸ソーダ（ｐＨ５．２）が該
混合液に添加され、そして３容量のエタノールが該ＲＮ
Ａを沈澱させるために添加された。該沈澱物はそれから
ＴＥバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ〔ｐＨ７．
５〕，１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に溶解された。ゲル電気泳
動のために、各々のレーンに、等しいカウントが負荷さ
れた。該ＲＮＡは６％ホルムアルデヒドを含む１．５％
アガロースゲル上で分離された。ランニングバッファー
は２０ｍＭ ＭＯＰＳ（３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパ
ンスルホン酸〔シグマ（Sigma）〕），５ｍＭ酢酸ソー
ダおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０であった。 【００８２】ＲＮＡはニトロセルロースペーパーに移さ
れた。ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡとｌｐｐ ｍＲＮＡに対
して特異的Ｍ１３ハイブリダイズプローブは第１図ｂに
示される１１２−ｂｐ ＸｂａＩ断片を適当な方向にお
いてＭ１３ｍｐ９の中ヘクローン化することによって個
々に組み立てられた。ｏｍｐＡ ｍＲＮＡに対して特異
的なプローブは、１２４５−ｂｐ ＸｂａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ断片（元来はＥｃｏＲＶ−ＰＳＴＩ断片）をＭ１３ｍ
ｐ１０の中へ挿入することによって組み立てられ、そし
て該プローブはラベルされた。
伝物質の遺伝子発現は、該生物体の遺伝物質のｍＲＮＡ
と対になりそしてそれと結合することの出来る一つのＲ
ＮＡへの転写を行なうＤＮＡもしくは他の遺伝物質を細
胞物質もしくは生物体の遺伝物質の中へもしくはそれと
共に取り入れることによって調節されもしくは阻害され
る。一つの遺伝子の遺伝子発現もしくは調節は該遺伝子
の発現を調節もしくは阻害するために該遺伝子に関して
反対側の方向において一つのプロモーターの後に挿入さ
れるかもしくは位置される該遺伝子の一つのＤＮＡ断片
もしくは複製を発現することによって調節される。 【０００２】 【従来の技術】細胞物質もしくは生物体の遺伝物質の遺
伝子発現の調節もしくは調節は科学者の特別な注目を集
めそして特種な状況の下において、組換えＤＮＡおよび
その他の手法が用いられるようになった。例えば、１９
８３年４月２３日に刊行されたＰＣＴ特許出願ＷＯ８３
／０１４５１においては、生物体の一つの生物学的成分
に対するコードを行なうメッセンジャーリボヌクレイッ
クアシッド（ｍＲＮＡ）の一部と実質的に対をなす塩基
配列を有し、望ましくはホスホトリエステル型のオリゴ
ヌクレオチドを用いる一つの手法が開示されている。こ
のオリゴヌクレオチドは生物体の中へ導入され、そして
該オリゴヌクレオチドと該メッセンジャーリボヌクレオ
チドとが対をなす性質のために、該二つの成分は適当な
条件下において該メッセンジャーリボヌクレオチドによ
ってコードされている生物体の該生物学的成分の合成を
調節もしくは阻害するためにハイブリダイズされる。も
し該生物学的成分が該生物体の生活力に対して極めて重
要なものであれば、該オリゴヌクレオチドは抗生物質と
して作用することが出来るであろう。これに関連する生
物体における遺伝子発現の調節のための手法はＣｅｌ
ｌ、第３４巻、第６８３頁（１９８３年９月）に掲載さ
れている論文の中に記述されている。上記刊行物の開示
はこの中に取り入れられ、この開示の部分をなすもので
ある。上記したようにある遺伝子の発現は転写の水準に
調節されることが出来るということが知られている。転
写の調節は蛋白質因子によってネガチブ（抑制化）にも
ポジチブ（活性化）にも行われる。ある特定の蛋白質因
子が特定のｍＲＮＡの翻訳を調節することもまた知られ
ている。また上記したように、ＲＮＡは特定の遺伝子の
発現を調節することが明らかになり、そして高浸透圧モ
ル濃度の培地における大腸菌の培養にもとづいて、外層
膜蛋白質（ＯｍｐＦ蛋白質）に対する遺伝子の発現を阻
害する１７４個の塩基からなる小さいＲＮＡ転写が生成
されると云うことが報告されている。Ｐｒｏｃ Ｊａ
ｐ．Ａｃａｄ．第５９巻、第３３５〜３３８頁（１９８
３年）、「大腸菌Ｋ１２の中の小さなＲＮＡ転写（ｍｉ
ｃＲＮＡ）による遺伝子発現の調節」を参照。小さいＲ
ＮＡ転写（ｍｉｃＲＮＡ、即ち対になるＲＮＡを妨害す
るｍＲＮＡ）によるＯｍｐＦ蛋白質保護の阻害はシャイ
ン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列および開始コドン
を含む約８０個の塩基の領域にわたって該ｍｉｃＲＮＡ
と該ｏｍｐＦ ｍＲＮＡとの間にハイブリッドが形成さ
れることによるものと思われる。小さい対になるＲＮＡ
による同様な調節はまたＴｎ１０トランスポサーゼに対
して記述されている。Ｃｅｌｌ、第３４巻、第６８３〜
６９１頁（１９８３年）「ＩＳ１０互換の翻訳調節」を
参照。しかしながらこの場合、トランスポサーゼに対す
る遺伝子とｍｉｃＲＮＡに対立する遺伝子は例えば該転
写の５'−末端が対になるハイブリッドを形成すること
が出来るようにＤＮＡの同じセグメントを離れた反対側
の方向に転写される。該ハイブリッドは該トランスポサ
ーゼｍＲＮＡの翻訳を阻害するものと考えられている。
しかしながら、トランスポサーゼ位置は該ｏｍｐＦ遺伝
子と該ｍｉｃＲＮＡ遺伝子（ｍｉｃＦ）とが完全に切り
離されており、そして各々大腸菌染色体上の２１および
４７分に地図がかゝれるｏｍｐＦの位置と対照である。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、生物
体を組み立てている遺伝物質の遺伝子発現の調節のため
に有用な手法を提供することにある。 【０００４】本発明の他の目的は、該生物体を組み立て
ている遺伝物質の遺伝子発現に関して特殊な性質を有す
る形質転換された生物体を提供することにある。 【０００５】本発明の更に他の目的は、ＤＮＡもしくは
該ＤＮＡを含むプラスミドがその中へ導入されている該
遺伝物質の該ｍＲＮＡと相補的でありそして結合もしく
はハイブリダイズすることの出来る一つのＲＮＡを転写
する該ＤＮＡを含むプラスミドのようなＤＮＡもしくは
他の遺伝物質を提供することにある。 【０００６】本発明の目的をより具体的に述べると、本
発明は、遺伝子を有する細胞内に存在するときに、該遺
伝子によって生産されるＲＮＡ転写物の少なくとも一部
に相補的なポリヌクレオチド配列を生産し、該遺伝子に
よって生産される該ＲＮＡ転写物に相補的な該ポリヌク
レオチド配列が、該遺伝子の機能を調節する、非天然の
ポリヌクレオチド構成物を提供することにある。 【０００７】また、本発明は、遺伝子を有する細胞内に
存在するときに、該遺伝子の機能を調節するリボヌクレ
オチド配列を生産し、該構成物は、プロモーターセグメ
ントおよびＤＮＡセグメントを有し、該ＤＮＡセグメン
トの転写によって、該遺伝子から生産されるＲＮＡ転写
物の少なくとも一部に相補的な該リボヌクレオチド配列
を生産する、非天然のポリヌクレオチド構成物を提供す
ることにある。 【０００８】本発明のこれらおよび他の目的が如何に達
成されるかは付随する開示からみて、そしてそれに添付
される図面を参照して明らかになるであろう。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明の実施による細胞
物質もしくは生物体の遺伝子発現は、該生物体もしくは
細胞物質の該遺伝物質のｍＲＮＡと対になりそして結合
もしくはハイブリダイズすることの出来る一つのＲＮＡ
への転写を行なうＤＮＡもしくは他の遺伝物質を細胞物
質もしくは生物体の遺伝物質の中へもしくはそれと共に
取り入れることによって調節、阻害、および（または）
調節される。該ｍＲＮＡとの結合もしくはハイブリダイ
ズにもとづいてｍＲＮＡの翻訳は、例えば該ｍＲＮＡに
よってコードされる蛋白質物質のような生成物が生成さ
れないと云う結果によって妨げられる。例えば蛋白質の
ようなｍＲＮＡ翻訳生成物が生物体もしくは細胞物質の
成長にとって極めて重要な場合において、このように形
質転換され改変された生物体もしくは細胞物質は少なく
とも無能になる。 【００１０】本発明の実施により遺伝子の発現を調節す
るために設計された一つのｍｉｃシステムが組み立てら
れた。更に詳しく述べれば、本発明の実施により大腸菌
の中のいかなる特定の遺伝子の発現を調節するための人
工ｍｉｃシステムを組み立てることが出来る。 【００１１】更に本発明の実施により一つの遺伝子に対
する一つのｍｉｃＲＮＡシステムが該遺伝子からのＤＮ
Ａ小断片を一つのプロモーターの後で反対側の方位の中
へ挿入することによって組み立てられる。このようなシ
ステムはいかなる遺伝子の発現を明確に調節するための
これまでには知られていない方法を提供する。更に詳し
く述べれば、特に大腸菌において具体化されるのである
が、一つの誘導可能なプロモーターの調節下において該
ｍｉｃＤＮＡ断片を挿入することによって、不可欠な大
腸菌遺伝子の発現が調節されることが出来る。それ故に
本発明の実施により、このようにして作り出された誘導
される致死は必須とされる遺伝子の研究において有効な
道具であろう。 【００１２】これ以後に、本発明の実施により、人工ｍ
ｉｃシステムの組み立てと数種の大腸菌遺伝子を用いる
その機能の実証が記述される。本発明による該ｍｉｃシ
ステムは、特定の原核遺伝子の発現を調節するための有
効な方法である。したがって本発明は真核細胞における
生物学的に重要な遺伝子の同様な調節を成し遂げるため
の基礎を提供する。例えば、該ｍｉｃシステムは腫瘍遺
伝子およびウィルス遺伝子のような有害な遺伝子の発現
を妨害するために、そして有害なもしくは無害な他のい
かなる遺伝子の発現に実質的に影響を与えるために用い
られることが出来る。 【００１３】本発明の実施は、イースト，ウィルスを含
む原核および真核細胞もしくは微生物の両方に適用され
ることが出来、そして一般的には、発現される遺伝物質
を含む生物体に適用されることが出来る。 【００１４】したがって、遺伝子発現によって立証され
るように、遺伝的観点から本発明の実施においては、新
しい生物体が容易に生成される。更に、本発明の実施
は、正常に作用することもしくはその中へ特殊な性質を
与える能力をなくし、もしくは不可能にされたこのよう
な生物体を作るために、生物体等を組み立てている遺伝
物質の遺伝子発現を改変するための有力な道具または手
段を提供する。本発明の実施において用いられる該ＤＮ
Ａ物質は、例えば真核生物体の核の中に直接導入するこ
とにより、または原核生物体の場合では本発明の特殊な
ＤＮＡを含むプラスミドもしくは適当なベクターを介し
て処理もしくは影響されるべき生物体の中へ取り入れら
れることが出来る。 【００１５】 【発明の実施の形態】本発明の実施の更なる背景を介し
て、大腸菌の大きい外層膜蛋白質ＯｍｐＦおよびＯｍｐ
Ｃに対する遺伝子の発現は浸透圧により調節されること
が判明した。該ｏｍｐＣ位置は高浸透圧モル濃度の条件
下において二方向性に転写されることが見出され、そし
て約１７０個の塩基の上流の転写ＲＮＡがＯｍｐＦ蛋白
質の生成を阻害することが見出された。このＲＮＡ（ｍ
ｉｃＲＮＡ）はリボゾーム結合場所と前ＯｍｐＦ蛋白質
の最初の９個のアミノ酸残基のコードを行なう領域を含
む該ｏｍｐＦ ｍＲＮＡの５'−末端領域と対になる長
い鎖を有する。かくして、ｍｉｃＲＮＡはそれとハイブ
リダイズすることによってｏｍｐＦ ｍＲＮＡの翻訳を
阻害することが提案されている。この新規なメカニズム
は、ＯｍｐＦとＯｍｐＣ蛋白質の全量が大腸菌中におい
ていつも一定であると云う観察の説明をすることが出来
る。 【００１６】大腸菌の大きい外層膜蛋白質ＯｍｐＦおよ
びＯｍｐＣは小さい親水性の分子に対する受動的な拡散
孔として機能する不可欠な蛋白質である。これらマトリ
ックスリン蛋白質は各々大腸菌染色体上２１および４７
分に地図がかかれる構造遺伝子ｏｍｐＦおよびｏｍｐＣ
によってコード化される。バクテリア外層膜：生物発生
と機能（井上，エム（Inouye, M）による編集）第２５
５〜２９１頁中のリーブス，ピー．（Reeves, P.）（ジ
ョン ワィリーアンドサンズ（Joun Wiley andSons），
ニューヨーク，１９７９）を参照。これら遺伝子の発現
は培地の浸透圧モル濃度によって調節される。両方の蛋
白質の厳密な補償生成が存在し、培地の浸透圧モル濃度
が増大するとＯｍｐＦ蛋白質の生成が減少し、一方Ｏｍ
ｐＣ蛋白質の生成は増大し、その結果ＯｍｐＦプラスＯ
ｍｐＣ蛋白質の総量は一定である。該ｏｍｐＦおよびｏ
ｍｐＣ遺伝子のこの浸透圧調節は７４分に地図がかかれ
る他の結合されていない位置，ｏｍｐＢによって調節さ
れる。ホール，エム．エヌ．(Hall, M .N.）およびシル
ハビー，テー．ジェー．(Silhavy, T. J.），Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ． 第１４６巻第２３〜４３頁（１９８１
年）、およびホール，エム．エヌ．(Hall, M. N.）およ
びシルハビー，テー．ジェー．(Silhavy,T. J.），Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１５１巻第１〜１５頁（１９８１
年）を参照。該ｏｍｐＢ位置はｏｍｐＲおよびｅｎｖＺ
と呼ばれる二つの遺伝子を含んでいる。両方の遺伝子の
ＤＮＡ配列は決定され、そしてこれら遺伝子生成物は特
徴づけが行われている。ブルツェル，イー．テー．(Wur
tzel, E. T.）等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５７
巻，第１３６８５〜１３９１頁（１９８２年）および水
野，テー（Mizuno, T）等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
第２５７巻，第１３６９２〜１３６９８頁（１９８２
年）を参照。該ＥｎｖＺ蛋白質は一つの浸透圧センサー
としての役割をし、そして培地からの信号を該ＯｍｐＲ
蛋白質へ伝える膜受容体蛋白質と考えられている。該Ｏ
ｍｐＲ蛋白質はそれから該ｏｍｐＦおよびｏｍｐＣ遺伝
子の発現に対するポジティブな調節体としての役割をす
る。該ｏｍｐＦおよびｏｍｐＣ遺伝子は配列決定され、
そして広範囲な相同性がそれらのコードしている領域に
おいて見出されるが、一方これらのプロモーターの領域
においては非常に僅かな相同性しか存在しない。本発明
による相補的なＲＮＡを妨害するｍＲＮＡ（ｍｉｃＲＮ
Ａ）と呼ばれるＲＮＡの新しい種類によって仲介される
遺伝子発現の新規な調節メカニズムが発見され明らかに
されたのは該ｏｍｐＣ遺伝子の特徴づけの過程において
である。ＭｉｃＲＮＡは一つの独立した転写単位（該ｍ
ｉｃＦ遺伝子）から生成される。この遺伝子は該ｏｍｐ
Ｃ遺伝子の上流に直接に位置づけられるが、反対側の方
向に転写される。該１７４−塩基ｍｉｃＲＮＡはそれと
ハイブリダイズすることによって該ｏｍｐＦ ｍＲＮＡ
の翻訳を妨害する。ｍｉｃＲＮＡの生成はｏｍｐＣ ｍ
ＲＮＡの生成に比例すると考えられるので、この調節メ
カニズムはＯｍｐＦとＯｍｐＣ蛋白質の総量を一定に維
持するに極めて効果的な方法であると思われる。ｏｍｐＦ発現を抑制する一つのＤＮＡ断片 該ｏｍｐＣプロモーターを特徴づけしている間に、該ｏ
ｍｐＣプロモーターの上流に位置づけられている約３０
０ｂｐの一つのＤＮＡ断片は、ＯｍｐＦ+細胞がこのＤ
ＮＡ断片を有している多重コピープラスミドによって形
質転換される時に、ＯｍｐＦ蛋白質の生成を完全に阻害
することが判明した。この実験のためにプラスミドｐＭ
Ｙ１５０が原ｏｍｐＣクローンからｐＭＹ１１１のＨｐ
ａＩ部位をＨｂａＩ部位に変換し次いで第１図の第１図
ａ中に記載されるように１．１ｋｂ ＳａｌＩ断片を除
去することによって組み立てられた。水野，テー．（Mi
zuno, T.）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２５８
巻、第６９３２〜６９４０（１９８２）を参照。 【００１７】第１図においては、該ｏｍｐＣ遺伝子のサ
ブクローンの構造と該ｏｍｐＣプロモーター領域を担持
している種々のプラスミドの構造が示されている。 【００１８】（ａ）ｏｍｐＣ遺伝子のサブクローン化の
図式表示。ｐＢＲ３２２中の２．７Ｋｂ大腸菌染色体Ｄ
ＮＡを担持しているプラスミドｐＭＹ１１１は先に記述
された。該プラスミドＤＮＡの１μｇはＨｐａＩによっ
て分解され、そしてＸｂａＩリンカー（ＣＴＣＴＡＧＡ
Ｇ，１５０ｐ ｍｏｌｅ）の存在下で再結合された。か
くして、約４００ｂｐ ＨａｐＩ断片が除去され、そし
て唯一のＸｂａＩ部位が新らしく作られた（ｐＭＹ１０
０）。プラスミドｐＭＹ１００（ＤＮＡの１μｇ）は更
にＳａｌＩで分解されそして１．１ｋｂ ＳａｌＩ断片
（ｐＭＹ１５０）を除去するために再結合された。種々
のサイズのｏｍｐＣプロモーター断片を得るために、プ
ラスミドｐＭＹ１５０は唯一のＢｇｌＩＩ部位の開裂の
後Ｂａｌ３１ヌクレアーゼによって分解され（第１図ｂ
を参照）、続いて該プラスミドはＸｂａＩリンカーの存
在下に再結合された。このようにして組み立てられたプ
ラスミドｐＣＸ２８は第１図ｂに示されるように約３０
０−ｂｐ ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片を担持するクローン
の一つである。 【００１９】（ｂ）完全なｏｍｐＣ遺伝子を担持するプ
ラスミドｐＭＹ１５０の単純化された制限地図。ｐＢＲ
３２２中の１．８Ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ断片
（箱に入れられている領域）は５'−および３'−非コー
ド領域のみならず完全なｏｍｐＣコード領域をも含んで
いる。該ｏｍｐＣ遺伝子の転写は矢印に示される方向に
進行する。二方向矢印はプラスミドｐＣＸ２８に対する
削除されたおよその領域（約６００ｂｐ）を示してい
る。 【００２０】（ｃ）ａｍｐＣプロモーターおよびその上
流領域から誘導されたＤＮＡ断片に対する種々のβ−ガ
ラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子融合：プラスミド
Ｉ、５０７−ｂｐ ＸｂａＩ−ＲｓａＩ断片はｐＭＹ１
５０から単離され（一つのＲｓａＩ部位はＡＴＧコドン
の丁度下流に存在する）、そしてｌａｃＺ遺伝子を担持
しているプラスミドｐＩＮＩＩＩから誘導されるプラス
ミドｐＩＣＩＩＩのＸｂａＩ−ＳｍａＩ部位の間に挿入
された。該結合の間、一つのＨｉｎｄＩＩＩリンカーが
ＲｓａＩとＳｍａＩ結合部位の間に挿入された。該Ｘｂ
ａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片はこのようにして組み立てら
れたプラスミドから単離されそしてプラスミドｐＫＭ０
０５の中へ再挿入されて右側に示されている枠の中のｌ
ａｃＺ遺伝子融合を生じた。プラスミドｐＩＣＩＩＩと
ｐＫＭ００５の特色は先に記述された。約４３０−ｂｐ
ＭｓｐＩ−ＢａｍＨＩ断片を担持しているプラスミド
ＩＩとＩＶはクローンＩから単離され（一つのＢａｍＨ
Ｉ部位はプラスミドＩの中のβ−ガラクトシダーゼコー
ド配列に対するＡＴＧコドンの丁度下流に存在する）、
そしてＳ１ヌクレアーゼで処理されてブラントエンドを
生成した。両端にＸｂａＩリンカーを添加した後、この
ようにして得られたＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片は可能な二
つの方向においてプラスミドｐＫＭ００５のＸｂａＩ部
位に挿入された。プラスミドＩＩＩとＶ、約３００ｂｐ
ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片はプラスミドｐＣＸ２８から
単離され（第１図ａ）そして二つの可能な方向において
プラスミドｐＫＭ００５のＸｂａＩ部位に挿入された。
これらプラスミド（Ｉ−Ｖ）はｌａｃＺ欠損株ＳＢ４２
８８（Ｆ-ｒｅｃＡ ｔｈｉ−１ ｒｅｌＡ ｍａｌ２
４ｓｐｃ１２ ｓｕｐＥ−５０ ｐｒｏＢ ｌａｃ）の
中へ形質転換され、そしてこれらのβ−ガラクトシダー
ゼ活性はマッコンキープレート（Difco）上で試験され
た。結果はＬａｃＺ+もしくはＬａｃＺ-として示され
る。ＯｍｐＦ蛋白質の発現を阻害するこれらクローンの
能力はまたＭｉｃＦ+もしくはＭｉｃＦ-として示されて
る。 【００２１】得られたプラスミドｐＭＹ１５０（第１図
ｂ）はｏｍｐＣ遺伝子の完全なコード領域とｏｍｐＣプ
ロモーターとｏｍｐＣ ｍＲＮＡの５'−末端非翻訳領
域をコード化しているＤＮＡとを含んでいる上流配列の
約５００ｂｐを含んでいる。種々のサイズのｏｍｐＣプ
ロモーター断片を得るために、ｐＭＹ１５０が唯一のＢ
ｇｌＩＩ部位でＢａｌ３１ヌクレアーゼによって分解さ
れ、次いでＸｂａＩリンカーが添加された。この方法で
組み立てられたプラスミドはＳａｌＩ部位から最も遠い
ＸｂａＩ部位の位置のために種々なサイズを有するＸｂ
ａＩ断片を担持している。種々なＸｂａＩ断片がそれに
続いて一つのプロモーター断片がその特殊ＸｂａＩ部位
の右側の方向へ挿入される時のみｌａｃＺ遺伝子を発現
することが出来る一つのプロモーター−クローン化ベク
ター、ｐＫＭ００５へと移された。これらの実験は該ｏ
ｍｐＣ遺伝子の転写は上流ＸｂａＩ部位（原ＨｐａＩ部
位）から３９０から４４０ｂｐ下流の間に位置する部位
で開始することを明らかにした。驚ろくべきことには、
これらｐＫＭ００５誘導体によって形質転換された、た
った３００ｂｐの最短ＸｂａＩ断片、ＣＸ２８のクロー
ン（ｐＣＸ２８からのサブクローン化、第１図ａおよび
ｂ）を含む大腸菌はＯｍｐＦ蛋白質を生成する活性を失
なっていた。ＯｍｐＦ蛋白質は明らかに宿主細胞（ｏｍ
ｐＢ+ ｏｍｐＦ+ ｏｍｐＣ+）の中で生成されるが、
一方該ＣＸ２８断片のクローンを担持している同じ細胞
はＯｍｐＦ蛋白質を生成することが出来なかった。同様
な効果が例えば第１図ｃ中のプラスミドＩのようなより
長い断片のクローンを有している細胞で観察された。こ
のクローンにおいて、該ｌａｃＺ遺伝子はｏｍｐＣ遺伝
子の開始コドンの後に直接に融合され、その結果このプ
ラスミドを担持している細胞のＬａｃＺ+発現型を生じ
た。しかしながら８７ｂｐのＸｂａＩ−ＭｓｐＩ断片が
プラスミドＩから除去された時、得られたプラスミド
（第１図ｃ中のプラスミドＩＩ）を担持している該細胞
はＯｍｐＦ蛋白質を生成することが出来た。該ｏｍｐＦ
遺伝子の上流領域を含む４３０ｂｐの長さの同様なＤＮ
Ａ断片はＯｍｐＦおよびＯｍｐＣの両方の蛋白質の生成
を妨害しなかったことは注目されるべきである。 【００２２】ＣＸ２８とｏｍｐＦ遺伝子との間のＤＮＡ
配列相同 上記の結果は、該ｏｍｐＣプロモーターの上流に位置す
る約３００ｂｐの長さのＤＮＡの拡がりはｏｍｐＦ発現
を妨げることが出来ることを示す。このＤＮＡ断片（Ｃ
Ｘ２８）の機能を解明するために、この領域のＤＮＡ配
列が決定された。 【００２３】該プロモーター領域と該ｏｍｐＣ遺伝子の
上流とのヌクレオチド配列を第２図に示す。ｐＭＹ１１
１もしくはｐＭＹ１５０から調製された制限酵素処理し
たＤＮＡ断片は〔α−32Ｐ〕ｄＮＴＰおよびＤＮＡポリ
メラーゼＩ大断片（クレナウ断片）を用いて坂野等の方
法、ネイチャー（Nature）、第２８０巻、第２８８〜２
９４頁（１９７９年）、によってこれらの３'−末端に
ラベルされた。別々に末端ラベルされたＤＮＡ断片は第
２の制限酵素によって分解することにより得られた。Ｄ
ＮＡ配列は７Ｍ尿素中２０％，１０％および６％ポリア
クリルアミトゲルを用いてマキサム（Maxam）およびギ
ルバート（Gilbert）の方法：Methods inEnzymology
第６５巻、第４９９〜５６０頁（１９８１年）、によっ
て測定された。該ｏｍｐＣ遺伝子の開始コドンのみなら
ずＲＮＡポリメラーゼ認識部位（−３５領域）およびｏ
ｍｐＣとｍｉｃＦプロモーターに対するプリブノーボッ
クス（−１０領域）もまた箱に囲われている。転写開始
部位はｏｍｐＣおよびｍｉｃＦ遺伝子に対して地図を作
成するＳｌヌクレアーゼによって決定される。 第２図は該ｏｍｐＣ遺伝子のＸｂａＩ部位（もとはＨｐ
ａＩ）から開始コドン、ＡＴＧ、までの５００ｂｐのＤ
ＮＡ配列を示す。残基８８のＤＮＡ配列下流は先に測定
された。残基９９から１８０までの配列（第２図）はシ
ャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列、開始コド
ン、および前ＯｍｐＦ蛋白質（＋印が付けられた塩基は
該ｏｍｐＦ配列と相同である）の最初の９個のアミノ酸
残基に対するコドンとを含むｏｍｐＦ ｍＲＮＡの５'
−末端領域と７０％相同性を有していることが判明し
た。上記結果を説明するための考えられ得るモデルでは
３００−ｂｐ ＣＸ２８断片（第１図ｃ）がｏｍｐＣ遺
伝子の領域下流の方へ向けられ、その結果この領域から
のＲＮＡ転写は該ｏｍｐＦ ｍＲＮＡと対をなす配列を
有する転写単位を含む。このようにして該二個のＲＮＡ
間のハイブリダイズによりＯｍｐＦ蛋白質の生成を妨害
する。 【００２４】新らしい転写単位の存在 該ＣＸ２８断片がｏｍｐＣ遺伝子とは反対側の方向に配
置されている１つの独立した転写単位を含むかどうかを
決定するために、該ｌａｃＺ遺伝子がＣＸ２８断片の中
で二個の異なった部位で融合された、プラスミドＶにお
いて、該ＣＸ２８断片はプラスミドＩＩＩに関して反対
の方向に挿入された（第１図ｃ）。このクローンはβ−
ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ-）を生成しないけれど
も、ＯｍｐＦ蛋白質の生成の抑制においていまだ完全に
活性であった。融合結合がＭｓｐＩ部位のヌクレオチド
８８にシフトされる時（第２図、まだ第１図ｃを参
照）、新しく組み立てられたクローン（プラスミドＩ
Ｖ）はβ−ガラクトシダーゼを生成することが出来た。
しかしながら、このプラスミドはもはやＯｍｐＦ蛋白質
の生成を抑制することが出来なかった。 【００２５】このプラスミドはｌａｃＺとＣＸ２８配列
（残基３００から５００、第２図）の上流で付加ＤＮＡ
（約２００ｂｐ）を含んでいるけれども、これはプラス
ミドＶがＯｍｐＦ蛋白質生成の抑制において完全に活性
であるので、ＣＸ２８断片の機能に影響しない。これら
の結果は、該ｏｍｐＣ遺伝子プロモーターから独立して
いる該ＣＸ２８断片の中の転写単位が存在すること、お
よび該ＣＸ２８断片と該ｏｍｐＣ遺伝子が互いに相違す
る方向に転写されることを示している。プラスミドＩＶ
がβ−ガラクトシダーゼを生成することが出来そしてプ
ラスミドＩＶがそれを生成しないと云う事実は、該ＣＸ
２８転写単位が残基１および８８の間で終わることを示
唆している（第１図ｃ）。事実、非常に安定した幹およ
びループ構造がオリゴ−Ｔが後に続くヌクレオチド７０
と９２との間に形成され得る（第２図中文字ａを付した
矢印）。この構造は原核細胞の中のｐ−因子非依存性転
写終結部位の特性である。この構造に対する△Ｇ値はサ
ルサー，ダブリュー．（Salser, W.），コールドスプリ
ングハーバーシンポジウム，Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．第
１３巻第９８５〜１００２頁（１９７７年）、によって
−１２．５Ｋｃａｌであることが計算された。 【００２６】該ＣＸ２８転写に対する開始部位はＳｌ−
ヌクレアーゼマッピングによってヌクレオチド２３７に
位置される（第２図）。この結果は該ＣＸ２８ ＤＮＡ
断片が転写されて１７４ヌクレオチドの転写を生成する
ことを示すものである。このことは更にノーザーンブロ
ットハイブリダイゼーションによって証明された。プラ
スミドＩＩＩ（第１図ｃ）を担持する細胞から抽出され
たＲＮＡ調製物において、一つのＲＮＡ種が該ＣＸ２８
断片とハイブリダイズすることが明らかに観察され、そ
してそれは５Ｓ ＲＮＡより若干遅い速度で移行する。
調節細胞において、同じＲＮＡの少量のみが検出され
た。該ＲＮＡ（ＣＸ２８ ＲＮＡ）のサイズはゲル上で
約６Ｓであると見積もられ、それは配列（１７４塩基）
から見積もられるサイズと非常に良く一致する。 【００２７】ＣＸ２８ ＲＮＡの機能 前に指摘したように、該ＣＸ２８ ＤＮＡ断片はｏｍｐ
Ｆ遺伝子の一部分と広範囲にわたる相同性を有してい
る。かくして、ＣＸ２８ ＲＮＡの部分は該ｏｍｐＦ
ｍＲＮＡと対をなしており、そして第３図に示されるよ
うにｏｍｐＦ ＲＮＡと非常に安定したハイブリッドを
形成することが出来る。このハイブリッド形成に対する
△Ｇ値は−５５．５Ｋｃａｌであると計算された。リボ
ゾーム結合のためのシャイン−ダルガノ（Shine-Delgar
no）配列とコード領域からの２８個の塩基を含んでいる
ｏｍｐＦ ｍＲＮＡの５'−末端非翻訳領域の４４個の
塩基は、ハイブリッド形成に関与している。このハイブ
リッド構造はＣＸ２８ ＲＮＡの二個の安定した幹およ
びループ構造（一つは３'−末端ｐ−非依存性転写終結
シグナル（ループａ）に対し、もう１つは５'−末端
（ループｂ）に位置する）、によってサンドイッチされ
ている。ループａとｂに対する△Ｇ値は各々−１２．５
および−４．５Ｋｃａｌであると計算された。 【００２８】図面の第３図を参照すると、そこにはｍｉ
ｃＦとｏｍｐＦ ｍＲＮＡとの間のハイブリッド形成が
示されている。ｍｉｃＦ ＲＮＡの配列は第２図におい
て残基２３７から６４までの配列と一致している。該ｏ
ｍｐＦ ｍＲＮＡ配列は井之口、ケイ．（Inokuchi
K.）等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．第１０
巻、第６９５７〜６９６８頁（１９８２年）、から引用
された。第二次構造ａ、ｂおよびｃに対する△Ｇ値は各
々−１２．５，−４．５および＋２．９Ｋｃａｌである
と計算された。第３図には他のループ（ループｃ）が示
されている。しかしながらこのループはその△Ｇ値（＋
２．９Ｋｃａｌ）のために形成されそうにもない。ハイ
ブリッドの形成はｏｍｐＦ ｍＲＮＡの翻訳を妨げるよ
うに思われる。このことは何故にＣＸ２８ ＤＮＡ断片
を担持しているクローンがＯｍｐＦ蛋白質の生成を抑制
するかを説明するものであろう。かくしてＣＸ２８ Ｒ
ＮＡはｏｍｐＦに対するｍＲＮＡ-interfering complem
entary ＲＮＡ（ｏｍｐＦに対するｍｉｃＲＮＡ）と称
され、そして該遺伝子はｍｉｃＦと称される。ループａ
がｍｉｃＦ遺伝子をｌａｃＺ遺伝子と融合することによ
って削除される時、該ＭｉｃＦ機能は消滅される（プラ
スミドＩＶ．第１図ｃ）と云うことは注目されるべきで
ある。このことはｍｉｃＦ ＲＮＡの安定性のためであ
るが、さもなければＭｉｃＦ機能に対するループａの要
求のためであろう。 【００２９】該ｍｉｃＦ遺伝子がｏｍｐＣ遺伝子のよう
にｏｍｐＢ遺伝子座の支配下にあるかどうかを調べるこ
とは興味あることのように思われる。参考は第１表に作
られている。 【００３０】 【表１】 【００３１】種々のｏｍｐＢミュータント細胞、ＭＣ４
１００（Ｆ-ｌａｃＶ１６９，ａｒａＤ１３９，ｒｓｐ
Ｌ，ｔｈｉＡ，ｔｉｂＢ，ｒｅｌＡ：ワイルドタイ
プ）、ＭＨ１１６０〔ＭＣ４１００からのｏｍｐＢ１０
１（ｏｍｐＲ１）ミュータント〕ＭＨ７６０〔ＭＣ４１
００からのａｍｐＢ４２７（ｏｍｐＲ２）ミュータン
ト〕、ＭＨ１４６１〔ＭＣ４１００からのｔｐｏｌｌ
（ｅｎｖＺ）ミュータント〕が種々のプロモーター−ｌ
ａｃＺ遺伝子融合クローンによって形質転換された。細
胞は３７℃で１．２のクレット（Klett）単位で栄養ス
ープの１０ｍｌ中で培養された。該培地の１００μｌは
ミラー，エイチ・ジェー．（Miller, H. J.）の方法、E
xperiments of Molecular Genetics〔ミラー，エイチ．
ジェー．（Miller, H. J.）編集〕，コールドスプリン
グハーバーラボラトリー、ニューヨーク（１９７２年）
第３５２〜３５５頁、によってβ−ガラクトシダーゼ活
性測定のために用いられた。プラスミドｐＫ００４はｐ
ＫＭ００５から誘導され、そしてｐＫＭ００４はｌａｃ
Ｚ遺伝子に融合されているｌｐｐ（外層膜リポ蛋白質に
対する遺伝子）を含んでいる。プラスミドＩとＩＶは第
１図ｃに記載されている。プラスミドｐＯｍｐＦ Ｐ−
ＡｌはｏｍｐＦプロモーターの支配下においてｌａｃＺ
遺伝子を含んでいる。 【００３２】第１表に示されるように、ｍｉｃＦ支配下
のｌａｃＺ遺伝子（第１図ｃ中プラスミドＩＶ）はｏｍ
ｐＣプロモーター支配下のｌａｃＺ遺伝子（第１図ｃ中
のプラスミドＩ）と同様な方法でβ−ガラクトシダーゼ
を生成する。β−ガラクトシダーゼの高活性がワイルド
タイプとｅｎｖＺ-細胞の両方で見出されたが、ｏｍｐ
Ｒ１-およびｏｍｐＲ２-ミュータントでは低い活性しか
観察されなかった。一方、ｏｍｐＦプロモーターの支配
下のｌａｃＺ遺伝子はｏｍｐＲ１-細胞においては発現
されなかった。さらにコントロールとして用いられたリ
ポ蛋白質プロモーターの支配下のｌａｃＺ遺伝子はすべ
ての細胞において発現された。これらの結果は該ｍｉｃ
Ｆ遺伝子が該ｏｍｐＣ遺伝子と同様な方法においてｏ
ｍｐＢ遺伝子座によって調節されると云うことを示す。
該ｏｍｐＦプロモーターの支配下のｌａｃＺ遺伝子がｅ
ｎｖＺ-1（Ｏｍｐｃ+ ＯｍｐＦ-）細胞の中に構成的に
発現されていると云うことに注目することは興味のある
ことである。このことはこのｅｎｖＺ-細胞のＯｍｐＦ-
発現型がｍｉｃＲＮＡによるｏｍｐＦ ｍＲＮＡの翻訳
を阻害しているためであることを暗示する。 【００３３】ｍｉｃＦおよびｏｍｐＣ遺伝子のプロモー
ター ｍｉｃＦおよびｏｍｐＣ遺伝子の両方がｏｍｐＢ遺伝子
座によって調節されているように見えるので、これら遺
伝子のプロモーターは配列相同性を有するべきである。
相同性に対する調査のために、ｏｍｐＣ遺伝子に対する
転写開始部位はＳｌ−ヌクレアーゼマッピングによって
まず決定された。主な転写開始はＴ残基の４１０および
４１１位置で起る（第２図、また第４図を参照）。 【００３４】第４図においては、ｍｉｃＦとｏｍｐＣ遺
伝子の間の相同配列が示されている。ヌクレオチドの数
は第２図のものと一致する。箱の中の配列は二つの遺伝
子の間の相同配列を示す。二つの配列間の棒は同一の塩
基を示す。矢印は転写開始部位を示す。−１０と−３５
の領域はアンダーラインされている。 【００３５】かくして、ｍｉｃＦとｏｍｐＣ遺伝子に対
する−１０の領域はＡＡＴＡＡＴ（第２図のヌクレオチ
ド２５０から２４５）およびＧＡＧＡＡＴ（第２図のヌ
クレオチド４００から４０５）として各々割り当てられ
（第４図）、その両者はコンセンサス配列ＴＡＴＡＡＴ
と良好な相同性を示す。ｍｉｃＦとｏｍｐＣ遺伝子に対
するＲＮＡポリメラーゼ認識部位（−３５領域）はまた
ＴＡＡＧＣＡおよびＴＴＧＧＡＴとして各々割り当てら
れ（第４図）、その両者はコンセンサス配列、ＴＴＧＡ
ＣＡと５５％相同性を示す。しかしながら、６３ｂｐの
ｍｉｃＦプロモーター（ヌクレオチド３００から２３
８）とｏｍｐＣプロモーター（第２図のヌクレオチド３
０１〜４０９）との間には重要な配列相同性が見出され
ない。一方、相同配列は第４図に示されるように両方の
転写の５'−末端領域において見出される。４４個の塩
基から離れた２８個が相同であり（６４％相同性）、そ
してこれらの領域は多分ＯｍｐＲ蛋白質によって認識さ
れる部位である。これらの配列と相同である一つの配列
はまたｏｍｐＦ ｍＲＮＡの５'−末端非翻訳領域にお
いて見出されることに注目することは興味あることであ
る。ｍｉｃＦ遺伝子とｏｍｐＣ遺伝子とを精製されたＯ
ｍｐＲ蛋白質によって結合する実験が現在進められてい
る。 【００３６】上記のように、大腸菌中の遺伝子発現の調
節は転写のレベルで一般に支配される。ある遺伝子の発
現はこれらに特異的なリプレッサーによって抑制され、
これらに特異的なインデューサーによって活性化され
る。例えばｃＡＭＰ受容体蛋白質およびＯｍｐＲ蛋白質
のようなポジティブな蛋白質因子はまた転写のレベルで
遺伝子発現を調節することが知られている。他の転写調
節機構はアテニュエーションであり、他の化合物の種々
のアミノ酸の生合成に関与する機能の発現を調節するこ
とにおいて重要な役割を果している。コルター，アー
ル．（Kolter, R.）およびヤノフスキー，シー．（Yano
fsky, C.）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．第１６巻第
１１３〜１３４頁（１９８２年）を参照。 【００３７】加うるに、ある種の蛋白質は翻訳のレベル
で遺伝子発現を調節することが示された。その結果はこ
こに翻訳開始領域と相補的なＲＮＡ因子による翻訳のレ
ベルでバクテリアの遺伝子発現の調節を示す。ｍｉｃＲ
ＮＡによって仲介されるこの新規な調節機構は第５図に
示されている。 【００３８】第５図はｍｉｃＦ ＲＮＡの役割の可能な
モデルを示すものである。ＯｍｐＲ蛋白質は低浸透圧モ
ル濃度下においてｏｍｐＦ遺伝子と結合し、そしてＯｍ
ｐＦ蛋白質の生成を促進する。高浸透圧モル濃度下にお
いては、ＯｍｐＲ蛋白質はｍｉｃＦおよびｏｍｐＣ遺伝
子の両方に結合する。かくして生成されたｍｉｃＦＲＮ
ＡはｏｍｐＦ ｍＲＮＡとハイブリダイズしてその翻訳
を制止する。ｍｉｃＲＮＡが翻訳のレベルでｏｍｐＦ遺
伝子の発現を抑制する可能性はありえないとされてき
た。しかしながら、該ｏｍｐＦプロモーターと融合され
るｌａｃＺ遺伝子はｅｎｖＺ-細胞（ＯｍｐＣ+ Ｏｍｐ
Ｆ-：第１図）の中に発現されたのでこのことは殆んど
ありそうにないことになる。この場合は、ｌａｃＺ発現
は恐らくクローンから転写されたｌａｃＺ ｍＲＮＡが
ｍｉｃＲＮＡと安定したハイブリッドを形成することが
出来ないためであろう。更にもしｍｉｃＲＮＡがｏｍｐ
Ｆ遺伝子の無意味な鎖と結合することが出来るならば、
結合がＲＮＡポリメラーゼにもっと接近し得るｏｍｐＦ
遺伝子を作るであろうから、遺伝子発現を妨げるよりは
むしろ活性化させることの方がよりありそうなことであ
る。 【００３９】ｍｉｃＲＮＡによる調節は他の蛋白質生成
を妨げることなくして特異的な蛋白質の生成を妨げるの
に非常に効果的な方法であるように思われる。現在、ｍ
ｉｃＲＮＡとｏｍｐＣとの間の相対的比率は知られてい
ない（第１表のβ−ガラクトシダーゼ活性は、プロモー
ター領域が同じ様相で挿入されなかったので（第１図ｃ
を参照）、それらの正確なプロモーター活性を当然反映
してはいない）。 【００４０】しかしながら、ｍｉｃＲＮＡとｏｍｐＣが
対等に生成されると仮定することは理由のあることであ
る。それ故に、ＯｍｐＣ蛋白質が生成される時、ｍｉｃ
ＲＮＡが同様な方法で生成される。ｍｉｃＲＮＡはそれ
からＯｍｐＦ蛋白質を比例的に妨害して、その結果Ｏｍ
ｐＣプラスＯｍｐＦ蛋白質の総量は一定になる。 【００４１】リボゾーム結合部位と開始コドンヘのｍｉ
ｃＲＮＡの結合は特定のｍＲＮＡの翻訳を妨げるために
非常に効果的な方法である。同様なメカニズムがバクテ
リオアァージＴ７のミュータントの中の翻訳の妨害を説
明するために提供されている。ミュータントｍＲＮＡの
３'−末端の配列はそれ自身のリボゾーム結合部位とハ
イブリダイズして翻訳を妨げることを暗示した。斉藤，
エイチ．（Saito, H.）およびリチャードソン，シー．
シー．（Richardson, C. C.）、Ｃｅｌｌ 第２７巻、
第５３３〜５４２頁（１９８１年）を参照。ｍｉｃＲＮ
Ａ調節システムが大腸菌において、そして真核細胞を含
む他の生物体において一般的な調節現象であろうことは
理由のあることと思われる。一つの蛋白質の形成を非常
に急速に停止すること、もしくは一つの蛋白質の比率を
他のもので調節することは特に好ましいメカニズムであ
る。ＲＮＡ種は種々の細胞活性の調節において付加的な
役割を有するであろう。事実、小さいＲＮＡ種はある種
のプラスミドのＤＮＡ複製の調節を行なうことが示され
ている。 【００４２】付随する開示において、本発明の実施によ
って遺伝子発現を調節するための有力な道具と手法が提
供される。本発明の実施による遺伝子発現は、その生来
の遺伝物質のみを所有するかまたは生来の遺伝物質の欠
失もしくは外来遺伝物質、即ち、該生物体もしくは細胞
物質の遺伝物質とを併なう転写にもとづいて該生物体も
しくは細胞物質の遺伝物質によって生成される一つのｍ
ＲＮＡと相補的でありそして（または）それとハイブリ
ダイズすることが出来、その結果該ＲＮＡの発現もしく
は翻訳が阻害もしくは妨害されるオリゴリボヌクレオチ
ドもしくはポリリボヌクレオチドＲＮＡを生成するＤＮ
Ａの付加によって遺伝的に改変せられた一つの生物体も
しくは細胞物質の遺伝物質に取り入れるかもしくはそれ
と結合することによって調節される。 【００４３】本発明の実施による生物体もしくは細胞物
質の遺伝子発現の調節は、形質転換された生物体もしく
は細胞物質の中で行われ、それにおいては、該生物体も
しくは細胞物質の遺伝物質を併なって該生物体もしくは
細胞物質の遺伝物質を併なう転写にもとづいて該生物体
もしくは細胞物質の遺伝物質によって生成された一つの
ｍＲＮＡと相補的かもしくはそれと結合もしくはハイブ
リダイズすることが出来、その結果該ｍＲＮＡの発現も
しくは翻訳が阻害もしくは妨害せられる一つのオリゴリ
ボヌクレオチドもしくはポリリボヌクレオチドＲＮＡを
生成するＤＮＡをその中に取り入れるかもしくはそれと
結合する。 【００４４】本発明の実施において、ＤＮＡ物質もしく
は分子を含む形質転換された生物体もしくは細胞物質に
おける転写にもとづいて該生物体もしくは細胞物質の遺
伝物質によって生成されるｍＲＮＡと相補的であり、そ
して（または）それと結合もしくはハイブリダイズする
ことの出来るオリゴリボヌクレオチドもしくはポリリボ
ヌクレオチドを生成するところのＤＮＡ物質もしくは分
子は、該生物体の遺伝物質に取り込まれもしくは結合さ
れ、その結果該生物体もしくは細胞物質を該ＤＮＡ物質
もしくはその分子自体と直接に形質転換させることによ
って、もしくは一つのプラスミドもしくはウィルスもし
くはウィルスベクターの中に該ＤＮＡ物質を取り込みそ
れから該生物体もしくは細胞物質を該プラスミドおよび
（または）ウィルスベクターで形質転換することによっ
て形質転換される。該ＤＮＡ物質もしくは分子は該生物
体もしくは細胞物質の遺伝物質を含む核の中に直接挿入
されるであろう。該生物体もしくは細胞物質の形質転換
をもたらす該ＤＮＡ物質もしくは分子は、該生物体を特
徴づける遺伝子または染色体ＤＮＡとの関連において該
生物体もしくは細胞物質の細胞質もしくは流動性内容物
の中へ生物体の膜を通して挿入されるであろう。簡便さ
と実際上のために望ましいことであるが、該ＤＮＡ物質
もしくは分子を該生物体もしくは細胞物質、例えば該生
物体の核もしくは細胞質の中に挿入して形質転換させる
ためにマイクロインジェクションが用いられる。それは
該ＤＮＡ物質もしくは分子を該生物体もしくは細胞物質
の遺伝物質に取り込まれるかそれと結合して該生物体も
しくは細胞物質を取り囲む膜を通して該ＤＮＡ物質もし
くは分子を移すことによって形質転換させるために通常
便利なものである。 【００４５】人工Ｍｉｃ遺伝子の組み立て 該ｍｉｃ遺伝子はＯｍｐＦ蛋白質の生成を妨げる一つの
１７４−塩基ＲＮＡを生成する。この小さなＲＮＡは二
つの幹およびループ構造（一つは３'−末端、もう一つ
は５'−末端）を有する。これらの構造は該ｍｉｃＲＮ
Ａの機能に対する重要な役割を果たすものと考えられる
ので、一つの誘導性の発現ベクターにクローン化される
大きい外層膜リポプロティンに対する遺伝子を用いる人
工ｍｉｃシステムの組み立てにこれらの特徴を用いるこ
とが試みられた。中村等「大腸菌のリポプロティン遺伝
子を用いた多方面の発現クローン化媒介物の構造」ＥＭ
ＢＯ．Ｊ．第１巻，第７７１〜７７５頁（１９８２年）
を参照。ｐＩＮベクターはリポ蛋白質プロモーターのｌ
ａｃpo下流を有する高発現ベクターであり、かくして一
つの挿入された遺伝子の高レベルの誘導可能な発現が出
来るようになる。ｐＩＮプロモーターはｌｐｐ遺伝子に
おいて、ｌｐｐｍＲＮＡのシャイン−ダルガノ（Shine-
Dalgarno）配列の直接上流の特殊ＸｂａＩ部位に融合さ
れた。得られたプラスミドはｐＹＭ１４０として示され
た。ｐＹＭ１４０の中のｌｐｐ遺伝子の発現がイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、一つの
ｌａｃ誘導体によって誘導される時、ｌｐｐ遺伝子から
誘導されるＲＮＡ転写は可能な幹およびループ構造
（５'−末端に）を有する。唯一のＸｂａＩ部位の直接
上流はその３'−末端でのもう一つの安定した幹および
ループ構造である。後者のループはｌｐｐ遺伝子のｐ−
非依存性転写終結シグナルから誘導される。一般的なｍ
ｉｃクローン化ベクター，ｐＪＤＣ４０２の組み立て
は、第６図に示されるように二つのループの間のｐＭＨ
Ｏ４４中のＤＮＡ断片を除去することによって達成され
る。終結部位の直接上流のＲｓａＩ部位は、ｐＹＭ１４
０の部分的分解に続いてＥｃｏＲＩリンカーを挿入する
ことによってＥｃｏＲＩ部位に移された。得られたプラ
スミド，ｐＭＨＯ４４はＥｃｏＲＩで部分的に分解さ
れ、続いてＸｂａＩで完全に分解された。線状ＤＮＡ断
片の一本鎖部分はＤＮＡポリメラーゼＩ（大きい断片）
によって充たされ、それからＴ４ＤＮＡリガーゼで処理
されて、その結果ＸｂａＩとＲｓａＩ部位の間に断片を
有しないプラスミド，ｐＪＤＣ４０２が形成された。こ
の方法の結果として、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩの両部位が
結合点で再生産された。かくして唯一のＸｂａＩ部位は
いかなるＤＮＡ断片に対する挿入部位としての役割を果
たし、そして人工ｍｉｃ遺伝子からのＲＮＡ転写は該ｍ
ｉｃＲＮＡと似た構造を有するＲＮＡを生成する。挿入
されるＤＮＡから誘導される部分は二つのループ構造
（その一つは５'そしてもう一つは３'−末端）によって
サンドイッチされる。 【００４６】以下に第６図および第７図のより詳細な説
明を行なう。ｐＪＤＣ４０２の組み立てにかかる第６図
に示されるように、制限部位は下記の通りに示される。
Ｘ，ＸｂａＩ；Ｐ，ＰｖｕＩＩ；Ｅ，ＥｃｏＲＩ．ｌｐ
ｐpおよびｌａｃpoは各々リポ蛋白質プロモーターおよ
びラクトースプロモーターオペレーターである。Ａｍｐ
rはアンピシリン耐性遺伝子である。交差平行線はリポ
蛋白質プロモーターを表わす。黒丸はラクトースプロモ
ーターオペレーターを表わす。斜線はリポ蛋白質シグナ
ル配列を表わし、そして黒棒はリポ蛋白質の成熟部分に
対するコード領域を表わす。白丸はｌｐｐ遺伝子から誘
導される転写終結領域を表わす。白枠はリポ蛋白質ｍＲ
ＮＡの５'非翻訳領域を表わす。 【００４７】ｍｉｃ（ｌｐｐ）ｐＪＤＣ４１２の組み立
てにかゝる第７図において、白矢印はプロモーターを表
わす。該ＰｖｕＩＩ部位はＸｂａＩリンカー（ＴＣＴＡ
ＧＡＧ）を挿入することによってＸｂａＩ部位に変換さ
れる。この断片はｐＪＤＣ４１２を形成する逆向き方向
においてｐＪＤＣ４０２の唯一のＸｂａＩ部位の中に挿
入された。ａおよびｂは各々ｌｐｐとｌａｃプロモータ
ーの位置で開始するｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡを示す。 【００４８】ｍｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子の組み立て このｍｉｃクローン化ベクター，ｐＪＤＣ４０２を用い
て、ｍｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子の誘導にもとづくリポ蛋白
質の合成を阻害するために大腸菌のｌｐｐ遺伝子に対す
るｍｉｃシステムを作ることがまず第一に試みられた。
この目的のために、リボゾーム結合のためのシャイン−
ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列を含むＤＮＡ断片とプ
ロリポ蛋白質の最初の数個のアミノ酸残基に対するコー
ド領域を先づ単離することが必要である。これを行なう
ために、プロリポ蛋白質シグナルペプチドのコード領域
の直後のＰｖｕＩＩ部位はこの位置にＸｂａＩリンカー
を挿入することによってＸｂａＩ部位に移された。得ら
れたプラスミドはそれからＸｂａＩで分解され、そして
１１２−ｂｐ ＸｂａＩ−ＸｂａＩ（元来ＰｖｕＩＩ−
ＸｂａＩ）断片は精製された。シャイン−ダルガノ（Sh
ine-Dalgarno）配列とプロリポ蛋白質のアミノ基末端か
らの最初の２９個のアミノ残基に対するコード領域を取
り囲むこの断片が精製された。この断片はそれから正常
ｌｐｐ遺伝子から反対の方向でｐＪＤＣ４０２唯一のＸ
ｂａＩ部位の中へ挿入された。得られたプラスミドはｐ
ＪＤＣ４１２として示され、ＩＰＴＧでの誘導にもとづ
いてｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡ，ｌｐｐｍＲＮＡと対にな
る一つのＲＮＡ転写を生成することが出来る。 【００４９】該ｍｉｃ発現ベクター，ｐＪＤＣ４０２の
もう一つの重要な特徴はｌｐｐプロモーターの直接上流
のＨｉｎｆＩ部位と転写終結部位の直接下流のもう一つ
のＨｉｎｆＩ部位とを含むことであることが指摘される
べきである。これら二つのＨｉｎｆＩ部位はベクターの
唯一のＰｖｕＩＩ部位の中に挿入されることが出来る完
全なｍｉｃ転写単位を含むＤＮＡ断片を除去するために
用いられることが出来る。このようにして、完全なｍｉ
ｃ遺伝子は単一プラスミド中に複製されることが出来
る。２つの同一なｍｉｃ遺伝子を含むプラスミドが、単
一のｍｉｃ遺伝子を含むプラスミドに比べて２倍のｍｉ
ｃＲＮＡを生成すると云うことが予想される。このプラ
スミドは二つのｍｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子を含んで組み立
てられｐＪＤＣ４２２として示された。 【００５０】ｍｉｃ遺伝子の発現 人工ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの効果を試験するために、
ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの２ｍＭＩＰＴＧによる誘発の
１時間後に細胞は〔35Ｓ〕−メチオニンで１分間パルス
ラベルされた。ベクター，ｐＪＤＣ４０２を有している
該細胞は放射線写真の濃度測定走査および標準化によっ
て定量されたのであるが、誘導体，ＩＰＴＧの不存在下
もしくは存在下のいづれにおいても同量のリポ蛋白質を
生成する。リポ蛋白質の生成はＩＰＴＧの不存在下でｐ
ＪＤＣ４１２を担持している細胞の場合の約２倍、そし
てＩＰＴＧの存在下では約１６倍減少した。ＩＰＴＧの
不存在下でのリポ蛋白質合成の減少は、ｍｉｃ（ｌｐ
ｐ）遺伝子の不完全な抑制のためであると考えられる。
ｍｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子が複製されたｐＪＤＣ４２２を
担持する細胞の場合では、リポ蛋白質生成がＩＰＴＧ不
存在下では４倍、ＩＰＴＧ存在下では３１倍減少され
る。これらの結果は、人工ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの生
成がリポ蛋白質生成を阻害していること、そして該阻害
が生成されるｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの量と比例するこ
とを明らかに示している。該ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡは
特異的にリポ蛋白質の生成を妨害していること、および
それはＯｍｐＣ蛋白質を除いては他のいかなる蛋白質の
生成をも妨害しないことは注目されるべきである。該ｍ
ｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子の誘導がＯｍｐＣプラスＯｍｐＦ
蛋白質の生成を減少すると云う事実は、以下に検討され
るようにｌｐｐとｏｍｐＣ遺伝子との間の通常ではない
相同性のためであることが判明した。 【００５１】ｍｉｃ阻害が惹起されるいくつかのメカニ
ズムがある。一つのメカニズムは、該ｍｉｃＲＮＡはリ
ボゾームがｍＲＮＡと結合することを阻止することであ
る。その他の可能なメカニズムは、ｍＲＮＡの不安定
化，転写の早過ぎる終結または転写の開始の阻害のため
に起こるｍＲＮＡのアテニュエーションを含む。該ｍｉ
ｃＲＮＡの阻害効果が単にアテニュエーションもしくは
転写開始のレベルであったならば、該ｍｉｃ効果は該リ
ポ蛋白質ｍＲＮＡの機能の半減期は１２分であると云う
事実のために、幾分かは延ばされることが予期せられる
であろう。それ故に、ＩＰＴＧによる誘導の後の種々な
時点においてｐＪＤＣ４１２を有しているパルスラベル
された大腸菌ＪＡ２２１／Ｆ'ｌａｃＩqによるｍｉｃ
（ｌｐｐ）ＲＮＡの誘導にもとづいて、いかに迅速にリ
ポ蛋白質生成が阻害されるかが測定された。リポ蛋白質
生成はＩＰＴＧ添加後５分以内で最大１６倍にまで阻害
された。この結果は、リポ蛋白質生成の阻害が最初はｍ
ｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡのｌｐｐｍＲＮＡに対する結合の
ためであり、該結合は結果としてｌｐｐｍＲＮＡの翻訳
の阻害および（または）ｍＲＮＡの不安定化を惹き起す
ことを示している。 【００５２】ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの存在下での１ｐ
ｐｍＲＮＡ生成 該ｍｉｃＦ遺伝子の発現が実質的に該ｏｍｐＦ ｍＲＮ
Ａの量を減少させるので、該ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡが
また該ｌｐｐｍＲＮＡのレベルに影響するかどうかを試
験することは興味のあることのように思われる。この目
的のために、該ｍｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子をＩＰＴＧで誘
導した１時間後に全細胞ＲＮＡが単離された。該ＲＮＡ
調製物はホルムアルデヒドアガロースゲル中での電気泳
動に続いてニトロセルロースペーパー上への移行を行な
った後に分析された。該ペーパーはそれから該ｍｉｃ
（ｌｐｐ）ＲＮＡもしくは該ｌｐｐｍＲＮＡに対して特
異的な一つのプローブによってハイブリダイズされた。
該ｏｍｐＡ ｍＲＮＡに対して特異的な一つのプローブ
もまた内部コントロールとして用いられた。ＩＰＴＧの
不存在下もしくは存在下において、ｐＪＤＣ４０２がも
はやｌｐｐｍＲＮＡの生成にいかなる相違も示さない。
これらの実験のための該プローブを作るために用いられ
た二重らせん構造のプライマーはｌａｃオペロンの一部
を含むと云う事実のために、該プローブは、例えばＪＤ
Ｃ４１２からのｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡおよびｐＪＤＣ
４０２の短い無意味な転写のようなｌａｃプロモーター
を含むいかなる転写ともハイブリダイズする。ｐＪＤＣ
４１２を有する細胞はＩＰＴＧの不存在下では該ｌｐｐ
ｍＲＮＡの減少された量を含み、ＩＰＴＧの存在下では
ｌｐｐｍＲＮＡの大巾に減少された量を含む。ｐＪＤＣ
４１２を宿している細胞中のＩＰＴＧの不存在および存
在下において該ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの生成が示され
た。それ故に、ＩＰＴＧの不存在下においても、該ｍｉ
ｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの可成りの量が生成され、そしてそ
れは以前に観察されたリポ蛋白質生成の結果と一致して
いる。該ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの誘導によってｌｐｐ
ｍＲＮＡが消滅すると云う事実は、該ｍｉｃＲＮＡの作
用のメカニズムが単に翻訳のレベルにとどまらないこと
を示している。試験はことなったサイズの二つのｍｉｃ
（ｌｐｐ）ＲＮＡが存在することを示した。これら転写
のサイズは２８１から１９７個の塩基であると決定さ
れ、そしてそれはリポ蛋白質プロモーター（大きい方の
ＲＮＡ）での開始およびｌａｃプロモーター（小さい方
のＲＮＡ）で開始する転写と一致する。 【００５３】ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子によるＯｍｐＣ
生成の阻害 人工的に組み立てられるｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子によ
ってＯｍｐＣ合成の殆んど完全な阻害を達成することが
また可能であった。二つのｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子を
担持する第１次構造（ｐＡＭ３２０）は該ｏｍｐＣ ｍ
ＲＮＡのリーダー領域の２０個のヌクレオチドおよびコ
ード領域の１００個のヌクレオチドと対になる一つのＲ
ＮＡ分子のもとになる。このことはｏｍｐＣ構造遺伝子
中の唯一のＢｇｌＩＩ部位およびＡＴＧ開始コドンの上
流の２０個のヌクレオチドをＸｂａＩ部位に移すことに
よって達成された。得られた１２８−ｂｐ ＸｂａＩ断
片はそれから該ＯｍｐＣ遺伝子とは逆の方向のｐＪＤＣ
４０２の中へ挿入され、そして該ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺
伝子の第２コピーは、ｐＪＤＣ４２２組み立てに対して
記述されたと同様な方法で導かれた。得られたプラスミ
ド（ｐＡＭ３２０）は第１のものと反対側の方向に挿入
される第２ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子を有する。第２ｍ
ｉｃ遺伝子の配位を逆にすることはプラスミドの発現も
しくは安定性を変化させなかった。第２次構造ｐＡＭ３
２１，はｍｉｃＲＮＡとｏｍｐＣ ｍＲＮＡとの間の相
補性を拡大して、ｐＡＭ３２０の場合よりも長いリーダ
ー配列、２０個の代りに７２個のヌクレオチドのリーダ
ー領域を含むように設計されたものである。このプラス
ミドは、ＸｂａＩ部位に移されたＭｎｌＩ部位にｏｍｐ
Ｃ開始コドンの上流７２個のヌクレオチドｂｐが位置せ
られたことを除いては、ｐＡＭ３２０に対して記述され
たと同様に組み立てられた。 【００５４】ｍｉｃクローンベクターｐＪＤＣ４０２，
ｐＡＭ３２０およびｐＡＭ３２１を有している大腸菌Ｊ
Ａ２２１／Ｆ'ｌａｃＩqから単離された外層膜蛋白質の
クマーシー ブリリアント ブルー（Commassie Brilli
ant B1ue）染色ゲルパターンが得られた。ＩＰＴＧの添
加の効果が、β−ガラクトシダーゼの出現によって明ら
かにみられた。ｐＡＭ３２０からのｍｉｃ（ｏｍｐＣ）
ＲＮＡの誘導はｐＪＤＣ４０２と比較して、ＯｍｐＣ生
成における実質的な減少（約５倍）を惹起こした。ｐＡ
Ｍ３２１からの長い方のｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡの誘
導はＯｍｐＣの合成をよりドラマチックに減少した（ｐ
ＪＤＣ４０２と比較して約２０倍）。ＯｍｐＣ生成はそ
れらがＩＰＴＧでの１時間誘導の後１分でパルス−ラベ
ルされた時、ｐＡＭ３２１を有する細胞において殆ど検
出されなかった。同様な実験においてＯｍｐＣ合成は、
ｐＡＭ３２０を有する細胞中のｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝
子がＩＰＴＧで誘導された時約７倍減少した。ＯｍｐＣ
発現の著しい減少はまたｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子の単
一コピーを含むプラスミドが誘導された時観察された。
また長い方のｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子はより大きな効
果を有していた。ｐＡＭ３２０によるｍｉｃ−媒介阻害
の増大された効率は該ｍｉｃＲＮＡ機能の効果がｍＲＮ
Ａの５'−末端と対になる拡がりと関連していることを
示すであろう。 【００５５】上記の該ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡのいず
れかの合成がＯｍｐＣ合成のみならずリポ蛋白質合成の
減少をも惹起すことに注目することは興味あることであ
った。リポ蛋白質生成における該ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）Ｒ
ＮＡのこの阻害効果は、第８図に示されるようにｌｐｐ
ｍＲＮＡ配列とｏｍｐＣ ｍＲＮＡとの間の予期せざる
相同性によるものであると思われる。この特徴は、何故
ｐＡＭ３２０とｐＡＭ３２１がリポ蛋白質生成に対する
ｍｉｃ効果を働かせているかを説明するものである。こ
のような説明は、ｐＪＤＣ４１２とｐＪＤＣ４２２から
のｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの誘導がＯｍｐＣ蛋白質の合
成を減少する筈であることを予言し、そしてこのことは
その場合であることが見出された。 【００５６】第８図において、ｌｐｐｍＲＮＡ（最上
線）とｏｍｐＣ ｍＲＮＡ（最下線）との間の相同領域
が示されている。棒は同一の塩基を結んでいる。両方の
ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡはこの相同領域を横断してハ
イブリダイズする能力を有する。該シャイン−ダルガノ
（Shine-Dalgarno）配列（Ｓ．Ｄ）とＡＵＧ開始コドン
は箱で囲われる。 【００５７】ｍｉｃ（ｏｍｐＡ）ＲＮＡによるＯｍｐＡ
生成の阻害 いかなる成分がｍｉｃＲＮＡの効果に寄与するかを測定
する努力において、いくつかのｍｉｃ遺伝子が該ｏｍｐ
Ａ遺伝子から組み立てられた。該ｏｍｐＡ ｍＲＮＡの
リーダー領域とコード領域が広範囲にわたって特徴づけ
られていたので、該ｏｍｐＡ遺伝子はこのことのために
選択された。５個のＤＮＡ断片（第９図のＩからＶを参
照）は、ｍｉｃ（ｏｍｐＡ）ＲＮＡの生成を促進する方
向でｐＪＤＣ４０２のＸｂａＩ部位の中へ個別的にクロ
ーン化された。結果として得られた断片Ｉ−Ｖを含むｍ
ｉｃ（ｏｍｐＡ）プラスミドは、各々ｐＡＭ３０１，ｐ
ＡＭ３０７，ｐＡＭ３１３，ｐＡＭ３１４，およびｐＡ
Ｍ３１８として示された。各々のプラスミドは記述され
たｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子の唯一つのコピーを含む。 【００５８】第９図において、最上線は大腸菌ｏｍｐＡ
遺伝子の構造を示す。矢印はプロモーターを表わし、白
色棒は該ｏｍｐＡ ｍＲＮＡの５'−リーダー領域をコ
ード化する領域を表わす。斜線を付した棒および影を付
けた棒は各々シグナル配列と成熟したＯｍｐＡ蛋白質と
をコード化するｏｍｐＡ遺伝子の部分を表わす。制限断
片Ｉ（ＨｐｈＩ−ＨｐａＩ）は、ｍｉｃ（ｌｐｐ）に関
する第７図において略図がかゝれているように、こゝに
記されたところから反対側の方向においてｐＪＤＣ４０
２のＸｂａＩ部位の中に挿入されて（第６図を参照）、
プラスミドｐＡＭ３０１を作る。他のｍｉｃ（ｏｍｐ
Ａ）プラスミドは同様に、断片ＩＩ，ｐＡＭ３０７；断
片ＩＩＩ，ｐＡＭ３１３；断片ＩＶ，ｐＡＭ３１４：断
片Ｖ，ｐＡＭ３１８から組み立てられた。シャイン−ダ
ルガノ（Shine-Dalgarno）配列（ＳＤ），ＡＴＧ開始コ
ドン（ＡＴＧ），および関連する制限部位の位置が示さ
れている。 【００５９】該ｍｉｃ（ｏｍｐＡ）プラスミドの各々を
含む大腸菌ＪＡ２２１／Ｆ'ｌａｃＩqは、ＩＰＴＧによ
る１時間前に前処理を行なうかまたは行なうことなくし
て〔35Ｓ〕−メチオニンで１分間パルス−ラベルされ
た。これらの培地から単離された外層膜蛋白質の電気泳
動パターンが得られた。放射線写真は５個のｍｉｃ（ｏ
ｍｐＡ）遺伝子の各々がＯｍｐＡ合成を阻害することが
出来ることを明らかにした。該ｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝
子は先に述べられたｍｉｃ（ｌｐｐ）およびｍｉｃ（ｏ
ｍｐＣ）遺伝子よりも小さい効果を有するものと思われ
るが、この問題はｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子投与量の増
加によって妨げられる。翻訳開始部位を取り囲む該ｏｍ
ｐＡ ｍＲＮＡの２５８個の塩基領域（第９図の断片
Ｉ）と相補的な一つのｍＲＮＡをコード化しているプラ
スミドｐＡＭ３０１は、約４５％までＯｍｐＡ合成を阻
害することが判明した。約５１％までの同様な阻害がｐ
ＡＭ３０７によって得られた。このプラスミドはｏｍｐ
Ａ構造遺伝子と一致するいかなるＤＮＡ配列をも含んで
いない断片ＩＩ（第９図を参照）を含む。ｐＡＭ３０７
による阻害は以前に述べられたｍｉｃ（ｏｍｐＣ）実験
がｍＲＮＡの５'−リーダー領域との増大された相補性
がｍｉｃＲＮＡ−媒介阻害においてより効果を有するこ
とを示したので驚くにはあたらない。一方、４５個の前
−ＯｍｐＡを介して４個のアミノ酸残基に対するコード
領域にわたる断片ＩｌＩ（第９図を参照）によって被覆
されているｏｍｐＡ構造遺伝子の部分とのみ対になる一
つのｍｉｃＲＮＡを生成するｐＡＭ３１３はまた約５４
％までＯｍｐＡ合成を阻害することが効果的に出来、こ
のことは機能を果すために蛋白質合成に対する開始部位
および（または）ターゲットｍＲＮＡの５'−リーダー
領域とハイブリダイズする必要がないことを示してい
る。このことはまたｍｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子を用いるこ
とが確認された。ｌｐｐｍＲＮＡのコード領域とのみ対
をなす二つのｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡはまたリポ蛋白質
生成を阻害することが判明した。アミノ酸残基３から２
９、およびプロリポ蛋白質の４３から６３の各々に対し
てコードを行なうｌｐｐ構造遺伝子断片から組み立てら
れたｐＪＤＣ４１３とｐＪＤＣ４１４におけるｍｉｃ
（ｌｐｐ）遺伝子の効果が観察された。しかしながらｐ
ＪＤＣ４１３とｐＪＤＣ４１４の両方がリポ蛋白質合成
のたった２倍の阻害しか示さず、このことは翻訳開始部
位を被覆している一つのＤＮＡ断片（それは１６倍阻害
を惹起する）が該ｍｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子の場合により
効果を有することを示している。 【００６０】断片ＩＶ（第９図を参照）は該ｏｍｐＡ
ｍＲＮＡの５'−リーダー領域とのみ対をなす１つのｍ
ｉｃＲＮＡの効果を試験するために選択された。結果と
して組み立てられたｐＡＭ３１４は、ＡＵＧ開始コドン
の上流６０個の塩基が位置するｏｍｐＡ ｍＲＮＡリー
ダー領域の６８−塩基区域と対になる１つのｍｉｃＲＮ
Ａを合成する。ｐＡＭ３１４はたった約１８％までしか
ＯｍｐＡ合成を阻害する非常に弱いｍｉｃ効果を示す。
断片ＩＩとＩＶ（第９図を参照）の間のｍｉｃ効果にお
ける重要な相違はリボゾーム、即ちシャイン−ダルガノ
（Shine-Dalgarno）配列および（または）コード領域と
相互作用するｍＲＮＡの領域の範囲での相補相互作用が
絶対的に必要とはされないながらも、効果的なｍｉｃ機
能のために非常に重要であることを明白に示している。
断片ＩからＶのｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子を短縮するこ
とはその能率にもたらす影響が少なく、各々４８％減少
に比して４５％であることに注目することはまた興味の
あることである。 【００６１】上記に検討したよりもより効果的にＯｍｐ
Ａ合成を阻害し得る一つのプラスミドを組み立てるため
に、プラスミドが２つ以上のｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子
を含んで組み立てられた。これらのプラスミド、ｐＡＭ
３０７とその誘導体ｐＡＭ３１９およびｐＡＭ３１５と
が比較せられた。前記のうちの後の２つのプラスミドは
各々ｐＡＭ３０７中にｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子の２つ
および３つのコピーを含んでいる。ｐＡＭ３０７は約４
７％までＯｍｐＡ合成を阻害したのであるが、ｐＡＭ３
１５とｐＡＭ３１９は各々６９％までＯｍｐＡ合成を阻
害した。 【００６２】上に提出された結果は明らかに本発明の人
工ｍｉｃシステムと手法とが目的とする１つの遺伝子の
発現を明確に調節するために用いることが出来ることを
はっきり示している。特に、ある特定の遺伝子に対する
誘導性のｍｉｃシステムは、ある遺伝子の機能を研究す
るために新規でかつ非常に効果的な方法である。もし該
遺伝子が不可欠のものであれば、条件付きの致死率は温
度感受性突然変異と幾分か同様にｍｉｃシステムの誘導
にもとづいて達成せられるであろう。しかしなから該ｍ
ｉｃシステムが特定の蛋白質それ自体の合成を妨害する
一方では、温度感受性突然変異はその合成を妨害するこ
となくして蛋白質の機能のみを妨害すると云うことは注
目されるべきである。 【００６３】本発明から、下記のことが明らかになっ
た。 【００６４】（ａ）１つの特定のｍＲＮＡと対になる１
つのＲＮＡ転写（ｍｉｃＲＮＡ）の生成はそのｍＲＮＡ
の発現を阻害する。 【００６５】（ｂ）１つのｍｉｃＲＮＡの生成は該ｍｉ
ｃＲＮＡと相補性を分け合うこれらの遺伝子のみについ
ての発現を妨害する。 【００６６】（ｃ）該ｍｉｃＲＮＡ生成の誘導はｍＲＮ
Ａの半減期よりもずっと速く特定の遺伝子の発現を妨害
する。 【００６７】（ｄ）該ｍｉｃＲＮＡはまた人工的に組み
立てられたｍｉｃ（ｌｐｐ）遺伝子が本発明の中で発現
される時のみならず、天然のｍｉｃＦ遺伝子が発現され
る時にも見出されるように、細胞中の特定のｍＲＮＡの
量を減小する。 【００６８】（ｅ）遺伝子投与量によって明らかな影響
がある。ｍｉｃＲＮＡがより多く生成される程、ターゲ
ット遺伝子の発現がより効果的に妨害される。 【００６９】本発明の実施において、リボゾームと相互
作用を行なうことが知られているｍＲＮＡの領域と対に
なるｍｉｃＲＮＡが最とも効果を有するものと思われ
る。１つの例としてｌｐｐ遺伝子を用いると、シャイン
−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列およびｌｐｐｍＲＮ
Ａの翻訳開始部位にハイブリダイズ出来る１つのｍｉｃ
（ｌｐｐ）ＲＮＡはそれが出来ないものよりもより能率
的にリポ蛋白質合成を阻害するものと思われる。しかし
ながらｏｍｐＡ遺伝子、シャイン−ダルガノ（Shine-Da
lgarno）配列と翻訳開始部位の両者と対になるｍｉｃＲ
ＮＡに対しては、まさしくシャイン−ダルガノ（Shine-
Dalgarno）配列もしくは構造遺伝子のみが等しく効果的
であった。 【００７０】例えばｏｍｐＣおよびｌｐｐのようないく
らかの遺伝子に対して、翻訳開始部位を取り囲む遺伝子
の領域は特定の配列を含まず、そしてｍｉｃＲＮＡ誘導
は２つ以上の蛋白質の生成を阻害する結果となる。これ
らの場合において、遺伝子の他の領域はｍｉｃ遺伝子を
組み立てるために用いられるであろう。ｍｉｃＲＮＡの
長さはもう１つの考慮に入れられるべき変化因子であ
る。長い方のｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡはＯｍｐＣ生成
の阻害において短かい方のｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡよ
りも４倍効果を有した。該ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡに
よるリポ蛋白質発現の阻害は、リポ蛋白質ｍＲＮＡと対
になる２つのｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡの領域が同じで
あると云う事実にも拘らず、長い方のｍｉｃ（ｏｍｐ
Ｃ）ＲＮＡの領域によっては殆んど影響されなかったこ
とは注目されるべきである。このことはより高い特性が
長い方のｍｉｃＲＮＡを用いることによって達成される
ことを示している。該ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子と対比
して、長さはＯｍｐＡ生成のｍｉｃ（ｏｍｐＡ）ＲＮＡ
媒介阻害に対しての重要な因子であるとは思われなかっ
た。加うるに、該ｍｉｃＲＮＡの第２次構造はｍｉｃＲ
ＮＡ機能においてある重要な役割を果している可能性が
大である。 【００７１】ｍｉｃＲＮＡが特定の遺伝子の発現を阻害
するために機能するであろういくつかのメカニズムが存
在する。該ｍｉｃＲＮＡが最初に該ｍＲＮＡと結合する
ことによって作用し、それによって先に提示されたよう
にリボゾームとの相互作用を妨害すると云うことは最と
もありそうに思われる。この仮説は該ｍｉｃ（ｌｐｐ）
ＲＮＡがもし転写がｌｐｐ ｍＲＮＡの半減期のみにも
とづいて影響されると仮定した場合よりもずっと速くリ
ポ蛋白質の生成を阻害したと云う事実によって支持され
る。ｍｉｃＲＮＡがリポ蛋白質ｍＲＮＡの量の減少をい
かに惹き起こすかにてついて、この減少を説明するため
に考えられ得るモデルは、リボゾームがｍＲＮＡ全域を
横切っていない時に該ｍＲＮＡがより安定していないと
云うことである。ｍＲＮＡレベルにおいてのこの減少を
説明するための他の可能なモデルは、ｍｉｃＲＮＡとｍ
ＲＮＡとの間の相補ハイブリッド形成が、ｍＲＮＡの転
写の早過ぎる終結もしくは不安定化を惹き起すと云うこ
とである。それに代えて、該ｍｉｃＲＮＡは直接転写の
開始を阻害するか、もしくはＣｏｌＥｌ複製における小
さい相補ＲＮＡ種の機能に対して記述されたと同様な方
法でｍＲＮＡ伸長の中断を惹き起こす。富沢（Tomizaw
a）等、ＣｏｌＥｌプライマー形成におけるＲＮＡ第２
次構造の重要性、Ｃｅｌｌ 第３１巻、第５７５〜５８
３頁（１９８２年）を参照。 【００７２】本発明のｍｉｃシステムはその応用におい
ては、真核細胞のみならず原核細胞において、例えば薬
剤耐性遺伝子、腫瘍遺伝子、およびファージもしくはウ
ィルス遺伝子のような種々の有毒あるいは有害な遺伝子
の発現およびその他の遺伝子の発現を永久的に、もしく
は誘導に際して妨害するために大きな可能性を有する。 【００７３】 【実施例】ここに記述されるような本発明の実施の開発
と表示において、下記の材料と方法が用いられた。 【００７４】細胞と培地 大腸菌ＪＡ２２１（ｈｓｄｒ，ｌｅｕＢ６，ｌａｃＹ，
ｔｈｉ，ｒｅｃＡ，△ｔｒｐＥ５）Ｆ'（ｌａｃＩq，ｐ
ｒｏＡＢ，ｌａｃＺＹＡ）がすべての実験において用い
られた。特に記述されていない場合には、この細胞はグ
ルコール０．４％，チアミン２μｇ／ｍｌ，ロイシンと
トリプトファンの各々の４０μｇ／ｍｌ，およびアンピ
シリン５０μｇ／ｍｌを補充されたＭ９培地〔ジェー．
エイチ．ミラー（J. H. Miller）、Experiments in Mol
ecular Genetics、コールドスプリングハーバーラボラ
トリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールド
スプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨ
ーク（New York）１９７２年〕の中で培養された。 【００７５】材料 制限酵素はベセスダ リサーチ ラボラトリー（Bethes
da Research Laboratories）またはニューイングランド
バイオラボラトリー（New England BioLabs）のいず
れかから購入された。Ｔ４ＤＮＡリガーゼと大腸菌ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（大きい断片）はベセスダ リサーチ
ラボラトリー（Bethesda Research Laboratories）か
ら購入された。すべての酵素は製造者によって提供され
た指示によって用いた。ＸｂａＩリンカー（ＣＴＣＴＡ
ＧＡＧ）はニューイングランドバイオラボラトリー（Ne
w England BioLabs）から購入した。 【００７６】ＤＮＡ操作 プラスミドＰＪＤＣ４０２，ｐＪＤＣ４１２，およびｐ
ＪＤＣ４２２はこゝおよび第９図に記載されたように組
み立てられた。プラスミドｐＪＤＣ４１３とｐＪＤＣ４
１４は、ｐＪＤＣ４１３に対するプロリポ蛋白質の３か
ら２９個のアミノ酸残基をコード化しているｌｐｐ遺伝
子，およびｐＪＤＣ４１４に対するプロリポ蛋白質の４
３から６３個のアミノ酸残基をコード化している５８−
ｂｐ ＡｌｕＩ断片から８０−ｂｐ ＡｌｕＩ断片を単
離することによって組み立てられた。該断片は先づＸｂ
ａＩで分解せられ、次いでＤＮＡポリメラーゼＩ（大き
い断片）によって処理されるｐＪＤＣ４０２の中へ結び
つけられているブラントエンドであった。 【００７７】ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）組み立てのために適当
なｏｍｐＣ断片の単離は、ｏｍｐＣプロモーターと構造
遺伝子との間の適当な特定の制限部位がないためにサブ
クローン化ステップを含んでいた。プラスミド，ｐＭＹ
ｌ５０，を含み、断片（ｐＤＲ００１とｐＤＲ００２の
各々）を含む４７１−ｂｐ ＸｂａＩ−ＭｎＩＩ ｏｍ
ｐＣプロモーターのいずれかを欠き、しかしその場所に
ＸｂａＩ部位を含むｏｍｐＣの２つの誘導体が単離され
た。これらプラスミドの各々の中の特定のＢｇｌＩＩ部
位はＤＮＡポリメラーゼＩ（大きい断片）による処理と
合成ＸｂａＩリンカーによる結び付けによってＸｂａＩ
部位に移された。ＸｂａＩ分解に続いて、ｐＤＲ００１
からの１２３−ｂｐ ＸｂａＩ断片とｐＤＲ００２から
の１７５−ｂｐ ＸｂａＩ断片とが個々に単離され、そ
してｐＪＤＣ４０２のＸｂａＩ部位の中ヘクローン化さ
れて、ｐＡＭ３０８とｐＡＭ３０９の各々を作成した。
ｐＡＭ３２０はｐＡＭ３０８のｐｖｕＩＩの中ヘクロー
ン化されているｐＡＭ３０８から単離されたｍｉｃ（ｏ
ｍｐＣ）遺伝子を被覆しているＨｉｎｆＩを含んでい
る。ｐＡＭ３２１は同様にｐＡＭ３０９から組み立てら
れて２つのｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子を含んでいる。 【００７８】ｍｉｃ（ｏｍｐＡ）プラスミドｐＡＭ３０
１，ｐＡＭ３０７，ｐＡＭ３１３，ｐＡＭ３１４，およ
びｐＡＭ３１８は、ｍｉｃ（ｌｐｐ）とｍｉｃ（ｏｍｐ
Ｃ）遺伝子の組み立てと類似した方法で述べられたよう
にして組み立てられた。ｐＡＭ３１９を組み立てるため
に、ｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子を含むＨｉｎｆＩ断片は
ｐＡＭ３０７から単離され、そしてｐＡＭ３０７のＰｖ
ｕＩＩ部位の中へ再び挿入された。ｐＡＭ３１５は、そ
れがｐＡＭ３０７のＰｒｕＩＩの中へ挿入されている２
つのＨｉｎｆＩを含んでいることを除いては、ｐＡＭ３
１９と同様な方法で組み立てられた。 【００７９】外層膜蛋白質生成の分析 適当なプラスミドを担持する大腸菌ＪＡ２２１／Ｆ'ｌ
ａｃＩqがクレット−サマーソン（Klett-Summerson）比
色計が３０を示す点まで培養され、その時点においてＩ
ＰＴＧは２ｍＭの最終濃度になるよう添加された。更に
１時間の培養の後（約２倍の時間）、〔35Ｓ〕−メチオ
ニンの５０μＣｉ〔アマーシャム（Amersham），１００
０Ｃｉ／ｍモル〕が１ｍｌの培地に添加された。該混合
物はそれから１分間振盪しつつ処置され、この時点でラ
ベル化は１ｍｌの氷冷停止溶液（１％ホルムアルデヒド
と１ｍｇ／ｍｌメチオニンを含んでいる２０ｍＭ燐酸ソ
ーダ〔ｐＨ７．１〕）の添加によって終結された。細胞
は１０ｍＭ燐酸ソーダ（ｐＨ７．１）によって１度洗浄
され、同じバッファーの１ｍｌ中に懸濁され、そしてカ
ップホーンアダプター付きのヒートシステム超音波発振
器モデルＷ−２２０Ｅによって３分間（３０秒パルス
で）超音波破壊された。破壊されなかった細胞は外層膜
を採集するに先立って低速遠心分離によって除去され
た。細胞質膜は０．５％ソジウムラウロイルサルコシネ
ートの存在下で室温で３０分の処置の間に可溶化され、
そして外層膜フラクションは１０５，０００Ｘｇで２時
間の遠心分離によって沈澱させた。 【００８０】リポ蛋白質とＯｍｐＡはトリス−ＳＤＳポ
リアクリルアミトゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に
よって分析した。ＯｍｐＣ生成を分析するために、尿素
−ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素−ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）が用いられた。蛋白質は試料バッファー
中に溶解され、そして該溶液はゲル塗布に先立って８分
間沸騰ウォータバス中で処置された。乾燥ゲルの放射線
写真は島津濃度計によって直接走査された。目的とする
バンドの相対量を測定するために、目的物のピークの面
積の１つの影響を受けていない蛋白質のピークに対する
比率が各々の試料に対して測定された。 【００８１】ＲＮＡ分析 細胞を培養しそして〔3Ｈ〕−ウリジンでラベルされ、
それから細胞の増殖を氷上で培地を５分間以内に急速に
冷却することによって停止した。該細胞は８０００ｒｐ
ｍ，５分間の遠心分離によって集められた。ＲＮＡは下
記の方法を用いて単離された。該細胞を１分間激しくボ
ーテックスして熱細胞溶解溶液（１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ〔ｐＨ８．０〕，１ｍＭ ＥＤＴＡ，３５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，２％ ＳＤＳおよび７Ｍ尿素）の中へ急速に再
分散した。該混合液は直ちにフェノール：クロロホルム
（１：１）で２回、クロロホルム単独で２回抽出され
た。１／１０容量の３Ｍ酢酸ソーダ（ｐＨ５．２）が該
混合液に添加され、そして３容量のエタノールが該ＲＮ
Ａを沈澱させるために添加された。該沈澱物はそれから
ＴＥバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ〔ｐＨ７．
５〕，１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に溶解された。ゲル電気泳
動のために、各々のレーンに、等しいカウントが負荷さ
れた。該ＲＮＡは６％ホルムアルデヒドを含む１．５％
アガロースゲル上で分離された。ランニングバッファー
は２０ｍＭ ＭＯＰＳ（３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパ
ンスルホン酸〔シグマ（Sigma）〕），５ｍＭ酢酸ソー
ダおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０であった。 【００８２】ＲＮＡはニトロセルロースペーパーに移さ
れた。ｍｉｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡとｌｐｐ ｍＲＮＡに対
して特異的Ｍ１３ハイブリダイズプローブは第１図ｂに
示される１１２−ｂｐ ＸｂａＩ断片を適当な方向にお
いてＭ１３ｍｐ９の中ヘクローン化することによって個
々に組み立てられた。ｏｍｐＡ ｍＲＮＡに対して特異
的なプローブは、１２４５−ｂｐ ＸｂａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ断片（元来はＥｃｏＲＶ−ＰＳＴＩ断片）をＭ１３ｍ
ｐ１０の中へ挿入することによって組み立てられ、そし
て該プローブはラベルされた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 １つのサブクローンまたは１つの遺伝子およ
びそのプロモーター領域を担持している種々なプラスミ
ドを記述する図である。 【図２】 プロモーター領域のヌクレオチド配列と１つ
の遺伝子、正確にはｏｍｐＣ遺伝子の上流とを記述する
図である。 【図３】 本発明の実施によるある種のＲＮＡ間のハイ
ブリッド形成を示す図である。 【図４】 ある種の遺伝子、正確にはｍｉｃＦとｏｍｐ
Ｃ遺伝子間の相同配列を示す図である。 【図５】 ＲＮＡ、正確には本発明において有用でそし
て本発明の実施によるｍｉｃＦＲＮＡの役割に対する可
能なモデルを示す図である。 【図６】 ｍｉｃベクターｐＪＤＣ４０２とｍｉｃ（ｌ
ｐｐ）の組み立てを示す図である。 【図７】 ｍｉｃベクターｐＪＤＣ４０２とｍｉｃ（ｌ
ｐｐ）の組み立てを示す図である。 【図８】 ｏｍｐＣ ｍＲＮＡとｌｐｐｍＲＮＡとの間
の相同を示す図である。 【図９】 ｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子を組み立てるため
に用いられる断片を示す図である。
びそのプロモーター領域を担持している種々なプラスミ
ドを記述する図である。 【図２】 プロモーター領域のヌクレオチド配列と１つ
の遺伝子、正確にはｏｍｐＣ遺伝子の上流とを記述する
図である。 【図３】 本発明の実施によるある種のＲＮＡ間のハイ
ブリッド形成を示す図である。 【図４】 ある種の遺伝子、正確にはｍｉｃＦとｏｍｐ
Ｃ遺伝子間の相同配列を示す図である。 【図５】 ＲＮＡ、正確には本発明において有用でそし
て本発明の実施によるｍｉｃＦＲＮＡの役割に対する可
能なモデルを示す図である。 【図６】 ｍｉｃベクターｐＪＤＣ４０２とｍｉｃ（ｌ
ｐｐ）の組み立てを示す図である。 【図７】 ｍｉｃベクターｐＪＤＣ４０２とｍｉｃ（ｌ
ｐｐ）の組み立てを示す図である。 【図８】 ｏｍｐＣ ｍＲＮＡとｌｐｐｍＲＮＡとの間
の相同を示す図である。 【図９】 ｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子を組み立てるため
に用いられる断片を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 水野 猛
東京都町田市成瀬２−11−３ ポプラケ
丘９−105
(72)発明者 メイ−イン チョウ
アメリカ合衆国 11727 ニューヨーク,
コラム，ホーキンズ ロード イースト
668
(56)参考文献 国際公開83／1451（ＷＯ，Ａ)
ＣＥＬＬ，ＶＯＬ．34 （1983−ＳＥ
Ｐ） Ｐ．683−691
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．非天然のポリヌクレオチド構成物を有する細胞であ
って、該構成物は、遺伝子を有する細胞に存在するとき
にポリヌクレオチド配列を生産するセグメントを有し、
該セグメントは転写プロモーターセグメントと該転写プ
ロモーターにより転写されるＤＮＡセグメントとを含有
し、該ＤＮＡセグメントの転写によりポリヌクレオチド
配列が生産され、そして、該生産されたポリヌクレオチ
ド配列は、該遺伝子によって生産されるＲＮＡ転写物の
少なくとも一部に相補的であり、そして、該ポリヌクレ
オチド配列は該遺伝子の機能を調節する、細胞。 ２．前記セグメントが (a)転写プロモーターセグメント； (b)転写終結セグメント；および、その間に、 (c)転写されたときに、前記遺伝子から生産されるＲＮ
Ａ転写物の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチド
配列を生産するＤＮＡセグメント；を有する、請求項１
に記載の細胞。 ３．前記ポリヌクレオチド構成物がベクターに包含され
ている、請求項１または２に記載の細胞。 ４．前記ポリヌクレオチド配列がリボヌクレオチド配列
である、請求項３に記載の細胞。 ５．前記細胞が微生物である、請求項１ないし４いずれ
かの項に記載の細胞。 ６．前記微生物が細菌である、請求項５に記載の細胞。 ７．前記細胞が大腸菌である、請求項６に記載の細胞。 ８．細胞の中で遺伝子の機能を調節する方法であって、
該方法は、 (a)遺伝子を有する細胞内に存在するときに、ポリヌク
レオチド配列を生産するセグメントを有する非天然のポ
リヌクレオチド構成物であって；該セグメントは転写プ
ロモーターセグメントと該転写プロモーターによって転
写されるＤＮＡセグメントとを含有し、それによって、
該ポリヌクレオチド配列が該遺伝子の機能を調節し得る
非天然のポリヌクレオチド構成物を提供する工程；およ
び、 (b)該構成物を該遺伝子を有する細胞に導入する工程；
を有する方法。 ９．前記セグメントが、 (a)転写プロモーターセグメント、 (b)転写終了セグメント、および、その間に、 (c)転写されたときに、前記遺伝子から生産されたＲＮ
Ａ転写物に相補的なリボヌクレオチド配列を生産するＤ
ＮＡセグメントを有する請求項８に記載の方法。 １０．前記ポリヌクレオチド構成物がベクターに包含さ
れている、請求項８または９に記載の方法。 １１．前記ポリヌクレオチド配列がリボヌクレオチド配
列である、請求項１０に記載の方法。 １２．前記細胞が微生物である、請求項８ないし１１い
ずれかの項に記載の方法。 １３．前記微生物が細菌である、請求項１２に記載の方
法。 １４．前記細胞が大腸菌である、請求項８ないし１３に
記載の方法。
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