JPS60232092A - 遺伝子発現を調節するポリヌクレオチド構築物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の摘要〕 細胞物質もしくは生物体の遺伝物質の遺伝子表現は、該
生物体の遺伝物質のｍＲＮＡと対になりそしてそれと結
合することの出来る一つのＲＮＡへの複写を行なうＤＮ
Ａもしくは他の遺伝物質を細胞物質もしくは生物体の遺
伝物質の中へもしくはそれと共に取シ入れることによっ
て調整されもしくは阻害される。一つの遺伝子の遺伝子
表現もしくは調整は該遺伝子の表現を調整もしくは阻害
するために該遺伝子に関して反対側の方向において一つ
の促進体の後に挿入されるかもしくは位置される該遺伝
子の一つのＤＮＡ断片もしくは複製を表現することによ
って調節される。

〔発明の背景〕

細胞物質もしくは生物体の遺伝物質の遺伝子表現の調節
もしくは調整は科学者の特別な注目を集めそして特種な
状況の下において、組換えＤＮＡおよびその他の手法が
用いられるようになった。

例えば、１９８３年４月２３日に刊行されたＰＣＴ特許
出願ＷＯ３３１０１４５１においては、生物体の一つの
生物学的成分に対するコードを行なうメソセンジャーリ
ボヌクレイツクｒｎＲＮＡの一部と実質的に対をなす塩
基連鎖を有し、望ましくはホスホトリエステル型のオリ
ゴヌクレオチドを用いる一つの手法が開示されている。

このオリゴヌクレオチドは生物体の中へ導入され、そし
て該オリゴヌクレオチドと該メツセンジャーリボヌクレ
オチドとが対をなす性質のために、該二つの成分は適当
な条件下において該メツセンジャーリボヌクレオチドに
よってコードされている生物体の該生物学的成分の合成
を調節もしくは阻害するためにハイプリント化される。

もし該生物学的成分が該生物体の生活力に対してきわめ
て重要なものであれば、該オリゴヌクレオチドは抗生物
質として作用することが出来るであろう。これに関連す
る生物体における遺伝子表現の調整のだめの手法は細胞
（Ｃｅｌｌ　）、第３４巻、第６８３頁（１９８３年９
月）に掲載されている論文の中に記述されている〇ト記
刊行物の開示はこの中に取り入れられ、この開示の部分
をなすものである。上記したようにある遺伝子の表現は
複写の水準に調整されることが出来るということが知ら
れている。複写の調整は蛋白質因子によってネガチプ（
抑制化）にもボジチプ（活性化）にも行われる。ある特
定の蛋白質因子が特定のｍＲＮＡの翻訳を調整すること
もまた知られている。また上記したように、ＲＮＡは、
特定の遺伝子の表現を調整することに従事することが明
らかになシ、そして高浸透圧モル濃度の培地における大
腸菌の培養にもとづいて、外層膜蛋白質（ＯｍｐＦ蛋白
質）に対する遺伝子の表現を阻害する１７４個の塩基か
らなる。Ｊ＼さいＲＮＡ複写が生成されると云うことが
報告されている。日本学会会報（Ｐｒｏｃ　Ｊａｐ、　
Ａｃａｄ、）第５９巻、第３３５〜３３８頁（１９８３
年）、「大腸菌に１２の中の小さなＲＮＡ複写（ｍｉｃ
ＲＮＡ）による遺伝子表現の調整」をみよ。小さいＲＮ
Ａ複写（ｍ　ｉ　ｃ　ＲＮ　Ａ　％即ち対になるＲＮＡ
を妨害するｍＲＮＡ　）によるＯｍｐＦ蛋白質保護の阻
害はシャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒ
ｎｏ　）連鎖および開始コードンを含む約８０個の塩基
の領域にわたって該ｍ１ｃＲＮＡと該ｏｍｐＦｍＲＮＡ
との間にハイブリッドが形成きれることによるものと思
われる。小さい対になるＲＮＡによる同様な調整はまた
Ｔｎ　１０トランスボサーゼに対して記述されている。

細胞（Ｃｅｌｌ）、第３４巻、第６８３〜６９１頁（１
９８３年）ｒＩｓｌｏ互換の翻訳調節」をみよ。しかし
ながらこの場合、トランスポサーゼに対する遺伝子とｍ
１ｃＲＮＡに対する遺伝子は例えば該複写の５′−末端
が対になるハイブリッドを形成することが出来るように
ＤＮＡの同じセグメントを離れた反対側の方向に複４さ
れる。該へイブリッドは該トランスボサーゼｍＲＮＡの
翻訳を阻害するものと考えられている。しかしながら、
トランスポサーゼ位置は該ｏｍｐＦ遺伝子と該ｍ１ｃＲ
ＮＡ遺伝子（ｍｉ　ｃＦ　）とが完全に切シ離されてお
り、そして各々大腸菌染色体上の２１および４７分に地
図がか＼れるｏｍｐＦの位置と対照である。

本発明の目的は、生物体を組み立てている遺伝物質の遺
伝子表現の調整のために有用な手法を提供することにあ
る。

本発明の他の目的は、該生物体を組み立てている遺伝物
質の遺伝子表現に関して特殊な性質を有する変転された
生物体を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、ＤＮＡもしくは該ＤＮＡを含
むプラスミドがその中へ導入されている該遺伝物質の該
ｍＲＮＡと対になシそして結合もしくはハイブリッド化
することの出来る一つのＲＮＡを複写する該ＤＮＡを合
むプラスミドのようなりＮＡもしくは他の遺伝物質を提
供することにある。

本発明のこれらおよび他の目的が如何に達成されるかは
付随する開示からみて、そしてそれに添付される図面を
参照して明らかに々るであろう。

〔発明の要約〕

本発明の実施による細胞物質もしくは生物体の遺伝子表
現は、該生物体もしくは細胞物質の該遺伝物質のｍＲＮ
Ａと対になりそして結合もしくはハイブリ・ソド化する
ことの出来る一つのＲＮＡへの複写を行なうＤＮＡもし
くは他の遺伝物質を細胞物質もしくは生物体の遺伝物質
の中へもしくはそれと共に取り入れることによって調整
、阻害、および（または）調節される。該ｍＲＮＡとの
結合もしくはハイブリッド化にもとづいてｍＲＮＡの翻
訳は、例えば該ｍＲＮＡによってコードされる蛋白質物
質のような生成物が生成されないと云う結果によって妨
げられる。例えば蛋白質のようなｍＲＮＡ翻訳生成物が
生物体もしくは細胞物質の成長にとって極めて重要な場
合において、このように変転され改変された生物体もし
くは細胞物質は少なくとも無能になる。

本発明の実施により遺伝子の表現を調整するために設計
された一つのｍｉｃシステムが組み立テラれた。更に詳
しく述べれば、本発明の実施により大腸菌の中のいかな
る固有の遺伝子の表現を調整するための人工ｍｉｃシス
テムを組み立てることが出来る。

更に本発明の実施により一つの遺伝子に対する一つのｍ
１ｃＲＮＡシステムが該遺伝子からのＤＮＡ小断片を一
つの促進体の後で反対側の方位の中へ挿入することによ
って組み立てられる。このようなシステムはいかなる遺
伝子の表現を明確に調整するだめのこれまでには知られ
ていない方法を提供する。更に詳しく述べれば、特に大
腸菌において具体化されるのであるが、一つの誘起可能
な促進体の調節下において該ｍ１ｃＤＮＡ断片を挿入す
ることによって、不可欠な大腸菌遺伝子の表現が調整さ
れることが出来る。それ故に本発明の実施により、この
ようにして作り出された帰納出来る致命率は不可欠な遺
伝子の研究において有効な道具であろう。

これ以後に、本発明の実施により、人工ｍｉｃシステム
の組み立てと数秤の大腸菌遺伝子を用いるその機能の実
証が記述される。本発明による該ｍｉｃシステムは、固
有原始核遺伝子の表現を調整するための有効な方法であ
る。したがって本発明は真核細胞における生物学的に重
要な遺伝子の同様な調整を成し遂げるための基礎を提供
する。例えば、該ｍｉｃシステムは腫瘍遺伝子およびウ
ィルス遺伝子のような有害々遺伝子の表現を妨害するた
めに、そして有害なもしくけ無害な他のいかなる遺伝子
の表現に実質的に影響を与えるために用いられることが
出来る。

本発明の実施は、イースト、ウィルスを含む原始核およ
び真核細胞もしくは微生物の両方に適用されることが出
来、そして一般的には、表現される遺伝物質を含む生物
体に適用されることが出来る０ したがって、遺伝子表現によって立証されるように、遺
伝的観点から本発明の実施において社、新しい生物体が
容易に生成される。更に、本発明の実施は、正常に作用
することもしくはその中へ特殊な性質を与える能力をな
くし、もしくは不可能にされたこのような生物体を作る
ために、生物体等を組み立てている遺伝物質の遺伝子表
現を改変するたぬの有力な道具または手段を提供する。

本発明の実施において用いられる該ＤＮＡ物質は、例え
ば真核生物体の核の中に直接導入することによシ、また
は原始核化物体の場合では本発明の特殊なりＮＡを含む
プラスミドもしくは適当なベクトルを介し７て処理もし
くは影響されるべき生物体の中へ取シ入れられることが
出来る。

〔詳細な説明〕

本発明の実施の更なる背景を介して、大腸菌の大きい外
層膜蛋白質ＯｍｐＦおよびＯｍｐＣに対する遺伝子の表
現は浸透圧により調整されることが判明した。該ｏｍｐ
Ｃ位置は高浸透圧モル濃度の条件下において二方向性に
複写されることが見出され、そして約１７０個の塩基の
上流の複写ＲＮＡがＯｍｐＦ蛋白質の生成を阻害するこ
とが見出された。このＲＮＡ　（ｍｉｃＲＮＡ）はりボ
ゾーム結合場所と前ＯｍｐＦ蛋白質の最初の９個のアミ
ノ酸残基のコードを行なう領域を含む該ｏｍｐＦ　ｍＲ
ＮＡの５′−末端領域と対になる長い鎖を有する。かく
して、ｍ１ｅＲＮＡはそれとハイブリッド化することに
よってｏｍｐＦ　ｍＲＮＡの翻訳を阻害することが提案
されている。この新規なメカニズムは、ＯｍｐＦとＯｍ
ｐＣ蛋白質の全量が大腸菌中におりていつも一定である
と云う観察の説明をすることが出来る。

大腸菌の大きい外層膜蛋白質ＯｍｐＦおよびＯｍｐＣは
小さい親水性の分子に対する受動的な拡散孔として機能
する不可欠な蛋白質である。これらマトリックスポリン
蛋白質は各々大腸菌染色体上２１および４７分に地図が
かかれる構造遺伝子ｏｍｐＦおよびｏｍｐＣによってコ
ード化される。バクテリア外層膜：生物発生と機能（弁
上。

エム（Ｉｎｏｕｙｅ　、　Ｍ　）による編集）第２５５
〜２９１頁中のリーブス、ピー−（Ｒｅｅｖｅｓ　＊　
Ｐ　−）（ジョン　ワイリーアンドサンズ（Ｊｏｕｎ　
Ｗｉｌｅｙａｎｄ　５ｏｎｓ　）、ニューヨー　り、１
９７９）をみよ。これら遺伝子の表現は培養地の浸透圧
モル濃度によって調整される。両方の蛋白質の厳密な補
償生成が存在し、培養地′の浸透圧モル濃度が増大する
とＯｍｐＦ蛋白質の生成が減少し、一方ＯｍｐＣ蛋白質
の生成は増大し、その結果ＯｍｐＦプラスＯｍｐＣ蛋白
質の総量は一定である。−該ｏｍｐＦおよびｏｍｐＣ遺
伝子のこの浸透圧調整は７４分に地図がか＼れる他の結
合されていない位置、ｏｍｐＢによりて調節される。ホ
ール、エム、：ｒ−ヌ、（Ｈａｌｌ、　Ｍ、　Ｎ、）お
よびシルハピー。

チー、ジエ−，（５ｉｌｈａｖ７．　Ｔ−Ｊ−Ｌ分子生
物学雑誌（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）第１４６巻第
２３〜４３頁（１９８１年）、およびホール、エム、エ
ヌ。

（Ｈａｌｌ、　Ｍ、　Ｎ、　）およびシルハビー、チー
、ジェ−，（５ｉｌｈａｖｙ、　Ｔ、　Ｊ、）＋　分子
生物学雑誌（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）第１５１巻
第１〜１５頁（１９８１年）をみよ。該ｏｒｎｐＢ位置
はｏｍｐＲおよびｅｎｖＺと呼ばれる二つの遺伝子を含
んでいる。両方の遺伝子のＤＮＡ連鎖は測定され、そし
てこれら遺伝子生成物は特徴づけが行われている。ブル
ツェル、イー、チー、（Ｗｕｒｔｚｅｌ　、Ｅ。

Ｔ、）等、生物化学雑誌（Ｊ−Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
　）Ｉ！２５７巻、第１３６８５〜１３９１頁（１９８
２年）および水野、チー（Ｍｉｚｕｎｏ、　Ｔ　）等、
生物化学雑誌（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）第２
５７巻、　ｆ！Ｅ１３６９２〜１３６９８頁（１９８２
年）をみよ。該ＥｎｖＺ蛋白質は一つの浸透圧センサー
としての役割をし、そして培養地からの信号を該Ｏｍｐ
Ｒ蛋白質へ伝える膜受容体蛋白質と考えられている。該
ＯｍｐＲ蛋白質はそれから該ｏｍｐＦおよびｏ　ｍ　ｐ
　Ｃ遺伝子の表現に対するポジティブな調整体としての
役割をする。該ｏｍｐＦおよびｏｍｐＣｍ低Ｃは連鎖さ
せられ、そして広範囲な相同性がそれらのコードしてい
る領域において見出されるが、一方これらの促進体の領
域においては非常に僅かな相同性しか存在しない。本発
明による対になるＲＮＡを妨害するｍＲＮＡ（ｍｉｃＲ
ＮＡ）と呼ばれるＲＮＡの新しい種類によって仲介され
る遺伝子表現の新規な調整メカニズムが発見され明らか
にされたのは該ａｍｐｃ遺伝子の特徴づけの過程におい
てである。ＭｉｃＲＮＡは一つの独立した複写単位（該
ｍ１ｃＦ遺伝子）から生成される。この遺伝子は該ｏｍ
ｐＣｍ低Ｃの上流に直接に位置づけられるが、反対側の
方向に複写される。該１７４−堪基ｍ１ｃＲＮＡはそれ
とハイブリッド化することによ　。

って該ｏｍｐＦｍＲＮＡの翻訳を妨害する。ｍ１ｃＲＮ
Ａの生成はｏｍｐＣｍＲＮＡの生成に比例すると考えら
れるので、この調整メカニズムはＯｍｐＦとＯｍｐＣ蛋
白質の総量を一定に維持するに極めて効果的な方法であ
ると思われる。

ｏｍｐＦ表現を抑制する一つのＤＮＡ断片該ａｍｐｃ促
進体を特徴づけしている間に、核ｏｍｐＣ促進体の上流
に位置づけられている約３００ｂｐの一つのＤＮＡ断片
は、ＯｍｐＦ＋細胞がこのＤＮＡ＠片を抱いている多重
コピーグラスミドによって変転される時に、ＯｍｐＦ蛋
白質の生成を完全に阻害することが判明した。この実験
のために７ラスミドルＭＹ１５０が原ｏｍｐＣクローン
からｐＭＹｌｌｌのＨｐａ１位置をＨｂａ１位置に変換
し次いで第１図の第１図ａ中に記載されるように１１ｋ
ｂ　Ｓａｌ　ｌ断片を除去することによって組み立てら
れた。水野、チー、（Ｍｉｚｕｎｏ、　Ｔ、　）等、生
物化学雑誌（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　）、第２５
８巻、第６９３２〜６９４０（１９８２）をみよ。

第１図においては、該ｏｍｐＣｍ低Ｃのサブクローンの
構造と該ｏｍｐＣ促進体領域を担持している種々のグラ
スミドの構造が示されている。

（ａ）　ｏ　ｍ　ｐ　Ｃ遺伝子のサブクローン化の図式
表示０ｐ　ＢＲ３２２中の２．７Ｋｂ大腸大腸菌体ＤＮ
Ａを担持しているプラスミドｐＭＹ１１１は先に記述さ
れた。該グラスミド（ＤＮＡのｌμｆ　）はＨｐａ　１
によって分解され、そしてＸｂａｌ結合子（ＣＴＣＴＡ
ＧＡＧ　、１５０　ｐ　ｍｏｌｅ）の存在下で再結合さ
れた。かくして、約４００ｂｐ　Ｈａｐｌ断片が除去さ
れ、そして唯一のＸ　ｂ　ａ　１個所が新らしく−作ら
れた（ｐＭＹｌｏｏ　）ｏグラスミドｐＭＹ１００（Ｄ
ＮＡの１μｇ　）は巣に５ａｌｊで分解されそして１．
１　ｋｂ　Ｓａｌ　ｌ断片（ｐＭＹ１５０　）を除去す
るために再結合された。種々のサイズのｏｍｐＣ促進体
断片を得るために、プラスミドｐＭＹ１５０は唯一のＢ
ｇｌ１１個所の開裂の後Ｂａ　ｌ　３１ヌクレアーゼに
よって分解され（第１図すをみよ）、続いて該プラスミ
ドはＸｂａｌ　結合子の存在下に再結　。

合さ熟た。このようにして組み立てられたプラスミドｐ
ＣＸ２８は第１図すに示されるように約３００−ｂｐＸ
ｂａＪ　−ＸｂａＩｒＦｒ片を担持するクローンの一つ
である。

（ｂ）　完全なａｍｐＣ遺伝子を担持するグラスミドｐ
ＭＹ１５０の単純化された限定地図。ｐＢＲ３２２中の
１．８　Ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−８ａｌｊ断片（箱に入
れられている領域）は５′−および３′−非コード領域
のみならず完全なｏｍｐＣコード領域をも含んでいる０
　該ＯｍｐＣ遺伝子の複写は矢印に示される方向に進行
する。二方向矢印はグラスミドｐＣＸ２８に対する削除
されたおよその領域（約６００ｂｐ）を示している。

（ｃ）ａｍｐＣ促進体およびその上流領域から誘導され
たＤＮＡ断片に対する種々のβ−カラクトシダーゼ（ｌ
ａｃＺ）遺伝子融合ニゲラスミド１１５０７−ｂｐ　Ｘ
ｂａｌ　Ｒｓａｌ断片けｐＭＹ１５０から単離され（一
つのＲｓａ　１個所はＡＴＧコードンの丁度下流に存在
する）、そして１ａｃＺ遺伝子を担持しているプラスミ
ドｐｌＮＩＩＩから誘導されるプラスミドｐＩｃＩｌｌ
のＸｂａ　ｌ　−Ｓｍａ　１個所の間に挿入された。該
結合の間、一つのＨｉｎｄＩＩＩ結合子かＲｓａ　ｌと
Ｓｍａｌ　結合個所の間に挿入された。該Ｘｂａｌ　−
Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　ｌ断片はこのようにして組み立てら
れたグラスミドから単離されそしてプラスミドｐｘＭｏ
０５の中へ再挿入されて右側に示されている枠の中の１
ａｃＺ　遺伝子融合を生じた。プラスミドｐＩｃＩｆｌ
とＰＫＭＯＯ５の特色は先に記述された。約４３０−ｂ
ｐ　Ｍｓｐｌ−ＢａｍＨＩ断片を担持しているプラスミ
ドＩＩとＩＶハクローンＩから単離きれ（一つのＩＪ）
ａｍＨｌ　個所はグラスミドＩの中のβ−ガラクトシダ
ーセコード連鎖に対するＡＴＧコードンの丁度下流に存
在する）、そしてＳ１ヌクレアーゼで処理されて短太な
末端を生成した。両端にＸｂａｌ　結合子を添加した後
、このようにして得られたＸｂ　ａ　ｌ　−Ｘｂａｌ断
片は可能な二つの方向においてプラスミドＴ）ＫＭ００
５のＸｂａ１個所に挿入された。プラスミドＩｊｌとＶ
１約３００ｂｐＸｂａｌ　−Ｘｂａｌ　断片はグラスミ
ドｐＣＸ２８から単離され（第１図ａ）そして二つの可
能な方向においてプラスミドｐＫＭ００５のＸｂａｌ　
個所に挿入された。これらプラスミ）”（Ｉ　Ｖ　）は
１ａｃＺ削除系列ＳＢ　４２８８（Ｆ−ｒｅｃＡ　ｔｈ
ｉ　−１ｒｅｌＡ　ｍａｌ　２４　５ｐｃ１２ｓｕｐＥ
−５０ｐｒｏＢ　ｌａｃ　）の中へ変転され、そしてこ
れらのβ−ガラクトシダーゼ活性はマツコンキープレー
ト（Ｄｉｆｃｏ　）上で試験された。結果はＬａｃＺ＋
もしくはＬａｃＺ−とじて示される。

ＯｍｐＦ蛋白質の表現を阻害するこれらクローンの能力
はまたＭｉｃＦ＋もしくはＭｉｃＦ−とじて示されてる
。

得られたプラスミドｐＭＹ１５０（第１図ｂ）はｏｍｐ
Ｃ遺伝子の完全なコード領域とｏｍｐＣ促進体とｏｍｐ
ＣｍＲＮＡ　の５′−末端非翻訳領域をコード化してい
るＤＮＡとを含んでいる上流連鎖の約５００ｂｐを含ん
でいる。種々のサイズのｏｍｐＣ促進体断片を得るため
に、ｐＭＹ１５０が特殊Ｂｇｌ１１個所でＢａ１３１ヌ
クレアーゼによって分解され、次いでＸｂａ）結合子が
添加された。

この方法で組み立てられたプラスミドはＳａｌ　１個所
から最も遠いＸｂａｌ　個所の位置のために種々なサイ
ズを有するＸｂａｌ断片を担持している。

種々なＸｂａｌ断片がそれに続いて一つの促進体断片が
その特殊Ｘ　ｂ　ａ　１個所の右側の方向へ挿入される
時のみ１ａｃＺ遺伝子を表現することが出来る一つの促
進体−クローン化ベクトル、ｐＫＭＯＯ５へと移された
。これらの実験は該ｏｍｐＣ遺伝子の複写は上流Ｘｂａ
１個所（原Ｈｐａ１個所）がら３９０から４４０ｂｐ下
流の間に位置する個所で開始することを明らかにした。

篤ろくべきことには、これらｐＫＭＯＯ５誘導体によっ
て変転された、たった３００ｂｐの最短Ｘｂａｌ　断片
、ＣＸ２８のクローン（ｐＣＸ２８からのサブクローン
化、第１図ａおよびｂ）を含む大腸菌はＯｍｐＦ蛋白質
を生成する活性を失なっていた。ＯｍｐＦ蛋白質は明ら
かに宿主細胞（ｏｍｐＢ”　ｏｍｐＦ＋ｏｍｐＣ”）の
中で生成されるが、一方該ＣＸ２８　断片のクローンを
担持している同じ細胞はＯｍｐＦ蛋白質を生成すること
が出来なかった。同様な効果が例えば第１図Ｃ中のプラ
スミドＩのようなより長い断片のクローンを有している
細胞で観察された。このクローンにおいて、該１ａｃＺ
遺伝子はｏｍｐＣ遺伝子の開始コードンの後に直接に融
合され、その結果このプラスミドを担持している細胞の
ＬａｃＺ＋表現型を生じた。しかしながら８７　ｂｐの
ＸｂａＩ−Ｍｓｐｌ断片がグラスミドＩから除去された
時、得られたプラスミド（第１図Ｃ中の１ラスミドＩＩ
）を担持している該細胞はＯｍｐＦ蛋白質を生成するこ
とが出来た。該ｏｍｐＦ遺伝子の上流領域を含む４３０
　ｂｐの長さの同様なりＮＡ断片はＯｍｐＦおよびＯｍ
ｐＣの両方の蛋白質の生成を妨害しなかったことは注目
されるべきである。

ＣＸ２８とｏｍｐＦ遺伝子との間のＤＮＡ連鎖相同上記
の結果は、該ｏｍｐＣ促進体の上流に位置せられる約３
００ｂｐの長さのＤＮＡの拡が９はｏｍｐＦ　表現を妨
げることが出来ることを示す。

このＤＮＡ断片（ＣＸ２８）の機能を解明するために、
この領域のＤＮＡ連鎖が測定された。

参照は該促進体領域と該ａｍｐｃ遺伝子の上流とのヌク
レオチド連鎖を示す第２図に示されている。ｐＭＹＩＩ
ＩもしくはｐＭＹ１５０から調製された限定ＤＮＡ断片
は〔α−３２Ｐ〕　ｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼ
１大断片（フレナラ断片）を用いて仮封等の方法、ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２８０巻、第２８８〜２９
４頁（１９７９年）、によってこれらの３′−末端にラ
ベルされた。別々に末端ラベルされたＤＮＡ断片は第２
限定酵素によって分解することにより得られた。ＤＮＡ
連鎖は７Ｍ尿素中２０％、１０％および６％ポリアクリ
ルアミドゲルを用いてマキサム（Ｍａｘａｍ　）および
ギルハ）（Ｇｉｌｂｅｒｔ）の方法：酵素学における方
法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第
６５巻、第４９９〜５６０頁（１９８１年）、によって
測定された。該ｏｙｎｐＣ遺伝子の開始コードンのみな
らずＲＮＡホリメラーゼ認識個所（−３５領域）および
ｏｍｐＣとｍ１ｃＦ促進体に対するブリプノーポソクス
（−１０領域）もまた箱に囲われている。複写開始個所
はｏ　ｍ　ｐ　Ｃおよびｍ１ｃＦ遺伝子に対して地図を
作成するＳｌヌクレアーゼによって測定される。

第２図は該ｏｒｎｐＣ遺伝子のＸｂａ（個所（原Ｈｐａ
ｌ）から開始コードン、ＡＴＧＸまでの５００ｂｐのＤ
ＮＡ連鎖を示す。残基８８のＤＮＡ連鎖下流は先に叩定
された。残基９９から１８０までの連鎖（第２図）はシ
ャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ　
）連鎖、開始コードン、および前ＯｍｐＦ　蛋白質（＋
印が付けられた塩基は該ｏｍｐＦ連鎖と相同である）の
最初の９個のアミノ酸残基に対するコードンとを含むｏ
ｒｎｐＦ　ｍＲＮＡ０５′−末端領域と７０％相同性を
有していることが判明した。上記結果を説明するための
考えられ得るモデルでは３００−ｂｐ　ＣＸ２８断片（
第１図Ｃ）がｏｍｐＣｍ低Ｃの領域下流の方へ向けられ
、その結果この領域からのＲＮＡ複写は該ｏｒｎｐＦｍ
ＲＮＡ　と対をなす連鎖を有するところの複写単位を含
む。該二個のＲＮＡ間のハイブリッド化はこのようにし
てＯｍｐＦ蛋白質の生成を妨害する。

新らしい複写単位の存在 該ＣＸ２８断片がｏｍｐＣｍ低Ｃとは反対側の方向に配
位されている１つの独立した接写単位を含むかどうかを
４１１１定するために、該１ａｃＺ遺伝子がＣＸ２８断
片の中で二個のことなった個所で融合された、プラスミ
ドＶにおいて、該ＣＸ２８断片はプラスミドＩＩＩに関
して反対の方向に挿入された（第１図Ｃ）。このクロー
ンはβ−ガラクトシダーゼ（１ａｃＺ−）を生成しない
りれども、ＯｍｐＦ蛋白質の生成の抑制においていまだ
完全に活性であった。融合結合がＭｓｐＩ個所のヌクレ
オチド８８にシフトされる時（第２図、また第１図Ｃを
みよ）、新しく組み立てられたクローン（プラスミドＩ
Ｖ　）はβ−ガラクトシダーゼを生成することが出来た
。しかしながら、このプラスミドはもはやＯｍｐＦ蛋白
質の生成を抑制することが出来なかった。

このプラスミドは１ａｃＺとＣＸ２８連鎖（残基３００
から５００、第２図）の上流で付加ＤＮＡ（約２００ｂ
ｐ）を含んでいるけれども、これはプラスミドＶがＯｍ
ｐＦ蛋白質生成の抑制において完全に活性であるので、
ＣＸ２８断片の機能に影響しない。これらの結果は、該
ｏｍｐＣ遺伝子促進体から独立している該ＣＸ２８断片
の中の複写単位が存在すること、および該ＣＸ２８断片
と該ｏｍｐＣ遺伝子が互いに相違する方向に複写される
ことを示している。プラスミドＮがβ−ガラクトシダー
ゼを生成することが出来そしてプラスミドＮがそれを生
成しないと云う事実は、該ＣＸ２８複写単位が残基１お
よび８８の間で終わることを指唆している（第１図Ｃ）
。事実、非常に安定した幹およびループ構造がオリゴ−
Ｔが後に続くヌクレオチド７０と９２との間に形成され
得る（第２図中文字ａを付した矢印）。この構造は原始
核細胞の中のｐ−因子独立複写終結個所の特性である。

この構造に対するΔＧ値はサルサー、ダブリュー、（５
ａｌｓｅｒ、Ｗ−）＋コールドスプリングハーバーシン
ポジウム、定量生物学（Ｑｕａｎｔ。

Ｂｉｏｌ、）第１３巻第９８５〜１００２頁（１９７７
年）、によって−１２，５Ｋｃａｌであることが計算さ
れた。

該ＣＸ２８複写に対する開始個所はＳｌ−ヌクレアーゼ
マツピングによってヌクレオチド２３７に位置される（
第２図）。この結果は該ＣＸ２８ＤＮＡ断片が複写され
て１７４ヌクレオチドの複写を生成することを示すもの
である。このことは更にノーザーングロットハイブリソ
ド化によって証明された。プラスミドＩＩＩ　（第１図
Ｃ）を担持する細胞から抽出されたＲＮＡ調剤において
、一つのＲＮＡ種が該ＣＸ２８断片とハイブリッド化す
ることが明らかに観察され、そしてそれは５Ｓ　ＲＮＡ
よシ若干遅い速度で移行する。調節細胞において、同じ
ＲＮＡの少量のみが検出された。

該ＲＮＡ（ＣＸ２８　ＲＮＡ　）のサイズはゲル上で約
６８であると見積もられ、それは連鎖（１７４塩基）か
ら見積もられるサイズと非常に良く一致する。

ＣＸ２８　ＲＮＡの機能 前に指摘したように、＃　ＣＸ２８　ＤＮＡ断片はｏｍ
ｐ　Ｆ遺伝子の一部分と広範囲にわたる相同性を有して
いる。かくして、ＣＸ２８ＲＮＡの部分は該ｏｍｐＦ　
ｍＲＮＡと対をなしており、そして第３図に示されるよ
うにｏｍｐＦＲＮＡと非常に安定したハイブリッドを形
成することが出来る。このハイブリッド形成に対するΔ
Ｇ値は−５５，５Ｋｃａｌであると計算された。リボゾ
ーム結合のためのシャインーデルガルノ（５ｈｉｎｅ　
−Ｄｅｌｇａｒｎｏ　）連鎖とコード領域からの２８個
の塩基を含んでいるｏｍｐＦｍＲＮＡの５′−末端不飽
和領域の４４個の塩基は、ハイブリッド形成に関与して
いる。このハイブリッド構造はＣＸ２８ＲＮＡの二個の
安定した幹およびループ構造（一つは３′−末端ｐ−独
立複写終結信号（ループａ）に対し、もう１つは５′−
末端（ループｂ）に位置する）、にょってサンドインチ
されている。ループａとｂに対するΔＧ値は各々−１２
，５および−４，５Ｋｃａｌであると計算された。

図面の第３図を参照すると、そこにはｍ１ｃＦとｏｍｐ
ＦｍＲＮＡとの間のハイブリッド形成が示されている。

ｍ１ｃＦＲＮＡの連鎖は第２図において残基２３７から
６４までの連鎖と一致している。

該ｏｍｐＦｍＲＮＡｍ１ＦＲＮＡ連鎖。

（Ｉｎｏｋｕｃｈｉ　Ｋ、　）等、核酸研究（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ、）第１０巻、第６９５７〜６
９６８頁（１９８２年）、から引用された。第二次構造
ａ１ｂおよびＣに対するΔＧ値は各々−１２，５゜−４
，５および＋２．９　Ｋ　ｃａｌであると計算された。

第３図には他のループ（ループＣ）が示されている。し
かしながらこのループはそのΔＧ値（＋２．９Ｋｃａｌ
）のために形成されそうにもない。ハイブリッドの形成
はｏｍｐＦｍＲＮＡの翻訳を妨げるように思われる。こ
のことは何故にＣＸ２８ＤＮＡ断片を担持しているクロ
ーンがＯｍｐＦ蛋白質の生成を抑制するかを説明するも
のであろう。かくしてＣＸ２８　ＲＮＡはｏｍｐＦに対
するｍＲＮＡ−妨害対ＲＮＡ　（ｏｍｐＦに対するｍ１
ｃＲＮＡ）と称され、そして該遺伝子はｍ１ｃＦと称さ
れる。ループａがｎｔｉ　ｃＦ遺伝子を１ａｃＺ遺伝子
と融合することによって削除される時、該ＭｉｃＦ機能
は消滅される（プラスミドｌｖ、第１図Ｃ）と云うこと
は注目されるべきである。このことはｍ１ｃＦＲＮＡの
安定性のためであるか、さもなければＭｉｃＦ機能に対
するループａの要求のためであろう。

該ｒｎｉ　ｃＦ遺伝子がｏｍｐ　Ｃ遺伝子のようにｏｍ
ｐ　Ｂ遺伝子座の支配下にあるかどうかを調べることは
興味あることのように思われる。参考は第１表に作られ
ている。

種々のｏｍｐＢ　ミュータント系列、ＭＣ４１００（Ｆ
−１ａｃ■１６９．ａｒａＤ１３９．ｒｓｐＬ、ｔｈｉ
Ａ＋目ｂ　Ｂ　＋　ｒ　ｅ　ｌ　Ａ　；ワイルドタイプ
）、ＭＨ１１６０［ＭＣ４１００からのｏｍｐＢｌｏｌ
（ａｍｐＲｌ）ミュータント］ＭＨ７６０ＣＭＣ４１０
０からのａｍｐ　Ｂ４２７（ｏｍｐＢ２）ミュータント
）、ＭＨ１４６１〔ＭＣ４１００からのｔｐｏｌｌ　（
ｅｎｖＺ）ミュータン′ト〕が梅々の促進体−１ａｃＺ
遺伝子融曾クローノによって変転された。細胞は３７℃
で１２のクレット（Ｋｌｅｔｔ）単位で栄養スープの１
０舵中で培養された。該培養地の１００μｔはミジ−，
エイチ。

ジｘ−０（Ｍｉｌｌｅｒ　、　Ｈ，Ｊ、）の方法、分子
生物学の実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ　）（ミラー、エイｆ、
ジェー、〔Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｈ，Ｊ、）編集〕、コール
ドスプリングハーバ−研究所、ニューヨーク（１９７２
年　）第３５２〜３５５頁、によってβ−ガンクトシタ
ーゼ活性測定のために用いられた。プラスミドｐＫ００
４はｐＫＭＯＯ５から誘導され、そしてｐＫＭ００４は
１ａｃＺ遺伝子に融合されている１ｐｐ（外層膜リボ蛋
白質に対する遺伝子）を含んでいる０プラスミドＩとＩ
Ｖは第１図Ｃに記載されている。プラスミドｐｏｍｐＦ
Ｐ−Ａｌ　１ｌ−ｊ：ｏｍｐＦｍ逆Ｆの支配下において
１ａｃＺ遺伝子を含んでいる。

第１表に示されるように、ｍ１ｃＦ支配下のｌ　ａｃＺ
遺伝子（第１図Ｃ中プラスミドＩＶ）はｏｍｐＣ促進体
支配下の１ａｃＺ遺伝子（第１図Ｃ中のプラスミドＩ）
と同様な方法でβ−ガラクトシダーゼを生成する。β−
ガラクトシダーゼの高活性がワイルドタイプとｅｎｖＺ
−系列の両方で見出されだが、ｏｍｐＲｌ−およびｏｍ
ｐＢ２−ミュータントでは低い活性しか観察されなかっ
た。一方、ｏｍｐＦｍ逆Ｆの支配下の１ａｃＺ遺伝子は
ｏｍｐＲｌ−細胞においては表現されなかった。さらに
コントロールとして用いられたリボ蛋白質促進体の支配
下の１ａｃＺ遺伝子はすべての系列において表現された
。

これらの結果は該ｍ１ｃＦ遺伝子が該ｏｍｐＣ遺伝子と
同様な方法においてｎｍｐＢ遺伝子座によ　ｌっで調整
されると云うことを示す。該ｏｍｐＦｍ逆Ｆの支配下の
１ａｃＺ遺伝子がｅｎｖＺ　（Ｏｍｐｃ＋ＯｍｐＦ−）
系列の中に構造的に表現されていると云うことに注目す
ることは興味のあることである０このことはとのｅｎｖ
Ｚ−系列の０ｒｎｐＦ−表現型がｍ１ｃＲＮＡによるｏ
　ｍ　ｐ　Ｆ　ｍ　ＲＮ　Ａの翻訳を阻害しているため
であることを暗示する。

ｍ１ｃＦおよびｏｍｐＣ遺伝子の促進体ｍ１ｃＦおよび
ｏｍｐＣ遺伝子の両方がｏｍｐＢ遺伝子座によって調整
されているように見えるので、これら遺伝子の促進体は
連鎖相同性を有するべきである。相同性に対する調査の
ために、ｏｍｐＣ遺伝子に対する複写開始個所はＳｌ−
ヌクレアーゼマ・ソビングによって第１に測定された。

主な複写開始はＴ残基の４１０および４１１位置で起る
（第２図、また第４図をみよ）Ｃ第４図においては、ｍ
１ｃＦ　とｏｍｐＣ遺伝子の間の相同連鎖が示されてい
る。ヌクレオチドの数は第２図のものと一致する一箱の
中の連鎖は二つの遺伝子の間の相同連鎖を示す。二つの
連鎖間の棒は同一の塩基を示す。矢印は複写開始個所を
示す。−１０と−３５の領域はアンダーラインされてい
る。

かくして、ｍ１ｃＦ　とｏｍｐＣ遺伝子に対する−１０
の領域はＡＡＴＡＡＴ（第２図のヌクレオチド２５０か
ら２４５）およびＧＡＧＡＡＴ（第２図のヌクレオチド
４００から４０５）として各々割り当てられ（第４図）
、その両者は共働連鎖、ＴＡＴＡＡＴと良好な相同性を
示す。ｍ１ｃＦ　とｏｍｐＣ遺伝子に対するＲＮＡポリ
メラーゼ確認個所（−３５領域）はまたＴＡＡＧＣＡお
よびＴＴＧＧＡＴとして各々割り当てられ（第４図）、
その両者は共働連鎖、ＴＴＧＡＣＡと５０係相同性を示
す。しかしながら、６３ｂｐのｍ１ｃＦ促進体（ヌクレ
オチド３００から２３８）とｏｍｐＣ促進体（第２図の
ヌクレオチド３０１〜４０９）との間には重要な連鎖相
同性が見出されない。一方、相同連鎖は第４図に示され
るように両方の複写の５′−末端領域において見出され
る。４４個の塩基から離れた２８個が相同であシ（６４
チ相同性）、そしてこれらの領域は多分ＯｍｐＲ蛋白質
によって認められる個所である。これらの連鎖と相同で
ある一つの連鎖はまたｏｍｐＦｍＲＮＡの５′−末端非
翻訳領域において見出されることに注目するととは興味
あることである。ｍ１ｃＦ遺伝子とｏｍｐＣ遺伝子とを
精製されたＯｍｐＲ蛋白質によって結合する実験が現在
進められている。

上記のように、大腸菌中の遺伝子表現の調整は複写のレ
ベルで一般に調節される。いくらかの遺伝子の表現はこ
れらに個有の抑制体によって抑制され、これらに個有の
誘引体によって活性化される。例えばｃＡＭＰ受容体蛋
白質およびＯｍｐＲ蛋白質のようなポジティブな蛋白質
因子はまた複写のレベルで遺伝子表現を調整することが
知られている。他の複写調整機構が他の化合物の種々な
アミノ酸の生合成に含まれる操作の表現を調節すること
において重要な役割を果している減衰である。コルター
、アー／に、（Ｋｏｌｔｅｒ、Ｒ，）およびヤノ７スキ
ー、シー、　（Ｙａｎｏｆｓｋ７＋　Ｃ−）、遺伝学展
望年刊雑誌（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　）第１
６巻第１１３〜１３４頁（１９８２年）をみよ。

加うるに１ある種の蛋白質は翻訳のレベルで遺伝子表現
を調整することが示された。その結果はここに翻訳出発
領域と対になるＲＮＡ因子による翻訳のレベルでバクテ
リアの遺伝子表現の調整を示す。ｍ１ｃＲＮＡによって
仲介せられるこの新規な調整機構は第５図に示されてい
る。

第５図はｍ１ｃＦ　ＲＮＡの役割の可能なモデルを示す
ものである。ＯｍｐＲ蛋白質は低浸透圧モル濃度下にお
いてｏｍｐＦ遺伝子と結合し、そしてＯｍｐＦ蛋白質の
生成を促進する。高浸透圧モル濃度下においては、Ｏｍ
ｐＲ蛋白質はｍｉ　ｃＦおよびｏｍｐＣ遺伝子の両方に
結合する。かくして生成されたｍ１ｃＦ　ＲＮＡは６　
ｍ　ｐ　Ｆ　ｍｍＲＮＡとハイブリッド化してその翻訳
を制止する。

ｍ１ｃＲＮＡが翻訳のレベルでｏｍｐＦ遺伝子の表現を
抑制する可能性はありえないとされてきた。

しかしながら、該ｏｍｐＦ促進体と融合される１ａｃＺ
遺伝子はｅｎｖＺ−細胞（ＯｍｐＣ”ＯｍｐＦ−：第１
図）の中に表現されたのでこのことは殆んどありそうに
ないことになる。この場合は、１ａｃＺ表現は恐らくク
ローンから複写された１ａｃＺｍＲＮＡがｍ１ｃＲＮＡ
と安定したハイブリッドを形成することが出来ないため
であろう。

更にもしｍ１ｃＲＮＡがｏ　ｍ　ｐ　Ｆ遺伝子の無意味
ならせんと結合することが出来るならば、結合がＲＮＡ
ポリメ２−ゼにもっと接近し得るｏｍｐＦ遺伝子を作る
であろうから、遺伝子表現を妨げるよりはむしろ活性化
させることの方がよりありそうなことである。

ｍ１ｃＲＮＡによる調整は他の蛋白質生成を妨けること
なくして固有の蛋白質の生成を妨げるのに非常に効果的
な方法であるように思われる。現在、ｍ１ｃＲＮＡとｏ
ｍｐｃとの間の相対的比率は知られていない（第１表の
β−ガラクトシダーゼ活性は、促進体領域が同じ様相で
挿入されなかったので（第１図Ｃをみよ）、それらの正
確な促進体活性を当然反映してはいない）。

しかしながら、ｍ１ｃＲＮＡとｏｍｐＣが対等に生成さ
れると仮定することは理由のあることである。それ故忙
、ＯｍｐＣ蛋白質が生成される時、ｍ１ｃＲＮＡが同様
な方法で生成される。

ｍ１ｃＲＮＡはそれからＯｍｐＦ蛋白質を比例的に妨害
して、その結果ＯｍｐＣプラスＯｍｐＦ蛋白質の総量は
一定になる。

リボゾーム結合個所と開始コードンへのｍ１ｃＲＮＡの
結合は特殊ｍＲＮＡの翻訳を妨けるために非常に効果的
な方法である。同様なメカニズムがバクテリオファー？
Ｔ７のミュータントの中の翻訳の妨害を説明するために
提供されている。ミュータン）　ｍＲＮＡの３−末端の
連鎖はそれ自身のりボゾーム結合個所とハイブリッド化
して翻訳を妨けることを暗示した。斉藤、エイチ。

（５ａｉｔｏ、Ｈ，）およびリチャードンン、シー。

シー−（Ｒｉ　ｃｈａｒｄｓｏｎ、　Ｃ，Ｃ，）、細胞
　。

（Ｃｅｌｌ）第２７巻、第５３３〜５４２頁（１９８１
年）をみよ（、ｍ１ｃＲＮＡ調整システムが大腸菌にお
いて、そして真核細胞を含む他の生物体において一般的
な調整現象であろうことは理由のあることと思われる。

一つの蛋白質の形成を非常に急速に停止すること、もし
くは一つの蛋白質の比率を他のもので調節することは特
に好ましいメカニズムである。ＲＮＡ種は種々の細胞活
性の調整において付加的な役割を有するであろう。

事実、小さいＲＮＡ種はある種のプラスミドのＤＮＡ複
製の調整を行なうことが示されている。

付随する開示の見地において、本発明の実施によって遺
伝子表現を調整するための有力な道具と手法が提供され
る。本発明の実施による遺伝子表現は、その生来の遺伝
物質のみを所有するかまたは生来の遺伝物質の削除もし
くは外来遺伝物質、即わち、該生物体もしくは細胞物質
の遺伝物質とを併なう複写にもとづいて該生物体もしく
は細胞物質の遺伝物質によって生成される一つのｍＲＮ
Ａと対をなしそして（または）それとハイブリッド化す
ることが出来、その結果該ＲＮＡの表現もしくは翻訳が
阻害もしくは妨害せられるオリゴリボヌクレオチドもし
くはポリリボヌクレオチドＲＮＡを生成するところのＤ
ＮＡの付加によって遺伝的に改変せられた一つの生物体
もしくは細胞物質の遺伝物質に取り入れるかもしくはそ
れと結合することによって調整される。

本発明の実施による生物体もしくは細胞物質の遺伝子表
現の調整は、変転された生物体もしくは細胞物質の中で
行われ、それにおいては、該生物−体もしくは細胞物質
の遺伝物質を併なって該生物体もしくは細胞物質の遺伝
物質を併なう複写にもとづいて該生物体もしくは細胞物
質の遺伝物質によって生成された一つのｍＲＮＡと対に
なるかもしくはそれと結合もしくはハイブリッド化する
ことが出来、その結果該ｍＲＮＡの表現もしくは翻訳が
阻害もしくは妨害せられる一つのオリゴリボヌクレオチ
ドもしくはポリリボヌクレオチドＲＮＡを生成するとこ
ろのＤＮＡをその中に取シ入れるかもしくはそれと結合
する。

本発明の実施において、ＤＮＡ物質もしくは分子を含む
変転された生物体もしくは細胞物質における複写にもと
づいて該生物体もしくは細胞物質の遺伝物質によって生
成されるｍＲＮＡと対をなし、そして（または）それと
結合もしくはハイブリッド化することの出来るオリゴリ
ボヌクレオチドもしくはポリリボヌクレオチドを生成す
るところのＤＮＡ物質もしくは分子は、該生物体の遺伝
物質に取り入れられもしくは結合され、その結果該生物
体もしくは細胞物質を該ＤＮＡ物質もしくはその分子自
体と直接に変転させることによって、もしくは一つのプ
ラスミドもしくはウィルスもしくはウィルスベクトルの
中に該ＤＮＡ物質を取り入れそれから該生物体もしくは
細胞物質を該プラスミドおよび（または）ウィルスベク
トルで変転することによって変転される。該ＤＮＡ物質
もしくは分子は該生物体もしくは細胞物質の遺伝物質を
含む核の中に直接挿入されるであろう。該生物体もしく
は細胞物質の変転をもたらす該ＤＮＡ物質もしくは分子
は、該生物体を特徴づける遺伝子または染色体ＤＮＡと
の関連において該生物体もしくは細胞物質の細胞質もし
くは流動性内容物の中へ生物体の膜を通して挿入される
であろう。簡便さと実際上のために望ましいことである
が、該ＤＮＡ物質もしくは分子を該生物体もしくは細胞
物質、例えば該生物体の核もしくは細胞質の中に挿入し
て変転させるためにマイクロ注射が用いられる。それは
該ＤＮＡ物質もしくは分子を該生物体もしくは細胞物質
の遺伝物質に取シ入れるかそれと結合して該生物体もし
くは細胞物質を取り囲む膜を通して該ＤＮＡ物質もしく
は分子を移すことによって変転させるために通常便利な
ものである。

人工Ｍｉｃ遺伝子の組み立て 該ｍｉｃ遺伝子はＯｍｐＦ蛋白質の生成を妨げる一つの
１７４＝塩基ＲＮＡを生成する０この小さなＲＮＡは二
つの幹およびループ構造（一つは３′−末端、もう一つ
は５′−末端）を有する０これらの構造は該ｍ１ｃＲＮ
Ａの機能に対する重要な役割を果たすものと考えられる
ので、一つの誘引可能な表現ベクトルにおいてクローン
化せられる大きい外層膜リポプロティンに対する遺伝子
を用いる人工ｍｉｃ　システムの組み立てにおけるこれ
らの特徴を用いることが試みられた０中村等「大腸菌の
りボブロチイン遺伝子を用いた多方面の表現クローン化
媒介物の構造」酵素生物学雑誌（ＥＭＢＯ，Ｊ、　）第
１巻、第７７１〜７７５頁（１９８２年）をみよ。ｐＩ
Ｎベクトルはリポ蛋白質促進体の１ａｃｐＯ下流を有す
る高度表現ベクトルであシ、かくして一つの挿入された
遺伝子の高レベルの誘起可能な表現が出来るようになる
。ｐＩＮ促進体はＩＰＩ）遺伝子において、ｌｐｐｍＲ
ＮＡのシャインーダルガルノ（５ｈｉｎｅ　−Ｄａｌｇ
ａｒｎｏ　）連鎖の直接上流の特殊Ｘｂａ　１個所に融
合された０得られたグラスミドはｐＹＭ１４０　として
示された。

ｐＹＭ１４０の中の１ｐｐ遺伝子の表現がイソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトシド（Ｉ　ＰＴＧ　）、一つの
ｌａｃ誘起体、によって誘起される時、　ｘｐｐ遺伝子
から誘導されるＲＮＡ複写は可能な幹およ゛　びループ
構造（５′−末端に）を有する。特殊Ｘｂａ１個所の直
接上流はその３′−末端でのもう−）　つの安定した幹
およびループ構造である。後者のループはｌｐｐ遺伝子
のｐ−独立複写終結信号から誘導される。一般的なｍｉ
ｃ　クローン化ベクトル、ｐＪＤｃ４０２の組み立ては
、第６図Ａに示されるように二つのループの間のｐＭＨ
Ｏ４４中のＤＮＡ断片を除去することによって達成せら
れる。

終結個所の直接上流のＲｓａＪ儒所は、ｐＹＭ１４０の
部分的分解に続いてＥｃｏＲＩ結合子を挿入することに
よってＥｃｏＲ１個所に移された。得られたグラスミド
、ｐＭＨＯ４４はＥｃｏＲＩで部分的に分解せられ、続
いてＸｂａｌで完全に分解された。線状ＤＮＡ断片の単
一らせん部分はＤＮＡポリメラーゼＩ（大きい断片）に
よって充たされ、それからＴ４ＤＮＡ！ｊガーゼで処理
されて、その結果ＸｂａｌとＲｓａ１個所の間に断片を
有しないプラスミド、ｐＪＤｃ４０２が形成された。こ
の方法の結果として、ＥｃｏＲｌとＸｂａｉ個所の両方
が結合点で再生産された。かくして唯一のＸＢａ１個所
はいかなるＤＮＡ断片に対する挿入個所としての役割を
果たし、そして人工ｍｉｃ遺伝子からのＲＮＡ複写は該
ｍ１ｃＲＮＡと似た構造を有するＲＮＡを生成する。挿
入されるＤＮＡから誘導される部分は二つのループ構造
（その一つは５′そしてもう一つは３′−末端）によっ
てサンドイッチされる。

以下に第６図Ａおよび第６図Ｂのより詳細な説明を行な
う。ｐＪＤｃ４０２の組み立てにかかる第６図Ａに示さ
れるように、限定個所は下記の通りに示される□　Ｘ＋
　Ｘｂａ　ｌ　：　Ｐ＋　Ｐｖｕ　ＩＩ　ｅ　Ｅ＋Ｅｃ
ｏＲ１，１ｐｐｐおよび１ａｃｅ’は各々リポ蛋白質促
進体およびラクトーズ促進体操作子である。

Ａｍｐｒはアンピシリン限定遺伝子である０交差平行線
はリポ蛋白質促進体を表わす。黒丸はラクトーズ促進体
操作子を表わす。斜線はリポ蛋白質信号連鎖を表わし、
そして点棒はリポ蛋白質の成熟した部分に対するコード
領域を表わす。白丸はＩＰｐ遺伝子から誘導される複写
終結領域を表わす。内棒はリボ蛋白質ｍＲＮＡの５′非
翻訳領域を表わす。

ｍ１ｃ（１ｐｐ）ｐＪＤｃ４１２の組み立てに７ｆ）−
＼る第６図Ｂにおいて、白矢印は促進体を表わす。該ｐ
ｖｕｌＩ個所はＸｂａｌ結合子（ＴＣＴＡＧＡＧ）を挿
入することによってＸｂａ１個所に変換される。

この断片はｐＪＤｃ４１２　を形成する逆向き方向にお
いてｐＪＤｃ４０２の特殊Ｘｂａ１個所の中に挿入され
た。ａおよびｂは各々ｌｐｐ　と　ｌａ、ｃ促進体の位
置で開始するｍ１ｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡを示す。

ｍ１ｃ（ｌｐｐ）遺伝子の組み立て このｍｉｃクローン化ベクトル、ｐＪＤｃ４０２を用い
て、ｍ１ｃ（１１）ｐ）遺伝子の誘導にもとづくリポ蛋
白質の合成を阻害するために大腸菌のｌｐｐ遺伝子に対
するｍｉｃシステムを作ることがまず第一に試みられた
。この目的のために、リホヅーム結合のだめのシャイン
ーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）連鎖を
含むＤＮＡ断片と前リポ蛋白質の最初の数個のアミノ酸
残基に対するコード領域を先づ単離することが必要であ
る０これを行なうために、前リポ蛋白質信号ペプチドの
コード領域の直接後のＰｖｕ１１個所はこの位置にＸｂ
ａｌ結合子を挿入することによってＸｂａ１個所に移さ
れた。得られたプラスミドはそれからＸｂａｌで分解さ
れ、そして１１２＝ｂｐＸｂａ　１−Ｘｂａｌ　（元来
Ｐｖｕｌｌ　Ｘｂａｌ）断片は精製された。シャインー
ダルガルノ（５ｈｉｎｅ　−Ｄａｌｇａｒｎｏ）連鎖と
前リポ蛋白質のアミノ基末端からの最初の２９個のアミ
ノ残基に対するコード領域を取シ囲むこの断片が精製さ
れた。この断片はそれから正常１ｐＰ遺伝子から反対の
方向でｐＪＤｃ４０２特殊Ｘｂａ１個所の中へ挿入され
た。得られたグラスミドはｐＪＤＣ４１２として示され
、　ＩＰＴＧでの誘起にもとづいてｍ１ｃ（ｌ　ｐＰ）
ＲＮＡ、ＩＰＩ）ｍＲＮＡと対になる一つのＲＮＡ複写
を生成することが出来る０ 該ｍｉｃ嚢現ベクトル、ｐＪＤＣ４０２のもう一つの重
要な特徴はＩＰＰ促進体の直接上流のＨｉｎｆ１個所と
複写終結個所の直接下流のもう一つのＨｉｎｆ１個所と
を含むことであることが指摘されるべきである。これら
二つのＨｉｎｆ１個所はベクトルの特殊ＰｖｕＩＩ個所
の中に挿入されることが出来る完全なｍｉｃ複写単位を
含むＤＮＡ断片を除去するために用いられることが出来
る０このようにして、完全なｍｉｃ遺伝子は単一グラス
ミド中に複製せられることが出来る０２つの同一なｍｉ
ｃ遺伝子を含むプラスミドが、単一のｍｉｃ遺伝子を含
むプラスミドに比べて２倍のｍ１ｃＲＮＡを生成すると
云うことが予想される。このプラスミドは二つのｍ　ｉ
　ｃ　（ｌ　ｐｐ　）遺伝子を含んで組み立てられｐＪ
ＤＣ４２２として示された。

ｍｉｃ遺伝子の表現 人工ｍｉｃ　（Ｉｐｐ）　ＲＮＡの効力を試験するだめ
に、ｍ１ｃ（１ｐｐ）ＲＮＡの２ｍＭＩＰＴＧによる誘
起の１時間後に細胞は（３５ｓ）−メチオニンで１分間
パルスラベルされた。ベクトル、ｐ　ＪＤＣ４０２を有
している該細胞は放射線写真の濃度測定走査および標準
化によって定量されだのであるが、誘起体、ＩＰＴＯの
不存在下もしくは存在下のいづれにおいても同量のリポ
蛋白質を生成する。

リボ蛋白質の生成はＩＰＴＧの不存在下でｐＪＤＣ４１
２を担持している細胞の場合の約２倍、そし）　てＩＰ
ＴＧの存在下では約１６倍減少した。

ＩＰＴＧの不存在下でのリポ蛋白質合成の減少は、ｍ１
ｃ（１１）ｐ）遺伝子の不完全な抑制のためであると考
えられる。ｍ１ｃ（ｌｐｐ）　遺伝子が複製されたｐＪ
ＤＣ４２２を担持する細胞の場合では、リポ蛋白質生成
がＩＰＴＧ不存在下では４倍、ＩＰＴＧ存在下では３１
倍減少される。これらの結果は、人工ｍｉｃ　（ＩＰｐ
）ＲＮＡの生成がリボ蛋白質生成を阻害していること、
そして該阻害が生成されるｍｉｃ　（ＩｐＰ　）　ＲＮ
Ａの量と比例することを明らかに示している。該ｍｔｃ
　（ＩｐＩ’　）　ＲＮＡｔｉ特異的にリボ蛋白質の生
成を妨害していること、およびそれはＯｍｐＣ蛋白質を
除いては他のいかなる蛋白質の生成をも妨害しないこと
は注目されるべきである。該ｍｉｃ　（ｘｐｐ　）遺伝
子の誘起がＯｍｐＣプラスＯｍｐＦ蛋白質の生成を減少
すると云う事実は、以下に検討されるように１ｐｐとｏ
　ｍ　ｐ　Ｃ遺伝子との間の通常ではない相同性のため
であることが判明した。

ｍｉｃ阻害が惹起されるいくつかのメカニズムがある。

一つのメカニズムは、該ｍ１ｃＲＮＡはりボゾームがｍ
ＲＮＡと結合することを阻止しているｍＲＮＡと結合す
ることである。その他の可能なメカニズムは、ｍＲＮＡ
の不安定化、複写の早過ぎる終結または複写の開始の阻
害のために起こるｍＲＮＡの減衰を含む。該ｍ１ｃＲＮ
Ａの阻害効果が単に減衰もしくは複写開始のレベルであ
ったならば、該ｍｉｃ効果は該リボ蛋白質ｍＲＮＡの機
能の半減期は１２分であると云う事実のために、幾分か
は延ばされることが予期せられるであろう。

それ故に、ＩＰＴＧによる誘起の後の程々な時点ノ においてｐＪＤｃ４１２を有しているパルスラベルされ
た大腸菌ＪＡ２２１／Ｆ’　１ａｃＩｑによるｍ１ｃ（
ｌｐｐ）ＲＮＡの誘起にもとづいて、いかに迅速にリボ
蛋白質生成が阻害されるかが測定された。

リボ蛋白質生成はＩＰＴＧ添加後５分以内で最大１６倍
にまで阻害された。この結果は、リボ蛋白質生成の阻害
が最初はｍ１ｃ（Ｉｐｐ）ＲＮＡのＩｎｐｍＲＮＡに対
する結合のためでちり、該結合は結果としてｌｐｐｍＲ
ＮＡの翻訳の阻害および（まだは）ｍＲＮＡの不安定化
を惹き起すことを示している。

ｍ１ｃ（ｌ　ｐｐ）ＲＮＡの存在下でのｌｐｐｍＲＮＡ
生成該ｍ１ｃＦ遺伝子の表現が実質的に該ｏｍｐＦｍＲ
ＮＡの量を減少させるので、該ｒｎｉｃ　（ｌｐｐ　）
ＲＮＡがまた該ｌｐｐｍＲＮＡのレベルに影響するかど
うかを試験することは興味のあることのように思われる
。この目的のために、該ｍ１ｃ（ｌｐｐ）遺伝子をＩＰ
ＴＧで誘起した１時間後に全細胞ＲＮＡが単離された。

該ＲＮＡ調剤はホルムアルデヒドアガローズゲル中での
電気泳動に続いてニトロセルロースペーパー上への移行
を行なった後に分析された。該ペーパーはそれから該ｍ
１ｃ（ｌ　ｐｐ）ＲＮＡもしくは該１　ｐｐｍＲＮＡに
対して固有な一つのグローブによってハイブリッド化さ
れた。該ｏｍｐＡ　ｍＲＮＡに対して固有な一つのプロ
ーブもまた内部コントロールとして用いられた。

ＩＰＴＧの不存在下もしくは存在下において、ｐＪＤＣ
４０２がもはやｌｐｐｍＲＮＡの生成にいかなる相違も
示さない。これらの実験のための該グローブを作るため
に用いられた二重らせん構造のプライマ−はｌａｃオペ
ロンの一部を含むと云う事実のために、該プローブは、
例えばＪＤＣ４１２からのｍ１ｃ（Ｉｐｐ）ＲＮＡ　お
、ｔびｐＪＤｃ４０２　Ｏ短い無意味な複写のよりなＩ
ａｃ促進体を含むいかなる複写ともハイブリッド化する
。　ｐＪＤｃ４１２を有する細胞はＩＰＴＧの不存在下
では該ｌｐｐｍＲＮＡの減少された量を含み、ＩＰＴＧ
の存在下ではｌｐｐｍＲＮＡの大巾に減少された量を含
む。ｐＪＤｃ４１２を宿している細胞中のＩＰＴＧの不
存在および存在下において該ｍ１ｃ（ＩｐＰ）ＲＮＡの
生成が示された。

それ故に、ＩＰＴＧの不存在下においても、該ｍ１ｃ（
Ｉｐｐ）ＲＮＡの可成りの量が生成され、そしてそれは
以前に観察されたリボ蛋白質生成の結果と一致している
。該ｍ１ｃ（ＩＰｐ）ＲＮＡの誘起によってｌｐｐｍＲ
ＮＡが消滅すると云う事実は、該ｍ１ｃＲＮＡの作用の
メカニズムが単に翻訳のレベルにとどまらないことを示
している。試験はことなったサイズの二つのｍ１ｃ（ｌ
ｐｐ）ＲＮＡが存在することを示した。これら複写のサ
イズは２８１がら１９７個の塩基であると定められ、そ
してそれはリポ蛋白質促進体（大きい方のＲＮＡ　）で
の開始およびｌａｃ　促進体（小さい方のＲＮＡ　）で
開始する複写と一致する。

ｍｉ　ｃ　（ａｍｐｃ　＞遺伝子によるＯｍｐＣ生成の
阻害人工的に組み立てられるｍｉｃ（ａｍｐｃ）遺伝子
によってＯｍｐＣ合成の殆んど完全な阻害を達成するこ
とがまた可能であった。二つのｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝
子を担持する第１次構造（ｐＡＭ３２０　）は該ｏｍｐ
ＣｍＲＮＡの指揮領域の２０個のヌクレオチドおよびコ
ード領域の１００個のヌクレオチドと対になる一つのＲ
ＮＡ分子のもとになる。このことはａｍｐｃ構造遺伝子
中の特殊Ｂｇｌ１１個所およびＡＴＧ開始コードンの上
流の２０個のヌクレオチドをＸｂａ１個所に移すことに
よって達成された。得られた１２８−ｂｐＸｂａｌ断片
はそれから該ＯｍｐＣ遺伝子とは逆の方向のｐＪＤｃ４
０２の中へ挿入され、そして該ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝
子の第２コピーは、ｐＪＤ０４２２組み立てに対して記
述されたと同様な方法で導ひかれた。得られたプラスミ
ド（ｐＡＭ３２０　）は第１のものと反対側の方向に挿
入される第２ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子を有する。第２
ｍ１ｃ　遺伝子の配位を逆にすることはプラスミドの表
現もしくは安定性を変化させなかった。第２次構造ＰＡ
Ｍ３２１．　はｍ　ｆ　ｃ　ＲＮＡとｏｒｎｐＣｍＲＮ
Ａとの間の相補性を拡大して、ｐＡＭ３２０の場合より
も長い指揮連鎖、２０個の代９に７２個のヌクレオチド
の指揮領域を含むように設計されたものである。このプ
ラスミドは、Ｘｂａ１個所に移されたＭｎ１１個所にｏ
ｍｐＣ開始コ開始コード流７２個のヌクレオチドｂｐが
位置せられたことを除いては、ｐＡＭ３２０に対して記
述されたと同様に組み立てられた。

ｍｉｃり０−：／’Ｚり）ルｐＪＤＣ４０２，ｐＡＭ３
２０およびｐＡＭ３２１を有している大腸菌ＪＡ２２１
／Ｆ’１ａｃｌｑから単離された外＃膜蛋白質のコマッ
シー　ブリリアント　ブルー（ＣｏｍｍａｓｓｉｅＢｒ
ｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）染色ゲルパターンが得られ
た。ＩＰＴＧの添加の効果が、β−カラクトシダーゼの
出現によって明らかにみられた。ｐＡＭ３２０からのｍ
ｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡの誘起はｐ　ＪＤＣ４０２と比
較して、Ｏｍｐｃ生成における実質的な減少（約５倍）
を惹起こした。ｐＡＭ３２１からの長い方のｍｉｃ（ｏ
ｍｐＣ）ＲＮＡ　の誘起はＯｍｐＣの合成をよシドラマ
チックに減少した（１）ＪＤＣ４０２と比較して約２０
倍）。ＯｍｐＣ生成はそれらがＩＰＴＧでの１時間誘起
の後１分でパルス−ラベルされた時、ｐＡＭ３２１を有
する細胞において殆んど検出されることが出来なかった
。同様な実験−においてＯｍｐＣ合成は、ｐＡＭ３２０
を有する細７、胸中のｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子がＩＰ
ＴＧで誘起された時約７倍減少した。ＯｍｐＣ表現の著
しい減少はまたｍｉｃ（ｏｍｐＣ＞遺伝子の単一コピー
を含むプラスミドが誘起された時観察された。また長い
方のｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子はよシ大きな効果を有し
ていた。ｐＡＭ３２０　によるｍ１ｃ＝媒介阻害の増大
された効率は該ｍｌｃＲＮＡ機能の効力がｍＲＮＡの５
′−末端と対になる拡がシと関連していることを示すで
あろう。

上記の該ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡのいずれかの合成が
ＯｍｐＣ合成のみならずリポ蛋白質合成の減少をも惹起
すことに注目することは興味あることであった。リポ蛋
白質生成における該ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡのこの阻
害効果は、第７図に示されるようにｌ’ｐｐ、ｍＲＮＡ
連鎖とｏｍｐＣｍＲＮＡとの間の予期せざる相同性によ
るものであると思われる。この特徴は、何故ｐ　ＡＭ３
２０とｐ　ＡＭ３２１がリポ蛋白質生成に対するｍｉｃ
効果を働かせているかを説明するものである。このよう
な説明は、ｐＪＤＣ４１２とｐＪＤＣ４２２からのｍ１
ｃ（ｌｐｐ）ＲＮＡの誘起がＯｍｐＣ蛋白質の合成を減
少する筈であることを予言し、そしてこのことはその場
合であることが見出された。

第７図において、ｌｐｐｍＲＮＡ（最上線）とｏｍｐＣ
ｍＲＮＡ（最下線）との間の相同領域が示されている。

棒は同一の塩基を結んでいる。両方のｍｉｃ（ｏｍｐＣ
）ＲＮＡはこの相同領域を横断してハイブリッド化する
能力を有する。該シャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−
Ｄａｌｇａｒｎｏ）連鎖（Ｓ。

Ｄ）とＡＵＧ開始コードンは箱で囲われる。

ｍｉ　ｃ　（ｏｍｐＡ　）　ＲＮＡによるＯｍｐＡ生成
の阻害いかなる成分がｍ１ｃＲＮＡの効力に寄与するか
を測定する努力において、いくつかのｍｉｃ遺伝子が該
ｏｍｐＡ遺伝子から組み立てられた。該ｏ　ｍ　ｐ　Ａ
　ｍＲＮＡの指揮体とコード領域が広範囲にわたって特
徴づけられていたので、該ｏ　ｍ　ｐ、Ａ遺伝子はこの
ことのために選択された。５個のＤＮＡ断片（第８図の
１からＶをみよ）は、’ｒｎ　ｉｃ　（ｏｍｐＡ　）Ｒ
ＮＡの生成を促進する方向でｐＪＤｃ４０２のＸｂａＩ
個所の中へ個別的にクローン化された。結果として得ら
れた断片Ｉ−Ｖを含むｍｉ　ｃ　（ｏｍｐＡ　）プラス
ミドは、各々ｐＡＭ３０１．ｐＡＭ３０７＋　ｐＡＭ３
１３、ｐＡＭ３１４．　およびｐＡＭ３１８として示さ
れた。各々のプラスミドは記述されたｍｉｃ　（ｏｍｐ
Ａ）・遺伝子の唯一っのコピーを含む。

第８図において、最上線は大腸菌ｏｍｐＡ遺伝子の構造
を示す。矢印は促進体を表わし、白色棒は該ｏｍｐＡ　
ｍＲＮＡの５′−指揮領域をコード化する領域を表わす
。斜線を付した棒および影を付けた棒は各々信号連鎖と
成熟したＯｍｐＡ蛋白質とをコード化する。ｍｐＡ遺伝
子の部分を表わす。

限定断片１　（ＨｐｈＩ−ＨｐａＩ）は、ｍ１ｃ（１ｐ
Ｐ）に関する第６図Ｂにおいて略図がか＼れているよう
に、こ＼に記されたところから反対側の方向においてｐ
ＪＤｃ４０２のＸｂａＩ個所の中に挿入されて（第６図
Ａをみよ）、プラスミドｐＡＭ３０１を作る。他のｍｔ
　ｃ　（ｏｒｎｐＡ　）プラスミドは同様に、断片ＩＩ
、ｐＡＭ３０７；断片ＩＩＩ、ｐＡＭ３１３　：断片Ｉ
Ｖ、ｐＡＭ３１４　；断片Ｖ、ｐＡＭ３１８　がら組み
立てられた。シャインーダルガルノ（５ｈｉｎｅ−Ｄａ
　Ｉｇａｒｎｏ　）連鎖（ＳＤ）、ＡＴＧ開始コードン
（ＡＴＧ）、および関連する限定個所の位置が示されて
いる。

該ｍｉ　ｃ　（ｏｍｐＡ　）プラスミドの各々を含む大
腸菌ＪＡ２２１／Ｆ’１ａｃＩｑは、ＩＰＴＧによる１
時間先の前装置を行なうがまたは行なうことなくして〔
３５Ｓ〕−メチオニンで１分間パルスーラペルされた。

これらの培養地から単離された外層膜蛋白質の電気泳動
パターンが得られた。放射線写真は５個のｍｉ　ｃ　（
ｏｍｐＡ　）遺伝子の各々がＯｍｐＡ合成を阻害するこ
とが出来ることを明らかにした。

該ｍｔ　ｃ　（ｏｍｐＡ　）遺伝子は先に述べられたｍ
１ｃ（ｌｐｐ）およびｍｆ　ｃ　（ｏｍｐＣ）遺伝子よ
シも小さい効力を有するものと思われるが、この問題は
ｍｉ　ｃ　（ｏｍｐＡ　）遺伝子投与量の増加によって
妨げられる。翻訳開始個所を取シ囲む該ｏｍｐＡ　ｍＲ
ＮＡの２５８個の塩基領域（第８図の断片Ｉ）と対をな
す一つのｍＲＮＡをコード化しているプラスミドｐＡＭ
３０１は、約４５チまでＯｍｐＡ合成を阻害することが
判明した。約５１係までの同様な阻害がｐＡＭ３０７に
よって得られた。このプラスミドはｏｍｐＡ構造遺伝子
と一致するいかなるＤＮＡ連鎖をも含んでいない断片Ｉ
Ｉ　（第８図をみよ）を含む。ｐＡＭ３０７による阻害
は以前に述べられたｍｉ　ｃ　（ｏｒｎｐＣ）実験がｍ
ＲＮＡの５′−指揮領域との増大された相補性がｍ　ｉ
　ｃ　ＲＮＡ−媒介阻害においてより効力を有すること
を示したので驚ろくにはあたらない。一方、４５個の前
−〇ｍｐＡを介して４個のアミノ酸残基に対するコード
領域にわたる断片ＩＩＩ　（２８図をみよ）によって被
覆されているｏｍｐＡ構造遺伝子の部分とのみ対になる
一つのｍ１ｃＲＮＡを生成するｐＡＭ３１３はまた約５
４俤までＯｍｐＡ合成を阻害することが効果的に出来、
このことは機能を果すために蛋白質合成に対する開始個
所および（または）ターゲットｍＲＮＡの５′−指揮領
域とハイブリッド化する必要がないことを示している。

このことは壕だｍ１ｃ（ｌｐｐ）遺伝子を用いることが
確認された。ｌｐｐｍＲＮＡのコード領域とのみ対をな
す二つのｍ１ｃ（１１）Ｐ　）　ＲＮＡはまたリポ蛋白
質生成を阻害することが判明した。アミノ酸残基３から
２９、および前リポ蛋白質の４３から６３の各ｋに対し
７てコードを行なうｌｐｐ構造遺伝子断片から組み立て
られたｐＪＤｃ４１３　とｐＪＤｃ４１４におけるｍ１
ｃ（ｌｐｐ）遺伝子の効果が観察された。しか１７なが
らｐＪＤｃ４１３　とｐＪＤｃ４１．４の両方がリポ蛋
白質合成のたった２倍の阻害しか示さず、このことは翻
訳開始個所を被覆している一つのＤＮＡ断片（それは１
６倍阻害を惹起す）が該ｍｉｃ　（ｉｐｐ　）遺伝子の
場合により効力を有することを示している。

断片ＩＴ　（第８図をみよ）は該ｏｍｐＡ　ｍＲＮＡの
５′−指揮領域とのみ対をなす１つのｍ１ｃＲＮＡの効
力を試験するために選択された。結果として組み立てら
れたｐＡＭ３１４は、ＡＵＧ開始コードンの上流６０個
の塩基が位置する。ｍｐＡ　ｍＲＮＡ指揮体の６８−塩
基区域と対になる１つのｍ　ｉ　ｃ　ＲＮＡを合成する
。ｐＡＭ３１４はたった約１８係までしかＯｍｐＡ合成
を阻害する非常に弱いｍｉｃ効果を示す。断片ＩＩとＩ
マ（第８図をみよ）の間のｍｉｃ効果における重要な相
違はりボゾーム、即ちシャインーダルガルノ（５ｈｉｎ
ｅ　−Ｄａｌｇａｒｎｏ　）連鎖および（または）コー
ド領域と相互作用するｍＲＮＡの領域の範囲での相補相
互作用が絶対的に必要とはされないながらも、効果的な
ｍｉｃ機能のために非常に重要であることを明白に示し
ている。断片ＩからＶのｒｎｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子を
短縮することはその能率にもたらす影響が少なく、各々
４８−減小に比して４５％であることに注目することは
また興味のあることである。

上記に検討したよりもより効果的にＯｍｐＡ合成を阻害
し得る一つのプラスミドを組み立てるために、プラスミ
ドが２つ以上のｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子を含んで組み
立てられた。これらのプラスミド、ｌ）ＡＭ３０７とそ
の誘導体ｐＡＭ３１９およびｐＡＭ３１５とが比較せら
れた。前記のうちの後の２つのプラスミドは各々ｐＡＭ
３０７中にｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子の２つおよび３つ
のコピーを含んでいるｏ　ｐＡＭ３０７は約４７％まで
ＯｍｐＡ合成を阻害しタッチあるが、ｐＡＭ３１５とｐ
ＡＭ３１９は各々６９チまでＯｍｐＡ合成を阻害した。

上に提出された結果は明らかに本発明の人工ｍｉｃシス
テムと手法とが目的とする１つの遺伝子の表現を明確に
調整するために用いることが出来ることをはっきシ示′
している。特に、ある固有遺伝子に対する誘起可能なｍ
ｉｃシステムは、ある遺伝子の機能を研究するために新
規でかつ非常に効果的な方法である。もし該遺伝子が不
可欠のものであれば、条件付きの致命率は温度感受性突
然変異と幾分か同様にｍｉｃシステムの誘起にもとづい
て達成せられるであろう。しかしながら該ｍｉｃシステ
ムが固有蛋白質それ自体の合成を妨害する一方では、温
度感受性突然変異はその合成を妨害することなくして蛋
白質の機能のみを妨害すると云うことは注目されるべき
である。

本発明から、下記のことが明らかになった。

（ａ）１つの固有ｍＲＮＡと対になる１つのＲＮＡ複写
（ｍｉｃＲＮＡ）の生成はそのｍ　ＲＮ　Ａの表現を阻
害する。

（ｂ）１つのｍ１ｃＲＮＡの生成は該ｍ１ｃＲＮＡと相
補性を分は合うこれらの遺伝子のみについ−この表現を
妨害する。

（ｃ）　該ｍ　ｉ　ｃ　ＲＮＡ生成の誘起はｍＲＮＡの
半減期よシもずっと速く固有遺伝子の表現を妨害する。

（ｄ）　該ｍ１ｃＲＮＡはまた人工的に組み立てられた
ｍ１ｃ（ｌｐｐ）遺伝子が本発明の中で表現される時の
みならず、天然のｍ１ｃＦ遺伝子が表現される時にも見
出されるように、細胞中の固有ｍＲＮＡの量を減小する
。

（ｅ）　遺伝子投与量によって明らかな影響がある。

ｍ１ｃＲＮＡがより多く生成される程、ターゲット遺伝
子の表現がよシ効果的に妨害される０ 本発明の実施において、リボゾームと相互作用を行なう
ことが知られているｍＲＮＡの領域と対になるｍ１ｃＲ
ＮＡが最とも効力を有するものと思われる。１つの例と
してＩＰＩ）遺伝子を用いると、シャインーダルガルノ
（Ｓｈ　ｉｎｅ　−Ｄａｌｇａｒｎｏ　）連鎖およびｉ
ｐＩ）ｍＲＮＡの翻訳開始個所にハイブリッド化出来る
１つのｍ１ｃ（１ｐＰ）ＲＮＡはそれが出来ないものよ
り　４−より能率的にリボ蛋白質合成を阻害するものと
思われる。しかしながらｏｍｐＡ遺伝子、シャインーダ
ルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ　）連鎖と翻
訳開始個所の両者と対になるｍ１ｃＲＮＡに対しては、
まさしくシャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇ
ａｒｎｏ　）連鎖もしくは構造遺伝子のみが等しく効果
的であった。

例えばｏｍｐＣおよびＩｐＩ）のようないくらかの遺伝
子に対して、翻訳開始個所を取シ囲む遺伝子の領域は特
殊連鎖を含まず、そしてｍ　ｉ　ｃ　ＲＮＡ誘起は２つ
以上の蛋白質の生成を阻害する結果となる。これらの場
合において、遺伝子の他の領域はｍｉｃ遺伝子を組み立
てるために用いられるであろう。ｍ１ｃＲＮＡの長さは
もう１つの考慮に入れられるべき変化因子である。長い
方のｍｉｃ　゛（ｏｍｐＣ）ＲＮＡはＯｍｐＣ生成の阻
害において短かい方のｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡよシも
４倍効力を有した。該ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡによる
リボ蛋白質表現の阻害は、リボ蛋白質ｍＲＮＡと対にな
る２つのｍｉｃ（ｏｍｐＣ）ＲＮＡの領域が同じである
と云う事実にも拘らず、長い方のｍｉｃ（ｏｍｐＣ）Ｒ
ＮＡの領域によっては殆んど影響されなかったことは注
目されるべきである。このことはより高い特性が長い方
のｍ１ｃＲＮＡを用いることＫよって達成されることを
示している。該ｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子と対比して、
長さはＯｍｐＡ生成のｍｉｃ（ｏｍｐＡ）ＲＮＡ媒介阻
害に対しての重要な因子であるとは思われなかった。

加うるに、該ｍ１ｃＲＮＡ　の第２次構造はｍｌｃＲＮ
Ａ機能においである重要な役割を果している可能性が大
である。

ｍ１ｃＲＮＡが固有遺伝子の表現を阻害するために機能
するであろういくつかのメカニズムが存在する。該ｍ１
ｃＲＮＡが最初に該ｍＲＮＡと結合することによって作
用し、それによって先に提示されたようにリボゾームと
の相互作用を妨害すると云うことは最ともありそうに思
われる。この仮説は該ｍ１ｃ（１ｐＰ）ＲＮＡがもし複
写がｌｐｐ　ｍＲＮＡの半減期のみにもとづいて影響さ
れると仮定した場合よりもずっと速くリボ蛋白質の生成
を阻害したと云う事実によって支持される。

ｍ１ｃＲＮＡがリポ蛋白質ｍＲＮＡの量の減少をいかに
惹き起こすかについて、この減少を説明するために考え
られ得るモデルは、リポゾームがｍＲＮＡ全域を横切っ
ていない時に該ｍＲＮＡが、より安定していないと云う
ことである。ｍＲＮＡレベルにおいてのこの減少を説明
するための他の可能なモデルは、ｍ１ｃＲＮＡ　とｍＲ
ＮＡとの間の相補ハイブリッド形成が、ｍＲＮＡの複写
の早過ぎる終結もしくは不安定化を惹き起すと云うこと
である。それに代えて、該ｍ１ｃＲＮＡは直接複写の開
始を阻害するか、もしくはＣｏ１Ｅ１複製における小さ
い相補ＲＮＡ種の機能に対して記述されたと同様な方法
でｍＲＮＡ伸長の中断を惹き起こす。音訳（Ｔｏｍｉｚ
ａｗａ　）等、Ｃｏ１Ｅｌプライマー形成におけるＲＮ
Ａ第２次構造の重要性、細胞（Ｃｅｌｌ）第３１巻、第
５７５〜５８３頁（１９８２年）をみよ。

本発明のｍｉｃシステムはその応用においては、真核細
胞のみならず原始核細胞において、例えば抗薬剤遺伝子
、腫瘍遺伝子、およびファージもしくはウィルス遺伝子
のような種々の有毒あるいは有害な遺伝子の表現および
その他の遺伝子の表現を永久的に、もしくは誘起に際し
て妨害するために大きな可能性を有する。

こ＼に記述されるような本発明の実施の開発と表示〈お
いて、下記の材料と方法が用いられた。

系列と培養地 大腸菌ＪＡ２２１　（ｈｓｄｒ　、　１ｅｕＢ６　、１
ａｃＹ　。

ｔｈｉ　、　ｒｅｃＡ　ｅΔｔｒｐＥ５　）Ｆ’（１ａ
ｃＩｑ＊　ｐｒｏＡＢ。

１ａｃＺＹＡ）がすべての実験において用いられた。

特に記述されていない場合には、この系列はグル’　−
ｚ−ルｏ、４％、ｆアミン２μ！１／ｌｔｔ、ロイシン
とトリプトファンの各々の４０μｆ／Ｉｌｌ、およびア
ンピシリン５ｏｔｔｙ７ｔｉを補充されたＭ９培養地〔
ジェー、エイチ、ミラー（Ｊ、　Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ　）
、分子生物学における実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　
ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）、コー
ルドスプリングハーバ−研究所（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ７　）、コールド
スプリングハーバ＝（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒ　）、　チューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）　
１９７２年〕　の中で培養された。

材料 限定酵素はベテスダ　リサーチ　ラボラトリ−（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ　）まだはニューイングランド　バイオラボラトリ
−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｇ　）のい
ずれかから購入された。Ｔ　４　ＤＮＡ　リガーゼと大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（大き臂断片）はベテスダ　
リサーチ　ラボラトリ−（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）から購入された
。すべての酵素は製造者によって提供された指示によっ
て用いたｏＸｂａＩ連結子（ＣＴＣＴＡＧＡＧ）はニュ
ーイングランド　バイオラボラトリ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄＢ　１ｏＬａｂｓ　）　から購入された。

ＤＮＡ操作 プラスミドｐＪＤｃ４０２．ｐＪＤｃ４１２．およびｐ
ＪＤＣ４２２はこ＼および第８図に記載されたように組
み立てられた。プラスミドｐＪＤＣ４１３とｐＪＤＣ４
１４は、ｐＪＤｃ４１３に対する前リポ蛋白質の３から
２９個のアミノ酸残基をコード化している１ｐｐ遺伝子
、およびｐ　ＪＤＣ４１４に対する前リポ蛋白質の４３
から６３個のアミノ酸残基をコード化している５８−ｂ
ｐＡｌｕＩ断片から８Ｏ−ｈｐＡｌｕｌ断片を単離する
ことによって組み立てられた。該断片は先づＸｂａｌで
分解せられ、次いでＤＮＡポリメラーゼＩ（大きい断片
）によって処理されるｐＪＤｃ４０２の中へ結びつけら
れている短太な末端であった。

ｍｉｃ　（ｏｍｐＣ）組み立てのために適当なｏｍｐＣ
断片の単離は、ｏｍｐＣ促進体と構造遺伝子との間の適
当な特殊の限定の不存在のためにザブクローン化ステッ
プを含んでいた。プラスミド、ｐＭＹ１５０．を含み、
断片（ｐＤＲｏｏｌと１）ＤＲＯＯ２の各々）を含む４
７ｘ−ｂｐｘｂａｌＭｎ　ｌ　ｌ　ｏｍｐｃ促進体のい
ずれかを欠き、しかしその場所にＸｂａ１個所を含むｏ
　ｍｐＣの２つの誘導体が単離された。これらグラスミ
ドの各々の中の特殊のＢｇｌ　１１個所はＤＮＡポリメ
ラーゼ１（大きい断片）による処理と合成Ｘｂａｌ連結
子による結び付けによってＸｂａ１個所に移されたｏｘ
ｂａ１分解に続いて、ｐＤＲＯＯＩからの１２３−　ｂ
ｐ　Ｘｂａｌ断片とｐＤＲＯＯ２からの１７５−ｂｐＸ
ｂａｌ断片とが個々に単離され、そしてｐ　ＪＤＣ４０
２のＸｂａｌ＠Ｎの中へクローン化されてｐＡＭ３０８
とＩ）ＡＭ３０９の各々を作成した。

ｐＡＭ３２０はｐＡＭ３０８のｐｖｕ　ＩＩの中ヘクロ
ーン化されているｐＡＭ３０８から単離されたｍｉｃ　
（ａｍｐｃ）遺伝子を被穆しているＨｉｎｆｌを含んで
いる。１）ＡＭ　３２１は同様にＰＡＭ３０９から組み
立てられて２つのｍｉｃ　（ｏｍｐＣ）遺伝子を含んで
いる。

ｍ１ｃ（ｏｍｐＡ）プラスミドｐＡＭ３０１　、ｐＡＭ
３０７、ｐＡＭ３１３．ｐＡＭ３１４．およびｐＡＭ３
１８け、ｍ１ｃ（ｌｐｐ）とｍｉｃ（ｏｍｐＣ）遺伝子
の組み立てと類似した方法で述べられたようにして組み
立てられた。ｐＡＭ３１９を組み立てるために、ｍｉｃ
（ｏｍｐＡ）遺伝子を含むＨｉｎｆｌ断片はｐＡＭ３０
７から単離され、そしてｐＡＭ３０７のＰｖｕ１１個所
の中へ再び挿入された。ｐＡＭ３１５は、それがｐＡＭ
３０７のＰｒｕｌｌの中へ挿入されている２つのＨｉｎ
ｆｌを含んでいることを除いては、ｐＡＭ３１９と同様
な方法で組み立てられた。

外層膜蛋白質生成の分析 適当なプラスミドを担持する大腸菌ＪＡ２２１／〆１ａ
ｅｌ′１がクレットーサマージン（Ｋｌｅｔｔ−８ｕｍ
ｍｅｒｓｏｎ）比色計が３０を示す点まで培養され、そ
の時点においてＩＰＴＧは２ｍＭの最終濃度になるよう
添加された。更に１時間の培養の後（約２倍の時間）、
（３５Ｓ）−メチオニンの５０μＣｉ（アマ−ジャム（
Ａｍｅｒｓｈａｍ）＋１０００Ｃｉ／ｍモル〕がＩＭｌ
の培養地に添加された。該混合物はそれから１分間振盪
されつつ装置され、この時点でラベル化は１１ｄの水冷
停止溶液（１チホルムアルデヒドと１ｑ／ｓｌメチオニ
ンを含んでいる２０ｍＭ燐酸ソーダ（ｐＨ７，１））の
添加によって終結せしめられた。細胞は１０ｍＭ燐酸ソ
ーダ（ｐＨ７，１）によって１度洗滌せられ、同じバッ
ファーの１ｄ中に懸濁せられ、そしてカップホーンアダ
プター付きのヒートシステム超音波発振器モデルＷ−２
２０Ｈによって３分間（３０秒パルスで）音波破壊され
た。破壊されなかった細胞は外層膜を採集するに先立っ
て低速遠心分離によって除去された。細胞質膜は０．５
チンジウムラウロイルサルコシネートの存在下で室温で
３０分の装置の間に可溶化され、そして外層膜フラクシ
ョンは１０５，０００Ｘｇで２時間の遠心分離によって
沈澱せしめられた。

リポ蛋白質とＯｍｐＡはトリス−８ＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析せ
られた。ＯｍｐＣ生成を分析するために、尿素−８ＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素−８ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）が用いられた。蛋白質は試料バッファー中に溶解
され、そして該溶液はゲル塗布に先立って８分間沸騰ウ
ォータバス中で装置された。乾燥ゲルの放射線写真は高
滓濃度計によって直接走査された。目的とするバンドの
相対量を測定するために、目的物のピークの面積の１つ
の影響を受けていない蛋白質のピークに対する比率が各
々の試料に対して測定され九〇ＲＮＡ分析 細胞は培養せられそして〔３Ｈ〕−ウリジンでラベルさ
れ、それから細胞培養は氷上で培養地を５分間以下で急
速に冷却することによって停止された。該細胞は８００
０ｒｐｍ、５分間の遠心分離によって採集された。ＲＮ
Ａは下記の方法を用いて単離された。該細胞は１分間の
激しい渦４１攪拌により加熱細胞溶解溶液（１０ｒｎＭ
　）　！ＪスーＨＣＩＣＩ）Ｈ８，０）、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、３５０ｍＭＮａＣ＃。

２％ＳＤＳおよび７Ｍ尿素）の中へ急速に再分散された
。該混合液は直ちにフェノール：クロロホルム（１：１
　）で２回、クロロホルム単独で２回抽出された。１／
１０容量の３Ｍ酢酸ソーダ（ｐＨ５，２）が該混合液に
添加され、そして３容量のエタノールが該ＲＮＡを沈澱
させるために添加された。該沈澱物はそれからＴＥバッ
ファー（１０ｍＭトリス−ＨＣ＃（ｐＨ７，５〕、１ｍ
ＭＥＤＴＡ）中に　１溶解せられた。ゲル電気泳動のた
めに１各々のレーンに、等しいカウントが負荷された。

該ＲＮＡは６ｔ４ホルムアルデヒドを含む１．５チアガ
ローズゲル上で分離された。ランニングバッファーは２
０ｍＭＭ０Ｐｓ（３−［Ｎ−モルホリノ〕プロパンスル
ホン酸〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）））、５ｍＭ酢酸ソーダ
および１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７，０であった。

ＲＮＡ　はニトロセルロースペーハーニ移すレタ、ｍｉ
　ｃ　（ｌｐｐ　）　ＲＮＡとｌｐｐ　ｍＲＮＡに対し
て固有なＭ１３ハイブリ・フド化プローブは第１図すに
示される１１２−ｂｐＸｂａＩ断片を適当な方位におい
てＭ１３ｍｐ９　の中ヘクローン化することによって個
々に組み立てられた。ｏｍｐＡ　ｍＲＮＡに対して固有
なプローブは、１２４５−ｂｐＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断
片（元来はＥｃｏＲＶ　ＰＳＴＩ断片）をＭ１３ｒｎｐ
ｌＯの中へ挿入することによって組み立てられ、そして
該プローブはラベルされた。

【図面の簡単な説明】

第１図は１つのサブクローンまたは１つの遺伝子および
その促進体領域を担持している種々なプラスミドを記述
する。 第２図は促進体領域のヌクレオチド連鎖と１つの遺伝子
、正確にはｏｍｐＣ遺伝子の上流とを記述する。 第３図は本発明の実施によるある種のＲＮＡ間のハイブ
リッド形成を示す。 第４図はある種の遺伝子、正確にはｍ１ｃＦとｏｍｐＣ
遺伝子遺伝相間連鎖を示す０ 第５図はＲＮＡ、正確には本発明において有用でそして
本発明の実施によるｍｉｃ　ＦＲＮＡの役割に対する可
能なモデルを示す。 第６図はｍｉｃベクトルｐ　ＪＤＣ４０２とｍ１ｃ（ｌ
ｐｐ）の組み立てを示す０ 第７図はｏｍｐＣｍＲＮＡ　とｌｐｐｍＲＮＡとの間の
相同を示す。 第８図はｍｉｃ（ｏｍｐＡ）遺伝子を組み立てるために
用いられる断片を示す。 計　７ シヤインーダルガルノ　Ｍ’ｌｈコードン違頷 図 ＋１１１１１１１１　１１１１　１１１１１１　１１１
１１６　ｂａｓｅｓ）〜−ＣＵＣＵＧＣＵＧＧＵＡＧＣ
ＡＧＧ−Ｃ−−Ｇ−ＣＡＧＣＡＡＡＣＣＣＵ−−−３’
第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号優先権主
張　■１９澗年３月１叶０米国（ＵＳ）［株］５８５２
８２＠発　明　者　メイーイン　チョウ　アメリカ合衆
国ンズ　ロード １１７２７　ニューヨーク、コラム、ホーキイースト　
６６８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）生物体もしくは細胞物質の遺伝物質と共に行われ
   る複写にもとづいて該生物体もしくは細胞物質の遺伝物
   質によって生成される一つのｍＲＮＡと対をなし、そし
   て（または）結合またはハイブリッド化することが出来
   、その結果該ｍＲＮＡの表現もしくは翻訳が阻害される
   か、もしくは妨害されるところのＤＮＡを該生物体もし
   くは細胞物質の遺伝物質の中に取り入れるか、またはそ
   れと結合することからなる生物体もしくは細胞物質の遺
   伝子表現を調整する方法（２、特許請求の範囲（１月に
   記載の方法において、該生物体もしくは細胞物質はバク
   テリアである。 （３）「特許請求の範囲（１月に記載の方法において、
   該生物体もしくは細胞物質は原始核生物である。 （４）［特許請求の範囲（１月に記載の方法において、
   該生物体もしくは細胞物質は真核生物である。 （５）「特許請求の範囲（１月に記載の方法において、
   該生物体もしくは細胞物質は大腸菌である。 （６）Ｉ−特許請求の範囲（１）」に記載の方法におい
   て、該生物体もしくは細胞物質は枯草菌である。 （７）「特許請求の範囲（１月に記載の方法において、
   該生物体もしくは細胞物質はイーストである。 （８）該生物体もしくは細胞物質の遺伝物質と共に行わ
   れる複写にもとづいて該生物体もしくは細胞物質の遺伝
   物質によって生成される一つのｍＲＮＡと対をなし、そ
   して（または）結合またはハイブリッド化することが出
   来、その結果該ｍＲＮＡの表現もしくは翻訳が阻害され
   るか、もしくは妨害されるところのＤＮＡを該生物体も
   しくは細胞物質の遺伝物質と共に取り入れるかまたはそ
   れと結合する変転された生物体もしくは細胞物質 ９）［特許請求の範囲（８月に記載の変転された生物体
   重しくけ細胞物質は、その核の中で該ＤＮＡが該生物体
   もしくは細胞物質の遺伝物質に取シ入れられるかまたは
   結合される。 Ｑｌ）　ｌ−特許請求の範囲（８月に記載の変転された
   生物体もしく祉細胞物質において、該生物体もしくは細
   胞物質は真核生物である。 （ロ）　［特許請求の範囲（８月に記載の変転された生
   物体もしくは細胞物質において、該生物体もしくは細胞
   物質は原始核生物である。 （６）　［特許請求の範囲（８月に記載の変転された生
   物体もしくは細胞物質において、該生物体もしくは細胞
   物質の遺伝物質に取り入れられたまたは結合されたＤＮ
   Ａがクラスミド中に存在する。 （２）　［特許請求の範囲（８月に記載の変転された生
   物体もしくは細胞物質におい１、該生物体もしくは細胞
   物質の遺伝物質に取り入れられたまたは結合されたＤＮ
   Ａがウィルスまたはウィルスベクトルに存在する。 α４　「特許請求の範囲（８）」に記載の変転された生
   物体もしくは細胞物質において、該ＤＮＡは細胞内にお
   いてまたは細胞質の状態において該生物体もしくは細胞
   物質の遺伝物質に取り入れられるかまたは結合される。 ０υ　ＤＮＡ物質もしくは分子を含む変転された生物体
   もしくは細胞物質において行われる複写にもとづいて該
   生物体もしくは細胞物質の遺伝物質によって生成される
   一つのｍＲＮＡと対をなし、そして（または）結合また
   はハイブリッド化することができるオリゴリボヌクレオ
   チドもしくけポリリボヌクレオチドを生成するところの
   ＤＮＡ物質もしくは分子。 ０６「特許請求の範囲αＱ」に記載のＤＮＡ物質もしく
   は分子において、該ＤＮＡ物質もしくは分子はプラスミ
   ド中に取シ入れられる。 Ｑ？）［特許請求の範囲Ｑ＊Ｊに記載のＤＮＡ物質もし
   くは分子において、該物質もしくは分子は該生物体もし
   くは細胞物質の染色体遺伝物質に取り入れられるか、あ
   るいは結合される。 ａ呻「特許請求の範囲（イ）」に記載のＤＮＡ物質も　
   １しくけ分子において、該ＤＮＡ物質もしくは分子はウ
   ィルスもしくはウィルスベクトルに取シ入れられる。 Ｑｏ［特許請求の範囲α０」に記載のＤＮＡ物質もしく
   は分子は該生物体もしくは細胞物質の核の中において遺
   伝物質に取り入れられるかあるいけ結合される。 （ホ）遺伝子の表現を調整もしくは阻害するために反対
   側の方向に該遺伝子のＤＮＡ小断片もしくは複製を表現
   することからなる遺伝子の遺伝子表現を調整する方法 （至）　「特許請求の範囲（ホ）」に記載の遺伝子表現
   を調整する方法において、該ＤＮＡ小断片もしくは複製
   値促進体の後に入れられるかまたは置かれる。 （イ）　「特許請求の範囲翰」に記載の方法において、
   該ＤＮＡ小断片もしくは複製は促進体を含む。　−一　
   生物体中における遺伝子の表現を調整もしくは阻害する
   ために、反対側の方位においてそこに表現するために該
   遺伝子のＤＮＡ小断片もしくは複製を、そこに表現する
   ために、該生物の中へ挿入することからなるそこで表現
   される遺伝子を含む遺伝物質を含有する生物体の遺伝的
   表現を調整する方法 （ハ）　「特許請求の範囲（至）」に記載の遺伝子表現
   を調整する方法において、該ＤＮＡ小断片もしくは複Ｊ
   ！！！は促進体を含む。 （２）　［特許請求の範囲（ホ）」に記載の方法におい
   て、ＤＮＡの該小断片もしくは複製は促進体の後に挿入
   されるかまたは供給される。 （ホ）該生物中の該遺伝子の表現を調整もしくは阻害す
   るために、反対側の方向に表現するために該遺伝子のＤ
   ＮＡ小断片もしくは複製をそこで表現される該生物体の
   中に挿入することからなる生物体中の腫瘍遺伝子の遺伝
   子表現を調整する方法。 に）　「特許請求の範囲（ホ）」に記載の方法において
   、該ＤＮＡ小断片もしくは複製は促進物の後に挿入され
   るかｔたは供給される。 （２）該生物体の中における遺伝子の表現を調整もしく
   は阻害するために、反対側の方向において表現するため
   に該遺伝子のＤＮＡ小断片もしくは複製を該生物体に挿
   入することからなる生物体中のウィルス遺伝子の遺伝子
   表現を調整する方法 翰　「特許請求の範囲（ハ）」に記載の方法において、
   該ＤＮＡ小断片もしくは複製は促進体の後に挿入される
   かまたは供給される。 曽　「特許請求の範囲−」に記載の方法において、−該
   遺伝子は真核遺伝子である。 ０η　「特許請求の範囲■」に記載の方法において、該
   遺伝子は原始核遺伝子である。 （２）　［特許請求の範囲（ハ）」に記載の方法におい
   て、該ＤＮＡの小断片もしくは複製はベクトルを介して
   該生物体に挿入される。 Ｃ３４「特許請求の範囲（ホ）」に記載の方法において
   、該ＤＮＡもしくは複製はプラスミドを介して該生物体
   に挿入される。 ■　「特許請求の範囲に）」に記載の方法において、該
   ＤＮＡ小断片もしくは複製はベクトルを介して該生物体
   に挿入される。 （２）　「特許請求の範囲（２）」に記載の方法におい
   て、該ＤＮＡ断片もしくは複製はプラスミドを介して該
   生物体に挿入される。 （至）遺伝的組み立ての一部分として該生物体の中へ反
   対側の方位もしくは方向においてそこで表現するために
   遺伝子のＤＮＡ小断片もしくは複製を取り入れることか
   らなる外部ソースから該生物の中へ導かれる遺伝子の毒
   性表現に対して生物体を保護する方法 （ロ）遺伝子の表現を調整もしくは阻害するために反対
   の方向において一つの促進体の後に挿入されるかもしく
   は位置されている該遺伝子のＤＮＡ小断片もしくは複製
   と共にそこで表現することが出来る遺伝子を遺伝的組立
   ての中に有する生物体 （至）　「特許請求の範囲に）」に記載の生物体におい
   て、該生物体は真核生物である。 ＯＩ「特許請求の範囲（ロ）」に記載の生物体において
   、該生物体は原始核化物である。 輪　［特許請求の範囲＠ｊに記載の生物体は大腸菌であ
   る。 １１）Ｉｍ許請求の範囲（ロ）」に記載の生物体におい
   て、その遺伝的組立の一部分として該遺伝子のＤＮＡ断
   片もしくは複製はベクトルを介して該生物体に挿入され
   る。 −（６）　１−特許請求の範囲（ロ）」に記載の生物体
   において、その遺伝的組立の一部分として該遺伝子のＤ
   ＮＡ断片もしくは複製はウィルスベクトルを介して該生
   物体に挿入される。 ■　「特許請求の範囲（ロ）」に記載の生物体において
   、その遺伝的組立の一部分として該遺伝子のＤＮＡ断片
   もしくは複製はプラスミドベクトルを介して該生物体に
   挿入される。 −遺伝的組立ての一部分として、対応するｍＲＮＡを生
   成するための表現もしくは複写をすることが出来る遺伝
   子を含み、そしてその遺伝的組立ての一部分として、一
   つのＤＮＡ断片もしくは該遺伝子の複製を含み、そして
   ｍＲＮＡと対をなし該ｍＲＮＡの翻訳に関して骸ｍ　Ｒ
   Ｎ　Ａの調整もしくは阻害を行なうＲＮＡを生成するた
   めに該遺伝子に対して反対側の方向で表現されもしくは
   複写されるところの一つの遺伝子を含む生物体 に）生物体の中で表現もしくは複写を行なうことが出来
   る遺伝子の一つのＤＮＡ断片もしくは複製からなる生物
   体中の遺伝子の表現もしくは複写を調節するためにＭ用
   なベク）／しであり、該遺伝子のＤＮＡ断片もしくは複
   製は一つの促進体の後でかつ反対側の方向に位置せられ
   その結果複写にもとづいて該生物体中へ挿入される時、
   該遺伝子のｍＲＮＡと対をなし、該ｍＲＮＡの翻訳に関
   して調整もしくは阻害を行なう一つのＲＮＡを生成する
   。