JPH10191990A - 病原体に必須の遺伝子の測定法 - Google Patents
病原体に必須の遺伝子の測定法Info
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- JPH10191990A JPH10191990A JP9320250A JP32025097A JPH10191990A JP H10191990 A JPH10191990 A JP H10191990A JP 9320250 A JP9320250 A JP 9320250A JP 32025097 A JP32025097 A JP 32025097A JP H10191990 A JPH10191990 A JP H10191990A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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-
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
Abstract
(57)【要約】
【課題】 病原体の感染および成長に必須の遺伝子のレ
ベル変化を同定する効果的な方法が望まれている。 【解決手段】 本発明は、インビトロ本質的に「オフ」
であり、インビボで感染過程では選択的に「オン」にな
るプロモーターを有する発現ベクター系を用いる遺伝子
生成物の低下のレベル変化に対する病原体の感受性を決
定する方法を提供する。この方法により、選択された病
原体の感染の成長に必須であると同定された遺伝子およ
び遺伝子生成物をもまた提供する。加えて、この方法に
より同定された標的遺伝子に対して設計された治療用組
成物をも提供する。
ベル変化を同定する効果的な方法が望まれている。 【解決手段】 本発明は、インビトロ本質的に「オフ」
であり、インビボで感染過程では選択的に「オン」にな
るプロモーターを有する発現ベクター系を用いる遺伝子
生成物の低下のレベル変化に対する病原体の感受性を決
定する方法を提供する。この方法により、選択された病
原体の感染の成長に必須であると同定された遺伝子およ
び遺伝子生成物をもまた提供する。加えて、この方法に
より同定された標的遺伝子に対して設計された治療用組
成物をも提供する。
Description
【０００１】本願は、１９９６年１０月１５日に提出さ
れた米国仮特許出願番号６０／０２８４１６および１９
９６年１１月１８日に提出された出願番号６０／０３１
１６１の利益を享受する。
れた米国仮特許出願番号６０／０２８４１６および１９
９６年１１月１８日に提出された出願番号６０／０３１
１６１の利益を享受する。
【０００２】
【発明の属する技術分野】本発明は、本質的にインビト
ロで「オフ」であり、感染過程において選択的に「オ
ン」になるプロモーターを有する発現ベクター系を用い
て、遺伝子生成物の発現のレベル低下の変化に対する病
原体の感受性を決定する方法を提供する。この方法を用
いると、阻害に対して最も鋭敏な遺伝子標的を、選択さ
れた病原体に対する新しい治療法の開発のための分子標
的として選別できる。
ロで「オフ」であり、感染過程において選択的に「オ
ン」になるプロモーターを有する発現ベクター系を用い
て、遺伝子生成物の発現のレベル低下の変化に対する病
原体の感受性を決定する方法を提供する。この方法を用
いると、阻害に対して最も鋭敏な遺伝子標的を、選択さ
れた病原体に対する新しい治療法の開発のための分子標
的として選別できる。
【０００３】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】遺伝
子の同定、配列決定および特徴づけは、現代の科学的研
究の主要な目標である。遺伝子を同定し、その配列を決
定し、その生物学的機能を特徴づけすることにより、組
換え技術を用いて多量の価値ある遺伝子生成物、例えば
タンパク質およびペプチドを生成することが可能にな
る。加えて、遺伝子配列の知識が、選択された遺伝子の
不当な発現および／もしくは抑制により、または遺伝子
機能に及ぼす外的因子、例えば発癌因子もしくはテラト
ゲンの影響により特徴づけられる植物および動物におけ
る種々の疾患の診断、予後および治療に対する解答を付
与する。
子の同定、配列決定および特徴づけは、現代の科学的研
究の主要な目標である。遺伝子を同定し、その配列を決
定し、その生物学的機能を特徴づけすることにより、組
換え技術を用いて多量の価値ある遺伝子生成物、例えば
タンパク質およびペプチドを生成することが可能にな
る。加えて、遺伝子配列の知識が、選択された遺伝子の
不当な発現および／もしくは抑制により、または遺伝子
機能に及ぼす外的因子、例えば発癌因子もしくはテラト
ゲンの影響により特徴づけられる植物および動物におけ
る種々の疾患の診断、予後および治療に対する解答を付
与する。
【０００４】遺伝子生成物に基づいて特定の遺伝子配列
を同定するための種々の技術もまた記載されている。例
えば１９９１年５月３０日公開の国際特許出願ＷＯ９１
／０７０８７を参照のこと。加えて、所望の配列を増幅
するための方法が記載されている。例えば１９９１年１
１月１４日公開の国際特許出願ＷＯ９１／１７２７１を
参照のこと。
を同定するための種々の技術もまた記載されている。例
えば１９９１年５月３０日公開の国際特許出願ＷＯ９１
／０７０８７を参照のこと。加えて、所望の配列を増幅
するための方法が記載されている。例えば１９９１年１
１月１４日公開の国際特許出願ＷＯ９１／１７２７１を
参照のこと。
【０００５】しかしながら、生物の成長に必須の遺伝子
は、将来の分析のために容易に回収できる様な方法で同
定するのは困難である。必須遺伝子を同定するために現
在用いられる最も一般的な方法は、条件つき致死変異体
ライブラリーを生成し、続いて適当な許容条件または非
許容条件下で２検体をスクリーニングすることからなる
多工程法である。ついで、候補突然変異体を別のゲノム
ライブラリーおよび突然変異表現型の相補性により単離
される所望の遺伝子で形質転換する。相補的プラスミド
を回収し、サブクローニングし、次に再試験する。しか
しながら、この方法は、所望の遺伝子を同定し、回収す
るための多くのサブクローニング工程からなり、従っ
て、手間と時間の両方がかかる。
は、将来の分析のために容易に回収できる様な方法で同
定するのは困難である。必須遺伝子を同定するために現
在用いられる最も一般的な方法は、条件つき致死変異体
ライブラリーを生成し、続いて適当な許容条件または非
許容条件下で２検体をスクリーニングすることからなる
多工程法である。ついで、候補突然変異体を別のゲノム
ライブラリーおよび突然変異表現型の相補性により単離
される所望の遺伝子で形質転換する。相補的プラスミド
を回収し、サブクローニングし、次に再試験する。しか
しながら、この方法は、所望の遺伝子を同定し、回収す
るための多くのサブクローニング工程からなり、従っ
て、手間と時間の両方がかかる。
【０００６】トランスポゾン突然変異誘発に基づく病原
体毒性遺伝子を単離するための多くの解決法が開発され
ている。これらの方法は、特異的な毒性関連因子の喪失
（Leeら、J.Infect.Dis.156:741（1987））、マクロフ
ァージ内での生存性（Fieldsら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.
83:5189（1986））、および上皮細胞の浸透性（Finlay
ら、Mol.Microbiol.2:757（1988））についてスクリー
ニングすることを包含する。しかしながら、これらの方
法は感染の特定の段階に限定される。トランスポゾン突
然変異体はまた感染の生存動物モデルにおいても試験さ
れている（Millerら、Infect.Immun.57:2758（1989）；
およびBolkerら、Mol.Gen.Genet.248:547-552（199
4））。しかしながら、突然変異誘発された細菌のプー
ル内で毒性を減じた突然変異体を同定するのが不可能で
あるために、細菌遺伝子を包括的にスクリーニングする
ことができない。従って、非常に多くの突然変異体で個
々スクリーニングする必要がある。
体毒性遺伝子を単離するための多くの解決法が開発され
ている。これらの方法は、特異的な毒性関連因子の喪失
（Leeら、J.Infect.Dis.156:741（1987））、マクロフ
ァージ内での生存性（Fieldsら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.
83:5189（1986））、および上皮細胞の浸透性（Finlay
ら、Mol.Microbiol.2:757（1988））についてスクリー
ニングすることを包含する。しかしながら、これらの方
法は感染の特定の段階に限定される。トランスポゾン突
然変異体はまた感染の生存動物モデルにおいても試験さ
れている（Millerら、Infect.Immun.57:2758（1989）；
およびBolkerら、Mol.Gen.Genet.248:547-552（199
4））。しかしながら、突然変異誘発された細菌のプー
ル内で毒性を減じた突然変異体を同定するのが不可能で
あるために、細菌遺伝子を包括的にスクリーニングする
ことができない。従って、非常に多くの突然変異体で個
々スクリーニングする必要がある。
【０００７】Henselらは、細菌性毒性遺伝子を単離する
ための独特なＤＮＡ配列タグを担持するトランスポゾン
を用いる突然変異誘発系の挿入を開発した。Science 26
9:400-403（1995）。シグナチャータグ化突然変異誘発
と称するこの系では、各トランスポゾン突然変異体を異
なるＤＮＡ配列でタグ化する。これにより突然変異体の
混合集団に感染した宿主から回収した細菌の同定、およ
び毒性を減じた突然変異体の選別が可能になる。この方
法を用いて、腸チフスのネズミモデルにおけるサルモネ
ラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）の毒性
遺伝子を同定した。さらに、Slauchらは、インビトロで
は本質的に存在しないが、感染の種々の相を通して、ま
たはその間に「オン」である転写物を同定するための手
段を提供するＩＶＥＴ技術と称する方法について記載し
ている（Methods in Enzymoloy 235:481-492（199
4））。しかしながら、これらの方法は、生物中の遺伝
子生成物の全体的な不存在、またはインビボでの特異的
なアップレギュレーションの効果に関する情報を提供す
るだけである。従って、病原体の感染性および成長に必
須の遺伝子のレベル変化を同定する効果的な方法が必要
とされている。
ための独特なＤＮＡ配列タグを担持するトランスポゾン
を用いる突然変異誘発系の挿入を開発した。Science 26
9:400-403（1995）。シグナチャータグ化突然変異誘発
と称するこの系では、各トランスポゾン突然変異体を異
なるＤＮＡ配列でタグ化する。これにより突然変異体の
混合集団に感染した宿主から回収した細菌の同定、およ
び毒性を減じた突然変異体の選別が可能になる。この方
法を用いて、腸チフスのネズミモデルにおけるサルモネ
ラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）の毒性
遺伝子を同定した。さらに、Slauchらは、インビトロで
は本質的に存在しないが、感染の種々の相を通して、ま
たはその間に「オン」である転写物を同定するための手
段を提供するＩＶＥＴ技術と称する方法について記載し
ている（Methods in Enzymoloy 235:481-492（199
4））。しかしながら、これらの方法は、生物中の遺伝
子生成物の全体的な不存在、またはインビボでの特異的
なアップレギュレーションの効果に関する情報を提供す
るだけである。従って、病原体の感染性および成長に必
須の遺伝子のレベル変化を同定する効果的な方法が必要
とされている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】一つの態様において、本
発明は、インビトロで「オフ」であり、病原体の感染過
程の特定の相では選択的に「オン」になるプロモーター
を用いる発現ベクター系を用いて、病原体の感染性およ
び成長に不可欠な1個または複数の遺伝子のレベル変化
を同定する方法を提供する。本発明のさらなる態様は、
病原体の感染性および／または成長に必須であり、前記
の方法により同定される単離遺伝子を提供することであ
る。本発明のさらに別の態様は、前記の同定された遺伝
子配列を発現することにより生成された、単離タンパク
質である。かかるタンパク質は治療用および診断用組成
物の開発または、薬物開発のための標的として有用であ
る。本発明のさらに別の態様は、抗生物質、特に広域ス
ペクトル抗生物質、とりわけこれらの必須遺伝子の発現
および／またはこれらの遺伝子生成物の活性を調節する
抗生物質を同定することである。
発明は、インビトロで「オフ」であり、病原体の感染過
程の特定の相では選択的に「オン」になるプロモーター
を用いる発現ベクター系を用いて、病原体の感染性およ
び成長に不可欠な1個または複数の遺伝子のレベル変化
を同定する方法を提供する。本発明のさらなる態様は、
病原体の感染性および／または成長に必須であり、前記
の方法により同定される単離遺伝子を提供することであ
る。本発明のさらに別の態様は、前記の同定された遺伝
子配列を発現することにより生成された、単離タンパク
質である。かかるタンパク質は治療用および診断用組成
物の開発または、薬物開発のための標的として有用であ
る。本発明のさらに別の態様は、抗生物質、特に広域ス
ペクトル抗生物質、とりわけこれらの必須遺伝子の発現
および／またはこれらの遺伝子生成物の活性を調節する
抗生物質を同定することである。
【０００９】本発明は、選択された病原体における遺伝
子エッセンシャリティー（gene essentiality）を測定
するための方法であって：オン／オフ特性を有する潜在
的標的遺伝子のプロモーターおよびリポーター遺伝子を
有してなるベクター発現系を製造すること；そのベクタ
ー発現系における標的遺伝子プロモーターを潜在的標的
遺伝子のためのリボザイムまたはアンチセンス構築物に
発現可能な様に連結させること；そのリボザイムまたは
アンチセンス構築物を含有する発現ベクター系を選択さ
れた病原体に導入すること；少なくとも一の動物を該発
現ベクター系を含有する病原体で感染させること；標的
遺伝子の遺伝子発現レベルを測定すること；および標的
遺伝子発現レベルを該動物における感染の進行に関連づ
け、選択された病原体の成長に必須の遺伝子を同定する
ことからなる方法を提供する。
子エッセンシャリティー（gene essentiality）を測定
するための方法であって：オン／オフ特性を有する潜在
的標的遺伝子のプロモーターおよびリポーター遺伝子を
有してなるベクター発現系を製造すること；そのベクタ
ー発現系における標的遺伝子プロモーターを潜在的標的
遺伝子のためのリボザイムまたはアンチセンス構築物に
発現可能な様に連結させること；そのリボザイムまたは
アンチセンス構築物を含有する発現ベクター系を選択さ
れた病原体に導入すること；少なくとも一の動物を該発
現ベクター系を含有する病原体で感染させること；標的
遺伝子の遺伝子発現レベルを測定すること；および標的
遺伝子発現レベルを該動物における感染の進行に関連づ
け、選択された病原体の成長に必須の遺伝子を同定する
ことからなる方法を提供する。
【００１０】本発明はまた選択された病原体における遺
伝子エッセンシャリティーを測定するための方法であっ
て：オン／オフ特性を有する潜在的標的遺伝子のプロモ
ーターおよびリポーター遺伝子を有してなるベクター発
現系を製造すること；そのベクター発現系における標的
遺伝子プロモーターを潜在的標的遺伝子のためのリボザ
イムまたはアンチセンス構築物に発現可能な様に連結さ
せること；そのリボザイムまたはアンチセンス構築物を
含有する発現ベクター系を選択された病原体に導入する
こと；少なくとも一の動物を発現ベクター系を含有する
病原体で感染させること；標的遺伝子のｍＲＮＡレベル
を測定すること；およびｍＲＮＡレベルを動物における
感染の進行に関連づけ、選択された病原体の成長に必須
の遺伝子を同定することからなる方法を提供する。
伝子エッセンシャリティーを測定するための方法であっ
て：オン／オフ特性を有する潜在的標的遺伝子のプロモ
ーターおよびリポーター遺伝子を有してなるベクター発
現系を製造すること；そのベクター発現系における標的
遺伝子プロモーターを潜在的標的遺伝子のためのリボザ
イムまたはアンチセンス構築物に発現可能な様に連結さ
せること；そのリボザイムまたはアンチセンス構築物を
含有する発現ベクター系を選択された病原体に導入する
こと；少なくとも一の動物を発現ベクター系を含有する
病原体で感染させること；標的遺伝子のｍＲＮＡレベル
を測定すること；およびｍＲＮＡレベルを動物における
感染の進行に関連づけ、選択された病原体の成長に必須
の遺伝子を同定することからなる方法を提供する。
【００１１】本発明はさらに選択された病原体における
遺伝子エッセンシャリティーを測定するための方法であ
って：潜在的標的遺伝子を同定すること；オン／オフ特
性を有する潜在的標的遺伝子のプロモーターおよびリポ
ーター遺伝子を有してなるベクター発現系を製造するこ
と；ベクター発現系におけるプロモーターのオン／オフ
特性が保存されていることを確認すること；ベクター発
現系におけるレポーター遺伝子を潜在的標的遺伝子のた
めのリボザイムまたはアンチセンス構築物で置換するこ
と；リボザイムまたはアンチセンス構築物を含有する発
現ベクター系を選択された病原体に導入すること；少な
くとも一の動物を該発現ベクター系を含有する病原体で
感染させること；標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定す
ること；およびｍＲＮＡレベルを動物における感染の進
行に関連づけ、選択された病原体の成長に必須の遺伝子
を同定することからなる方法を提供する。
遺伝子エッセンシャリティーを測定するための方法であ
って：潜在的標的遺伝子を同定すること；オン／オフ特
性を有する潜在的標的遺伝子のプロモーターおよびリポ
ーター遺伝子を有してなるベクター発現系を製造するこ
と；ベクター発現系におけるプロモーターのオン／オフ
特性が保存されていることを確認すること；ベクター発
現系におけるレポーター遺伝子を潜在的標的遺伝子のた
めのリボザイムまたはアンチセンス構築物で置換するこ
と；リボザイムまたはアンチセンス構築物を含有する発
現ベクター系を選択された病原体に導入すること；少な
くとも一の動物を該発現ベクター系を含有する病原体で
感染させること；標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定す
ること；およびｍＲＮＡレベルを動物における感染の進
行に関連づけ、選択された病原体の成長に必須の遺伝子
を同定することからなる方法を提供する。
【００１２】また選択された病原体における遺伝子エッ
センシャリティーを測定するための方法であって：オン
／オフ特性を有する潜在的標的遺伝子のプロモーターお
よびリポーター遺伝子を有してなるベクター発現系を製
造すること；そのベクター発現系における標的遺伝子プ
ロモーターを潜在的標的遺伝子のためのリボザイムまた
はアンチセンス構築物に発現可能な様に連結させるこ
と；そのリボザイムまたはアンチセンス構築物を含有す
る発現ベクター系を選択された病原体に導入すること；
少なくとも一の動物を該発現ベクター系を含有する病原
体に感染させること；標的遺伝子が発現したタンパク質
レベルを測定すること；およびタンパク質レベルを動物
における感染の進行に関連づけ、選択された病原体の成
長に必須の遺伝子および遺伝子生成物を同定することか
らなる方法を提供する。
センシャリティーを測定するための方法であって：オン
／オフ特性を有する潜在的標的遺伝子のプロモーターお
よびリポーター遺伝子を有してなるベクター発現系を製
造すること；そのベクター発現系における標的遺伝子プ
ロモーターを潜在的標的遺伝子のためのリボザイムまた
はアンチセンス構築物に発現可能な様に連結させるこ
と；そのリボザイムまたはアンチセンス構築物を含有す
る発現ベクター系を選択された病原体に導入すること；
少なくとも一の動物を該発現ベクター系を含有する病原
体に感染させること；標的遺伝子が発現したタンパク質
レベルを測定すること；およびタンパク質レベルを動物
における感染の進行に関連づけ、選択された病原体の成
長に必須の遺伝子および遺伝子生成物を同定することか
らなる方法を提供する。
【００１３】その選択された病原体が、ストレプトコッ
カス（Streptococcus）、ストレプトコッカス・ニュー
モニア（Streptococcus pneumoniae）、スタフィロコッ
カス（Staphylococcus）、スタフィロコッカス・アウレ
ウス（Staphylococcus aureus）、エンテロコッカス（E
nterococcus）、エンテロコッカス・フェカリス（Enter
ococcus faecalis）、シュードモナス（Pseudomona
s）、シュードモナス・アウリギノサ（Pseudomonas aur
iginosa）、エシェリキア（Escherichia）、およびエシ
ェリキア・コリ（Escherichia coli）からなる群から選
択される方法も提供する。感染工程の動物を齧歯類、マ
ウス、ラット、ウサギ、およびモルモットからなる群か
ら選択したその他の方法をも提供する。本発明は、本発
明のベクターを有してなるキットを提供する。本発明
は、本発明の方法において使用するベクター、かかる方
法において使用する病原体を提供する。オン／オフ特性
を有する潜在的標的遺伝子のプロモーターおよびリポー
ター遺伝子を有してなる発現ベクターも提供する。また
潜在的標的遺伝子のためのリボザイムまたはアンチセン
ス構築物に発現可能な様に連結した標的遺伝子プロモー
ターを有してなるベクターも提供する。
カス（Streptococcus）、ストレプトコッカス・ニュー
モニア（Streptococcus pneumoniae）、スタフィロコッ
カス（Staphylococcus）、スタフィロコッカス・アウレ
ウス（Staphylococcus aureus）、エンテロコッカス（E
nterococcus）、エンテロコッカス・フェカリス（Enter
ococcus faecalis）、シュードモナス（Pseudomona
s）、シュードモナス・アウリギノサ（Pseudomonas aur
iginosa）、エシェリキア（Escherichia）、およびエシ
ェリキア・コリ（Escherichia coli）からなる群から選
択される方法も提供する。感染工程の動物を齧歯類、マ
ウス、ラット、ウサギ、およびモルモットからなる群か
ら選択したその他の方法をも提供する。本発明は、本発
明のベクターを有してなるキットを提供する。本発明
は、本発明の方法において使用するベクター、かかる方
法において使用する病原体を提供する。オン／オフ特性
を有する潜在的標的遺伝子のプロモーターおよびリポー
ター遺伝子を有してなる発現ベクターも提供する。また
潜在的標的遺伝子のためのリボザイムまたはアンチセン
ス構築物に発現可能な様に連結した標的遺伝子プロモー
ターを有してなるベクターも提供する。
【００１４】本発明はまたオン／オフ特性を有する潜在
的標的遺伝子のプロモーターおよびリポーター遺伝子を
有してなる発現ベクターを有してなる病原体、および潜
在的標的遺伝子のためのリボザイムまたはアンチセンス
構築物に発現可能な様に連結した標的遺伝子プロモータ
ーを有してなるベクターを有してなる病原体をも提供す
る。かかる病原体を有してなる動物をも、本発明により
提供される。本発明のその他の目的、特徴、利点および
態様は、以下の記載より当業者には明白になるであろ
う。しかしながら、以下の記載および具体的な実施例
は、本発明の好ましい具体例を示すものであり、説明の
ためにのみ示すものであると理解すべきである。開示し
た本発明の精神および観点内での種々の変更および修飾
は、以下の記載および本明細書のその他の部分を読むこ
とにより、当業者に容易に明らかとなろう。
的標的遺伝子のプロモーターおよびリポーター遺伝子を
有してなる発現ベクターを有してなる病原体、および潜
在的標的遺伝子のためのリボザイムまたはアンチセンス
構築物に発現可能な様に連結した標的遺伝子プロモータ
ーを有してなるベクターを有してなる病原体をも提供す
る。かかる病原体を有してなる動物をも、本発明により
提供される。本発明のその他の目的、特徴、利点および
態様は、以下の記載より当業者には明白になるであろ
う。しかしながら、以下の記載および具体的な実施例
は、本発明の好ましい具体例を示すものであり、説明の
ためにのみ示すものであると理解すべきである。開示し
た本発明の精神および観点内での種々の変更および修飾
は、以下の記載および本明細書のその他の部分を読むこ
とにより、当業者に容易に明らかとなろう。
【００１５】
【発明の実施の形態】抗微生物物質に対する多くの病原
体抵抗性メカニズムの生化学的基礎は周知である。これ
らのメカニズムは、単独でまたは共同して、病院および
共同体の両方の後天性感染に見られる抗微生物耐性の漸
増の問題の原因となる。これらの問題を克服するための
研究者による主たる解決法は、既存の薬物をさらに改善
しようとするものである。これらの解決法でも、かかる
耐性病原体による感染に対していくらか対抗するが、新
しい解決法が必要とされている。生物の成長に必須の遺
伝子または遺伝子生成物に関する知識は、感染性病原体
の処置の開発に対する解答を付与する。遺伝子ノックア
ウト実験により遺伝子生成物の全体的な欠如の効果に関
する情報が得られる。しかしながら、抗微生物治療によ
り、当該遺伝子生成物の作用を完全に排除できることは
まれである。加えて、遺伝子生成物がインビトロでの生
存性に必須である場合、（単純な挿入／欠失突然変異に
より）遺伝子ノックアウトを作ることはできない。
体抵抗性メカニズムの生化学的基礎は周知である。これ
らのメカニズムは、単独でまたは共同して、病院および
共同体の両方の後天性感染に見られる抗微生物耐性の漸
増の問題の原因となる。これらの問題を克服するための
研究者による主たる解決法は、既存の薬物をさらに改善
しようとするものである。これらの解決法でも、かかる
耐性病原体による感染に対していくらか対抗するが、新
しい解決法が必要とされている。生物の成長に必須の遺
伝子または遺伝子生成物に関する知識は、感染性病原体
の処置の開発に対する解答を付与する。遺伝子ノックア
ウト実験により遺伝子生成物の全体的な欠如の効果に関
する情報が得られる。しかしながら、抗微生物治療によ
り、当該遺伝子生成物の作用を完全に排除できることは
まれである。加えて、遺伝子生成物がインビトロでの生
存性に必須である場合、（単純な挿入／欠失突然変異に
より）遺伝子ノックアウトを作ることはできない。
【００１６】本発明は遺伝子生成物低下のレベル変化に
鋭敏な病原体を決定する方法を提供し、遺伝子生成物の
レベルの低下はインビボでしか起こらないので、インビ
トロで必須の遺伝子に適用できる。選択した標的のｍＲ
ＮＡ低下の程度はモニターでき、感染の進行および／ま
たは感染組織から回収した生存数に相関させることがで
きる。この方法を用いると、インビボでの阻害に最も反
応する選択された病原体からの遺伝子を同定でき、新し
い介入治療の開発の標的として選択できる。
鋭敏な病原体を決定する方法を提供し、遺伝子生成物の
レベルの低下はインビボでしか起こらないので、インビ
トロで必須の遺伝子に適用できる。選択した標的のｍＲ
ＮＡ低下の程度はモニターでき、感染の進行および／ま
たは感染組織から回収した生存数に相関させることがで
きる。この方法を用いると、インビボでの阻害に最も反
応する選択された病原体からの遺伝子を同定でき、新し
い介入治療の開発の標的として選択できる。
【００１７】「病原体」とは動物または植物を感染で
き、動物または植物の細胞または組織における核酸配列
を複製できる任意の生物を意味する。かかる病原体は、
一般に感染した動物または植物の病態に関係する。かか
る病原体は、通常、組織または血液に感染する、細胞内
または細胞外で複製するウイルス、または細菌、真菌ま
たは寄生虫のごときその他の生物を包含するが、これら
に限定されるものではない。特定の病原体は、進行の逐
次的および識別可能な段階、例えば潜伏段階、感染段階
および疾患の徴候を引き起こす段階において存在するこ
とが知られている。これらの異なる段階では、病原体は
生存に必須の遺伝子とは異なる遺伝子に依存すると予想
される。
き、動物または植物の細胞または組織における核酸配列
を複製できる任意の生物を意味する。かかる病原体は、
一般に感染した動物または植物の病態に関係する。かか
る病原体は、通常、組織または血液に感染する、細胞内
または細胞外で複製するウイルス、または細菌、真菌ま
たは寄生虫のごときその他の生物を包含するが、これら
に限定されるものではない。特定の病原体は、進行の逐
次的および識別可能な段階、例えば潜伏段階、感染段階
および疾患の徴候を引き起こす段階において存在するこ
とが知られている。これらの異なる段階では、病原体は
生存に必須の遺伝子とは異なる遺伝子に依存すると予想
される。
【００１８】本発明の方法に有用な好ましい病原体は、
例えばストレプトコッカス（Streptococcus）、ストレ
プトコッカス・ニューモニア（Streptococcus pneumoni
ae）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、スタフ
ィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureu
s）、エンテロコッカス（Enterococcus）、エンテロコ
ッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、シュ
ードモナス（Pseudomonas）、シュードモナス・アウリ
ギノサ（Pseudomonas auriginosa）、エシェリキア（Es
cherichia）、およびエシェリキア・コリ（Escherichia
coli）を包含する。この方法では、抗微生物治療のた
めの潜在的遺伝子標的を、最初、インビトロでの成長に
対するエッセンシャリティーまたは感染におけるエッセ
ンシャリティーのいずれかで同定する。インビトロでの
成長に対するエッセンシャティーは、例えば選択された
病原体の条件付き致死突然変異体の生成により決定され
る。突然変異遺伝子は、病原体から製造したゲノムライ
ブラリーとの相補性により同定できる。シグナチャータ
グ化突然変異誘発（ＳＴＭ；Henselら、Science 269;40
0-403（1995））のごとき感染モデルによるサイクリン
グ後の負の選択の後、個々の遺伝子欠失／ノックアウト
を生成することにより、またはランダム突然変異誘発法
を用いて、感染過程における遺伝子のエッセンシャリテ
ィーを決定する。
例えばストレプトコッカス（Streptococcus）、ストレ
プトコッカス・ニューモニア（Streptococcus pneumoni
ae）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、スタフ
ィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureu
s）、エンテロコッカス（Enterococcus）、エンテロコ
ッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、シュ
ードモナス（Pseudomonas）、シュードモナス・アウリ
ギノサ（Pseudomonas auriginosa）、エシェリキア（Es
cherichia）、およびエシェリキア・コリ（Escherichia
coli）を包含する。この方法では、抗微生物治療のた
めの潜在的遺伝子標的を、最初、インビトロでの成長に
対するエッセンシャリティーまたは感染におけるエッセ
ンシャリティーのいずれかで同定する。インビトロでの
成長に対するエッセンシャティーは、例えば選択された
病原体の条件付き致死突然変異体の生成により決定され
る。突然変異遺伝子は、病原体から製造したゲノムライ
ブラリーとの相補性により同定できる。シグナチャータ
グ化突然変異誘発（ＳＴＭ；Henselら、Science 269;40
0-403（1995））のごとき感染モデルによるサイクリン
グ後の負の選択の後、個々の遺伝子欠失／ノックアウト
を生成することにより、またはランダム突然変異誘発法
を用いて、感染過程における遺伝子のエッセンシャリテ
ィーを決定する。
【００１９】前例では、転写がインビトロでは本質的に
オフであるが、インビボではオンである遺伝子の存在
を、ＩＶＥＴ技術（Slauchら、Methods in Enzymology
235:481-492（1994））および感染組織またはインビト
ロ成長細胞から単離した全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析に
より強調している。ゲノムデータベースを用いて、選択
された病原体の予想される転写物に対してプライマー対
を設計し、マイクロタイター・ディッシュ・フォーマッ
ト（microtiter dish format）に並べる。インビトロ成
長病原体から全ＲＮＡを単離し、全てのプライマー対で
ＲＴ−ＰＣＲを実施する。同様に、種々の適当な動物モ
デルにおける選択された病原体の感染から種々の時間に
単離した全ＲＮＡで、ＲＴ−ＰＣＲを実施する。当該ｍ
ＲＮＡの、ｒＲＮＡまたはハウスキーピング遺伝子のご
とき内部標準に対する比率を反映するＰＣＲプロファイ
ルを比較することにより、インビトロでは本質的に不存
在であるが、感染の種々の相を通してまたはその間で
「オン」であるこれらの転写物を同定できる。
オフであるが、インビボではオンである遺伝子の存在
を、ＩＶＥＴ技術（Slauchら、Methods in Enzymology
235:481-492（1994））および感染組織またはインビト
ロ成長細胞から単離した全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析に
より強調している。ゲノムデータベースを用いて、選択
された病原体の予想される転写物に対してプライマー対
を設計し、マイクロタイター・ディッシュ・フォーマッ
ト（microtiter dish format）に並べる。インビトロ成
長病原体から全ＲＮＡを単離し、全てのプライマー対で
ＲＴ−ＰＣＲを実施する。同様に、種々の適当な動物モ
デルにおける選択された病原体の感染から種々の時間に
単離した全ＲＮＡで、ＲＴ−ＰＣＲを実施する。当該ｍ
ＲＮＡの、ｒＲＮＡまたはハウスキーピング遺伝子のご
とき内部標準に対する比率を反映するＰＣＲプロファイ
ルを比較することにより、インビトロでは本質的に不存
在であるが、感染の種々の相を通してまたはその間で
「オン」であるこれらの転写物を同定できる。
【００２０】潜在的標的遺伝子を同定すると、次に選択
された病原体に適当なベクターにおけるリポーター遺伝
子の上流に、潜在的標的遺伝子のプロモーター領域をク
ローニングする。「適当な」とは、選択された病原体に
おいて安定して複写できるベクターを意味する。本発明
は、インビトロでは本質的に「オフ」であり、感染過程
の特定の相の間で選択的に「オン」になるプロモーター
を用いる発現ベクター系の使用に基づく。「オン」と
は、プロモーターが、結合した遺伝子の発現を誘発また
は促進することにより正常の能力で機能し、転写が検出
可能であることを意味し；「オフ」とは、プロモーター
が正常な能力で機能せず、その結果、転写が極少しかま
たは検出されないことを意味する。この新規の構築物中
のプロモーターの条件付きおよび一時的発現の保存、ま
たはその「オン／オフ」特性は、インビトロおよびイン
ビボ成長中に可視的に（発光）およびリポーターｍＲＮ
Ａに特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより確
認される。プロモーターによりこれらの特性の保存を確
認する場合、リポーター遺伝子コーディング領域を、潜
在的標的遺伝子のためのリボザイムまたはアンチセンス
ＲＮＡ構築物と置換する。最初、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼの発現を調節するＩＰＴＧ／ｌａｃＩＰＯと結合した
Ｔ７プロモーターのごとき標準的な調節可能なプロモー
ターを用いて、インビトロで標的遺伝子発現を阻害する
リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡを最適化する。
された病原体に適当なベクターにおけるリポーター遺伝
子の上流に、潜在的標的遺伝子のプロモーター領域をク
ローニングする。「適当な」とは、選択された病原体に
おいて安定して複写できるベクターを意味する。本発明
は、インビトロでは本質的に「オフ」であり、感染過程
の特定の相の間で選択的に「オン」になるプロモーター
を用いる発現ベクター系の使用に基づく。「オン」と
は、プロモーターが、結合した遺伝子の発現を誘発また
は促進することにより正常の能力で機能し、転写が検出
可能であることを意味し；「オフ」とは、プロモーター
が正常な能力で機能せず、その結果、転写が極少しかま
たは検出されないことを意味する。この新規の構築物中
のプロモーターの条件付きおよび一時的発現の保存、ま
たはその「オン／オフ」特性は、インビトロおよびイン
ビボ成長中に可視的に（発光）およびリポーターｍＲＮ
Ａに特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより確
認される。プロモーターによりこれらの特性の保存を確
認する場合、リポーター遺伝子コーディング領域を、潜
在的標的遺伝子のためのリボザイムまたはアンチセンス
ＲＮＡ構築物と置換する。最初、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼの発現を調節するＩＰＴＧ／ｌａｃＩＰＯと結合した
Ｔ７プロモーターのごとき標準的な調節可能なプロモー
ターを用いて、インビトロで標的遺伝子発現を阻害する
リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡを最適化する。
【００２１】次に標準的な技術を用いて、発現ベクター
を選択された病原体に導入する。リボザイムまたはアン
チセンスＲＮＡ構築物を担持するベクターの選択された
病原体への導入は、インビトロでの標的遺伝子の成長ま
たは発現には影響しないはずである。しかしながら構築
物を動物モデルへ導入すると、結果的に標的遺伝子発現
の低下を招くリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡ構築
物を発現することになる。遺伝子発現のレベルは、感染
中の種々の時間に感染組織から単離した全ｍＲＮＡのＲ
Ｔ−ＰＣＲによりモニターでき、ハウスキーピング遺伝
子対照および生存細胞数に相関させることができる。標
的ｍＲＮＡにおける低下は、疾患の病理学、代謝的に活
性な病原体の数を決定できる組織薄片の発光、および治
療用物質の開発のための遺伝子標的に順位を付す生存細
胞数に相関する。例えば標的ＲＮＡが有意に低下する
が、生存細胞数にはほとんど影響しない場合、生存細胞
数の低下がＲＴ−ＰＣＲ分析による標的ｍＲＮＡの低下
に相関する場合ほど、遺伝子は標的として魅力的でない
と考えられる。
を選択された病原体に導入する。リボザイムまたはアン
チセンスＲＮＡ構築物を担持するベクターの選択された
病原体への導入は、インビトロでの標的遺伝子の成長ま
たは発現には影響しないはずである。しかしながら構築
物を動物モデルへ導入すると、結果的に標的遺伝子発現
の低下を招くリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡ構築
物を発現することになる。遺伝子発現のレベルは、感染
中の種々の時間に感染組織から単離した全ｍＲＮＡのＲ
Ｔ−ＰＣＲによりモニターでき、ハウスキーピング遺伝
子対照および生存細胞数に相関させることができる。標
的ｍＲＮＡにおける低下は、疾患の病理学、代謝的に活
性な病原体の数を決定できる組織薄片の発光、および治
療用物質の開発のための遺伝子標的に順位を付す生存細
胞数に相関する。例えば標的ＲＮＡが有意に低下する
が、生存細胞数にはほとんど影響しない場合、生存細胞
数の低下がＲＴ−ＰＣＲ分析による標的ｍＲＮＡの低下
に相関する場合ほど、遺伝子は標的として魅力的でない
と考えられる。
【００２２】本発明の方法に準じて同定した遺伝子およ
び遺伝子生成物を、次に治療用および診断用物質の設計
に用いることができる。例えば、この方法に準じて感染
過程における選択された病原体に必須であると同定した
された遺伝子、およびそれによりコードされるタンパク
質は、この病原体による感染の治療のための治療薬とし
て有用な天然または化学的合成化合物のスクリーニング
および開発のための標的として提供できる。一例とし
て、かかる遺伝子によりコードされるかかるタンパク質
に結合し、その生物学的活性を阻害できる化合物は、特
定の生物の成長の結果もたらされる疾患または障害を防
御する薬物成分として有用である。また別に、必須遺伝
子の発現を阻害するまたは低下させる化合物は、治療用
として有用であると考えられる。
び遺伝子生成物を、次に治療用および診断用物質の設計
に用いることができる。例えば、この方法に準じて感染
過程における選択された病原体に必須であると同定した
された遺伝子、およびそれによりコードされるタンパク
質は、この病原体による感染の治療のための治療薬とし
て有用な天然または化学的合成化合物のスクリーニング
および開発のための標的として提供できる。一例とし
て、かかる遺伝子によりコードされるかかるタンパク質
に結合し、その生物学的活性を阻害できる化合物は、特
定の生物の成長の結果もたらされる疾患または障害を防
御する薬物成分として有用である。また別に、必須遺伝
子の発現を阻害するまたは低下させる化合物は、治療用
として有用であると考えられる。
【００２３】慣用されるアッセイおよび技術をかかる治
療薬のスクリーニングおよび開発に用いることができ
る。例えば、これらの遺伝子配列によりコードされるタ
ンパク質に特異的に結合するかまたはこれを阻害する化
合物の同定方法は、試験化合物をタンパク質に結合でき
るような試験化合物と選択されたタンパク質または遺伝
子生成物を接触させ；タンパク質に結合する試験化合物
がもしあれば、その量を決定する工程を単に包含でき
る。かかる方法では、試験化合物をインキュベーション
し、タンパク質を固体支持体に固定化する。さらにその
他の薬物スクリーニングに慣用される方法では、その遺
伝子生成物またはその一部分の構造に類似または相補的
である化合物を決定し、適当なコンピュータープログラ
ムを用いて、タンパク質に競合結合するそれらの化合物
をスクリーニングできる。かかる化合物は適当な治療用
製剤に単独で、またはその他の活性成分と組み合わせて
処方できる。かかる治療用組成物および適当な医薬用担
体等の処方の方法は当業者に周知である。従って、かか
る方法を用いることにより、本発明はこれらの遺伝子、
またはコードされるタンパク質もしくはそのフラグメン
トと相互作用し、望むように、生物学的活性を増強させ
るか、または低下させることができる化合物を提供する
と考える。かかる化合物はまた本発明の範囲内である。
療薬のスクリーニングおよび開発に用いることができ
る。例えば、これらの遺伝子配列によりコードされるタ
ンパク質に特異的に結合するかまたはこれを阻害する化
合物の同定方法は、試験化合物をタンパク質に結合でき
るような試験化合物と選択されたタンパク質または遺伝
子生成物を接触させ；タンパク質に結合する試験化合物
がもしあれば、その量を決定する工程を単に包含でき
る。かかる方法では、試験化合物をインキュベーション
し、タンパク質を固体支持体に固定化する。さらにその
他の薬物スクリーニングに慣用される方法では、その遺
伝子生成物またはその一部分の構造に類似または相補的
である化合物を決定し、適当なコンピュータープログラ
ムを用いて、タンパク質に競合結合するそれらの化合物
をスクリーニングできる。かかる化合物は適当な治療用
製剤に単独で、またはその他の活性成分と組み合わせて
処方できる。かかる治療用組成物および適当な医薬用担
体等の処方の方法は当業者に周知である。従って、かか
る方法を用いることにより、本発明はこれらの遺伝子、
またはコードされるタンパク質もしくはそのフラグメン
トと相互作用し、望むように、生物学的活性を増強させ
るか、または低下させることができる化合物を提供する
と考える。かかる化合物はまた本発明の範囲内である。
【００２４】本発明の多くの修飾および変更は前記した
本明細書に包含され、当業者に明白であると考えられ
る。本発明の組成物および方法に対するかかる修飾およ
び改変は本明細書に添付した請求の範囲の範囲内である
と考える。本明細書に開示した参考文献は、その内容を
出典明示により本明細書の一部とする。本出願の先願の
特許出願もまた、その内容を出典明示により本明細書の
一部とする。以下の実施例は限定するものではなく、本
明細書をさらに説明するために提供するものである。
本明細書に包含され、当業者に明白であると考えられ
る。本発明の組成物および方法に対するかかる修飾およ
び改変は本明細書に添付した請求の範囲の範囲内である
と考える。本明細書に開示した参考文献は、その内容を
出典明示により本明細書の一部とする。本出願の先願の
特許出願もまた、その内容を出典明示により本明細書の
一部とする。以下の実施例は限定するものではなく、本
明細書をさらに説明するために提供するものである。
【００２５】
実施例１：遺伝子エッセンシャリティー エス・アウレウス（S．aureus）感染において発現する
遺伝子のエッセンシャリティーを、エス・アウレウスの
選択された株、例えばＲＮ４２２０で感染した細胞１０
2〜１０8個を、ネズミ創傷または腎盂腎炎モデルのごと
き適当な動物モデルに導入することにより決定する。感
染後種々の時間に動物から感染組織を回収する。全ＲＮ
Ａを組織から単離し、エス・アウレウスゲノムデータベ
ースを用いて設計したプライマーで指示されるＲＴ−Ｐ
ＣＲに供し、実験中のエス・アウレウス株によりコード
される全転写物を増幅する。転写物が一過性であり、条
件付きで調節される遺伝子のプロモーターを、次いでAu
gustinら、Eur.J.Biochem.204:1149-1154（1992）に記
載される方法に準じて、イー・コリ（E.coli）／エス・
アウレウスシャトルベクターに、ｐＣＵ１の独特なＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位でライゲーションする。このシャトルベ
クターはまたｐＣＵ１の独特なＥｃｏＲ１部位に挿入し
たエス・アウレウス翻訳物のための適当なコドンを含有
するリポーター遺伝子ｌｕｃをも担持する。選別用にア
ンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）抵抗性を用いて、組換
え物をイー・コリ中で増幅する。
遺伝子のエッセンシャリティーを、エス・アウレウスの
選択された株、例えばＲＮ４２２０で感染した細胞１０
2〜１０8個を、ネズミ創傷または腎盂腎炎モデルのごと
き適当な動物モデルに導入することにより決定する。感
染後種々の時間に動物から感染組織を回収する。全ＲＮ
Ａを組織から単離し、エス・アウレウスゲノムデータベ
ースを用いて設計したプライマーで指示されるＲＴ−Ｐ
ＣＲに供し、実験中のエス・アウレウス株によりコード
される全転写物を増幅する。転写物が一過性であり、条
件付きで調節される遺伝子のプロモーターを、次いでAu
gustinら、Eur.J.Biochem.204:1149-1154（1992）に記
載される方法に準じて、イー・コリ（E.coli）／エス・
アウレウスシャトルベクターに、ｐＣＵ１の独特なＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位でライゲーションする。このシャトルベ
クターはまたｐＣＵ１の独特なＥｃｏＲ１部位に挿入し
たエス・アウレウス翻訳物のための適当なコドンを含有
するリポーター遺伝子ｌｕｃをも担持する。選別用にア
ンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）抵抗性を用いて、組換
え物をイー・コリ中で増幅する。
【００２６】このようにして生成した組換えプラスミド
を次いでイー・コリから単離し、エレクトロポレーショ
ンによりエス・アウレウスＲＮ４２２０に導入し、クロ
ラムフェニコール（１０ｍｇ／ｍｌ）抵抗性により選別
し、次いでにルシフェラーゼ反応のための基質および脂
肪酸の生合成並びリサイクリングのための遺伝子を、毒
性に影響を及ぼさない既知の位置で染色体に挿入して担
持するように修飾した毒性エス・アウレウスＷＣＵＨ２
９株に移す。ルシフェラーゼ発現を、組織薄片中の発光
を探すことにより、またはインビトロおよびインビボの
両方でルシフェラーゼ特異的ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分
析により可視的に測定し、プロモーターの特性が保存さ
れているかどうかを確認する。プロモーターの「オン／
オフ」特性が保存されている場合、ルシフェラーゼ遺伝
子のコーディング配列が、実験中の候補遺伝子に特異的
なリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡのコーディング
配列と置換されている。染色体中にルシフェラーゼオペ
ロン全体を担持するよう修飾したエス・アウレウスに、
新しい構築物を挿入する。リボザイムまたはアンチセン
スＲＮＡ、およびその標的ＲＮＡのインビトロで成長し
ている間の発現をモニターし、発現が適当であることを
確認する。次に、構築物を担持するエス・アウレウスを
一晩抗生物質の存在下で成長させ、１０2〜１０8個の生
存細胞を動物モデルに導入することにより、感染中の両
方の発現をモニターする。標的ｍＲＮＡの低下は、疾病
の病理学、代謝的に活性な細菌数を測定できる組織薄片
中の発光、および遺伝子候補物質が治療薬の開発のさき
がけとなり得る生存細胞数を包含する感染の進行に相関
する。
を次いでイー・コリから単離し、エレクトロポレーショ
ンによりエス・アウレウスＲＮ４２２０に導入し、クロ
ラムフェニコール（１０ｍｇ／ｍｌ）抵抗性により選別
し、次いでにルシフェラーゼ反応のための基質および脂
肪酸の生合成並びリサイクリングのための遺伝子を、毒
性に影響を及ぼさない既知の位置で染色体に挿入して担
持するように修飾した毒性エス・アウレウスＷＣＵＨ２
９株に移す。ルシフェラーゼ発現を、組織薄片中の発光
を探すことにより、またはインビトロおよびインビボの
両方でルシフェラーゼ特異的ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分
析により可視的に測定し、プロモーターの特性が保存さ
れているかどうかを確認する。プロモーターの「オン／
オフ」特性が保存されている場合、ルシフェラーゼ遺伝
子のコーディング配列が、実験中の候補遺伝子に特異的
なリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡのコーディング
配列と置換されている。染色体中にルシフェラーゼオペ
ロン全体を担持するよう修飾したエス・アウレウスに、
新しい構築物を挿入する。リボザイムまたはアンチセン
スＲＮＡ、およびその標的ＲＮＡのインビトロで成長し
ている間の発現をモニターし、発現が適当であることを
確認する。次に、構築物を担持するエス・アウレウスを
一晩抗生物質の存在下で成長させ、１０2〜１０8個の生
存細胞を動物モデルに導入することにより、感染中の両
方の発現をモニターする。標的ｍＲＮＡの低下は、疾病
の病理学、代謝的に活性な細菌数を測定できる組織薄片
中の発光、および遺伝子候補物質が治療薬の開発のさき
がけとなり得る生存細胞数を包含する感染の進行に相関
する。
【００２７】実施例２：インビボモデルで「オン」であ
るスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus a
ureus）プロモーター エス・アウレウスプロモーター配列を発現の「オン」お
よび「オフ」様式を調節できるプロモーターの実例とし
て提供する。このオープン・リーディング・フレーム
（本明細書において「ＯＲＦ」と称する）のプロモータ
ー配列を感染動物モデルにインビボで転写するが、イン
ビトロでは転写しない。このプロモーターを本発明の方
法において使用できる。２個の好ましい推定プロモータ
ー配列領域が存在し、下線を付して示す。下線を付し、
太字で示した配列番号：１（以下）の配列は、最も好ま
しい推定プロモーター領域を示している。これの上流は
２番目に好ましい推定プロモーター領域（下線のみ）で
ある。配列番号：１の配列から転写された遺伝子のＡＴ
Ｇ出発コドンをイタリックで示す。本明細書に記載する
方法において試験した遺伝子を、この出発コドンを包含
するまたは包含しないプロモーター配列に発現可能なよ
うにライゲーションできる。
るスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus a
ureus）プロモーター エス・アウレウスプロモーター配列を発現の「オン」お
よび「オフ」様式を調節できるプロモーターの実例とし
て提供する。このオープン・リーディング・フレーム
（本明細書において「ＯＲＦ」と称する）のプロモータ
ー配列を感染動物モデルにインビボで転写するが、イン
ビトロでは転写しない。このプロモーターを本発明の方
法において使用できる。２個の好ましい推定プロモータ
ー配列領域が存在し、下線を付して示す。下線を付し、
太字で示した配列番号：１（以下）の配列は、最も好ま
しい推定プロモーター領域を示している。これの上流は
２番目に好ましい推定プロモーター領域（下線のみ）で
ある。配列番号：１の配列から転写された遺伝子のＡＴ
Ｇ出発コドンをイタリックで示す。本明細書に記載する
方法において試験した遺伝子を、この出発コドンを包含
するまたは包含しないプロモーター配列に発現可能なよ
うにライゲーションできる。
【００２８】（配列番号：１）
【化１】
【００２９】
（１）一般的情報 （ｉ）出願人：パーマー，レスリー プラット，ジュリー ローゼンバーグ，マーティン （ｉｉ）発明の名称：病原体における必須遺伝子の決定
方法 （ｉｉｉ）配列の数：１ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛て名：スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：１９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒介タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）作動システム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：Ｗｉｎｄｏｗｓバージョン２.０
用ＦａｓｔＳＥＱ （ｖｉ）本願のデータ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日：１９９７年１０月１５日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願のデータ： （Ａ）出願番号：６０／０２８４１６ （Ｂ）出願日：１９９６年１０月１５日 （Ａ）出願番号：６０／０３１１６１ （Ｂ）出願日：１９９６年１１月１８日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ギミ，エドワード・アール （Ｂ）登録番号：３８８９１ （Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５０５６９ （ｘｉ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−４４７８ （Ｂ）ファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：
方法 （ｉｉｉ）配列の数：１ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛て名：スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：１９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒介タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）作動システム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：Ｗｉｎｄｏｗｓバージョン２.０
用ＦａｓｔＳＥＱ （ｖｉ）本願のデータ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日：１９９７年１０月１５日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願のデータ： （Ａ）出願番号：６０／０２８４１６ （Ｂ）出願日：１９９６年１０月１５日 （Ａ）出願番号：６０／０３１１６１ （Ｂ）出願日：１９９６年１１月１８日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ギミ，エドワード・アール （Ｂ）登録番号：３８８９１ （Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５０５６９ （ｘｉ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−４４７８ （Ｂ）ファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：
【００３０】（２）配列番号：１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２８１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１：
【化２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジュリー・エム・プラット イタリア37155ベローナ、ビア・アレッサ ンドロ・フレミング２番 (72)発明者 マーティン・ローゼンバーグ アメリカ合衆国19468ペンシルベニア州ロ イヤーズフォード、ミンゴ・ロード241番
Claims (20)
- 【請求項１】 選択された病原体における遺伝子エッセ
ンシャリティー（gene essentiality）の測定法であっ
て： （ａ）オン／オフ特性を有する潜在的標的遺伝子のプロ
モーターおよびリポーター遺伝子を有してなるベクター
発現系を製造すること； （ｂ）そのベクター発現系における標的遺伝子プロモー
ターを潜在的標的遺伝子のためのリボザイムまたはアン
チセンス構築物と発現可能なように連結させること； （ｃ）そのリボザイムまたはアンチセンス構築物を含有
する発現ベクター系を選択された病原体に導入するこ
と； （ｄ）少なくとも一の動物を該発現ベクター系を含有す
る病原体に感染させること； （ｅ）その標的遺伝子の遺伝子発現レベルを測定するこ
と；および （ｆ）標的遺伝子発現レベルを該動物における感染の進
行と相関させて、選択された病原体の成長に必須の遺伝
子を同定すること；からなる測定法。 - 【請求項２】 選択された病原体における遺伝子エッセ
ンシャリティーの測定法であって： （ａ）オン／オフ特性を有する潜在的標的遺伝子のプロ
モーターおよびリポーター遺伝子を有してなるベクター
発現系を製造すること； （ｂ）そのベクター発現系における標的遺伝子プロモー
ターを潜在的標的遺伝子のためのリボザイムまたはアン
チセンス構築物と発現可能なように連結させること； （ｃ）そのリボザイムまたはアンチセンス構築物を含有
する発現ベクター系を選択された病原体に導入するこ
と； （ｄ）少なくとも一の動物を該発現ベクター系を含有す
る病原体に感染させること； （ｅ）その標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定するこ
と；および （ｆ）ｍＲＮＡレベルを該動物における感染の進行と相
関させて、選択された病原体の成長に必須の遺伝子を同
定すること；からなる測定法。 - 【請求項３】 選択された病原体における遺伝子エッセ
ンシャリティーの測定法であって： （ａ）潜在的標的遺伝子を同定すること； （ｂ）オン／オフ特性を有する潜在的標的遺伝子のプロ
モーターおよびリポーター遺伝子を有してなるベクター
発現系を製造すること； （ｃ）そのベクター発現系においてプロモーターのオン
／オフ特性が保存されていることを確認すること； （ｄ）そのベクター発現系におけるリポーター遺伝子を
潜在的標的遺伝子のためのリボザイムまたはアンチセン
ス構築物と置換すること； （ｅ）そのリボザイムまたはアンチセンス構築物を含有
する発現ベクター系を選択された病原体に導入するこ
と； （ｆ）少なくとも一の動物を発現ベクター系を含有する
病原体に感染させること； （ｇ）その標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定するこ
と；および （ｈ）ｍＲＮＡレベルを該動物における感染の進行と相
関させて、選択された病原体の成長に必須の遺伝子を同
定すること；からなる測定法。 - 【請求項４】 選択された病原体における遺伝子エッセ
ンシャリティーの測定法であって： （ａ）オン／オフ特性を有する潜在的標的遺伝子のプロ
モーターおよびリポーター遺伝子を有してなるベクター
発現系を製造すること； （ｂ）そのベクター発現系における標的遺伝子プロモー
ターを潜在的標的遺伝子のためのリボザイムまたはアン
チセンス構築物と発現可能なように連結させること； （ｃ）そのリボザイムまたはアンチセンス構築物を含有
する発現ベクター系を選択された病原体に導入するこ
と； （ｄ）少なくとも一の動物を該発現ベクター系を含有す
る病原体に感染させること； （ｅ）標的遺伝子により発現したタンパク質レベルを測
定すること；および （ｆ）タンパク質レベルを該動物における感染の進行と
相関させて、選択された病原体の成長に必須の遺伝子お
よび遺伝子生成物を同定すること；からなる測定法。 - 【請求項５】 選択された病原体がストレプトコッカス
（Streptococcus）、ストレプトコッカス・ニューモニ
ア（Streptococcus pneumoniae）、スタフィロコッカス
（Staphylococcus）、スタフィロコッカス・アウレウス
（Staphylococcus aureus）、エンテロコッカス（Enter
ococcus）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococ
cus faecalis）、シュードモナス（Pseudomonas）、シ
ュードモナス・アウリギノサ（Pseudomonas auriginos
a）、エシェリキア（Escherichia）およびエシェリキア
・コリ（Escherichia coli）からなる群から選択される
請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 選択された病原体がストレプトコッカス
（Streptococcus）、ストレプトコッカス・ニューモニ
ア（Streptococcus pneumoniae）、スタフィロコッカス
（Staphylococcus）、スタフィロコッカス・アウレウス
（Staphylococcus aureus）、エンテロコッカス（Enter
ococcus）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococ
cus faecalis）、シュードモナス（Pseudomonas）、シ
ュードモナス・アウリギノサ（Pseudomonas auriginos
a）、エシェリキア（Escherichia）およびエシェリキア
・コリ（Escherichia coli）からなる群から選択される
請求項２記載の方法。 - 【請求項７】 選択された病原体がストレプトコッカス
（Streptococcus）、ストレプトコッカス・ニューモニ
ア（Streptococcus pneumoniae）、スタフィロコッカス
（Staphylococcus）、スタフィロコッカス・アウレウス
（Staphylococcus aureus）、エンテロコッカス（Enter
ococcus）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococ
cus faecalis）、シュードモナス（Pseudomonas）、シ
ュードモナス・アウリギノサ（Pseudomonas auriginos
a）、エシェリキア（Escherichia）およびエシェリキア
・コリ（Escherichia coli）からなる群から選択される
請求項３記載の方法。 - 【請求項８】 選択された病原体がストレプトコッカス
（Streptococcus）、ストレプトコッカス・ニューモニ
ア（Streptococcus pneumoniae）、スタフィロコッカス
（Staphylococcus）、スタフィロコッカス・アウレウス
（Staphylococcus aureus）、エンテロコッカス（Enter
ococcus）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococ
cus faecalis）、シュードモナス（Pseudomonas）、シ
ュードモナス・アウリギノサ（Pseudomonas auriginos
a）、エシェリキア（Escherichia）およびエシェリキア
・コリ（Escherichia coli）からなる群から選択される
請求項４記載の方法。 - 【請求項９】 感染工程の動物を齧歯類、マウス、ラッ
ト、ウサギおよびモルモットからなる群から選択する請
求項１記載の方法。 - 【請求項１０】 感染工程の動物を齧歯類、マウス、ラ
ット、ウサギおよびモルモットからなる群から選択する
請求項２記載の方法。 - 【請求項１１】 感染工程の動物を齧歯類、マウス、ラ
ット、ウサギおよびモルモットからなる群から選択する
請求項３記載の方法。 - 【請求項１２】 感染工程の動物を齧歯類、マウス、ラ
ット、ウサギおよびモルモットからなる群から選択する
請求項４記載の方法。 - 【請求項１３】 請求項１記載のベクターを有してなる
キット。 - 【請求項１４】 請求項１記載のベクター。
- 【請求項１５】 請求項１記載の病原体。
- 【請求項１６】 オン／オフ特性を有する潜在的標的遺
伝子のプロモーターおよびリポーター遺伝子を有してな
る発現ベクター。 - 【請求項１７】 潜在的標的遺伝子のためのリボザイム
またはアンチセンス構築物に発現可能なように連結した
標的遺伝子プロモーターを有してなるベクター。 - 【請求項１８】 オン／オフ特性を有する潜在的標的遺
伝子のプロモーターおよびリポーター遺伝子を有してな
る発現ベクターからなる病原体。 - 【請求項１９】 潜在的標的遺伝子のためのリボザイム
またはアンチセンス構築物に発現可能なように連結した
標的遺伝子プロモーターを有してなるベクターからなる
病原体。 - 【請求項２０】 請求項１９記載の病原体を有してなる
動物。
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|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9320250A Withdrawn JPH10191990A (ja) | 1996-10-15 | 1997-10-15 | 病原体に必須の遺伝子の測定法 |
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|---|---|
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| JP (1) | JPH10191990A (ja) |
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-
1997
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- 1997-10-15 JP JP9320250A patent/JPH10191990A/ja not_active Withdrawn
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