JPH04502851A - 原核生物細胞中にポリペプチドを調製するための発現システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３３、前記細胞が旦、ｌＬ細胞である請求の範囲第３２項記載の細胞。

３４、対象のポリペプチド及びバクテリオファージスＮ−タンパク質又はＣｒｏ タンパク質からの約８〜約３５個のＮ−末端アミノ酸又は前記対象のポリペプチ ドのＮ〜末端に結合される変性された細菌性アルカリホスファターゼシグナル配 列を含んで成る融合タンパク質。

３５、前記対象のポリペプチドと前記Ｎ−末端のアミノ酸との間に少なくとも１ つのアミノ酸の中心領域をさらに含んで成る請求の範囲第３４項記載の融合タン パク質。

３６、前記中心領域が化学的切断部位又は酵素的切断部位を含んで成る請求の範 囲第３５項記戦の融合タンパク質。

明　細　書 にポリペプチド ｆ　１　るための　システム ゛　へのクロス１フ　レンス この出願は、１９８７年１０月３０日に出願されたアメリカ特許出願第１１５． １３９号の一部継続出願である、１９８８年９月２日に出願されたアメリカ特許 出願第２４０．７６８号の一部継続出願であり、これを引用により本明細書中に 組込む。

庄−輪 孜歪公立 本発明は、新規ペプチドの組成物及びその調製方法、特に組換え技法を用いての 融合ポリペプチドに関する。

■−景 遺伝子工学の出現は、多量の種々のペプチドの容易な製造を可能にした。しかし ながら、この可能性は、多くの理由のために十分に実現化されていない。たとえ ば、ペプチドが生成され、そして宿主生物の細胞質中に保持されている場合、封 入体は、しばしば単に一部又はほとんどの好結果をもたらさないで、タンパク質 の変性及び再生の必要性をもたらして来た。他の場合、ペプチドが実質的に分解 され、その結果、低収率のみならず、また複雑化された混合物が得られ、そして これは分離するのに難かしくなる。

これらの困難性に対する可能性ある解決法として、栄養培地中への所望するペプ チドの分泌を得ることの可能性が調査されて来た。所望するタンパク質の分泌を 得ることは、すべてのタンパク質は、使用されて来た宿主細胞により分泌され得 ないので、これまで制限されて来た。さらに、分泌される場合でさえ、宿主細胞 によるペプチドのプロセッシングは、所望するポリペプチドの組成物及び／又は コンホメーションとは異なる生成物をもたらし、そしてそのタンパク質の収量は 予想よりも少なかった。従って、所望するポリペプチドが分解しないで宿主細胞 中で蓄積することができ、そして活性コンホメーション形で分泌されるか又は便 利には機能的状態にプロセッシングされ、そして再生され得る活性ペプチドの効 果的且つ経済的産生のためのシステムを開発することに実質的な興味が存在する 。

１里■！ｈ 活性遺伝子生成物の増強された発現及び産生を提供する発現カセット及びそれら の調製及び使用方法が記載される。その発現カセットは、宿主細胞が所望するポ リペプチドの発現を付与するために適切な効果的転写及び翻訳開始及び終結円節 領域を含む。その発現カセットは、さらに好ましくは、宿主細胞のために適切な ように、調節領域の転写及び翻訳調節下での発現のためのリーダー配列、成熟ポ リペプチドからリーダーペプチドの分解のために酵素又は化学的分解部位を付与 する配列及びモジュレートされるべき対象の遺伝子の発現の時期を可能にする調 節配列を含む、その発現力セントは、条件下で宿主細胞中に導入され、それによ ってその得られた形質転換体は安定して発現カセットを維持する。天然に存在す るＤＮＡ及び合成遺伝子は、対象のポリペプチドの産生のために使用され得る。

豆主夏皿様立記１ 本発明によれば、宿主細胞中に挿入される場合、増強された安定性を有し、そし て活性コンホメーションで分泌され又は便利には活性状態にプロセッシングされ 、そして再生され得る対象のポリペプチドの調製を可能にする発現カセットが供 給される。

宿主細胞中に対象のポリペプチドの増強された発現を得るために、対象のポリペ プチドのＮ−末端アミノ酸をコードするヌクレオチドを、コドン組型の強制下で 変性し、発現カセットに使用されるシャインーダルガルノ配列と共に見出される 天然の遺伝子配列のヌクレオチドをまねる。従って、発現カセットは次の一般構 造を存する：　Ｐ　−５，Ｄ、　−ｍｅｔ　−Ｇ＋　。

ここで、ＰはＲＮＡ鎖の開始から上流の約−３５及び−１０ヌクレオチドで存在 する調節領域を含むプロモーター配列を含み、そしてまた、調節の誘発を可能に する調節配列も含むことができ； Ｓ、Ｄ、はシャインーダルガルノ配列を含み；ｓｅｔは対象のポリペプチドの開 始メチオニンのためのコドンを含み；そして Ｇ、は対象のポリペプチドのための遺伝を含み、ここでその遺伝子の初めの７〜 ３０個のコドンは、可能な場合どこででも、発現カセットに使用されるシャイン ーダルガルノ配列に続く天然の遺伝子のヌクレオチド配列に近づけるためにコド ン組型を用いて変性されている。

宿主細胞から対象のポリペプチドの増強された発現を得るための他の手段として 、ポリペプチドは、対象の遺伝子からの上流で読み枠を合わして連結されるリー ダー配列ペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現カセットに含むことによって、 融合タンパク質として発現され得る。融合タンパク質としての対象のポリペプチ ドの発現は、対象のポリペプチドである宿主細胞により産生されるタンパク質３ ０％まで又はそれ以上をもたらすことができる。融合タンパク質を発現するため の発現カセットは次の基本構造を有する：Ｐ　−Ｓ、Ｄ、　−＋ａｅｔ　−Ｌ　 −Ｇ。

ここで、ｐ、ｓ、ｏ、及びｍｅｔは上記意味を有し；Ｇは対象のポリペプチドの ための遺伝子を含み；そしてＬは細菌又はバクテリオファージ遺伝子からである が、しかし一般的には高く発現された遺伝子からであるＮ−末端配列のリーダー ペプチドをコードするＤＮＡ配列；多くの数の疎水性アミノ酸残基を含むアミノ 酸配列；又は多くの数の親水性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含む。Ｌが疎 水性アミノ酸配列を含む場合、この配列は好ましくは、シグナル配列として機能 し、宿主細胞からの対象のポリペプチドの分泌及びそのポリペプチドからのシグ ナル配列の分離を可能にする。ＬをコードするＤＮＡ配列はまた、可能な場所の どこでも、コドン組型を用いて変性され、発現カセットに使用されるシャインー ダルガルノ配列に続く天然の遺伝子のヌクレオチド配列に近づけられる。

上記発現カセットは、対象のポリペプチド及びリーダーペプチドを含んで成る融 合発現生成物を付与する。対象のポリペプチドのみを得ることが所望され、そし てたとえば天然のシグナル配列により付与されるような便利な切断部位が存在し ない場合、切断部位は、対象の遺伝子からの上流で読み枠を合わして切断部位を コードする少なくとも１つのコドンを連結することによって付与され得る。従っ て、そのカセットは次の構造を有する： Ｐ　−５，Ｄ、　−ｍｅｔ　−Ｌ　−Ｃ−Ｇ。

ここでＰ　、　Ｓ、Ｄ、、　ｍｅｅｔ、　Ｌ及びＧは前記意味を有し、そして、 Ｃは化学的又は酵素的切断部位を付与する少な（とも１つのコドンを含んで成る 。

＋ａＲＮＡを安定化し、そして所望するポリペプチドの高レベルの発現を付与す るためには、転写終止領域（Ｔ）が、対象の遺伝子から下流の発現カセットに含 まれ得る。Ｔを含んで成る発現カセットの例は次の通りである：Ｐ−Ｓ、Ｄ、− ＋ｓｅｔ　−Ｇ　−Ｔ。

但し、Ｔは上記のいづれかの発現カセットに含有される。

カセットの 高レベルの遺伝子生成物を得るための発現システムのためには、発現に影響を及 ぼすことが決定されている遺伝子の特定の領域だけでなく、またいかにこれらの 領域（及び従ってそれらの配列）がお互い影響を及ぼすかを考慮すべきである。

可能な場合、適切な調節配列の選択により、発現に影響を及ぼす種々の因子を考 慮すべきである。種々、の遺伝子が、特定の発現速度を得るためにこれらの因子 のすべての組合せを生ぜしめ、従って高く発現された遺伝子が有用なモデルとし てみなされ得る。

転写調節に関しては、ｍＲＮＡ０量及び安定性が、遺伝子生成物の発現に影響を 及ぼす重要な因子である。ｎ＋ＲＮＡ０量は、特定の遺伝子のコピー数、そのプ ロモーターの相対的効力及びプロモーターを調節する因子、たとえばエンハンサ −又はリプレッサーにより決定される。開始は、コード配列の起原のちょうど上 流に存在すると思われる。

原核生物細胞中のプロモーターは、転写の効力に影響を及ぼすことができるヌク レオチド配列を含有する。これらの配列は、ＲＮＡ鎖の開始から約−３５及び− １０のヌクレオチドで調節領域を含む。効果的なプロモーターは、これらを含み 、ここで−３５及び−１０のｇＪｌ　ｊＦｆｆ　ｆｉｌ域のヌクレオチド配列は 、高い効果的な遺伝子からの細菌性プロモーターにおけるこれらの領域のための コンセンサス配列と実質的に同じである。一般的にこれらの領域はそれぞれ約５ 個のヌクレオチド及び６個のヌクレオチドの長さを有し、そしてそれぞれの配列 は長さ及び／又は配列で約１個のヌクレオチドにより異なることができる。−３ ５コンセンサス調節配列のための好ましい配列はｔｒｐプロモーター、すなわち ＴＧＡＣＡからのものであり、そして−１０コンセンサス調節配列のための好ま しい配列はｌａｃプロモーター、すなわちＴＡＴＡＡＴからのものである。

ヌクレオチド配列だけでなく、また−３５及び−１０の調節領域のコンセンサス 配列の空間が、対象の遺伝子の最適な転写を得るためにお互い重要である。一般 的に、−３５及び−１０の調節領域のコンセンサス配列は、約１６〜１８個のヌ クレオチド、好ましくは約１７個のヌクレオチドにより分離される。

効果的な転写を付与する例示的な転写調Ｗｊ　領域又はプロモーターは、θ−ｇ ａｌプロモーター、左及び右のλプロモーター、ｔｒｐ及びＩａｃプロモーター 並びにｔｒｐ−１ａｃ（ｔａｃ）融合プロモーター、及び同様のものを含む、こ れらの配列に実質的に類似する配列を有する合成プロモーターもまた使用され得 る。好ましいプロモーターは、　ｔｒｐプロモーターからの一３５調節領域及び ｌａｃプロモーターからの一１０調節領域を含む融合プロモーターである。最っ とも好ましくは、プロモーターは、−３５ｔｒｐコンセンサス配列が一１０１ａ ｃコンセンサス配列から約１７個のヌクレオチド目の上流に位置するプロモータ ーである。

転写調節領域はさらに、増殖培地中における栄養物又は発現生成物の存在又は不 在により、温度及び同様のものにより調節されるべき対象の遺伝子の発現の時期 を可能にする調節配列を含むことができる。たとえば対象の遺伝子の発現は、発 現ベクター中にバタテリオファージλＰＬプロモーター、バタテリオファージＯ Ｌオペレーター及び温度感受性Ｃ，リプレッサーをコードする遺伝子Ｃ１８５７ をを含有する調節配列を含むことによって宿主細胞増殖培地の温度により調節さ れ得る。これは、低温度、たとえば約３０″Ｃでリプレッサーとオペレーターと の相互作用によりプロモーターの調節を可能にするであろう。約４２℃への温度 の上昇は、リプレッサーを不活性化し、そして対象の遺伝子の発現を可能にする 。

増殖培地栄養物を用いる調節の例として、ｌａｃ又はｔｒｐ　−１ａｃハイブリ ツドプロモーターの調節が、−１０調節領域から下流のｌａｃプロモーター領域 に結合する、Ｌａｃｌリプレッサーのための遺伝子の使用により達成され得る。

そのＬａｃＩリプレッサー遺伝子は、エピゾーム、好ましくは１ａｃｌｑ増強変 異体上に存在することができ、又は発現カセット自体中に含まれ得る。増殖培地 中における有意な濃度のりブレッサーの存在は、インデューサーの不在下でプロ モーター機能を阻害する。

従って、宿主増殖培地へのＩＰＴＧ又はラクトースの添加は、プロモーター機能 を増強する。細菌株がＬａｃ”である場合、ラクトースが、ＩＰＴＧＯ代わりに インデューサーとして使用され得る。

転写調節領域は、転写を終結し、そしてｍＲＮＡの分解を阻害し、そして従って ｍＲＮＡ種の安定性を高め、そして高い発現を可能にする配列又は構造体を付与 する調節配列をさらに含むことができる。原核生物の配列のいくつかの例として 、ｔｒｐターミネータ−１遺伝子ＣＴ４）ターミネータ−又は遺伝子３２に配列 的に類似する合成ターミネータ−が知られている。

翻訳調節に関しては、ｍＲＮＡが存在する場合、発現は、開始の速度（ｍＲＮＡ に結合するリポソーム）、延長の速度（ｍＲＮＡの向こう側へのリポソームのト ランスロケーション）、翻訳後変性の速度及び遺伝子生成物の安定性に影響を及 ぼすことによって調節され得る。延長の速度はたぶん、コドン処理により影響さ れ；微量ｔＲＮＡのためのコドンの使用は翻訳速度を減じることができる。従っ て、翻訳速度を早めるために宿主細胞により通常発現される遺伝子に頻繁に出現 するコドンを使用することが好ましい。

−３５及び−１０の調節領域から下流に、一般的にシャインーダルガルノの配列 と呼ばれるＡＧＧＡのコンセンサスヌクレオチド配列が存在し、これはリポソー ム結合に関与すると思われている。最適なリポソーム結合及び翻訳の開始は、高 く発現された遺伝子からの、宿主細胞中で機能的なリポソーム結合部位を用いる ことによって達成され得る。シャインーダルガルノ配列、及びたぶんリポソーム が開始部位を認識する構造上のモチーフの形成によりリポソーム結合に影響を及 ぼすことができるコード領域内の配列を囲むヌクレオチド配列の存在が証拠とし て指摘され、従って、前記コード領域のヌクレオチド配列の変更が、最適なリポ ソーム結合及び翻訳の開始を達成するために使用され得る。開始コドンＡＴＣの 後の初めの約７〜３０個のコドンの配列がまた、結合及び発現にも影響を及ぼす ことができる。好ましくは、リーダー配列及びシャインーダルガルノ配列は同じ 遺伝子から得られ、又はそれらが異なった遺伝子から得られる場合、リーダー配 列のコドンは、リーダー配列に続く天然の遺伝子のヌクレオチド配列に接近する ようにコドン縮重を用いて変性され得る。

開始ＡＴＧコドンに関するＡＧＧＡ配列の位置が発現に影響を及ぼすことができ る。一般的に、シ＋インーダルガルノ配列は、突然、高レベルの発現が発現カセ ットを用いて達成され得るけれども、開始コドンから約５〜９個目のヌクレオチ ドに位置し、この際、前記発現カセットにおいては、シャインーダルガルノ配列 は開始コドンから約１６〜１８個目のヌクレオチド、好ましくは１１〜１２個目 のヌクレオチドに位置する。

ｍＲＮＡの安定性は、リボヌクレアーゼ酵素への５ＲＮＡの感受性により支配さ れる。一般的に、エキソヌクレアーゼ消化は、ｍＲＮＡの末端での構造的モチー フ、パリンドローム構造、変更されたヌクレオチド又は特定のヌクレオチド配列 の存在により阻害される。エンドヌクレアーゼ消化は、５ＲＮＡ内の特定の認識 部位で生じると思われ、そして安定したａ＋ＲＮＡはこれらの部位で欠失するで あろう。また、高レベルの翻訳を受けるｍＲＮＡはまた、ｍＲＮＡ上のリポソー ムの存在により分解から保護されるある証拠が存在する。

発現生成物の安定性は、所望するポリペプチドが第２ポリペプチド又はそのフラ グメント、特に細菌性ポリペプチドと一緒に発現される融合ポリペプチドとして 所望する遺伝子生成物の発現により助けられる。好ましくは、発現生成物の安定 性は、対象のポリペプチドが発現され、リーダー配列に連結されている融合タン パク質の合成を付与することによって達成される。たとえば高（発現された細菌 性又はバクテ・リオファージ遺伝子、たとえばバタテリオファージλＮタンパク 質遺伝子もしくはｃｒｏ遺伝子又はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子からのＮ−末端 アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が、対象の遺伝子から上流に及びその遺伝 子と読み枠を合わして連結される。リーダー配列は、通常、約８〜約３５、好ま しくは約１５〜約２５個のＮ−末端アミノ酸を含む。

他の遺伝子からのリーダー配列を有する融合タンパク質としての対象のポリペプ チドの発現は、安定性を付与する他に、いくつかの利点を有する。たとえば、Ｎ −末端アミノ酸の存在は、種々のポリペプチドのいづれかの精製のための一般的 な精製技法を用いるための手段を付与する。たとえば、Ｎ−タンパク質のＮ−末 端アミノ酸は、たぶん抗原性であり、そして従ってＮ−タンパク質のＮ−末端ア ミノ酸に対して生ぜしめられた特異的抗体は、Ｎ−タンパク質のＮ−末端を含む 融合タンパク質のアミノ精製のために使用され得る。さらに、Ｎ−タンパク質の Ｎ−末端は、高い陽性の電荷を有し、これはイオン交換クロマトグラフィー及び 同様のものにより所望するタンパク質の精製を促進する。

リーダー配列はまた、疎水性アミノ酸配列であり、これはさらに、分泌のための シグナル配列として機能することができる。シグナル配列をコードするＤＮＡ配 列は、対象の遺伝子から上流に及びその遺伝子と読み枠を合わして連結される。

典型的には、そのシグナル配列は、シグナル配列ペプチダーゼにより認識される 切断部位を含む。従って、シグナル配列切断部位のすぐ後に対象のポリペプチド を配置することは、シグナル配列からの特異的な切断及び成熟ポリペプチドとし ての分泌を可能にするであろう。疎水性アミノ酸配列の例として、細菌性アルカ リ性ホスファターゼシグナル配列：ＬＰＰシグナル配列；β−ラクタマーゼシグ ナル配列；及びトキシンシグナル配列を包含される。

使用され得る他のリーダー配列は、親水性配列、たとえば対象のポリペプチドの 機能の変性を提供することができるアンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉ ｎ）からのＮ−末端の４１個のアミノ酸残基を含む。さらに、細胞毒性物質、た とえばトキシンＡ−ｇフラグメント、リシンＡ−鎖、ヘビ毒増殖停止ペプチド又 は標的分子、たとえばホルモン又は抗体は、はとんどの場合、対象の遺伝子生成 物の生物学的活性に対して最少の効果でリーダー配列と共有結合され得る。他の リーダー配列に関しては、リーダー配列をコードするＤＮＡ配列は、対象の遺伝 子から上流に及びその遺伝子と読み枠を合わして連結さ部位を含まない場合、追 加のアミノ酸が、対象の遺伝子とリーダー配列との間に挿入され、リーダーペプ チドの切断のための酵素的又は化学的切断部位が付与され、融合タンパク質の精 製の後、成熟ポリペプチドの続く精製を可能にされる９たとえば融合タンパク質 の２つのセグメント間への酸不安定性アスパルチループロリン結合の導入は、低 いｐＨでのそれらの分離を促進する。この方法は、所望するポリペプチドが酸不 安定性である場合、適切でない。融合タンパク質は、メチオニン残基のカルボキ シ側に対して特異的である臭化シアンにより切断され得る。リーダー配列と所望 するポリペプチドとの間へのメチオニンの位置決定は、所望するポリペプチドの 開放を可能にするであろう。この方法は、所望するポリペプチドがメチオニン残 基を含む場合、適切でない。

リーダー配列がシグナル配列を含む場合、分泌リーダー配列を有する対象の遺伝 子は、前記配列が保持され又は切断され得る条件下でリーダー配列を伴って又は その配列を伴わないで発現され得る。さらに、培地中に分泌される成熟した切断 された及び再生されたペプチドとして高い割合の所望するポリペプチドを得るた めには、低温、たとえば約３０°Ｃで作用することができるプロモーター、たと えばｔａｃプロモーターを使用することが好ましい、思いがけなく、高いレベル の分泌が低温で得られる。ひじょうに高い発現レベルは、タンパク質の十分な翻 訳的変性の存在を妨げることができ、未切断前駆体（すなわち構造タンパク質及 び分泌リーダー）の集合及び蓄積をもたらす。同様に、高温、たとえば４２°Ｃ での増殖はまた、未切断前駆体の集合及び蓄積をもたらす傾向がある。

対象のポリペプチドは、発現が所望されるいづれかのポリペプチドであり、そし て同種（宿主細胞に由来する）又は異種（外来源又は合成りＮＡ配列に由来する ）のものであり得る。そのポリペプチドは、原核生物源又は真核生物源に由来し 、この真核生物源としては菌類、原生生物、を椎動物、無を椎動物及び同様のも のを挙げることができる。対象のポリペプチドは、酵素、たとえばイソペニシリ ンシンセターゼ；哺乳類ペプチド、たとえばインターロイキン、カイトキン、増 殖因子、たとえば上皮増殖因子、血小板由来の増殖因子、オンコスタチンＭ、Ｔ ＧＦ−α及び−β、ウィルス性増殖因子、たとえばワタシニアウィルス、ショー プ線維腫；ヘビ毒増殖停止性ペプチド、脳由来性ペプチド、免疫グロブリン及び そのフラグメント、及び同様のものを含むことができる。

対象の遺伝子が所望する対象の遺伝子の天然の転写及び翻訳調節領域を認識する 宿主に発現される予定である場合、その天然の５′及び３′−調節領域を有する 完全な遺伝子が、適切な発現ベクター中に導入され得る。しかしながら、その遺 伝子が天然の転写及び翻訳調節領域を認識する宿主中に発現される予定である場 合、追加の操作が必要とされるであろう、対象の遺伝子から上流の非コード５′ −領域は、エンドヌクレアーゼによる制限、Ｂａ　１３１による制限又は同様の ものにより除去され得る。他方、便利な制限部位が対象の遺伝子の５′−末端近 くに存在する場合、対象の遺伝子が制限され、そしてアダプターがプロモーター 領域に対象の遺伝子を結合するために使用される（この際、そのアダプターは対 象の遺伝子の欠失ヌクレオチドを提供する）。種々の３′−転写間！ｆｆ　６Ｎ 域が知られていて、そして停止コドンから下流に挿入され得る。

対象のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、所望するコード配列を定義する ために一緒に連結され得るオーバーラッピング性−重鎖を付与する従来の技法を 用いて合成され得る。その末端は、制限部位を付与するように計画され、又は一 端又は両端が発現ベクターの相補的末端への連結のためにプラント末端化され得 る。その配列の発現のためには、開始メチオニンが付与される。発現ベクターは 一般的に入手でき、そして文献中に十分に記載されている。

対象の遺伝子を合成する代わりに、遺伝子が種々の技法により単離される。これ らは、対象のポリペプチドをコードする宿主生物体からのｍＲＮＡの単離を含み 、そのｗＲＮＡが逆転写され、その得られた一本鎖（ｓｓ）　ＤＮＡは二本１ｉ （ｄｓ）ＤＮＡを調製するための鋳型として使用され、そしてそのｄｓ　ＤＮＡ が単離される。もう１つの技法は、宿主細胞のゲノムＤＮＡの断片を単離し、そ して適切に分離し、対象のポリペプチドをコードする遺伝子において最っとも保 存された配列の領域を含んで成るプローブを用いて、宿主細胞ゲノムにおける対 象のポリペプチドをコードする配列を同定することを含む。そのプローブは、完 全な配列よりも相当に短かいがしかし少なくとも１０個、好ましくは少なくとも １４個、より好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドの長さであるべきであ る。より長いオリゴヌクレオチド、すなわち対象のポリペプチドをコードする遺 伝子の完全な長さまでのオリゴヌクレオチドがまた有用である。ＤＮＡ及びＲＮ Ａプローブの両者が使用され得る。

使用する場合、プローブは典型的には、検出可能な態様で（たとえば３２Ｐ−ラ ベルされた又はビオチニル化されたヌクレオチドにより）ラベルされ、そして遺 伝子が見出される生物体からの一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと共にインキュベートさ れる。ハイブリダイゼーションは、−末鎖及び二本鎖（ハイブリダイズされた） 　、ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡが典型的にはニトロセルロース紙を用いて分離さ れた後、ラベルにより検出される。オリゴヌクレオチドと共に使用するための適 切なハイブリダイゼーション技法は、当業者に良く知られている。

プローブは、通常、容易な同定と可能にする検出可能なラベルと共に使用される けれども、ラベルされたプローブの前駆体として及びＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡ の直接的な検出を提供する方法に使用するためには、ラベルされていないオリゴ ヌクレオチドがまた、有用である。従って、用語、“オリゴヌクレオチド”とは 、ラベルされた形及びラベルされていない形の両者を言及する。

所望するＤＮＡ配列が得られた後、それは、発現を付与するために種々の方法で 操作され得る。たとえば、キメラ性ポリペプチド配列は、天然に存在するポリペ プチド鎖に実質的に類似する配列を有する少なくとも２種のポリペプチドの遺伝 子フラグメントを組合すことによって調製され得る。ポリペプチドの立体構造体 、特に対象のポリペプチドの生物学的活性を担持することができる構造体の一部 を保持することが高く所望される。フラグメントの源及び所望するポリペプチド の長さに依存して、便利な制限部位が、キメラ性ポリペプチドを構成するために 使用される合成遺伝子中に予定される。

可能な場合、制限部位は、未変性ポリペプチドのアミノ酸配列を残す、しかしな がら、多くの場合、新しい制限部位の導入により、タンパク質の活性を変えない で、変性されたアミノ酸配列を付与することができる。

発現カセットの構成の間、ＤＮＡの種々のフラグメントが通常、ＤＮＡの増幅、 ＤＮＡの変性又は配列、リンカ−又は同様のものの連結又は除去による操作を可 能にする適切なりローニングベクター中にクローンされるであろう。通常、ベク ターは、細菌中において比較的高いコピー数で複製することができるであろう。

多くのベクターは、グラム陰性細菌、特に旦０．２ｉにおけるクローニングのた めに容易に利用でき、そのようなベクターとして、ｐＢＲ３２２、ｐＡｃＹｃ１ ８４　、　Ｍ２Ｓ、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ及び同様のものが存在する。そのクローニ ングベクターは、宿主細菌中で機能する効果的複製システムを有することにより 特徴づけられる。

クローニングベクターは、少なくとも１つのユニークな制限部位、通常多くのユ ニークな制限部位を有し、そしてまた多重制限部位も含むことができる。さらに 、クローニングベクターは、形質転換体の選択を提供する１又は複数のマーカー を有するであろう。そのマーカーは通常、細胞毒性物質、たとえば抗生物質、重 金属、トキシン又は同様のものに対する耐性、栄養要求性宿主の相補性又はファ ージに対する免疫性を付与するであろう。ベクター及びカセットの適切な制限及 び適切なようにその末端の変性により、プラント末端を付与するためにオーバー ハングをチューイングパックし又はフィルインすることによって、リンカ−の付 加により、連結することによって、相補性末端が発現カセット又はその成分への ベクターの連結を付与され得る。

カセットの進行におけるＤＮＡのそれぞれの操作の後、プラスミドはクローン化 され、そして単離され、そして必要な場合、特定のカセット成分が、正しい配列 が得られたことを確めるためにその配列について分析されるであろう。操作の性 質に依存して、所望する配列がプラスミドから切断され、そして異なったベクタ ー中に導入され、又はプラスミドが制限され、そして発現カセット成分が適切な ように操作される。

多くの場合、シャトルベクター（ここで該ベクターは異なった複製システムを必 要とする異なった宿主において複製することができる）が使用されるであろう。

これは、２種の宿主において機能する追加のマーカーを必要とするかも知れない が又は必要としないかも知れない。そのようなマーカーが必要とされる場合、こ れらはベクター中に含まれ、プラスミドがカセットを含む場合、２種の複製シス テム及びマーカーが必要に応じ、１つの宿主から他の宿主にトランスファーされ 得る。選択のためには、いづれかの有用なマーカーが使用され得る。所望により 、ネオマイシン又はテトラサイクリンに対する耐性が興味の対象である。しかし ながら、選択のためのマーカーは便利さのためにひじょうに所望されるけれども 、形質転換された細胞をスクリーニングするための他の方法が記載されている。

たとえば、Ｇ、　Ｒｅ１ｐｉｎ　ｆｉｌ　益、、　ＣｕｒｒｅｎｔＧｅｎｅｔｉ ｃｓ　（１９８２）　１８９〜１９３を参照のこと。形質転換された細胞はまた 、それらが製造する特定の生成物によりスクリーンされ、たとえば所望する生成 物の合成が免疫学的又は酵素学的方法により測定され得る。

発現カセットは、適切な細胞宿主においてエピゾーム維持のために複製システム 内に含まれ、又は複製システム外に供給され得、ここでそれは宿主ゲノム中に組 み込まれるようになる。ＤＮＡは、既知の技法、たとえばリン酸カルシウム−沈 殿ＤＮＡを用いての形質転換、細胞とウィルスとを接触することによるトランス フェクション、細胞中へのＤＮＡのマイクロインジェクシッン及び同様の技法に 従って宿主中に導入され得る。

対象の遺伝子が適切な宿主中に導入された後、宿主は対象が使用され得る。宿主 細胞は、グラム陰性生物、たとえば旦、２ｉ、たとえばＪＭ　１０９　、　、Ｔ Ｍ　１０１及び１０７　；ＨＢ　１０１　、　ＤＩ　１又はＤＩ５を包含する。

グラム陰性生物、たとえば細胞周辺腔を有さす、そして増殖培地中にポリペプチ ドを直接的に分泌する旦、サブチリスＣＢ−，５ｕｂｔｉｌｉｓ）が特に好まし い。

宿主細胞は、適切な栄養培地中において高密度に増殖され得る。プロモーターが 誘発性である場合、許容状態、たとえば温度変化、代謝生成物又は栄養物の消耗 又は過多又は同様のものが使用されるであろう。たとえば、調節配列がバクテリ オファージλＰＬプロモーター、バタテリオファージＯＬオペレーター及びＣＩ 　８５７温度怒受性リプレッサーを含む場合、宿主細胞が許容温度、一般的に約 ３０゛Ｃで増殖され、この温度でＰ、プロモーターからの転写が抑制され、そし て宿主細胞が、さらに、宿主生物に対して毒性であるかも知れない外来性遺伝子 生成物の合成の要求により妨げられないまま増殖するかも知れない。宿主細胞が 最適密度に達した場合、その温度は非許容温度、たとえば約４２°Ｃに上げられ 、この時、Ｃｌリプレッサーが不活性化され、ＰＬプロモーターからの転写を可 能にする。

最大の分泌は、ｌａｃプロモーター又はｔｒｐ−１ａｃプロモーターを用いるこ とにより及びｌａｃ”宿主株のための代謝インデューサー、たとえばラクトース による誘発により並びにベクター上に１ａｃＩ′Ｉを供給することによって得ら れる。このシステムと共に使用され得る宿主細胞の例として、ＤＨ！、ＤＩ５又 はＨａ　１０１を挙げることができる。

生成物が宿主細胞中に保持される場合、細胞が収穫され、溶解され、そして生成 物が単離され、そして抽出法、沈殿法、クロマトグラフィー処理法、電気泳動法 及び同様の方法により精製される。生成物が細胞周辺腔中に分泌される場合、細 胞は収穫され、そして生成物が細胞壁の破壊により、たとえば低張ショック及び 同様の方法により生せしめられる。生成物が培地中に分泌される場合、栄養培地 が集められ、そして生成物は従来の手段、たとえばアフィニティークロマトグラ フィーにより単離される。活性タンパク質を生成するためには、タンパク質の再 生を可能にする必要がある。タンパク質がリーダー配列との融合タンパク質とし て発現される場合、リーダー配列は、たとえば蟻酸又は臭化シアンによる処理に より除去され得る。リーダー配列は好ましくは、タンパク質の再生の後、除去さ れる。

次の例は、例示的であって、限定するものではない。

土工ｍ− 且象皇這倣王■星製 Ａ１合成増殖因子遺伝子 １、　ＴＧＦ合成オリゴヌクレオチド ２、　ＶＧＦ合成オリゴヌクレオチド ３、ＥＧＦ合成オリゴヌクレオチド ４、アッセンブリー増殖因子遺伝子 Ｂ０合成血小板因子４遺伝子 Ｃ，オンコスタチンＭのＤＮＡクローニング１、ｃＤＮ＾ライブラリーの調製 ２　制限部位地図 ３、　オンコスタチンＭのＤＮＡ配列 ４、ＲＡＮ分析 ■−ヱー Ｎ−ンパク　る８ム　ンノぐり　としての・　のボユゴ１１≦口欠免現 Ａ、変性された合成ＴＧＦ １、ｐＢＭ　１１／　Ｎ　／ＴＧＦの調製Ｂ、変性された合成ＴＧＦ　−ＶＧＦ ノ八イブイブリッド１　ｐＢＭ　１１／Ｎ／ＴＴＶ　（７）ｔＪｉｉ製Ｃ０合成 血小板因子４ １、ｐＢＭ　１１／　Ｎ　／ＰＦ　４の調製１二コム− Ｎ−ンパク　び　る　人　ンパク　としての・　のボ１ペプチドの Ａ、変性された合成ＶＧＦ １、ｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＶＧＦＡの調製２、ｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／Ｖ ＧＦａの調製Ｂ、変性された合成ＴＧＦ　−ＶＧＦハイブリッド１、ｐＢＭ　１ １／ＮＤＰ　／ＴＴＶの調製２、ｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＶＴＶ　（７）調製 ３、　９ＢＭ　１６／ＮＤＰ　／ＴＶＶの調製Ｃ０合成ＥＧＦ １、ｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＥＧＦの調製り３合成血小板因子４（ＰＦ４） １、ｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＰＦ４の調製Ｅ、オンコスタチンＭ １、ｐＢＭ　１６／ＮＤＰ　１０ｎｃｏＭの構成２、ｐＢＭＸ　／　ＯｎｃｏＭ の調製 側−ｊ− ゛　れたアルカ１ホスフア　−ゼシグ　ル配　るツブ　ンパク　としての・　の ボＩペプチドのＡ、　ｐＢＭ　１１／ＰＡＤ　／ＥＧＦの調製１、ＥＧＦの０． １７ＫｂのＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩフラグメントの調製２、ｐＢＭ　１１／Ｐ ＡＤの０．５ＫｂのＰｖｕ　ｌ−Ｈｌｎｄｌ［Ｉフラグメントの調製 ３、ｐＢＭ　１１／ＰＡＤの５．２ＫｂのＰｖｕ　Ｉ　ＢａｍＨＩフラグメント の調製 ４、ｐＢＭ　１１／ＰＡＤ　／ＥＧＦの連結及び単離Ｂ、　ｐＢＭ　１１／ＰＡ Ｄ　１０ｎｃｏＭの調製１、　変性されたオンコスタチンＭ遺伝子フラグメント の調製 ２、ｐＢｌ’１１１Ｍ３／ＰＡＤフラグメントの調製３、ｐＢＭ　１１／ＰＡＤ 　１０ｎｃＭの連結及び単離Ｃ，ｐＢＭ　１１／ＰＡＤ　／ｎＶＧＦａの調製１ 、Ｈｉｎｄｕｌ　−Ｐｖｕ　Ｉにより消化されたｐＢＭ　１１／ＰＡＤの０．５ Ｋｂフラグメントの調製 ２．９８Ｍ１１プラスミドの５．２ＫｂのＰｖｕ　Ｉ　−Ｂａｓ＋ＨＩフラグメ ントの調製 ３、　合成ＶＧＦａ遺伝子の１７０ｂｐのＮｃｏＩ（プラント）　−ＢａｗＨ■ フラグメントの調製 ４、ｐＢＭ　１１／ＰＡＤ　／ｎＶＧＦａの連結及び単離り、　ｐＢＭ　１１／ ＰＡＤ　／ＰＦ４の調製■−ニー アルカ１ホスフ　−ゼシグ　ル　る　ム　ンパク　としての・　のボ冨ペプチド の Ａ、ｐＢＭ　１１／ＰＡＫ　／ｎＶＧＦａの調製Ｂ、　ｐＢＭ　１１／ＰＡＫ　 ／ＥＧＦの調製Ｃ、ＴａｃＰａｋ　／　ＥＧＦの調製 側−昌１− １　゛　カセート　い　アルカ１ホス フ　−ゼシグ　ル　１　る　ム　ンバク　としての・　のポｉペプチドの Ａ、　ｐＴＣＰｔ　／ＥＧＦの調製 １、ＴａｃＰａｋ　／　ＥＧＦの４２０ｂｐのＨｉｎｄｌ［Ｉ　（プラント）　 −Ｂａｓ＋ＨＩフラグメントの調製 ２、ｐＢＭ１６ｔ／ＮＤＰ　／ＶＧＦａの２．８ＸｂのＥｃｏＲＩ（プラント） −町狸ＨＩフラグメントの調製 ３、ｐＴＣＰｔ　／ＥＧＦの連結及び単離Ｂ、　ｐＴＣＰｔ　／ｎＶＧＦａの調 製１、ｐｌＭ　１１／ＰＡＮ　／ｎＶＧＦａの３５０ｂｐのＰｖｕ　Ｉ　Ｂａｍ ＨＩフラグメントの調製 ２、ｐＴＣＰｔ／ＥＧＦの２．８ＫｂのｂッＩ−影υＨｌフラグメントの調製 ３、ｐＴＣＰｔ／　ｎＶＧＦａの連結及び単離Ｃ１ｐＴＮＰｔ　／ＥＧＦの調製 １、ｐＴＮＰｔの２．８Ｋｂのハ１１−坦徂ＩＩフラグメントの調製２、ｐＢＭ 　１１／ＰＡＫ　／ＥＧＦ　（７）　３００ｂｐ（７）Ｐｖｕ　Ｉ　−ＢａｍＨ Ｉ　７　ラグメントの調製 ３、ｐＴＮＰｔ　／ＥＧＦの連結及び単離猶−に ゛ボｉペプチ゛の Ａ、ＰＬプロモーター及びＣＩリプレッサーを用いてｐＢＭ　−基礎ベクター中 に産生される増殖因子 １．７ＧＦ及び変性されたＴＧＦ ａ、Ｎ／ＴＧＦ Ｚ　変性され、そして切断されたＶＧＦａ　、ＰＡＤ／ｎＶＧＦａ ｂ　、ＮＤＰ／　ＶＧＰａ Ｃ０ＶＧＦａ ｄ　、ＮＤＰ／ＶＧＦＡ ３、キメラ性ＴＧＦ／ＶＧＦハイブリッドａ、Ｎ／ＴＴＶ ｂ　、ＮＤＰ／ＴＴＶ ｃ、ＮＤＰ／ＶＴＶ ｄ　、ＮＤＰ／ＴＶＶ β、ｔａｃ又はｌａｃプロモーターを含むベクター中に産生される増殖因子 １、ＰＡＫ／ＥＧＦ ２、ＰＡＫ　／　ｎＶＧＦａ Ｃ０血小板因子４ １、Ｎ／ＰＦ４ ２、ＮＤＰ／ＰＦ　４ Ｄ、オンコスタチンＭ １、ＮＤＰ／オンコスタチンＭ ２、ＰＡＤ／オンコスタチンＭ で量　れた　え　の　、Ｓ 立 Ａ、ＥＧＦ受容体結合 １、　キメラ性ペプチドの受容体結合 Ｂ、マイトジェン活性 Ｃ１創傷の治療 １、　中間−皮膚損傷 Ｚ　中間−皮膚供与体一移植片損傷 ｌ上− で富　１　れた　え　ハ　４の 泣孟二 Ａ、ＤＮＡ合成の阻害 Ｂ、ヌードマウスにおける腫瘍の増殖の阻害ｌニー で１　れた　えオンコス　チンＭの 隻ヱ血孟１ Ａ、生理化学的特徴 １、　５Ｏ５−ＰＡＧＥ Ｂ、　Ｍｉ換えオンコスタチンＭの増殖阻害活性Ｃ１組換えオンコスタチンＭの 受容体結合活性二車ｌすｍ批 すべてＥ、２ｉＨＢＩＯＩ中に形質転換された次の発現プラスミドが、アメリカ ンタイプカルチャーコレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ 　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃ ｋｖｉｌｌｅ。

ＭＤ　２０８５２）に、指示された日に寄託され、そして下記に示される寄託番 号及びＡＴＣＣ名称を有する：主−−作　紅匹充丘且号　ｉ丘夏旦 ｐＢＭ　１１　６７３６６ ｐＢＭ　１４　６７３６７ ｐＢ）１１１／ＰＡ／ＶＧＦ　６７４１７　６月３日、１９８７ｐＢＭ　１１／ ＤＰ／ＶＧＦａ　６７４１８　６月３日、１９８７ｐＢＭ　１１／ＰＡ／ＥＧＦ 　６７４１９　６月３日、１９８７ｐＢＭ　１１／Ｍ５　６７４３６ ｐＢＭ　１１／Ｃ２６７４３７ ｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＥＧＦ　６７５４７　１０月２３日、１９８７：ｆｆ ａｎｕａｌ’、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ、　Ｃ５Ｈ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋに記載される一般的なりローニング技法を用い た。すべてのＤＮＡ−変性酵素は、市販されている。それらは製造業者の指示に 従って使用された。ＤＮＡ精製及び分離のための材料及び装置は、供給業者から の指示に従って使用された。

劃−」− マイトジェン誘発アッセイを次の通りに行なった：新生児の包皮の外植片から得 られた二倍体のヒト繊維芽細胞を３×１０４個の細胞／ウェルの密度で接種しく ９６−ウェルプレート、Ｎａｎｃｌｏｎ、　Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、　Ｄｅｎｍａｒ ｋ）　、そしてダルベツコの変性イーグル培地（ＧＩＢＣＯ）　／１０％ウシ血 清中に集密的になるまで増殖した０次に、培養物を、０．２％のウシ血清を含む 培地中に入れ、そして２日後、試験されるべき種々の濃度の増殖因子を添加した 。８時間後、培養物を５−　（”りヨード−２′−デオキシウリジン（Ａｗｅｒ ｓｈａｍ、　１０μＣｉ／ａｄ！　、　５Ｃｉ／Ｉ１ｇ　；　Ｉ　Ｃｉ＝　３７ ＧＢｑ）によりラベルし、そしてＴＣＡ不溶性物質中に組込まれる同位体の量を 、Ｔｗａｒｄｚｉｋｆｔζ＋ｌ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８５）１８２　：　５３００〜５３０４に記載のように して測定した。

Ｂ、　寒　コロニー　ア・セイ 増殖培地中における０、　５％寒天（Ａｇａｒ　Ｎｏｂｌｅ　；口１ｆｃｏ　Ｌ ａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｉｃｈｉｇａｎ）の基層０ ．５　ｍを、２４−ウェルＣｏｓ　ｔａｒ組織培養プレートに添加した。１〜１ ．５Ｘ１０’個の細胞／ｄのＮＲＫ細胞又は他の対象の細胞系及び試験されるべ き種々の濃度の因子を含む増殖培地中における０、３％寒天０、５　ｄを、寒天 の基層上にオーバーレイした。そのプレートを空気中において５％ＣＯｔの加湿 雰囲気下で３７℃でインキュベートし、そして試験されるべき同じ濃度の因子を 含む増殖培地中における０、３％寒天０．５　Ｍｌの添加により、７日後再び栄 養を与えた。コロニーを固定しないで及び染色しないで計数した。６個以上の細 胞を有するコロニーの数を計数した。

Ｃ，ＥＧＦ　六　八　−セイ ラジオレセプターアッセイを次の通りに行なった二種的細胞の単層上でｌ！ＳＩ −ラベル化増殖因子のその受容体への結合を、Ｃｏｈｅｎ及びＣａｒｐｅｎｔｅ ｒ＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

歩祷（１９７５）７２　：　１３１７〜１３２１に記載の方法に従って変性した 。

細胞（ｔ　ｘｌＯ’　／ウェル）を、アッセイの前、リン酸緩衝溶液中、１０％ ホルマリンを有する２４−ウェルプレート（Ｌｉｎｂｒｏ。

Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上に固定した。ホルマリン−固定された 細胞は、固定されていない細胞と同じように容易にプレートから脱離せず、そし て従って複製値はより一定であった。増殖因子の濃度は、−当たりの生来の増殖 因子のｎｇ当量として、すなわち既知量の生来の増殖因子により生成される増殖 因子結合の阻害性に等しいｌ２ＳＩ増殖因子結合の阻害性を生成するのに必要と される量として表わされる。

Ｄ、、１！ｌｉ夙血！ １、生皿二皮１藍損１ 中間−皮膚熱損傷を、麻酔された雌のヨークシャブタ（３０ボンド）（この背中 は短く刈られ、そして市販の毛除去クリームにより脱毛されている）の背側の胸 郭部上に作った。黄銅型板（３Ｘ３Ｃ１１，１４７ｇ）を、７０°Ｃの水浴中で 平衡化し、そして正確に１０秒間、皮膚と堅く接触せしめた。次にその得られた 水瓶を除いた。５個の中間−皮膚やけどを背骨のそれぞれの部上に生ぜしめ、そ してお互いから約１インチ分けた。

やけどを、１日２度、約３ｍのビークルクリーム（Ｓｉｌｖａｄｅｎｅｅ　）の みにより又は増殖因子を含むビークルクリームにより治療し、又は未治療のまま にした。治療の９日又は１ｏ日後、ブタに麻酔をかけ、モして焼癲をそのやけど から除いた。バイオプシーを、勇士波形成したそれぞれのやけど部分から採取し た。

２、ｅ− ５か月の２０．５ｋｇのミクロブタを、２０ａ／ｋｇのケタミン及び２ｒｘｇ／ ｋｇのＲｏｍｐｕ−により麻酔をかけた。背側の胸郭部の毛を刈り、ベータジン により準備し、そして食塩水により十分にすすいだ、一連の６個の５Ｘ５Ｃ１１ 供与体部分を、３０／１０００インチで２回強打することによって、６５０／１ ０００インチでＰａｄｇｅｔｔデルマトームにより背側の胸郭部のそれぞれの部 上に作った０局部治療が、左側の６個の傷の間に食塩水ＩＭｉ中、５ｉｌｖａｄ ｅｎｅ＠２０ｇを均等に分布することによってほどこされた。右側を、６個の傷 の間に均等に分布される２０ｇの５ｉｌｖａ−ｄｅｎｅｅ中、試験されるべき増 殖因子１ｄにより治療した。すべての傷を、大きなやけど用包帯、チャマウス、 エースラップ及びガーキンによりおおった。その動物を、実施後、１゜２．３． ４．７，８，９．１０及び１１１日目上記のようにして麻酔をかけた。傷を、ベ ータジンにより軽くふき、そして食塩水により十分にすすいだ、適切な薬剤を通 用し、そして傷を上記のようにして再び包帯でおおった。

Ｅ、↓擾し！１戒４■１１ ２日目の朝、Ｎｕｎｃ　９６−ウェルプレート（Ｋａａ＋５ｔｒｕｐｖｅｊ　９ ０゜ＤＫ−４，０００，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、　Ｄｅｎａ＋ａｒｋ）中に、Ａ３４ ９細胞（ヒト肺癌）を生ぜしめた。これらの細胞を、３０個よりも少ない場合、 継代した０周辺ウェルを除くすべてのウェル中に導入し、４×１０３個の細胞１ ５０ｄ／ウエル〔１０％ＦＣＳ、Ｐ／Ｓ、グルタミンを含むアッセイ培地（ＤＭ ＥＭ）　ｄ当たり９Ｘ１０’個の細胞〕にした。ＰＢＳ　５０ｍを受けた周辺ウ ェル及び全プレートを３７°Ｃでインキュベートした。午後、試験化合物を、ア ッセイ培地中に再懸濁した。すべての化合物を三回試験した。それぞれの試験ウ ェル中に、アッセイ培地中、試験化合物５０１１１を導入し、そして対照ウェル は５０ｍのアッセイ培地のみを受けた。次に、それぞれのプレートを、３７℃で ３日間インキュベートした。

４日目、それぞれのウェル中に、＋！Ｊ−ヨードー２′−デオキシウリジン（４ Ｃｉ／■〜０．５ｍＣ１／ｍ）（１ｔｌの同位体／ｉアッセイ培地）の溶液５０ Ｊ１１を添加し、そしてそのプレートを３７°Ｃで一晩インキユベートした。５ 日目、培地をウェルから吸い出し、そしてウェルをＰＢＳにより洗浄した。１０ ０Ｊのメタノールを室温で１０分間にわたって添加した。メタノールを吸い出し 、そしてＩＭの水酸化ナトリウム２００ｉ１１をそれぞれのウェルに添加した。

プレートを３７°Ｃで３０分間インキュベートし、そして水酸化ナトリウムをＴ ｉｔｅＦｌｅｋプラグ（ＦｌｏｗＬａｂｓ）により除いた。次に、そのプラグを Ｔカウンターにより計数した。

Ｆ、ヌードマ　スにお番る　の 雄のヌードマウス（Ｂａｌｂ／　ｃ　−ｎｕ”　／ｎｕ’″）は、ＦｒｅｄＨｎ ｔｃｈｉｎｓｏｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔａｒ　、シアト ル、ワシントンにより供給された。１２週で、マウスは、リン酸緩衝溶液０．２ ｄＯ）体積中、約１．３Ｘ１０’個ノヒト肺癌細胞（Ａ５４９）　ニより首の部 分に皮下注射された。明らかにわがる腫ｊｌ（約１０■３）が通常、２０日で進 展した。それぞれのグループは５匹の動物を含んだ、動物は、ＰＢＳ　Ｏ，１１ ｄ　（対照グループ）又はＰＢＳ　Ｏ，ｌ　ｄ中に再懸濁された試験サンプル（ １，２Ｒ／注射）により腫瘍部位で２又は３日ごとに注射された。処理後１日目 が初日に相当し、そして動物は試験化合物により腫瘍部位で注射された。腫瘍の 大きさは、指示された日、続く注射の前、測定され、そしてグループ中のそれぞ れの動物の腫瘍の平均サイズを表わす。

プラスミドｐＢｌ’ｌ　１１は、バクテリオファージスＮタンパク質の初めの３ ３個のＮ−末端アミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む。それはまた、選 択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子及びλＰＬプロモーターから下流に外 来性遺伝子のクローニングのためのユニークＢａａ＋ＨＩ部位も含む、　ｐＢＭ 　１１は次の通りにして構成された。

１、飢旦■ｌ底 バタテリオファージλｃ１をコードする遺伝子配列を含む２．４ＫｂのＤＮＡフ ラグメントが、３７°Ｃで２時間、混合物をインキュベートすることにより、１ ７０単位のｎ工ＩＩ　（ＢＲＬ）制限酵素により１２０眉のλｃＩ８５７ｓ７　 ＤＮＡ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）を消化（切断）することに よって単離された。その消化混合物を、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて１％分 離用アガロースゲル上で電気泳動にゆだねた。２．４Ｋｂのフラグメント（塩基 対３５７７１〜３８１０３　；番号はＤａｒｉｅｌ、　星＆、＋ラムダ■におけ るＰｑ、５１９＋　Ｈｅｎｄｒｉｘ、　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　５ｔａｈ１　％及び −ｅｉｓｂｅｒによる編集に基づく）を、ｇｅｌから切り出し、そして室温で４ 時間、１００ｖでの電気溶離にゆだねた。その得られた溶出物を回収し、濃縮し 、そしてフェノール：クロロホルム（１：１）の等体積により３度抽出した。Ｄ ＮＡを、１７１０体積の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）の存在下でエタノ ール沈殿法により水性相から回収した。フラグメントの回収率は、アガロースゲ ル電気泳動により分析された。

プラスミドｐＰＬ−λ（５ｎ　＋　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　（左方向へのλプロ モーターＰＬ＋λＮ遺伝子及びＮ（ＴＬ）及び２坦徂ＨＩ部位の転写のための終 結部位を含むｐＢ［？３２２誘導体〕を、３７℃で２０分間、その混合物をイン キュベートすることによって５単位のＢａｍＨｌにより消化した。その消化され たＤＮＡをアガロース−電気泳動により分離し、そして十分な長さのＤＮＡを当 業者に良く知られている技法を用いて電気溶離により回収した。

線状化されたｐＰＬ−λを、アルカリホスファターゼにより処理し、５′リン酸 を除き、そしてリガーゼ緩衝液（５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐＨ７， ８、１００５ＭのＭｇＣ１２，２００ｍＭのＤＴＴ、　１０ｍＭのＡＴＰ）及び Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）の存在下でｃＩ８５７１ｓ７からの２．４Ｋｂ のＩｎフラグメント（３Ｊｊ１．約２５０ｎｇ）に連結した。

その得られた反応混合物を１２℃で約１５時間インキュベートし、次にコンピテ ント旦、旦ユＨＢＩＯＩ細胞中への形質転換のために直接使用した。

旦、２ｉ細胞を、ｔｌａｎａｈａｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　（１９ ８３）１６６　：５５７〜５８０により記載される方法の変法によりコンピテン トにした。ＨＢ　１０１細胞の飽和培養物を、２Ｏｎ＋ＭのＭｇＣｆ□により補 足されたルリアブイヨンにより１：２００に希釈し、そして培養物が０．３の光 学密度（００）　（ｎａ＋Ａｓ５ｏ）に達するまで、旋回水浴中において３７° Ｃでインキュベートした。２０ｄの培養物を、４℃で遠心分離することによって 収穫した。その得られたペットを、氷で冷却された５０＋＋＋ＭのＭｇＣＩｌｚ 　／　２０ｍＭの酢酸カリウム（ｐＨ６，０）溶液４ｄ中に再懸濁し、そして氷 上に１５分間維持した。その細胞を遠心分離し、そしてそのベレットをＬＯ＋ｓ Ｍのカリウムメタンスルホネート、ｐＨ６，２、１００ｍＭの塩化カリウム、４ ５ＩＩＩＭのＭｎＣ１！、ｚ　・４Ｌｏ、　１０＋＊ＭのＣａＣｌ　ｉｎ　３ｍ ＭのへキサミンＣｏＣｆ５，１００ｍのＤＭＳＯ及びＬｏｏｉｔｌのＩＭのＤＴ Ｔの溶液１、４　ｄ中に再懸濁した。

その処理された細胞３００　ｄを、４Ｊ１１及び６Ｉの連結混合物に添加した。

その処理された細胞を３０分間氷上に置き、４２℃で９０秒間インキュベートし 、そして次に氷上に９０秒間再び置いた。次にその細胞を、１００ｇ／ｄのアン ピシリンにより補充されたし一ブイヨン寒天プレート上に置いた。挿入体を含む 細菌形質転換体についてスクリーンするための早く且つ便利な方法は存在しない ので、形質転換体をＨｏｌｍｅｓ及びＱｕｉｇｌｅｙ。

Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、　、　（１９８１）ｌ１４．１９３〜１９８の急 速なプラスミドＤＮＡ単離方法により種々のＤＮＡを単離することによりスクリ ーンした。′正しい”大きさで移動する組換え細菌からのプラスミドＤＮＡ調製 物を制限地図分析により分析し、挿入体の配向を決定した。

２、ル皿互１底 プラスミドｐＢＲ３２２（５ｔｒｇ　）を、Ｐｓｔ　Ｉ　（３ｔｒｌ　、　Ｎｅ ｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）により消化し、続いてｌ；ｌ（Ｖ：Ｖ）の フェノール：クロロホルム溶液を用いて３回の連続した抽出を行ない、続いてエ ーテルにより２回抽出した。消化の完成に伴って沈殿せしめられたＤＮＡを、０ ．８％アガロースゲル上で電気泳動により分析した。Ｐｓｔｌにより消化された ｐＢＲ３２２（１０ｍ）をＴ４ポリマラーゼ（１ｍ、ＢＲＩ）により処理し、３ ′突出末端をプラント末端に転換した。ＨｉｎｄＩ［［部位を、リン酸化された 合成ＲｉｎｄＩ［［”リンカ−（５’　−ｄ　（ＣＡＡＧＣＴＴＧ）　）（Ｐｈ ａｒｍａ−ｃｉａ）の連結によりｐＢＲ３２２のＰｓｔＴ部位で導入した。その 得られたＤＮＡを、過剰の現ｎｄｌ［Ｉにより消化した。２種のＤＮＡフラグメ ント、３．５８Ｋｂ及び７８２ｂｐのフラグメントを得た。

３．５８Ｋｂのフラグメントを単離し、連結し、そしてコンピテントＥ、　＝ｒ ＋Ｊ　ＨＢＩＯＩ中に形質転換した。形質転換体を、アガロースゲル上でＨｉｎ ｄＩＩＩ消化性ＤＮＡを分類することによって上記のようにして分析した。

３、ｌ」冴コ阻ｌ底 プラスミドｐＢｌ’１８を、ＨｉｎｄＤＩ及びＢａｅ＋ＨＩにより消化し、２種 のＤＮＡフラグメントを得た。３．２３Ｋｂの長い方のフラグメントをアガロー スゲル電気泳動により単離し、そして電気溶離により回収した。プラスミドｐＮ ｅｏ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＨｉｎｄｌＩ［及びＢａａ＋ＨＩにより消化し、 ネオマイシン耐性をコードする遺伝子配列を含む１．５　Ｋｂのフラグメントを 得た。１．５　Ｋｂのフラグメントを単離し、そして精製し、次にｐＢＭ８から の３．２３Ｋｂのフラグメントに連結した。その得られたプラスミド、９８Ｍ９ をコンピテント２．２１Ｊ　ＨＢＩＯＩ中に形質転換し、そしてその形質転換体 を前記のようにしてスクリーンした。

４、ル肚虹夏盈虞 プラスミドｐＢｍ９を、Ｎｄｅ　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂ ｓ）により消化した。５′突出末端を、旦、ユニのＤＮＡポリマラーゼ“フレハ ウ”フラグメントを用いてプラント末端に転換し、そしてフィルインされたＮｄ ｅ　Ｉ部位でリン酸化された合成以遠ＲＩリンカ−（５’　−ｄ　（ＧＧ八へＴ ＴＣＣ）　−３’　）に連結した。

その得られたプラスミド、ｐＢＭ　１０をコンピテントＥ、ＬＬＨＢ　１０１中 に形質転換し、そしてその形質転換体を前記のようにしてスクリーンした。

５・　飢り旦■ｌ終膿底 プラスミドｐＢＭ　１０を、ＥｃｏＲＩ及びＢａｗｌ　Ｉにより完全に消化した 。ネオマイシン遺伝子及び複製の起点を含むその得られた２、８Ｋｂのフラグメ ントを、アガロースゲル電気泳動により単離し、そして電気溶離により回収した 。プラスミドｐＢＭ４（上記）を、ＥｃｏＲＩ及びＢａｗＨＩにより完全に消化 した。ｃｌ遺伝子及びλＰＬプロモーター並びにＮ遺伝子リポソーム結合部位の ためのＤＮＡ配列を含む２．８４Ｋｂのフラグメントを単離し、そして回収した 。次にそれを、２．８４Ｋｂの９８Ｍ４フラグメントに連結し、ｐＢＭ　１１を 形成した。プラスミドｐＢＭ　１１をコンピテントＢ、ユニＨＢＩＯＩ中に形質 転換し、そしてその得られた形質転換体を上記のようにしてスクリーンした。ｐ ＢＭ　１１を含む細胞を、Ｂａｗｌ　Ｉによる制限酵素分析によりさらにスフこ のプラスミドはｐＢＭ　１１に由来し、そしてＮ遺伝子の開始メチオニンのすぐ 後のシυ８１制限部位で外来性遺伝子のクローン化を可能にする。プラスミドｐ ＢＭ　１１層Ｍ４はまた、ネオマイシン遺伝子のＮｃｏ　Ｉ部位も含む、それを 次の通りにして構プラスミドｐＢＭ１１（２０Ｉ！ｇ）を、影ｔ＋ｓＨＩ及びハ １■により切断した。消化が完結した後、ＤＮＡを０．８％のアガロースゲルを 通して電気泳動し、そして大きなフラグメント（５１２４ｂｐ）を単離し、そし て電気溶離により回収した。ｐＢＭｌｌ　（１０１ｒｇ）の第２サンプルをジ± ｌにより完全に消化し、そして３′突出末端を７４　ＤＮＡポリマラーゼにより プラント末端に転換した。

前記２種のフラグメントのそれぞれ０．３　ｎを、制限部位ＥｃｏＲｌ　、　Ｎ ｄｅ　Ｉ及びＢａｍＨＩを含む、３７．５　ｐモルのリン酸化された合成オリゴ デオキシヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ） 、５　’　ＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＡ　３　’　と共 に混合した。その得られたプラスミドを、ｐＢＭ１１／Ｍと命名した。そのプラ スミドｐＢＭ１１／Ｍを１００”Ｃで３分間加熱し、次に連続的に次の通りに冷 却した：ａｏ”ｃで３０分間、４°Ｃで３０分間及び０℃で１０分間。再アニー ルされたＤＮＡを続いて、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼにより処理し、そしてＥ、２ｉ ＨＢ　１０１中に形質転換した。ネオマイシン耐性形質転換体を、合成オリゴヌ クレオチドによりコードされる新しい３種の制限部位を含むプラスミドについて スクリーンした。

２、祁し■Ｚ肚優盪威 プラスミドｐＢＭ　１１層ＭをＢａｍＨＩにより完全に消化し、次に０．７％の アガロースゲルを通して電気泳動した。大きなフラグメント（５５５４ｂｐ）を 単離し、そして電気溶離により回収した。リポソーム結合性翻訳開始部位から下 流にλＮ遺伝子の１０１００ｂｐを欠くその得られたプラスミドを、ｐＢＭ　１ １層Ｍｌと命名した。プラスミドｐＢＭ　１１層Ｍｌを再連結し、そしてコンピ テント旦、ユニＨＢＩＯＩ中に形質転換した。

３、」Ｌ旦Ｚ股■揚底 プラスミドｐＢＭ１１（０，３ｘ）の第１サンプルを、Ｂａｗｌ　Ｉ及びＰｖｕ 　Ｉにより切断した。プラスミドｐＢＭ１１　（０，３ｍ　）の第２サンプルを ＩＩにより切断し、そして次にＴ４ポリマラーゼにより処理した。これらの２種 のサンプルを、ＢａｍＨＩ部位のみを含む、３．７５ｐモルのリン酸化された合 成オリゴデオキシヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌ）。

５　’　ＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＡ　３　’　と共に 混合した。その混合物を加熱し、そして上記のようにして冷却し、そしてＴ４Ｄ ＮＡ　リガーゼ及びＥ、　２ｉＤＮＡポリマラーゼ“′フレノウ”フラグメント により処理した。ｐＢＭ　１１層Ｍ２と命名されたその得られたプラスミドを、 コンピテントＥ、　２ｉ＝ＨＢ　１０１中に形質転換した。マイオシン耐性コロ ニーを、合成オリゴデオキシヌクレオチドによりコードされる新規のＢａｍＨ１ 部位を含むプラスミドについてスクリーンした。

４、ｑ胆■盪底 プラスミドｐＢＭ　１１層Ｍ２をＢａｏ＋ＨＩにより完全に消化した。切断され たＤＮＡを０．７％アガロースゲルを通して電気泳動し、そして大フラグメント （５５５４ｂｐ）を単離し、そして電気溶離により回収した。再連結され、そし てｐＢＭ　１１層Ｍ２として命名されたＤＮＡをコンピテントＥ、　２ｉＨＢＩ ＯＩ中に形質転換した。

５、　８Ｍ１１？Ｉ４の プラスミドｐＢＭ　ＩＩ／　Ｍｌ　（２０ｔｒｇ）を、ＥｃｏＲｌ及びＢａｔａ ＨＩにより完全に消化し、次に０．７％アガロースゲルを通して電気泳動した。

大フラグメント（５５４４ｂｐ）を単離し、そして電気溶離により回収した。こ のＤＮＡを、Ｎｃｏ　１部位を含む次のリン酸化された合成オリゴデオキシヌク レオチド（それぞれ２００２モル）の対に連結した： ５　’　ＡＡＴＴＣＣＣＡＴＧＧＧＧ　３　’及び ３　’　ＧＧＧＴＡＣＣＣＣＴＡＧ　５’。その混合物を６５°Ｃに加熱し、そ してアニールするために２５℃への冷却を可能にした。ｐＢＭ　１１．／υ４と 命名されたその得られたプラスミドを、コンピテント旦。

、２ｉＨＢＩＯＩ中に形質転換した。ネオマイシン耐性コロニーを、新規のＮｃ ｏ　Ｉ部位を含むプラスミドについてスクリーンした。

Ｃ，ＢＭＩＩ　Ｍ５の プラスミドｐＢＭ　１１層Ｍ５は、ｐＢＭ　１１に由来した。ネオマイシ゛ン耐 性遺伝子に存在する連通１部位は、意図された突然変異誘発により除去されてい る。プラスミドｐＢＭ　１１層Ｍ５はｐＢＭ　１１層Ｍ４と同一である。但し、 ネオマイシン遺伝子中のＮｃｏ　Ｉ部位が、部位特異的突然変異誘発により除去 されている。従って、ｐＢＭ　１１層Ｍ５中への外来性遺伝子のクローニングは 、Ｎｃｏ　Ｉによるそのベクターの部分消化を必要としない。

ラスミドを生成し、そして“ｐＢＭ　１１／Ｃ″として命名した。

プラスミドｐＢＭ１１　（３０層）を、８０河のハ別■及び１９２単位のＢａｔ ａＨＩにより消化した。その得られた２種のフラグメント（５，ＩＸｂ及び０． ５３Ｋｂ）を、ゲル電気泳動により分離し、そして電気溶離により単離した。次 に０．５３Ｋｂのフラグメントを、Ｈａｅｍにより消化した。その得られたフラ グメントをゲル電気泳動により分離し、そして３２４ｂｐのフラグメントを電気 溶離により単離した。構成体ｐＨ１Ｍ１１ｃ　、　５．１にｂ及び３２４ｂｐの フラグメントを、プラスミドｐＢＭ　１１から単離し、そして化学的に合成され たリン酸化リンカ−５ ５’　ＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＴＡＴＴＡＴＧ　３　’３　’　ＣＡＴＴ ＣＣＴＣＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＴＡＣＣＴＡＧ　５　’を一緒に連結した。この ようにして構成されたプラスミドを、ｐＢＭ　１１／Ｃと命名する。プラスミド ｐＢＭ　１１／Ｃは、クローニング部位として制限部位Ｂａｗｌ　Ｉ及びリポソ ーム結合部位のスペーサー領域内にユニークな影恥１制限部位を有する。スペー サーの長さは、タンパク質翻訳の効力に影響を及ぼすことが報告されている。影 徂Ｉ部位の存在は、スペーサー領域の長さの変化を可能にし、そしてまた発現さ れるべき他の遺伝子のための他のクローニング部位の挿入を可能にする。

プラスミドｐＢＭ　１１／Ｃの変性をまた行なった。ｐＢＭ　１１／Ｃ（Ｌｏｇ ）を制限酵素影ＩＩ（４５単位）により消化し、そして５′ホスフエートをホス ファターゼにより除去した。このＤＮＡを、リン酸化された合成Ｎｃｏ　Ｉリン カ−１ＣＣＡＴＧＧに連結した。ｐＢＭ１１ｃ／　１と命名されたその得られた プラスミドは、２個のＮｃｏ　１部位を含み、その１つはネオマイシン遺伝子中 に存在し、そして他の１つは外来性遺伝子のクローニングのためのものである。

外来性遺伝子のクローニングにおいてＰＢＭ　１１／ＣＩのＮｃｏ　Ｉによる部 分消化を避けるために、ネオマイシン遺伝子中のＮｃｏ　１制限部位を、前記技 法を用いて部位特異的突然変異誘発により除去した。このプラスミドを、ｐＢＭ 　１１／Ｃ２と命名する。

Ｅ、　ＢＭＩＩ　ＮＤＰの プラスミドｐＢＭ　１１に由来するプラスミドｐＢＭ　１１／ＮＤＰは、λＮタ ンパク質の初めの３２個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列、続いて酸分 解性アスパラギン酸−プロリンジペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む 、そのプラスミドは、ＰＬプロモーターの下流に外来性遺伝子をクローニングす るためのＮｃｏ　１部位及び幻罰１部位を含む。

Ｆ、ブースミドＢＭ１６ｔ このプラスミドは、ｐＢＭ　１１／ＮＤＰと同一である。但し、それは上記のよ うに（例Ｉ１．　Ｆ、　Ｌネオマイシン遺伝子にＮｃｏ　１部位を欠いていて、 そしてそれはプラスミドｐＴＮＰｔについて記載されるように転写ターミネータ −を含む〔例（ＩＦ。

Ｎ、ターミネータ−配列に関する）を参照のこと〕。

Ｇ、ブースミドＢＭ１６ＮＤＰの プラスミドｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＶＧＦａ　（下記例Ｖ、Ａ、１．を参照ノ コと）を、Ｎｃｏ　Ｉ及びＢａｍＨＩにより消化し、ｐＢＭ　１６／ＰＰプラス ミドフラグメントから合成遺伝子ＴＶＶを除去した。次にｐＢＭ　１６／Ｎ１） ＰのＬ辺Ｉ−シ狸ＨＩの５．５Ｋｂプラスミドフラグメントを、ゲル精製した。

このフラグメント中のＮｃｏ　１部位を、Ｎ−遺伝子の初めの３２個のアミノ酸 をコードするヌクレオチド配列の下流に及び酸不安定性ジペプチドＡｓｐ−Ｐｒ ｏをコードする配列のすぐ後に配置する。

ＨｏＢＭＩＩ　ＰＡＤ　た８Ｍ１１Ｍ３ＰＡＤと　ばれる　のこのプラスミドは 、ｐＢＭ　１１／Ｍ３に由来し、そして変性されたアルカリホスファターゼシグ ナル配列から下流のＨｉｎｄ　ｍ　。

Ｓｍａ　Ｉ又はＲａｍ）！　Ｉ部位での外来性遺伝子のクローン化を可能にする 。合成オリゴヌクレオチドが、変性されたアルカリホスファターゼシグナルペプ チド及び３種のクローニング部位（Ｈｉｎｄｎ［、Ｓ＋ｓａ　Ｉ及び坦υ）ＩＩ ）を有するリンカ−領域をコードするＤＮＡを、ＰＬプロモーター及びＮ遺伝子 リポソーム結合部位から下流のｐＢＭ　１１発現ベクター中に挿入することを可 能にするように計画された。そのヌクレオチド配列は、λＮ遺伝子配列が有効的 なリポソーム開始及び翻訳のためにそのリポソーム結合部位の配列により生ぜし められるように、λＮ遺伝子のアミノ末端のヌクレオチド配列にできるだけ類似 するように最適化された。

シグナル配列をコードするオリゴヌクレオチドの配列は下記に示される； ＰＡＬ　５　’　ＧＡＴＣＡＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＧＣＣＣＴＣＧＣＡＣＴＴＣ ＴＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＣ＾ＧＴＧＡＣＡＡＡＡＧＣＴＴＣＣＣ ＧＧＧ　３’ＰＡ２　５　’　ＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＴＧＴＣＡＣ ＴＧＧＡＧＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＴＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴ ＴＧＴＡＧＡＴＴ　３’オリゴヌクレオチドＡ１及びＡ２を、Ａｐｐｌｉｅｄ　 Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ｒにより合成し、そしてアクリルアミドゲル上で精製した。そのオリゴヌクレオ チドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′末端でリン酸化し、そして 次にお互にアニールし、それぞれの末端でＢａｍＨＩオーバーハングを有する二 本鎖の０．０６７ＫｂのＤＮＡフラグメントを得た。

ｐＢＭ　１１／ＰＡＤを次の通りに構成した＝　１プラスミドルＢＭ　１１／Ｍ ３　（２０Ｒ）を、Ｎ遺伝子リポソーム結合部位及び開始メチオニンのためのＡ ＴＧコドンのすぐ後で、３０単位のＢａ＋ｓＨＩにより消化し、プラスミドを線 状化した。５′ホスフエートを、ウシ腸のアルカリホスファターゼによる消化に より除去した。

０．０６７ＫｂのＰＡオリゴヌクレオチドフラグメントを、前記線状化されたｐ ＢＭ　１１／Ｍ３プラスミドに連結し、そしてその得られたＤＮＡを用いて、コ ンピテントＥ、　２ｉＩＩＢＩＯＩを形質転換した。その形質転換体を、ヌクレ オチド配列決定によりスクリーンし、そして正しい構造体を単離した。

プラスミドｐＢＲ３２２を、制限酵素ＰｓｔＩにより消化した。その得られた３ ′突出末端を、従来の技法に従ってＴ４　ＯＮＡポリマラーゼにより前記消化生 成物を処理することによってプラント末端に転換した。合成石１１リンカ−（５ ’　−ｄ〔ＣＡＧＡＴＣＴＧ）　）をリン酸化し、そしてプラント末端ＤＮＡに 連結し、そしてそれを用いてコンピテントＥ、　２４　ＨＢＩＯＩを形質転換し た。プラスミドＤＮＡｍ製物を、従来の技法を用いてテトラサイクリン耐性形質 転換体から調製し、シ匹Ｉ制限部位の欠失及びＩｎ制限部位の付加についてスク リーンするためにＰｓｔＩ及びＩｎにより消化した。

２、迎ｌユ釘目１収 上記のようにして得られたプラスミドｐＢＭ４を、町ｓａｌにより消化した。３ ′突出末端を、プラント末端に転換し、そしてリン酸化されたＢ！ＪＬＵリンカ −をそのプラント末端に付加した。連結反応混合物を用いて、コンピテント基、 　２ｉＨＢ１０１を形質転換した。

３、飢Ｍ　１４皇ｌ終盪底 プラスミドｐＢＭ　１２を、ＩＩＩ及びＥｃｏＲＩにより消化した。

テトラサイクリン遺伝子及び複製の起点を含むその得られたドｐＢＭ　１３をｈ 工ＩＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、そしてバタテリオファージλｃＩ８５７Ｄ ＮＡ配列及びλＰＬ及びＮリポソーム結合部位を含むその得られた２、８Ｋｂの フラグメントを単離し、そして回収した。ｐＢＭ　１２からの３．６Ｋｂのフラ グメント及びｐＢＭ１３からの２．８Ｋｂのフラグメントを連結し、プラスミド ｐＢＭ　１４を形成した。その得られた連結混合物をＥ、　２ｉＨＢＩＯＩ中に 形質転換し、そしてその得られた形質転換をｐＢＭ　１４についてスクリーンし た。推定上のｐＢＭ　１４を、従来の技法を用いて制限消化に３−りさらに分析 した。

Ｊ、ブースミドＬＥＢａ■ プラスミドｐＬＥＢａｍが、その便利なりａｓＨＩｆ及びＢａｍＨＩ制限部位に より合成オリゴヌクレオチドフラグメントをクローン化するために使用された。

Ｎｃｏ　■及び坦υ■Ｉ制限部位を存するプラスミド、たとえばｐＢＭ　１１又 はｐＢＭ　１１／ＮＤＰ（下に説明される）を、合成ヌクレオチドフラグメント をクローニングするために使用することができる。

Ｋ、ブースミドＩａｃ　ｃｒｏ　−ａｌ。

ベクターｐｌａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌの調節要素は、旦、ユニのラクトース（里 ）オペロンのオペレーター−プロモーター領域及び迅及び竺のリポソーム結合部 位がら成る。このベクターは、プラスミドｐＴＲ２１３（Ｒｏｂｅｒｔｓなど、 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ（１９７８）７６　：　７６０　）及びｐＬＧ ３００　（Ｇｕａｒａｎｔｅ星？、＋並置（１９８０）毅：５４３）に由来する 。

プラスミドｐｌａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌを、ＢａｍＨＩ及びＩｎにより消化され た下記のオリゴヌクレオチドリンカー：ＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＣＧＡ ＧＧＡＴＣＣＴＴＴＣＴＡＧＡＧＴＣＣＧＧＡＴＣＴＣＣＴＡＧＧの存在下で、 ｐＴＲ２１３からの０．９６Ｋｂの力匹■−尼■フラグメント及びｐＬＧ３００ からの５．５４Ｋｂの力１ｔｌ−シυ）ＩＩフラグメントを連結することによっ て構成した。

このリンカ−は次の目的を満たした： （１）親プラスミドからｎ工■及びＢａｍＨＩ部位を再生すること、（２）外来 性ＤＮＡの挿入のために追加の部位を供給すること及び（３）挿入されたＤＮＡ が９１５’−ｇａｌコード配列に関して正しい翻訳の読み枠を合わしての存在を 可能にプラスミドｐｔａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌは、外来性遺伝子が細菌性Ｃｒｏ タンパク質のＮ−末端の２１個のアミノ酸の下流にクローン化されることを可能 にする。それは、ｐｌａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌプラスミドの０．８７ＫｂのＲｓ ａ　Ｉフラグメント（前もってフレノウ酵素の作用によりプラント末端に転換さ れている）を、シ獲）１１部位でｐＤＲ５４０（Ｐｈａｒ蒙ａｃｉａ）中に挿入 することによって構成された。挿入されたＤＮＡの配向は、リポソーム結合部位 及びＣｒｏのコード配列が里のリポソーム結合部位から下流に位置するような方 向であった。その得られたプラスミド、ｐｔａｃ／ｃｒｏは、里及び９１のリポ ソーム結合部位及びＣｒｏのＮ−末端コード配列を含んだ。

ｐｔａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌの構成における第２段階は、それぞれｐｔａｃ／ｃ ｒｏ及びｐＬＧ４００プラスミドからの１．１６Ｋｂ及び５．５４ＫｂのＰｓｔ 　Ｉ　−Ｂａ＋ｍＨＩフラグメントを連結することであった。従って発現ベクタ ーｐｔａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌはｐｌａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌに類イ以した。（ 旦し、ｐｔａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌのプロモーターは、トリプトファンオペロン のプロモーターからの一３５領域及び里オペロンのプリブナウ配列（−１０６１ 域）から成る。このハイブリッドプロモーターは、ｐｌａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌ よりも高いレベルの発現を可能にする。

Ｍ、Ｔａｃ　Ｐｔ区忙 この調製のためには、例■Ｃを参照のこと。

Ｎ、ブースミド　ｒｃｐ　ｔ このプラスミドは、　ｔａｃプロモーター要素を有し、そしてアルカリホスファ ターゼシグナル配列の後に対象の遺伝子を発現するためにｃｒｏ　ＳＤを利用す るように企画されている。このプラスミドの構成の例は、下記のｐＴＣＰｔ／Ｅ ＧＦの構成において示される。

Ｑ、ＴＮＰｔの　ｔｒ　３５１７ｂ　１ａｃ−１０ｎ５Ｄ８ｂ　ＡＴＧ　アルカ Ｉホスフ　−ゼシグ　ル　リンカ−量　−ＮＥＯ） このプラスミドは、　ｔａｃプロモーター要素を有し、そしてアルカリホスファ ターゼシグナル配列の後に一定の遺伝子を発現するためにＮ−遺伝子ＳＤを利用 するように企画されている。それは、ネオマイシン耐性遺伝子を有するｐＢＲ３ ２２バックグラウンドを有する。プラスミドｐＴＮＰｔを、次の通りにして構成 した： １、Ｈｉｎｄ　”　８Ｍ１６ｔ　ＶＧＦａの２．８ＫｂのＥｃｏＲ−プラスミド ｐＢＭ１６ｔ／　ＶＧＦａをＥｃｏＲＩ及びＢａｓ＋ＨＩにより消化し、そして ２．８Ｋｂのフラグメントを単離した。その２．８Ｋｂのフラグメントを、Ｅｃ ｏＲｌ及びＢａｒａＨＩリンカ−に連結し、そして正しい構造体を制限分析によ り単離し、そして中間体Ｉとして言及する。

ネオマイシン耐性遺伝子の近くのユニークＨｉｎｄｌ［Ｉ部位をＨｉｎｄＩＩ［ による消化により中間体■プラスミドから除き、フレノウフラグメントを用いて プラント末端を作り、そして再連結した。これは、ＨｉｎｄｎＩ部位を欠く中間 体■プラスミドをフラグメントを、ＥｃｏＲＩ及びＢａｇ）ｌ　Ｉによる中間体 ■の消化により単離した。その得られた２、、８Ｋｂのフラグメントを、アガロ ースゲル電気泳動により単離した。

２、　８ＭＩＩ　ＰＡＫの１５０ｂのＢａ＋＊ＨＩ　−Ｂｓｍ　Ｉフラグメント Ω璽製 プラスミドルＢ門１１／ＰＡＫは、ｐＢＭ　１１／ＰＡＷ　／ＥＧＦ　と同一で ある。但し、それはＥＧＦ遺伝子の代わりに、アルカリホスファターゼシグナル 配列の下流にＨｉｎｄｌＩ［、Ｓ＋ｓａ　Ｉ及び坦υ）ＩＩを有するリンカ−領 域を含む。ｐＢＭ　１１／ＰＡＫをＢｓｍ　Ｉ及びＢａｍＨＩにより消化し、そ してＮ−遺伝子ＳＤを含む１５０ｂｐのフラグメント、アルカリホスファターゼ シグナル配列及びリンカ−領域を単離した。

３、　第１ゴヌクレオチドＴａｃＡ　”　びＴａｃＡ−のｉＰオリゴヌクレオチ ドＴａｃＡ＋及びＴａｃＡ−をＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｏ＋ｓ０１ｉ ｇｏｎｕｃｌｏｕｔｉｄｏ合成機上で合成し、そして５ｓｔＩ部位の位置を定め られた１７個のヌクレオチドにより　１ａｃ−１０コンセンサス配列から分離さ れたｔｒｐ　−３５コンセンサス配列を有する５′末端でＥｃｏＲＩオーバーハ ングを有するように企画された。

この配列はまた、ｌａｃ　ａ＋ＲＮＡの５′末端、ｌａｃリプレッサー結合部位 及びＢｓｓ　Ｉオーバーハングも含んだ。

２．８Ｋｂのシ改ＲＩ−シ狸ＨＩフラグメント、　１５０ｂｐの影通■−Ｂａｍ ＨＩフラグメント及びオリゴヌクレオチドＴａｃＡ　”及びＴａｃＡ−を、ＤＮ Ａリガーゼを用いて一緒に連結し、そしてそのＤＮＡを用いてコンピテントＪＭ １０９（ｌａｃｌｑ）を形質転換した。正しい構造体を、制限分析及びＤＮＡ配 列決定により単離した。

ＴＴＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＡＴＡＣＧＡＡＡＣＧＡＡＧＣＡＴＴＧＧＣＣＧＴＡ ＡＧＴＧＣＧＡＴＴＣＣＧＧＡＴＴＡＧＣＴＧＣＣＡＡＴＧＴＧＣＣＡＡＴＣＧ ＣＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＡＣＴＧＣＣＡＣＡＣＡ ＣＣ・　の゛　云　の量 Ａ、ム　云 高レベルの発現のために最適化された宿主細胞コドンを使用する合成増殖因子遺 伝子を企画した。さらに、いくつかの便利な制限部位を、合成遺伝子中に精製し た。可能な場合、その新規の制限部位は、増殖因子遺伝子のアミノ酸配列を不変 化のままにし、しかしながらある場合、新規の制限部位の導入は変更されたアミ ノ酸配列を生成した。これらの部位は、合成遺伝子をおおまかに３部分、すなわ ちＮ−末端ドメイン、中間ドメイン及びＣ−末端ドメインに分割した。

天然のＶＧＦ遺伝子生成物は、成熟ＴＧＦの対照体を有さない極端なＮ−末端ド メインを含む。このドメインを欠くＶＧＦフラグメントは、切断されたものとし て言及される。

その制限部位を、１つの制限部位から他の部位に延びる一部合成のオリゴヌクレ オチドフラグメントから最終遺伝子の初期構成のために使用した。オリゴヌクレ オチドを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｏ１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ ｄｅ合成機により合成し、そしてアクリルアミドゲル上で精製した。オリゴヌク レオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′末端でリン酸化し、そ して次にそれぞれのオリゴヌクレオチドをその補体にアニＩＱＥＤＫ　る・　れ たヒトＴＧＦ　８ドメインＣ０！ニートＴＧＦＣ−ｒト）イン ｄ、νＧＦＣ−ｔドメイン　５′　す れたＶＧＦ　Ｃ−・　ドメイン、５′１（７）（７）Ｃ−ｒコード　るＶＧＦ　 Ｃ−ドメイヒトＥＣ，Ｆをコードする３種のオーバーラツプする合成オリゴヌク レオチド１　（Ａ、Ｂ）、２　（Ａ、Ｂ）及び３（Ａ、Ｂ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ 　Ｂｉｏｓｙｓｔｅａ＋ｓのオリゴヌクレオチド合成機により合成し、そしてア クリルアミドゲル上で精製した。オリゴヌクレオチドを、５′末端でＴ４ポリヌ クレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。それぞれのオリゴヌクレオチドを、 その補体にアニールした。

ＴＴＶ又は（ＴＧＦ／ＴＧＦ　／ＶＧＦ）で示される合成キメラ増殖因子を、ク ローニングベクターｐＬＥＢａｍ中にアセンブリーした。このハイブリッド増殖 因子は、遺伝子の２７３のアミノ末端中にヒトＴＧＦのアミノ酸配列を含んだ（ 但し、天然のヒト配列ＱＥＤＫから変更された配列ＱＥＥＫを除く）。カルボキ シ末端は、ＶＧＦのアミノ酸配列に由来し、そして天然の配列ＰＮＴの上流で配 列ＹＱＲＴＭＲを末端とした。プラスミドｐＬＥＢａｍを、Ｂｓ５ＨＩＩ及びシ 復ＨＩにより消化した。次に影咀ＨＩＩ−坦ｉｄＩのｐＬＥＢａｍを、ＤＮＡリ ガ・−ゼを用いて、オリゴヌクレオチドＴＧＦＩＯＩ、　１０２．１０３及び１ ０４、並びにＶＧＦＩ、２．３及び４に連結し、そしてその得られたプラスミド を用いてコンビテン）ＨＢＩＯＩを形質転換した。その形質転換体をアンピシリ ンに対して選択し、そしてＥｃｏＲｌ　、　Ｎｃｏ　Ｉ及びＢａｍＨＩを用いて の制限分析により及びＭｏｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ方法を用いてのヌクレオチド 配列決定によりスクリーンした。正しい構造体を単離し、そしてｐＬＥＢａｍ／ 　ＴＴＶと命名した。

ｅｒ ｂ、ブースミ　’　ＬＥＢａｍ　ＴＶＶ　（７）”　”ＴＶＶ又は（ＴＧＦ／Ｖ ＧＦ　／ＶＧＦ）として示される合成キメラ増殖因子を、クローニングベクター ｐＬＥＢａａ＋中にアセンブリーした。このハイブリッド増殖因子は、遺伝子の Ｎ−末端ドメイン中にヒ）ＴＧＦのアミノ酸配列を含んだ。中間及びＣ−末端ド メインは、切断されたＶＧＦ配列に由来し、そして天然の配列ＰＮＴの上流で配 列ＹＱＲを末端とする。さらに、その合成遺伝子は、変性部、すなわちＧＭＹＣ ＲＣに代るＧＹＡＣＶＣを有する。

（１）　ＬＥＢａｍ　ＴＴＶの４．３ＫｂのＫｎＩ−３ｈＩフーグ　ンプラスミ ドｐＬＥＢａｍ／↑ＴＶをＬ通Ｉ及びＩＩにより消化し、そして４．３Ｋｂの七 １１−ジ虫Ｉフラグメントをゲル精製した。

この消化は、クローニングプラスミドｐＬＥＢａ醜中の合成遺伝子ＴＴＶから中 間のＴＧＦドメインを除去する。

（２）　ＬＥＢａｍ　ＴＶＶ　（７）’　ヒオリゴヌクレオチドＶＧＦ１０１ａ 及び１０２ａを、ＤＮＡリガーゼを用いて、ｐＬＥＢａｍ／ＴＴＶの４．３Ｋｂ のに３Ｂ　Ｉ　−Ｓ３：　Ｉフラグメントに連結し、そしてその得られた混合物 を用いて、コンピテントＨＢ　１０１を形質転換した。その形質転換体をアンピ シリンに対して選択し、そしてサンガー−ジデオキシ法を用いてヌクレオチド配 列決定することによりスクリーンした。

ｅｒ Ｂ３合成血小板因子４遺伝子 高レベルの発現のために最適化された細菌性コドを使用する合成血小板因子４遺 伝子を企画した。一本鎖オーバーラッピング配列を調製し、マニーリング媒体中 で混合し、そして連結し、血小板因子４が単離される融合タンパク質を調製する ために読み枠を合わして発現ベクター中への挿入のために適切な末端を有する完 全な遺伝子を付与した。その得られた発現ベクターは、ＰＨＣＰＰ４と呼ばれた 。一本鎖セグメントを、Ｔ４ポリヌクレオチドリガーゼにより５′−リン酸化し 、そして反応体積物（３０ｍＭのＡＴＰ、　ＩＯＩＩＭのＤＴＴ、　１０５Ｍの Ｍｇｃｊｌ！ｚ。

ｌｘ／ｄのスペルミジン、１１００ｎのＴｒｉｓ−ＨＣｌ２　、　ｐＨ１，８及 び７４　ＯＮＡリガーゼ）３０Ｉ中でそれぞれのセグメント２００　ｐモルを混 合することによってアニールした。そのｄｓＤＮＡをＢａｍＨＩＩ及びシー）Ｉ Ｉにより消化し、そして７％ポリアクリルアミドゲル上で精製した。

次の配列が調製された： ■ ＨＫ ホルボール１２−シリステート１３−アセテ−）　ＰＭＡ　（］Ｏｎｇ／　ｄ　 ）を含む媒体により１６　、３６及び５２時間処理されたＵ９３７細胞から得ら れたポリ（Ａ）’　ＲＮＡをプールし、そして実質的に、Ｈｕｙｎｈ　７！？、 、ＤＮＡ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｉ　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ 　Ａ　ｒｏａｃｂ。

Ｄ、　Ｇｌｏｖｅｒ（ｅｄ）　（１９８４）により記載されているようにしてｃ ＤＮＡ合成及びλｇｔｌｏベクター中へのクローニングのために使用した。手短 に言えば、１０■のポリ（Ａ”　）ＲＮＡを、５０ｐモルのオリゴｄＴの存在下 で逆転写した。第２鎖を、ＤＮＡポリマラーゼ■を用いて合成し、そしてｃＤＮ Ａを３１ヌクレアーゼにより処理し、ヘアピンループを排除した。次にｃＤＮＡ を、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによる処理によりｄＧ末端化 した。ｄＧ末端化されたｃＤＮ＾を続いて、ＢｉｏｇｅｌＡ−５０カラム上でク ロマトグラフィー処理し、３００ｂｐ以下のｃＤＮＡを排除した。分類されたｄ Ｇ末端化されたｃＤＮＡを、ＥｃｏＲ■により切断されたλｇｔｌＯ中に、５′ 末端からのＡＡＴＴ、次いで１２個のデオキシシトシン残基を含む一本鎖の１６ 個のヌクレオチドの長さのリンカ−分子の存在下で連結した（Ｗｅｂｂｑ、２． 。

１９８７）。この連結されたＤＮＡを４ｙ　とトロでパッケージしくＧｒｏｓｖ ｅｌｄ星＆、、Ｇｅｎｅ（１９８１）１３　：　２２７〜２３７　）　、そして そのファージを用いてＥ、　２ｉＣ６０Ｈｌ！”を感染せしめた。この技法は、 ３Ｘ１０’個の組換え体／　ｐｇ　ｃＤＮＡを付与した。ニトロセルロースフィ ルタープラークリフトを２通り行ない、そしてそのフィルターを、長く最良と思 われる３５〜５０個のヌクレオチドの長さのプローブを用いてプローブした。そ のオリゴヌクレオチドプローブは、自動化された反復エドマン分解により得られ たペプチド配列に由来した。その精製されたオンコスタチンＭ配列は、そのタン パク質のＮ−末端から又はプロテアーゼにより生成された。リシンペプチドを配 列決定することによって得られた。

λｇｔｌｏライブラリィーの初期スクリーニングを、５０ヌーのオリゴヌクレオ チドプローブを用いて行なった。そのプローブは、リシンペプチドに由来した。

ペプチド１： （Ｋ）　Ａ　Ｑ　Ｄ　Ｌ　Ｅ　ＲＳ　Ｇ　Ｌ　Ｎ　Ｉ　Ｅ３　′　丁ＴＣＣＧＣ ＧＴＣＣＴＧ　ＧＡＣＣＴＣＧＣＣＡＧＡ　ＣＣＧ　ＧＡＣＴＴＧ　ＴＡＡ　Ｃ ＴＣ（”Ｐ）によりラベルされた上記オリゴヌクレオチドに対して陽性の反応性 を示すλｇｔｌＯクローンを、プラーク精製した。８個のクローンを得た。サザ ンプロット分析は、クローン中における陽性反応性ｃＤＮＡ挿人体は、６００ｂ ρ〜２Ｋｂの範囲であることを示した。続いて、サザンブロ２ト法を、３５１７ −のオリゴヌクレオチド（アミノ酸５３〜６４をコードする）及び４１７−のオ リゴヌクレオチド（アミノ酸２２〜３５をコードする）を用いて行なった。たっ た１個のクローンが、すべての３種の放射性ラベルされたオリゴヌクレオチドプ ローブと陽性の反応性を示した。

λｇｔｌＯクローン（λｏｎ＞　のｃＤＮＡ挿入体は、およそ２．ＩＫｂである ことが見出された。５′及び３′末端でＥｃｏＲＩ部を有するｃＤＮＡ挿入体を 、プラスミドベクターｐＥＭＢＬ　１８　［Ｄｅｎｔｅ　ｆｉｌｅ、。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　（１９８３）１１　：　１６４５〜１６ ５５：ｌのポリリンカー領域のＥｃｏＲ１部位にサブクローンした。その組換え 体をｐＯｎｃＭ４６と命名した。次に、追加のｃＤＮＡクローンを、オンコスタ チンＭ遺伝子の５′コード領域に由来するオリゴヌクレオチドを用いて特異的感 作により得、そしてその全遺伝子を含むゲノムクローンを単離した。

２、璽反皿位主園 オンコスタチンＭタンパク質をコードするクローンｐＯｎｃＭ４６の制限地図を 、プラスミドＤＮＡの標準の単−又は二重消化により得た。そのコード領域は、 Ｐｓｔ１部位、尼Ｉ［部位及ｃＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列を得、 そしてコンセンサス配列を次のように決定した： ＣＧＧＧＣＣＧＧＡＧＣＡＣＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡ　ＴＧＧＧＧＧＴＡＣＴ ＧＣＴＣＡ　ＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＭＧＶＬＬＴＱＲＴ Ｇ　ＣＴＧＣＴＣＡ　ＧＴＣＴＧ　ＧＴＣＣＴＴＧＣＡ　ＣＴＣＣＴＧ　ＴＴＴ 　ＣＣＡ　Ａ　ＧＣＡ　ＴＧＧＣＧＡ　ＧＣＡ　ＴＧＧＫＫＳＫＶＫＡＫＫＦＯ ５ＮＡＳＭＡ ＣＧ　ＧＣＴＡ　Ｔ　Ａ　ＧＧＣＡ　ＧＣＴＧＣＴＣＧＡ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｇ Ｔ　Ａ　ＣＣＧ　ＣＧＴ　Ｇ　ＣＴＣＣＴＴＧＧＣＣＡ　ＧbＴＣ ＡＩＧＳＣＳＫＥＹＲＶＬＬＧ　Ｑ　ＬＣＡ　ＧＡ　Ａ　ＧＣＡＧＡＣＡＧＡ　 ＴＣＴＣＡ　ＴＧＣＡＧＧＡＣＡ　ＣＣＡＧ（：ＡＧＡＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＣ ＣＴＡＱＫＱＴＤＬＭＱＤＴＳＲＬＬＤＰＹ ＡＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＧＣＣＴＴＣＣＣＣＡ　ＧＴＧ　ＡＧＧＡＧ　Ａ　ＣＣ ＣＴＧ　Ａ　ＧＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡ　ＧＧＲＰＧＡＦＰＳＥＥＴＬＲＧＬＧ Ｒ ＣＧＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡ　Ｇ　Ａ　ＣＣＣＴＣＡ　Ａ　ＴＧ　ＣＣＡ　Ｃ Ａ　ＣＴＧＧＧＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＡ　ＣＡ　ＧＲＧＦＬＱＴＬＮＡＴＬＧ ＣＶＬＨＲ Ａ　ＣＴＧＧＣＣＧＡＣＴＴＡＧＡＧＣＡ　ＧＣＧＣＣＴＣＣＣＣＡＡ　ＧＧＣ ＣＣＡＧＧＡ　ＴＴＴＧＧ　Ａ　ＧＡ　ＧＧＴＬＡＤＬＥＱＲＬＰＫＡＱＤＬＥ ＲＳ ＣＴＧＧＧＣＴＧＡ　ＡＣＡ　ＴＣＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＡＧＡ　ＡＧＣＴＧＣ Ａ　ＧＡ　ＴＧＧＣＧＡ　ＧＧＣＣＧＡ　ＡＣＧＬＮＩＥＤＬ　Ｅ　ＫＬＱＭＡ ＲＰＮＡ　ＴＣＣＴＣＧＧＧＣＴＣＡ　ＧＧＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＴＣＴ　Ａ　 ＣＴＧＣＡ　ＴＧＧＣＣＣＡ　ＧＣＴＧＣＴＧＧＡ　ＣＡ　ＡＩＬＧＬＲＮＮＩ ＹＣＭＡＱＬＬＤＮ ＣＴＣＡＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＡＧＣＣＣＡＣＧＡＡＧＧＣＴＧＧＣＣＧＧＧＧ ＧＧＣＣＴＣＴＣＡＧＣＣＧＣ５ＤＴＡＥＰＴＫＡＧＲＧＡＳＱＰＰ ＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＡＧＣＧＣＡ ＡＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＴＧＣＴＰＴＰＡＳＤＡＦＱＲＫＬＥＧＣ ＾ＧＧＴＴＣＣＴＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＴＣＧＣＴＴＣＡＴＧＣＡＣＴＣＡ ＧＴＧＧＧＧＣＧＧＧＴＣＴＴＲＦＬＨＧＹ）ＩＲＦＭＨＳＶＧＲＶＦＣＡＧＣ ＡＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＧＡＧＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＧＡＧＡＣＡＣ ＡＧＣＣＣＣＣＡＣＣＳＫＷＧＥＳＰＮＲＳＲＲＨＳＰ）ｉＱＡＧＧＣＣＣＴＧ ＡＧＧＡＡＧＧＧＧＧＴＧＣＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＡＣＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡ ＧＧＣＡＡＧＡＬＲＫＧＶＲＲＴＲＰＳＲＫＧｋ ＧＣＣＧＧＴＧＡＡＧＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＴＧＡＧ ＡＧＧＡコンセンサス配列を、ゲノムクローンの配列と比べることによってさら に確めた。その読み取り枠は、ヌクレオチド１からヌクレオチド７８３での終止 コドンまで続く。その読み取り枠は、推定上の開始メチオニンから上流に８個の アミノ酸をコードする。その推定上の開始メチオニンをコードするヌクレオチド 配列は、その開始メチオニンのためのコンセンサス配列と一致する［Ｋｏｚａｋ 、　Ｃｅ１ｌ（１９８６）４４二２Ｂ３〜２９２　）。

コンセンサスｃＤＮＡ配列から推定されるオンコスタチンＭポリペプチドのアミ ノ酸配列は、オンコスタチンＭが２５３個のアミノ酸前駆体のポリペプチドに由 来することを示す、精製されたオンコスタチンＭのアミノ末端配列〔上記及びＺ ａｒｌｉｎｇＲｅ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ３．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳ Ａ（１９８６）８３　：　９７３９〜９７４３）は、アミノ酸２６で存在する。

それは、シグナル配列として機能するように思われる疎水性領域により先行され る。成熟タンパク質は２６．０００の分子量を有する２２８個のアミノ酸を有し 、そしてそれは精製されたオンコスタチンＭのポリアクリルアミドゲル電気泳動 により測定される場合、約Ｍ　ｒ　＝２８．ＯＯＯにほぼ一致する（Ｚａｒｌ　 ｉｎｇ、　ｆｔ　ｅ　、　、１９８６皿皿）。

初期のタンパク質化学研究（Ｚａｒｌｉｎｇ７ｊ？、、１９８６皿皿）は、オン コスタチンＭが糖タンパク質であることを示した。ｃＤＮＡクローン配列は、成 熟タンパク質のアミノ酸７６及び１９３で位置する２種の可能性あるＮ−グリコ ジル化部位（Ｈｕｂｂａｒｄ及びＩｖａｔｔ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈ ｅ＊、（１９８１）５０：　５５５〜５８３　）を示唆する。ヌクレオチド誘導 タンパク質配列は、オンコスタチンＭが高い親水性分子であることを示す。５′ 未翻訳領域の２４個の塩基対及び３′未翻訳領域の１０５４個の塩基対を、異な ったｃＤＮＡクローンに得た。しかしながら、ポリＡ末端及びポリアデニル化の 認識部位は得られなかった。

４、剋匹皿毀立握１ ２．１）［ｂのオンコスタチンＭのｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩによる消化により、 λファージ組換え体、ｐＯｎｃＭ　４６から切り出した。その挿入体をｐＥＭＢ Ｌ　１Ｂ　［Ｄｅｎｔｅ　星＆、、Ｎｕｃ１．　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、（１９８３ ）１１　：　１６４５〜１６５５）中にＥｃｏＲＩ部位でクローン化し、β−ｇ ａｌ配列に対立するオンコスタチン間コード配列を有するクローンｐＯｎｃＭ　 ４６　１５ベクターを生成した。オンコスタチンＭの５非コ一ド配列を、ｐＯｎ ｃＭ　４６　１５の５ａｆｌ及びハエＩ［での二重消化により除去し、そして合 成のｅｏｂｐのＳａ　ｌ　Ｉ−鼠ＩＩフラグメントにより交換し、新規のＢａｔ ａＨＩ及びＮｃｏ　Ｉ部位を付与した。その得られたクローンをｐＯｎｃＦＩＥ ν５と命名した。その８０ｂｐのフラグメントの配列は次の通りである：５　’ 　−ＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＣＴＧ ＣＴＣＧ３　’　−ＧＣＣＴＡＧＧＴＧＧＴＡＣＣＧＣＣＧＣＴＡＧＣＣＧＴＣ ＧＡＣＧＡＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＣＧＣＧＴＧＣＴＣＣＴＴＧＧＣＣＡＧＣＴ ＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡ　−３’ＴＴＴＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＡＣＧＡＧＧ ＡＡＣＣＧＧＴＣＧＡＧＧＴＣＴＴＣＧＴＣＴＧＴＣＴＡＧ−５゜オンコスタチ ンＭのコード配列を、Ｘｈｏ　Ｉ及び伽」」での二重消化によりｐｏｎｃＭＥＶ ５から０．７Ｋｂのフラグメントとして切り出し、そして５ａ１１部位でｐＵｃ ８ベクター中にクローン化した。ｌａｃ　Ｚ’配列に対立するコード配列を有す るｃＤＮＡ挿入体を含むりＯ−ンｐＯｎｃＭＶＶ２を単離した。りｏ　−７ｐＯ ＮｃＭＶＶ２から切り出された０、７Ｋｂの違遼ｌ−脂υＨ１及び０．７Ｋｂの シ復ＨＩ−ＢａｄＩ７ラグメントを用いて、λｐＬ−基礎の（ｐＢＭ１６／ＮＤ Ｐ　１０ｎｃＭ　）発現ベクターを構成した。

ＬＪＳｍ Ｎ−ンパク　を　る１ム　ンバク　としての・　のボ変性されたヒ）ＴＧＦが、 Ｎ−遺伝子の３３個のＮ−末端アミノ酸との融合の一部としてこのシステムに発 現され、そしてヒト配列ＱＥＤＫに取って代る配列ＱＥＥＫを有する。

プラスミドｐＢＭ　１１／　Ｎ　／ＴＴＶをと±Ｉ及びＰｖｕ　Ｉにより消化し 、そして７８０ｂｐのＳ３ｐ　Ｉ　−Ｐｖｕ　Ｉフラグメントをゲル精製した、 このフラグメントは、Ｐｖｕ　Ｉ末端及び５Ｂｐｌ末端でｐＢＭｌ　１プラスミ ドの一部、Ｎ−遺伝子及びヒ）ＴＧＦ遺伝子のＮ−末端の２７３を含む。

ｂ、ＢＭＩＩ　Ｎ　ＴＴＶ　１゛の５ＫｂのＢａａ＋ＨＩ　Ｐｖｕ　Ｉフープ２ Ｌン」」１１製 プラスミドｐＢＭ　１１／Ｎ／ＴＴＶをＢａｗｌ（１及びＰｖｕ　Ｉにより消化 し、そして５ＫｂのＢａｍＨＩ　−Ｐｖｕ　Ｉフラグメントをゲル精製した。

ｃ、　ＢＭＩＩ　Ｎ　ＴＧＦ　の゛　び　−オリゴヌクレオチドＴＧＦ２０５及 び２０６．　ｐＢＭ１１／　Ｎ　／ＴＴＶからの７８０ｂｐＯ抽■−５世ｌフラ グメント及び５Ｋｂのは＋＋ｉＨＩ　−Ｐｖｕ　Ｉフラグメントを一緒に連結し 、そしてそれを用いて、コンピテントＨＢ　１０１を形質転換せしめた。その形 質転換体をネオマイシンに対して選択し、そしてＥｃｏＲＩを用いての制限分析 及びサンガー−ジデオキシ方法従ってのヌクレオチド配列決定によりスクリーン した。正しい構造体を単離し、そしてｐＢＭ　１１／　Ｎ　／ＴＧｐと命名した 。

この構造体においては、変性された合成ＴＴＶキメラ遺伝子が、Ｎ−末端でＮ− 遺伝子の初めの３３個のアミノ酸を有する融合タンパク質のＣ−末端部分として 発現された。このハイブリッド増殖因子は、前記遺伝子のアミノ末端の２７３に ヒトＴＧＦのアミノ酸を有した（但し、天然のヒト配列ＱＥＤＫから変えられた 配列ＱＥＥＫを除く）。カルボキシ末端はＶＧＦのアミノ酸配列に由来し、そし て天然の配列ＰＮＴの上流で配列ＹＱＲを末端とした。

ａ、Ｎｃｏｌ　ブーント　−ＢａＩＩｌｌ　Ｉ　ＴＴＶ人’　云　の量　リフ” 　ラスミ）’　ｐＬＥＢａｍ／　ＴＴＶ　ヲＮｃｏ　Ｉにより消化し、そしてそ の末端を、ＤＮＡポリマラーゼのフレノウフラグメントを用いてオーバーハング をフィルインすることによってプラント化した。次にそのＤＮＡをＢａｍＨＩに より消化し、そして１７０ｂｐのＮｃａｌ（プラント）　−ＢａｍＨＩ　ＴＴＶ フラグメントをゲル精製した。

ｂ、ＢａｍＨＩによ　″　れたＢＭ　１１のｆ′＋プラスミドｐＢＭ　１１をＢ ａｍＨＩにより消化した。

を、ＤＮＡリガーゼを用いて一緒に連結し、そしてその得られた混合物を用いて 、コンピテントＨＢ　１０１を形質転換した。

その形質転換体をネオマイシンに対して選択し、そして制限分析及びサンガー− ジデオキシ方法を用いてのヌクレオチド配列決定によりスクリーンした。正しい 構造体を単離し、そしてｐＢＭ　１１／　Ｎ　／　ＴＴＶ　と命名シタ。

Ｃ−合裁［丑土 このプラスミドを、ｐＢＭ　１１／Ｎ／ＴＴＶについて上に記載しているように して調製した。但し、合成ＰＦ４遺伝子がキメラＴＴＶ遺伝子の代わりに使用さ れた。発現ベクターｐＢＭ　１１中においてバクテリオファージスＮ−遺伝子の 初めの３３個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の下流で融合する合成血 小板因子４遺伝子のヌクレオチド配列及びその対応するアミノ酸配列は次の通り である。

１−♂ムー Ｎ−ンバク　び　る　Ａ　ンパク　としての・　のポ１ペプチドの量 Ａ、崖ｊば９また合迩い皐≧Ｌ １、ｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＶＧＦＡの調製：合成ＶＧＰＡ遺伝子のＮ−末端 配列は、天然のＶＧＦ配列の切断部分であり、そして配列ＤＩＰＡＩＲで始まる 。このプラスミドにおいて、ＶＧＦＡフラグメントは、λＮ−タンパク質の３２ 個のアミノ酸及びジペプチドのアスパラギン酸−プロリンの下流に位置する。Ｋ Ｂ１部位を保存するために、合成配列が、天然のＶＧＦ配列ＣＬ）ＩＧＤｃの代 わりにＣＬＨＣＧＴＣをコードするように変えられ、そしてそれは天然の配列Ｐ ＮＴの上流で配列ＹＱＲで終結する。さらに、ＶＧＦＡ遺伝子は、天然の配列Ｇ ＭＹＣＲＣに取って代る配列ＧＹＡＣＶＣをコードする。

ａ、ム　ＶＧＦ’　−のｓｏｂのＫｎＩ−ＢａｍＨＩ　Ｃ−ｒフｌノンユニト鉦 ４袈 プラスミドＰＬＥＢａｍ　／　ＴＶＶ　ｉを七通■及びＢａｍＨＩにより消化し 、そして８０ｂｐの拘徂Ｉ　ＢａｍＨＩフラグメントをゲル精製した。

このフラグメントは、５′末端で、ＫＬＬＩ部位を有する合成ｖＧＦ遺伝子のＣ −末端の２／３を含む。

ｂ、Ｂａ＠ＨＩによ　″　れた　リン　れたＢｌ’ｌ　１１の量プラスミドｐＢ Ｍ　１１／　Ｎ　／ＴＴＶをＢａｍＨＩにより消化し、そして５′ホスフエート をウシの腸のアルカリホスファターゼにグメントをゲル精製した。

ｃ、ＢＭ　１１　ＮＤＰ　ＶＧＦＡの゛　びオリゴヌクレオチドＶＧＦ　１０３ ａ、　１０４ａ、　ｐＢＭ　１１の５．６ＫｂのＢａｍＨＩフラグメント及びｐ ＬＥＢａｍ／ＴＴＶの５ｏｂｐのＫＨＢ　Ｉ　Ｂａａ）Ｉ　Ｉ’フラグメントを 、ＤＮＡリガーゼを用いて一緒に連結し、そして次にそれを用いてコンビテン） ＨＢＩＯＩを形質転換せしめた。形質転換体をネオマイシンに対して選択し、そ してＣＬＬＩを用いる制限分析及びサンガー−ジデオキシ技法に従ってのヌクレ オチド配列決定によりスクリーンした。正しい構成体を単離し、そしてＩ）ＢＭ 　１１／ＮＤＰ　／ＶＧＦＡと命名した。この構成体は、ＶＧＦ配列ＧＤＣ及び ＧＭＹＣＲＣの代わりに配列ＧＴＣ及びＧＹＡＣＶＣを有する。

２、　ＢＭＩＩ　ＮＤＰ　ＶＧＦａの量ＶＧＦａのＮ−末端配列は、天然のＶＧ Ｆ配列の切断された部分であり、そしてそれは配列ＤＩＰＡＩＲにより始まる。

さらに、そのＶＧＦａ配列は、天然のＶＧＦ配列、ＧＤＣ及びＧＭＹＣＲＣの代 わりに変えられた配列、ＧＴＣ及びＧＹＡＣＲＣを含む。このプラスミドにおい て、ＶＧＦａ遺伝子は、λＮ−タンパク質の３２個のアミノ酸及びジペプチドの アスパラ陀ン酸−ブロリンの下流に位置する。蟻酸による精製された融合タンパ ク質の処理は、λＮ＝タンパク質のアミノ末端からＶＧＦａタンパク質の分離を 可能にする、酸不安定性アスパラギン酸−プロリンのペプチド結合での切断をも たらす。ＶＧＦａタンパク質がアミノ末端でプロリン残基と共に放されるように 切断は、存在する。

ａ、ＳｈＩによ　゛　ヒ　れ、　リン　れたＢＭ１１ＤＰ／力上ｍ袈 プラスミドｐＢＭ　１１／ＤＰ／ＶＧＦＡ　（１０ａｇ）を、３０単位（７）Ｓ セＩにより消化し、そして５′ホスフエートをウシの腸のアルカリホスファター ゼによる処理により除去した。５Ｋｂのプラスミドフラグメントを、アガロース ゲル上で電気泳動した後、回収した。

ｂ、ＢＭＩＩ　ＤＰ　ＶＧＦＡの７０ｂのＥｃｏＲＪ−ＳｈＩ７−グメン上立握 袈 ブーｙスミＦｐＢＭ　１１／ＤＰ／ＶＧＦＡ　（１０Ｒ）を、３０単位のＥｃｏ Ｒｌにより及び次に３０単位の鏑Ｉにより消化した。　７０ｂｐのフラグメント を、アガロースゲル上で電気泳動した後、回収した。

３、ＢＭ　１１　ＮＤＰ　ＶＧＦａの゛　びオリゴヌクレオチドＶＧＦ　ＩＡ及 び２Ａを含む２４ｂｐのフラグメント、５　Ｋｂ（７）ト±Ｉ　７　ラグメント 及びｐＢＭ　１１／ＤＰ／ＶＧＦＡ（７）７０ｂｐのＥｃｏＲｒ　−５３４１フ ラグメントを一緒に連結し、そしてその混合物を用いてコンピテント旦、ユニＨ ＢＩＯＩ細胞を形質転換せしめた。その形質転換体を、サンガー−ジデオキシヌ クレオチド方法を用いてヌクレオチド配列決定することによってスクリーンした 。正しいクローンを単離し、そしてｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＶＧＦａと命名し た。

この構成体においては、変性された合成ＴＴＶキメラ遺伝子が、Ｎ−末端でＮ− 遺伝子の初めの３２個のアミノ酸を有する融合タンパク質のＣ−末端部分として 発現される。酸不安定性アスパラギン酸−ブロリンジペプチドは、融合の２種の 部分を分離する。ハイブリッド増殖因子は、その遺伝子のアミノ末端の２７３に おいてヒトＴＧＦのアミノ酸配列を含む。

但し、天然のヒ）ＴＭＲ配列ＱＥＤＫから変更された配列ＱＥＥＫを除く、カル ボキシ末端は、ＶＧＦのアミノ酸配列に由来し、そして天然の配列ＰＮＴの上流 で配列ＹＱＲで終結された。

ａ、５ＫｂのＮｃｏ　ＩによるＢＭ　１１ブースミドフーグメントの貞袈 プラスミ）’ｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＶＧＦＡをＮｃｏ　Ｊにより消化し、そ して５ＫｂのＮｅｏ　Ｉプラスミドフラグメントをゲル精製した。

このフラグメントは、Ｎ−遺伝子の初めの３２個のアミノ酸をコードする配列の 下流でのアスパラギン酸−プロリン切断部位で１個のＮｃｏ　Ｉオーバーハング を有する。他のＮｃｏ　Ｉ部位は、ネオマイシン耐性遺伝子に存在する。

ｂ、　ＢＭｌｌの０．６ＫｂのＮｃｏ　Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメントの８．１プ ラスミドルＢＭ　１１／　Ｎ　／ＴＴｖをＮｃｏ　Ｉ及びＢａｍＨＩにより消化 し、そして０．６にｂのＮｃｏ　Ｉ　−ＢａｍＨＩプラスミドフラグメントをゲ ル精製した。このフラグメントは、ネオマイシン耐性遺伝子中にＮｃｏ　Ｉ−オ ーバーハングを有する。

ｃ、１７０ｂのム　ＴＧＦ　ＴＧＦ　ＶＧＦ　７−グメントの調１プラスミドｐ ＬＥＢａｍ　／　ＴＴＶをＮｃｏ　Ｉ及びＢａｍＨＩにより消化し、そし７　Ｔ ＧＦ／ＴＧＦ　／ＶＧＦ合成遺伝子を含む１７０ｂｐのＮｃｏ　Ｉ　−ＢａｍＨ Ｉフラグメントをゲル精製した。このフラグメントは、遺伝子の５′末端でＮｃ ｏ　Ｉオーバーハング及び遺伝子の３′末端でＢａｎ＋ＨＩオーバーハングを有 する。

ｄ、ＢＭ　１１　ＮＤＰ　ＴＴＶ　（７）’　び５ＫｂのＮｅｏ　Ｉフラグメン ト及び０．６ＫｂのＮｃｏ　Ｉ　−ＢａｗｓＲ１フラグメントを、ＤＮＡリガー ゼを用いて１７０ｂＰのＮｃｏ　Ｉ　−Ｂａｇ）ｌ　ＩＴＴＶ遺伝子と共に連結 し、そしてその得られた混合物を用いて、コンピテントＨＢ　１０１を形質転換 せしめた。その形質転換体を、正しく再構成されたネオマイシン耐性遺伝子を有 するコロニーのみが生存するようにネオマイシンに対して選択した。形質転換体 を、Ｎｃｏ　■による制限分析及びサンガー−ジデオキシ技法を用いるヌクレオ チド配列決定を用いてスクリーンした。正しい構成体を単離し、そしてｐＢＭ　 １１／ＮＤＰ　／ＴＴνと命名した。

２、ＢＭＩＩ　ＮＤＰ　ＶＴＶ（７）ｉ　ｌこの構成体においては、変性された 合成ＶＴＶキメラ遺伝子が、Ｎ−末端でＮ−遺伝子の初めの３２個のアミノ酸を 有する融合タンパク質のＣ−末端部分として発現された。酸不安′定性アスパラ ギン酸−プロリンジペプチドは、融合の２種の部分を分離する。ハイブリッド増 殖因子は、天然の配列ＱＥＤにに取って代るアミノ酸配列ＱＥＥＫを有する中間 のドメインにおいてヒトＴＧＦのアミノ酸配列を含んだ。Ｎ−末端及びＣ−末端 ドメインは、切断されたＶＧＦ配列に由来し、そしてそれは配列ＤＩＰＡＩＲで 始まり、そして天然の配列ＰＮＴの上流で存在する配列ＹＱＲで終結する。

ａ、　ＢＭｌｌの５ＫｂのＢａｇ）Ｉ　Ｉ　−Ｎｃｏ　Ｉフラグメントの８゜プ ラスミドｐＢＭ　１１　／　Ｎ　／ＴＴＶをＢａｍＨＩ及びＮｃｏ　Ｉにより消 化し、そして５）［ｂのＢａｍｔｌ　Ｉ　−Ｎｃｏ　Ｉフラグメントをゲル精製 した。このフラグメントは、Ｎ−遺伝子の初めの３２個のアミノ酸をコードする 配列の３′末端で複ＬＨ１オーバーハング及びネオマイシン耐性遺伝子中にＮｃ ｏ　１部位を含む。

ｂ、ＢＭＩＩ　Ｎ　ＴＴＶの７００ｂのＫｎＴ−ＮｃｏＩフーグメｌ上Ω璽袈 プラスミドｐＢ？＋　１１／　Ｎ　／ＴＴＶをｊ副■及びＮｃｏ　Ｉにより消化 し、そして７００ｂｐの七通Ｉ　Ｎｃｏｌフラグメントをゲル精製した。このフ ラグメントは、Ｎｃｏ　Ｉオーバーハングでネオマイシン耐性遺伝子の一部及び 七胆■オーバーハングでＴＴＶ合成遺伝子のＣ−末端ＶＧＦドメインを含むプラ スミドｐＢＭ１１の一部から製造される。

ｃ、ＢＭＩＩ　ＮＤＰ　ＶＴＶ（７）゛ヒオリゴヌクレオチドＶＧＦ　１０３ａ 及び１０４ａ　、　ｐＢＭ　１１の５ＫｂのＢａｍＨＩ　−Ｎｃｏ　Ｉ　７　ラ グメント及びｐＢＭ　１１／　Ｎ　／ＴＴＶ　（７）　７００ｂｐの拘狙Ｉ　Ｎ ｃｏＩフラグメントをＤＮＡリガーゼを用いて一緒に連結し、そして次にそれを 用いてコンピテントＨＢ　１０１を形質転換した。その形質転換体をネオマイシ ンに対して選択し、そＬ７Ｃｆａｌを用いての制限分析及びサンガー−ジデオキ シ技法に従ってのヌクレオチド配列決定によりスクリーンした。

ｅｒ ３、　８Ｍ１６　ＮＤＰ　ＴＶＶ（７）ｆ　ｌこの構成体においては、変性され た合成ＴＶＶキメラ遺伝子は、Ｎ−末端でＮ−遺伝子の初めの３２個のアミノ酸 を有する融合タンパク質のＣ−末端部分として発現された。酸不安定性アスパラ ギン酸−ブロリンジペプチドは、融合の２種の部分を分離する。ハイブリッド増 殖因子は、Ｎ−末端ドメインにおいてヒトＴＧＦのアミノ酸配列を含んだ。中間 及びＣ−末端ドメインは切断されたＶＧＦ配列に由来し、そして配列ＹＱＲで終 結した。さらに、合成遺伝子は、ＧＭＹＣＲＣに代る変性体ＧＹＡＣＶＣを有す る。

ａ、ＢＭ　１１　ＮＩＩＰ　￥ＧＦａの４．３ＫｂのＮｃｏ　Ｉ　−Ｂ　Ｉ！　 ＩＩフーグ）７上■握Ｉ プラスミドｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＶＧＦａをＮｃｏ　Ｉ及びｈＩＩＩにより 消化し、そして４．３Ｋｂのフラグメントをゲル精製した。Ｎｃｏ　Ｉオーバー ハングは、Ｎ−遺伝子の初めの３２個のアミノ酸のすぐ下流のアスパラギン酸− プロリン切断部位に位置する。

ｂ、８Ｍ１１Ｍ５の１．２　ＫｂのＢａｍＨＩＢｉ！、Ｉｆフーグメントの１プ ラスミドｐＢＭ１１Ｍ５を坦υＨ１及びＩＩＩにより消化し、そして１．２Ｋｂ のフラグメントをゲル精製した。このフラグメントは、ネオマイシン耐性遺伝子 中のＮｃｏ　１部位が除去されていることにおいて正常なｐＢＭ　１１フラグメ ントと異なり、そしてこのＮｃｏ　１部位を欠くすべての続くベクターをｐＢＭ 　１６として言及する。

Ｃ，１７０ｂのＮｃｏ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　ＴＶＶ人’　云　フラグメント葛皿 袈 プラスミドｐＬＥＢａｍ　／　ＴＶＶをＮｃｏ　Ｉ及びシυＦｌｌにより消化し 、そして１７０ｂｐのＮｃｏ　Ｉ　ＢａｍＨＩフラグメントをゲル精製した。

この合成遺伝子フラグメントは、５′−末端でＮｃｏ　工部値及び３′−末端で ＢａｍＨＩ部位を有する。

ｄ、ＢＭ　１６　ＮＤＰ　ＴＶＶ　（７）’　びｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＶＧ Ｆａの４．３ＫｂのＮｃｏ　Ｉ−鼠■フラグメント、９８Ｍ１１Ｍ５の１．２Ｋ ｂの影＋ｓ＋ＨＩ−展■フラグメント及び１７ｏｂｐのＮｃｏ　Ｉ　Ｂａｎ＋Ｈ Ｉ　ＴＶＶ合成遺伝子フラグメントをＤＮＡリガーゼを用いて一緒に連結し、そ してその得られた混合物を用いて、コンピテントＨＢ　１０１を形質転換せしめ た。その形質転換体をネオマイシンに対して選択し、制限分析及びサンガー−ジ デオキシ技法を用いてのヌクレオチド配列決定によりスクリーンした。そのプラ スミドをｐＢＭ　１６と命名し、そしてそれはネオマイシン耐性遺伝子における Ｎｃｏ　Ｉ制限部位の欠失を示唆する。

Ｃ１澄迩ＵシＹ乙 １、ｄ台１１　ＮＤＰ　ＥＧＦのｆ′＋この構成体において、ヒトＥＧＦ遺伝子 は、Ａｓｐ　−Ｐｒｏ切断部位の下流に存在するＮ−遺伝子の３２個のＮ−末端 アミノ酸を有する融合タンパク質の一部として発現される。

ａ、　ＢＭｌｌの５ＫｂのＮｃｏ　ＩフーグメントのＩｌｌｌｌプラスミドル８ １１／ＤＰ／ＶＧＦＡをＮｃｏ　Ｉにより消化し、そして５′ホスフエートをウ シの腸のアルカリホスファターゼによる処理により除去した。その５Ｋｂのプラ スミドフラグメントをゲル精製した。このフラグメントは、Ｎ−遺伝子の初めの ３２個のアミノ酸をコードする配列の下流のＡｓｐ　Ｐｒｏ切断部位で１つのＮ ｃｏ　Ｉオーバーハングを有する。他のＮｃｏ　Ｉ部位は、ネオマイシン耐性遺 伝子中に存在する。

ｂ、ｄｊｊｌの０．６ＫｂのＮｃｏ　Ｉ　−Ｂａｎ＋ＨＩフーグメントのＵプラ スミドル８Ｍ　１１／　Ｎ　／ＴＴＶをＮｃｏ　Ｉ及びＢａｍＨｒにより消化し 、そしてこの０．６ＫｂのＮｅｏ　Ｉ−ＢＪυ）ＩＩプラスミドフラグメントを ゲル精製した。このフラグメントは、ネオマイシン耐性遺伝子中にＮｃｏ　Ｉオ ーバーハングを有する。

ｃ、ＢＭＩＩ　ＤＰ　ＥＧＦの′　び ５′末端でＮｃｏ　Ｉオーバーハング及び３′末端でシυＨＩオーバーハングを 有する３組のアニールされたＥＧＦオリゴヌクレオチド、ｐＢＭ　１１の５Ｋｂ のＮｃｏ　Ｉフラグメント及びｐＢｌ’ｌ　１１の０．６Ｋｂの違改■−シυＨ ｌフラグメントを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて一緒に連結し、そしてその得 られた混合物を用いて、コンピテントＥ、２ｉＨＢＩＯＩを形質転換せしめた。

その形質転換体を、正しく再構成されたネオマイシン耐性遺伝子を有するコロニ ーのみが生存するようにネオマイシンに対して選択した。その形質転換体を、上 記のようにＥｃｏＲＩ及びＢａｎ＋ＨＩを用いての制限分析及びＤＮＡ配列決定 によりスクリーンした。

Ａ　ＡＧＣＡＧＣＡ　Ａ　ＡＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＡ　ＡＧＣ ＧＣＡ　Ａ　Ａ　ＡＣＣＡＧＴＴＣＧＧ　ＡＴＣＧＡＴＣＣＡＡＮＰＬＬＶＧＶ ＳＡＫＰＶＲＩＤＰＧＣＴ　Ａ　ＣＡ　ＴＣＧＧＣＧＡ　ＡＣＧＴＴＧ　ＣＣＡ 　ＧＴＡＣＣＧＴＧ　Ａ　ＣＣＴＧ　Ａ　Ａ　Ａ　ＴＧＧＴＧＧＧ　Ａ　ＡＣＴ fＣＧ　ＴＴＡ ＹＩＧＥＲＣＱＹＲＤＬＫＷＷＥＬＩ？傘この構成体においては、合成ＰＦ４遺 伝子が、Ｎ−末端でＮ−遺伝子の初めの３２個のアミノ酸を有する融合タンパク 質のＣ−末端タンパク質として発現される。酸不安定性アスパラギン酸−ブロリ ンジペプチドは、融合体の２種の部分を分離する。

ａ、ブースミドＢＭ　１１の５ＫｂのＮｃｏ　ＩフラグメントのＷブー７ｘミド ｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＶＧＦＡをＮｃｏ　１により消化し、そして５Ｋｂの ル改１プラスミドのフラグメントをゲル精製した。

このフラグメントは、Ｎ−遺伝子の初めの３２個のアミノ酸をコードする配列の 下流のアスパラギン酸−プロリン切断部位で１つのＮｃｏ　Ｉオーバーハングを 有する。他のＮｃｏ　１部位は、ネオマイシン耐性遺伝子中に存在する。

ｂ、ブースミドＢＭ　１１の０．６ＫｂのＮｃｏ　Ｉ　−ＢａｍＨＴ　７−グメ ｌ上■星製 プラスミドｐＢＭ　１１／Ｎ／ＰＦ４をＮｃｏ　Ｉ及び坦伊ＨＩにより消化し、 そして０．６ＫｂのＮｃｏ　Ｉ　−Ｂａ＋＋ＨＩフラグメントをゲル精製した。

このフラグメントは、ネオマイシン耐性遺伝子中に５ＫｂのＮｃｏ　Ｉ及び０． ６Ｋｂの違改Ｉ　−Ｂａａ）ｌ　Ｉフラグメントを、ＤＮＡリガーゼを用いてＰ Ｆ４遺伝子と共に連結し、そしてその得られた混合物を用いてコンピテント）Ｉ Ｂ　１０１を形質転換せしめた。その形質転換体を、正しく再構成されたネオマ イシン耐性遺伝子を有するコロニーのみが生存するようにネオマイシンに対して 選択した。形質転換体を、Ｎｃｏ　Ｉによる制限分析及びサンガー−ジデオキシ 技法を用いてのヌクレオチド配列決定によりスクリーンした。正しい構成体を単 離し、そしてｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＰＦ４と命名した。

発現ベクターｐＢＭ　１１におけるバタテリオファージλＮ−遺伝子の初めの３ ２個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列及び酸不安定性ジペプチドＡｓｐ 　Ｐｒｏ（”Ｏ）の下流での融合体中の合成血小板因子４のヌクレオチド配列及 びその対応するアミノ酸配列は、次の通りである。

袈 変性されたオンコスタチンＭ遺伝子を含むプラスミドｐＯｎｃＭＶＶ２を、連速 ■及びＢａｗｌ　Ｉ　ニより消化し、そして７００ｂｐのＮｃｏ　Ｉ　−Ｂａｍ ＨｌオンコスタチンＭ遺伝子をゲル精製した。

このフラグメントは、遺伝子の５′末端でＮｃｏ　Ｔオーバーハング及び遺伝子 の３′末端でＢａｍＨＴオーバーハングを含んだ。

ｂ、ＢＭ　１６　ＮＤＰ　ＯｎｃＭの゛　び　−変性されたオンコスタチンＭ遺 伝子の７００ｂｐ（７）Ｎｃｏ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフラグメント及びプラスミド ｐＢＭ　１６／ＮＤＰのＮｃｏ　Ｉ　−影υＨｌフラグメントをＴ４リガーゼに より一緒に連結し、そしてそれを用いてコンピテントＥ、　：ｌ　１．Ｉ　ＨＢ ＩＯＩを形質転換せしめた。その形質転換体を、サンガー−ジデオキシ技法を用 いての配列決定により正しい構成体についてスクリーンした。正しいコロニーを 選択し、そしてｐＢＭ　１６／　ＮＤＰ　１０ｎｃＭと酸分解性ジペプチド（Ｄ Ｐ）に融合されるバクテリオファージスＮ−遺伝子の初めの３２個のアミノ酸を コードするプラスミドｐＢＭ　１６／ＮＤＰ　１０ｎｃＭ及び合成ＯｎｃＭ遺伝 子を含む旦、ユＩＪ　）１８１０１株を、３０゛Ｃで増殖せしめた。約０．９の ００６゜。で、温度を４２°Ｃに上げ、ＮＤＰ　／　ＯｎｃＭ融合遺伝子の転写 及び翻訳を可能にするためにＰＬプロモーターを誘発する温度感受性リプレッサ ーを不活性化する。その融合タンパク質は、バクテリオファージスＮ−遺伝子の ３２個のアミノ末端残基、続いて酸不安定性ジペプチドＡｓｐ−Ｐｒｏ　、続い てそのＮ−末端メチオニンを含むオンコスタチンＭの２２８個のアミノ酸を有す ることによって特徴づけられる。

２．８Ｍｘを　いてのオンコスタチンＭのし１■８２ｂｐのフラグメントを、下 記に示すように化学的に合成した。

ＧＡＧＴＡＣＣＧＣＧＴＧＣＴＣＣＴＴＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧ ＡＣ八　−３′ＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＡＣＧＡＧＧＡＡＣＣＧＧＴＣＧＡＧＧＴ ＣＴＴＣＧＴＣＴＧＴＣＴＡＧ　−５’ｐｏｎｃＭＶＶ２から単離された８２ｂ ｐのフラグメント及び切断されたＯｎｃＭｃＤＮＡ　（ＢＬＬＩＩ　−Ｈｌｎｄ 　ＩＩＩ　）を、Ｎｅｏ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ｍによる２重消化により調製された ｐＢＭ　１６／ＮＤＰ　／ＴＶＶベクター中にクローン化した。そのＤＮＡを用 いて、Ｅ、２４ＤＨ５αを形質転換せしめた。クローンｐＢＭＸを単離し、そし て予測される配列を担持することを確証した。そのコード配列は−１−Ｅ−Ｇ− Ｒ−１すなわち成熟ＯｎｃＭのＮ−末端に正確に融合される因子Ｘ認識部位を含 むので、ｐＢＭＸにより産生される組換えタンパク質は、活性化された因子Ｘの 処理に従って−１−Ｅ−Ｇ−Ｒ−のＲ残基で切断され、確実なＮ−末端配列を有 する成熟ＯｎｃＭが生成される。ｐＢＭ　１６／ＮＩＩＰ　１０ｎｃＭからオン コスタチンＭを調製するために、ｐＢＭＸを用いてのオンコスタチンＭの類領す る方法が使用された。

■−ニー アルカリホスファ　−ゼシグナル配置を　る　Ａタンパク　としての・　のポリ ペプチドのｉ Ａ、ＢＭＩＩ　ＰＡＤ　ＥＧＦのｆＩ 合成オリゴヌクレオチドを、Ｐｔプロモーター及びＮ遺伝学リポソーム結合部位 の下流のｐＢＭ　１１発現ベクター中への、変性されたアルカリホスファターゼ シグナルペプチド及び３種のクローニング部位（）Ｉｉｎｄｌ［Ｉ　、　Ｓｍａ 　Ｉ及びシ＞ｒｓＨＩ　）を有するリンカ−領域をコードするＤＮＡの挿入を可 能にするように企画した。そのヌクレオチド配列は、λＮ遺伝子配列が効果的な リポソーム開始及び翻訳のためにそのリポソーム結合部位の配列と共に進展する につれて、λＮ遺伝子のアミノ末端のヌクレオチド配列にできるだけ類似するよ うに最適化された。さらに、アルカリホスファターゼシグナル配列の第２アミノ 酸、すなわち塩基性アミノ酸のりシンが、酸性アミノ酸、すなわちアスパラギン 酸に変えられた。

１、ＥＧＦの、７ＫｂのＥｃｏＲ−Ｂａｗｌ　−グ　ントの−プラスミドｐＢＭ 　１１／ＮＤＰ　／ＥＧＦ（３０■）を、３０単位の以遠ＲＩにより消化し、そ して次に４単位のＤＮＡポリマラーゼのフレノウフラグメントにより処理し、プ ラント末端を製造した。

最終的に、そのＤＮＡを３０単位のＢａｇ）ｌ　Ｉにより消化し、そしてＥＧＦ の０．１７Ｋｂのフラグメントを、アガロースゲル上での電気泳動後、回収した 。そのように精製されたＤＮＡは、５′末端でプラント化されたＥｃｏＲｒ部位 及び３′末端でＲａｍ）ｌ　ｌオーバーハングを有する。

２、ＢＭＩＩ　ＰＡＤの０．５ＫｂのＰｖｕ　ｌ−ＨｌｎｄＩ［Ｉフラグメント 皇虞翌 プラスミドｐＢＭ　１１／ＰＡＤ（１８Ｍ’）を、３０単位のＨｉｎｄｌｌによ りそして０．５ＫｂのＰｖｕｌ　ＨｉｎｄｌＩＩ　（プラント）フラグメントを 、アガロースゲル上での電気泳動後、回収した。

３、　８Ｍ　Ｉ　ＰＡＤの５．２ＫｂのＰｖｕ−Ｂａ−■　フーグメン９」１１ プラスミドｐＢＭ　１１／ＰＡＤ（１８ｉＩｇ）を、３０単位のＰｖｕ　Ｉ　、 次に３０単位のＢａｍＨＩにより消化した。５．２Ｋｂのフラグメントを、アガ ロースゲル上での電気泳動後、回収した。

０．５Ｋｂのハッ■−影ｎｄｌｌＩ（プラント）フラグメント及び５．２Ｋｂの Ｐｖｕ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフラグメントを一緒に連結し、そしてその得られた混 合物を用いて、コンピテントＥ、　２４　）ＩＢＩＯＩを形質転換せしめた。そ の形質転換体を、上記のようにＤＮＡ配列決定によりスクリーンした。所望する シグナル配列／ＥＧＦ領域は、次の配列を有した： ｐＢＭ　１１／ＰＡＤ発現システム中での外来性タンパク質の産生の効力及び融 合生成物から機能的に活性的な外来性タンパク質を精製するための能力が、例と してｐＢＭ　１１／ＰＡＤ　／ＥＧＦを用いて示された。サイズ排除クロマトグ ラフィー（ＴＳＫ　−２５０）により処理した後、１０．３■等量の活性ＥＧＦ 融合ポリペプチドを、ＥＧＦ遺伝子を発現するために抑制解除された２３ｇ（８ ２）の旦、ａから回収した。４０％のＥＧＦ活性が、シグナル配列から切断され たＥＤＦに由来した。

袈 変性されたオンコスタチンＭ遺伝子を含むプラスミドｐｏｎｃＭＶＶ２を、Ｎｃ ｏ　Ｉにより消化し、そして５′オーバーハング塩基を３１ヌクレアーゼによる 処理により除去し、プラント末端化されたフラグメントを残した。そのヌクレア ーゼ処理は、開始メチオニンのためのコドンを除去した。そのプラスミドをさら に、シ狸ＩＩにより消化し、そして７００ｂ、のＮｃｏ　Ｉ（プラント）　−Ｂ ａｏ＋ＨＩオンコスタチンＭ遺伝子フラグメントをゲル精製した。このフラグメ ントは、５′末端でＮｃｏ　Ｉプラント末端及び３′末端でＢａｍＨｌオーバー ハングを含んだ。

２、　８Ｍ１１？Ｉ３　ＰＡＤフーグメントのテ変性されたアルカリホスファタ ーゼシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＢＭ１１Ｍ ３　／ＰＡＤを）１ｉｎｄＩＩ［により消化し、シグナル配列の下流を直接切断 した。

そのオーバーハング末端をフィルインし、そしてＤＮＡポリマラーゼのフレノウ フラグメントを用いてプラント化した。

その得られたＤＮＡをさらにＰｖｕ　Ｉにより消化し、そして６８０ｂｐのＨｉ ｎｄｌｌＩ　（プラント）　−ＰｖｕＩフラグメントをゲル精製した。

プラスミドｐＢＭ１１Ｍ３　／ＰＡＤをまた、影＋ｄＩ及びハラＩにより消化し 、そして５ＫｂのＢａｍＨＩ　−Ｐｖｕ　Ｉフラグメントを、ゲル精製した。

３、　８Ｍ　１１　ＰＡＤ　ＯｎｃＭの゛　び７００ｂｐのＮｃｏＩ（プラント ）　−ＢａｍＨＩオンコスタチンＭ遺チンフラグメント、ｐＢＭ１１Ｍ３　／Ｐ ＡＤの６８０ｂｐＯ影ｎｄＩ［Ｉ（プラント）−ハッ■フラグメント及びｐＢＭ １ｔＭ３　／ＰＡＤの５ＫｂのＢａｍＨＩ　−Ｐｖｕ　Ｉフラグメントを、Ｔ４ リガーゼを用いて一緒に連結し、そしてそれを用いてコンピテントＨＢ　１０１ を形質転換せしめた。正しい構成体を、サンガー−ジデオキシ技法を用いてのヌ クレオチド配列決定によりアッセイした。正しいコロニーを選択し、そしてｐＢ Ｍ　１１／ＰＡＤ　１０ｎｃＭと命名した。

ＣｏＢＭ　１１　ＰＡＤ　ｎＶＧＦａのｉ合成オリゴヌクレオチドは、上の極端 なＮ−末端を示す、天然のＶＧＦにおけるシグナル配列切断部位のすぐ下流に存 在する追加のＮ−末端残基をコードすることによって最適なシグナル配列切断部 位を付与するために、アルカリホスファターゼ変性シグナル配列とＶＧＦａの合 成遺伝子とを°連結するように企画された。そのｎＶＧＦａ配列は、天然のＶＧ Ｆ配列ＧＤＣ及びＧ？ＩＹＣＲＣの代わりに変性された配列ＧＴＣ及びＧＹＡＣ ＲＣを含み、そして、天然の配列ＰＮＴの上流での配列ＹＱＲで終結する。

この発現システムにおいては、大部分の分子に関して、シグナル配列が、Ｃ−末 端でｎＶＧＦａを有する、融合タンパク質を形成するｎＶＧＦａに結合したまま 存続する。

１．　Ｈｉｎｄ　−Ｐｖｕ　によ　′　れた０、５ＫｂのＢＭＰＡＤフーグメン 　の゛　リ プラスミドｐＢＭ　１１／ＰＡＤを期ｎｄｌｌＩ及びＰｖｕ　Ｉにより消化し、 そして０．５Ｋｂのフラグメントをゲル精製した。　ｌｌｉｎｄＩＩＩ部位は、 変性されたアルカリホスファターゼシグナル配列のＣ−末端で位置する。

２．８Ｈ１１ブースミドの５．２ＫｂのＰｖｕ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフーグメヱ上 ■Ｕ プラスミドｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＶＧＦａをＰｖｕ、Ｉ及びＢａｎ＋ＨＩに より消化し、そして５．２Ｋｂのプラスミドフラグメントをゲル精製した。

３、　１７０ｂのＮｃｏ　■　ブーント　−Ｂａ１１１）Ｉ　Ｉ　”　ＶＧＦａ ’　−プラスミドｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／νＧＦａをＮｃｏ　Ｔにより消化し 、そして５′オーバーハングを８１−ヌクレアーゼによる処理により除去した。

これは、ＶＧＦａ切断合成遺伝子の初めのコドンでプラント末端を生成せしめた 。次にそのＤＮＡをＢａｎ）ｌ　Ｉにより消化し、そして１７０ｂｐのＮｃｏｌ （プラント）　−Ｂａｎ＋ＨＴフラグメントをゲル精製した。

４、ｐＢＭ　１１／ＰＡＤ　／ｎＶＧＦａの連結及び単離、ｔ　＋Ｊゴヌクレオ チドＶＧＦ　１０５及び１０６、ｐＢＭ　１１／ＰＡＤの０．５Ｋｂの抛ｄＩ［ ［−ハ１１フラグメント、ｐＢＭ　１１の５．ＳｌｂのハッＩ−シυＩ（Ｉフラ グメント及び１７０ｂｐのＮｃｏｌ（プラント）結し、そしてその混合物を用い てコンピテントＨＢ　１０１を形質Ｌ　転換せしめた。その形質転換体をネオマ イシンに対して選択し、そして制限分析及びサンザーージデオキシ技法を用いて のヌクレオチド配列決定によりスクリーンした。　ｎＶＧＦａ遺伝子と読み枠を 合わして変性されたアルカリホスファターゼシグナル配列を含む正しい構成体を 単離した。

ＴＡＣＴＡＣＴＧＡＣＡ　ＴＣＣＣＧＧＣＴＡＴＣＣＧＴＣＴＧＴＧＣＧＧＣＣ ＣＧＧＡ　Ａ　ＧＧＣＧＡＣＧＧＣＴＡＣＴＧＣＴＴＤＩＰＡＩＲＬＣＧＰＥＧ ＤＧＹＣ２としてＡｓを　るアルカリホスファ　−ゼのシグナル配列り至握盟 変性されたアルカリホスファターゼシグナルペプチドをコードするヌクレオチド 配列の下流の融合体における合成血小板因子４遺伝子のヌクレオチド配列及びそ の対応するアミノ酸配列は、上記ｐＢＭ　１１／ＰＡＤ　／ｎＶＧＦａの調製法 と実質的に同じようにして調製された。但し、合成ＰＦ４遺伝子が、段階３にお ける合成ＶＧＦａ遺伝子の代わりに使用された。単離された構成体は次の通りで ある。予測される切断部位は、（１峠）により示される。

ＬＱＣＬＣＶＫＴＴＳＱＶＲＰ ＣＴＧ　ＣＡＡ　ＴＧＣＣＴＧ　ＴＧＣＧＴＴ　ＡＡＧ　ＡＣＴ　ＡＣＧ　ＴＣ Ｔ　ＣＡＧ　ＧＴＴ　ＡＧＡ　ＣＣＧＲＨＩＴＳＬＥＶＩＫＡＧＰＨ ＣＧＧ　ＣＡＴ　ＡＴＣＡＣＴ　ＡＧＣＣＴＣＧＡＧ　ＧＴＴ　ＡＴＣＡＡＡ　 ＧＣＧ　ＧＧＣＣＣＡ　ＣＡＣＣＰＴＡＱＬＩＡＴＬＫＮＧＲ ＴＧＴ　ＣＣＧ　ＡＣＴ　ＧＣＧ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＡＴＣＧＣＧ　ＡＣＴ　Ｃ ＴＧ　ＡＡＡ　ＡＡＣＧＧＣＣＧＴＫＩＣＬＤＬＱＡＰＬＹＫＫＩ ＡＡＡ　ＡＴＡ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　ＣＣＧ　 ＣＴＧ　ＴＡＣＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＴＣアルカ１ホスフ　−ゼシグ　ル配■　る 　ム　ンバク　としての・　のポ）ペプチドの Ａ、Ｊニレ２ＡＫ　ｎＶＧＦａ（アルカリホスファターゼシグナル１　＆（７） ＶＧＦＮ−１１？”　び　［びＧＹＡＣＲＣを１擾１匹Ｆａ）　（阪」製 プラスミドｐＢＭ　１１／ＰＡＤ　／ｎＶＧＦを不ヱビトロで突然変異誘発しく Ｍｏｒｉｎａｇａｑ＆、、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　（１９８４）２　：　６３ ６〜６４３：ｌ、シグナル配列における第２アミノ酸をコードするコドンを変更 し、すなわち天然の配列に見出される残基Ｌｙｓ　（Ｋ）のためのコドンにＡｓ ｐ（Ｄ）コドンを変えた。この突然変異誘発はまた、この発現カセットにおいて 、ＥＧＦ遺伝子は、アルカリホスファターゼシグナル配列を有する融合体の一部 である。

プラスミドｐＢＭ　１１／ＰＡＤ　／ＥＧＦを不ヱビトロで突然変異誘発せしめ 、シグナル配列における第２アミノ酸をコードするコドンを変更し、すなわちＡ ｓｐ（Ｄ）コドンを天然の配列に見出される残基Ｌｙｓ　（）りのためのコドン に変えた。この突然変異誘発はまた、Ｐｖｕ　１部位をシグナル配列中にも導入 した。

上ヱＳ」つ」１」製 １．　ブースミドのフラグメントの量 プラスミドｐ１３５−１は、プラスミドｐＤＲ５４０（Ｐｈａｒｎａｃｉａ）に 由来し、そして１ａｃＳＤの下流にｃｒｏＳＤ遺伝子及びＩＩＩ部位を含んだ。

ｐＤＲ５４０は、ｔｒｐ−１ａｃハイブリツドベクターを含む発現ベクターであ る。ｐ１３５−１をＭＩＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、そして細菌性アルカリ ホスファターゼにより処理した。

プラスミドｐＢＭ　１１／ＰＡＫ　／ＥＧＦをハラ■及びシ徂Ｈ１により消化し 、そしてアルカリホスファターゼシグナル配列及びヒトＥＧＦの一部をコードす る〜２３０ｂｐのフラグメントを単離した。

２、ＴａｃＰａｋｌ　びＴａｃＰａｋ　２オリゴヌクレオチドのセ　リ合成オリ ゴヌクレオチドＴａｃＰａｋ　１及びＴａｃＰａｋ　２を、ｐ１３５−１の、Ｂ ｆＩｒ部位と適合できるオーバーハング及びアルカリホスファターゼ／　ＥＧＦ 　Ｐｖｕ　ＩＩ　／　Ｂａｗｌ　ＩフラグメントにおけるＰｖｕ　Ｉｆ部位と適 合できるＰｖｕ　ＩＩオーバーハングにより企画した。そのオリゴヌクレオチド は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ−ｏｔｉｄ ｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒにより合成された。

尼■−町邊ＨＩにより消化されたｐ１３５−１．２３０ｂｐのＰ＾に／ＥＧＦフ ラグメント及びオリゴヌクレオチドＴａｃＰａｋ　１及びＴａｃＰａｋ　２を、 ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、それを用いてコンピテントＨＢ　１０１を形質 転換せしめ、そして正しい構成体をＤＮＡ配列決定により単離した。

ｔｒｐ−３５（１６ｂｐ）　Ｉａｃ−１０ＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧ　（ＴＴＧＡＣ Ａ）　ＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧ（ＴＡＴＡＡＴＧ）ｍＲＮＡ　５’　 １ａｃＩ結合部位　１　ａｃｓＤＴＧＴＧＧ／ＡＡＴＴＧＴＧ　ＡＧＣＧＧＡＴ ＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣ（ＡＧＧＡ）　ＡＡＣＡＧＧＡＴＣＡＣＴＡ−令　 む　カセ・トを　いて、アルカリホスフ　−ゼシグ　ル配　する１人タンパク　 としての・　のボッペプチドの Ａ、ＴＣＰｔ　ＥＧＦ（ｔｒ−３５１６ｂ　Ｌａｃ−１０１ａｃＳＤ　１ｌｂＡ ＴＧ　アルカリホスファ　−ゼシグナル　ヒトＥＧＦ　−−ＮＥＯの置割 このプラスミドは、ｔａｃプロモーター成分を有し、そしてアルカリホスファタ ーゼシグナル配列の後ろに、ヒトＥＧＦを発現するためにｃｒｏＳＤを利用する ように企画される。それは、ネオマイシン耐性遺伝子を有するｐＢＲ３２２バッ クグラウンフーグメントのｇ２ ＴａｃＰａｋ　／　ＥＧＦをＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、そして次に、ＤＮＡ ポリマラーゼのフレノウフラグメントにより処理し、プラント末端を製造した。

次にそのＤＮＡをＢａｍＨｌにより消化し、そしてｔａｃプロモーター成分、及 びアルカリホスファターゼシグナル配列及びヒトＥＧＦのためのコード領域を含 む４２０ｂｐのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により単離した。

２、　８Ｍ１６ｔ　ＮＤＰ　ＶＧＦａの２．８にｂのＥｃｏＲｌ　プーント　− Ｂａｌｌ１ｌ　Ｉフラグメントの量 ｐＢＭ１６ｔ／ＮＤＰ　／ＶＧＦａをＥｃｏＲｌにより消化し、そして次にフレ ノウフラグメントにより処理し、プラント末端化した。次にそのＤ　Ｎ　Ａ　＠ 　ＢａｒａＨＩにより消化し、そして２．８Ｋｂのフラグメントを単離した。こ のＤＮＡフラグメントは、ｐＢＲ３２２起点、除去されるそのＮｃｏ　１部位を 有するネオマイシン耐性遺伝子及びＢａｎ＋Ｈ１部位の下流での遺伝子３２様転 写ターミネータ−をｐＢＭ１６ｔ／　ＮＤＰ　／　ＶＧＦａの２．８ＫｂのＥｃ ｏＲＩ　（プラント）−ＢａａｔＨＩフラグメントを、ＴａｃＰａｋ／　ＥＧＦ の４２０ｂｐのＨｉｎｄｌＩ［（プラント）−町υＨＩフラグメントに連結し、 そしてその得られたＤＮＡを用いてコンピテントＪＭ　１０９（ｌａｃＩｑ）を 形質転換せしめた。

正しい構成体を、そのネオマイシン耐性により及びＤＮＡ配列決定により単離し た。

ｔｒｐ−３５（１６ｂｐ）　１ａｃ−１０ＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧ　（ＴＴＧＡＣ Ａ）　ＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧ（ＴＡＴＡＡＴＧ）ｍＲＮＡ　５’　 １ａｃｌ結合部位　１ａｃｓＤＴＧＴＧＧ／ＡＡＴＴＧＴＧ　ＡＧＣＧＧＡＴＡ ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣ（ＡＧＧＡ）　ＡＡＣＡＧＧＡＴＣＡＣＴＡ翻訳　終 結 ＣＴＡ　Ａ　ＴＴＧＧ　ＧＧ　ＡＣＣＣＴＡ　Ｇ　Ａ　ＧＧＴＣＣＣＣＴＴＴＴ 　ＴＴＡ　ＴＴＴＴＡ　Ａ　Ａ　ＡＣＧ　Ａ　ＴＣＢ、ＴＣＰｔ　ｎＶＧＦａ（ ｔｒ−３５１６ｂ　１ａｃ−１０１ａｃｓＤｃｒｏＳＤ　ｌｌｂ　ＡＴＧ　アル カリホスファターゼシグナル　配［びＧＹＡＣＲＣを　するｎ　−ｒＶＧＦａ　 ８終潴二Ｎ並連ｌｊ製 このプラスミドは、　ｔａｃプロモーター成分を有し、そしてアルカリホスファ ターゼシグナル配列の下流にＮ−末端延長部を有する変性されたＶＧＦ遺伝子を 発現するためにｃｒｏＳＤを使用する。このプラスミドは、ネオマイシン耐性遺 伝子を有するｐＢＲ３２２バックグラウンドを有する。

１、ＢＭ　１１　ＰＡＫ　ｎＶＧＦａの３５０ｂのＰｖｕ−ＢａｍＨフーｙｉｙ 上皇握製 プラスミドｐＢＭ　１１／ＰＡＫ　／ｎＶＧＦａをＰｖｕ　Ｉ及びＢａｗｌ　Ｉ により消化し、そして３５０ｂｐのフラグメントをゲル電気泳動により単離した 。このフラグメントは、アルカリホスファターゼシグナル配列及びｎＶＧＰａ遺 伝子のほとんどを含む。

２、ＴＣＰｔ　ＥＧＦの２．８ＫｂのＰｖｕ　Ｉ　−Ｂａｎ＋）ｌ　ｌフラグメ ント■握１ プラスミドｐＴＣＰｔ　／ＥＧＦをＰｖｕ　Ｉ及び膓υＨ１により消化し、そし て２．８Ｋｂのフラグメントをゲル電気泳動により単離した。

３、ＴＣＰｔ　ｎＶＧＦａの゛　び 前記２．８Ｋｂのフラグメント及び３５０ｂｐのフラグメントを、ＤＮＡリガー ゼを用いて連結し、そしてそのＤＮＡを用いてコンピテントＪＭ　１０９（ｌａ ｃｌｑ）を形質転換せしめた。正しい構成体を、制限分析を用いて単離した。

ｔｒｐ−３５（１６ｂｐ）　１ａｃ−１０ＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧ　（ＴＴＧＡＣ Ａ）　ＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧ（ＴＡＴＡＡＴＧ）ｍＲＮＡ　５’　 １ａｃｌ結合部位　１ａｃＳＤＴＧＴＧＧ／ＡＡＴＴＧＴＧ　ＡＧＣＧＧＡＴＡ ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣ（ＡＧＧＡ）　ＡＡＣＡＧＧＡＴＣＡＣＴＡＴＣＴＣ ＣＧＧＡＡＡＴＣＡＣＴＡＡＣＧＣＴＡＣＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＣＧＧＣＴＡ ＴＣＣＧＴＣＴＧＴＧＣＧＧＣＣＳＰＥＩＴＮＡＴＴＤＩＰＡＩＲＬＣＧＰＡＴ Ｇ　アルカｉホスフ　−ゼシグナル　ヒトＥＧＦ　ＩＩ−ＮＥＯ）のｉ このプラスミドは、ｔａｃプロモーター成分を有し、そしてアルカリホスファタ ーゼシグナル配列の後ろにヒトＥＧＦをそれは、ネオマイシン耐性遺伝子を有す るｐＢＲ３２２バックグラウンドを有する。

１、ＴＮＰｔの２．８ＫｂのＰｖｕ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフラグメントのｆｌ＋プ ラスミドｐＴＮＰｔをＰｖｕ　Ｔ及びＢａｎ＋ＨＩにより消化し、そしてその２ ．８Ｋｂのフラグメントをゲル電気泳動により単離した。

プラスミドｐＢＭ　１１／ＰＩ　／ＥＧＦをＰｖｕ　ｌ及びＢａｍＨＩにより消 化し、そして３００ｂｐのフラグメントを単離した。

３、ＴＮＰｔ　ＥＧＦの゛　び 前記２．８Ｋｂのフラグメント及び３００ｂｐのフラグメントを、ＤＮＡリガー ゼを用いて連結し、そしてそのＤＮＡを用いてコンピテントＪＭ　１０９（Ｌａ ｅＩｑ）を形質転換せしめた。正しい構成体を制限分析及びＤＮＡ配列決定によ り選択した。

ＧＡＴＡＣＧＡＡＡＣＧＡＡＧＣＡＴＴＧＧＣＣＧＴＡＡＧＴＧＣＧＡＴＴＣＣ ＧＧＡＴＴＡＧＣＴＧＣＣＡＡＴＧＴＧＣＣＡＡＴＣＧＣＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴ ＣＧＴＴＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＡＣＴＧＣＣＡＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴ ＡＡえポリペプチドの Ａ、ＰＬジブロモ　−びｔｓ　Ｃ１リプレッサーを　いて聞−のベクター　に産 　される− ｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／増殖因子プラスミドを含む旦、ユ１Ｂ（ＨＢＩＯＩ） を、３０℃でシリアブイヨン中で増殖した。その培養物の密度を５５０ｎｍで測 定し、そしてその密度が０．７〜０，９の吸光度に達した場合、増殖因子融合タ ンパク質の合成が温度を４２°Ｃに高めることによって誘発された。その培養物 をこの温度で５〜２０時間イ時間インキトベートに細菌を遠心分離により単離し 、そして使用まで一７０°Ｃで凍結した。

組換えタンパク質の単離のためには、細胞を、０．０５ＭのＮａＨｚＰＯａ、ｐ Ｈ７，２＋　ｏ、　５　ＭのＮａｃｆ　、　０．０１ＭのＥＤＴＡを含む緩衝液 中で融解した。１５０ｄの緩衝液を、５０ｇの細菌からの調製のために使用した 。細胞を、６０ワツトの電力で１／４−インチのプローブ、５０％パルスを用い て氷上で１５分間、音波処理することによって破壊した。細胞の破壊の後、不溶 性タンパク質を、ＧＳＡローターで９０分間、１２．　ＯＯＯｒｐｍで遠心分離 することによって集めた。不溶性タンパク質を含むベレットを、６Ｍのグアニジ ン塩酸塩５０１ｄ中に再懸濁した。不溶性物質を、Ｂｅｃｋｍａｎタイプ３０の 超遠心機ローターを用いて２５．ＯＯＯｒｐｍで２時間、遠心分離することによ って集めた。その上滑液を集め、そしてさらに使用するまで一２０℃で貯蔵した 。

融合タンパク質の精製を、ＩＭのグアニジン塩酸塩により平衡化された５ｅｐｈ ａｃｒｙｌ　５３００又はＦｒａｃｔｕｇｅｌ　ＨＷ−５５カラムのいづれかで 行なった。融合タンパク質を含む画分を、１５％ポリアクリルアミド−尿素ゲル 上で決定される場合、合成遺伝子によりコードされるポリペプチドの分子量と一 致する分子量を有するポリペプチドを含む画分として同定した。

組換え増殖因子の活性形を得るために、融合タンパク質を、１Ｍのグアニジン塩 酸塩、１．２５ａ＋Ｍの還元されたグルタチオン及び０．２５ｍＭの酸化された グルタチオンを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｆ緩衝液（ｐＨ８，７）中におい て４０°Ｃで３〜１０日間インキュベートすることによって再生せしめた。増殖 因子の生物学的活性を、上記（例１．Ｃを参照のこと）のようにして競争受容体 結合アッセイによりモニターした。最大レベルの活性が得られる場合、そのタン パク質を蒸留水に対して透析し、そして凍結乾燥せしめた。

リーダー配列を除去したい場合、タンパク質を、７０％蟻酸中に再懸濁し、そし て４０℃で３日間インキュベートすることにより又は１００倍モル過剰の臭化シ アン中において室温で一晩インキユベートすることにより切断した。その切断さ れた生成物を、蒸留水に対して透析し、そして凍結乾燥せしめた。

組換え増殖因子をさらに精製するために、その増殖因子を４０％アセトニトリル 、０．１％ＴＦＡ中に再懸濁し、そしてＢｉｏＲａｄ　ＴＳＫ−２５０カラムを 用いてＨＰＬＣにより精製した。増殖因子を含む両分をプールし、そして逆相Ｈ ＰＬＣ，ＷａｔｅｒｓμＢｏｎｄａ−ｐａｋ　Ｃ−１８又はＲａ１ｎｉｎ　Ｄｙ ｎａｍａｘ　Ｃ−８を用いてさらに精製した。

溶出液は、０．１％ＴＦＡを含む２０〜４０％アセトニトリルの直線グラジェン トであった。受容体結合活性を含む両分をプールし、凍結乾燥せしめ、そして使 用するまで一２０″Ｃで貯蔵した。

変性された組換えヒトＴＧＦが、プラスミドｐＢＭ１１／Ｎ／ＴＧＦから産生さ れ、そしてＮ−末端でＮ−遺伝子の３３個のアミノ酸及び天然のヒト配列ＱＥＤ Ｋの代わりに配列変性体ＱＥＥＫを変性された組換えＶＧＦを、ＶＧＦのＮ−末 端配列及び天然のＶＧＦ配列ＧＤＣ及びＧＭＹＣＲＣの代わりに変性された配列 ＧＴＣ及びＧＹＡＣＲＣを含むプラスミドｐＢＭ　１１／ＰＡＤ　／ｎＶＧＦａ から製造した。ｎＶＧＦＡフラグメントは、Ｎ−末端で変性されたアルカリホス ファターゼシグナル配列を有する融合タンパク質として発現され、そしてＣ−末 端での配列ＹＱＲで切断された。

ｂ、−昶り乙１ハ 変性された組換えＶＧＦを、旧ＰＡＩＲ配列で始まり、そしてＶＧＦ中（７）　 ＹＫＱＲ配列で終結するプラスミドｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＶＧＦａから製造 した。それは、天然のＶＧＦ配列ＧＤＣ及びＧＭＹＣＲＣの代わりに変性された 配列ＧＴＣ及びＧＹＡＣＲＣを有する。ＶＧＦａフラグメントが、Ｎ−末端でＮ −遺伝子の３２個のアミノ酸及び酸不安定性ジペプチド、アスパラギン酸−プロ リンを有する融合タンパク質として発現された。

Ｃ１亘ハ ＶＧＦフラグメントを上記２．ｂに記載のようにして調製し、そして酸処理によ り融合タンパク質から切断した後、ＨＰＬＣによりさらに精製した。

ｄ、−昶りう１ハ 変性された組換えＶＧＦを、ＤＩＰＡＩＲ配列で始まり、そしてＶＧＦのＹＫＱ Ｒ配列で終結し、そして天然のνＧＦ配列ＧＤＣ及びＧＭＹＣＲＣの代わりに変 性された配列ＧＴＣ及びＧＹＡＣＶＣを有するプラスミドｐＢＭ　１１／ＮＤＰ 　／νＧＦ＾から製造した。そのＶＧＦＡフラグメントは、Ｎ−末端でＮ−遺伝 子の３２個のアミノ酸及び酸不安定性ジペプチド、アスパラギン酸−プロリンを 有する融合タンパク質として発現された。

変性された組換えＴＴＶがｐＢＭ　１１　／　Ｎ　／　ＴＴＶがら製造され、そ して遺伝子のアミノ末端の２７３にヒトＴＧＦのアミノ酸配列を含んだ、但し、 天然のヒト配列ＱＥＤＫから変更された配列ＱＥＥＫを除く。カルボキシ末端は 、ＶＧＦのアミノ酸配列に由来し、そして天然の配列ＰＮＴの上流で配列ＹＱＲ で終結した。ＴＴＶフラグメントは、Ｎ−末端でＮ−遺伝子の３３個のアミノ酸 を有する融合タンパク質として発現された。

ｂ、Ｎ匣／Ｈし 組換えＴＴＶを、プラスミドルＢ門１１／　Ｎ　／ＴＴＶがら製造し、そして（ ａ）に記載のようにして変性した（但し、ＴＴＶフラグメントは、Ｎ−末端でＮ −遺伝子の３２個のアミノ酸及び酸不安定性ジペプチド、アスパラギン酸−プロ リンを有する融合タンパク質として発現された）。

Ｃ１−籾Ｌ／Ｍ■− 変性された組換えＶＴＶが、プラスミドｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＶＴＶから製 造され、そして天然の配列ＱＥＤＫに取って代わるアミノ酸配列１１１ＥＥＫを 有する中間ドメインにヒ１−ＴＧＦのアミノ酸配列を含んだ。Ｎ−末端及びＣ− 末端ドメインは、切断されたＶＧＦ配列に由来し、そして配列ＤＩＰＡＩＲで始 まり、そして配列ＹＱＲで終結する。ＶＴＶフラグメントは、Ｎ−末端でＮ−遺 伝子の３２個のアミノ酸及び酸不安定性ジペプチド、アスパラギン酸−プロリン を有する融合タンパク質として発現された。

ｄ、コ旦し６呈［ 変性された組換えＶＴＶがブラスミ）’ｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＴＶＶから製 造され、そして遺伝子のＮ−末端ドメインにヒトＴＧＦのアミノ酸配列を含んだ 。中間及びＣ−末端ドメインは、切断されたＶＧＦ配列に由来し、そして配列Ｙ ＱＲで終結した。さらに、その合成遺伝子は、ＧＭＹＣＲＣに代わる変性配列Ｇ ＹＡＣＶＣを有する。ＴＶＶフラグメントは、Ｎ−末端でＮ−遺伝子の３２個の アミノ酸及び酸不安定性ジペプチド、アスパラギン酸−プロリンを有する融合タ ンパク質として発現された。

ｔａｃ又はｌａｃプロモーターを含む発現カセットを含む細菌宿主を、ＬＢブイ ヨン又は化学的に定義された培地、たとえばチアミン及びグルコースにより補充 されたＭ９培地のいづれか中において、３０〜３７°ＣでＡ６００での光学密度 が０．２〜０．８になるように増殖せしめた。適切な抗生物質が、発現カセット を含む宿主を選択するために培養培地中に含まれた。細菌培養物が、１００〜１ ０００ｍＭ濃度のＴＰＴＧにより誘発され、そして３０″Ｃで１６〜２４時間、 増殖せしめられた。ｌａｃ　Ｉ遺伝子を欠く発現カセ７）に関しては、細菌宿主 が１ａｃｌｑ遺伝子を有するＦ−因子、たとえばＪＭ　１０９　、　ＸＬ　１　 、　ＪＭ　１０３、等を担持した。

たＩａｃ　Ｉ遺伝子を担持する発現カセットに関しては、細菌宿主の例は）ＩＢ 　１０１　、　ＤＨ１、ＤＨ５等である。細菌宿主が機能的なｌａｃオペロン（ ｌａｃ”　）を有する場合、発現カセットは、１％ラクトースにより誘発され得 る。誘発期間の後、増殖因子が、培地又は細菌ペレットのいづれかから単離され る。

１、ｌ匡り 発現カセットＴａｃＰａｋ　／　ＥＧＦ及びｐＴｃＣＰ　ｔ　／　ＥＧＦから製 造されたヒトＥＧＦも活性形で培地から単離し、そしてアルカリホスファターゼ シグナル配列を除去した。約８５％の活性ＥＧＦが培地中に見出され、そして残 りは細菌ペレットに関連した。

これらの発現カセットは、４■／２の活性ＥＧＦを生成した。

細胞を遠心分離により培地から除き、そしてその培地をＡｍ１ｃｏｎ　５Ｙ３０ の３０．ＯＯＯＭｒカセットオフ螺施フィルターに通し、そして次にＱ−セファ ロースカラムに通し、そして高度に精製されたヒトＥＧＦを０〜０．５ＭのＮａ ｃ　ｌグラジェントで２０１のＮａＰＯａ　（ｐＨ７）中に溶出した。他方、増 殖因子は、浸透ショック法又は音波処理により細胞ベレットから単離され、そし て実質的に同じ方法により精製した。

２．１」レラ匹上し Ｕ換えｎＶＧＦａを、発現カセットｐＴＣＰｔ　／ｎＶＧＦａから生成した。ｎ ＶＧＦａが音波処理により細胞ベレットから単離され、そして合計の細菌タンパ ク質のおよそ４０％を構成することが示された。

Ｃ１血」」ｄ１五土 組換え血小板因子４を、増殖因子について上記に記載されるようにして単離した 。

１、Ｎ／江土 組換え血小板因子４が、Ｎ−タンパク質の３３個のＮ−末端アミノ酸を有する融 合体としてｐＢＭ　１１／Ｎ／ＰＦ４から生成さ組換え血小板因子４が、Ｎ−タ ンパク質の３３個のＮ−末端アミノ酸及びアスパラギン酸−プロリン切断部位を 有する融合体としてｐＢＭ　１１／ＮＤＰ　／ＰＦ４から生成された。蟻酸によ る前記融合タンパク質の処理は、成熟ＰＦ４を開放した。

組換えＯｎｃＭ融合タンパク質を、次のようにしてＥ、２＋、Ｉから精製した： Ｅ、＝ｒ＋Ｊの培養物５００戚からの細胞ベレットをＰＮＥ緩衝液（０，５Ｍの ＮａＣ１、１，０ｍＭのＥＤＴＡ、　５０ａ＋Ｍのリン酸ナトリウム）４０ｄ中 に懸濁し、そして音波処理により溶解した。凝集されたタンパク質を、次のよう に緩衝化された８Ｍの尿素溶液１２０ｄによりそれぞれ１６時間、連続的に抽出 した：溶液１　）　２０１ＭのＴｒｉｓ　、　ｐＨ５；溶液２　）　２０ｍＭの Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ８；溶液３　）　５０ｍＭのＴｒｉｓ　、　ｐＨ１１゜最っ とも凝集されたタンパク質を溶液１及び２により溶解し、そして組換えＯｎｃｏ Ｍは、溶液３よる処理まで、不溶性のまま維持された。

ｂ、凹に分１ｊｕ１生 溶液３抽出物を、再生緩衝液（ＩＭのグアニジン塩酸塩、１．２ｓ＋Ｍの酸化さ れたグルタチオニン、０．２ｍＭの還元されたグルタチオニン、２抛ＨのＴｒｉ ｓ　Ｈｃｊ！　、　ｐＨ８，０〜９．０　）に対して２４時間透析した。　ｐＨ の８．０以下への低下は、生物学的に活性するＯｎｃＭの収量の１００倍の低下 をもたらした。再生の後、タンパク質を、増殖阻害アッセイ（例１．Ｅ）での試 験の前、ＩＮの酢酸に対して透析した。

２、ＰＡＤ　オンコス　チンＭ ＰＡＤ　１０ｎｃｏＭを、発現カセットｐＢＭ　１１／ＰＡＤ　１０ｎｃｏＭか ら生成した。培地が活性０ｎｃｏＨについて試験され、そして１１当たり２０〜 ５００ｎを含むことが示された。

別−Δ− ・　に　れる　え　の　μ　、Ｓ 二 Ａ、旦旦ｌｉ蔓生延金 このアッセイは、ＥＧＦのその受容体への結合を阻害するその能力により測定さ れるように、ＥＧＦ受容体に結合する分子の能力を決定する。単離されたすべて の増殖因子及びキメラ性増殖因子は、変性されていても又は切断されていてもい づれにせよ、ＥＧＦ受容体結合阻害アッセイにおいて活性的であった。これらの 結果の要約は、下記に示される：天然のマウスＥＧＦのための結合阻害曲線及び 細菌に発現される組換えキメラ性増殖因子Ｎ／ＴＴＶ（λＮ−遺伝子の３２個の Ｎ−末端アミノ酸及び変性され、そして切断されたＴＧＦ／ＶＧＦハイブリッド のペプチド融合体）の比較は、結合活性に差異。

が存在しないことを示唆した。

Ｂ、ヱヱ上乏王ヱ孟二 いくつかの精製された増殖因子の活性を試験し、そしてすべての場合で決定され た活性は、ＥＧＦにより引き起こされる効果に匹敵した。試験された化合物は、 下記に示されたようなものである。

表 のマイトジェン２ ペプチド　ヱ４＋’；ｓし」牡Ｖ ＴＴＶ−変性され切断されたキメラ性　は　い融合体 Ｎ／ＴＴシー変性され切断された　は　いキメラ性融合体 ′″　３Ｈ−チミジン　は＋２’ｌ−１ｄｌｌの　によ　゛　れ玉】１Ｆ。

ｃ、ｍ顕パ１面 １、　生澗とｍ洟 中間−皮膚損傷に対する合成ＴＧＦ、　ＥＧＦ及びＶＧＦ並びに組換え増殖因子 の効果を、例ＶＥＩに記載のようにして評価した。

治癒した元の熱傷部分の％を、コンピューター助力の遠隔測定法により測定し、 そして創傷の上皮形成率を測定した。未処理創傷は約１５％の再上皮形成率を示 した。シルバデンのみ又はシルバデン及びＥＧＦによる処理は、およそ５０％の 上皮形成率をもたらし、そして合成ＴＧＦ又は天然のＶＧＦによる処理は、およ そ９０％の上皮形成率をもたらした。再上皮形成を促進するＥＧＦの最適濃度は １〜１０ｘｉｒ／ｌｄであり、そして合成ＴＧＦ及び天然のＶＧＦは、０．１ｔ ｒｇ／ｄで最大の応答を生ぜしめた。

上記実験に類似する実験が、ＴＧＦ変性され、切断された形（７）ＶＧＦ（ＶＧ Ｆａ）　、又はＴＧＦ及びＶＧＦ　（ＴＴＶ）の変性され、切断されたキメラ性 融合体（これらすべては、細菌中において組換え技法により生成される）の創傷 治癒における効果を試験するために行なわれた。これらの組換え増殖因子及びハ イブリッド増殖因子は、合成ＴＧＦ又は天然のＶＧＦと同じ程度に創傷の治癒を 促進せしめ、そして０．１ｎ／ｄで最適濃度を示した。

２．６− 変性され切断されたＶＧＦａを、供与体移植片モデルにおける創傷の治癒を促進 するその能力について検定した。その処理法は、上記（例Ｉを参照のこと）と同 じであり、そしてシルバッフ２０ｇ中、５　ｔｚｇ　／　ｘｔｌのＶＧＦａ　Ｉ 　Ｒ１を用いた。毎日、写真が取られた。その結果の要約は、下記に提供される ：の汁　、に・　る　えＶＧＦａの六 ＊　シルバデンがビークルである 変性され切断されたＶＧＦａは、対照のキャリヤーと比べて、創傷の治癒を促進 した。ＰＯＤ８での写真（提供されていない）は、食塩水とＶＧＦａとの実質的 な差異を示した。

■−Δ」− に　された　え　７Ｘ　４の　声 カ益性 種々の発現カセットを用いて生成された組換え因子４の収率は、合計細胞タンパ ク質の約２％〜約２０％であった。これらの結果は下記に要約される： 々の　システムにおしるＰＦ　４の ム言タンパク　の％ ｐＢＭ　１１　／Ｎ遺伝子／ＰＦ　４　２０％ｐＢＭ　１１　／Ｎ遺伝子／ＤＰ ／ＰＦ　４　２０％ｐＢＭ　１１　／ＰＡＤ　／ＰＦ　４　１５％ｐＢＭ　１１ 　／ＰＦ　４　２％ Ａ、−仄Σ込ｊ」しく社）ｌ電 最っとも高い活性が、プラスミドｐＢＭ　１１／　Ｎ遺伝子／ＰＦ　４からの融 合タンパク質により見出された。Ａ３４９細胞の最大阻害の５０％が、０．６７ ｇ／ウェルにより得られた。

Ｂ、ヌードマウスにおける　の　の 雄のヌードマウスに、例ＩＣに記載されるように、血小板因子４又はリン酸緩衝 溶液を２〜３日間隔で注射した。下に示されるように、因子４は有意に腫瘍の増 殖を阻害した。

第に表 ヌードマウスにおしる　の　に・　る　えｌ　云ハ　４ｗ人タンパク　の六 劃−■」」− において　れた　えオンコス　チンの ま土１り壇乱１ 培養物（５（ｌｄ）を記載のようにして増殖し、そして誘発せしめた。培養物を ベレット化し、そしてその細胞ペレットを６Ｍのグアニジン塩酸塩中に溶解した 。不溶性タンパク質はこの点で除去されなかった。　５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析のた めのサンプルを、再生しないでＩＮの酢酸に対して直接透析した。

約６贋の合計細菌タンパク質から成るアリコートを、１０〜２０％のグラジェン トゲル（５％積重ねゲル）上で５ＯＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ゲルを、クー マシーブリリアントプルーにより染色し、脱色し、そして乾燥せしめた。ＮＤＰ −ＯｎｃＭ融合タンパク質の見掛の分子量Ｍ工が、標準のタンパク質の分子量の 移動性と比べることによって３２，０００であることがわかった。

Ｂ、えオンコス　チンＭ　Ｎ−゛　云　１ム　ンパク■崖及■査量且 天然のオンコスタチンＭの組換え体の存在下での細胞の増殖を、未処理サンプル 中の増殖と比較し、そして最大（未処理）増殖の百分率として表わした。サンプ ルを二重反復試験又は三重反復試験でアッセイし、そして一般的にその変動お互 い２０％以下であった。オンコスタチンＭの１つの増殖阻害アッセイ単位を、７ ２時間のアッセイの間、３〜４Ｘ１０’で接種されたＡ３７５細胞の増殖の５０ ％阻害を引き起こすのに必要とされるタンパク質の量として定義した。半分の最 大増殖阻害のために必要とされる濃度を、次のように形質転換の後の増殖データ から推定することによって測定した：ある場合、修飾された増殖アッセイが使用 され、ここで標的細胞数及び血清濃度が減じられた。細胞を、５％ＦＢＳを含む ＤＭＥＭ中に５００個の細胞／ウェルの濃度で接種され、同じ媒体中、オンコス タチンＭにより処理し、そして未処理細胞が集密的になるまで（細胞系に依存し て、一般的に６〜１０日間）、３７℃でインキュベートした０次に単層を染色し 、そして上記のように処理した。

えオンコス　チンＭの　ゞ ２４０　１２．２　１６０　１５．１ ４８　１９．５　３２　２２．２ ９．６　３０．４　６．４　４１．５ １．９　７０．０　１．３　６７．３ ０．３８　７７．８　０．２６　８２．３０．０８　８１．５　０．０５　７６ ．０８６．４　７２．４ ８５．９　７７．５ ０　１００．０　０　１００．０ １　：　ｐＢＭ１１／ＮＤＰ　１０ｎｃｏＭ発現カセットを用いて調整され一一 大工−−一一一一−−一一一−一一一−−−−−−−Ｃ９えオンコス　チンＷＬ 　Ｎ−゛　云　１人　ンバク■受査生延金盈二 Ａ、４．ヒト肺癌細胞を、多量のラベルされていないオンコスタチンＭの存在下 で１２５１−オンコスタチンＭと共にインキュベートした。少量（〜３）の添加 された＋５１−オンコスタチンＭが、ラベルされていないオンコスタチンＭの存 在下でこれらの細胞に結合した。結合がラベルされていない天然の又は組換えオ ンコスタチンＭの存在下で測定される場合、＋ｚｓＩ−オンコスタチンの結合の 濃度依存性阻害が観察された（〜３００ｐＭで半分の最大効果）。１２Ｓｉ−オ ンコスタチンＭの合計結合が、試験されるラベルされていないオンコスタチンＭ の最っとも高い濃度で約９０％阻害された。天然及び組換えオンコスタチンＭは 、′ｔ５■−オンコスタチンＭチン合を阻害するそれらの能力においてお互い異 ならなかった。その結果は、下記に示される。

糞 １６．０００　１４　２７．０００　１２３．２００　２７　５．４００　２０ ６４０　４８　１．０８０　４０ ２６　８０　４３．２　８１ ５．１　９２　８．６　８８ １　９０　１．７　８９ １　：　ｐＢＭ１１／ＮＤＰ　１０ｎｃｏＭ発現カセットを用いて調整され一一 犬エーーーーーーーーーーーーー−−−一一一−−−一本発明の組成物は、原核 生物細胞中でのポリペプチドの効果的な発現のための発現カセットを含んで成る 。その発現カセットは、発現生成物の高められた安定性を付与し、そして宿主細 胞の増殖培地中に分泌される成熟した折りたたまれたポリペプチドを得ることに よって多量のポリペプチドの生成に使用される。

本明細書に言及されたすべての出版物及び特許出願は、本発明が関与する当業者 の熟練のレベルの表示である。すべての出版物及び特許出願は引例により本明細 書中に組込まれる。

本発明は今、十分に記載されたが、これによってこの発明の範囲を限定するもの ではない。

国際調査報告 ｎ１１Ｍ１１６″ｌ　Ａ１１１＋ＣＭ１１６°９°ｐＣＴ／ＵＳ８ｇ１０３８７ ２

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．下記式： Ｐ−Ｓ．Ｄ．−ｍｅｔ−Ｇ１ 〔式中、Ｐはプロモーター配列を含み；Ｓ．Ｄ．はシャイン−ダルガルノ配列を 含み；ｍｅｔは開始メチオニンのためのコドンを含み；Ｇ１は対象のポリペプチ ドをコードする第１ＤＮＡ配列を含み、ここで対象のポリペプチドをコードする ヌクレオチドが前記Ｓ．Ｄ．に関連する天然のヌクレオチド配列に近づくように 、Ｎ−末端アミノ酸のためのコドンが、コドン分解により変性されている〕で表 わされる発現カセット。
2. ２．前記Ｓ．Ｄ．がＮ−遺伝子のシャイン−ダルガルノ配列である請求の範囲第 １項記載の発現カセット。
3. ３．前記Ｓ．Ｄ．及び前記ｍｅｔを、約５〜９個のヌクレオチドにより分離する 請求の範囲第２項記載の発現カセット。
4. ４．下記式： Ｐ−Ｓ．Ｄ．−ｍｅｔ−Ｌ−Ｇ 〔式中、Ｐはプロモーター配列を含み；Ｓ．Ｄ．はシャイン−ダルガルノ配列を 含み；ｍｅｔは開始メチオニンのためのコドンを含み；Ｌがリーダー配列をコー ドする第１ＤＮＡ配列を含み、ここで前記リーダー配列をコードするヌクレオチ ドが前記Ｓ．Ｄ．に関連する天然のヌクレオチド配列に近づくように、アミノ酸 のためのコドンがコドン分解により変性されていて；そして Ｇは対象のポリペプチドをコードする第２ＤＮＡ配列を含む〕で表わされる発現 カセット。
5. ５．前記第１ＤＮＡ配列の初めの約７〜３０個のコドンが変性されたコドンを含 んで成る請求の範囲第４項記載の発現カセット。
6. ６．前記Ｓ．Ｄ．がＮ−遺伝子のシャイン−ダルガルノ配列を含んで成り、そし て前記リーダー配列がアルカリホスファターゼシグナル配列を含んで成る請求の 範囲第５項記載の発現カセット。
7. ７．前記リーダー配列が高度に発現された遺伝子からのＮ−末端アミノ酸配列； 疎水性アミノ酸配列；又は親水性アミノ酸配列である請求の範囲第４項記載の発 現カセット。
8. ８．前記高度に発現された遺伝子が、バクテリオファージλＮ−タンパク質遺伝 子又はＣｒｏ遺伝子、又は細菌性β−ガラクトシダーゼ遺伝子である請求の範囲 第７項記載の発現カセット。
9. ９．前記疎水性アミノ酸配列が細菌性アルカリホスファターゼシグナル配列であ る請求の範囲第７項記載の発現カセット。
10. １０．前記親水性アミノ酸配列が、アンフィレグリンからの約４１個のＮ−末端 アミノ酸である請求の範囲第７項記載の発現カセット。
11. １１．下記式： Ｐ−Ｓ．Ｄ．−ｍｅｔ−Ｌ−Ｇ 〔式中、ＰはバクテリオファージλＰＬプロモータ；細菌性１ａｃプロモーター ；又は細菌性ｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターを含み； Ｓ．Ｄ．はシャイン−ダルガルノ配列を含み；ｍｅｔは開始メチオニンのための コドンを含み；Ｌはリーダー配列をコードする第１ＤＮＡ配列を含み；そして Ｇは対象のポリペプチドをコードする第２ＤＮＡ配列を含む〕で表わされる発現 カセット。
12. １２．前記プロモーターがさらに調節配列を含んで成る請求の範囲第１１項記載 の発現カセット。
13. １３．前記調節配列がバクテリオファージλＯＬオペレーター；又は細菌性１ａ ｃオペレーターを含んで成る請求の範囲第１２項記載の発現カセット。
14. １４．前記Ｓ．Ｄ．がＮ−遺伝子又はＣｒｏ遺伝子のリボソーム結合部位を含ん で成る請求の範囲第１１項記載の発現カセット。
15. １５．前記リーダー配列がバクテリオファージλＮ−遺伝子又はＣｒｏ遺伝子； 又は細菌性アルカリホスファターゼ遺伝子からの約８〜約３５個のＮ−末端アミ ノ酸を含んで成る請求の範囲第１１項記載の発現カセット。
16. １６．前記第１ＤＮＡ配列と前記第２ＤＮＡ配列との間に読み枠を整合して結合 される少なくとも１つのコドンをさらに含んで成る請求の範囲第１１項記載の発 現カセット。
17. １７．前記コドンが化学的切断部位又は酵素的切断部位をコードする請求の範囲 第１６項記載の発現カセット。
18. １８．前記化学的切断部位がアスパラギン酸−プロリンである請求の範囲第１７ 項記載の発現カセット。
19. １９．下記式： Ｐ−Ｓ．Ｄ．−ｍｅｔ−Ｌ−Ｇ 〔式中、Ｐは−３５及び−１０の調節配列を有するプロモーターを含み； Ｓ．Ｄ．はシャイン−ダルガルノ配列を含み；ｍｅｔは開始メチオニンのための コドンを含み；Ｌはアルカリホスファターゼシグナル配列をコードする第１ＤＮ Ａ配列を含み；ここで前記シグナル配列のアミノ酸のためのコドンが前記Ｓ．Ｄ ．に関連する天然のヌクレオチド配列のコドンにほぼ等しく；そして Ｇは対象のポリペプチドをコードする第２ＤＮＡ配列を含む〕で表わされる発現 カセット。
20. ２０．前記−３５及び前記−１０調節配列が細菌性１ａｃプロモーターからの配 列と実質的に同じである請求の範囲第１９項記載の発現カセット。
21. ２１．前記調節配列が細菌性ｌａｃプロモーターからのものである請求の範囲第 ２０項記載の発現カセット。
22. ２２．前記−３５調節配列がｔｒｐプロモーターからの−３５調節配列と実質的 に同じであり、そして前記−１０調節配列がｌａｃプロモーターからの−１０調 節配列と実質的に同じである請求の範囲第１９項記載の発現カセット。
23. ２３．前記−３５調節配列がｔｒｐプロモーターからのものであり、そして前記 −１０調節配列がｌａｃプロモーターからのものである請求の範囲第２２項記載 の発現カセット。
24. ２４．前記Ｓ．Ｄ．がＮ−遺伝子のシャイン−ダルガルノ配列を含んで成る請求 の範囲第２１及び２３項記載の発現カセット。
25. ２５．前記Ｓ．Ｄ．がＣｒｏ遺伝子のシャイン−ダルガルノ配列を含んで成る請 求の範囲第２３項記載の発現カセット。
26. ２６．前記Ｓ．Ｄ．が約１１又は１２個のヌクレオチドにより前記ｍｅｔから分 離される請求の範囲第２５項記載の発現カセット。
27. ２７．前記Ｓ．Ｄ．が約７又は１２個のヌクレオチドにより前記ｍｅｔから分離 される請求の範囲第２４項記載の発現カセット。
28. ２８．下記式： Ｐ−Ｓ．Ｄ．−ｍｅｔ−Ｌ−Ｇ−Ｔ 〔式中、Ｐはｔｒｐプロモーターからの−３５調節配列及びｌａｃプロモーター からの−１０コンセンサス調節配列を有するプロモーターを含み； Ｓ．Ｄ．はＣｒｏ遺伝子のシャイン−ダルガルノ配列を含み；ｍｔは開始メチオ ニンのためのコドンを含み；Ｌはアルカリホスファターゼシグナル配列をコード する第１ＤＮＡ配列を含み、ここで前記シグナル配列をコードするヌクレオチド がＮ−遺伝子のシャイン−ダルガルノ配列に関連する天然のヌクレオチド配列に 近づくように、アミノ酸のためのコドンがコドン分解により変性されており；Ｇ は対象のポリペプチドをコードする第２ＤＮＡ配列を含み；そして Ｔは遺伝子３２の転写終結領域に実質的に類似する転写終結領域を含む〕で表わ される発現カセット。
29. ２９．下記式： Ｐ−Ｓ．Ｄ．−ｍｅｔ−Ｌ−Ｇ−Ｔ 〔式中、Ｐはｔｒｐプロモーターからの−３５調節配列及びｌａｃプロモーター からの−１０調節配列を有するプロモーターを含み； Ｓ．Ｄ．はＮ−遺伝子のシャイン−ダルガルノ配列を含み；ｍｅｔは開始メチオ ニンのためのコドンを含み；Ｌはアルカリホスファターゼシグナル配列をコード する第１ＤＮＡ配列を含み、ここで前記シグナル配列をコードするヌクレオチド が前記Ｓ．Ｄ．に関連する天然のヌクレオチド配列に近づくように、アミノ酸の ためのコドンがコドン分解により変性されており； Ｇは対象のポリペプチドをコードする第２ＤＮＡ配列を含み；そして Ｔは遺伝子３２の転写終結領域に実質的に類似する転写終結領域を含む〕で表わ される発現カセット。
30. ３０．下記式： Ｐ−Ｓ．Ｄ．−ｍｅｔ−Ｌ−Ｇ−Ｔ 〔式中、Ｐは−３５調節配列及びｌａｃプロモーターからの−１０コンセンサス 調節配列を有するプロモーターを含み；Ｓ．Ｄ．はＮ−遺伝子のシャイン−グル ガルノ配列を含み；ｍｅｔは開始メチオニンのためのコドンを含み；Ｌはアルカ リホスファターゼシグナル配列をコードする第１ＤＮＡ配列を含み、ここで前記 シグナル配列をコードするヌクレオチドが前記Ｓ．Ｄ．に関連する天然のヌクレ オチド配列に近づくように、アミノ酸のためのコドンがコドン分解により変性さ れており； Ｇは対象のポリペプチドをコードする第２ＤＮＡ配列を含み；そして Ｔは遺伝子３２の転写終結領域に実質的に類似する転写終結領域を含む〕で表わ される発現カセット。
31. ３１．下記式： Ｐ−Ｓ．Ｄ．−ｍｅｔ−Ｌ−Ｇ−Ｔ 〔式中、Ｐはｔｒｐプロモーターからの−３５コンセンサス調節酎列及びｌａｃ プロモーターからの−１０コンセンサス調節記列を有するプロモーターを含み； Ｓ．Ｄ．はＣｒｏ遺伝子のシャイン−ダルガルノ配列を含み；ｍｅｔは開始メチ オニンのためのコドンを含み；Ｌはアルカリホスファターゼシグナル配列をコー ドする第１ＤＮＡ配列を含み、ここで前記シグナル配列をコードするヌクレオチ ドがＮ−遺伝子のシャイン−ダルガルノ配列に関連する天然のヌクレオチド配列 に近づくように、アミノ酸のためのコドンがコドン分解により変性されており； Ｇは対象のポリペプチドをコードする第２ＤＮＡ配列を含み；そして Ｔは遺伝子３２からの転写終結領域を含む〕で表わされる発現カセット。
32. ３２．請求の範囲第２８〜３１項記載の発現カセットを含んで成る原核生物細胞 。
33. ３３．前記細胞がＥ．コリ細胞である請求の範囲第３２項記載の細胞
34. ３４．対象のポリペプチド及びバクテリオファージλＮ−タンパク質又はＣｒｏ タンパク質からの約８〜約３５個のＮ−末端アミノ酸又は前記対象のポリペプチ ドのＮ−末端に結合される変性された細菌性アルカリホスファターゼシグナル配 列を含んで成る融合タンパク質。
35. ３５．前記対象のポリペプチドと前記Ｎ−末端のアミノ酸との間に少なくとも１ つのアミノ酸の中心領域をさらに含んで成る請求の範囲第３４項記載の融合タン パク質。
36. ３６．前記中心領域が化学的切断部位又は酵素的切断部位を含んで成る請求の範 囲第３５項記載の融合タンパク質。