NO177540B

NO177540B - Fremgangsmåte for fremstilling av heterologe proteiner i Bombyx mori samt plasmid og rekombinant Bombyx mori nukleært polyhedrosevirus (BmNPV)

Info

Publication number: NO177540B
Application number: NO864486A
Authority: NO
Inventors: Susumu Maeda; Mitsuru Furusawa; Yasumasa Marumoto; Tadashi Horiuchi; Yoshinari Sato; Yoshiyuki Saeki
Original assignee: Daiichi Seiyaku Co
Priority date: 1985-11-14
Filing date: 1986-11-11
Publication date: 1995-06-26
Also published as: FI864624A; PL262348A1; FI94260B; DK175184B1; FI864624A0; DK543686D0; PH25470A; JPS62208276A; NO864486D0; CN86107784A; PL158590B1; ATE82590T1; BG60255B2; NO864486L; KR950001992B1; IL80612A0; IE862999L; DK543686A; CN1032762C; HU208340B

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av heterologe proteiner i Bombyx mori samt plasmid og rekombinant Bombyx mori nukleært polyhedrosevirus (BmNPV).

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravene.

En fremgangsmåte for fremstilling av proteiner ved anvendelse av Bombyx mori nukleært polyhedrosevirus (BmNPV) er allerede omtalt (Nature, 315, 592, 1985).

Det viktigste trekket ved denne metoden omfatter oppbygging av et rekombinant BmNPV med et strukturelt gen for et ønsket protein som erstatter den strukturelle gendelen som koder for det polyhedrale protein ved anvendelse av rekombinante DNA teknikker og propagering av rekombinanten til dyrkede silkeormceller (Bombyx mori) eller til levende silkeormer (Bombyx mori), for dermed å akkumulere det ønskede protein deri. Denne metoden er imidlertid ennå utilfredsstillende med hensyn til utbyttene av de ønskede proteiner.

Dessuten er fremstillingen av fusjonsproteiner allerede praktisert i Escherichia coli. Utbyttene kan imidlertid ikke sies å være blitt særlig forbedret (se Science, 198, 1056, 1977, japansk patentsøknad (OPI) nr. 145289/79, japansk patentsøknad (OPI) nr. 19092/80, japansk patentsøknad (OPI) nr. 45395/80, japansk patentsøknad (OPI)nr. 104886/80, japansk patentsøknad (OPI) nr. 145221/81, og japansk patentsøknad (OPI) nr. 166200/81).

Foreliggende oppfinnelse vedrører således en fremgangsmåte for fremstilling av heterologe proteiner som omfatter oppbygging av et rekombinant nukleært polyhedrosevirus som inneholder et heterologt strukturelt gen i den strukturelle gendelen av BmNPV som koder for et polyhedralt protein og propagering av det nevnte virus i Bombyx mori for dermed å fremstille det heterologe protein, som er kjennetegnet ved at det nevnte strukturelle gen for et heterologt protein binder til hele eller en del av det strukturelle gen som koder for et polyhedralt protein med eller uten innskudd av en linkerbasesekvens, og at det heterologe protein fremstilles som et fusjonsprotein bestående av det nevnte heterologe protein og hele eller en del av det polyhedrale protein bundet sammen med eller uten innskudd av en linkeraminosyre eller et linkerpeptid, idet fusjonsproteinet kuttes i linkersetet for å utvinne det heterologe protein.

Oppfinnelsen vedrører også et plasmid som inneholder en 5'-oppstrøms DNA-sekvens inkluderende promotordelen av polyhedringenet i BmNPV DNA, DNA-sekvensen til et strukturelt gen for et heterologt protein som eventuelt inkluderer en DNA-sekvens av terminatoren til det heterologe protein, og en 3'-nedstrøms DNA-sekvens inkluderende terminatordelen av polyhedringenet i BmNPV DNA, som er kjennetegnet ved at det nevnte strukturelle gen for et heterologt protein binder til hele eller en del av DNA-sekvensen til strukturgenet i BmNPV som koder for et polyhedralt protein, med eller uten en linkerbasesekvens.

Endelig vedrører oppfinnelsen et rekombinant Bombyx mori nukleært polyhedrosevirus (BmNPV) som er kjennetegnet ved at det inneholder et plasmid som kan uttrykke det heterologe protein.

I de vedlagte tegninger viser fig. 1-6 skjematisk oppbyg-ningen av visse plasmider for fremstillingen av rekombinant virus.

Fig. 7 og 8 viser elektroforesemønsteret til det ønskede fusj onsprotein.

BmNPV er godt kjent blant silkeavlere. Stammen T3 er en typisk stamme som man har isolert. Det virale DNA (BmNPV DNA) fra denne stammen er deponert hos ATCC i USA under registreringsnummer ATCC 40188.

For å isolere en del som inneholder det strukturelle gen for det polyhedrale protein fra dette virale DNA, passer blant annet en behandling med EcoRI som omtalt i Nature, 315, 592, 1985. En Escherichia coli stamme (E. coli K12JM83 DGB-0036) som bærer plasmidet pBmE36 med et EcoRI-EcoRI fragment (omtrent 10,5 kb) av det virale DNA innskutt i plasmidet i EcoRI spaltingssetet, er deponert hos "The Fermentation Resrearch Institute, Agency of Industrial Science and Techonology, Ministry of International Trade and Industry of Japan", med registreringsnummer FERM BP-813.

Videre, som beskrevet i Nature, 315, 592, 1985, gir pBmE36, når det behandles med Hindlll, et fragment med en lengde på omtrent 3,9 kb som inneholder det strukturelle gen for det polyhedrale protein. Fragmentet innføres deretter i det kommersielt tilgjengelige plasmidet pUC9 (kommersielt tilgjengelig fra Pharmacia P-L Biochemicals). Den påfølgende oppkutting ved hjelp av EcoRI, behandling med Bal31 (hvorved fragmenter med forskjellig lengde kan fremstilles ved å forandre behandlinstiden) og ytterligere oppkutting med Hindlll, eller en lignende prosedyre, tilveiebringer et fragment som omfatter hele eller deler av det polyhedrale protein-gen.

Et strukturelt gen for et heterologt protein kan binde til hele eller en del av det polyhedrale protein-gen ved anvendelse av en passende linker (DNA) (T.Maniatis et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), og det dannede fusjonsprotein, når det spaltes ved hjelp av passende midler i setet til peptidet eller aminosyren (linkerdelen) som er translatert i overensstemmelse med linkerbase-sekvensen, gir det ønskede protein, som deretter kan isoleres ved hjelp av vanlig anvendte metoder.

Når fusjonsproteinet kan anvendes per se, er en spaltings-prosedyre unødvendig. I et slikt tilfelle kan linkeren være fraværende.

Som peptid eller aminosyre (linkerdelen) tilsvarende linkeren og som midler for spalting eller nedbrytning av linkeren, kjenner man også godt til sekvensene Ile-Glu-Gly-Arg og blod-koagulasjons f aktoren Xa (heretter forkortet "F-Xa") som er i stand til å spalte sekvensen, Pro-Ama-Gly-Pro (hvori Ama kan være en hvilken som helst aminosyre) og kollagenase som er i stand til å spalte sekvensen, Arg eller Phe og trypsin som er i stand til å spalte peptidbindingen etter den samme. Tyr eller Phe og chymotrypsin som er i stand til å spalte peptidbindingen etter den samme, Pro-Arg og trombin som er i stand til å spalte peptidbindingen etter den samme, tryptofan og N-bromsuccinimid som er i stand til å nedbryte den samme, og metionin og cyanbromid som er i stand til å nedbryte den samme (Science, 198, 1056, 1977), japansk patentsøknad (OPI)

nr. 145289/79, japansk patentsøknad (OPI) nr. 19092/80, japansk patentsøknad (OPI) nr. 45395/80, japansk patentsøknad (OPI) nr. 104886/80, japansk patentsøknad (OPI) nr. 145221/81, japansk patentsøknad (OPI) nr. 166200/81, Nature, 309, 810, 1984.., Nature, 285,. 456, 1980). Linkerdelen og midlene for spalting eller nedbrytning er ikke begrenset til dem som er nevnt over, og mange andre passende kombinasjoner av forskjellige peptider eller aminosyrer og forskjellige kjemiske eller enzymatiske metoder kan også anvendes for henholdsvis linkerdelen og som midler for spalting eller nedbrytning.

Det heterologe protein bør ikke inneholde noe peptid eller noen aminosyrer som nedbrytes ved å bli utsatt for en spaltings- eller nedbrytningsprosess av linkerdelen som nevnt over. Det er imidlertid også mulig å nedbryte fusjonsproteinet restriktivt ved anvendelse av passende restriktive, moderate betingelser for derved å oppnå det tilsiktede protein.

Betegnelsen "heterologt protein" slik det anvendes heri kan være et eukaryotisk protein, foretrukket et protein fra pattedyr. Spesifikke eksempler på proteinet omfatter for skjellige fysiologisk aktive substanser og substanser som er nyttige som diagnostiske reagenser, slik som interferoner

(IFN), tumornekrosefaktor (TNF), interleukiner og andre lymfokiner, insulin, veksthormon og andre hormoner, hepatitt-vaksine, influensavaksine og forskjellige andre antigen-proteiner, vevsplasminogenaktiverende faktor (TPA), somato-mediner, enzymer som er nyttige for industriell anvendelse slik som steroidomdannelsesenzymer, acylaser, amylaser, lipaser og lignende, tilsetningsmidler i mat og for, blant annet. Noen av disse materialene kan ha en sukkerkjede festet dertil. I overensstemmelse med oppfinnelsen fremstilles peptidene i eukaryote celler. Når man anvender et gen som er avledet fra en eukaryot, kan det fremstilte peptid gjennomgå den samme modifikasjon eller modifikasjoner som den eller de som foregår in vivo i eukaryoten. Derfor kan produktene som fremstilles i henhold til denne oppfinnelsen sies å ha en større anvendbarhet sammenlignet med dem som fremstilles i bakterier.

Genene som koder for disse proteinene kan være kromosom-DNAer .som er isolert fra naturlig, forekommende materialer,. cDNAer som er fremstilt gjennom mellomleddet av naturlig avledete mRNAer, DNAer som er syntetisert kjemisk eller DNAer som er fremstilt ved en passende kombinasjon av teknikkene i de ovennevnte eksempler (Am. J. Hum. Genet., 31, 531, 1979),

T. Maniatis et al: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

Dersom et produkt på noen måte avviker i aminosyresekvens (substitusjon, deletering eller addisjon) fra det kontemplerte material, men har imidlertid de ønskede funksjoner slik som fysiologisk aktivitet, kan en modifikasjon med hensikt gjennomføres. F.eks., når metionin skal nedbrytes med cyanbromid i forbindelse med den ovennevnte linkerdelen, kan metioninresten eller restene som er tilstede i proteinet erstattes med en annen aminosyrerest eller andre aminosyre-rester, eller kan fjernes. I dette tilfellet er det til-rådelig at peptidet som er fremstilt på grunnlag av basesekvensen i overensstemmelse med det som er sagt tidligere, undersøkes med hensyn på om aktiviteten derav er passende for

det tilsiktede formål eller ikke.

I noen tilfeller kan noe av en aminosyrerest forbli i protein-produktet som sett i f.eks. tilfellet med kjemisk nedbrytning av cystein med 2-nitro-5-tiocyanbenzosyre. Også i dette tilfellet bør produktet undersøkes med hensyn på aktiviteten som nevnt over, for dermed å bestemme om produktet er egnet for det tilsiktede formål eller ikke.

Plasmider (plasmider for rekombinering) med en basesekvens omfattende hele eller en del av det polyhedrale protein-gen fra Bombyx mori nukleært polyhedrosevirus DNA (BmNPV DNA) som er bundet til et strukturelt gen for et ønsket protein (enten med eller uten en innskutt linker), kan fremstilles ved anvendelse av vanlige rekombinante DNA teknikker ved anvendelse av de plasmider, restriksjonsenzymer og andre materialer som er kommersielt tilgjengelige. Fremstilling av slike plasmider kan oppnås rutinemessig idet man henviser til eksemplene som er beskrevet senere.

For fremstilling av rekombinante viruser ved anvendelse av de ovennevnte plasmider, underkastes celler fra en etablert Bombyx mori cellelinje en blandet infeksjon med et plasmid for rekombinering og BmNPV, om nødvendig etterfulgt av isolering av rekombinant virus ved hjelp av for eksempel plakkmetoden (J. Serie. Sei. Jpn, 53, 547, 1984) eller fortynningsmetoden (J. Invertebr. Pathol., 29, 304, 1977). Passende etablerte Bombyx mori cellelinjer som kan anvendes omfatter blant annet kjente Bm-celler (BM-N celler beskrevet i Nature, 315, 592, 1985, J. Serie, Sei. Jpn, 53, 547, 1984, og Appl. Environ. Microbiol., 44, 227, 1982, deponert under ATCC nr. CRL-8910), og Bm-N celler deponert under ATCC nr. CRL-8851. For å fremstille et ønsket material i silkeormer, underkastes silkeormene en virusinfeksjon ved injisering av viruset (enten en blanding av rekombinante og ikke-rekombinante viruser, eller det rekombinante virus isolert derfra), som har propagert i dyrkede celler, perkutant eller inn i kroppshulen eller viruset innføres sammen med for gjennom munnen. Deretter fores silkeormene med kunstig for eller med morbærtreblader i et passende antall døgn for dermed å akkumulere det ønskede fusjonsprotein. Generelt er fusjonsproteinet ikke løselig i vann, og er suspendert i kroppsvæsken til silkeormen, idet proteinet kan separeres eller renses ved hjelp av vanlige anvendte metoder slik som kromatografi (ionebytteharpiks, affinitet, gelpermeasjon osv), sentrifugering, ekstraksjon og lignende.

Når silkeormen er høstet og blandet med et løsningsmiddel som en vandig SDS-løsning, en vandig urealøsning, en vandig alka-lisk løsning og lignende, eller er høstet i nærvær av et slikt løsningsmiddel, kan fusjonsproteinet separeres eller renses fra løsningen på samme måte som beskrevet over. Når fusjonsproteinet skal spaltes, kan spaltings/nedbrytningsprosedyren gjennomføres på samme måte som beskrevet over.

De etterfølgende eksempler hvori insulinlignende vekstfaktorer (IGF-I og.IGF-II) og cc-interferon er de ønskede proteiner, er gitt for å illustrere oppfinnelsen ytterligere. Skjemaer for plasmidoppbygning er vist i fig. 1-5. Om ikke annet er angitt, er 5'-siden (oppstrømssiden) av DNA-sekvensen vist på venstre side, og 3'-siden (nedstrømssiden) på høyre side i overensstemmelse med vanlig praksis.

Syntetisering, kutting, screening, isolering og annen behandling av det polyhedrale protein-genet, gener for de ønskede proteiner og gener for fusjonsproteiner, kan gjennomføres ved anvendelse av de teknikker som er beskrevet i Nature, 315, 592, 1985, såvel som ved genmanipulasjonsteknikker som til vanlig anvendes (se for eksempel Am. J. Hum. Genet., 31, 531, 1979, og T. Maniatis et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

EKSEMPEL 1

A. Oppbygning av plasmid uten polyhedringen.

Plasmidet pBmE36 (Nature, 315, 592, 1985), ble kuttet med EcoRI og produktet fikk butte ender ved anvendelse av DNA polymerase I (Klenow-fragment) i nærvær av dNTPer (fire deoksynukleosidtrifosfatarter). Delvis spatlting med Hindlll etterfulgt av agarosegelelektroforese ga et polyhedringenholdig fragment. Ved anvendelse av T4-ligase, ble dette fragment ligert med et pUC9-fragment, som var fremstilt ved kutting av pUC9 (tilgjengelig fra Pharmacia P-L Biochemicals) med EcoRI, idet det oppnådde produkt fikk butte ender ved anvendelse av et Klenow-fragment og ble ytterligere spaltet med Hindlll, for å fremstille et ligeringsprodukt. Det oppnådde ligeringsproduktet ble anvendt for å transformere Escherichia coli K-12JM83. Plasmidet ble deretter gjenvunnet og betegnet p9BmE36. (Den ovennevnte metoden er beskrevet i T. Maniatis et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

Et EcoRV gjenkjenningssete og et Aatl gjenkjenningssete ble innført i p9BmE36, ved henholdsvis setet for initierings-kodonet ATG og setet for termineringskodonet TAA ved hjelp av in vitro mutagenese (Nucleic Acids Res., 9, 3647, 1981). p9BmE3 6 ble deretter behandlet med DNase I i nærvær av etidiumbromid for å fremstille et "nicked" plasmid (Nucleic Acids Res., 9, 3647, 1981), som deretter ble annealet med de følgende to kjemisk syntetiserte DNA-fragmenter:

Påfølgende behandling med polymerase I og T4-ligase ga et heterodupleks plasmid, som deretter ble anvendt for transformering av Escherichia coli K-12JM83. Transformasjonen ble gjennomført igjen for å oppnå en ønsket mutant. Således ble et plasmid p9BmM36 oppnådd.

For å eliminere polyhedringenet fra p9BmM36 og for å innføre polylinker, ble de følgende to DNA-fragmenter (hver 38mer) syntetisert kjemisk:

Disse to fragmentene er komplementære til hverandre og har SacI, Smal, EcoRI, Ncol, EcoRV og Xbal gjenkjenningsseter.

De ovennevnte to fragmenter ble fosforylert på de respektive 5'-endene ved anvendelse av T4-kinase og deretter annealet til hverandre. Det annealede produkt ble ligert, i nærvær av T4-ligase, med et fragment uten polyhedringen som var oppnådd ved å kutte p9BmM36 med EcoRV og Aatl. Denne prosedyre resul-terte i dannelse av et Bglll gjenkjenningssete og et Aatl gjenkjenningssete på henholdsvis 5'-siden og på 3'-siden av linkeren. Det oppnådde plasmid ble anvendt for å transformere Escherichia coli K-12JM83 og deretter utvunnet og betegnet pBM030.

DNA-sekvensen til, og spaltingssetene på, polylinkerdelen av pBM030 er vist under til sammenligning med polyhedringendelen av p9BmE3 6.

B. Oppbygning av plasmid med delvis mangelfullt polyhedringen.

Plasmidet p9H18 (Nature, 315, 592, 1985) ble kuttet med

EcoRI og deretter behandlet med Bal31 for derved å skjære av en del på begge sider av spaltingssetet. Ved å variere tiden for Bal31 behandlingen ble det fremstilt fragmenter med varie-rende lengde. Disse fragmenter ble behandlet med Hindlll og separert ved hjelp av 0,7 % agarosegelelektroforese, etterfulgt av ekstrahering, som ga ulike virusavledede DNA-fragmenter med forskjellig lengde.

Plasmid pUC9 ble behandlet med Smal og Hindlll, etterfulgt av ligering med DNA-fragmentene som var oppnådd tidligere (som hadde en butt ende og en Hindlll ende). Ved anvendelse av de plasmidene som således var fremstilt, ble Escherichia coli K-12JM83 transformert og deretter dyrket. Plasmidet ble gjenvunnet, og basesekvensen fra 3'-siden av hvert virusavledet innskutt DNA-fragment ble bestemt ved hjelp av dideoksymetoden (Science, 214, 1205 (1981)), ved anvendelse av en primer (15-base sekvenseringsprimer for M13), for derved å identi-fisere den virale polyhedrale gendelen. Således ble en basesekvens i overensstemmelse med aminosyresekvensen til det polyhedrale protein som er beskrevet hos Serebryani et al.

(J. Invertebr. Pathol., 30, 442, 1977), funnet blant base-sekvensene til de virusavledede DNA-fragmentene. Transla-sjonsstartkodonet ATG og termineringskodonet TAA ble også identifisert.

Blant de forskjellige plasmidene (p9B serie plasmider) som ble oppnådd avhengig av varigheten av Bal31 behandling, ble de med 212 bp, 338- bp, 662 bp og 727 bp nedstrøms fra translasjons-startkodonet ATG for polyhedringenet som mangler, angitt som henholdsvis p9B240, p9B120, p9B115 og p9B086. Polyhedringenet har en lengde på 738 bp omfattende stoppkodonet TAA.

Oppstilling, se side 11.

C. Oppbygning av gen for fusjonsprotein som utgjores av oc-interferon og polyhedralt protein.

PIFN2B310 (Nature, 315, 592 (1985)) ble kuttet med Smal og et a-IFN-J-fragment ble isolert ved hjelp av agarosegelelektroforese. Dette ble ligert med Smal kuttet pBM030 ved anvendelse av T4-ligase, og det oppnådde plasmid ble anvendt for transformering av Escherichia coli K-12JM83. Det rekombinante plasmidet ble betegnet pBT310 etter at det ble bekreftet at det hadde a-IFN-J-genet innskutt i den riktige retningen.

pBT310 ble kuttet med Bglll og produktet ble gjort buttendet ved anvendelse av et Klenow-fragment i nærvær av dNTPer og deretter kuttet med Seal. Et a-IFN-J genholdig fragment ble isolert ved hjelp av agarosegelelektroforese.

p9B086 ble kuttet med EcoRI og Seal og et polyhedringenholdig fragment ble isolert ved hjelp av agarosegelelektroforese. Dette fragmentet ble gjort buttendet ved anvendelse av Sl nuklease og ligert med det ovennevnte a-IFN-J genholdige fragment ved anvendelse av T4-ligase. Escherichia coli K-12JM83 ble transformert med det oppnådde plasmid. Det ble så bekreftet ved hjelp av dideoksymetoden at DNA-sekvensen til linkerdelen i det således oppnådde plasmid var korrekt. Plasmidet ble betegnet pIFNF086.

DNA-sekvensen av linkerdelen var:

D. Oppbygning av gen for fusjonsprotein som utgjøres av

IGF-I og polyhedralt protein.

Plasmidet pIGFOOl ble utvunnet fra Escherichia coli K12 MC1061 IGF001 (FERM BP-932) og kuttet med Sali. Produktet ble gjort buttendet ved anvendelse av Klenow-fragmentet i nærvær av dNTPer og kuttet med Avall, og et IGF-I genholdig fragment ble isolert ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese. Separat ble pBM030 kuttet med EcoRV og SacI.

Det viste seg at aminosyresekvensen Ile-Glu-Gly-Arg skulle innføres mellom det polyhedrale protein og IGF-I ved fremstillingen av et fusjonsprotein, slik at fusjonsproteinet kunne gjenkjennes og kuttes ved hjelp av blodkoagulasjonsfaktoren Xa (F-Xa). For dette formålet ble de to følgende DNA-fragmenter syntetisert kjemisk:

Disse to fragmenter er komplementære til hverandre, og danner, etter annealing, på oppstrømssiden, en kohesiv ende som kan kobles med en Sacl-kuttet ende og, på nedstrømssiden, en kohesiv ende som kan kobles med en Avall-kuttet ende.

Disse to fragmentene ble begge fosforylert i 5'-enden ved anvendelse av T4-kinase og deretter annealet. Produktet derav, det ovennevnte IGF-I fragment og det ovennevnte kuttede pBM030 ble ligert ved anvendelse av T4-ligase. Escherichia coli K-12JM83 ble transformert med ligeringsproduktet for å fremstille et plasmid. DNA sekvensering ved hjelp av dideoksymetoden bekreftet at bindingen mellom F-Xa gjenkjennings-stedet og IGF-I-genet i dette plasmid (pIFG-1030) var riktig. pIGF-1030 ble kuttet med Bglll, deretter ble butte ender dannet ved anvendelse av Klenow-fragmentet i nærvær av dNTPer, og kuttet med Seal, og et IGF-I genholdig fragment ble isolert ved hjelp av agarosegelelektroforese.

Separat ble p9B086 kuttet med EcoRI og Seal, og butte ender ble dannet ved anvendelse av Sl-nuklease, og et fragment inneholdende et polyhedringen ble isolert ved hjelp av agarosegelelektroforese, og ligert med fragmentet inneholdende IGF-I genet som er nevnt over, ved anvendelse av T4-ligase. Ved anvendelse av det oppnådde plasmid ble Escherichia coli K-12JM83 transformert, og et plasmid med fusjonsproteingenet konstruert ved hjelp av korrekt ligering ble oppnådd og betegnet pIGF-IF086. DNA-sekvensen til linkerdelen er vist under.

E. Oppbygning av gener for fusjonsproteiner som utgjøres av

IGF-II og polyhedrale proteiner med forskjellige lengder. Plasmidet pIGF002 ble utvunnet fra Escherichia coli K12 MC1061 IGF002 (FERM BP-933), delvis kuttet ved hjelp av Sali, og butte ender ble dannet ved anvendelse av et Klenow-fragment i nærvær av dNTPer, og deretter kuttet med Haelll, etterfulgt av polyakrylamidgelelektroforese, hvorved et fragment inneholdende et IGF-II gen ble isolert. Dette fragment ble ligert med Smal-kuttet pBM030 ved anvendelse av T4-ligase og produktet ble anvendt for å transformere Escherichia coli K-12JM83. For den således oppnådde transformant ble det bekreftet at denne hadde et plasmid (pIGF-11030) med IGF-II genet innskutt deri i riktig retning.

pIGF-11030 ble delvis spaltet med EcoRI og deretter kuttet med Seal, og et fragment inneholdende et IGF-II gen ble isolert ved hjelp av agarosegelelektroforese. Dette fragmentet ble ligert, i nærvær av T4-ligase, med et fragment som innholdt en del av polyhedringenet som var isolert ved hjelp av agarosegelelektroforese etter kutting av hver av p9B240, p9B120 og p9B115 med Ecorl og Seal.

Escherichia coli K-12JM83 ble transformert med de oppnådde plasmidene. DNA-sekvensering ved hjelp av dideoksymetoden bekreftet at plasmidene fra de resulterende transformanter hadde de respektive fusjonsproteingener oppbygget på riktig måte.

Disse plasmidene ble betegnet henholdsvis pIGF-IIF240, PIGF-IIF120 og pIGF-IIF115.

DNA-sekvensen til linkerdelen i hvert plasmid er vist under:

EKSEMPEL 2

Transfeksjon av Bm-celler.

BmNPV T3-stamme viral DNA (ATCC nr. 40188) og pIFNF086, i et molforhold på 1:100, ble blandet med løsningene I og II med henholdsvis følgende sammensetninger:

En 1-ml porsjon av den oppnådde suspensjon ble tilsatt til

4 ml av et Bm-celle kulturmedium (TC-10-medium inneholdende 10 % føtalt kalveserum, J. Invertebr. Pathol., 25, 363, 1975), og blandingen ble tilsatt til Bm-celler (ATCC nr. CRL-8910, 2 x IO6 celler) for derved å innføre det ovennevnte DNA i Bm-cellene. Tyve timer senere ble mediumet byttet ut med et friskt medium. Etter ytterligere inkubering i fem døgn, ble mediumet gjenvunnet og sentrifugert, og supernatanten ble underkastet plakkmåling (J. Serie. Sei. Jpn, 53, 547, 1984), hvorved det rekombinante virus ble utvunnet i form av et klon. Dette ble betegnet VIFNF086.

Rekombinant virus-kloner, VIGF-IF086, VIGF-IIF240, VIGF-IIF120 og VIGF-IIF115 ble oppnådd på samme måte som over ved anvendelse av henholdsvis pIGF-IF086, pIGF-IIF240, pIGF-11120 og PIGF-IIF115.

EKSEMPEL 3

Ekspresjon av fusjonsprotein i Bm-celler.

Bm-celler (ATCC nr. CRL-8910, 2 x 10<6->celler) ble infisert med vIFNF08.6 ved tilsetning av en vIFNF086-suspensjon dertil

(5 x IO<7> pfu) . 30 minutter senere ble supernatanten fjernet, 4,5 ml nylaget medium ble tilsatt og inkuberingen fortsatte ved 25°C i fire døgn. Deretter ble kulturen sentrifugert (1.000 rpm, ti minutter) for å oppnå et presipitat. 500 \ Ll nylaget medium ble tilsatt til presipitatet, og etter fem gjentatte fryse-tineprosedyrer ble blandingen sentrifugert (15.000 rpm, ti minutter). Til det således oppnådde presipitat ble 200 \ Ll 4 % natriumdodecylsulfat (SDS)-10 % merkaptoetanol tilsatt. 5 \ il av den oppnådde løsning ble anvendt som en prøve for SDS-15 % akrylamidgelelektroforese.

Etter gjennomført elektroforese observerte man et bånd på gelen tilsvarende det forventede fusjonsprotein. Densiteten av båndet ble målt ved anvendelse av et densitometer og sammenlignet med densiteten av hver markør (hvert markørbånd inneholder 1 \ ig protein) . Det således beregnede utbytte var 0,3 mg/ml av cellekulturen som først ble oppnådd. Da IFN-delen utgjør omtrent 40 % av dette fusjonsprotein med hensyn til molekylvekt, skulle dette utbyttet nogenlunde være i overensstemmelse med et IFN-utbytte på 0,12 mg/ml etter en vel-lykket kutting og utvinning av IFN. Dette utbyttet er mer en 2 0 ganger større sammenlignet med verdien 5 x 10<6> enheter/ml (som er i overensstemmelse med 0,005 mg/ml), som er gitt i rapporten vedrørende ekspresjon av IFN i Bombyx mori celler (Nature, 315, 592, 1985).

Utbyttene av fusjonsproteiner fremstilt ved hjelp av Bm-celler som var infisert med vIGF-IF086, VIGFIIF240, VIGF-IIF120 og vIGF-IIF115 og målt på samme måte som beskrevet over, var henholdsvis 0,5 mg, 0,1 mg, 0,4 mg og 0,5 mg pr. ml cellekul-turløsning, eller, uttrykt som en kvantitet av IGF-I eller IGF-II inneholdt disse fusjonsproteiner henholdsvis 0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml og 0,1 mg/ml.

EKSEMPEL 4

A. Ekspresjon av fusjonsprotein i Bm-celler.

Bm-celler (ATCC nr. CRL-8910, 2 x 10<6->celler) ble infisert med VIGF-IIF120 ved tilsetning av en vIGF-IIF120-suspensjon dertil (5 x 10<7> pfu). 30 minutter senere ble viruset fjernet, og 4,5 ml nylaget medium ble tilsatt, idet inkuberingen ble fort-satt ved 25°C i fire døgn og kulturen ble sentrifugert (1.000 rpm, ti minutter). Til det således oppnådde presipitat ble 500 ul nylaget medium tilsatt. Etter gjentatte fryse-tine-operasjoner ble blandingen sentrifugert (15.000 rpm, ti minutter) for å oppnå et presipitat. Dette presipitat ble vasket med destillert vann, oppløst i 0,5 % SDS og underkastet væskekromatografi (HPLC: TSK Gel Phenyl 5PWRP (produsert av Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.), løsningsmiddelsystem: 0,1 % trifluoreddiksyre-20-75 % acetonitril med en lineær konsentrasjonsgradient). Således ble en 2 ml fraksjon inneholdende fusjonsproteinet samlet.

B. Kutting med cyanbromid (BrCN).

Til denne fraksjon ble det tilsatt 50 ul av 1 % SDS, og blandingen ble konsentrert til tørrhet, og konsentratet ble oppløst i 50 Ul destillert vann. Til 15 ul av løsningen ble det tilsatt 35 ul maursyre og 45 ul av 70 % maursyre, etterfulgt av tilsetning av 5 ul av en cyanbromidløsning

(200 umol/ml) i 70 % maursyre. Etter reaksjon i 24 timer ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen konsentrert til tørrhet, konsentratet ble oppløst i 7,5 ul destillert vann, og løs-ningen ble underkastet elektroforese, hvorpå et bånd tilsvarende IGF-II ble påvist.

Således, ved SDS-16 % polyakrylamidgelelektroforese, ga fraksjonen som ble oppnådd ved ekstrahering av VIGF-IIF120 infiserte Bm-celler med en vandig SDS-løsning og påfølgende partiell rensing ved hjelp av høyeffektiv væskekromatografi,

et omtrent 23 K bånd tilsvarende fusjonsproteinet som omfattet det polyhedrale protein (partiell) og IGF-II, mens cyanbromidnedbrytningsproduktet viste et omtrentlig 7 K bånd tilsvarende IGF-II sammen med en rekke bånd ved 10-14 K som antagelig

skyldes nedbrytningsprodukter fra det polyhedrale protein (se fig. 8, hvori A er markører, B er fusjonsproteinet og C er cyanbromidnedbrytningsproduktet) .

C. Bestemmelse av den N-terminale enden av XGF-IP.

På samme måte som beskrevet over, ble omtrent 20 mg av fusjonsproteinet oppnådd fra en 50 ml kultur av Bm-celler som var infisert med VIGF-IIF120 og fusjonsproteinet ble kuttet med cyanbromid og reaksjonsblandingen ble konsentrert.

Konsentratet ble oppløst i 5 ml 200 mM pyridineddiksyrebuffer (pH 3,0), og løsningen ble underkastet kolonnekromatografi (SP-Toyopearl (produsert av Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd), løsningsmiddelsystem: 200 mM pyridineddiksyrebuf f er (pH 3,0) - 2, OM pyridineddiksyrebuf f er (pH5,0) med en lineær konsentrasjonsgradient). Således ble en fraksjon som inneholdt IGF-II samlet. Denne fraksjonen ble frysetørket, oppløst i destillert vann og underkastet høyeffektiv væskekromatografi

(HPLC: ODS-120T) fremstilt av Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.), løsningsmiddelsystem: 0,1 % trifluoreddiksyre-10-65 % acetonitril med en lineær konsentrasjonsgradient). Det oppnådde rene IGF-II ble underkastet peptidsekvensering (47OA Protein Sequencer (fra Applied Biosystems)). Den aminoterminale aminosyresekvensen til IGF-II som således ble bekreftet er vist under.

EKSEMPEL 5

A. Ekspresjon av fusjonsprotein i Bm-celler.

Plasmidet pIGFOOl ble utvunnet fra Escherichia coli K12 MC1061 IGF001 (FERM BP-932) og kuttet med Sali. Produktet fikk butte ender ved anvendelse av Klenow-fragmentet i nærvær av dNTP og ble kuttet med Avall, og et fragment inneholdende et IGF-I gen ble isolert ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese.

pIGF-IIF120 ble kuttet separat med EcoRV og EcoRI for å fjerne fragmentet inneholdende IGF-II genet.

Det fremgikk at aminosyresekvensen Gly-Pro-Ala bør innføres gjentatte ganger mellom det polyhedrale protein og IGF-I ved fremstillingen av et fusjonsprotein, slik at fusjonsproteinet kunne gjenkjennes og kuttes ved hjelp av en kollagenase som gjenkjenner aminosyresekvensen Pro-Ama-Gly-Pro (Ama: hvilken som helst aminosyre) og kutter mellom Ama og Gly. For dette ble følgende to DNA-fragmenter syntetisert kjemisk:

Disse to fragmenter er komplementære til hverandre, og danner, etter annealing, på oppstrømssiden, en kohesiv ende som kan binde seg til en EcoRI kuttingsende, og, på nedstrømssiden, en kohesiv ende som kan binde seg til en Avall kuttingsende.

Hvert av disse to fragmentene ble fosforylert på 5'-enden ved anvendelse av T4-kinase og deretter annealet. Det oppnådde produkt, det ovennevnte IGF-I-fragment og det ovennevnte kuttede pIGF-IIF120 ble ligert sammen ved anvendelse av T4-ligase. Escherichia coli K-12JM83 ble transformert med ligeringsproduktet for å danne et plasmid og betegnet pIGF-IF120. DNA-sekvensering ved hjelp av dideoksymetoden bekreftet at bindingen mellom kollagenasegjenkjenningssetet og iGF-I-genet i dette plasmidet var korrekt. DNA-sekvensen av linkerdelen er vist under.

På lignende måte som beskrevet i eksempel 2, ble det rekombinante virus VIGF-IF120 oppnådd ved anvendelse av pIGF-IF120.

På lignende måte som beskrevet i eksempel 4 (a) ble Bm-celler infisert med VIGF-IF120 og etter frysing-tining ble Bm-cellene samlet fra en 50 ml kulturløsning, cellene ble sentrifugert (15.000 rpm, ti minutter) for å oppnå et presipitat. Dette presipitat ble oppløst i en 6M guanidinhydrokloridløsning og sentrifugert (15.000 rpm, fem minutter) for å fjerne en rest. Løsningen ble dialysert mot destillert vann og det oppnådde presipitat ble samlet ved hjelp av sentrifugering

(15.000 rpm, ti minutter).

B, Kutting med kollagenase.

Det således oppnådde presipitat ble oppløst i 800 ul av 10M urealøsning etterfulgt av tilsetning av 100 ul 2 00 mM kalsium-klorid, 200 ul 250 mM tris-hydrokloridbuffer (pH 7,4) og 900 ul kollagenaseløsning (fra Sigma Chemical Co.)

(1.500 u/ml). Etter inkubering i to timer ved 30°C, ble blandingen sentrifugert (15.000 rpm, fem minutter) for å samle supernatanten. Denne supernatant ble underkastet ionebytter-kromatografi (DEAE-Toyopear1 (fra Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.), løsningsmiddel: 25 mM tris-hydrokloridbuffer (pH 7,4)). Således ble en fraksjon inneholdende IGF-I med ekstra amino-

syrerester ved de aminoterminale ender (heretter betegnet "IGF-IP") samlet. C. Bestemmelse av den N-terminale enden av IGP-IP. Fraksjonen som inneholdt IGF-IP ble konsentrert og konsentratet ble underkastet høyeffektiv væskekromatografi (HPLC: RPSC (fra Beckman Co.), løsningsmiddelsystem: 0,1 % trifluoreddiksyre-10-65 % acetonitril med en lineær konsentrasjonsgradient). Det oppnådde rene IGF-IP ble underkastet peptidsekvensering (47OA Protein Sequencer (fra Applied Biosystems)), og det ble vist at fusjonsproteinet var blitt kuttet ved hjelp av kollagenase på det forventede sted. Den aminoterminale aminosyresekvensen til IGF-IP som således ble bekreftet er vist under.

EKSEMPEL 6

Ekspresjon av polyhedrin-XGF-I fusjonsprotein i silkeormer (Bombyx mori).

Silkeormer (Bombyx mori) fikk på den første dagen av det femte stadium, injisert perkutant en vIGF-IF086-suspensjon i en dose på 0,5 ml/hode (IO<7> pfu) og deretter ble de foret med morbær-blader ved 25°C i tre dager. Deretter ble en oppsamlingsnål innført i den abdominale appendiks og kroppsvæsken ble samlet i et isavkjølt Eppendorf-rør. Kroppsvæsken ble sentrifugert (15.000 rpm, ti minutter), og sedimentet ble oppløst i 200 ul 4 % SDS-10 % merkaptoetanol, og 2 ul av den oppnådde løsning ble anvendt som en prøve ved SDS-14 % akrylamidgelelektroforese. Et bånd som tilsvarer fusjonsproteinet viste seg på gelen etter elektroforese. Densiteten av båndet ble målt ved anvendelse av et densitometer og sammenlignet med densiteten av hver markør (hvert bånd inneholdende 1 ug protein). Det således estimerte utbytte var 5 mg/ml kroppsvæske.

(Molekylvektsbasert beregning indikerer at IGF-I kan gjenvin-nes i en mengde på 1 mg/ml etter separering av IGF-I fra dette fusjonsprotein.)

Ved SDS-14 % polyakrylamidgelelektroforese ga kroppsvæsken som var oppnådd fra de BmNPV-T3 stamme infiserte silkeormer et typisk bånd ved omkring 30 K tilsvarende polyhedralt protein, idet kroppsvæsken fra vIGF-IF086-infiserte silkeormer ikke ga noe bånd tilsvarende det polyhedrale protein, men viste et bånd ved omtrent 36 K som er karakteristisk for fusjonsproteinet og bestående av polyhedralt protein og IGF-I

(se fig. 7, hvori A er markører, B er kroppsvæske infisert med vIGF-IF086 og C er kroppsvæske infisert med BmNPV-T3) .

DNA-sekvensen til det syntetiske gen for IGF-I og til det syntetiske gen for IGF-II som anvendt i de ovennevnte eksempler er vist under sammen med den tilsvarende aminosyresekvens.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av heterologe proteiner som omfatter oppbygging av et rekombinant nukleært polyhedrosevirus som inneholder et heterologt strukturelt gen i den strukturelle gendelen av BmNPV som koder for et polyhedralt protein og propagering av det nevnte virus i Bombyx mori for dermed å fremstille det heterologe protein, karakterisert ved at det nevnte strukturelle gen for et heterologt protein binder til hele eller en del av det strukturelle gen som koder for et polyhedralt protein med eller uten innskudd av en linkerbasesekvens, og at det heterologe protein fremstilles som et fusjonsprotein bestående av det nevnte heterologe protein og hele eller en del av det polyhedrale protein bundet sammen med eller uten innskudd av en linkeraminosyre eller et linkerpeptid, idet fusjonsproteinet kuttes i linkersetet for å utvinne det heterologe protein.

2. Plasmid som inneholder en 5'-oppstrøms DNA-sekvens inkluderende promotordelen av polyhedringenet i BmNPV DNA, DNA-sekvensen til et strukturgen for et heterologt protein som eventuelt inkluderer en DNA-sekvens av terminatoren til det heterologe protein, og en 3'-nedstrøms DNA-sekvens inkluderende terminatordelen av polyhedringenet i BmNPV DNA, karakterisert ved at det nevnte strukturelle gen for et heterologt protein binder til hele eller en del av DNA-sekvensen til det strukturelle gen i BmNPV som koder for et polyhedralt protein, med eller uten en linkerbasesekvens.

3. Rekombinant Bombyx mori nukleært polyhedrosevirus (BmNPV) karakterisert ved at det inneholder et plasmid ifølge krav 2 og som kan uttrykke det heterologe protein.