JPH05500615A - ヒルジン及び新規のヒルジンの組換え製造方法 - Google Patents
ヒルジン及び新規のヒルジンの組換え製造方法Info
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- JPH05500615A JPH05500615A JP3506842A JP50684291A JPH05500615A JP H05500615 A JPH05500615 A JP H05500615A JP 3506842 A JP3506842 A JP 3506842A JP 50684291 A JP50684291 A JP 50684291A JP H05500615 A JPH05500615 A JP H05500615A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ヒルジン及び新規のヒルジンの組換え製造方法本発明は、ヒルHirudo m
edicinalisから最初に単離されたヒルジン(hi+odin)の製造
、並びにその誘導体の製造に関する。
最も一般的な抗血液凝固性ペプチドは、おそらくヒルジンファミリーに属するも
のである。薬効のあるヒルであるH4rudo medicinalisから最
初1こ単離されたヒルジンは、よく知られた且つ十分に特徴付けられたトロンビ
ンのポリペプチド阻害剤である1・2゜さらに詳細1こ!ヨ、それ(よイオン的
相互作用によってトロンビンと結合し、したがってフィブリノーゲンのフィブリ
ンへの切断、及びその後のフイブIJンー凝血形成を防止する。動物試験では、
ヒルジンEよ静脈血栓症、血管吻合閉塞、及びトロンビン誘発性散在性血管向凝
固症を防止する効能が示されている。さらに、ヒルジン(よ低毒性で、はとんど
又は全く抗原性を示さず、循環系からのクリアランス時間が非常に短い。
ヒルジンの3種類の天然変異体が公知である。HVIと呼(fれる第一の変異体
の配列は、Dodtら、FEBS 165(1984)180−184により決
定された。3文字コードによるHVIの配列(Eur、J、Biochem、1
38゜9−37.1984)を以下に示す:
Glu−Glu−Tyr−Leu−Gln。
03H
HV2と呼ばれル第二ノ変異体ハ、Dodtら、Biol。
Chem、Hoppe−3eyler 367(1986)803−811によ
って記載された。HV2は以下の点でHVIと異なる:
位置1のValの代わりにIle、位置2のValの代わりにThr、位置24
のGlnの代わりにL y s s位置33のAspの代わりにA、 s n
、位置35のGluの代わりにLys。
位置36のLysの代わりにG17.位置47のLysの代わりにAsn、位置
49のGlnの代わりにG l u %位置53のAspの代わりにAsn0
HV3と呼ばれる東三の変異体は、Ha r v e yら。
Proc、Na t 1. Acad、Sc i、USA (1986)108
4−4088により記載された。HV3は位置1から位置32まではHV2と同
じで、以下の点でHVIと異なる二位置33のAspの代わりにGin、位置3
5のGluの代わりにLys、位置36のLysの代わりにAsp、位置53の
Aspの代わりにG1n1位置58のGluの代わりにP r O、位置62の
Gluの代わりにAsp、位置63のT y r (S O3H)の代わりi:
Ala、位置64のLeuの代わりにAsp、及び位置65のGinの代わりに
Glu0ヒルジン及びヒルジン様ポリペプチドの製造のための新しいアプローチ
がここに創案された。このアプローチは、ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列の化学的合成、及び組換え体生物内でのヒルジン
又はヒルジン様ポリペプチドの発現を基礎とする。遺伝的に修飾された生物の培
養により、十分な生物学的活性を示す所望の物質が産生される。
したがって、本発明は、ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードするDN
A配列を包含する発現ベクターを提供する。
本発明はさみに、本発明の適合性発現ベクターで形質転換された宿主を提供し、
さらにヒルジン又はヒルレジン様ポ!ノペプチドをコードする合成りNAを提供
する。ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードするDNA断片は、−重鎖
であっても二本鎖でもよい。
ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが発現され得る宿主は、本発明の適合性発
現ベクターで宿主を形質転換することによって製造される。発現ベクターは、一
般に、以下のようにして製造する。
(a)ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードするDNAを化学的に合成
し;そして
(b)上記のDNAを発現ベクターに挿入するOヒルジン又はヒルジン様ポリペ
プチドはしたがって、ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが発現されるような
条件下に本発明の形質転換宿主を供給することによって製造される。欠に、ヒル
ジン又はヒルジン様ポリペプチドを単離する。この方法では、ヒルジン又はヒル
ジン様ポリペプチドは純粋形態で得られる。
本明細書中で用いられる「ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチド」という用語は
、その天然HVI、HV2、及びHV3形機能化、及び化学的修飾によるその誘
導体を指す。したがって本発明は、抗トロンビン活性を有するHVI、HV2、
又はHV3の誘導体にも適用し得る。
HVI、HV2、又はHV3のアミノ酸配列は、一つ又はそれ以上のアミノ酸の
置換、挿入及び/又は欠失により、及び/又は一方の末端又は各末端の伸長によ
って修飾し得る。このような修飾配列から成る誘導体は、もちろん依然として抗
トロンビン活性を示さねばならない。一般に、Hvl、Hv2、又はHV3のア
ミノ酸配列とその誘導体のアミノ酸配列との間には75%以上の程度の相同性が
認められる。相同性の程度は85%以上、又は95%以上でもあり得る。
例えば、HVl、Hv2、又はHV 3の配列の一つ又はそれ以上のアミノ酸残
基が置換又は欠失されるか、あるいは一つ又はそれ以上の付加的アミノ酸残基が
挿入され得る。元の配列の物理化学的特性、即ち電荷密度、疎水性/親水性、サ
イズ、及び配置に関しては保存される。1文字コードに基づく、考えられる置換
(Eur、J、Biochem、 138.9−37.1984)を以下に示す
:
Gの代わりにA及びその逆:
■の代わりにA、L、又はG;
にの代わりにR:
Sの代わりにT及びその逆:
Dの代わりにE及びその逆:並びに
Qの代わりにN及びその逆。
伸長に関する限り、50アミノ酸残基までの短い配列が一方又は各末端に付与さ
れ得る。その配列は、30個まで、例えば20個まで、又は10個までのアミノ
酸残基を有する。
ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドは、一つ又はそれ以上が翻訳後修飾、例え
ばグリコジル化、硫酸化、C00H−アミド化、アシル化、又はポリペプチド鎖
の化学的変化を受ける。
例えば、位11163のTyr残基が硫酸化され得る。本発明によって得られる
組換え体ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドは、天然HV1、Hv2、及びH
V3とは異なって、一般にこの位置では硫酸化されない。さらに、本発明はHV
I、HV2、又はHV3のN−末端又はC−末端部分を持たな0低分子量の誘導
体の産生にも適用し得る。
本発明は特に、HVI、及び、Hvlの最初の46残基その後の)(V2変異体
の47−65残基のアミノ酸配列から成るHVI誘導体の産生に適用し得る:
ハイブ’JッFHV1/HV2 (HVI2と呼ぶ):Gly−Ser−Asp
−Gly−Glu −Lys −As n−Gln−Cys−Val −Thr
−Gl y−Gl u−Gl y−sh r−
ここで、下線を施した配列は、HV2部分である。上記のようなポリペプチドH
V12及びその誘導体は、本発明の別の態様を成す。
ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドは、組換えDNA技術によって製造される
。ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードする合成遺伝子を製造する。D
NAコード配列は一般に、イントロンを含まない。合成遺伝子を、組換え物質の
産生を推進し得る発現ベクターに挿入する。合成遺伝子は一般に、全体的に所望
の遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによって製造さ
れる。次に、オリゴヌクレオチドを集めて遺伝子を得る。
したがって、遺伝子は、4つの化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築
され、各々のオリゴヌクレオチドは二本鎖DNA遺伝子の一本鎖の約半分を表わ
す。オリゴヌクレオチドを連結し、アニーリングして、所望の遺伝子を生成する
。所望により、一つ又はそれ以上のコドン変化を導入するために部位特異的突然
変異誘発によって遺伝子配列を修飾してもよい。一般に、その後の操作を容易に
するために、各末端に制限部位をもつ遺伝子を作製する。
HVIをコードする好ましいDNA配列を、添付の図面の図1に示す。HVI2
をコードする好ましいDNAは、図3に示す。いずれの配列も、誘導体をコード
するために修飾し得る。
さらにリーダーペプチドをコードするDNA配列が提供される。リーダーペプチ
ドは、ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが発現さるべき細胞からのヒルジン
又はヒルジン様ポリペプチドの分泌を指示(direct) シ得る。リーダー
ペプチドをコードする配列は一般に、ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコ
ードするDNA配列の5′ −末端に融合される。
リーダーペプチドは、大腸菌(E、coli)のような細菌宿主中での発現の場
合には、好ましくはOmpAリーダーペプチドである。リーダーペプチドは、昆
虫細胞中での発現の場合には、好ましくは##;水庖性ロ内炎ウィつスG蛋白質
(VSV G蛋白質)のリーダーペプチドである。OmpA及びVSV G蛋白
質リーダー配列をコードする適切なりNA配列を、それぞれ図5及び8に示す。
ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドを放出するために切断可能な融合蛋白質を
コードするDNA配列が提供され得る。切断可能な結合を介してヒルジン又はヒ
ルジン様ポリペプチドのN−末端に融合されるキャリヤーポリペプチド配列をコ
ードするDNA配列を用い得る。切断可能な結合は、臭化シアンによって切断可
能なものであってもよい。
ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドの発現のために、ヒルジン又はヒルジン様
ポリペプチドをコードするDNA配列を含み、且つ、好適な宿主中に移入された
場合にヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドを発現し得る発現ベクターを作製す
る。
DNA配列のためのプロモーター、転写終結部位、翻訳開始コドン、及び翻訳停
止コドンを包含する適切な転写及び翻訳制御因子が提供される。DNA配列は、
ベクターと適合する宿主中でポリペプチドの発現を起こさせるような正しいフレ
ーム内に導入される。
発現ベクターは一般に、複製起点、及び所望により抗生物質耐性遺伝子のような
選択可能なマーカー遺伝子を包含する。プロモーターは、操作可能なように(o
pe11h17)ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードするDNA配列
に結合する。発現ベクターはプラスミドであり得る。その場合、好ましくはP
及びPlee/lieプロモーターから選択されるプロモータap
−は、操作可能なようにDNA配列に結合される。あるいは、発現ベクターはウ
ィルスであってもよい。ウィルスは組換えバキュロウィルスであり得、この場合
には、ポリヘトリン[po17hed+in)プロモーターが、操作可能なよう
にヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードするDNA配列に結合される。
ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドを発現できる発現ベクターは、任意の便利
な方法で製造され邊る。ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードするDN
A断片を発現ベクター、例えばプラスミドベクターの適切な制限部位に挿入する
。組換えバキュロウィルスは、以下のようにして製造し得る:(i)ヒルジン又
はヒルジン様ポリペプチドをコードする遺伝子を、ポリへドリンプロモーターの
下流の制限部位でバキュロウィルス転移ベクター中にクローニングし:そして(
11)工程(i)からの組換え転移ベクター及び無傷の野生型バキュロウィルス
DNAを用いてバキュロウィルス感染し易い昆虫細胞を同時トランスフェクショ
ンする。
相同的組換えが起こり、その結果、ポリへドリンプロモーターの下流にヒルジン
遺伝子、又はヒルジン様ポリペプチドをコードする遺伝子を有する組換えバキュ
ロウィルスが生じる。バキュロウィルス転移ベクターは、ポリヘトリンATG開
始コドンの下流に非反復性クローニング部位を有するベクターであり得る。得ら
れる組換えバキュロウィルスによって発現される物質は、ポリヘトリン蛋白質の
N−末端部分がヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドのN−末端に融合した融合
蛋白質である。
上記のように、切断可能な結合は、融合連接部に導入される。
工程(11)で用いる昆虫細胞は、一般に5podoptera frugip
erda細胞である。野生型バキュロウィルスは、一般にAutographa
ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードする発現ベクターは、適切な宿主
中に導入される。細胞をヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードする遺伝
子で形質転換する。形質転換宿主は、ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが発
現されるような条件下に供給される。例えば形質転換細胞を、発現を起こさせる
ために培養する。任意の適合性宿主−ベクター系を用いることができる。
形質転換宿主は、原核又は真核宿主である。細菌又は酵母菌宿主、例えばE、c
oli又はS、cerevisiaeを用いてもよい、グラム陽性細菌を用いて
もよい。好ましい細菌宿主はE、coli B型株である。あるいは、昆虫細胞
を用いてもよいが、この場合、バキュロウィルス発現系が適切である。昆虫細胞
は一般に、5pod、opteraf rugiperda−細胞である。さら
にそれに代わるものとしては、哺乳類細胞系の細胞を形質転換してもよい。ヒル
ジン又はヒルジン様ポリペプチドを産生ずるトランスジェニック動物(例えばヒ
ト以外の哺乳類)が提供される。発現されるヒルジン又はヒルジン様ポリペプチ
ドを単離し、精製する。
本発明にしたがって製造されるヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドは、医薬上
許容可能な担体又は賦形剤とともに医薬処方物中に用い得る。このような処方物
は一般に、静脈内投与用である(この場合、担体は一般に許容可能な純度の滅菌
食塩水又は水である)。本発明にしたがって製造されるヒルジン又はヒルジン様
ポリペプチドは抗トロンビン活性をもち、一般にヒト患者における血栓塞栓性症
状、例えば血液凝固の治療に適している。本発明の一つの実施態様において、ヒ
ルジン又はヒルジン様ポリペプチドを、プラスミノーゲン活性化因子、例えば組
織プラスミノーゲン活性化因子と一緒に同時投与する。本発明にしたがって製造
されるヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドは、後者、即ち組織プラスミノーゲ
ン活性化因子と適合性であることが判明している。
以下の実施例で本発明をさらに説明する。
添付の図面の説明:
図1は、ヒルジンf(Vl鎖の大部分をコードする4つのオリゴヌクレオチドの
ヌクレオチド配列を示す。下線を施した配列は、さらなる作製のために用いたB
a11部位を示す。図の下方部は、4つのオリゴヌクレオチドの組立て形式を示
す。
Hindllr及びPstI部位は、その後の操作を可能にするために含入され
た。
図2は、中間プラスミドM13−HV1の作製の模式図であって、これはさらな
る全作製物ためのBalI−BamHI DNA断片の供給源である。
図3は、ヒルジンHV12鎖の大部分をコードする4つのオリゴヌクレオチドの
ヌクレオチド配列を示す。下線を施した配列は、さらなる作製のために用いたB
a11部位を示す。図の下方部は、4つのオリゴヌクレオチドの組立て形式を示
す。
HindIII及びPst1部位は、その後の操作を可能にするために含入され
た。
図4は、中間プラスミドM13−HV12の作製の模式図であって、これはさら
なる全作製物ためのBall−BamHI DNA断片の供給源である。
図5は、それぞれOm p Aリーダーペプチドと結合する完全HVI遺伝子及
び完全HV12遺伝子を保有する、OMP−HVI及びOMP−HVI 2と呼
ばれる新規の組換え体M13の作製を模式的に示す。リーダーペプチド配列には
二重下線を施し、一方Ba1I平滑末端及びHindllI付着末端は一重下線
を施しである。
図6は、E、coli中でのHvl及びHV12fJm生(Dt=めに用いるプ
ラスミドであるpFC−HVI及びpFC−HVl2の作製を模式的に示す。
図7は、E、coli中でのヒルジンの産生のため1こ用−するプラスミドpO
MP−HVIの一般構造を示す。我々【よ、伝統的な遺伝子操作技術を用いてこ
の新規のプラスミドを製造したが、この場合、ヒルジン遺伝子は)1イブリツド
プロモーターP1pp/IAcの転写制御下に置かれる。この場合でさえ、Om
pAリーダーペプチドはE、coliのペリプラズム(periplxsm)へ
のヒルジンの分泌を推進する0図8は、ヌクレオチド配列、及び昆虫細胞からの
ヒルジンの分泌のために用いる合成オリゴヌクレオチドの組み立てを示す。
下線を施した配列はVSV G蛋白質リーダーペプチドを示す。
図9は、VSV−HVl2と呼ばれる新規の組換え体M13の作製の模式図であ
って、この場合、完全遺伝子はvSvG蛋白質リーダーペプチドと結合される。
図10は、バキュロウィルスゲノムへの転移ベクターとして用いたpAc−HV
l2の作製を模式的に示す。p A c Y M 1は、該ウィルスに転移され
る異種配列の受容体として広く用(1られる出発プラスミドである。
図11は、ヒルジン鎖のはじめの部分をコードするヌクレオチド配列及び合成オ
リゴヌクレオチドの組み立てを示す。付加的メチオニン残基をコードするATG
コドンには下線を施している。
図12は、細胞内ヒルジン発現のために用いたpAcFTlの作製を模式的に示
す。
図13は、それぞれ、ポリヘトリンの最初の18個のアミノ酸と結合する完全H
VI及びHVl2を保有する、pAcFTl−HVI及びpAcFTl−HVl
2と呼ばれる新規)転移プラスミドの模式図である。これらのプラスミドは、バ
キュロウィルスゲノムに異種配列を転移するために用いられた。
実施例1:HVl及びHV12遺伝子の化学的合成Escherichia c
oliの好ましいコドンを基礎にして、ヌクレオチドコード配列を設計した4゜
さらに、異なる発現ベクター中にそのコード配列を挿入させるために、合成遺伝
子の5°末端のごく近くにBa1l制限部位を作り出した。
実際、細菌細胞及び昆虫細胞における発現のために、同一合成遺伝子を用いた。
昆虫細胞の場合、分泌生成物又は細胞生成物を生じさせる方法を開発した。
プラスミドDNA操作はすべて、Maniatls2が記載したように実施した
。
Hv1遺伝子を以下のように合成し1組み立てた0自動DNA合成機(Appl
ied Biosystems)を用いて4つの合成相補的オリゴヌクレオチド
を製造した。その配列を図1に示す。酵素的燐酸化後、4つのオリゴ体をDNA
リガーゼを用いて組み立て、その結果生じた二本鎖配列をM13ファージベクタ
ーmp18に挿入して、図2Iこ示す組換えプラスミドM13−HV1を得た。
ヒルジン遺伝子をM13ベクターに挿入させるために、さらにHindl I
夏及びPstI部位を合成オリゴ体に付加した。正しいヌクレオチド配列は、−
重鎖ファージDNAで実施するSange r法6によって立証された。
組換えプラスミドM13−HVIは、実施例で用いる全発現ベクター用のHVl
遺伝子の供給源として用いた。
同様の方法でHV12遺伝子を合成し、組み立てた。遺伝子を組み立てるために
用いたオリゴ体を、図3に示す。オリゴ体3及び4は図1のオリゴ体3及び4と
は異なるアミノ酸をコードする。図3に示す組換えプラスミドM13−HV12
を得た。
蛋白質形態のHVl及びHV12分子を合成する必要がある。
さらに、効率のよい分泌に寄与する「リーダーペプチドコと呼ばれるアミノ酸配
列が、Hvl又はHVl2のN H2末端に存7.8
在しなければ成らない 。次に、このエキストラ配列(extrs分泌系の多数
の例が文献に記載されている10“1.1゜それらの中で、発表済みのE、co
liの外膜タンパク質[OuterMembrane Protein of
E、coli(OmpA)]の分泌シグナルに基づいて、系を選択した。したが
って、メツセンジャーR,N Aの効率のよい翻訳に寄与することが知られてい
るOmpA Shine−Dalgarn。
配列によって先行されるO m p Aリーダーペプチドをコードする2つの付
加的な相補的オリゴヌクレオチドを設計した13゜図5に示すその配列は、最初
の10個のアミノ酸をコードするHV1遺伝子の開始部分をも含む。Ba11部
位の存在によりこの合成片と残りのHVIコード配列とが結合し、一方上流Hi
ndIr[部位の存在によってM13ベクターとの結合が可能になった。したが
って、合EHindIrl−Ball断片をML3−)(VlからのBa l
T−BamHI片とを連結し、ML 3mp 18に挿入して、OMP−HVI
と呼ばれる新規のプラスミドを得た。この新規のプラスミド作製の模式図も、図
5に示す。同様の操作をML3−HVl2から開始して、OMP−HVl2を得
た(図5)。
OMP−HVlから、後にヒルジンコード配列が続いて含む、OmpA Shi
ne−Dalgarno及びリーダーペプチドをコードするHindI r r
−BamH1断片として切り出すことができる。この制限断片は、目下、適切な
発現ベクター中への挿入のために用いられる。細菌中で異種蛋白質を高レベルに
産生ずるために、理論的には、いくつかの発現系を用い得モーターの場合でも、
指定ポリペプチドの発現レベルは予測できない。ヒルジンの発現のためのプロモ
ーターP の使用は、ap
今日まで報告されていない。
図6に示すプラスミドpFC33は、文献にすでに記載されている13゜それは
抗生物質アンピシリンに対する耐性、及びプロアポリポ蛋白iA1の発現を推進
する細菌プロモーターPlrpを保有する。HindlII及びB a m H
TでpFC33を消化した後、抗生物賀耐性遺伝子及びプロモーターを保有する
大きなHindr I I−BamHI断片を単離して、ヒルジンHV1又はヒ
ルジン誘導体HV 12をコードするOMP−HVI又ハOM P −HV 1
2からのHindlII−BamHI′lfr片に結合する。この作製の詳細は
図6に示す。本発明者らは、pFC−HVI及びpFC−HVl2と呼ばレル新
規のプラスミドを単離したが、これはE、coli中でのHVl及びHV 12
の産生のための最終プラスミドである。
本発明の主な目的は、ヒルジン及びその誘導体の発現及びペリプラズムへの分泌
のためのE、coliのB型株の使用である。実際、細菌E、coliのB型株
中にプラスミドpFC−HVIを挿入すると高レベルのヒルジン産生が引き起こ
されることを〆見出した。興味深いことに、異なる株型のE、coliは、効率
よくは住僧せず、したがってヒルジンを首尾よく産生ずるには宿主株型が決定的
であると考えられる。
E、coljのいくつかのB型株が有用であって、ヒルジン又はヒルジン様ポリ
ペプチドの産生に用い得る。好ましい株は、ATCC12407、ATCC11
303、NCTC10537である。以下に、プラスミドp F C−HV 1
にょるNCTC10537の形質転換、及びその後の形質転換体の培養の例を示
す。
4シ
NCTC10537株のコピテント細胞を、MandelとH4ga”の塩化カ
ルシウム法を用いて調製した。1ミリリツトル当たり1x109細胞の約200
μmのこれらの細胞調製物を2μlのプラスミドDNA (濃度約5μg/ml
)で形質転換した。形質転換体を、100μg / m lアンピシリンを含有
するし一寒天平板上で選択した。同一抗生物質を含有するし一寒天上に、木製つ
まようじで2つの小コロニーの筋を付けた(各々、約1cmの長さの3本の筋)
。37℃で12時間インキュベーションした後、10m1のLB培地(150μ
g/mlの濃度でアンピシリンを含有する)上に接種し、37℃で一晩インキユ
ベートすることによって、ヒルジン産生に関して筋の部分を試験した。翌日、培
養物を、同濃度のアンピシリンを含有するM9培地中で1 + 100に希釈し
て、37℃で6時間インキュベートした。
20m1のこのような培養物を12000xgで、4℃で10分間遠心分離した
。細菌ペレットを、2mlの33mMHClトリスpH8、等容量の33mM
EDTAの二次溶液中に再懸濁し、次に40%ショ糖を加えて、軽く振盪しなが
ら37℃で10分間、全混合液をインキュベートした。遠心分離後、透過した細
胞(permexbili!ed eell+)を2mlの冷水中に再懸濁して
、水中に10分間放置した。その結果生じた上澄を遠心分離して単離したが、こ
れは細菌細胞のペリプラズム画分を示す。
合成基質S−2238を切断する紳トロンビンの能力の阻害を基礎にした発色ア
ッセイを用いてヘヒルジン産生細胞のペリプラズム画分中の抗トロンビン活性の
存在を測定した。これらの試料においては、ヒルジン活性は約50μg / m
Iのレベルで認められた。この活性は、対照ペリプラズム画分中には存在しな
かった。pFC−HVl2の場合、ヒルジン変異体HV12の生産性は80μg
/ m +に相当するものであった。
同様のアプローチを泪いて、ヒルジン用の新規の発現/分泌プラスミドを作製し
たが、この場合、プロモーター16がプロモーターPlrpの代わりに存在する
。
Plt19/Itc
pOMP−HVlと呼ばれるこの異なるプラスミドを図7に示す。このプラスミ
ドをE、coli B型株に挿入後にも、高レベルの活性ヒルジンが得られた(
40〜80μg/ml)。
pOMP−HVI〆の作製のための出発プラスミドとして、Ghraybらが記
載したプラスミドpIN−111−ompA3を用いた。イソプロピル−β−D
−チオガラクトピラノシド(IPTG)を用いた培養及び発現の誘発のための条
件は、過去に記載されている16゜
実施例3:E、coliから得られた組換えHVIの抗血液凝固活性
ヒルジン変異体HVIの抗血液凝固活性を、活性化部分トロンボプラスチン時間
(aPTT)試験及びトロンビン時間(T、T、)試験でも調べた。両試験は、
自動凝固計(ACL300 Re5earch、Instrumentatio
nLaboratory、Milan、Italy)を用0て行った0
クエン酸処理した正常ヒト血漿に漸増濃度の、組換え法で産生じたヒルジンHV
Iを添加した。次;こ、適切な試薬を血漿に自動的に添加し、凝血の形成速度を
記録すること(こよって、aPTT及びT、T、の測定を可能!こする自動凝固
計を用(1て試料をアッセイした。aPTTは、セファリン及び塩化カルシウム
を用いて測定しく自動化aPTT試薬、GeneralDiagnostic、
USA)、T、T、+よ5 I U / m 1の濃度のヒトトロンビン(Fi
brindex、0rth。
Diagnostic、Milan、Italy)を用(1て測定した。メーカ
ーの指示に従って試薬を調製し、保存し、使用した。
a P T T及びT、T、試験で得られた凝血時間を組換え蛋白質の濃度に対
してプロットした。各試験にお(1て、正常血漿番二対して凝血時間を2倍にす
る濃度を計算した。
aPTT試験に関して得られた値は210ng/mlであり、一方T、T、試験
に関しては、その値は90ng/mlであつた。
実施例4:昆虫細胞からのHVl2の発現及び分泌組換え昆虫細胞からHVl2
を分泌させるために、本発明者らは、HV12コード配列を、これらの細胞によ
って効率よく認識されるリーダーペプチドに結合した。水痘性口内炎ウィルス(
VSV)G蛋白質のリーダーペプチドを用いた17゜昆虫細胞におけるヒルジン
又はその誘導体の産生のためのこのような配列の使用は、今日まで報告されてい
ない。上記のものと同様に、後にHV12遺伝子の最初の部分が続いて含む、v
SvG蛋白質リーダーペプチドをコードする合成りNA配列を調製したが、その
ヌクレオチド配列を図8に示す。この場合も、残りのHV12遺伝子に、及び発
現ベクターに結合させるのに便利な制限部位(HindrlI、BamHI及び
Ba1I)を導入した。
合成HindI I T−BalI断片を、HV12遺伝子を保有するM13−
HVl2からの精製Ba l I−BamHT断片に結合させ、予めHindl
lI及びBamHIで切断したM 13 m p 181.::挿入した。VS
V−HVl2と呼ばレルl’rfflのプラスミドを生産するこの作製手順を図
9に模式的に示す。
VSV−HVI2から、VSvリーダーペプチドと融合したH−V 12遺伝子
を保有するBamHI−BamHI DNA断片を切り出し、これを図10に示
すようにベクターpAcYM3−18に挿入1.た。その結果生じたプラスミド
は、pAc−HVI2と命名した。
昆虫細胞中で発現を起こすためには、VSV−HV12コード配列を、ポリへド
リンプロモーターの転写制御下でバキュロウィルスゲノムに転移しなければなら
ない。このために、昆虫細胞を野生型バキュロウィルスDNA、及び転移ベクタ
ーp A c −HV 12で同時トランスフェクションした。昆虫細胞として
、5podoptera frugiperda細胞を宿主として選択した。実
験の詳細を以下に示す:載した方法の改良法を用いて、感染性AcNPV DN
Aと個々の組換え体転移ベクターを表わすプラスミドDNAとの混合物でトラン
スフェクションした。1マイクログラムのウィルスDNAを25〜100μgの
プラスミドDNAと混合し、20mM HEPES緩衝液、pH7,5,1mM
オルト燐酸水素二ナトリウム、5mM塩化カリウム、140mM塩化ナトリウム
、及び10mMグルコース(総容量1m1)の存在下で、0.125M塩化カル
シウムで沈殿させた。(濃度はいずれも呼
麓濃度である。)
frugiperda細胞上に接種し、室温で1時間該細胞に吸着させ、次いで
1mlの培地と置換した。28℃で3日間インキュベージランした後、上澄み液
を取り出し、S。
frugiperda細胞単層中にプラークを生成するために用いた。組換えウ
ィルスを含有するプラークは、光学顕微鏡でのようなプラークからウィルスを回
収し、さらにプラークを精製した後、ポリへドリンー陰性ウィルスストックを作
るために用いた。
上記の手順により、ポリへドリンプロモーター及びVSvG蛋白質リーダーペプ
チドの制御下でゲノムがHV12遺伝子を保育する組換えバキュロウィルスを単
離することができた。本発明者らは、十分確立された手法19によって、いた。
次に、感染細胞を、発表済みの方法19にしたがって、10%ウシ胎仔血清の存
在下で、回転培養中、又は単層中で培養した。感染後の種々の時間に、S−22
38発色アッセイを用いて上澄み液中て抗トロンビン活性(ATU)を測定した
。
結果を、以下の表に要約する:
表:ヒルジン活性
ATU/106細胞
回転培養 0.8 0.9 1.4 1.8単層 0.8 0.8 2.0 5
.1の細胞質中でも産生され、蓄積される。このアプローチは一般に、それが非
分泌性ウィルス蛋白質であるポリヘトリンの発現シグナルを利用するため、異種
蛋白質を良好な収量で産生ずる。
大量の組換えHVI及びHVI2を生成するためのアプローチは、融合ポリペプ
チドの発現に基づいているが、この場合、ポリヘトリンの最初の18個のアミノ
酸をフレーム内でHV 1又はHVI2の65個のアミノ酸と結合させる。ポリ
ヘトリンのNH2末端配列の存在によって、高レベルの発現が可能になる20゜
さらに、ポリヘトリン部分とHVI又はHV12配列との間に、本発明者らは、
CNB rを用いてハイブリッド蛋白質を処理することによってHV 1又はH
V12部分を分離させるメチオニン残基を置いた。
従来のアプローチと同様に、M2S−HVI又はM2S−HVI2からのBa
l I−BamHI断片を適切な転移ベクターに結合させ得る合成りNA断片を
調製した。図11に示す新規の合成片は、その後の操作のために、BamHI及
びBalI部位をも含む。
ポリヘトリンの最初の18個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を保有す
る別の転移ベクターpAcFT1が得られた(図12)。要するに、pAcYM
1’のEcoRV−BamHI断片を、ヌクレオチド−92〜ヌクレオチド+5
5のポリヘトリン遺伝子配列を含有する合成オリゴヌクレオチドと置き換えた。
この配列の後に便利なりamHI部位が存在し図13に示した模式図にしたがっ
て完全HV1又はHV12コード配列を挿入するためにBamHI部位出−を用
いた。この作製を通じて、pAcFTl−HVI及びpAcFTl−HVl2と
呼ばれる2つの新規のプラスミドを得たが、これはハイフリット遺伝子をバキュ
ロウィルスゲノムに転移するのに用いた。
実施例4に記載のようにして、組換えバキュロウィルスを得た。S、frugi
perda細胞の感染は、標準手法19にしたがって実施した。感染昆虫細胞を
培養すると、融合蛋白質の細胞質蓄積が生じる。このハイブリッド蛋白質は、組
換えHVl又はHVl2の供給源であつた。そのハイブリッドをCNB rで開
裂するために用い得るいくつかの方法が、文献から利用できる 。O]sonら
22の方法を用いて、正確な21.22
ポリペプチド配列のHVI及びHVl2を得ることができた。
これら2つの分子は、抗トロンビン活性を示した。
下記の文献は明細書中に引用されたものであるニア) Blobeユ G、an
d Dobberstain B、1975. J、Ce1l B工ology
、旦ヱ。
15) Kr5tenansky、 J、に、、 and Mao、 S、J、
T、 1987. FEBS Lett、 211゜D、H,L、 1987.
J、 Gen、 Virol、 68. p、 123319) Summe
rs、M、D、、and Sm1th、G、E、1987. Texas Ag
ricuユturalPeptides、!、P、301
オリゴ1 融合
S’ GATC[ATGG’rTT[TTACACCGAffGCACCGAA
TCTGG 3’オリゴ 2融合
組み立て
Hト一
要 約
調ンビン活性をもつヒルジン又はヒルジン様ポリペプチド発現される。ヒルジン
様ポリペプチドは、好ましくは、次のアミノ酸配列をもつ、HVI及びHV2か
らのハイブリッド蛋白質である:
H′v12:
Va l −Va l −Tyr−Thr−Asp−Cys−Thr−Glu−
5sr−Gly−Gin−Asn−TAu−Cys−Leu|
Cys−Glu−Gly−5er−Asn−Va 1−Cys−Gly−Gln
−Gly−Asn−Lys−Cys−工1e−Leu−Gly−5er−Asp
−Gly−Glu−Lys−人5n−Gln−Cys−Val−Thr−Gly
−Glu−Gly−Thr−(ここで、下線を施した配列はHV2部分である)
。
国際調査報告
PcrmPC丁Its^、7101111+191・Il饗−11M言1w+1
211.Pk12Bαシ11国際調査報告
EP 9100643
S^ 46239
Claims (25)
- 1.ヒルジン又はヒルジン機ポリペプチドをコードするDNA配列を含む発現ベ クター。
- 2.ベクターがプラスミドである請求項1記載のベクター。
- 3.Ptrp及びPlpp/lacプロモーターから選択されるプロモーターが 、操作可能なように前記DNA配列に結合されている請求項2記載のベクター。
- 4.ベクターがウイルスである請求項1記載のベクター。
- 5.ウイルスが、ポリヘドリンプロモーターが、操作可能なように前記DNA配 列に結合されている組換えバキュロウイルスである請求項4記載のベクター。
- 6.前記DNAがさらに、前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが発現され る細胞からの前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドの分泌を指示し得るリー ダーペプチドをコードする請求項1〜5のいずれか一項に記載のベクター。
- 7.リーダーペプチドがOmpA又はVSV G蛋白質リーダーペプチドである 請求項6記載のベクター。
- 8.前記DNA配列が、前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドを放出させる ために切断可能である融合蛋白質をコードし ている請求項1〜5のいずれか一項に記載のベクター。
- 9.請求項5による場合、前記融合蛋白質が、切断可能な結合2を介してヒルジ ン又はヒルジン様ポリペプチドのN−末端と融合するポリヘドリン蛋白質のN− 末端部分を含む請求項8記載のベクター。
- 10.前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが、【配列があります】 (ここで、下線を施し た配列はHV2部分である)である請求項1〜9のいずれか一項に記載の発現ベ クター。
- 11.請求項1〜10のいずれか一項に記載の適合可能な発現ベクターで形質転 換された宿主。
- 12.宿主が細菌である請求項11記載の宿主。
- 13.宿主がE.coli B型株である請求項12記載の宿主。
- 14.宿主が酵母菌、哺乳類細胞系、昆虫細胞系及び動物から選択される真核宿 主である請求項11記載の宿主。
- 15.宿主がSpodoptera frugiperda細胞系である請求項 14記載の宿主。
- 16.ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードする合成DNA。
- 17.前記DNAがさらに、前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが発現さ れる細胞からの前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドの分泌を指示し得るリ ーダーペプチドをコードする請求項16記載のDNA。
- 18.リーダーペプチドがOmpA又はVSV G蛋白質リーダーペプチドであ る請求項17記載のDNA。
- 19.前記DNA配列が、前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドを放出させ るために切断可能である融合蛋白質をコードする請求項16記載のDNA。
- 20.前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが、請求項10に記載のHV1 又はHV12である請求項16〜19のいずれか一項に記載のDNA。
- 21.ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが発現されるような条件下に請求項 11〜15のいずれか一項に記載の宿主を供給することを包含する、ヒルジン又 はヒルジン様ポリペプチドの製造方法。
- 22.請求項1〜10のいずれか一項に記載の適合可能な発現ベクターで宿主を 形質転換することを包含する、ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドを発現する ことが可能な宿主の製造方法。
- 23.前記発現ベクターを、 (a)前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードするDNAを化学的に 合成すること、及び、(b)前記DNAを発現ベクター中に挿入することによっ て製造する請求項22記載の方法。
- 24.請求項10に記載のポリペプチドHV12又はその誘導体。
- 25.医薬上許容可能な担体又は希釈剤、及び、活性成分としての請求項21に 記載の方法によって生成されたヒルジン又はヒルジン様ポリペプチド又は請求項 24に記載のポリペプチドを含有する医薬組成物。
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