JP2930984B2 - Ｅ．Ｃｏｌｉからの異種蛋白質の排泄 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、E.Coli（Escherichia Coli.）に適用さ
れる遺伝工学の技術に関する。より詳細には、細胞が培
養された培地中に異種蛋白質を排出する、遺伝子操作さ
れたE.Coli細胞に関する。

〔発明の背景〕

E.Coliを包む内膜を通過し、周辺質として知られてい
る内膜および外膜間の空間に異種蛋白質を生産するE.Co
liの技術は、現在確かに確立されている。その蛋白質
が、E.Coli認識ペプチドまたはそのＮ末端に結合された
「シグナルペプチド」を有する融合蛋白（fusion prote
in）として発現されるとき、その所望の蛋白質は周辺質
の中へ分泌される（ジェネンテック社のEP 177,314号参
照）。幾つかのそのようなシグナルペプチドが、現在、
アミノ酸配列およびDNA配列によって同定されている（W
atson,M.Nucleic Acids Resarch,Vol 12,No.13,1984,p
p.5145−5164参照）。また、これらのシグナルペプチド
を用いることによって、異種蛋白質をE.Coliの周辺質中
に誘導することに成功している（下記文献参照）。

・Oka等;Proc,Natl.Acad.Sci.USA,82,pp7212−7216,Nov
ember1985 この中では、成熟EGFをE.Coliの周辺質中に誘導する
ために、ヒト表皮性成長因子（hEGF）がE.Coliアルカリ
フォスフォターゼのシグナルペプチドと融合されてい
る。

・Hsiung等;Biotechnology,Vol 4,November 1986,pp 99
1−995 ここでは、E.Coliの外膜蛋白質Ａ（ompA）のシグナル
蛋白質を使用して、ヒト成長ホルモンがE.Coliの周辺質
中へ誘導されている。

周辺質中の蛋白質は、しばしば「分泌された（secret
ed）」と述べられる。しかし、それらは外膜によって細
胞内に含まれており、培地中では入手できないから、外
膜を一旦崩壊するか或いは透過性にすることによって、
周辺質成分を放出させなければ回収できないことを理解
しなければならない。

蛋白質回収工程を容易にするために、蛋白質を生産す
るE.Coli宿主を培養している間に、培地中に蛋白質を蓄
積させることが好ましい。なぜなら、比較的汚染を少な
くし且つその細胞性の供給源を傷付けることなく、当該
蛋白質を回収することができるからである。蛋白質を培
地中に排泄するシステムを開発するために、様々な試み
が成されている。そのシステムのすべては、外膜障壁の
一体性を克服するための幾つかの方策を含んでいる。

一つの手段は、一般にE.Coliの遺伝子操作を含んでい
る。この遺伝子操作は、外膜の一体性に影響を与えてこ
れを透過性または「漏出性（leaky）」するような溶原
蛋白質と一緒に、所望の蛋白質を分泌可能な形（シグナ
ルペプチドを持つ）で共に発現させるためのものである
（下記文献参照）。

・米国特許第4,595,658号 このなかでは、透過化剤としてfIファージの遺伝子II
I生産物が透過剤として使用される。

・Kobayashiら;J,Bacteriol,June 1986,pp 728−732 このなかでは、陰性キル（kil）蛋白質の活性化が用
いられる。

・EP 140,864号 この中では、温度感受性溶原菌が使用される。

これらの方法においては、宿主生存度を維持するため
に、溶原性生産物の発現を注意深う調節することが必要
とされる。さらに、共発現は本質的に宿主にとってエネ
ルギーの浪費となり得るので、所望の蛋白質の収率が低
下し、また宿主細胞バイオマスが減少することになる。

別の手段では、所望の蛋白質はミメラな蛋白質として
発現される。この場合、所望の蛋白質はキャリアー蛋白
質に融合される。典型的に使用されるキャリアー蛋白質
は、天然で生産されるE.Coli蛋白質、またはそれらの断
片である。これらのE.Coli蛋白質は排泄され得るもの
（溶血素）、または外膜に結合されるもの束縛されるも
の（ompF）である。例えばマックマン（Mackman）ら
は、溶血素のＣ−末端蛋白質と融合したとき、opmFはそ
のシグナルペプチドなしで、E.Coliの膜を通過した培地
中に引きずり出され得ることを見出だした（EMBO J.Vol
6,No.9,pp.2385−2841,1987）。ナガハリ（Ngahari）
らは、ヒトβ−エンドロフィンが、E.ColiompF蛋白質の
少なくとも一つの蛋白質と融合したときに培地中に放出
されることを見出だした（EMBO J.Vol 4,No.13A,pp.358
9−3592,1985）。しかしながら、そのような技術により
製造された蛋白質を回収するために、所望の蛋白質はキ
ャリアー蛋白質から切断されなければならず、これは単
離を困難にする。

さらに別の手段では、その外膜の一体性が遺伝子レベ
ルで弱められたE.Coli菌株が使用される。そのような菌
株は「漏出性」の宿主として知られ、周辺質の蛋白質を
維持することができない。実際には、環境条件の厳重な
調節なしにこれらの菌株を生存条件に維持することは困
難である。

この発明の一つの目的は、異種蛋白質を生産するE.Co
liが成長している培地中に、該異種蛋白質を排出できる
ようにする方法を提供することである。

この発明の一つの目的は、DNAベクターであって、そ
の上でコードされた異種蛋白質をE.Coliから排出するこ
とを可能とするDNAベクターを提供することである。

この発明の更なる目的は、E.Coli菌株が培養される培
地に排出される所望の異種蛋白質を表現するために遺伝
手術されたE.Coli菌株を提供することである。

この発明の全体にわたる目的は、E.Coliにより生産さ
れる異種蛋白質をE.Coliの培地中に蓄積できるようにす
ることにより、該異種蛋白質の回収を容易にすることで
ある。

〔発明の概要〕

今や、E.Coli宿主からの異種蛋白質の排泄が、一貫し
て且つ広範囲の異種蛋白質のために達成され得ることが
見出だされた。しかも、この異種蛋白質の排出は、キャ
リアー蛋白質または膜透過剤からの援助なしに、且つ外
膜が不完全な変異菌株ではなく健康な（healthy）宿主
を使用することによって目的を達成できることが見出だ
された。さらに、以下に述べるDNAベクターから発現さ
れた異種蛋白質は培地中に直接排泄され、比較的に高い
収率で回収できることを見出だされた。

この発明の一つの見地に従えば、異種蛋白質のE.Coli
からの排出を得ることに役立つ組換えDNA構造が提供さ
れる。この組換えDNA構造は、 コーディング領域であって、該領域内では異質蛋白質
をコードするDNAが、リーディングフレーム中におい
て、前記蛋白質の周辺質からの排泄を可能とするompAシ
グナルペプチドをコードするDNAと結合されているコー
ディング領域と、 前記コーディング領域のE.Coli宿主中での発現を可能
とし、さらに前記蛋白質の周辺質から培地中への排泄を
可能とする、コーディング領域と作用可能に連結された
コントロール領域であって、該コントロール領域にはta
cプロモーター、lacオペレーターおよび配列５′AGGAGG
AAAAAATT3′を有するコンセンサスリボソーム結合部位
が含まれるコントロール領域と、を含んでいる。

本発明のその他の見地にしたがえば、異種蛋白質を排
泄するE.coli形質変換体の製造に有用なE.coli排泄ベク
ターが提供される。このベクターは、上記定義した組み
替えDNA構造を含み、このベクターの上にコードされた
異種蛋白質は、哺乳類の蛋白質、ヒトPTHもしくはその
断片、ヒトインターロイキン−６、CD4の細胞外ドメイ
ン、ヒトEGF、または、ヒトPTHである。本発明の他の具
体例にしたがえば、上記排泄ベクターは、lacl^q遺伝子
またはparエレメントをさらに含む。

その組換えDNA構造は、異種蛋白質を排泄するE.Coli
形質転換体を作るのに有用なE.Coli排泄ベクターを形成
するために、好ましくはベクター上に取り込まれる。

この発明のその他の見地にしたがえば、宿主が培養さ
れる培地中に異種蛋白質を排泄するE.Coli宿主が提供さ
れる。この宿主は、上記の特徴を有するこの発明の組換
えDNAにより形質転換されたものである。本発明のこの
見地における好ましい具体例にしたがえば、哺乳類の蛋
白質またはその断片、ヒトPTHもしくはその断片、ヒト
インターロイキン−６、CD4の細胞外ドメイン、ヒトEG
F、または、ヒトPTHを排泄することができるE.Coli細胞
が提供される。

この発明のその他の見地にしたがえば、異種蛋白質を
生産するための方法が提供される。この方法は、この発
明の形質転換されたE.Coli菌株を培地中で培養すること
と、次いでこの菌株が培養された培地から直接、異種蛋
白質を回収することとを含んでいる。本発明のこの見地
での好ましい具体例において、上記方法は、上皮小体ホ
ルモン（PTH）またはその断片、上皮成長因子（EGF）、
インターロイキン−６（IL−６）および溶解性CD4（Ｔ
−細胞蛋白質の細胞外ドメイン）のようなヒト蛋白質の
生産のために適用される。

本発明のその他の具体例にしたがえば、上記の方法
は、約30℃で宿主を培養することを追加で含む。本発明
のさらに他の具体例にしたがえば、宿主は、IPTGの存在
下で培養される。本発明のさらに他の具体例にしたがえ
ば、上記の方法は、ヒトPTHまたはその断片を培地中に
排泄するE.coli菌株を培養することと、次いで、この菌
株が培養された培地から直接、ヒトPTHを回収すること
とを含んでいる。本発明のさらに他の具体例にしたがえ
ば、上記の方法は、ヒトEGFを培地中に排泄するE.coli
菌株を培養することと、次いで、この菌株が培養された
培地から直接、ヒトPTHを回収することとを含んでい
る。

上記に述べたシステムを使用すれば、比較的多量の異
種蛋白質が培養溶液中に排泄される。それにより、蛋白
質の回収方法が簡易化されるだけでなく、かなりの収率
で蛋白質を提供することができる。この発明の排泄シス
テムでは、他の従来技術のシステムで知られる条件を課
されない。すなわち、このシステムから結果として生じ
る排泄は直接的であり、細胞溶解なしに生じ、且つ以下
で説明する非限定的なパラメータの範囲内で確実に再現
可能である。

〔発明および好ましい実施例の詳細な説明〕

この発明は、E.Coli中において異種蛋白質を生産する
ためのシステムであって、これにより当該蛋白質は宿主
が培養されている培地中に排出されるようなシステムに
関する。

「異種蛋白質」と言う用語は、E.Coliによって自然に
は生産されないが、ゲノムDNA、cDNAおよび合成DNAのよ
うに蛋白質をコードするDNAで好適に形質転換される
と、この宿主によって発現される蛋白質を意味する。こ
こに説明するシステムを使用して生産され得る異種蛋白
質の中では、自然に分泌されるヒト起源のものを含む哺
乳類の蛋白質が好ましく、とくに成長因子、リンホカイ
ン、ホルモン、インターフェロン、酵素等のような治療
的価値を有する蛋白種が好ましい。さらに、約100kDを
超える蛋白質は、好ましいレベルよりも低いレベルで排
泄されるが、この発明のシステムを使用して排泄するこ
とができる蛋白質の大きさには制限的な限界がないよう
に思える。最も適切には、この発明のシステムを使用し
て生産される蛋白質は５ないし10kDの範囲の分子量を有
する蛋白質である。

同様に、標準形（authentic form）の蛋白質を培地か
ら直接の単離するためには成熟蛋白質を生産することが
好ましいが、この発明に従い、ハイブリッド蛋白質を標
準蛋白質（authentic protein）の断片として生産およ
び排泄してもよい。ハイブリット蛋白質は、標準蛋白質
の生物学的活性を促進するか少なくとも低下させない追
加のアミノ酸残基を有する標準蛋白質を含むことができ
る。標準蛋白質の断片は、標準蛋白質の生物学的に活性
なドメインを含むことができる。

蛋白質が周辺質内に蓄積され、従って周辺質からの回
収が必要となることを十分に予想した上で、多量の異種
蛋白質をE.Coli宿主の周辺質に分泌できるようにするこ
とを元来は意図したのであるが、驚くべきことに、第１
図に示すようなDNA構造によって、異種蛋白質は培地中
に排泄され得ることが見出だされた。事実、この構造成
分はE.Coli分泌ベクターに典型的に関連している。即
ち、プロモーター、オペレーター及びリボソーム結合部
位を含むコントロール領域は、E.Coli認識シグナルペプ
チドをコードするDNAをもったコーディング領域にリン
クされている。このコーディング領域は、周辺質への異
種蛋白の分泌を可能とするために、所望の異種蛋白質を
コードするDNAの組み込みのための多重クローニング部
位の上流に位置している。しかしながら、入手可能な成
分のなかから優れた効率を有するものを選択することに
よって、その構造上でコードされた異種蛋白質をE.Coli
宿主が培養される培地中に排泄し得るような構造が開発
された。

最も好ましい組換えDNA構造が、これから言及する第
１図に示されている。この構造を生産するために、第１
図の水平線によって示される４つの１本鎖オリゴヌクレ
オチドが、ホスホロアミダイト（phosphoramidite）法
により個々に合成された。次いで、ゲル精製されたこれ
らのオリゴヌクレオチドがアニーリングにより組み立て
られ、ギャップをDNAシーケナーゼ（sequenase）を用い
て満たすことにより、図示のような二本鎖構造が提供さ
れた。こうして、例えばボスニック（Wosnicl）らによ
りGene,Vol 60,pp 115−127,1987に記載されている標準
的な遺伝子合成の方法論を使用することにより、上記の
構造が調製された。

第１図に示したように、その構造は、ハイブリッドta
cプロモーター、lacオペレータ、コンセンサスリボソー
ム結合部位、ompAシグナルペプチドをコードするDNA、
多重クローニング部分、すべての３つのリーディングフ
レームの中の翻訳停止コドン、および示されたヌクレオ
チド配列に従って互いに相対的に関連する転写終結部位
を含んでいる。第１図に示す構造には、E.ColiのtrpA遺
伝子の転写ターミネータが取り込まれている。しかし、
E.Coliのthr,hisおよびphe遺伝子に関連するもののよう
に、他の転写ターミネータをその位置に使用してもよ
い。これらターミネータのヌクレオチド配列は、ローゼ
ンベルグ（Rosenberg）およびコート（Court）によって
Ann.Rev.Genet.,1979,Vol.13,319−355において提供さ
れている。また第１図に示された構造には、適切なE.Co
liまたはM13mplのようなファージベクター中に都合よく
連結するための、側面に位置する制限部位が設けられて
いる。その部位において、配列および部位特異的な変異
生成が実行され得る。

蛋白質の排泄を提供するために、以下では簡単にはTa
cとして示される構造は、これをE.Coli中に導入し且つ
E.Coli中で安定に維持するために、商業的に入手され得
る何れかのE.Coliベクター中に導入され得る。ファージ
ベクターを使用できるが、プラスミドベクターが好まし
い。pUC系のプラスミドはとくに適している。しかしな
がら、Tacカセットの多重クローニング部位内にある制
限部位が独特の状態で残るように、好ましくは、選択さ
れるベクターに共通の部位が削除される。いったん適切
なベクタに取り込まれると、得られたプラスミドはE.Co
li中に増幅され、続いて行われるクローニング処理のた
めに十分な量が提供される。

選択された異種蛋白質をコードするDNAは、標準的な
クローニング／連結反応を用いることにより、多重クロ
ーニング部位が設けられたプラスミド上に都合よく取り
込まれると思われる。蛋白質をコードするDNAを前記構
造中に取り込むために、クローニング部位およびクロー
ニング技術は、蛋白質をコードするDNAが、ompAシグナ
ルペプチドをコードするDNAと共にリーディングフレー
ム中に取り込まれる得るように選択される。ompAシグナ
ルペプチドおよび異種蛋白質が発現されたとき、不必要
なアミノ酸残基を介在することなく直接融合されること
を可能とするために、例えばKunkel,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,Vol 82,pp.48−492,1985によって示される一般的
な技術を使用して、その融合結合は部位特異的な突然変
異誘発により作り上げることができる。同様の技術は、
例えば蛋白質の断片の発現を可能とするために、異種蛋
白質をコードするDNAの部分を除去するためにも使用す
ることができる。

必要な異種蛋白質をコード化するDNAがその発現ベク
ターに取り込まれたら、通常の方法を使用して、選択さ
れたE.Coli菌株が該ベクターで形質転換される。

宿主として有用なE.Coli菌株には、商業的に入手可能
な「健康的な」菌株が含まれる。健康的として特徴付け
られる菌株は、普通の条件下で培養されたとき、その生
育した培地中に周辺質蛋白質または細胞質蛋白を放出し
ない菌株である。例えば標準培地中で培養されたとき
に、適切な菌株が生育した培地には、検出可能な量のβ
−ガラクトシダーゼ及びβ−ラクタマーゼ（これらの蛋
白質を周辺質蛋白および細胞質蛋白としてそれぞれ自然
に生産する菌株について）の何れをも含まれていてはな
らない。所望の異種蛋白質を発現するTac構造（第１
図）は、Tacプロモーターおよにlacオペレーターを使用
する。従って以下で詳細に説明するように、この形質転
換された宿主菌株は、異種蛋白質の発現が調節され得る
ようにlac I生産物を発現し、好ましくは過剰生産する
ことができるにちがいない。E.Coliの形質転換体による
lac I過剰生産の必要性は、この発明の一つの具体例に
したがって、lac I過剰生産の原因であるlac I^q遺伝子
をすでに含んでいるE.Coli宿主を使用することにより満
たすことができる。宿主として使用することができるla
cI過剰生産菌株には、米国カリフォルニアのクロンテッ
ク・ラボラトリーズ社（Clontech Laboratories Lnc.）
から入手可能なE.Coli菌株のJMシリーズが含まれる。使
用に適した特定の宿主菌株には、JM103およびJM105が含
まれる（JM109,recA^-宿主は、細菌され得るため避けな
ければならない）。ここで用いるために好ましいのは、
JM101菌株である。

形質転換体におけるlac I過剰生産の必要性は、上記
の代わりに、Tac排泄ベクター上にlac I^q遺伝子を取り
込むことによっても満たされる。この条件において、la
c Iの生産過剰はTac排泄ベクターによって媒介されるか
ら、DH1,RR1,C600,CMK603およびEB505のような菌株を含
む多くの商業的に入手可能なE.Coli菌株のうちの何れか
を、宿主として用いることができる。Tacの排泄ベクタ
ーに取り込まれるlac I^q遺伝子は、pMMB32プラスミドの
1.2kb Hind III断片（バグダサリアンらによりGene26,2
73−282,1983に記載されたもの）として得られ、次いで
Tac構造を含むプラスミド媒介物の幾つかの部位に、非
分裂的に取り込まれる。

その子孫に初めて形質転換される菌株からのプラスミ
ドの遺伝的安定性を高めるために、E.Coli中で機能する
分割要素（partition element;par）もまたTac排泄ベク
ターに組み込まれ得る。E.ColiプラスミドpSC101に含ま
れるそのような一つのpar要素の性質および位置は、ミ
ラー（Miller）によってのGene24,309−315,1983に記載
されている。このpar要素は、380bp Hinc II/Ava I遺伝
子としてpSC101から遊離させれ、次いでTac排泄ベクタ
ーの適切な部位にクローニングされ得る。

形質転換に続いて、排泄ベクターを含んだE.Coli菌株
は、選択された宿主のために最も適した培地中で培養さ
れる。一般的には、LBブロスまたは2YT培地（酵母抽出
物／トリプトン）が、ここで好ましい宿主の培養に使用
することができる。形質転換体を生存させるために必要
な代謝産物を提供することにより、選択的な圧力が維持
されなければならない。例えば、pUCベースの排泄ベク
ターを使用するときは、その培地はアンピシリンを含ん
でいなければならない。アンピシリン濃度は、およそ70
μg/mlが適切である。

上記のように、前記構造におけるtacプロモータお
は、該tacプロモーターに隣接して位置するlacオペレー
ターにlac I遺伝子を結合することによって調節され
る。lac I生産物を結合することによってtacプロモータ
は抑制され、その支配下に、コード化DNAの発現レベル
を低下させる。発現レベルを高くするために、この状況
においては、典型的には化学剤IPTG（イソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシド）が培地中に添加され
る。このIPTGはlac I生産物に結合してtacプロモーター
の抑制を解除（de−represses）する。この発明の好ま
しい具体例にしたがえば、形質転換体はIPTGの存在なし
で培養される。IPTGを培地中に使用しないとき、排泄さ
れる蛋白質の収率にさほど違いはなく、実際には高め得
ることが見出だされた。或いは、好ましくは細胞が早期
対数成長期（early log growth phase）に達したとき
に、IPTGを培地中に添加してもよい。

tacプローモーターは約37℃でより効果的に発現する
ことが知られているにもかかわらず、収率をさほど犠牲
にすることなく、より低い温度を用い得ることが見出だ
された。この発明の好ましい具体例にしたがえば、形質
転換は約30℃、即ち28〜32℃で培養される。勿論、低い
温度で作用させることの利点は、蛋白質およびプラスミ
ドコピー数の安定性向上である。

排泄される蛋白質の最大収率を実現するために最適な
培養時間を決定するために、試行試験が行われ、実験の
経過時間に沿って排泄された蛋白質が検定される。一般
にこの発明のシステムでは、培養４〜10時間後に大量の
蛋白質が培地中に蓄積することを期待できる。しかし、
細胞が早期対数期に達したときには、適切な収率で蛋白
質を回収することが可能である。

培地への蛋白質の排泄によって、蛋白質の回収および
単離は極めて容易になる。新鮮な栄養源がシステムに還
流されるとすれば、所望により、培地はバイオレアクタ
ーから吸い出され得る。使用済みの培地に含まれる蛋白
質は、分子量、正味電荷（net charge）、等電点などの
項目に関する蛋白質の性質を反映したバイオケミカル技
術を用いることによって単離され得る。この培地は、ま
ず最初に凍結乾燥を用いる等によって濃縮されてもよ
い。さらに、抗体または蛋白質のための天然リガンドが
入手可能なときは、アフィニティーカラムを使用しても
よい。

以下、この発明の特徴的な具体例を図面を参照して例
示する。

〔実施例〕

実施例１ E.Coli排泄ベクターの構造 二つの排泄ベクターは、第１図に図示され且つ既述の
ようにして調整されたTac構造を、複製起源および選択
可能な標識を含むE.Coliプラスミド上に組み込むことに
よって構築された。第２図に示されたpETacと称される
ひとつのプラスミドベクターが、プラスミドpEのNde I
の中にTac構造を組み込むことにより構築された。プラ
スミドpEは、EcoR I以外の多重クローニング部位を欠い
たpUC18の変種である。

pcenATacと称する二番目のプラスミドベクターは、pU
C18−1.6cenAプラスミド上のKpn I/Hind III部位の間に
Tac構造を組み込むことにより、第３図に図示されるよ
うに形成された。このpUC18−1.6cenAプラスミドは、こ
こに参照として組み込まれるGuoらのFEMS Microbiol.Le
tt.Vol.49,pp.279−283記載されている。排泄ベクターp
cenATac上にも組み込まれたpUC18−1.6cenAのcenA部分
は、セルロモナス フィミ（Cellulomonas fimi）エン
ドグルカナーゼ（endgulucanasae）を発現することがで
きる。

Guo等によって上記文献で報告されたように、発現さ
れたエンドグルカナーゼは、E.Coliプラスミドにより発
現されたときに排泄される。その結果、E.Coli蛋白質の
周辺質から培地への放出が生じる。これらの従来の所見
に基づいて、cenA遺伝子生産物はE.Coliによって分泌さ
れた異種蛋白質の周辺質への放出を容易にするために使
用され得るとの独創的な仮説が提出された。これが可能
である一方で、以後の実施例において示す証拠は、Tac
構造を含むベクターが使用されるとき、E.Coli宿主から
の異種蛋白質の排泄を得るためにcunA遺伝子生産物を発
現は必要とされないことを示している。Tac構造は、そ
の上にコード化された選択された異種蛋白質を排泄する
ために、それ自身で十分である。従って、この点におい
て、上記で述べられ且つ実施例で使用される２つの排泄
ベクターは今回の内容において実質的に同じであること
が理解される。

pcenATacにcenA遺伝子が共存することは、Tac構造の
適切な機能と、並びにこれによって発現される蛋白質を
細胞外へ放出することには無関係である。

実施例 ２ 異種蛋白質をコードするDNAのクローニン
グ 哺乳類由来の多種の蛋白質をコードするDNAは、参照
図面に示された方策を用いて、実施例１で説明した２つ
の発現ベクターの何れかに取り込むことができる。

PTH 成熟した形において、PTHはヒトの血中のカルシウム
を上昇し、骨吸収を減少させる作用をもった84個のアミ
ノ酸ペプチドである。Ｎ末端メチオニン残基を持ったPT
H類似体をコードするDNAが、ボスニック（Wosnick）ら
の上記文献に記載された一般の方法を使用し、且つヘン
ディ（Hendy）らによってProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,V
ol.78 pp.7365−7369,1981に発表されたヌクレオチド配
列にしたがって合成された。第４図に示されるように、
合成Met PTH−をコードするDNAが、pKK223−PTHプラス
ミドからのEcoR I/Hind III断片として得られた。この
断片は、pETacPTHプラスミドを形成するために、第４図
で概説した方法で、鈍端連結によって排泄ベクターpETa
cのSph I部位にクローニングされた。得られたプラスミ
ドにおいて、ompAシグナルペプチドおよびMet PTHの間
に、２つの人工的なアミノ酸残基がコード化されてい
る。

EGF 成熟した形において、ヒトEGFは、ベル（Bell）等の
下記文献に示されるアミノ酸配列を有する53個のアミノ
酸ペプチドである。EGFは、胃酸分泌の阻害を含む治療
的有用性を有している。ベル等によってNucleic Acids
Research,Vol.14,pp 8427−8446,1984に発表されたヌク
レオチド配列をに基づき、EGFをコードするDNAのEcoR I
/Xbalカセットが調製され、前もってpUC12中にクローニ
ングされた。EGFをコードするDNAをE.Coli排泄ベクター
中にクローニングするために、EGF遺伝子がpCU12から回
収された。このEGF遺伝子は、pETacEGFを生産するため
に、第５図に示すようにStu I/Xba Iで消化されたpETac
中にクローンニングされた。得られたプラスミドにおい
ては、ompAシグナルペプチド及びEGFのＮ末端の間に、
４つの介在するアミノ酸残基がコードされる（第５
図）。

インターロイキン−６ 成熟したインターロイキン−６（多数かつ広い範囲で
の生理的活性を有するヒト蛋白質）をコードするDNA
は、ブリティッシュバイオテクノロジー社（British Bi
otechnology Limited）から購入した（cat＃BBG−1
7）。IL−６をコード化したDNAのヌクレトチド配列は、
Hirano等によってNature,Vol.324,pp.73−76,1986に報
告されている（WO 88/00206も参照のこと）。次いで。p
cenATacIL−６プラスミドを形成するために、この合成D
NA構造は第６図に示したpcenATacに含まれるTac構造のN
ru I部位に連結された。

CD4の細胞外ドメイン CD4は、エイズウイルスによって認識されるヒトＴ細
胞に見出だされた膜結合蛋白質である。従って、CD4
は、ウイルスがこのヒトＴ細胞中に侵入する機構に含ま
れると確信されている。CD4の細胞外ドメインは、その
細胞膜から細胞外環境に延出した該CD4分子の一部であ
る（この領域は、「溶解性」CD4としても知らてい
る）。CD4細胞外ドメインの主要蛋白質をコードするDN
A、即ちCD4− 3−369は、Maddon等によってCell,Vol.4
2,pp.93−104,Augaust 1985に発表されたCD4アミノ酸配
列に基づいて得られ、酵母分泌ベクターpMV2Adelに前も
ってクローニングされた（Wong等のBio/Technology,Vo
l.6,pp.713−719,1988）。pcenATacCD4を形成するた
め、第７図に示すように、CD4 DNAは酵母ベクターから
回収され、pcenATac上のSph I/EcoR Vにクローニングさ
れた。得られたプラスミドにおいて、ompAシグナルおよ
びCD4は、CD4 DNAの酵母ベクター源から取り込まれる９
個のコドンによって離間される。

上記のようにして構築されたそれぞれのプラスミドに
おいて、哺乳類の蛋白質をコードしたDNAは、該蛋白質
をE.Coli周辺質中に分泌可能にするために、ompAシグナ
ルと共に読み取りフレームに取り込まれている。このコ
ーディング領域は、それぞれの場合において、tacプロ
モーター、lacオペレーターおよびコンセンサスリボソ
ーム結合部位を含むコントロール領域の発現制御下にあ
る。

別の実験におて、プラスミドは通常の方法を用いてE.
Coli宿主JM101中に導入された。そしてこの形質変換体
は、発現される異種蛋白質の位置を特徴付けるために、
以下でより正確に示されるプロトコールに従って培養さ
れた。

実施例 ３ E.Coliによる（ヒト）異種蛋白質の排泄 PTH PTH排泄ベクターpETacPTHを含むJM101形質変換体は、
アンピシリンを含むLBブロス培地中において30℃で一昼
夜培養され、次いで新鮮な培地中に接種され、OD600で
測定した吸光度が30に達する（初期対数期）まで連続し
て30℃で培養された。次いで、培養は誘導された（1mM
IPTG）。２時間の生育間隔で培地の一定量が回収され、
分画されて次のサンプルが作成された。即ち、（１）排
泄された生産物を固定するための培地；（２）周辺質の
蛋白質を同定するための浸透圧ショック溶液；（３）細
胞質および周辺質蛋白質の両者を含み、従って前記ショ
ック溶液との比較により細胞質蛋白質含有量の示度を提
供する音波処理された溶解質である。

とくに、PTH,β−ラクタマーゼ（天然周辺質蛋白質）
およびβ−ガラクトシダーゼ（天然細胞質蛋白質）を検
出し、かつ全蛋白質含有量を測定するために、各分画の
検定を行った。比較のために、誘導されていない培地に
ついても同様に試験を行った。上記の試験の結果は第１
表に示す通りである。

第１表の説明文^１ 標準曲線を提供するために、ウシ血球アルブミンを用
いたBio−Rad蛋白質検定により測定された。^２ ラジオイムノアッセイＮ−タックキット（Ｎ−tack k
it）（Incstar ＃10412,Catalog ＃96065）によって決
定された。^３ 基質としてニトロセフィン（nitorocefin）を用い、
吸光光度測定法により検定された（Antimicrob.Ag.Chem
other.Vol.1,pp.283−288,1972）。β−ガラクトシダー
ゼ1Uは、１分間あたり、ニトロセフィン酸1nmolを生産
する。^４ ミラー（Miller）に従って検定された（Experiments
in Molecular Genetics.Cold Spring Habor Laborator
y,Cold Spring Habor,NY,1972）。β−ガラクトシダー
ゼ1Uは、１分間あたり、ｏ−ニトロフェノール1nmolを
生産する。⁵ Cは、音波処理により作られる全細胞溶解質を表す。⁶ Pは、浸透圧ショック技術により作られる周辺質分画を
表す（J.Biol.Chem.Vol,241,pp.3055−3062,1966）。⁷ Sは、培地上清を表す。

ND: 検出せず 幾つかの重要な発見が第１表で明らかにされている。
第一に、PTHが培地に排泄されることは明確である。β
−ガラクトシダーゼが培地中に検出されなかったこと
は、培地中でのPTHの出現が、細胞融解の結果ではない
ことを示している。さらに、周辺質蛋白質であるβ−ラ
クタマーゼが培地中に出現することは、周辺質からのPT
Hの放出が特異的でないことを示している。誘導されて
いない培養、即ちIPTGを添加しない培養についての同様
の検定から得られた結果は、上記に示した点において、
誘導された培養についての検定と一致した。しかし、排
泄されたPTHの収率はIPTGの不存在下で顕著に低下しな
いことに留意すべきである。IPTGはlac I生産物がtacプ
ロモーターを抑制するのを防止することが知られている
なかで、上記の事実は特に驚くべき発見である。従っ
て、IPTGが存在せず且つlac I生産物の存在する場合
に、PTHレベルは減少することが期待される。何れか一
つの方法では比較的高収率でPTHを生産でき、培養が早
期対数期に達した後約10時間で最大収率が実現される。

EGF EGF排泄プラスミドpETacEGFを含むE.ColiJM101形質変
換体が、PTHのために上記で説明した方法と実質的に同
じ方法で評価された。この結果は、第２表に示したよう
に、PTH形質変換体での結果を反映している。

この表に示されたデータは、EGFは培地中に排泄され
たが、β−ガラクトシダーゼのデータが示しているよう
に、これは細胞融解の結果生じたのではないことを明ら
かにしている。IPTGによる誘導によって、４時間でのEG
F生産は顕著であり、培養が中期対数期（mid−log phas
e）に達した後約10時間で最大収率が実現される。ま
た、このデータはIPTG誘導が不可欠でないことを明らか
にしている。IPTGの効果の不存在は、協力なtacプロモ
ーターと、コンセンサスリボゾーム結合部位との複合効
果によって生じ得る。このコンセンサスリボゾーム結合
部位は、普通にtacの機能を抑制するlac生産物によって
中和するにはあまりに強力すぎる。更にある所見とし
て、周辺質からのEGFの排泄が著しく完全であることが
指摘される。

CD4 CD4排泄プラスミドpcenATacCD4を含むE.Coli菌株JM10
1が、上記に説明したのと同じ方法で培養され、培養が
早期対数期に達した後にIPTGで誘導された。２時間おき
に一定量の培地を採取し、これを透析し、凍結乾燥し且
つ0.02％NaN₃および1mM PMSF（プロテアーゼ分解の阻害
剤）を含むリン酸緩衝生理食塩水中で再構成した後に分
析した。サンプルはサンドイッチELISAフォーマットで
のCD4活性について検定された。このフォーマットで
は、商業的に入手可能なアンチCD4抗体であるOKT4を捕
獲体として用い、また複合体としてOKT4−ウレアーゼを
用いる。この培地を検定した結果は、次の表に示す通り
である。

両方の温度で、CD4が排泄されていることに留意する
のが重要である。30℃では、cenA生産物はどのような有
意な程度でも漏出できない（Guo等の上記文献参照）。
従って、CD4が培地中へ漏出する原因がcenA生産物がで
あるとは、合理的には考えられない。

IL−６ IL−６排泄プラスミドを含むJM101形質変換体の培地
を検定した予備実験において、強い陽性の検定結果が得
られた。具体的には、Koj等によって1986,J.Immunol.Me
thods,76,pp.317−327に記載されたバイオアッセイを用
いて、培地1ml当り250単位のIL−６活性が検出された。

上記に例示した各プラスミドによって生産された異種
蛋白質は、排泄された蛋白質のＮ−末端が本物ではない
点において、「成熟」したものではなかろう。しかし、
これらのプラスミドは、余計なＮ−末端アミノ酸残基を
コードするDNAを除去することにより、成熟蛋白質のＮ
−末端が直接ompAペプチドのＣ−末端に融合されるよう
に、部位特異的に変異されることが可能であると思われ
る。この処理を詳細に述べるために、Kunkel等の上記文
献が参照される、部位特異的な変異誘発を導くオリゴヌ
クレオチドに向けられた変異誘発（oligonucleotide−d
erected mutagenesis）を実行するために有用なシステ
ムが、アマーシャム・インターナショナル（Amersham I
nternational plc）によりキットの形で商業的に販売さ
れている。PTH排泄ベクターの特殊な場合、即ちpETacPT
Hでは、発現されたときにompAシグナルペプチドに直接
融合される種々の形のPTH分子、即ちPTH1−84およびPTH
1−34を生産するために、変異誘発技術を使用すること
ができる。

実施例 ４ Tac排泄ベクターの修飾 一つの型のpETacPTHプラスミドが、lac I^q遺伝子およ
びpar成分の両方を取り込むことにより修飾された。こ
の柄のプラスミドにおいてはPTH1−84をコードするDNA
が、部位特異的な変異誘発によって、ompAシグナルをコ
ードするDNAに直接融合されている。前記par成分を得る
ために、E.ColiプラスミドpSC101（Miller等の上記文
献）をHinc IIおよびSma Iで切断することにより2.9kb
断片が放出させ、次いで該断片をAva Iによって切断し
た。こうして得られたpar成分を含む380bp Hinc II/Ava
I断片は、ゲル精製ののち、鈍端連結によってTacカセ
ットの直接下流にあるHind IIIの中にクローニングされ
た。得られたプラスミドはpar8と称され、その構造は第
８図に示す通りである。

次いで、第９図に概略的に示された手段を用いること
により、lac I^q遺伝子がプラスミドpar8のなかにクロー
ニングされた。lac I^q遺伝子を得るために、広範囲宿主
プラスミドpMMB22（Bagdasarian等の上記文献に記載さ
れている）がHind IIIで切断された。次いで、ゲル精製
されたlac I^q遺伝子を含む1.2kb断片は、Pvu II制限酵
素で消化されたプラスミドpar8中に鈍端連結によりクロ
ーニングされ、Tacカセットの上流に取り込まれた。

次に、上記のようにして得られたpar成分、lac I^q遺
伝子およびTac/PTHカセットを含むプラスミドの特性
が、種々のE.Coli宿主菌株中において検討された。修飾
されたプラスミドのlac I^q成分の特性を評価するため
に、lac I^q遺伝形質が欠落している野生型のE.Coli菌株
が形質変換された。DH1,RR1,C600,CMK603およびEB505を
含む試験された全ての菌株において、IPTGの誘導に続い
て生物活性なPTH活性が検出され、プラスミドにコード
化されたlac I^q遺伝子の生産物が作用することが示され
た。機能的なpar活性も、JM101形質変換体で検出され
た。par成分を取り込むことにより、選択的な圧力（sel
ective pressure）の不存在下においてさえ、多くの世
代を通してプラスミドの安定した遺伝性が得られた。

【図面の簡単な説明】 第１図は、この発明に有用なヌクレオチド配列および組
換えDNA構造を概略的に説明する図、 第２図は、プラスミドpETacを形成するために、pEと称
されるプラスミドpUC18の誘導体中にTac構造を取り込む
ことを示す図、 第３図はpcenATacを形成するために、C.fimi cemA遺伝
子も組み込んだTac含有プラスミドの構造を示す図、 第４図は、pETacPTHを形成するために、ヒト上皮小体ホ
ルモン（PTH）をコードするDNAをpETac中に取り込むこ
とを示す図、 第５図は、pETacEGFを形成するために、ヒト成長ホルモ
ン（EGF）をコードするDNAをpETac中に取り込むことを
示す図、 第６図は、pcenATacIL6を形成するために、インターロ
イキン−６（IL−６）をコードするDNAをpcenATacベク
ター中に取り込むことを示す図、 第７図は、pcenATacCD4を形成するために、CD4の細胞外
ドメインをコードするDNAをpcenATacの中に取り込むこ
とを示す図、 第８図は、pETacPTHの変種のなかにpar成分を取り込む
ことを概略的に示す図、および 第９図は、第８図に示すpar成分を含むpETacPTHの変種
のなかに、Ilac遺伝子を取り込むことを概略的に示す図
である。

フロントページの続き (56)参考文献 特表 昭62−501262（ＪＰ，Ａ) 国際公開88／3171（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/21 C12P 21/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】コーディング領域であって、該領域内では
   異質蛋白質をコードするDNAが、リーディングフレーム
   中において、前記蛋白質の周辺質からの排泄を可能とす
   るompAシグナルペプチドをコードするDNAと結合されて
   いるコーディング領域と、 前記コーディング領域のE.Coli宿主中での発現を可能と
   し、さらに前記蛋白質の周辺質から培地中への排泄を可
   能とする、コーディング領域と作用可能に連結されたコ
   ントロール領域であって、該コントロール領域にはtac
   プロモーター、lacオペレーターおよび配列５′AGGAGGA
   AAAAATT3′を有するコンセンサスリボソーム結合部位が
   含まれるコントロール領域とを具備した、E.Coliから異
   種蛋白質の排泄を得るために有用な組換えDNA構造。
2. 【請求項２】その培養の際に異種蛋白質を培地中に排泄
   するE.Coli菌株であって、請求項１に定義した組換えDN
   A構造を含むE.Coli排泄ベクターによる形質転換によっ
   て得られた菌株。
3. 【請求項３】異種蛋白質を生産するための方法であっ
   て、請求項２記載のE.Coli菌株を培地中で培養すること
   と、次いでこの菌株が培養された培地から直接、異種蛋
   白質を回収することとを具備した方法。