JPH02177889A - Ｅ．Ｃｏｌｉからの異種蛋白質の排泄 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、Ｅ．Ｃｏｌｉ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｊａ
　Ｃｏｌ＋、）に適用される遺伝工学の技術に関する。

より詳細には、細胞か培養された培地中に異種蛋白質を
排出する、遺伝子操作されたＥ．Ｃｏｌｉ細胞に関する
。

〔発明の背景〕

Ｅ．Ｃｏｌｉを包む内膜を通過し、周辺質として知られ
ている内膜および外膜間の空間に異種蛋白質を生産する
Ｅ．Ｃｏｌｉの技術は、現在確かに確立されている。そ
の蛋白質が、Ｅ．Ｃｏｌｉ認識ペプチドまたはそのＮ末
端に結合された「シグナルペプチド」を有する融合蛋白
（ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）として発現されると
き、その所望の蛋白質は周辺質の中へ分泌される（ジエ
ネンテツク社のＥＰ　１７７．３１４号参照）。

幾つかのそのようなシグナルペプチドが、現在、アミノ
酸配列およびＤＮＡ配列によって同定されている（Ｖａ
ｔｓｏｎ、Ｍ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ａ
ｒｃｈ、Ｖｏｌ　１２Ｎｏ、１３．１９８４．ｐｐ、５
１．４５−５１６４参照）。また、これらのシグナルペ
プチドを用いることによって、異種蛋白質をＥ．Ｃｏｌ
ｉの周辺質中に誘導することに成功している（下記文献
参照）。

−Ｏｋａ等；　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ、８２．ｐｐ７２１２−７２１６．Ｎｏｖｅｍ
ｂｅｒ１９８５この中では、成熟Ｅ、ＣＰをＥ．Ｃｏｌ
ｉの周辺質中に誘導するために、ヒト表皮性成長因子（
ｈｌＥＧＦ）がＥ．Ｃｏｌｉアルカリフオスフオターゼ
のシグナルペプチドと融合されている。

φｌｌｓｊｕｎｇ等；　Ｂｊｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、
Ｖｏｌ　４．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　１９ｇｅ、ｐ−ｐ　９
９１−９９５ ここでは、Ｅ．Ｃｏｌｉの外膜蛋白質Ａ（ｏｍｐＡ）の
シグナル蛋白質を使用して、ヒト成長ホルモンかＥ．Ｃ
ｏｌｉの周辺質中へ誘導されている。

周辺質中の蛋白質は、しばしば［分泌された（　５ｅｃ
ｒｅｔｅｄ）　Ｊと述べられる。しかし、それらは外膜
によって細胞内に含まれており、培地中では入手できな
いから、外膜を一旦崩壊するか或いは透過性にすること
によって、周辺質成分を放出させなければ回収できない
ことを理解しなければならない。

蛋白質回収工程を容易にするために、蛋白質を生産する
Ｅ．Ｃｏｌｉ宿主を培養している間に、培地中に蛋白質
を蓄積させることが好ましい。なぜなら、比較的汚染を
少なくし且つその細胞性の供給源を傷付けることなく、
当該蛋白質を回収することができるからである。蛋白質
を培地中に排泄するシステ１１を開発するために、様々
な試みが成されている。そのシステムのすべては、外膜
障壁の一体性を克服するための幾つかの方策を含んでい
る。

一つの手段は、一般にＥ．Ｃｏｌｉの遺伝子操作を含ん
でいる。この遺伝子操作は、外膜の一体性に影響を与え
てこれを透過性または「漏出性（ｌｅａｋｙ）ｊするよ
うな清涼蛋白質と一緒に、所望の蛋白質を分泌可能な形
（シグナルペプチドを持つ）で共に発現させるためのも
のである（下記文献参照）。

・米国特許節４，５９５，６５８号 このなかでは、透過化剤としてｆｌファージの遺伝子■
生産物が透過剤として使用される。

＃ＫｏｂａｙａＳｈｉ　ら；　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、Ｊｕｎｅ　１９８６．ｐｐ　７このなかでは、陰性キ
ル（ｋｉ １）蛋白質の活性化が用いられる。

・ＥＰ　１４０，８６４号 この中では、温度感受性清涼菌 か使用される。

これらの方法においては、宿主生存度を維持するために
、清涼性生産物の発現を注意深く調節することか必要と
される。さらに、共発現は本質的に宿主にとってエネル
ギーの浪費となり得るので、所望の蛋白質の収率が低下
し、また宿主細胞バイオマスが減少することになる。

別の手段では、所望の蛋白質はキメラな蛋白質として発
現される。この場合、所望の蛋白質はキャリアー蛋白質
に融合される。典型的に使用されるキャリアー蛋白質は
、天然で生産されるＥ．Ｃｏｌｉ蛋白質、またはそれら
の断片である。これらのＥ。

Ｃｏ１１蛋白質は排泄され得るもの（溶血素）、または
外膜に結合されるもの束縛されるもの（ｏｍｐＰ）であ
る。例えばマックマン（Ｍａｃｋｍａｎ）らは、溶血素
のＣ−末端蛋白質と融合したとき、ｏｍｐＰはそのシグ
ナルペプチドなしで、Ｅ．Ｃｏｌｉの膜を通過して培地
中に引きずり出され得ることを見出だした（ＥＭＢＯＪ
、Ｖｏｌ　Ｂ、Ｎｏ、９．ｐｐ、２３８５−２８４１．
１９８７）。ナガハリ（Ｎｇａｈａｒｉ）らは、ヒトβ
−エンドロフィンが、Ｅ。

ＣｏｌＣｏ１１ｏ蛋白質の少なくとも一つの蛋白質と融
合したときに培地中に放出されることを見出だした（Ｅ
ＭＢＯＪ、Ｖｏｌ　４．Ｎｏ、１３Ａ、ｐＩ）、３５８
９−３５９２．１９８５）。しかしながら、そのような
技術により製造された蛋白質を回収するために、所望の
蛋白質はキャリア蛋白質から切断されなければならず、
これは単離を困難にする。

さらに別の手段では、その外膜の一体性が遺伝子レベル
で弱められたＥ．Ｃｏｌｉ菌株が使用される。

そのような菌株は「漏出性」の宿主として知られ、周辺
質の蛋白質を維持することができない。実際には、環境
条件の厳重な調節なしにこれらの菌株を生存条件に維持
することは困難である。

この発明の一つの目的は、異種蛋白質を生産するＥ．Ｃ
ｏｌｉが成長している培地中に、該異種蛋白質を排出で
きるようにする方法を提供することである。

この発明の一つの目的は、ＤＮＡベクターであって、そ
の上でコードされた異種蛋白質をｌＥ、ｃｏｌｊから排
出することを可能とするＤＮＡベクターを提供すること
である。

この発明の更なる目的は、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株が培養され
る培地に排出される所望の異種蛋白質を表現するために
遺伝手術されたＥ、Ｃｏ目菌株を提供することである。

この発明の全体にわたる目的は、Ｅ．Ｃｏｌｉにより生
産される異種蛋白質をＥ．Ｃｏｌｉの培地中に蓄積でき
るようにすることにより、該異種蛋白質の回収を容易に
することである。

〔発明の概要〕

今や、Ｅ．Ｃｏｌｉ宿主からの異種蛋白質の排泄が、−
貫して且つ広範囲の異種蛋白質のために達成され得るこ
とが見出だされた。しかも、この異種蛋白の排出は、キ
ャリアー蛋白質または膜透過剤からの援助なしに、且つ
外膜が不完全な変異菌株ではなく健康な（ｈｅａｌｔｈ
ｙ）宿主を使用することによって目的を達成できること
が見出だされた。さらに、以下に述べるＤＮＡベクター
から発現された異種蛋白質は培地中に直接排泄され、比
較的に高い収率で回収できることを見出だされた。

この発明の一つの見地に従えば、異種蛋白質のＥ．Ｃｏ
ｌｉからの排出を得ることに役立つ組み替えＤＮＡ構造
が提供される。この組み替えＤＮＡ構造は、 コープイン領域であって、その中では異質蛋白質をコー
ドするＤＮＡが、読み取りフレーム（ｒｅａ＋Ｈｎｇ　
ｆｒａｍｅ）中において、周辺質への蛋白質の分泌を可
能とするｏｍｐＡシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
と共に結合されているコーディング領域と、前記コーデ
ィング領域の発現を可能とするように、コーディング領
域と実施可能に（ｏｐｅｒａｂ　ｌ　ｙ）にリンクされ
たコントロール領域であって、該コントロール領域には
ｔａＣプロモーター　、ｌａｃオペレーターおよびコン
センサスリボソーム結合部位（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　ｒ
ｉｂｏｓｏｍｅ旧旧ｎｇ　５ｉｔｅ）が含まれるコント
ロール領域と、を含んでいる。

その組み替えＤＮＡ構造は、異種蛋白質を排泄するＥ．
Ｃｏｌｉ形質転換体を作るのに有用なＥ．Ｃｏｌｉ排泄
ベクターを形成するために、好ましくはベクタ」二に取
り込まれる。

この発明のその他の見地にしたがえば、宿主が培養され
る培地中に異種蛋白質を排泄するＥ．Ｃｏｌｉ宿主が提
供される。この宿主は、上記の特徴を有するこの発明の
組み替えＤＮＡにより形質転換されたものである。本発
明のこの見地における好ましい具体例にしたがえば、哺
乳類の蛋白質またはその断片を排泄することができるＥ
．Ｃｏｌｉ細胞が提供される。

この発明のその他の見地にしたがえば、異種蛋白質を生
産するための方法が提供される。この方法は、この発明
の形質転換されたＥ．Ｃｏｌｉ菌株を培地中で培養する
ことと、次いでこの菌株が培養された培地から直接、異
種蛋白質を回収することとを含んでいる。本発明のこの
見地での好ましい具体例において、上記方法は、上皮小
体ホルモン（ＰＴＩ＋）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、イ
ンターロイキン６　（ＩＬ−６）および溶解性ＣＤ４　
（Ｔ−細胞蛋白質の細胞列ドメイン）のようなヒト蛋白
質の生産のために適用される。

上記に述べたシステムを使用すれば、比較的多量の異種
蛋白質が培養溶液中に排泄される。それにより、蛋白質
の回収方法が簡易化されるだけでなく、かなりの収率て
蛋白質を提供することかできる。この発明の排泄システ
ムでは、他の従来技術のシステムで知られる条件を課さ
れない。すなわち、このシステムから結果として生じる
排泄は直接的であり、細胞溶解なしに生じ、且つ以下で
説明する非限定的なパラメータの範囲内で確実に再現可
能である。

〔発明および好ましい実施例の詳細な説明〕この発明は
、Ｅ．Ｃｏｌｉ中において異種蛋白質を生産するための
システムであって、これにより当該蛋白質は宿主が培養
されている培地中に排出されるようなシステムに関する
。

「異種蛋白質」と言う用語は、Ｅ．Ｃｏｌｉによって自
然には生産されないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび
合成りＮＡのように蛋白質をコードするＤＮＡで好適に
形質転換されると、この宿主によって発現される蛋白質
を意味する。ここに説明するシステムを使用して生産さ
れ得る異種蛋白質の中では、自然に分泌されるヒト起源
のものを含む哺乳類の蛋白質が好ま、シく、とくに成長
因子、リンホカイン、ホルモン、インターフェロン、酵
素等のような治療的価値を有する蛋白種が好ましい。

さらに、約１００　ｋＤを超える蛋白質は、好ましいレ
ベルよりも低いレベルで排泄されるが、この発明のシス
テムを使用して排泄することができる蛋白質の大きさに
は制限的な限界がないように思える。

最も適切には、この発、明のシステムを使用して生産さ
れる蛋白質は５ないし１０ｋＤの範囲の分子量を有する
蛋白質である。

同様に、標準形（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ　ｆｏｒｍ）の蛋
白質を培地から直接の単離するためには成熟蛋白質を生
産することが好ましいが、この発明に従い、ハイブリッ
ド蛋白質を標準蛋白質（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ　ｐｒｏｔ
ｅｉｎ）の断片として生産および排泄してもよい。ハイ
ブリッド蛋白質は、標準蛋白質の生物学的活性を促進す
るか少なくとも低下させない追加のアミノ酸残基を有す
る標準蛋白質を含むことができる。標準蛋白質の断片は
、標準蛋白質の生物学的に活性なドメインを含むことか
できる。

蛋白質が周辺質内に蓄積され、従って周辺質からの回収
が必要となることを十分に予想した上で、多重の異種蛋
白質をＥ．Ｃｏｌｉ宿主の周辺質に分泌できるようにす
ることを元来は意図したのであるか、驚くべきことに、
第１図に示すようなりＮＡ構造によって、異種蛋白質は
培地中に排泄され得ることが見出だされた。事実、この
構造成分はＩｇ、ｃｏｌｉ分泌ベクターに典型的に関連
している。即ち、プロモーター、オペレーター及びリポ
ソーム結合部位を含むコントロール領域は、Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ認識シグナルペプチドをコードするＤＮＡをもったコ
ーディング領域にリンクされている。このコーディング
領域は、周辺質への異種蛋白の分泌を可能とするために
、所望の異種蛋白質をコードするＤＮＡの組み込みのた
めの多重クローニング部位の上流に位置している。しか
しながら、入手可能な成分のなかから優れた効率を有す
るものを選択することによって、その構造上でコードさ
れた異種蛋白質をＥ、Ｃｏ目宿主が培養される培地中に
排泄し得るような構造が開発された。

最も好ましい組み替えＤＮＡ構造が、これから言及する
第１図に示されている。この構造を生産するために、第
１図の水平線によって示さ・れる４つの１本鎖オリゴヌ
クレオチドか、ホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒ
ａｍｉｄｉｔｅ）法により個々に合成された。次いで、
ゲル精製されたこれらのオリゴヌクレオチドがアニーリ
ングにより組み立てられ、ギャップをＤＮＡシーケナー
ゼ（５ｅｑｕｅｎａｓｅ）を用いて満たすことにより、
図示のような二本鎖構造が提供された。こうして、例え
ばボスニック（ＷＯｓｎｉｃｌ）らによりＧｅｎｅ、Ｖ
ｏｌ　ｅｏ、ｐｐ　］−］１．５−１２７．１９８に記
載されている標準的な遺伝子合成の方法論を使用するこ
とにより、上記の構造が調製された。

第１図に示したように、その構造は、ハイブリッドｔａ
ｃプロモーター　、ｌａｃオペレーター　コンセンサス
リボソーム結合部位、ｏｍｐＡシグナルペプチドをコー
ドするＤＮＡ、多重クローニング部分、すべての３つの
読取りフレームの中の翻訳停止コドン、および示された
ヌクレオチド配列に従って互いに相対的に関連する転写
終結部位を含んでいる。第１図に示す構造には、Ｅ．Ｃ
ｏｌｉのｔｒｐＡ遺伝子の転写ターミネータが取り込ま
れている。しかし、Ｅ．Ｃｏｌｉのｔｈｒ、ｈｉｓおよ
びｐｈｅ遺伝子に関連するもののように、他の転写ター
ミネータをその位置に使用してもよい。これらターミネ
ータのヌクレオチド配列は、ローゼンベルグ（Ｒｏｓｅ
ｎｂｅｒｇ）およびコート（Ｃｏｕｒｔ）ｌこよって八
ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅ、ｔ、　、　１９７９、Ｖｏｌ
、１．３，８１９−３５５において提供されている。ま
た第１図に示された構造には、適切なＥ．Ｃｏｌｉまた
はＭ１３ｉｌｐｌのようなファージベクター中に都合よ
く連結するための、側面に位置する制限部位が設けられ
ている。その部位において、配列および部位特異的な変
異生成が実行され得る。

蛋白質の排泄を提供するために、以下では簡単にはＴａ
ｃとして示される構造は、これをＥ．Ｃｏｌｉ中に導入
し且つＥ、ｃｏｌｉ中で安定に維持するために、商業的
に入手され得る何れかのＥ．Ｃｏｌｉベクター中に導入
され得る。ファージベクターを使用できるが、プラスミ
ドベクターが好ましい。ｐＵＣ系のプラスミドはとくに
適している。しかしながら、ＴａＣカセットの多重クロ
ーニング部位内にある制限部位が独特の状態で残るよう
に、好ましくは、選択されるベクターに共通の部位が削
除される。いったん適切なベクターに取り込まれると、
得られたプラスミドはＥ．Ｃｏｌｉ中に増幅され、続い
て行われるクローニング処理のために十分な量が提供さ
れる。

選択された異種蛋白質をコードするＤＮＡは、標準的な
りローニング／連結反応を用いることにより、多重クロ
ーニング部位が設けられたプラスミド上に都合よく取り
込ますると思われる。蛋白質をコードするＤＮＡを前記
構造中に取−り込むために、クローニング部位およびク
ローニング技術は、蛋白質をコードするＤＮＡが、ｏｍ
ｐＡシグナルペプチドをコードするＤＮＡと共に読み取
りフレム中に取り込まれる得るように選択される。ｏｍ
ｐＡングナルペプチドおよび異一種蛋白質が発現された
とぎ、不必要なアミノ酸残基を介在することなく直接融
合されることを可能とするために、例えばＫｕｎｋｅｌ
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、Ｖ
ｏｌ　８２．ｐｐ、４８］８ ８−４９２．１９８５によって示される一般的な技術を
使用しで゛、その融合結合は部位特異的な突然変異誘発
により作り上げることができる。同様の技術は、例えば
蛋白質の断片の発現を可能とするために、異種蛋白質を
コードするＤＮＡの部分を除去するためにも使用するこ
とができる。

必要な異種蛋白質をコード化するＤＮＡがその発現ベク
ターに取り込まれたら、通常の方法を使用して、選択さ
れたＥ、Ｃｏｌ　ｉ菌株が該ベクターで形質転換される
。

宿主として有用なＥ．Ｃｏｌｉ菌株には、商業的に入手
可能な「健康的な」菌株が含まれる。健康的として特徴
付けられる菌株は、普通の条件下で培養されたとき、そ
の生育した培地中に周辺質蛋白質または細胞質蛋白を放
出しない菌株である。例えば標章培地中で培養されたと
きに、適切な菌株か生育した培地には、検出可能な量の
β−ガラクトシダーゼ及びβ−ラクタマーゼ（これらの
蛋白質を、周辺質蛋白および細胞質蛋白としてそれぞれ
自然に生産する菌株について）の何れをも含まれていで
はならない。所望の異種蛋白質を発現するＴａｃ構造（
第１図）は、ＴａｃプロモーターおよにａＣオペレータ
ーを使用する。従って以下で詳細に説明するように、こ
の形質転換された宿主菌株は、異種蛋白質の発現が調節
され得るように、ｌａｃｌ生産物を発現し、好ましくは
過剰生産することができるにちかいない。Ｅ．Ｃｏｌｉ
の形質転換体によるＩａｃｌ過剰生産の必要性は、この
発明の一つの具体例にしたがって、ＩａＣ］過剰生産の
原因である、ｌａｃ１６遺伝子をすでに含んでいるＥ、
ｃｏｌｉ宿主を使用することにより満たすことができる
。宿主として使用することができるＩａｃｌ過剰生産菌
株には、米国カリフォルニアのクロンチック・ラボラト
リーズ社（ＣＩｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ　Ｌｎｃ’、）から入手可能なＥ、Ｃｏ１ｆ菌株のＪ
Ｍシリーズが含まれる。使用に適した特定の宿主菌株に
は、Ｊ旧０３およびＪＭ１０５が含まれる（　ＪＭ１０
９．　ｒｅｃＡ−宿主は、細菌され得るため避けなけれ
ばならない）。ここで用いるために好ましいのは、Ｊ旧
制菌株である。

形質転換体における、ｌａｃｌ過剰生産の必要性は、上
記の代わりに、Ｔａｃ排泄排泄ベクタ心上ａｅｌｑ遺伝
子を取り込むことによっても満たされる。この条件にお
いて、１ａＣｆの生産過剰はＴａｃ排泄ベクターによっ
て媒介されるから、ＤＩＩＬ、ＲＲＩ、Ｃ６００，ＣＭ
ＫＧＯ３およびＥＢ５０５のような菌株を含む多くの商
業的に入手可能なＥ、ｃｏｌｊ菌株のうちの何れかを、
宿主として用いることができる。Ｔａｃ排泄ベクターに
取り込まれる、ｌａｃｌ’遺伝子は、ｐＭＭＢ２２プラ
スミドの１．２ｋｂ　ｔｌｉｎｄｍ断片（バグダサリア
ンらによりＧｅｎｅ２［ｉ、２７３−２８２．１９８３
に記載されたもの）として得られ、次いてＴａｃ構造を
含むプラスミド媒介物の幾つかの部位に、非分裂的に取
り込まれる。

その子孫に初めて形質転換される菌株からのプラスミド
の遺伝的安定性を高めるために、Ｅ．Ｃｏｌｉ中で機能
する分割要素（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ　ｅｌｅｍｅｎｔ　
；　ｐａｒ）もまたＴａｃ排泄ベクターに組み込まれ得
る。Ｅ、Ｃ。

ｊプラスミド媒介物１．０１に含まれるそのような一つ
のｐａｒ要素の性質および位置は、ミラー□Ｈ］　１ｅ
ｒ）によってのＧｅｎｅ　２４，３０９−３１５．１９
８３に記載されている。

このｐａｒ要素は、３８０ｂｐ　ＨｉｎｃＩＩ　／Ａｖ
ａ　Ｉ遺伝子としてｐｓｃＪ、０１から遊離させれ、次
いてＴａｃ排泄ベクタの適切な部位にクローニングされ
得る。

形質転換に続いて、ｖｌ−泄ベクターを含んだＥ、Ｃ。

１菌株は、選択された宿主のために最も適した培地中で
培養される。一般的には、ＬＢブロスまたは２ＹＴ培地
（酵母抽出物／トリプトン）が、ここで好ましい宿主の
培養に使用することができる。形質転換体を生存させる
ために必要な代謝産物を提供することにより、選択的な
圧力が維持されなければならない。例えば、ｐＵＣベー
スの排泄ベクターを使用するときは、その培地はアンピ
シリンを含んでいなければならない。アンピシリン濃度
は、およそ７０μｇ　／　ｍｌが適切である。

上記のように、前記構造におけるｔａｃプロモーターは
、該ｔａｃプロモーターに隣接して位置するａＣオペレ
ーターにＩａｃｌ遺伝子を結合することによって調節さ
れる。、ｌａｃｌ生産物を結合することによってｔ’ａ
ｃプロモーターは抑制され、その支配下に、コード化Ｄ
ＮＡの発現レベルを低下させる。

発現レベルを高くするために、この状況においては、典
型的には化学剤ＩＰＴＧ　（イソプロピル−β−Ｄチオ
ガラクトピラノシド）が培地中に添加される。この］　
ＰＴＧは、ｌａｃｌ生産物に結合してｔａｃプロモータ
ーの抑制を解除（ｄｅ−ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ）する。こ
の発明の好ましい具体例にしたかえば、形質転換体はｌ
　ＰＴＧの存在なしで培養される。ｌ　ＰＴＧを培地中
に使用しないとき、排泄される蛋白質の収率にさほど違
いはなく、実際には高め得ることが見出たされた。或い
は、好ましくは細胞が早期対数成長期（ｅａｒｌｙ　ｌ
ｏｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｈａｓｅ）に達したときに、Ｉ
　ＰＴＧを培地中に添加してもよい。

ｔａＣプロモーターは約３７℃でより効果的に発現する
ことが知られているにもかかわらず、収率をさほど犠牲
にすることなく、より低い温度を用（Ａ得ることか見出
だされた。この発明の好ましい具体例にしたがえば、形
質転換は約３０℃、即ち２８〜３２°Ｃて培養される。

勿論、低い温度で作用させることの利点は、蛋白質およ
びプラスミド複写数（Ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ）の安定
性向上である。

排泄される蛋白質の最大収率を実現するために最適な培
養時間を決定するために、試行試験が行われ、実験の経
過時間に沿って排泄された蛋白質が検定される。一般に
この発明のシステムでは、培養４〜１０時間後に大量の
蛋酊質が培地中に蓄積することを期待できる。しかし、
細胞が早期対数期に達したときには、適切な収率で蛋白
質を回収することが可能である。

培地への蛋白質の排泄によって、蛋白質の回収および単
離は極めて容易になる。新鮮な栄養源がシス・テムに還
流されるとすれば、所望により、培地はバイオレアフタ
−から吸い出され得る。使用済みの培地に含まれる蛋白
質は、分利り正味電荷（ｎｅｔ　ｃｈａｒｇｅ）、等電
点などの項目に関する蛋白質の性質を反映したバイオケ
ミカル技術を用いることによって単離され得る。この培
地は、まず最初に凍結乾燥を用いる等によって濃縮され
てもよい。さらに、抗体または蛋白質のための天然リガ
ンドが入手可能なときは、アフィニティーカラムを使用
してもよい。

以下、この発明の特徴的な具体例を図面を参照して例示
する。

〔実施例〕

実施例Ｉ　　Ｅ．Ｃｏｌｉ排泄ベクターの構造二つの排
泄ベクターは、第１図に図示され且つ既述のようにして
調整されたＴａｃ構造を、複製起源および選択可能な標
識を含むＥ．Ｃｏｌｉプラスミド上に組み込むことによ
って構築された。第２図に示されたｐＥＴａｃと称され
るひとつのプラスミドベクターが、プラスミドｐＥのＮ
ｄｅｌの中にＴａｃ構造を組み込むことにより構築され
た。プラスミドｐＥは、ＥｃｏＲｌ以外の多重クローニ
ング部位を欠いたｐＵｃｉ８の変種である。

ｐｃｅｎＡＴａｃと称する二番目のプラスミドベクタは
、ｐＵ０１８−１．８　ｃｅｎＡプラスミド上のＫｐｎ
ｌ／　ｌｌｉｎｄｍ部位の間にＴａｃ構造を組み込むこ
とにより、第３図に図示されるように形成された。この
ｐＵｃ１８．−１６　ｃｅｎＡプラスミドは、ここに参
照として組み込まれるＧｕｏらのＰＥＭＳ　ＭｉｅｒＯ
ｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、ＶＯｌ、４９．ｐｐ、２７９−２
８３記載されている。排泄ベクターｐｃｅｎＡＴａｃ上
にも組み込まれたｐＵ０１８−１．６　ｃｅｎＡのｃｅ
ｎＡ部分は、セイレロモナス　フィミ　（Ｃｅｌｌｕｌ
ｏｍｏｎａｓ　ｆｉｍｉ）エンドグルカナーゼ（ｅｎｄ
ｇｕｌｕｃａｎａｓａｅ）を発現することができる。

Ｇｕｏ等によって上記文献で報告されたように、発現さ
れたエンドグルカナーゼは、Ｅ．Ｃｏｌｉプラスミドに
より発現されたときに排泄される。その結果、Ｅ．Ｃｏ
ｌｉ蛋白質の周辺質から培地への放出が生じる。これら
の従来の所見に基づいて、ｃｅｎＡ遺伝子生産物はＥ．
Ｃｏｌｉによって分泌された異種蛋白質の周辺質への放
出を容易にするために使用され得るとの独創的な仮説が
提出された。これか可能である一方で、以後の実施例に
おいて示す証拠は、Ｔａｃ　ｔＷ造を含むベクターが使
用さるとき、Ｅ．Ｃｏｌｉ宿主からの異種蛋白質の排泄
を得るためにｃｅｎＡ遺伝子生産物を発現は必要とされ
ないことを示している。Ｔａｃ構造は、その上にコード
化された選択された異種蛋白質を排泄するために、それ
自身で十分である。従って、この点において、上記で述
べられ且つ実施例で使用される２つの排泄ベクタは今回
の内容において実質的に同じであることが理解される。

ｐｃｅｎＡＴａｃにｃｅｎＡ遺伝子が共存することは、
Ｔａｃ構造の適切な機能と、並びにこれによって発現さ
れ、る蛋白質を細胞外へ放出することには無関係である
。

実施例　２　異種蛋白質をコードするＤＮＡのクローニ
ング 哺乳類由来の多種の蛋白質をコードするＤＮＡは、参照
図面に示された方策を用いて、実施例１で説明した２つ
の発現ベクターの何れかに取り込むことができる。

ＴＨ 成熟した形において、ＰＴＩＩはヒトの血中のカルシウ
ムを上昇し、骨吸収を減少させる作用をもった８４個の
アミノ酸ペプチドである。Ｎ末端メチオニン残基を持っ
たＰＴＨ類似体をコードするＤＮＡが、ボスニック（Ｗ
ｏｓｎｉｃｋ）らの上記文献に記載された一般の方法を
使用し、且つヘンデイ（Ｈｅ　ｎ　ｄ　ｙ）らによって
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、
、Ｖｏｌ、７８ｐｐ、７３６５−７３６９．’１９８１
に発表されたヌクレオチド配列にしたがって合成された
。第４図に示されるように、合成Ｍ　ｅ　ｔ　Ｐ　Ｔ　
Ｈ−をコードするＤＮＡが、ｐＫＫ２２３−　Ｐ　Ｔ　
ＩｔプラスミドからのＥｃｏＲＩ／１ｌｉｎｄＩＩ［断
片として得られた。この断片は、ｐＥＴａｃＰＴＨプラ
スミドを形成するために、第４図で概説した方法で、鈍
端連結によって排泄ベクターｐＥＴａｃ、のｓｐｈ　Ｉ
部位にクローニングされた。得られたプラスミドにおい
て、ｏｍｐＡシグナルペプチドおよびＭｅｔ　ＰＴＨＯ
間に、２つの人工的なアミノ酸残基かコード化されてい
る。

ＥＧＦ 成熟した形において、ヒトＥＧＦは、ベル（ＢｅＩ＋）
等の下記文献に示されるアミノ酸配列を有する５３個の
アミノ酸ペプチドである。ＥＧＦは、胃酸分泌の阻害を
含む治療的有用性を有している。ベル等によってＮｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ、１
４．ｐｐ８４２７−８４４６．１９８４に発表されたヌ
クレオチド配列をに基づき、ＥＧＦをコードするＤＮＡ
のＥｃｏＲＩ／Ｘｂａ１カセットが調製され、前もって
ｐｕｃ　ｌ　２中にクロニングされた。ＥＧＦをコード
するＤＮＡをＥ、Ｃ。

１１排泄ベクター中にクローニングするために、ＥＧＦ
８ Ｐ遺伝子がｐＵｃ１２から回収された。このＥＧＦ遺伝
子は、ｐＥＴａｃＥＧＦを生産するために、第５図に示
すように５ｔｕｌ／Ｘｂａｌで消化されたｐＥＴａｃ中
にクローニングされた。得られたプラスミドにおいては
、ｏｍ　ｐＡシグナルペプチド及びＥＧＦのＮ末端の間
に、４つの介在するアミノ酸残基がコードされる（第５
図）。

インターロイキン−６ 成熟したインターロイキン−６（多数かつ広い範囲での
生理的活性を有するヒト蛋白質）をコドするＤＮＡは、
ブリティッシュバイオテクノロジー社（Ｂｒｉｔｉｓｈ
　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）から
購入した（ｃａｔｌｔＢＢＧ−１７）。ＩＬ−６をコー
ド化したＤＮＡのヌクレオチド配列は、Ｈｊｒａｎｏ等
によってＮａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、３２４．１）Ｌ７３−
７Ｇ、１９８６に報告されている（ＷＯ８８７００２０
６も参照のこと）。次いで、ｐｃｅｎＡＴａｃ　Ｉ　Ｌ
６プラスミドを形成するために、この合成りＮＡ構造は
第６図に示したｐｃｅｎＡＴａｃに含まれるＴａｃ構造
のＮｒｕ１部位に連結された。

ＣＤ４の細胞外ドメイン ＣＤ４は、エイズウィルスによって認識されるヒトＴ細
胞に見出だされた膜結合蛋白質である。

従って、ＣＤ４は、ウィルスがこのヒトＴ細胞中にに侵
入する機構に含まれると確信されている。ＣＤ４の細胞
外ドメインは、その細胞膜から細胞外環境に延出した該
ＣＤ４分子の一部である（この領域は、［溶解性ｊ　Ｃ
Ｄ４としても知られている）。ＣＤ４細胞外ドメインの
主要蛋白質をコードするＤＮＡ１即ちＣＤ４３−３６９
は、Ｍａｄｄｏｎ等によってＣｅｌ　Ｉ　、　Ｖｏｌ、
４２．ｐｐ、９３−１０４．Ａｕｇａｕｓｔ　１９８５
に発表されたＣＤ４アミノ酸配列に基づいて得られ、酵
母分泌ベクター　ｐＭＶ２Ａｄｅｌに前もってクローニ
ングされた（　Ｗｏｎｇ等のＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１ｏ
ｇｙ４ｏ１．６．ｐｐ、７Ｌ３−７１９，１９８８）。

ｐｃｅｎＡＴａｃｃＤ４を形成するため、第７図に示す
ように、ＣＤ４ＤＮＡは酵母ベクターから回収され、ｐ
ｃｅｎＡＴａｃ上の５ｐｈｌ／ＥｃｏＲＶにクローニン
グされた。得られたプラスミドにおいて１．　ｏｍｐＡ
シグナルおよびＣＤ４は、ＣＤ４ＤＮＡの酵母ベクター
源から取り込まれる９個のコドンによって離間される。

上記のようにして構築されたそれぞれのプラスミドにお
いて、哺乳類の蛋白質をコードしたＤＮＡは、該蛋白質
をＥ．Ｃｏｌｉ周辺質周辺付中可能にするために、ｏｍ
ｐＡシグナルと共に読み取りフレームに取り込まれてい
る。このコーディング領域は、それぞれの場合において
、ｔａｅプロモーター　１ａＣオペレーターおよびコン
センサスリボソーム結合部位を含むコントロール領域の
発現制御下にある。

別の実験において、プラスミドは通常の方法を用いてＥ
．Ｃｏｌｉ宿主Ｊ旧吋中に導入された。そしてこの形質
変換体は、発現される異種蛋白質の位置を特徴付けるた
めに、以下でより正確に示されるプロトコールに従って
培養された。

実施例　３ Ｅ．Ｃｏｌｉによる（ヒト）異種蛋白質の排泄ＴＨ ＰＴＨ排泄ベクターｐＥＴａｃＰＴＩ＋を含むＪ旧吋形
質変換体は、アンピシリンを含むＬＢブロス培地中にお
いて３０℃で一昼夜培養され、次いで新鮮な培地中に接
種され、０Ｄ６００で測定した吸光度が３０に達する（
初期対数期）まで連続して３０℃で培養された。次いで
、培養は誘導された（　１＋ｎＭ　Ｉ　ＰＴＧ）。２時
間の生育間隔で培地の一定量が回収され、分画されて次
のサンプルが作成された。即ち、（１）排泄された生産
物を同定するための培地；（２）周辺質の蛋白質を同定
するための浸透圧ショック溶液；（３）細胞質および周
辺質蛋白質の両者を含み、従って前記ショック溶液との
比較により細胞質蛋白質含有量の示度を提供する音波処
理された溶解質である。

とくに、ＰＴＨ，β−ラクタマーゼ（天然細胞質蛋白質
）およびβ−ガラクトシダーゼ（天然細胞質蛋白質）を
検出し、かつ全蛋白質含有量を測定するために、各分画
の検定を行った。比較のために、誘導されていない培地
についても同様に試験を行った。上記の試験の結果は第
１表に示す通りである。

第１表の説明文 １標準曲線を提供するために、ウシ血球アルブミンを用
いた旧ｏ−Ｒａｄ蛋白質検定により測定された。

２ラジオイムノアッセイＮ−タックキット（Ｎ−ｔａｃ
ｋ　ｋｉｔ）（Ｉｎｅｓｔａｒ　＄１０４１２．　Ｃａ
ｔａｌｏｇ　［６０６５）によって決定された。

３基質としてニトロセフイン（ｎｉｔｏｒｏｃｅｆｉｎ
）を用い、吸光光度測定法１こより検定された（Ａｎｔ
ｉｍｉｃｒｏｂ、Ａｇ、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、Ｖｏｌ、
ｌ、ｐｐ、２８３−２８８．１９７２）　、βガラクト
シダーゼＩＵは、１分間あたり、ニトロセフイン酸１ｎ
ｍｏｌを生産する。

４ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）に従って検定された（　Ｅｘ
ｐｅｒｔｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂ。

ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｂｏｒ、ＮＹ、１９７２）　ｏ　β−ガラクトシダ
ーゼＩＵは、１分間あたり、０−ニトロフェノール１　
ｎｍｏ　Ｉを生産する。

５Ｃは、音波処理により作られる全細胞溶解質を表す。

６Ｐは、浸透圧ショック技術により作られる周辺質分画
を表す（Ｊ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、Ｖｏｌ、２４＋　、
ｐｐ、３０５５３０Ｂ２．１．９［ｉ［ｉ）。

７Ｓは、培地上清を表す。

ＮＤ：　　検出せず 幾つかの重要な発見が第１表で明らかにされている。第
一に、ＰＴＨが培地に排泄されることは明確である。β
−ガラクトシダーゼが培地中に検出されなかったことは
、培地中でのＰＴＨの出現が、細胞融解の結果ではない
ことを示している。さらに、周辺質蛋白質であるβ−ラ
クタマーゼが培地中に出現することは、周辺質からのＰ
Ｔｌｌの放出が特異的上ないことを示している。誘導さ
れていない培養、即ちｌ　ＰＴＧを添加しない培養につ
いての同様の検定から得られた結果は、上記に示した点
において、誘導された培養についての検定と一致した。

しかし、排泄されたＰＴＨの収率はＩＰＴＯの不存在下
で顕著に低下しないことに留意すべきである。

ＩＰＴＧはＩａｅｌ生産物かｔａｃプロモーターを抑制
するのを防止することが知られているなかで、上記の事
実は特に驚くべき発見である。従って、Ｉ　ＰＴＧが存
在せず且つＩａｃｌ生産物の存在する場合に、ＰＴＨレ
ベルは減少することが期待される。何れか一つの方法で
は比較的高収率でＰＴＨを生産でき、培養が早期対数期
に達した後約１０時間で最大収率が実現される。

ＥＧＦ ＥＧＦ排泄プラスミド１）ＥＴａｃＥＧＦを含むｌＥ、
ｃｏｌｉＪＭ１０１形質変換体が、ＰＴＨのために上記
で説明した方法と実質的に同じ方法で評価された。この
結果は、第２表に示したように、ＰＴ）ｌ形質変換体で
の結果を反映している。

３　に の表に示されたデータは、ＥＧＦは培地中に排泄された
が、β−ガラクトシダーゼのデータが示しているように
、これは細胞融解の結果生じたのではないことを明らか
にしている。ｌ　ＰＴＧによる誘導によって、４時間で
のＥＧＦ生産は顕著であり、培養が中期対数期（ｍｉｄ
−１ｏｇ　ｐｈａｓｅ）に達した後約１０時間で最・大
収率が実現される。また、このデータはＩ　Ｐ’Ｔ’Ｇ
誘導が不可欠でないことを明らかにしている。ｌ　ＰＴ
Ｇ効果の不存在は、強力なｔａｅプロモーターと、コン
センサスリボゾーム結合部位との複合効果によって生じ
得る。このコンセンサスリボゾーム結合部位は、普通に
ｔａｃの機能を抑制するＩａｅ生産物によって中和する
にはあまりに強力すぎる。更にある所見として、周辺質
からのＥＧＦの排泄が著しく完全であることが指摘され
る。

Ｄ４ ＣＤ４排泄プラスミドｐｃｅｎＡＴａｃｃＤ４を含むＥ
　、　Ｃ。

１１菌株ＪＭ　１０１が、上記に説明したのと同じ方法
で培養され、培養が早期対数期に達した後にｌ　ＰＴＧ
で誘導された。２時間おきに一定量の培地を採取し、こ
れを透析し、凍結乾燥し且っ０，０２％ＮａＮ３および
１ｍＭ　ＰＭＳＰ　（プロテアーセ分解の阻害剤）を含
むリン酸緩衝生理食塩水中で再構成した後に分析した。

サンプルはザントイッチＥＬＩＳＡフォーマットでのＣ
Ｄ４活性について検定された。このフォーマットでは、
商業的に入手可能なアンチＣＤ４抗体である０ＫＴ４を
捕獲体として用い、また複合体として０ＫＴ４ウレアー
ゼを用いる。この培地を検定した結果は、次の表に示す
通りである。

第３表 ＣＤ４活性の決定 培養誘導 （３０℃） 培養誘導 （３７℃） 誘導後の時間 ０、Ｄ、５９０ ０．２１８ ０．３７７ ０．２６８ ０．３１６ ０．２４７ ０．２２８ Ｄ、１１８５ ０゜２２９ ０．２１１１ ０．２７８ ″δＰ１定値は、背景と比較して修正された。（コント
ロール・宿主／ベクターのみ） 両方の温度で、ＣＤ４が排泄されていることに留意する
のが重要である。３０℃では、ｃｅｎＡ生産物はどのよ
うな有意な程度でも漏出できない（Ｇｕｏ等の上記文献
参照）。従って、ＣＤ４が培地中へ漏出する原因がｅｅ
ｎＡ生産物がであるとは、合理的には考えられない。

　Ｌ−６ １Ｌ−６排泄プラスミドを含むＪＭ　ｌｏｔ形質変換体
の培地を検定した予備実験において、強い陽性の検定結
果が得られた。具体的には、Ｋｏｊ等によって１９８６
．Ｊ、ｌ＋ｎｎ＋ｕｎｏ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ、７Ｂ、ｐ
ｐ、３１７−３２７に記載されたバイオアッセイを用い
て、培地１　ｍｌ当り２５０単位のＩＬ−８活性が検出
された。

上記に例示した各プラスミドによって生産された異種蛋
白質は、排泄された蛋白質のＮ−末端が本物ではない点
において、「成熟コしたものではなかろう。しかし、こ
れらのプラスミドは、余計なＮ−末端アミノ酸残基をコ
ードするＤＮＡを除去することにより、成熟蛋白質のＮ
−末端が直接ｏｍｐＡペプチドのＣ−末端に融合される
ように、部位特異的に変異されることが可能であると思
われる。この処理を詳細に述べるために、Ｋｕｎｋｅｌ
等の上記文献が参照される。部位特異的な変異誘発を導
くオリゴヌクレオチドに向けられた変異誘発（ｏｌｉｇ
ｏｎｕｃｌｅｏｔｊｄｅ−ｄｅｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓ）を実行するために有用なシステムが、
アマ−ジャム・インターナショナル（Ａｍｅｒｓｈａｍ
　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｑｎａｌ　ｐｌｃ）によりキット
の形で商業的に販売されている。ＰＴＨ排泄ベクターの
特殊な場合、即ちＩ）ＥＴａｃＰＴ）Ｉでは、発現され
たときにｏｍ　ｐＡシグナルペプチドに直接融合される
種々の形のＰＴＨ分子、即ちＰＴＨＩ−８４およびＰＴ
ＨＩ−３４を生産するために、変異誘発技術を使用する
ことができる。

実施例　４　　Ｔａｃ排泄ベクタニの修飾−つの型のｐ
ＥＴａｃＰＴＨプラスミドが、ｌ’ａｃ’ｌｑ遺伝子お
よびｐａｒ成分の両方を取り込むことにより修飾された
。この型のプラスミドにおいてはＰＴＨＩ−８４をコー
ドするＤＮＡが、部位特異的な変異誘発によって、ｏｍ
ｐＡシグナルをコードするＤＮＡに直接融合されている
。前記ｐａｒ成分を得るために、Ｅ．Ｃｏｌｉプラスミ
ドｐｓｃ１０１（Ｍ目１ｅｒ等の上記文献）を旧ｎｃＩ
ＩおよびＳｍａｌで切断することにより２．９ｋｂ断片
が放出させ、次いで該断片をＡｖａ　Ｉによって切断し
た。こうして得られたｐａｒ成分を含む３８０ｂｐ１１
ｉｎｃＩＩハｖａｌ断片は、ゲル精製ののち、鈍端連結
によってＴａｃカセットの直接下流にある旧ｎｄＩ［の
中にクローニングされた。得られたプラスミドはｐａｒ
８と称され、その構造は第８図に示す通りである。

次いで、第９図に概略的に示された手段を用いることに
より、、ｌａｃｌ′Ｉ遺伝子がプラスミドｐａｒ８のな
かにクローニングされた。、ｌａｃｌｑ遺伝子を得るた
めに、広範囲宿主プラスミドｐＭＭＢ２２（Ｂａｇｄａ
ｓａｒｉａｎ等の上記文献に記載されている）が旧ｎｄ
ｍで切断された。次いで、ゲル精製されたｆａｃｔｑ遺
伝子を含む１．２ｋｂ断片は、Ｐｖｕ　ＩＩ制限酵素で
消化されたプラスミドｐａｒＢ中に鈍端連結によりクロ
ーニングされ、Ｔａｃカセットの上流に取り込まれた。

次に、上記のようにして得られたｐａｒ成分、ＩａｃＩ
ｑ遺伝子およびＴ　ａ　ｃ　／　Ｐ　Ｔ　Ｈカセットを
含むプラスミドの特性が、種々のＥ．Ｃｏｌｉ宿主菌株
中において検討された。修飾されたプラスミドのＩａｃ
ｌｑ成分の特性を評価するために、、ｌａｃｌＱ遺伝形
質が欠落している野生型のＥ．Ｃｏｌｉ菌株が形質変換
された。

ＤＨＩ、ＲＲＩ、Ｃ６００，ＣＭＫ６０３およびＥＢ５
０５を含む試験された全ての菌株において、ｌ　ＰＴＧ
の誘導に続いて生物活性なＰＴＨ活性が検出され、プラ
スミドにコド化された、ｌａｃｌｑ遺伝子の生産物か作
用することが示された。機能的なｐａｒ活性も、Ｊ旧０
１形質変換体で検出された。ｐａｒ成分を取り込むこと
により、選択的な圧力（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｐｒｅｓ
ｓｕｒｅ）の不存在下においてさえ、多くの世代を通し
てプラスミドの安定した遺伝性が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明に有用なヌクレオチド配列および組
み替えＤＮＡ構造を概略的に説明する図、第２図は、プ
ラスミドｐＥＴａｃを形成するために、ｐＥと称される
プラスミドｐＵｃ１８の誘導体中にＴａｃ構造を取り込
むことを示す図、 第３図は、ｐｃｅｎＡＴａｃを形成するために、Ｃ，ｆ
ｉｍｉｅｅｍＡ遺伝子も組み込んだＴａｃ含有プラスミ
ドの構造を示す図、 第４図は、ｐＥＴａｃＰＴ’Ｈを形成するために、ヒト
上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）をコードするＤＮＡをｐＥ
Ｔａｃ中に取り込むことを示す図、第５図は、ｐＥＴａ
ｃＥＧＦを形成するために、ヒト成長ホルモン（ＥＧＦ
）をコードするＤＮＡをｐＥＴａｃ中に取り込むことを
示す図、 第６図は、ｐｃｅｎＡＴａｃ　Ｉ　Ｌ６を形成するため
に、インターロイキン−６（ＩＬ−［ｉ）をコードする
ＤＮＡをｐｃ６１ＡＴａｃベクター中に取り込むことを
示す図、第７図は、ｐｃｅｎＡＴａｃｃＤ４を形成する
ために、ＣＤ４の細胞外ドメインをコードするＤＮＡを
ｐｃｅｎＡＴａｃの中に取り込むことを示す図、第８図
は、ｐＥＴａｃＰＴＨの変種のなかにｐａｒ成分を取り
込むことを概略的に示す図、および第９図は、第８図に
示すｐａｒ成分を含むｐＥＴａｃＰＴＨの変種のなかに
、１ｌａｃ遺伝子を取り込むことを概略的に示す図であ
る。 筑 図 第 図 第６ 図 第 図

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）コーディング領域であって、該領域内では異質蛋
   白質をコードするＤＮＡが、読み取りフレーム（ｒｅａ
   ｄｉｎｇｆｒａｍｅ）中において、前記蛋白質の周辺質
   への分泌を可能とするｏｍｐＡシグナルペプチドをコー
   ドするＤＮＡと結合されているコーディング領域と、 前記コーディング領域の発現を可能とする ように、コーディング領域と実施可能に（ｏｐｅｒａｂ
   ｌｙ）にリンクされたコントロール領域であって、該コ
   ントロール領域にはｔａｃプロモーター、ｌａｃオペレ
   ーターおよびコンセンサスリボソーム結合部位（ｃｏｎ
   ｓｅｎｓｕｓｒｉｂｏｓｏｍｅｂｉｄｉｎｇｓｉｔｅ）
   が含まれるコントロール領域とを具備した、Ｅ．Ｃｏｌ
   ｉから異種蛋白質の排泄を得るために有用な組み替えＤ
   ＮＡ構造。
2. （２）異種蛋白質を排泄するＥ．Ｃｏｌｉを製造するた
   めに有用なＥ．Ｃｏｌｉ排泄ベクタ−であって、前記ベ
   クターが請求項１に定義した組み替えＤＮＡ構造を含む
   ベクター。
3. （３）前記ベクターによってコードされる前記異種蛋白
   質が哺乳動物の蛋白質である、請求項２に記載のベクタ
   ー。
4. （４）前記異種蛋白質がヒトＰＴＨまたはその断片であ
   る請求項３に記載のベクター。
5. （５）前記異種蛋白質がヒトインターロイキン−６であ
   る請求項３に記載のベクター。
6. （６）前記異種蛋白質がＣＤ４の細胞外ドメインである
   請求項３に記載のベクター。
7. （７）前記異種蛋白質がヒトＥＧＦである請求項３に記
   載のベクター。
8. （８）前記異種蛋白質がヒトＰＴＨである請求項４に記
   載のベクター。
9. （９）更にｌａｃＩ＾ｑ遺伝子を具備した請求項２に記
   載のＥ．Ｃｏｌｉ排泄ベクター。
10. （１０）更にｐａｒ要素を具備した請求項２に記載のＥ
    ．Ｃｏｌｉ排泄ベクター。
11. （１１）その培養の際に異種蛋白質を培地中に排泄する
    Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株であって、請求項２に記載の排泄ベク
    ターによる形質転換によって得られた菌株。
12. （１２）その培養の際にヒトＰＴＨまたはその断片を培
    地中に排泄するＥ．Ｃｏｌｉ菌株であって、請求項４に
    記載の排泄ベクターによる形質転換によって得られた菌
    株。
13. （１３）その培養の際にヒトインターロイキン−６を培
    地中に排泄するＥ．Ｃｏｌｉ菌株であって、請求項５に
    記載の排泄ベクターによる形質転換によって得られた菌
    株。
14. （１４）その培養の際にＣＤ４の細胞外ドメインを培地
    中に排泄するＥ．Ｃｏｌｉ菌株であって、請求項６に記
    載の排泄ベクターによる形質転換によって得られた菌株
    。
15. （１５）その培養の際にヒトＥＧＦを培地中に排泄する
    Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株であって、請求項７に記載の排泄ベク
    ターによる形質転換によって得られた菌株。
16. （１６）異種蛋白質を生産するための方法であって、請
    求項１１に記載のＥ．Ｃｏｌｉ菌株を培地中で培養する
    ことと、次いでこの菌株が培養された培地から直接、異
    種蛋白質を回収することとを具備した方法。
17. （１７）宿主が約３０℃で培養される請求項１６に記載
    の方法。
18. （１８）宿主がＩＰＴＧの不存在下で培養される請求項
    １６に記載の方法。
19. （１９）ヒトＰＴＨを生産するための方法であって、請
    求項１２に記載のＥ．Ｃｏｌｉ菌株を培地中で培養する
    ことと、次いでこの菌株が培養された培地から直接、ヒ
    トＰＴＨを回収することとを具備した方法。
20. （２０）ヒトＥＧＦを生産するための方法であって、請
    求項１５に記載のＥ．Ｃｏｌｉ菌株を培地中で培養する
    ことと、次いでこの菌株が培養された培地から直接、ヒ
    トＥＧＦを回収することとを具備した方法。