CN117466990A - 一种重组人源xvii型胶原蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物基因工程重组技术领域，具体涉及一种重组人源XVII型胶原蛋白及其制备方法与应用。本发明通过基因工程方法结合谷氨酸棒状杆菌表达系统，得到不同区域的重组COL蛋白，对其功能进行比较，结果显示重组COL17‑2蛋白在促进毛囊干细胞增殖、迁移、黏附以及促进小鼠毛发生长的活性等效果最佳，本发明进一步对序列的信号肽进行筛选和优化，实现了COL17的分泌表达，极大简化了蛋白的纯化步骤，节约了成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物基因工程重组技术领域，具体涉及一种重组人源XVII型胶原蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
胶原蛋白作为一类主要的结构蛋白，在哺乳动物体内发挥着重要的力学支撑和信号传递作用。其中，XVII型胶原蛋白(COL17)，也被称为BP180，是一种位于真表皮交界处的II型跨膜蛋白，作为半桥粒蛋白(位于真皮-表皮基底膜区的多蛋白复合体，可介导角质形成细胞与下层膜的粘附)中的重要组成成分，对维持基底膜与细胞外基质间的紧密连接具有重要作用。
在COL17的胞外域中(489-1497aa)，存在15个胶原域和16个非胶原域，这些结构域共同参与了与细胞外基质的相互作用。COL17形成的半桥粒将表皮干细胞连接到基底膜，同时调节肌动蛋白和角丝蛋白网络，协调表皮干细胞的迁移和更新，从而在皮肤更新中发挥重要的调节作用。随着时间的推移和生活环境因素的影响，COL17在人体中的含量会逐渐减少，从而导致皮肤老化、脱发等问题。由于COL17的胞外域活性位点多且分布广、可溶性强，且易于表达和分泌，成为目前重组COL17研发的主要对象。
但COL17的胞外域也可能被其他自身免疫性水疱性皮肤病中的自身抗体靶向，包括粘膜类天疱疮(MMP)和线性IgA大疱性病症(LABD)。BP自身抗体的主要表位紧密聚集在COL17的近膜细胞外非胶原第16A(NC16A)结构域内，之前的研究已经揭示了免疫球蛋白G(IgG)类自身抗体的致病性，这些抗体指向NC16A区域。研究表明在COL17的胞外域中的氨基酸片段490-567aa、774-807aa和1136-1413aa存在BP自身抗原识别位点，包含这些序列的蛋白多肽可能会被BP自身抗体所识别，产生过敏反应。因此，筛选出不含BP自身抗原识别序列，同时对脱发具有调控作用的COL17功能多肽具有重要的作用。
人源XVII型胶原蛋白(COL17)属于跨膜类的胶原蛋白，有胞内区、跨膜区、胞外区。一般来说跨膜蛋白于真核细胞中表达时多数时候并不会分泌于胞外，而是会固定于细胞膜上，而且COL17的氨基酸序列很长(1497个氨基酸)、蛋白质分子量较大(180kDa)，理论上很难有效分泌于胞外且易于降解，要成功表达就需要进行相关序列的选取。现有技术中重组COL17的表达主要通过对部分功能序列进行串联表达和氨基酸优化来实现，并未对胞外段的核心结构域进行对比和分析。
此外，在现有技术中，通过大肠杆菌表达的COL17存在表达产物需要纯化、原核表达系统容易形成包涵体、获得的COL17生物学活性较低等问题。而毕赤酵母表达的COL17则存在表达上清液中含有有害甲醇成分、去除甲醇成本高、酵母生长周期长和生产成本高等问题。
谷氨酸棒状杆菌是一种好氧的、无芽胞的、细胞为短小棒状呈“八”字排列的革兰氏阳性菌，属于放线菌目棒状杆菌属，是一种公认的安全菌株。在表达重组蛋白方面，谷氨酸棒状杆菌具有较高的表达水平和高质量的蛋白表达，其表达的蛋白质量比大肠杆菌更高、更稳定，并且更容易纯化。由于谷氨酸棒状杆菌的细胞壁结构和代谢途径不同于大肠杆菌，它在表达蛋白时会产生不同的蛋白折叠和修饰方式，进而可以提高表达蛋白的可溶性和纯化效率。
如何筛选出COL17胞外段的核心结构域并将其在谷氨酸棒状杆菌表达系统中进行有效重组表达，可为大规模生产重组COL17、开发高效的绿色制造平台提供思路和方向，从而为日化、护肤、保健和医疗等领域提供新的解决方案。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种重组人源XVII型胶原蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种重组载体，该重组表达载体包含编码上述重组人源XVII型胶原蛋白的基因。
本发明的第三个目的在于提供一种重组表达菌株，该重组表达菌株包含上述重组表达载体。
本发明的第四个目的在于提供一种重组人源XVII型胶原蛋白的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种重组人源XVII型胶原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
编码所述的重组人源XVII型胶原蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述的重组人源XVII型胶原蛋白的上游还包括信号肽，信号肽的氨基酸序列如下所示：
MLNRVSRIAGASAITLCIGLTTILSPTSTAQS；
所述的信号肽的核苷酸序列如下示：
ATGTTAAACAGAGTCAGTCGTATTGCAGGCGCTTCTGCAATCACACTATGCATCGGC TTAACCACAATACTAAGCCCTACTTCCACTGCACAAAGC；
一种重组载体，该重组表达载体包含编码上述重组人源XVII型胶原蛋白的基因；
所述的重组载体，是将上述编码重组人源XVII型胶原蛋白的基因克隆进入表达载体得到；
所述的表达载体优选为pET20b或pXMJ19；
一种重组表达菌株，为含有上述重组表达载体的宿主菌株，是将上述重组表达载体转入宿主菌株得到；
所述的宿主菌株为细菌或酵母；
所述的细菌优选为谷氨酸棒杆菌；
所述的谷氨酸棒杆菌优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032；
一种重组人源XVII型胶原蛋白的制备方法，包含如下步骤：
(1)将上述编码重组人源XVII型胶原蛋白的基因克隆进入表达载体，得到重组表达载体；
(2)将重组表达载体转入宿主菌株，得到重组表达菌株；
(3)将重组表达菌株诱导表达，分离纯化，得到重组人源XVII型胶原蛋白；
所述的表达载体为pXMJ19；
所述的宿主菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032；
所述的诱导表达的条件为在OD600＝0.6-0.8的菌液中加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂，表达6h；
所述的分离纯化的具体操作为：
诱导表达后，离心收集上清，过滤，采用His TrapTM HP 5mL亲和纯化；
所述的重组人源XVII型胶原蛋白在药品、医疗器械、生物材料、组织工程或日化产品领域中的应用；
所述的日化产品优选为护发或护肤产品；
所述的重组人源XVII型胶原蛋白在制备生物修复产品中的应用；
本发明的原理：
为了筛选出XVII型胶原蛋白胞外段的核心结构域，本发明通过基因工程方法结合谷氨酸棒状杆菌表达系统，得到不同区域的重组COL蛋白，对其功能进行比较，结果显示重组COL17-2蛋白在促进毛囊干细胞增殖、迁移、黏附以及促进小鼠毛发生长的活性等效果最佳，本发明进一步对序列的信号肽进行筛选和优化，实现了COL17的分泌表达，极大简化了蛋白的纯化步骤，节约了成本。
本发明提供的谷氨酸棒状杆菌表达重组COL17-2具有如下优势：
质量高：谷氨酸棒状杆菌在表达重组蛋白方面具有较高的表达水平和高质量的蛋白表达。相对于大肠杆菌，谷氨酸棒状杆菌表达的蛋白质量更高、更稳定，并且更容易纯化。
可溶性高：由于谷氨酸棒状杆菌的细胞壁结构和代谢途径不同于大肠杆菌，所以它在表达蛋白时会产生不同的蛋白折叠和修饰方式，因此可以提高表达蛋白的可溶性和纯化效率。
适用性广：谷氨酸棒状杆菌表达系统适用于多种重组蛋白的表达，包括复杂的膜蛋白、异源蛋白、大分子蛋白等，而大肠杆菌表达系统在表达这些复杂蛋白时往往会出现问题。
不含内毒素：谷氨酸棒状杆菌不会产生内毒素，因此在表达重组蛋白时不需要进行内毒素的去除步骤，能够大大减少对重组蛋白质量的影响。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明利用谷氨酸棒状杆菌表达重组COL17-1蛋白、重组COL17-2蛋白、重组COL17-3蛋白，对其在促进毛囊干细胞增殖，迁移，黏附以及促进小鼠毛发生长的活性进行比较，筛选出最优的蛋白片段为COL17-2。并通过信号肽的筛选，获得了能够进行分泌表达的菌株。
(2)本发明提供的重组COL17-2蛋白具有与商品化的天然人胶原相同或更优的细胞粘附活性、促细胞迁移活性、组织修复和促进毛囊修复再生等多种生物学活性，能达到真正产品应用的目的。
(3)本发明的重组COL17-2蛋白可用于皮肤和毛囊组织的修复，提升皮肤和毛囊的抵抗力，适用于制备护发、护肤及相关医药领域应用的产品，尤其是用于抑制毛囊干细胞的衰老、延缓脱发等日化产品及药物的开发和应用。
(4)本发明中重组COL17-2蛋白选取的序列为经过筛选优化的序列组合而成，其氨基酸序列与天然胶原蛋白氨基酸序列相应部分同源性为100％，且重组COL17-2蛋白序列中不含潜在的抗原识别位点，无免疫原性，可以广泛应用于医药、医疗器械、生物材料、组织工程、化妆品等领域。
(5)本发明中重组COL17-2蛋白可于谷氨酸棒状杆菌表达系统中高效分泌表达，易于纯化获得高纯度的胶原蛋白；编码氨基酸序列的基因DNA序列进行了优化设计，使得构建的工程菌株蛋白表达量很高，可于高密度发酵表达时获得很高的产量；谷氨酸棒状杆菌易于进行高密度发酵表达，本发明筛选的菌种己能实现100L级中试规模的高密度高表达量发酵，已具备工业化广大生产的条件。
附图说明
图1是COL17结构示意图。
图2是实施例2诱导表达的重组COL17蛋白的SDS-PAGE图谱图。
图3是纯化后的重组COL17蛋白的SDS-PAGE图谱图。
图4是重组COL17蛋白对毛囊干细胞增殖的影响结果分析图。
图5是重组COL17蛋白对毛囊干细胞迁移的影响结果分析图。
图6是重组COL17蛋白对毛囊干细胞黏附的影响结果分析图。
图7是重组COL17蛋白促进小鼠毛发生长的结果分析图。
图8是实施例8信号肽筛选结果分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中的pET20b购自广州景研生物科技有限公司；大肠杆菌DH5α感受态购自上海生工；穿梭载体pXMJ19、大肠杆菌JM109和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032感受态等购自广州市齐云生物技术有限公司；人毛囊干细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；含有10％ FBS的DMEM培养基购自美国Gibco公司；细胞培养箱购自美国赛默飞公司；CCK8购自MCE公司；C57小鼠购自广东省医学实验动物中心。
实施例1重组人源XVII型胶原蛋白(COL17)表达系统构建
(1)根据GenBank中人源XVII型胶原蛋白(COL17)全长序列(Accession：NP_000485.3)截取人源XVII型胶原蛋白胞外段的序列，对胞外段的序列进行分析；将胞外段的序列分成3段，分别为COL17-1(489-820aa)、COL17-2(812-1148aa)和COL17-3(1144-1480aa)；
(2)在COL17-1(489-820aa)、COL17-2(812-1148aa)和COL17-3(1144-1480aa)对应核苷酸序列的基础上引入限制性核酸内切酶酶切位点(Nco I和Xho I)，然后进行基因合成(瑞捷生物)，得到带有酶切位点的COL17-1(489-820aa)、COL17-2(812-1148aa)和COL17-3(1144-1480aa)基因片段；
(3)按照常规方法，将上述带有酶切位点的COL17-1(489-820aa)、COL17-2(812-1148aa)和COL17-3(1144-1480aa)基因片段以及pET20b分别采用Nco I和Xho I 37℃双酶切1h，然后采用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化酶切产物；酶切、纯化后的基因片段和pET20b采用T4 DNA连接酶于4℃过夜连接；将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，菌液涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，然后挑取转化子37℃液体培养，提取质粒，经PCR鉴定和测序鉴定，得到含目的基因片段的重组质粒pET20b-COL17-1、pET20b-COL17-2和pET20b-COL17-3；
(4)将步骤(3)获得的重组质粒pET20b-COL17-1、pET20b-COL17-2、pET20b-COL17-3和穿梭载体pXMJ19分别采用相应酶(基因片段、具体酶及酶切位点如下所示)37℃双酶切1h，然后采用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化酶切产物；酶切、纯化后的基因片段和pXMJ19采用T4 DNA连接酶于4℃过夜连接；将连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态中，菌液涂布于含30μg/mL氯霉素的LB平板，然后挑取转化子37℃液体培养，提取质粒，经双酶切鉴定和测序验证，得到COL17-1、COL17-2和COL17-3基因片段正确插入到穿梭载体pXMJ19相应酶切位点的重组质粒，分别命名为pXMJ19-COL17-1、pXMJ19-COL17-2和pXMJ19-COL17-3。
(5)将步骤(4)获得的重组质粒pXMJ19-COL17-1、pXMJ19-COL17-2和pXMJ19-COL17-3通过电击转化法转入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032感受态细胞中，菌液涂布于含25μg/ml卡那霉素的LB平板，通过抗性筛选阳性转化子，并经菌落PCR鉴定，得到重组质粒正确转入的重组表达菌株C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-COL17-1、C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-COL17-2和C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-COL17-3。
带酶切位点的编码COL17-1的基因片段序列为：
其中，划线部分依次分别为：Hind III和EcoR I酶切位点；
COL17-1氨基酸序列为：
AEEVRKLKARVDELERIRRSILPYGDSMDRIEKDRLQGMAPAAGADLDKIGLHSDSQEELWMFVRKKLMMEQENGNLRGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGPPGSGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGPDGHQGPRGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGKPGLTGPQGPQGLPGTPGRPGIKGEPGAPGKIVTSEGSSMLTVP
带酶切位点的编码COL17-2的基因片段序列为：
其中，划线部分依次分别为：BamH I和EcoR I酶切位点；
COL17-2氨基酸序列为：
EGSSMLTVPGPPGPPGAMGPPGPPGAPGPAGPAGLPGHQEVLNLQGPPGPPGPRGPPGPSIPGPPGPRGPPGEGLPGPPGPPGSFLSNSETFLSGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSTSGSSSFGLNLQGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPSGPSEGGSSSTMYVSGPPGPPGPPGPPGSISSSGQEIQQYISEYMQSDSIRSYLSGVQGPPGPPGPPGPVTTITGETFDYSELASHVVSYLRTSGYGVSLFSSSISSEDILAVLQRDDVRQYLRQYLMGPRGPPGPPGASGDGSLLSLDYAELSSRILSYMSSSGISIGLP
带酶切位点的编码COL17-3的基因片段序列为：
其中，划线部分依次分别为：Hind III和Xbal I酶切位点；
COL17-3氨基酸序列为：
SIGLPGPPGPPGLPGTSYEELLSLLRGSEFRGIVGPPGPPGPPGIPGNVWSSISVEDLSSYLHTAGLSFIPGPPGPPGPPGPRGPPGVSGALATYAAENSDSFRSELISYLTSPDVRSFIVGPPGPPGPQGPPGDSRLLSTDASHSRGSSSSSHSSSVRRGSSYSSSMSTGGGGAGSLGAGGAFGEAAGDRGPYGTDIGPGGGYGAAAEGGMYAGNGGLLGADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGISKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKG
实施例2重组人源XVII型胶原蛋白(COL17)的诱导表达
(1)以实施例1获得的重组表达菌株C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-COL17-1、C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-COL17-2和C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-COL17-3为对象，挑取阳性转化子单菌落至5mL BHI培养基中，30℃、200rpm过夜培养，次日转接于新的BHI培养基中，摇菌至OD600＝0.6-0.8之间；
(2)在菌液中加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂表达6h，然后12000rpm离心处理2min，分离菌体和上清；
(3)取步骤(2)制得的菌体用PBS重悬，置于均质机进行破碎，离心，取上清进行SDS-PAGE分析，其中，SDS凝胶上样缓冲液的成分包括：60mM的Tris-HCl(pH6.8)、质量分数为25％的甘油、质量分数为2％的SDS、14.4mM的β-巯基乙醇、体积分数为0.1％的溴酚兰。
结果见图2，重组COL17-1蛋白、重组COL17-2蛋白和重组COL17-3蛋白的分子量大小约为35kD，其中，重组COL17-2蛋白的表达量为2.5g/L，COL17-1蛋白的表达量为1.06g/L，COL17-3蛋白的表达量为1.78g/L，COL17-2蛋白的表达量较重组COL17-1蛋白和重组COL17-3蛋白高。
实施例3重组COL17蛋白的纯化
(1)按照实施例2制备菌体；然后将其用PBS重悬，置于均质机进行破碎；离心收集上清，过滤；
(2)将过滤后的溶液用His TrapTM HP 5mL亲和纯化，具体方法为：
①先用5倍柱体积结合缓冲液A(20mmol/L Na2HPO4、20mmol/L NaH2PO4、500mmol/LNaCl、10mmol/L咪唑、pH7.4)平衡，再以5mL/min的流速上样；
②上样结束后，用洗脱缓冲液B(20mmol/L Na2HPO4、20mmol/L NaH2PO4、500mmol/LNaCl、50-500mmol/L咪唑、pH7.4)进行梯度洗脱，具体洗脱梯度为：(a)20mmol/L Na2HPO4、20mmol/L NaH2PO4、500mmol/L NaCl、50mmol/L咪唑，pH7.4；(b)20mmol/L Na2HPO4、20mmol/L NaH2PO4、500mmol/L NaCl、100mmol/L咪唑，pH7.4；(c)20mmol/L Na2HPO4、20mmol/LNaH2PO4、500mmol/L NaCl、500mmol/L咪唑，pH7.4；经上述3个梯度洗脱后，获得目的蛋白；
④利用SDS-PAGE分析纯化情况。
结果见图3，从图3中可以看出，纯化后的蛋白分子量符合理论值，呈现单一条带，且蛋白无降解。
实施例4重组COL17促进细胞增殖活性检测
(1)样品溶液配制
用无血清DMEM培养基稀释实施例3获得的重组COL17-1蛋白、重组COL17-2蛋白和重组COL17-3蛋白样品至10μg/mL；
(2)将处于对数生长期的人毛囊干细胞用含有10％ FBS的DMEM培养基、常规培养至80～90％，然后用0.25％(m/v)胰蛋白酶消化并重悬，以7.0×103个/孔的细胞数目接种于96孔板，培养8h后，换无血清DMEM培养基继续培养16h；
(3)培养结束后，将无血清DMEM培养基吸出，加入步骤(1)制得的含浓度为10μg/mL的重组COL17蛋白的无血清DMEM培养基100μL，每个浓度设3个孔计算误差。然后放入细胞培养箱(37℃，5％CO2，赛默飞公司，美国)培养24h；
(4)培养结束后，将孔内培养基吸出，再加入含有10％CCK8(购于MCE公司)的无血清DMEM培养基，置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中孵育1h；120转振荡30秒，然后于450nm波长下检测吸光值。
结果如图4所示，重组COL17-1蛋白、重组COL17-2蛋白和重组COL17-3蛋白均表现出促毛囊干细胞增殖活性，其中COL17-2的活性最高。
实施例5重组COL17细胞划痕试验
(1)样品溶液配制
用无血清DMEM培养基稀释实施例3获得的重组COL17-1蛋白、重组COL17-2蛋白和重组COL17-3蛋白样品至10μg/mL，以下操作均在无菌条件下进行；
(2)操作过程
①先用Maker笔在12孔板背后，用直尺比划参考线，横穿过孔中心，每孔至少穿过2条线；
②用0.25％(m/v)胰蛋白酶消化处于对数期的人毛囊干细胞，然后用10％FBS的DMEM培养基重悬，以15万个/mL，1mL/孔接种细胞至12孔板中；
③第二天观察人毛囊干细胞长至90％后，吸弃原细胞12孔板中的培养基，残留100～200μL培养基，用200μL枪头比着直尺，尽量垂直于背后的参考线划痕，枪头要垂直，不能倾斜；用PBS洗涤细胞1～2次，去除脱落下的细胞，镜下观察没有漂浮的细胞即为洗涤干净；再加入步骤(1)制得的含浓度为10μg/mL的重组COL17蛋白的无血清DMEM培养基，1ml/孔，做好标记；用显微镜(徕卡公司，德国)记录细胞划痕照片，记为0小时；记录完成后，再放入细胞培养箱(37℃，5％CO2)培养；按24h和48h选取位置拍照(每组拍摄的不同时间点要求是同一位置)，可根据实际情况调整拍摄时间；
结果如图5所示，10μg/mL的重组COL17-1蛋白、重组COL17-2蛋白和重组COL17-3蛋白均具有良好的促细胞迁移活性，其中重组COL17-2蛋白的促迁移活性最佳，且在促进人毛囊干细胞迁移方面显著高于市售的三型胶原蛋白。
实施例6重组COL17蛋白细胞粘附试验
(1)样品溶液配制
用无血清DMEM培养基(Gibco公司，美国)稀释重组COL17-1、重组COL17-2和重组COL17-3样品至10μg/mL，以上操作均在无菌条件下进行。
(2)操作过程
用步骤(1)制得的含浓度为10μg/mL的重组COL17蛋白的无血清DMEM培养基预铺96孔板，70μL/孔，4℃过夜后，PBS洗3遍，再用质量分数为1％的BSA于37℃封闭1h，PBS洗3遍；将待测人毛囊干细胞培养至对数生长期，0.25％(m/v)胰蛋白酶消化细胞，用无血清DMEM培养基悬浮细胞，调整浓度为5×105/mL；分别接种于预铺重组COL17蛋白的96孔板中，每个孔加入100μL细胞悬液，使得每个孔内的细胞数为5000个细胞，每组设3个复孔。37℃孵育1h后，PBS洗去未黏附的细胞；加入含有10％CCK8(购于MCE公司)的无血DMEM清培养基，置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中孵育1h，振荡，然后于450nm波长下检测吸光值；
结果如图6所示，重组COL17-2蛋白和重组COL17-3蛋白对毛囊干细胞的粘附具有促进作用，二者的促进作用相当，在促进毛囊干细胞粘附方面显著高于市售的三型胶原蛋白。
实施例7重组COL17蛋白对脱发的改善作用
(1)C57小鼠适应性喂养(提供饲料和水，提供清洁、干燥、通风的环境并定期更换垫料，以确保实验小鼠的健康和良好的实验表现)1周后，用质量体积比为1％的戊巴比妥钠溶液按照50mg/kg的剂量通过腹腔注射麻醉小鼠，用小动物剃毛器在小鼠背部剃出面积为2cm*2cm的脱毛区域，然后将脱毛膏涂抹于剃毛部位维持5min，5min后用0.9％生理盐水洗去脱毛膏，分组并拍照；
(2)将小鼠分为两组，其中，模型组：于脱毛后第1d起，按照10mg/kg的剂量局部涂抹质量体积比为0.5％的睾酮乙醇溶液(溶解方式为睾酮溶于50％的乙醇溶液中)，每天1次，直至第21d；COL17组：于脱毛后第1d起，每天上午在剃毛区域采用10mg/kg的剂量涂抹质量体积比为0.5％的睾酮乙醇溶液，下午在同区域涂抹100μL浓度为1mg/mL的重组COL17蛋白，共处理21d；
(3)于脱毛后21天比较两组剃毛部位毛发生长与毛囊生长情况。
结果如图8所示，重组COL17-1蛋白、重组COL17-2蛋白和重组COL17-3蛋白均对雄激素诱导的脱发具有一定的改善作用，其中重组COL17-2蛋白的改善作用最佳。
实施例8重组人源XVII型胶原蛋白(COL17-2)信号肽筛选
上述实施例通过筛选明确了COL17-2的序列为促进毛发生长的核心功能片段，然而，上述蛋白为胞内表达，不能分泌。研究表明谷氨酸棒状杆菌具有两条主要分泌途径，通过不同信号肽使蛋白质穿过细胞膜，分别是分泌未折叠蛋白的依赖型和转运折叠蛋白的依赖型。为了实现COL17-2的分泌表达，本发明通过在目的片段的上游添加信号肽，筛选合适的信号肽，实现COL17-2的分泌表达。具体方法如下所示：
(1)根据COL17-2的序列特征，设计了4条包含酶切位点Hind III和BamH I的信号肽序列(见表1)，送至苏州金唯智生物科技有限公司合成；信号肽序列及实施例1制得的pXMJ19-COL17-2质粒经过Hind III和BamH I酶切，其中，酶切条件为37℃双酶切1h；
表1信号肽的序列
注：AAGCTT为Hind III，GGATCC为BamH I酶切位点；
(2)将步骤(1)中的酶切产物回收，16℃过夜连接，连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态中，菌液涂布于含30μg/mL氯霉素的LB平板，培养12～14h挑取单菌落培养，提取质粒，送基因测序；测序验证正确后，将质粒命名为pXMJ19-COL17-2(1243)、pXMJ19-COL17-2(1109)、pXMJ19-COL17-2(0413)和pXMJ19-COL17-2(1514)；
COL17-2(0413)核苷酸序列：
atgaagcttcttcgccgcatcgctgcaccagccatcgcgctgggaattgcgatgtccaccattgtcac gccatccaccgcaggGAGGGGTCATCGATGCTCACTGTCCCAGGCCCCCCAGGACCTCCTGGAGCCATGGGACCCCCAGGACCTCCAGGTGCCCCAGGCCCTGCCGGCCCAGCTGGTCTCCCAGGACATCAAGAAGTTCTTAATTTACAAGGTCCCCCAGGCCCACCCGGCCCACGCGGGCCACCAGGGCCTTCCATTCCAGGCCCACCAGGACCCCGAGGCCCACCAGGGGAGGGTTTGCCAGGCCCACCAGGCCCACCAGGATCGTTCCTGTCCAACTCAGAAACCTTCCTCTCCGGCCCCCCAGGCCCACCTGGCCCCCCAGGTCCCAAGGGAGACCAAGGTCCCCCAGGCCCCAGAGGACACCAAGGCGAGCAAGGCCTCCCAGGTTTCTCAACCTCAGGGTCCAGTTCTTTCGGACTCAACCTTCAGGGACCACCAGGCCCACCTGGCCCCCAGGGACCCAAAGGTGACAAAGGTGATCCAGGTGTTCCAGGGGCTCTTGGCATTCCTAGTGGTCCTTCTGAAGGGGGATCATCAAGTACCATGTACGTGTCAGGCCCGCCAGGGCCCCCTGGGCCCCCTGGGCCTCCGGGCTCTATCAGCAGCTCTGGCCAGGAGATTCAGCAGTACATCTCTGAGTACATGCAGAGTGACAGTATTAGATCTTACCTATCCGGAGTTCAGGGTCCCCCAGGCCCACCTGGTCCCCCAGGACCTGTCACCACCATCACAGGCGAGACTTTCGACTACTCAGAGCTGGCAAGCCACGTTGTGAGCTACTTACGGACTTCGGGGTACGGTGTCAGCTTGTTCTCGTCCTCCATCTCTTCTGAAGACATTCTGGCTGTGCTGCAGCGGGATGACGTGCGTCAGTACCTACGTCAGTACTTGATGGGCCCTCGGGGTCCGCCAGGGCCACCAGGAGCCAGTGGAGATGGGTCCCTCCTGTCTTTGGACTATGCAGAGCTGAGTAGTCGCATTCTCAGCTACATGTCGAGTTCTGGGATCAGCATTGGGCTTCCT
COL17-2(1109)核苷酸序列：
atgaagctttcacaccgcatcgcagcaatggcagcaaccgcaggcatcacagtggcagcattcgcagc acctgcttccgcaGAGGGGTCATCGATGCTCACTGTCCCAGGCCCCCCAGGACCTCCTGGAGCCATGGGACCCCCAGGACCTCCAGGTGCCCCAGGCCCTGCCGGCCCAGCTGGTCTCCCAGGACATCAAGAAGTTCTTAATTTACAAGGTCCCCCAGGCCCACCCGGCCCACGCGGGCCACCAGGGCCTTCCATTCCAGGCCCACCAGGACCCCGAGGCCCACCAGGGGAGGGTTTGCCAGGCCCACCAGGCCCACCAGGATCGTTCCTGTCCAACTCAGAAACCTTCCTCTCCGGCCCCCCAGGCCCACCTGGCCCCCCAGGTCCCAAGGGAGACCAAGGTCCCCCAGGCCCCAGAGGACACCAAGGCGAGCAAGGCCTCCCAGGTTTCTCAACCTCAGGGTCCAGTTCTTTCGGACTCAACCTTCAGGGACCACCAGGCCCACCTGGCCCCCAGGGACCCAAAGGTGACAAAGGTGATCCAGGTGTTCCAGGGGCTCTTGGCATTCCTAGTGGTCCTTCTGAAGGGGGATCATCAAGTACCATGTACGTGTCAGGCCCGCCAGGGCCCCCTGGGCCCCCTGGGCCTCCGGGCTCTATCAGCAGCTCTGGCCAGGAGATTCAGCAGTACATCTCTGAGTACATGCAGAGTGACAGTATTAGATCTTACCTATCCGGAGTTCAGGGTCCCCCAGGCCCACCTGGTCCCCCAGGACCTGTCACCACCATCACAGGCGAGACTTTCGACTACTCAGAGCTGGCAAGCCACGTTGTGAGCTACTTACGGACTTCGGGGTACGGTGTCAGCTTGTTCTCGTCCTCCATCTCTTCTGAAGACATTCTGGCTGTGCTGCAGCGGGATGACGTGCGTCAGTACCTACGTCAGTACTTGATGGGCCCTCGGGGTCCGCCAGGGCCACCAGGAGCCAGTGGAGATGGGTCCCTCCTGTCTTTGGACTATGCAGAGCTGAGTAGTCGCATTCTCAGCTACATGTCGAGTTCTGGGATCAGCATTGGGCTTCCT
COL17-2(1243)核苷酸序列：
atgtcttctgcgtcatttaccaccaaagcactgtccgtactcgcagctttaacggctgcgtctgcccc cttagtggcggcgtcaccGAGGGGTCATCGATGCTCACTGTCCCAGGCCCCCCAGGACCTCCTGGAGCCATGGGACCCCCAGGACCTCCAGGTGCCCCAGGCCCTGCCGGCCCAGCTGGTCTCCCAGGACATCAAGAAGTTCTTAATTTACAAGGTCCCCCAGGCCCACCCGGCCCACGCGGGCCACCAGGGCCTTCCATTCCAGGCCCACCAGGACCCCGAGGCCCACCAGGGGAGGGTTTGCCAGGCCCACCAGGCCCACCAGGATCGTTCCTGTCCAACTCAGAAACCTTCCTCTCCGGCCCCCCAGGCCCACCTGGCCCCCCAGGTCCCAAGGGAGACCAAGGTCCCCCAGGCCCCAGAGGACACCAAGGCGAGCAAGGCCTCCCAGGTTTCTCAACCTCAGGGTCCAGTTCTTTCGGACTCAACCTTCAGGGACCACCAGGCCCACCTGGCCCCCAGGGACCCAAAGGTGACAAAGGTGATCCAGGTGTTCCAGGGGCTCTTGGCATTCCTAGTGGTCCTTCTGAAGGGGGATCATCAAGTACCATGTACGTGTCAGGCCCGCCAGGGCCCCCTGGGCCCCCTGGGCCTCCGGGCTCTATCAGCAGCTCTGGCCAGGAGATTCAGCAGTACATCTCTGAGTACATGCAGAGTGACAGTATTAGATCTTACCTATCCGGAGTTCAGGGTCCCCCAGGCCCACCTGGTCCCCCAGGACCTGTCACCACCATCACAGGCGAGACTTTCGACTACTCAGAGCTGGCAAGCCACGTTGTGAGCTACTTACGGACTTCGGGGTACGGTGTCAGCTTGTTCTCGTCCTCCATCTCTTCTGAAGACATTCTGGCTGTGCTGCAGCGGGATGACGTGCGTCAGTACCTACGTCAGTACTTGATGGGCCCTCGGGGTCCGCCAGGGCCACCAGGAGCCAGTGGAGATGGGTCCCTCCTGTCTTTGGACTATGCAGAGCTGAGTAGTCGCATTCTCAGCTACATGTCGAGTTCTGGGATCAGCATTGGGCTTCCT
COL17-2(1514)核苷酸序列：
atgttaaacagagtcagtcgtattgcaggcgcttctgcaatcacactatgcatcggcttaaccacaat actaagccctacttccactgcacaaagcGAGGGGTCATCGATGCTCACTGTCCCAGGCCCCCCAGGACCTCCTGGAGCCATGGGACCCCCAGGACCTCCAGGTGCCCCAGGCCCTGCCGGCCCAGCTGGTCTCCCAGGACATCAAGAAGTTCTTAATTTACAAGGTCCCCCAGGCCCACCCGGCCCACGCGGGCCACCAGGGCCTTCCATTCCAGGCCCACCAGGACCCCGAGGCCCACCAGGGGAGGGTTTGCCAGGCCCACCAGGCCCACCAGGATCGTTCCTGTCCAACTCAGAAACCTTCCTCTCCGGCCCCCCAGGCCCACCTGGCCCCCCAGGTCCCAAGGGAGACCAAGGTCCCCCAGGCCCCAGAGGACACCAAGGCGAGCAAGGCCTCCCAGGTTTCTCAACCTCAGGGTCCAGTTCTTTCGGACTCAACCTTCAGGGACCACCAGGCCCACCTGGCCCCCAGGGACCCAAAGGTGACAAAGGTGATCCAGGTGTTCCAGGGGCTCTTGGCATTCCTAGTGGTCCTTCTGAAGGGGGATCATCAAGTACCATGTACGTGTCAGGCCCGCCAGGGCCCCCTGGGCCCCCTGGGCCTCCGGGCTCTATCAGCAGCTCTGGCCAGGAGATTCAGCAGTACATCTCTGAGTACATGCAGAGTGACAGTATTAGATCTTACCTATCCGGAGTTCAGGGTCCCCCAGGCCCACCTGGTCCCCCAGGACCTGTCACCACCATCACAGGCGAGACTTTCGACTACTCAGAGCTGGCAAGCCACGTTGTGAGCTACTTACGGACTTCGGGGTACGGTGTCAGCTTGTTCTCGTCCTCCATCTCTTCTGAAGACATTCTGGCTGTGCTGCAGCGGGATGACGTGCGTCAGTACCTACGTCAGTACTTGATGGGCCCTCGGGGTCCGCCAGGGCCACCAGGAGCCAGTGGAGATGGGTCCCTCCTGTCTTTGGACTATGCAGAGCTGAGTAGTCGCATTCTCAGCTACATGTCGAGTTCTGGGATCAGCATTGGGCTTCCT
(3)将步骤(2)测序正确的重组质粒电击转化进谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC13032感受态细胞中，通过抗性筛选得到阳性转化子，并经菌落PCR鉴定，得到重组质粒正确转入的重组表达菌株命名为C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-COL17-2(1243)、C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-COL17-2(1109)、C.glutamicum ATCC 13032
/pXMJ19-COL17-2(0413)和C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-COL17-2(1514)。
(4)将步骤(3)获得的重组表达菌株按照实施例2步骤(1)和(2)培养并诱导表达(参照实施例2)，诱导表达结束后，取发酵上清液进行SDS-PAGE分析(参照实施例2)。
结果见图8，与未插入信号肽的对照菌株(C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-COL17-2)相比，C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-COL17-2(0413)、C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-COL17-2(1109)、C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-COL17-2(1243)分泌表达效果差，C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-COL17-2(1514)的分泌效果好。因此cg1514可作为介导COL17-2分泌的信号肽。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种重组人源XVII型胶原蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的重组人源XVII型胶原蛋白，其特征在于编码所述的重组人源XVII型胶原蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1所述的重组人源XVII型胶原蛋白，其特征在于上游还包括信号肽，信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.根据权利要求3所述的重组人源XVII型胶原蛋白，其特征在于：
所述的信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
5.一种重组载体，其特征在于是将编码权利要求1-4任一项所述的重组人源XVII型胶原蛋白的基因克隆进入表达载体得到。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：
所述的表达载体为pET20b或pXMJ19。
7.一种重组表达菌株，其特征在于为含有权利要求5或6所述的重组表达载体的宿主菌株。
8.根据权利要求7所述的重组表达菌株，其特征在于：
所述的宿主菌株为细菌或酵母；
所述的细菌为谷氨酸棒杆菌；
所述的谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032。
9.权利要求1-4任一项所述的重组人源XVII型胶原蛋白的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)将编码权利要求1-4任一项所述的重组人源XVII型胶原蛋白的基因克隆进入表达载体，得到重组表达载体；
(2)将重组表达载体转入宿主菌株，得到重组表达菌株；
(3)将重组表达菌株诱导表达，分离纯化，得到重组人源XVII型胶原蛋白。
10.权利要求1-4任一项所述的重组人源XVII型胶原蛋白在药品、医疗器械、生物材料、组织工程或日化产品领域中的应用。
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