JPH025868A - Ｈｉｖ結合タンパク質の発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は可溶性ＣＤ−４（ｓＣＤ’−４）タンパク質か
ら由来したＨＩＶ結合タンパク質の産生に関する。さら
に詳しくは、本発明はイー・コリ（Ｅ。

ｃｏ！＋）、ストレプトミセス（ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ）および酵母におけるＨＩＶ結合タンパク質の発
現用ベクターの構成に関する。

発明の背景 ヒトＴ−細胞菌タンパク質であるＣＤ−４（以前には、
時々、「Ｔ４」と称されていた）は、有効なＴ細胞−標
的細胞相互作用の媒介に関連するいくつかの非多形性Ｔ
リンパ球表面受容体タンパク質のうちの１種である。

ヒトＣＤ−４（Ｔ−４）受容体のｃＤＮＡ配列が知られ
ている（マツトンら（Ｍａｄｄｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、）
、セル（Ｃｅｌ　ｌ）土２：９３　（１９８５））、完
全ＣＤ−４プレ一タンパク質配列は、推定２３アミノ酸
９泌ＩＪ−グー１３フ２フミ／酸表面（Ｖｌ−Ｖ４）、
２３アミノ酸トランスメンプランおよび４０アミノ酸細
胞質ドメインからなる長さの４５８アミノ酸である。表
面ドメインは、イムノグロブリン可変部位（Ｖ）および
ジョイニング部位（Ｊ）に対して、相同性を２０〜３０
％に制限された４つの部位を示す。表面ドメインの５つ
のイントロン−エクソン境界のうち４つは、これらＶ−
Ｊ部位の接合部付近に生じている。

ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）　、後天性免疫不全
症候群（エイズ）（ＡＩＤＳ）の精神病薬剤は、ＣＤ−
４リンパ球に対して著しい親和性を示す。ＣＤ＝４に結
合しているウィルスは、ウィルス外被タンパク質のｇｐ
１２０糖タンパク質によって媒介される。ＣＤ−４タン
パク質は、抗−ｅｖｎ抗体と共に、溶解ＨＩＶ感染細胞
から共沈させることができ、また逆に、ｇｐ１２０は抗
−ＣＤ−４単クロ一ン抗体と共に共沈させることができ
る。すなわち、ＣＤ−４に結合しているウィルスは、ウ
ィルス外被タンパク質のｇｐ１２０糖タンパク質により
媒介されることを示す。

近年、多くの科学研究者が、哺乳動物の細胞系において
発現したＣＤ４誘導体を用い、ＣＤ−４とエイズ感染の
間の相互作用に関連する知見を報告している。

ディーンら（Ｄｅｅｎ、　ｅｔ　ａｌｅ）は、ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）　　３３上：８２（１９８８）にお
いて、いくつかの細胞環境におけるｓＣＤ−４の単離お
よび発現を報告している。ｓＣＤ−４は、ＣＤ−４゜の
トランスメンブランおよび細胞質ドメインを欠＜ＣＤ−
４の可溶性誘導体である。ｄｆｈｒ欠失のチャイニーズ
・ハムスター卵巣（Ｃ）（Ｏ）細胞系統を用いた場合、
発現ｓＣＤ−４は、細胞表面においてＣＤ−４の構造お
よび生物学特性を保持し、Ｈ１ＶｇｐＨＯ外被タンパク
質に結合し、ＣＤ−４”リンパ球の結合を抑制しうろこ
とが示されｊ；。

トララネツカ−ら（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ、　ａｔ　ａ
ｌ、）は、ネイチャー、３３上：８４（１９８８）にお
いて標的細胞に対するウィルスの付着を抑制するｓＣＤ
−４の使用を報告している。表示されているデーターは
、組換え型のｓＣＤ−４を用い、ｉｎ　ｖｉｔｒ。

におけるＨＩＶ感染の抑制を示す。

フィッシャーら（Ｆ　１ｓｈｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、）は
、ネイチャー、３３上ニア６　（１９８ｇ）において、
ＣＨＯからのｓＣＤ−４の精製およびウィルス複製とウ
ィルス誘発細胞融合の両方の強力なインヒビターとして
のその使用を報告している。

ハッセイら（Ｈｕｓｓｅｙ、　ａｔ　ａｌ、）は、ネイ
チャ、３３１　：　７８　（１９８８）において、ｇｐ
１２０発現細胞に結合することによりウィルス誘発細胞
融合（シンシチウム形成）およびＨＩＶ感染を抑制する
ことが判明したｓＣＤ−４を産生ずるバキュロウィルス
発現系の使用を報告している。

また、ｓＣＤ−４タンパク質が、クラス■特異的Ｔ−細
胞相互作用を抑制することは明らかでないことか示され
ている。

スミスら（Ｓｍｉｔｈ、　ｅｔ　ａｌ、）もまた、サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３８　：　１７０４　（
１９８７）において、ｓＣＤ−４を産生するＣＨＯ補乳
動物細胞系の使用を報告している。それらは、ＨＩＶｇ
ｐ１２０外被タンパク質に対して結合し、１ｎｖｉｔｒ
ｏにおけるＨｉｌｌの感染性を消滅させることが示され
ているＣＨ○細胞におけるｓＣＤ−４タンパク質の産生
を報告している。データーは、ｓＣＤ−４が、エイズ感
染の治療処理に対する主成分として用いうろことを示す
。

しかしながら、なお、ｓＣＤ−４タンパク質の発現用の
細菌および低真核生物系に関する要請がある。

発明の要約 本発明はζＣＤ−４タンパク質のＨＩＶ結合機能がイー
・コリにおいて発現可能であるという知見とかかるＨｒ
Ｖ結合タンパク質が発酵培地中に分泌可能であるという
知見にある。したがって、特に、本発明は、調節因子に
機能的にリンクしたＨＩＶ結合タンパク質からなるイー
・コリ発現ベクターにある。

本発明はまた、ＣＤ−４タンパク質のＨＩＶ結合機能が
ストレプトミセスにおいて発現可能であるという知見と
かかるＨＩＶ結合タンパク質が発酵培地中に分泌可能で
ある知見にある。したがって、特に、本発明は、調節因
子に機能的にリンクしたＨＩＶ結合タンパク質からなる
ストレプトミセス発現ベクターにある。

本発明はまた、ＣＤ−４タンパク質のＨＩＶ結合機能が
酵母において発現可能であるという知見にある。したが
って、特に、本発明は、調節因子に機能的にリンクした
ＨＩＶＩ”合タンパク質からなる酵母発現ベクターにあ
る。

本発明はまた、ＯＭＰＡリーダー配列を用い、異種構造
のタンパク質をイー・コリから輸送できるという知見に
ある。したがって、特に、本発明は、調節因子に機能的
にリンクしたＤＮＡコーディング配列からなり、該ＤＮ
Ａコーディング配列が、ＸがＯＭＰＡリーダー配列で、
Ｙが異種構造のタンハク質であるタンパク質Ｘ−Ｙにつ
いてコード化するイー・コリにおける輸送タンパク質を
発現するためのイー・コリ発現ベクターにある。

発明の詳細 な説明によれば、ＣＤ−４受容体から誘導された有用量
のＨｒＶ拮合タンパク質が、初期Ｈ［Ｖ感染を抑制し、
宿主感染後にＨＩＶの細胞から細胞への伝達を抑制する
治療および／または予防剤としての使用、ＨＩＶ−リン
パ球結合の抑制剤についてのスクリーニング使用、ＣＤ
−４”リンパ球結合の抑制剤としての使用または後記の
ような他の使用に対して発現する。すべてのタンパク質
はＣＤ−４からのＨＩＶ結合機能を有する。かかるタン
パク質の好ましい例として、ｓＣＤ−４タンパク質およ
びその誘導体が挙げられる。ｓＣＤ４タンパク質は、Ｃ
Ｄ−４のトランスメンプランおよび細胞質ドメインを欠
くＣＤ−４の誘導体である。ｓ　ＣＤ−４タンパク質の
例が、ディーンら、トラウｌツカ−ら、フィノンヤーら
およびハッセイらにより、ネイチャー、３３１ニア６〜
８８（１９８８）の各論文に、かつスミスらにより、サ
イエンス、２３８　：１７０４　（１９８７）に記載さ
れている。

本願明細書に例示されたＳＫＢｓＣＤ−４と称されるｓ
ＣＤ−４タンパク質は、ディーンらにより前掲、８３頁
に報告されている。それは、以下のアミノ酸およびヌク
レオチド配列にて示される。

該配列は、マツトンらにより、セル（Ｃｅｌ　１）、４
２：９３　（１９８５）に報告されているＣＤ４　　ｃ
ＤＮＡから誘導されたリーダー配列および５′非翻訳部
位を示す。ＣＨＯ細胞により発現され、分泌された成熟
ＳＫＢｓＣＤ−４の第一アミノ酸は、塩基対１５１−１
５３によりコード化されたリジンである。塩基対１２５
２にてＣＤ−４ｃＤＮＡを）ｌｐａＩ［で制限し、そこ
に塩基対１２５３−１２５７を復原し、Ｃ−末端バリン
の後方に翻訳停止コドンであるＴＡＡを配列したリンカ
−を結合させることにより、トランスメンブランドメイ
ンを削除した。マントンらにより報告されているように
、成熟ＣＤ−４の最初の３つのアミノ酸はグルタミン（
本明細書中、アミノ酸（−）２として示された）−グリ
シン（本明細書中、アミノａ（−）ｌとして示された）
−アスパラギン（本明細書中、リジン、アミノ酸（＋）
ｌとして示された）である。それ以外、以下に報告され
ている配列は、マツトンらにより報告されている配列と
同じである。

τｇｇｅｇｃｃｔ、ｃＬａｇ！ 本発明によれば、実質的にｓＣＤ−４のＨＩＶ結合親和
性を保持しているｓＣＤ−４切形物およびその誘導体も
また、発現しうる。かかる切形物のうち好ましいものは
、およそアミノ酸１−１’８２内に含まれるｖｔおよび
Ｖ２部位のＨＩＶ結合部位からなるタンパク質またはポ
リペプチドである。前記配列に関して、１つの例は、ア
ミノ酸３５１−３６９　（−グリシン−グルタミン−バ
リン−スレオニン−プロリン−バリン−〇）に融合した
アミノ酸（−）２−１０４（Ｎ−グルタミン−グリシン
リジン−〜−アラニンーアスパラギンーセリン−Ｃ）を
有する、本願明細書においてＶＩＪ４と称されるタンパ
ク質である。第２の例は、アミノ酸３５１−３６９に融
合したアミノ酸（−）２−１８３　（Ｎグルタミン−グ
リシン−リジン−〜−リジンーアラニンーセリンーＣ）
を有する、本願明細書においてＶＩＶ２Ｊ４と称される
タンパク質である。第３の例は、（−）９−１５１　　
（Ｎ−アラニン−ロイシンロイシン−〜−ロイシンーグ
ルタミン酸−ロイシンＣ）からなる、本願明細書におい
てＹＶｌと称されるタンバグ質である。第４の例は、ア
ミノ酸（−）９−３６９を有する、本願明細書において
ＳＫＢｓＣＤ−４と称されるタンパク質である。

例えば、０ＫＴ４Ａ結合に基づくこれらの各ＨＩＶ結合
タンパク質は、ｓＣＤ−４タンパク質、特にＳＫＢｓＣ
Ｄ−４のＨＩＶ結合特性を有しており、さらに詳しくは
、ｓＣＤ−４タンパク質、特にＳＫＢｓＣＤ−４のＶｌ
および■２部位のＨＩＶ結合ドメインを有する。

本明細書に詳しく例示されているこれらタンパク質に加
えて、当業者は、容易にｓＣＤ−４誘導体ＤＮＡコーデ
ィング配列を構成することができる。かかる誘導体は、
実質的にｓＣＤ−４タンパク質のＨＩＶ結合機能を保持
しており、すなわち、該タンパク質のＨＩ　Ｖ　ｅｎｖ
タンパクＬｇｐ１２０に対する結合は、有意な悪影響を
及ぼさない。

例えば、■１部位のみ、例えば、アミノ酸１−９４を有
する誘導体、またはＣＤ−４のＶ１部位の一部のみを有
する誘導体を構成することができる。

また、ｌまたは数個のアミノ酸欠失、付加または置換に
より、異なる誘導体、すなわち本明細書において特に例
示されているタンパク質の誘導体を構成することもでき
る。

また、ハイブリッドタンパク質、すなわち、翻訳融合を
、ｓＣＤ−４タンパク質とタンパク質担体、もう一つ別
の抗原または他のｓＣＤ−４分子との間に構成させ、ポ
リ−ｓＣＤ−４分子を調製することもできる。さらに別
法において、ｓＣＤ４欠失変異体を、人工的に担体分子
に接合することができる。

ＨＩＶに対するｓＣＤ−４分子の親和性は、既知親和力
を有するｓＣＤ−４分子を用いるか、またはＯＫ　Ｔ−
４および○ＫＴ４ＡのようなＣＤ−４受容体を認識する
抗体を用いる競合結合検定により測定することができる
。本発明の有用なｓＣＤ４タンパク質は、以下の実施例
において示されるように、０ＫＴ４Ａにより条件培地か
ら選択的に沈澱する。ＣＤ−４、フラグメントおよび誘
導体は、発現後、または一般的には発現前に、リーダー
および／または細胞外ドメイン用のコーディング配列の
操作により化学的に調製することができる。

ｓＣＤ−４またはそこから誘導されたＨＩＶ結合タンパ
ク質ＤＮＡコーディング配列は、例えば、既知ＤＮＡ配
列を用いる遺伝子を合成することにより、配列に基づく
標準的クローニング法により、ならびにタンパク質の検
出、すなわち、ＣＤ−４発現細胞系統からのｃＤＮＡク
ローンのトランスフェクションおよびタンパク質に対向
する抗体での同定による再分離により得ることができる
（マツトンら、前掲参照）。

特定のｓＣＤ−４タンパク質コ一デイング配列を有する
ｃＤＮＡクローンは、オリゴヌクレオチド雑種分子形成
プローブの使用により同定することができる。該プロー
ブは、特定の配列のタンパク質に基づき設計することが
できる。問題のコーディング配列を有するクローンを同
定する場合、タンパク質コーディング配列を制限エンド
ヌクレアーゼを用いて切断し、クローニングおよび／ま
たは発現ベクター中に挿入することができる。発現ベク
ターにおいて、ｓＣＤ−４タンパク質コ一デイング配列
は、コーディング配列の転写、翻訳およびプロセシング
に必要なまたは望ましい調節機能に対して効果的にリン
クしている。

イー・コリにおける本発明の実施において、Ｈ！■結合
タンパク質、例えば、ｓＣＤ−４またはその誘導体をコ
ード付けするＤＮＡコーディング配列は、イー・つりの
翻訳用のＤＮＡベクター内の調節因子に機能的にリンク
する。かかる調節因子からなる多くのダラム陰性菌発現
ベクターを用いることができる。調節因子はＲＮＡポリ
メラーゼ結合および転写を効果的に行うプロモーターか
らなる。調節可能な、すなわち、誘発可能なまたは活動
的にしうるプロモーターが好ましい。種々の有用なプロ
モーターを、イー・コリの異種構造のポリペプチドの発
現に利用することができる。

これらは、ｔｒｐ７０モーターおよびＡＰＬプロモータ
ーを包含する。例えば、米国特許第４５７８３５５号、
コートネイら（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ、　ｅｔ　ａｌ、）、
ネイチャー、３１３：　１４９　（＋９８５）参照。

最も好ましくは、調節因子は、本発明により、Ｈ！■結
合タンパク質を分泌しうろことが判明した細胞膜に、ま
たは介して、ＨＩＶ結合タンパク質輸送用のリーダー配
列からなる。タンパク質をイー・コリの外膜に輸送する
ことが知られているリーダーは、バシラス・リチェニホ
ルミス（Ｂｓｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ）ペニシリナーゼ遺伝子のものである。サーバスら（
Ｓａｒｖａｓ、　ａｔ　ａｌ、）、ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー （Ｊ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）上５５　：　６５７
　（１９８３）参照。

本願明細書において特に示されているものは、ＯＭＰＡ
リーダーまたはシグナルと称される外膜ポリサツカリド
Ａ用のリーダーである。モッパら（Ｍｏｖｖａ、　ｅｔ
　ａｌ、）　、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー（Ｊ　、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂ　ｉｏｌ、）、１
４３：３１７　（１９８０）参照。ＯＭＰＡコーディン
グ配列は、ＨＩＶ結合タンパク質を発酵培地中に分泌す
るのに有用であるリーダー配列からなる。

今日、ＯＭＰＡリーダーを用い、種々の低分子量タンパ
ク質またはポリペプチドを、十分に培養培地中に分泌で
きることが判明している。例えば、ＯＭＰＡシグナルは
、ＳＫＢｓＣＤ−４、ＶＩＪ４およびＶＩＶ２Ｊ４に加
えて、多量（例えば、１〜約１０ｍｇ／Ｌ）の活性ヒト
形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、ｌｔｉ瘍壊死因
子（ＴＮＦ）およびインターロイキン−１−β（ＩＬ−
１−β）を輸送するのに用いられている。

ＯＭＰＡシグナルは、実質的に次の２１アミノ酸：　Ｎ
−ｍｅｔ−１ｙｓ−１ｙｓ−ｔｈｒ−ａｌａ−ｉｌｅ−
ａｌａ−ｉｌｅ−ａｌａ−ｖａ　Ｉ−ａ　Ｉａ−１ｅｕ
−ａ　Ｉａ−ｇ　Ｉｙ−ｐｈｅ−ａ　Ｉａ−ｔｈｒ−ｖ
ａ　ｉ　−ａ　Ｉａ−ｇ　１ｎ−ａｌａ−Ｃからなる。

かかるリーダー用のＤＮＡコーディング配列は、好まし
くは、ｌまたはそれ以上の制限部位が所望のＤＮＡコー
ディング配列の挿入用のＣ−末端アミノ酸に隣接して配
列され、ターミネータ−が所望のコーディング配列の下
流に配列されるように合成する。代表的な合成コーディ
ング配列を、以下の実施例において示す。

ＨＩＶ結合タンパク質ミニ遺伝子、すなわち、調節因子
に機能的にリンクしたコーディング配列に加えて、形質
転換に用いられるベクターは、少なくともｌの表現型形
質転換マーカー、すなわち、抗生物質耐性遺伝子、発色
体エージェントまたは栄養要求性突然変異を相補する遺
伝子のような遺伝的選択マーカーを有していることが好
ましい。

該ベクターはまた、自己複製に必要な部位を有する。

イー・コリのｓＣＤ−４タンパク質の発現に対して有用
な発現ベクターの代表的構成が、実施例において詳細に
記載されている。タンパク質は培地中にて発現し、適宜
明確にホールドされた。

ストレプトミセスにおける本発明の実施において、ＨＩ
Ｖ結合タンパク質、例えば、ｓＣＤ”４またはその誘導
体をコード化するＤＮＡコーディング配列は、ストレプ
トミセスの形葦転換用のＤＮＡベクター内の調節因子に
機能的にリンクする。

調節因子は、ＲＮＡポリメラーゼ結合または転写を効果
的に実施するプロモーターからなる。調節可能な、すな
わち、誘発可能なまたは活動的にしうるプロモーターが
好ましい。種々の有用なプロモーターを用い、ストレプ
トミセスの異種構造のポリペプチドを発現することがで
きる。例えば、ストレプトミセス・ガラクトース・オペ
ロンのガラクトース−誘発可能プロモーター（ホーンワ
ルドら（Ｆｏｒｎｗａｌｄ、　ｅｔ　ａｌ、）　、プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス・ニー・ニス・エイ　（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ
１１．　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ）、１土：２１３０　（１９８７））、ニス・リ
ビダンス（Ｓ　、　Ｉ　１ｖｉｄａｎｓ）β−ガラクト
シダーゼ遺伝子の構成プロモーター（ニックハルトら（
Ｅｃｋｈａｒｄｔ、ｅｔ　ａｌ、）　、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Ｊ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
）、１６９：４２４９　（１９８７）；プロウナーら（
Ｂ　ｒａｗｎａｒ、　ｅｔａｔ、）　、米国特許第４７
１７６６６号）およびニス、ｏンギスポラス（Ｓ　、　
ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）　）リプシン抑制剤遺伝子（
欧州特許出願第８７３０７２６０．７号）またはエム・
エチノスポルサ（Ｍ　、　ｅｃｈ　１ｎｏｓｐｏｒｓａ
）において報告されているような側頭にて調節されたプ
ロモーター（バウムら（Ｂａｕｍ、　ｅｔ　ａｔ、）　
、ジャーナル・オブ・バタテリオロジー、１７０ニア１
　（１９８ｇ））が挙げられる。ストレプトミセスにお
ける転写終止領域は、いくつかのストレプトミセス遺伝
子の３′末端、例えば、ストレプトミセスガラクトース
オペロンの末端での終止シグナルから誘導されるか、ま
たはニス・フラジエ（Ｓ、　ｆｒａｄｉａｅ）ネオマイ
シンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｍｙｃｉｎ　ｐ
ｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子の末端に
て見い出されている（トンプソンおよびグレイ（Ｔ　ｈ
ｏｍｐｓｏｎおよびＧ　ｒａｙ）、プロシーディング・
オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス・ニ
ー・ニス・エイ、８０：５１９０（１９８３））。スト
レプトミセスにおけるタンパク質輸送用の配列は、ニス
・リビダンスβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ニス・リビ
ダンスＬＥＰ１０遺伝子（欧州特許出願第８７３０７２
６０７号）およびニス・ロンギスポラス・トリプシンイ
ンヒビター遺伝子から単離された配列を包含する。

ｓＣＤ−４遺伝子は、遺伝的選択マーカー系からなる巨
大ＤＮＡ分子内に挿入される。該選択マーカー系は、マ
ーカー遺伝子が形質転換細胞における選択可能な新規表
現型を付与する多数の既知マーカー系のうちのいずれか
である。例えば、チオストレプトン耐性リポゾームメチ
ラーゼ（トンプソンら、ジン（Ｇｅｎｅ）　、　２０　
：　５１　（１９８２））、ネオマイシン・ホスホトラ
ンスフエラゼ（トンプソンら、前掲）およびエルトロマ
イシン（ｅｒｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）耐性リポゾームメチ
ラーゼ（トンプソンら、前掲）のようなストレプトミセ
ス薬剤耐性遺伝子が挙げられる。ＤＮＡ分子はまた、Ｐ
ＩＪＩＯＩ誘導体（ケイサーら（Ｋｅｉｓｅｒ、　ｅｔ
ａｌ、）　、モレキュラー・アンド・ジェネラル・シネ
テックス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）　、　　ｌ
　８５　：　２２３　（１９８２））または５ＬＰＩ由
来のベクター（ビブら（Ｂｉｂｂ、　ｅＬ　ａｔ、）　
、モレキュラー・アンド・ジェネラル・シネテックス、
ｌ　８　ｌｌ・２３０　（１９８１））のようなストレ
プトミセスにおける自己複製用の配列を有する。ＤＮＡ
分子はまた、遺伝子を増幅させるマーカーを有していて
もよい。ストレプトミセスにおける遺伝子コピー数の増
幅に供するマーカーは、スペクチノマイシン（ｓｐｅｃ
ｔｉｎ。

ｍｙｃｉｎ）耐性（ホル不マンら（Ｈｏｒｎｅｍａｎｎ
、　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナル・オフ・バタテリオロ
ジ−１６９：２３６０　（１９８７）　）およびアルギ
ニン栄養要求体（アルテンバラフナ−ら（ＡｉＬｅｎｂ
ｕｃｈｎｅｒ、　ｅｔａｌ、）　、モレキュラー・アン
ド・ジェネラル・シネテックス、１９５：１３４　（１
９８４））用の遺伝子を有する。

初期発現の研究について、以下の実施例にさらに詳細に
記載されているようなＣＤ−４コ一デイング配列は、β
ｇａｌシグナルペプチド分割部位の８アミノ酸下流に位
置するポジションにてβｇａｌングナル配列に融合する
。この発現ベクターに対するストレプトミセス復製機能
は、ＰＩＪＩＯＩ（ケイサーら、モレキュラー・アンド
・ジェネラル・シネテックス、１８５　：　２２３　（
１９８２）の誘導体であるプラスミドＰｒＪ７０２　（
カツエら（Ｋａｔｚ、　ｅｔ　ａｌ、）　、ジャーナル
・オフ゛・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ　、
　Ｇｅｎ、Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ１．）１２９：２７０３
　（１９８３））により付与された。用いた宿主株は、
野性型ニス・リビダンス１３２６（ヒヴら、モレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・シネテックス、＋８４　：２
３０　（１９８１））であった。βｇａｌ−ｓＣＤ−４
融合タンパク質は、培養上澄液および完全細胞の両方に
おいて検出された。別の一連の実験は、ＬＴＩプロモー
ターを用い、さらに効果的なｓＣＤＪタンパク質発現を
得ることができることを示した。

ＬＴＩＴ１発現７ベ泌ベクター遺伝子発現がＬ”「ｌプ
０モーターにより指示され、タンパクＭ　輸送がＬＴ［
／グナルペプチドにより促進されるβｇａｌ系に類似し
ている。多くのＨ［Ｖ結合タンパク質コーディング配列
は、Ｖ、Ｖ２Ｊ、およびＶ、Ｊ。

を有するＬＴ１ベクター中にてクローンに付される。こ
れらすべてのタンパク質コーディング配列は、ＬＴ［ン
グナルペプチド分割部位の８アミノ酸下流に位置するポ
ジションにて挿入される。βｇａｌ融合と同様、ｓＣＤ
−４タンパク質はＬＴＩシグナルペプチドを介して培養
上澄液中に輸送される。ストレプトミセス複製機能はま
た、ＰＩＪｌＯ１誘導体：　Ｉ）　Ｉ　Ｊ　７０２およ
びＰＩＪ３５１により付与される（ケイサーら、前掲）
。

ＬＴ１発現系からのＳＫＢｓＣＤ−４、ＶＩＪ４および
Ｖ、Ｖ２Ｊ　４発現は、最初、ニス・リビダンス１３２
６において試験された。ＳＫＢｓＣＤ−４およびＶ、Ｖ
２Ｌ４の両方は培養上澄液と完全細胞の間に等しく分配
された。これらのタンパク質は完全には輸送されないが
、細胞内および細胞外形は、５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル上のその可動性により判断した場合、同一の分子
量を有しているのは明らかである。シグナルペプチドが
細胞内形からタンパク質分解的に除去されているかどう
かは明らかでない。ＳＫＢｓＣＤ−４の最大レベルは、
培養上澄液および完全細胞において３０　ｍｇ／　Ｑで
あると評価された。Ｖ、Ｖ、Ｊ　４レベルは、少なくと
も３０ｍｇ／　Ｑ　（培養上澄液および完全細胞）であ
ると評価された。

ニス・リビダンスにおけるｓＣＤ−４発現にて直面する
１つの問題は、プロテアーゼ活性に対するその感受性に
ある。この問題は、ｓＣＤ−４を他のストレプトミセス
種において発現させることにより除去するか、または少
なくとも有意に減少させることができる。ｓＣＤ−４タ
ンパク質は、例えば、ニス・コエリカラー（Ｓ　、ｃｏ
ｅｌ　１ｃｏｌｏｒ）　、ニス・ロンギスポラスおよび
ニス・アルプスにおいて発現させることができる。該分
子の安定性がこれら異なる宿主を用いて強化されること
が考えられる。この宿主は、比較的にはより少ないタン
パク質を培養上澄液中に分泌し、それは精製工程を助成
するｔ二め、ニス・ロンギスボラスに３１するｓＴ４タ
ンパク質の発現が有利であるかもしれない。

酵母において本発明を実施する場合、ＨＩＶ結合タンパ
ク質、例えば、ｓＣＤ−４またはその誘導体をコード付
けするＤＮＡコーディング配列が、酵母の形質転換用の
ＤＮＡベクター内の調節因子に機能的にリンクする。形
質転換、クローニングおよび発現系が利用できるいずれ
の酵母宿主も用いることができる。個々の例は、ハンセ
ヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピチア（Ｐ　１ｃｈｉａ
）　、タルベロミセス（Ｋ　ｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）
　、シゾサツカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ）　、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）および
サツカロミセス（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の
酵母を包含する。好ましい酵母宿主はサッカロミセス・
セレビシエ（ｃｅｒｅｖ　ｉｓ　１ａｅ）である。

調節因子は、ＲＮＡポリメラーゼ結合および転換を効果
的に実施するプロモーターからなる。調節可能な、すな
わち、誘発可能であるか、または活動的にしうるプロモ
ーターが好ましい。種々の有用なプロモーターを、酵母
の異種構造のポリペプチドの発現に用いることができる
。これらは、銅誘発メタロチオネイン遺伝子（ＣＵＰＩ
）プロモーターむよび解糖遺伝子グリセルアルデヒド３
ホス７エートデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）およびアル
コールデヒドロゲナーゼ（Ａ　Ｄ　Ｈ）の構成プロモー
ターを包含する。酵母における転写終止部位は、いくつ
かの酵母遺伝子のうちいずれか、例えば、イソ−１−チ
トクロームＣ（ＣＹＣｌ）遺伝子の３′末端から誘導さ
れる。

ｓＣＤ−４遺伝子を、遺伝的選択マーカー系からなる巨
大ＤＮＡ分子中に挿入する。該選択マーカー系は、マー
カー遺伝子が形質転換した細胞上に選択可能な新規表現
型を付与する多くの既知マーカー系のうちのいずれかで
ある。例えば、ホスホ−リボシルアントラニレートイソ
メラーゼ（ｐｂｏｓｐｈｏ−ｒｉｂｏｓｙｌ　ａｎＬｈ
ｒａｎｉｌａｔｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）　　（ＴＲＰ
Ｉ）またはオロチジン−５′−ホスフェートデカルボキ
シラーゼ（ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’　−ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）　　（Ｕ　ＲＡ　
３　）のような生合成酵素用の酵母遺伝子または６４１
８耐性またはベノミル耐性（ＢＥＮＩ）のような異種構
造の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。ＤＮＡ分子はまた、
酵母２−ミクロン−サークル０口部位またはＡＲ３Ｉの
ような染色体自己複製部位（ＡＲ３）およびＣＥＮ３の
ような酵母動原体（ＣＥＮ）のごとき、酵母における自
己複製用の配列を有し、プラスミドの自己複製を可能と
する。

好ましい発現系において、ＳＫＢｓＣＤ−４単独では僅
かしか発現せず、かかる僅かな発現は効力のない転写お
よび翻訳によるか、または迅速なタンパク質減成による
ものかもしれないということが“ｒ１ｊ明したため、Ｈ
ＩＶ結合タンパク質コーディング配列を、発現を安定化
させるコーディング配列に融合させる。いずれにせよ、
ユビキチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）のコーディング配列
がＳＫＢｓＣＤ−４コ一デイング配列に対して５′に融
合した遺伝子融合産生物を比較的高レベルにて発現させ
、分裂させてユビキチンとｓＣＤ−４遺伝子産生物を得
ることが示されている。

エビキチンＤＮＡコーディング配列は、標準的遺伝子ク
ローニング法により、酵母または哺乳動物細胞を包含す
る他の真核生物細胞から単離することができる。また、
漂準的公知技法により合成することもできる。本発明を
説明するのに用いたモジュラ−（ｍｏｄｕｌａｒ）ユビ
キチン遺伝子のヌクレオチド配列は、エノカーら（Ｅｃ
ｋｅｒ、　ｅＬ　ａｔ、）により、ジャーナル・オフ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ　、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、）　、２６２　：　３５２４（１９８７）にて記
載されている配列である。該配列は実質的に次のとおり
である： ＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＴＣＡＡ
ＧＡＣＧＴＴＡＡＣＣＧＧＴＡＡＡＡＣＣＡＴＡＡＣＴ
ＣＴＡＧＡＨＩ　Ｖ結合タンパク質配列の５゛末端にて
、シグナルペプチドＤＮＡ配列を挿入することによって
、タンパク質の培養培地への分泌を達成することができ
る。この目的に有用なシグナル配列は、例えば、酵母交
配因子、α−因子の配列である（カージャンおよびヘル
スコヴイッツ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔ
ｚ）　、セル、３０　：　９３３　（１９８２））。

加えて、発現は、ｓＣＤ−４酵母発現モジュールを酵母
染色体と一体化し、つづいて増加コピー数を選択する酵
母Ｄ　ＨＦ　Ｒ遺伝子のようなマーカーを用いて増幅さ
せることにより達成される。

一般的に、本発明のｓＣＤ−４タンパク質は、種々のタ
ンパク質精製法、例えば、アフィニティークロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除ク
ロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーまたは逆
相クロマトグラフィーを用い、使用した培養培地から精
製することができる。

ｓＣＤ−４のそのフラグメントおよび誘導体は、一般の
基特異性吸着剤、例えば、炭水化物結合または染料アフ
ィニティーリガンドを用いるか、またはｓＣＤ−４に特
異的に結合するりガント、例えば、モノクローナル抗体
またはＨＩＶｇｐ１２０タンパク質またはその１部を用
いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製する
ことができる。

精製は、選択的成長培地中、約２８°Ｃないし約４５°
Ｃにて細胞を増殖させた後、発酵培地を清澄化し、つい
で培地中に存在する他のタンパク質からＨＩＶ結合結合
タンパ音質離することからなる。

好ましい方法においては、ｓＣＤ−４タンパク質を、ｓ
ＣＤ−４分子の物理特性に基づく一連のクロマトグラフ
ィー工程を用いて培養培地から精製する。

ｓＣＤ−４タンパク質を精製する別法は、ｓＣＤ−４に
対向するモノクローナル抗体の使用を意味する。該タン
パク質は、タンパク質に対向するモノクローナル抗体が
結合するアフィニティーゲル担体を介して清澄培養培地
を通すことにより１工程にて精製することができる。混
入タンパク質はカラムを介して洗浄されるが、問題のタ
ンパク質は、抗体結合部位にて該カラムに結合する。つ
いで、不活性化を防止する条件下、該タンパク質を該カ
ラムから溶出する。

ｓＣＤ−４タンパク質のｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける生体
および免疫特性の特徴は、該タンパク質がエイズ予防お
よび治療において有用であることを示す。

研究は、ｓＣＤ−４タンパク質がウィルスの細胞外およ
び細胞から細胞への蔓延のインヒビターとして作用する
ことを示す。本発明に記載されているｓＣＤ−４，７ラ
グメントおよびその誘導体は、ウィルスが培養中のＣＤ
−４＋標的細胞に結合することを遮断することが知られ
ているため、感染したヒトにこれらのタンパク質を投与
することは、ウィルスの細胞外蔓延を抑制するように作
用すると考えられている。したがって、ｓＣＤ−４タン
パク質は、エイズまたはエイズ関連症候群（ＡＲＣ）の
治療用の予防および治療剤として両方に有用である。

予防剤として、ｓＣＤ−４タンパク質を、該疾患の危険
性の高い患者またはウィルスに対する抗体の存在により
ＨＩＶにさらされていることを示す患者に投与する。疾
患の初期段階または罹患前に、有効量の該タンパク質の
投与は、ＨＩＶによるＣＤ−４＋リンパ球の感染を抑制
するように作用する。治療剤として、ｓＣＤ−４のＨＩ
Ｖで感染したヒト＼の投与は、ウィルスの細胞外蔓延を
抑制するように作用する。

ＨＩＶ感染細胞と他のＣＤ−４＋リンパ球の間の融合も
また、ウィルス蔓延経路であると考えられる。さらに、
融合は、一部、ＣＤ−４°リンパ球機能の障害および結
局は、感染患者におけるＣＤ４３リンパ球の涸渇の原因
となりうる。細胞融合は、ウィルス外被タンパク質遺伝
子産生物とＣＤ４受容体の両方に依存しており、０ＫＴ
−４Ａまたは類似するモノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）
により抑制することができる（サラテンタウら（Ｓａｔ
ｔｅｎｔａｕ、　ｅＬａｌ、）、サイエンス（Ｓ　ｃｉ
ｅｎｃｅ）、２３４　：１１２０　（１９８６））。本
願明細書に記載されているｓＣＤ−４タンパク質は細胞
融合を干渉し、したがって、ウィルスの細胞から細胞へ
の蔓延およびＣＤ−４＋クリンパ機能の喪失を減少させ
る。

ＣＤ−４受容体は単形性であるため、ｓＣＤ−４タンパ
ク質は、すべてのＨＩＶを包含するＣＤ４受容体の表面
ドメインを認識するウィルスの万能抑制剤であると考え
られる。

ｓＣＤ−４タンパク質は、他の薬剤と組み合わせて、例
えば、逆転写酵素、プロテアーゼまたはｔａｔのような
他のＨＩＶタンパク質に対向する薬剤と組み合わせて用
いてもよい。ＨＩＶに対して効果的な治療剤は、ウィル
ス媒介ならびに感染の細胞から細胞への伝染を予防する
。ｓＣＤ−４タンパク質はまた、他の抗ウィルス剤、例
えば、アジドチミジン（ａｚｉｄｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ
）　　（ＡＺＴ）と組み合わせて用いてもよい。

本発明のｓＣＤ−４タンパク質もまた、通常、ＣＤ−４
受容体の表面ドメインと相互に作用する細胞外標的分子
に結合することにより、ＣＤ−４”細胞機能の抑制剤と
しての有用性を有する。多数の研究は免疫耐薬力、特に
自己免疫疾患の病原および経過において、かつ宿主特異
的移植片拒絶反応におけるＣＤ４受容体に対する臨界的
役割を示唆している。

予防剤または治療剤としては、ｓＣＤ−４タンパク質を
非経口的、好ましくは静脈内に投与する。

該薬剤は、例えば、毎日、毎週または毎月、注入または
注射により投与することができる。投与量および割合は
、循環系において、有効量のｓＣＤ−４タンパク質を維
持するように選択する。別の投与方法は、ｓ　ＣＤ−４
タンパク質を透析剤として用い、体外的に投与すること
である。

本発明のｓＣＤ−４タンパク質はまた、ＣＤ−４”細胞
相互作用の治療剤または抑制剤として作用する天然、合
成または組換え体分子を同定する試薬として用いること
もできる。

例えば、ｓＣＤ−４タンパク質は、ＥＬＩＳＡをベース
とする方法により測定されるタンパク質相互作用につい
ての検定のようなスクリーニング検定において用い、る
ことができ、ＣＤ−４受容体表面ドメイン相互作用の競
合物質について検定する他の試薬と組み合わせて用いる
ことのできる生化学的に純粋な水溶性の試薬を提供する
。例えば、ｓＣＤ−４タンパク質は、ＨＩ　Ｖ　ｅｎｖ
タンパク質またはＨＩ　Ｖ　ｅｎｖタンパク質を含有す
る混合物に結合するため、該タンパク質をウィルス結合
の抑制剤をスクリーニングするのに用いることができる
。

ｓＣＤ−４タンパク質がＨＩ　Ｖ　ｅｎｖタンパク質を
発現する細胞に結合することを示すｉｎ　ｖｉＬｒｏデ
ーターに基づき、これらのタンパク質はまた、１ｎｖｉ
ｖｏにおけるＨＩＶ感染細胞についての選択的標的分子
として供することもできる。標的特異性担体タンパク質
として、ｓＣＤ−４タンパク質を、例えば、細胞毒性剤
の感染細胞へのデリバリ−用担体タンパク質として供す
ることもできる。

加えて、ＣＤ−４受容体が、ＣＤ−４”細胞のクラス制
限により示唆されるような細胞含有抗原において、ＭＨ
Ｃクラス■抗原と特異的に結合することを示すデーター
に基づいて、ｓＣＤ−４タンパク質は、クラス■抗体と
組み合わせてＣＤ−４リンパ球−標的細胞の相互作用の
抑制剤についての試験に用いることができる。該タンパ
ク質とその漂的分子の間の直接的結合検定に基づくこれ
らの例に加えて、タンパク質認識に対する生化学応答に
依存するさらに複雑な検定全行なうこともできる。欠失
突然変異体は、それらが相互に作用するＣＤ−４タンパ
ク質または分子を検出する診断検定に用いることができ
る。例えは、ＣＤ−４およびＣＤ−４＋細胞ならびにＣ
Ｄ−４に対する抗体の定量は、エイズに対する診断的価
値を示す。

加えて、ｓＣＤ−４タンパク質は、新規な診断薬、例え
ば、Ｍａｂｓまたは標準的免疫検定、すなわち、ＥＬＩ
ＳＡ、捕捉イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイにお
いて用いる他の分子型を生成するのに用いることができ
る。ｓＣＤ−４は、０ＫＴ−４，０ＫＴ−４ＡおよびＣ
Ｄ−４受容体の他の表面エピトープのすべてではないが
、大部分を表すので、該タンパク質は、系中のＣＤ−４
レベルの絶対量についての免疫診断検定において特に有
用である。

ＣＤ−４受容体は、３つの異なる化学環境下、すなわち
、酸化−親水性細胞表面、疎水性膜および還元−親水性
細胞質に存在する。これらの種々の環境が、おそらく、
完全な本来の状態での受容体の単離を阻んでいる。ｓＣ
Ｄ−４タンパク質は、細胞外ドメインの選択セグメント
からのみなり、可溶性タンパク質として細胞上澄液中に
分泌され、その構造は、受容体表面ドメインの表面を有
意な程度まで模写していると思われる。すなわち、ｓＣ
Ｄ−４タンパク質は、詳細な構造分析、特にＸ線結晶学
に適している。ｓＣＤ−４タンパク質の単独および他の
相互に作用する分子との複合形の３次元構造の決定は、
ｓＣＤ−４に対する選択的拮抗剤および作用剤の合理的
な設計に関する基礎を提供する。

実施例 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、
これらの限定されるものではない。一般操作において用
いられている酵素は商業的に入手し、実質的に販売者の
指示に従って用いた。他に断らない限り、操作は、実質
的にマニアナイスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ
、）　、モレキュラー葡クローニング（Ｍｏ！ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、コールド・スプリング・ハ
ーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８２に記載さ
れているように実施した。

実施例１ イー・コリ発現ベクターの構成 組換え体ＤＮＡ操作を用い、短縮しないＳＫＢｓＣＤ−
４８よび欠失突然変異体、ＶＩＶ２Ｊ４またはＶＩＪ４
、つづいてフレーム内のＴＡＡ終止コドン用のコーディ
ング配列（前記の配列参照）を、イー・コリ発現ベクタ
ーにおけるＯＭＰＡシグナル配列の下流に配列し、プラ
スミドＯＭＰＡＳＴ４ＢＢＶｌ、ＯＭＰＡＶＩＶ２およ
びＯＭＰＡＶＩを形成した。これらベクターの構成は以
下のとおりである。

プラスミドＪ　ＲＴ４の構成ニブラスミドＪＲＴ４を形
成するために、プラスミドＤＳＰｌ　（プファら（Ｐｆ
ａｒｒ、　ｅＬ　ａｌ、）　、ＤＮＡ、４：４６１（＋
９８５））をＸｈｏＩで切断し、ＳＶ４０ポリＡ初期部
位を欠失させ、該ＸｈｏＩ部位をＤＮＡポリメラーゼの
クレノー・フラグメント（Ｋ　ｌｅｎｏｗｆ　ｒａｇｍ
ｅｎ　ｔ　）を用いてフィル・イン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）
　した。

ラン成長ホルモン（Ｂ　Ｇ　Ｈ）のポリアゼニレ−ジョ
ン部位（プフア−ら、ＤＮＡ、５　：ｌ１５　（１９８
６））をＰｖｕＩ［およびＫｐｎＩで切断し、該Ｋｐｎ
■部位を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することによ
りプラント化した。この２３０ｂｐフラグメントをＤＳ
ＰＩに結合し、ＤＳＰ　Ｉ　ＢＧＨを形成しｌこ。

該ＤＳＰ’１ＢＧＨをＳ　ｍａ　Ｉおよび５ａｌｌで切
断し、ｇａｌＫカセント（ＳＶ４０初期プロモータと、
ｇａｌＫコーディング部位とＢ　Ｇ　Ｈポリ八部位とか
らなる）を、５ａｌＩ末端、Ｂｇ１ｍ部位およびＳ　ｍ
ａ　Ｉ末端からなる合成リンカ−を用いることにより５
ａｌＩ部位にてｐＵｃ１９（ヤニシューノぐ一ロンら（
Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、）、ジ
ン（Ｇ　ｅｎｅ）、３３　：１０３　（１９８５）に結
合した。この３部分の結合は、プラスミドＤＳＰ　ＩＢ
ＺＢＧＭ、ＪＴをもたらした。

ＤＳＰ　ＩＢＺＢＧＨ，ＪＴを、Ｓ　Ｌｕ　ＩおよびＢ
ｃｌ■で切断し、ｇａｌＫコーディング部位を欠失させ
、プラスミドｐＴ４Ｂ（マツトンら、セル、４２：９３
　（１９８５））からのＣＤ−４ｃＤＮＡを有する１　
、　７　ｋ’ｂＥ　ｃｏＲＩ　　（フィル・イン）−Ｂ
ａｍＨＩフラグメントに結び、プラスミドＪＲＴ４を形
成させｔこ。

プラスミドｐＴＪｃｓＴ４の構成ニブラスミドｐＵＣｓ
Ｔ４を形成するため、プラスミドｐＴ４ｂからのＣＤ−
４ｃＤＮＡのＨａｅＩ［およびＨｐａＩｒ７ルミＩｒ７
ラグメントｂｐ）を、合成リンカ−を用いて、Ｋｐｎｌ
およびＸｂａＩで切断されたベクターｐＵＣ１８に結合
した。ＣＤ−４ｃＤＮＡのＨａｅｌＩ末端を、合成リン
カ−を用い、Ｋｐｎｌ末端およびＨａｅＵ末端でｐＵｃ
１８のＫｐｎＩ部位に結合した。ＣＤ−４ｃＤＮＡのＨ
ｐａＩｌを、合成リンカ−を用い、Ｈｐａ■末端とＸｂ
ａｌ末端でｐＵＣのＸｂａＩに結合した。

このリンカ−はまた、ＣＤ−４コ一デイング部位のヌク
レオチド１２５７の後にＴＡＡ停止コドンを挿入した。

得られたプラスミドは、ｐＵＣｓＴ４であった。

ｐＳ　Ｔ　４　ｓａｔの構成ニブラスミドｐＳ　Ｔ　４
　ｓａｌを形成するため、プラスミドＪＲＴ４を、Ｂｇ
ｌＩ［および５ａｃＩで切断し、９５９ｂｐフラグメン
ト（ＣＤ４　ｃＤ　Ｎ　Ａの第１の６０２ヌクレオチド
とＳＶ４０初期プロモーターとからなる）を単離した。

プラスミドｐＵｃｓＴ４を、５ａｃｌおよびＸ　ｂａ　
Ｉで切断し、６６０ｂｐフラグメント（合成リンカ−か
らのＴ　Ａ　Ａコドンに付随したヌクレオチド６０３１
２５７からのＣＤ−４ｃＤＮＡからなる）を単離した。

これら２つの７ラグメントを、Ｂｇｌ［ＩおよびＸｂａ
ｌで切断したＤＳＰＩＢＺＢＧＨ，ＪＴに結合し、ＳＶ
４０初期プロモーターおよび短縮しないｃ　Ｄ−４コ一
デイング部位を欠失させた。得られたプラスミドはｐＳ
　Ｔ　４　ｓａｌであった。

＋）ＳＴ４ＤＨＦＲの構成ニブラスミドｐＳＴ４ＤＨＦ
Ｒを形成するため、β−グロビンＤＨＦＲ発現力セント
を有するＢｇｌ　ＩＩ　−ＢａｍＨＩ　７ラグメントを
、ｐｓＴ４ｓａｌのＢａｍＨ１部位に結合した。βグロ
ビンＤＨＦＲ発現カセットは、その５′末端にて合成リ
ンカ−で修正され、ＢｇｌＩ［部位を有するマウスβ−
グロビン・プロモーター（プラスミドｐＰＫ２８８から
の５５０ｂｐＨｉｎｃＩ［７ラグメント（バーブら（Ｂ
ｅｒｇ、　ｅｔ　ａｌ、）、モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂ　ｉ。

１、）、３：１２４６　（１９８３））、マウスＤＨＦ
Ｒコーディング部位（プラスミドｐＳ　Ｖ　２−　ＤＨ
ＦＲからの７３５ｂｐＨｉｎｄｌＩ［（７４ル・イン）
フラグメント（スプラマニら（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、　
ｅｔ　ａｌ、）、モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー１＋８５４　（１９８１））、ＤＳＰＩから
のＮｈｅＩ　（フィル・イン）−ＢａｍＨＩ（フィル・
イン）ＳＶ４０ポリＡ初期部位（プフ７−ら、ＤＮＡ、
４：４６１　（１９８５））、およびその３″末端にて
合成リンカ−で修正され、Ｂａｍ８１部位を形成するマ
ウスＤＨＦＲターミネータ一部位（９０７ｂｐＨｉｎｄ
ｎｌ　（プラスミドｍＤＨ９からのフィル・インフラグ
メント（７ラインら（Ｆｒａｙｎｅ、　ｅｔ　ａｔ、）
、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー４：
２９２１　　（１９８４）））からなる。

ｐｓＴ４ＢＢＶＩＤＨＦＲの構成・プラスミドｐｓＴ４
ＢＢＶｌ’ＤＨＦＲを形成するため、プラスミドｐＳＴ
４ＤＨＦＲをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断し、ｓＣ
Ｄ−４コ一デイング部位を有するより小さなフラグメン
トを欠失させた。プラスミドｓＴ　４　ｓａｔをＸｂａ
ＩおよびＢ　ｂｖ　Ｉで切断し、リダ一部位を欠損して
いる可溶性ＣＤ−４用の配列を有する１１２０塩基対コ
ーデイングフラグメントを単離した。このフラグメント
を、合成リンカ−を用い、ＥｃｏＲＩ末端、ＫｐｎＩ部
位およびＢｂｖ■末端で、ｐＳＴ４ＤＨＦＲ切断のＥｃ
ｏＲＩ／ＸｂａＩに結んだ。このフラグメンｉ・は、前
記の単離したｓＣＤ−４７ラグメント上のＢｂｖｌ突出
部と適合する。得られたプラスミドを、ｐＳＴ４ＢＢＶ
ＩＤＨＦＲと称した。

ＯＭＰＡＳＴ４（７）構成ニブラスミドＯＭＰＡＳＴ４
を形成するため、プラスミドＯＭＰＡ、ＧＳを、Ｎｃｏ
ＩおよびＳａ！Ｉで消化し、リンカ一部位を有する小フ
ラグメントを欠失させた。ＯＭＰＡ。

ＧＳは、ａｌｌリボゾーム結合配列の３′末端にてＮｄ
ｅ１部位に挿入された合成配列を有するｐＡｓｌ（ロー
ゼンバーグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　ｅｔ　ａｌ、）
　、メッソズ・イン・ｒ、ンザイモロジー（Ｍｅｔｈ、
　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ、）、ｌｏｔ　：　１２３　（１９
８３）；米国特許第４５７８３５５号）の誘導体である
。該合成配列は、マルチリンカ−配列に付随したＯＭＰ
Ａリーダーからなる。合成配列は、実質的には、次のと
おりであった。

５　−Ｔ　　ＡＴＧ　　ＡＡＡ　　ＡＡＧ　　ＡＣＡ　
　ＧＣＴ　　ＡＴＣＧＣＧ　　ＡＴＴ　　ＧＣＡ　　Ｇ
ＴＧ　　ＧＣＡ　　ＣＴＧ　　ＧＣＴＧＧＴ　ＴＴＣＧ
ＣＴ　ＡＣＣＧＴＡ　ＧＣＧ　ＣＡＧ　　ＧＣＣＧＧＣ
ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＴＴ　ＭＣＴＡ
Ｇ−３ プラスミドｐＵｃｓＴ４を、ＮｃｏＩおよび５ａｌｌで
切断し、ｓＣＤ−４配列を有する１　１４’ｌ塩基対フ
ラグメント（ＣＤ−４ヌクレオチド１２４−１２５７）
を単離した。このフラグメントを、ＯＭＰＡ、ＧＳ切断
のＮｃｏＩ／５ａｌｌに結び、ＯＭＰＡＳＴ４を形成さ
せた。

ＯＭＰＡＳＴ４ＢｂｖＩの構成ニブラスミドＯＭＰＡＳ
Ｔ４ＢｂｖＩを形成するため、プラスミドＯＭＰＡＳＴ
４をＮａｅＩおよびＸｂａＩで切断した。

この切断により得られたｓＣＤ−４コ一デイング部位を
有するフラグメントを欠失させｌ：。プラスミド５Ｔ４
ＢＢＶＩＤＨＦＲを、ＫｐｎＩで切断し、得られた３′
突出部を７４ＤＮＡポリメラーゼでブラン］・末端化し
た。ついで、該プラント末端ＤＮＡをＸｂａｌで切断し
、ＣＤ４ｃＤＮＡのヌクレオチド１４５ｉ２５７を含有
する１１２４塩基対フラグメン１−を単離した。該単離
７ラグメントを、ＯＭＰＡＳＴ４プラスミド切断のＮａ
ｅＩ／ＸｂａＩ切断に結合し、プラスミドＯＭＰＡＳＴ
４ＢｈｖＩを形成した。

ｐｕｃｓＴ４１８４の構成ニブラスミドｐｕｃｓＴ４１
８４を形成するため、ＣＤ−４ｃＤＮＡからのＥｃｏＲ
Ｉ−ＮｈｅＩフラグメント　［アミノ酸（−２５）〜（
＋１７６）をコード化する６８２ｂｐ７ラグメント］を
、ＮｈｅＩ部位にて合成リンカ−５ｋ７２７／　７２５
　（ＮｈｅＩおよびＡｖａｌ末端）に結合させた。５ｋ
７２７／７２５は、ＣＤ−４アミノ酸＋７７−１８３を
コード化する。５ｋ７２７／７２５のＡｖａＩ末端を、
ｐｕｃＳＴ４のＡｖａＩ　−Ｘｂａｌフラグメント（ヒ
トｃＤＮＡのｂｐＨ９８−１２５７とＴＡＡ終止コドン
に付随したＣＤ−４受容体のコード化アミノ酸３５１−
３６９とからなる）に結んだ。この配列を、ＥｃｏＲＩ
およびＸｂａＩ末端で７ランク化（ｆ　ｔａｎｋ）　Ｌ
、ｐＵｃ１９ポリリンカー（ｓｋ７２７／　７２５）の
ＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌ末端にてｐｌＪｃ１９に挿入
した。５ｋ７２７／７２５は実質的には以下のとおりで
ある。

５’　ｃｔａｇｃｔｔｔｃｃａｇａａｑｑｃｃ　３’３
’　ｑａａａｑｑｔＣｔｔＣＣｑｑａｑＣＣ５’ｐｕｃ
ｓＴ４１０６の構成ニブラスミドｐｕｃＳＴ４１０６を
形成するため、ＣＤ−４ｃＤＮＡのＥｃ。

Ｒ１−ＡｖａＩ［７ラグメント（ｂｐｌ−４１３とコー
ド化アミノａ（−）２５〜８７とからなる）を、Ａｖａ
■部位にて合成リンカ−５ｋ７９１／７９２　（Ａｖａ
■−Ａｖａｌ末端）に接合した。５ｋ７９１−７９２は
、ＣＤ−４アミノ酸８８−１０４をコード化する。５ｋ
７９１／７９２のＡｖａｌ末端を、ｐｕｃ　ＳＴ４のＡ
ｖａＩ−Ｘｂａｌフラグメント（ヒトｃＤＮＡのｂｐＨ
９８−１２５７と、ＴＡＡ終止コドンに付随したＣＤ−
４受容体のコード化アミノ酸３５１−３６９とからなる
）に結合させた。この配列を、ＥｃｏＲＩおよびＸ　ｂ
ａ　Ｉ末端でフランク化し、ｐＵｃ１９ポリリンカーの
ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ末端にてｐＵｃ１９に挿入し
た。５ｋ７９１／７９２は、実質的には以下のとおりで
ある。

ｑａＣＣａｑａａｑｑａｑｑａｑｑｔｑｃａａｔｔｇｃ
ｔａｇｔｑｔｔｃｇｇａｔｔｇａｃｔｇｃＣａａＣｑｔ
ＣｔｔＣＣｔＣＣｔＣＣａＣｑｔｔａａＣｑａｔＣａＣ
ａａｑＣＣｔａａＣｔｑａＣｑｑｔｔｑａｑＣ５ｓＴ４
１８４．ＤＨＦＲの構成ニブラスミド５Ｔ４１８４、Ｄ
ＨＦＲを形成するため、ｐｕｃｓＴ４１８４のＥｃｏＲ
Ｉ−ＸｂａＩフラグメント（３５１〜３６９に融合した
アミノ酸（−２５）−１８３をコード化）を、ＳＫＢｓ
ＣＤ−４をコード化するＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメ
ントの代わりに、ｐｓＴ４．ＤＨＦＲのＥｃｏＲＩおよ
びＸｂａｌ末端に結合しｔこ。

ｓＴ４１０６．ＤＨＦＲの構成ニブラスミド５Ｔ４１０
６、ＤＨＦＲを形成するため、ｐｕｃｓＴ４１０６のＥ
ｃｏＲＩ　−Ｘｂａｌ　７ラグメント（３５１−３６９
に融合したアミノ酸（−２５）−１０４をコード化）を
、ＳＫＢｓＣＤ−４をコード化するＥｃｏＲＩ　−Ｘｂ
ａ　ｌフラグメントの代わりに、ｐｓＴ４、ＤＨＦＲの
ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ末端に結合しＩこ。

ＯＭＰＡＶｌの構成：　ＯＭＰＡＶｌを形成するため、
プラスミドＯＭＰＡＳＴ４ＢｂｖＩを、ＡＨ■およびＸ
ｂａｌで切断し、ＣＤ−４ｃＤＮＡコーディング部位の
ヌクレオチド３７１−１２５７を有する小フラグメント
を欠失させた。プラスミドｐｓｔ４１０６．ＤＨＦ　Ｒ
を、ＡｆｌｌｌおよびＸｂａｌで切断し、ＣＤ−４ｃＤ
ＮＡ配列のヌクレオチド３７１−４５９．・１１９８−
１２５７を有する１６０塩基対フラグメントを単離した
。２つのフラグメントを結合し、シラスミドＯＭＰＡＶ
ｌを形成させた。

ＯＭＰＡＶＩＶ２の構成：ＯＭＰＡＶＩＶ２を形成する
ため、プラスミドＯＭ　Ｐ　Ａ　Ｓ　Ｔ　４　Ｂ　ｂｖ
　１を、５ａｃＩおよびＸｂａＩで切断し、ＣＤ−４ｃ
ＤＮＡ配列のヌクレオチド６０３−１２５７を有する小
フラグメントを欠失させた。プラスミド５Ｔ４１８４、
ＤＨＦＲを５ａｃｌおよびＸｂａｌで切断し、ＣＤ−４
ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド６０３−６９６．１１９８
−１２５７を有する１６４塩基対フラグメントを単離し
た。２つの７ラグメントを結び、プラスミドＯＭＰＡＶ
ＩＶ２を形成させに。

実施例２：イー・コリにおけるｓＣＤ−４タンパク質の
発現 ＯＭＰＡＶｌおよびＯＭＰＡＶＩＶ２構成を、漂準操作
を用い、不完全なイー・コリλリゾゲン、ＡＲ５８（ｃ
ｌ　８５７）およびＡＲ１２０に形質転換させＩ；。熱
誘導（ローゼンバーグら、メンッズ・イン・エンサイモ
ロシ＋、ｔｏ　ｌ　：　１２３　（１９８３））または
ナリジクス酸誘導（モットら（Ｍｏｔｔ、　ｅｔ　ａｌ
、）　、プロシーデインダス・オフ・ナショナル・アカ
デミ−・オフ・サイエンシス、ニー・ニス・エイ、８２
　：　８Ｌ（１９８５））は、以下のとおりに実施した
。

熱誘導：細胞系統ＡＲ５８について、Ｌ８２００ｍ１２
（５９μｇ／−のアンピシリンを含有）を、ＯＭＰＡＳ
Ｔ４Ｂｂｖｌ、ＯＭＰＡＶＩまたはＯＭＰＡＶＩＶ２プ
ラスミドを含有するＡＲ５８細胞のｌＯ−オーバーナイ
ト（０，Ｎ、）培養株のうちの７−で接種し、３２℃に
おいて振盪インキュベーター中で増殖させた。６５０ｎ
ｍでの光学濃度Ｃｏ−Ｄ−ｍｓ。）、０．８吸光度単位
にて、５５°Ｃに加温したＬＢ２００ｍｌｌを該培養株
に加え、該フラスコを４２℃の振盪インキュベーターに
移した。

解析用に、温度上昇の３０．６０および９０分後、培養
株の試料１ｒｒｔｌを摂取した。９０分での細胞を、氷
水中にて１５分間冷却し、ついでＪ−６ベツクマン遠心
分離機（カリフォルニア州、フラートン、ベックマン・
インステニルメン）　）　　（）３　ｅｃｋｍａｎＩｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　　ＦｕＪＩｅｒｔｏｎ、　Ｃａ
１ｉｆｏｒｎｉａ）を用い、４℃にて１５分間、３５０
０　ｒｐｍにてペレット状にした。細胞ペレットを、プ
ロセシングまで一２０°Ｃにて凍結保存した。

ナリジクス酸誘導：細胞系統ＡＲｌ　２０について、Ｌ
Ｂ４００ｍｆｆ（５０μｇ／−のアンピシリンを含有）
を、ＯＭＰＡＳＴ４Ｂｂｖｌ、ＯＭＰＡＶＩまたはＯＭ
ＰＡＶ　Ｉ　Ｖ２プラスミドを含有するＡＲ１２０細胞
の２０ｒｎＱＯ，Ｎ、培養株のうちの１３−で接種し、
振盪インキュベーター中、３７０Ｃにて増殖させた。Ｏ
，Ｄ、、、。、０，４にて、ナリジクス酸（５０ｍｇ／
ｍＱ）　４００μａを該培養株に添加した。該培養株を
振盪インキュベーター中、３７℃に維持し、ナリジクス
酸の添加後、１３および５時間にて試料ｌ−を摂取した
。５時間での細胞を、氷水中にて１５分間冷却し、つい
でＪ６ベツクマン遠心分離機を用い、４℃にて１５分間
、３５００　ｒｐｍにてペレット状にした。細胞ペレッ
トをプロセシングまで一２０°Ｃにて凍結保存した。条
件培地をプ・ロセシングまで一２０°Ｃにて凍結保存し
た。

誘導後、細胞を試料１ｄからペレット化し、ラビットの
ポリクローナル抗体を細菌にて産生した変性形の可溶性
Ｔ４に用いるウェスタンプロット法により、短縮してい
ない、突然変異体のｓＴ４タンパク質（ＳＫＢｓＣＤ−
４、ＶＩＪ４およびＶＩＶ２Ｊ４）の発現について試験
した。適当なサイズのタンパク質が、熱およびナリジク
ス酸の両方で誘導した試料の細胞溶解物において検出し
た。検出レベルは、総タンパク質の１〜５％を示しＩこ
。

条件培地プロセシング：凍結した条件培地を室温にて解
氷し、アリコート３０　ｎ＋１２を摂取し、ベックマン
５Ｗ２８・スイング・バケント・ローターヲ用い、４°
Ｃにて１時間、２４００　Ｏｒｐｍで遠心分離に付した
。遠心分離後、上澄液をプールし、圧膜濾過により４°
Ｃにて１０〜２０倍に濃縮した。

濃縮培地を、ウェスタンブロンド解析（前記ト同じ）、
競合ＥＬｒＳＡおよび免疫沈澱法により、短縮しないＳ
ＫＢｓＣＤ−４、ＶＩＪ４またはＶ１Ｖ２Ｊ４タンパク
質について検定シタ。

各試料において、適当なサイズのタンパク質を、細胞内
部にて検出されたタンパク質の１〜５％を示すレベル（
０，１〜０　、５　ｎｇ／−の非濃縮条件培地）にて、
ウェスタンプロットにより濃縮条件培地にて検出した。

３種のすべてのタンパク質は、競合ＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定
において、０ＫＴ４Ａと結合した。ＶＩＪ４およびＶＩ
Ｖ２Ｊ４タンパク質をサラに、ＣＤ−４に対する一群の
モノクローナル抗体にュージャージー州、ラリタン、オ
ルト）（ｏｒｔｈｏ、　Ｒａｒｉｔａｎ、　Ｎｅｗ　Ｊ
　ｅｒｓｅｙ）との免疫沈澱法により検定した。ＯＭＰ
ＡＶＩにより発現したタンパク質、ＶＩＪ４１１．０Ｋ
Ｔ４Ａおよび０ＫＴ４Ｄ＋、：より免疫沈澱したが、０
ＫＴ４．０ＫＴ４Ｂ、○ＫＴ４Ｃ１ＯＫＴ４Ｅまたは０
ＫＴ４Ｆでは免疫沈澱しなかった。ＯＭＰＡＶＩＶ２に
より発現したタンパク質、ＶＩＶ２Ｊ４は、０ＫＴ４以
外のすべての０ＫＴ４モノクロ一ナル抗体により免疫沈
澱した。加えて、このタンパク質の０ＫＴ４Ｃに対する
親和性は、他のモノクローナル抗体に対する親和性より
も低い。

細胞ペレットプロセシング：９０分時点のＯＭＰＡＳＴ
４Ｂｂｖｌ／ＡＲ５８熱誘導からの細胞ペレットを、氷
上で解氷し、緩衝液に対するベレットの割合、１０００
　、Ｄ　、ｉｓｏ／　ｍ１２にて、４°Ｃの緩衝液（１
００ｍＭトリス−ＨＣｆｆ、ｐＨ８，０，５ｍＭＥＤＴ
Ａおよび０．５Ｍシュークロース）に再懸濁させた。リ
ソチーム（０，０５Ｍトリス−ＨＣ１２゜ｐＨ８におい
てｌｏｍｇ／ｍＱ）を、最終濃度０．２ｍｇ／−まで添
加し、懸濁液を氷上にて１５分間インキユベーンヨンし
た。等量の氷冷水を加え、懸濁液を氷上にて１５分間イ
ンキュベーションした。

ＰＭＳＦ　（５０ｍＭ）を最終濃度１ｍＭまで加え、つ
いでＭｇｃＱｚ（ＩＭ）を最終濃度２ｍＭまで加えた。

該細胞懸濁液を、１８ゲージ針に３回通し、粘度を減少
させ、ついで４°Ｃにて１０分間、２００００ｘｇにて
遠心分離に付した。

遠心分離後、ペレ７）を遠心分離前の容量に等しい容量
の２０ｍＭトリス−ＨＣＱ、ｐＨ８，５ｍＭＥＤＴＡ、
５ｍＭ／７ＭＨに再懸濁させた。該懸濁液を、６０秒間
超音波九埋金行い、ついで４°Ｃにて１５分間、２００
００ｘｇで遠心分離に付した。

得られたベレットおよび上澄液のウェスタンプロット検
定は、７０％のＳＫＢｓＣＤ−４タンパク質が上澄液フ
ラクションにあることを示した。該上澄液７ラクシヨン
を、１１０００００ｘにて６０分間遠心分離に付した。

得られたベレットと上澄液のウェスタンプロット解析は
、〈５％のＳＫＢｓＣＤ−４タンパク質が溶液中に残存
することを示した。該上澄液フラクションを、等容量の
４０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６，０で希釈し、２０ｍＭＭＥＳ
。

ｐＨ６，０で平衡状態にしたｌ−のＳセファロースにュ
ージャージー州、ビス力タウエイ、ファーマシア）（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎｅｗ
　Ｊｅｒｓｅｙ）カラム上に加えた。該カラムを、１０
ｍ１の２０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６，０で洗浄した。結合し
たＳＫＢ　ｓＣＤ−４を、２０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６，０
，０，５ＭＮａＣＱで溶出し、１ｍｆｌづつのフラクシ
ョンを採集した。流出、洗浄および溶出フラクションの
ウェスタンフロノド解析は、＜５％のＳ　Ｋ　Ｂ　ｓ　
ＣＤ４が該カラムに結合し、フラクション２および３に
て溶出したことを示した。

流出、洗浄および溶出フラクションを、競合ＥＬＩＳＡ
により、機能的ＳＫＢｓＣＤ−４について検定した。流
出および溶出フラクション２の両方は、０ＫＴ４Ａと結
合したＳＫＢｓＣＤ−４を有した。

免疫法＃：濃縮培地（１００μａ）を、等容量の沈澱緩
衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７。

５、ｌ　ＯＯｍＭＮａＣ：　Ｑ、０．１％ＮＰ−，４０
，０゜５％非脂肪ドライミルク）で希釈し、４°Ｃにて
１５分間、３Ｆｇの、ラビットＩｇＧで予め清掃し、つ
づいて４°Ｃにて３０分間、タンパク質Ａ−セファ０−
ス・ビーズにュージャージー州、ビス力タウェイ、フ７
−マシア）３０μＱ（パック容ｉｋ）を加えた。予め清
掃した上澄液を、５μｇの０ＫＴ４．４Ａ、４Ｂ、４Ｃ
，４Ｄ、４Ｅ、４Ｆ、０ＫＴ８モノクロ一ナル抗体（オ
ルト・ファーマシューティカル）、マウスＩｇＧ（ペン
シルベニア州、マルバーン、クーパー・バイオメディカ
ル）（Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、　Ｍａｌ
ｖｅｒｎ、Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）またはラビット
抗−マウスＩｇＧ（クーパー・バイオメディカル）と共
に４°Ｃにて３０分間インキュベーションした。０ＫＴ
４．４Ａ’、４Ｃ，０ＫＴ８、マウスＩｇＧおよびラビ
ット抗−マウスＩｇＧは、４℃にて３０分間、タンパク
質入−セファロース・ビーズ２０μＱ（バック容量）と
のインキュベーションにより沈澱した。０ＫＴ４Ｂ、４
Ｄ１４Ｅおよび４Ｆは、タンパク質Ａセファロース・ビ
ーズの添加前、４℃にて３０分間、ラビット抗マウスＩ
ｇＧＩＯμｇと共にインキュベーションした。沈澱した
後、該ビーズを沈澱緩衝液２００μＱで２回、ＮＰ−４
０および非脂肪ドライミルクを除去した沈澱緩衝液２０
０μａで１回洗浄した。洗浄ビーズを、試料緩衝液（１
２５ｍＭトリス−ＨＣＱ、ｐＨ６，８，２０％グリセロ
ール、１．４ＭβＭＥ（β−メルカプトエタノール））
２０μρ中で５分間煮沸した。煮沸後、上澄液を１２．
５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動に付
し、前記のようにウェスタンプロットにより検定した。

ＶＩＪ４およびＶＩＶ２Ｊ４タンパク質の両方は、０Ｋ
Ｔ４Ａにより免疫沈澱した。ＯＭＰＡＶｌにより発現し
たタンパク質は、０ＫＴ４Ａおよび０ＫＴ４Ｄにより免
疫沈澱したが、０ＫＴ４．０ＫＴ４Ｂ、０ＫＴ４Ｃ，０
ＫＴ４Ｅまたは０ＫＴ４Ｆによっては免疫沈澱しなかっ
た。ＯＭＰＡＶＩＶ２により発現したタンパク質は、０
ＫＴ４以外のすべての０ＫＴ４モノクロ一ナル抗体によ
り免疫沈澱した。加えて、０ＫＴ４Ｃに対するこのタン
パク質の親和性は、他のモノクローナル抗体に対するよ
りも低い。

競合ＥＬＩＳＡ：マイクロタイター・プレート（ｍｉｃ
ｒｏｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅ）　　（バージニア州、マ
ツクレーン、７０−・ラボラトリーズ）（ＦｌｏｗＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　ＭｃＬｅａｎ、　Ｖｉｒｇｉ
ｎｉａ）を、精製したｓＣＤ４を１５０ｎｇ含有するＯ
６１ＭＮａＨＣＯｓ／Ｎａ５ＣＯ３（ｐＨ９，４）ｌ　
００／’　Ｑ／ウェルで、室温にて一夜コートした。

濃縮した培地または細胞抽出物のアリコート（２，５〜
８０μＱ）を、１００μＱの最終容量のウシ血清アルブ
ミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）　１　ｍｇ／−の存在下、室温にて
一夜、ＯＫＴ４Ａ５ｎｇと共にインキュベーションした
。１００μＱに満たない試料は、リン酸塩緩衝食塩水（
ＰＢＳ）で１００μＱに希釈した。インキュベーション
後、該プレートを洗い流し、ＰＢＳで３回リンスし、バ
ット乾燥した。

各ウェル番こ、ＰＢＳ／Ｑ、５％ゼラチン３８０μＱを
添加した。該プレートを３７°Ｃにて１時間インキュベ
ーションした。

３７°Ｃにてインキュベーションした後、該プレトを洗
い流し、ＰＢＳで３回リンスし、バット乾燥した。モノ
クローナル抗体を含有する試料インキュベーション１０
０μＱを、調製プレートの個々のウェルに加え、３７℃
にて５時間インキュベーションした。

インキュベーション後、該プレートを洗い流し、ＰＢＳ
で５回リンスし、バット乾燥した。バイオチニレート（
ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ウマ／抗−マウスＩｇＧを
含有する溶液１００μＱを、各ウェルに加えた。この抗
体調製物は、１滴のウマ／抗−マウスＩｇＧ（カリフォ
ルニア州、パーリンガム、ベクター・ラブダ）　　（Ｖ
ｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を、１％ウマ血清を含有するＰ
ＢＳｌＯ−に加えることにより調製した。該プレートを
３７°Ｃにて３０分間インキュベーションした。

インキュベーション後、該プレートを洗い流し、ＰＢＳ
で５回リンスし、バット乾燥した。ＡＢＣ複合体（カリ
フォルニア州、バーリンガム、ベクター・ラブダ）１０
０μＱを、各ウェルに加えた。

ついで、該プレートを、室温にて３０分間インキュベー
ションした。

該プレートを再度洗い流し、ＰＢＳで５回リンスし、バ
ット乾燥した。ｐ−ニトロフェニルホスフェート混合物
（０，１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ９，４、ｌ　Ｏｍ
Ｍ　ＭｇＣＱ　２中、２１Ｔ１ｇ／−のｐ−ニトロフェ
ニルホスフェート（ミズリー州、セント・ルイス、シグ
マ・ケミカル・コーポレイション（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓ　Ｌ、　Ｌ　ｏｕｉｓ、　Ｍ　
１ｓｓｏｕｒｉ））■００μＱを、各ウェルに加えた。

該プレートを、暗がりにて３０分間、３７°Ｃにてイン
キュベーションした。インキュベーション後、該プレー
トを４０５ｎｍの吸光度にて読み取った。ｓＣＤ−４の
濃度を、既知量の精製ｓＣＤ−４と０ＫＴ４Ａ抗体との
インキュベーションにより生成する標準曲線に対して測
定した。両方のタンパク質（ＶＩＪ４とＶＩＶ２Ｊ４）
は、この競合ＥＬＩＳＡにおいて、０ＫＴ４Ａモノクロ
一ナル抗体と結合することが判明した。

実施例３ 酵母発現ベクターの構成 ｓＣＤ−４タンパク質の発現について、酵母における発
現ベクターを構成するために用いたプラスミドは、ベー
シック・ハイ・コピー・酵母・シャトルベクターｐＹＳ
Ｋ１０２（ローゼンバーグら、ゲネテック・エンジニア
リング（ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）　、
８　：　ｌ　５１　（１９８６）をベースとする。かか
るすべてのプラスミドは、酵母ＴＲＰＩ遺伝子の８２３
塩基対ＥｃｏＲ１−ＰｓＬＩフラグメント（ランパーお
よびカーボン（Ｔ　ｓｕｍｐｅｒおよびＣａｒｂｏｎ）
　、ジン（Ｇ　ｅｎｅ）、ｌｏ：１５７（１９８０））
を有し、それは選択マーカーを提供し：酵母２−ミクロ
ン・サークルの２．０ｋｂＥｃ。

ＲＩ−ＰｓＬＩフラグメント（ハートレイおよびドナル
ドソン（）ｌ　ａｒｔ　ｌｅｙおよび　Ｄｏｎａｌｄｓ
ｏｎ）　、ネイチャー、２８６　：　８６０　（１９８
０）を有し、それは酵母の複製源を提供し、ｐＢＲ３２
２の一部（ＢａｍＨＩからＰｖｕｌＩまで欠失した）（
クローニング・ベクターにおいて、ポーウエルス、エン
ガ、バルク（Ｐｏｕｗｅｌｓ、Ｅｎｇｅｒ、Ｖａｌｋ）
　、Ｅｄｓ、、１９８５）を倚し、それはｐＢ　Ｒ３２
２のＨｉｎｄｌｌＩとＢａｍＨＩ部位の間に挿入された
イー・コリおよび酵母のプロモーター−ターミネータ−
・モジュールの複製および選択を提供する。該プロモー
ターは、ｐＹｓＫ１２からのＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲｌ
フラグメントとして誘導されたＣＵＰ　ｌの４３１塩基
対ＢａｍＨＩ　−Ｒｓａ　ｌフラグメント（バットら（
Ｂｕｔｔ、　ｅｔ　ａｌ、）、プロシーデインダス・オ
フ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシス、ニ
ー・ニス・エイ、８１　：　３３３２　（１９８４）、
　ローゼンバグら、ゲネテンク・エンジニアリング、８
：１５１（１９８６）、ゴーマンら（Ｇｏｒｍａｎ、　
ｅｔ　ａｌ、）、ジン、４８　：　１３−（１９８６）
）であるか、またはプラスミドｐＹｓＫ１８からのＢａ
ｍＨＩ　−Ｅｃ。

ＲＩｌフラグメントローゼンバーグら、前掲、ゴーマン
ら、前掲）として誘導された１、１ｋｂＴＤＨ３プロモ
一ター配列（ホランドら（Ｈｏｌｌａｎｄ。

ｅｃ　ａｌ−）　、ジャーナル・オフ・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃｈｅｍ、）、
２５５　＋　２５９６　（１９８０）のいずれかである
。該ターミネータ−は、ＣＹＣｌ遺伝子の３６１塩基対
ＫｐｎＩ　−Ｈｌｎｄｎ［フラグメント（スミスら、セ
ル、１６：７５３（１９７９）である。該プロモーター
と該ＣＹＣｌフラグメントの間の部位に、以下に示すよ
うな種々の合成配列を挿入することができる。

ｐＹＳＫ１４７およびｐＹｓＫ１４８の構成ニブラスミ
ドｐｙ　Ｓ　Ｋ’４３７　（（、Ｕ　Ｐ　Ｉプロモータ
ー）およびｐＹＳＫ　１３８　（ＴＤｔＬ３プロモータ
ー）は、プロモーター配列の３″末端でのＥｃｏＲＩ部
位とターミネータ−配列の５′末端でのＫｐｎＩ部位の
間に合成オリゴヌクレオチド配列を有する。

この合成配列は、３つの読み取り枠中、翻訳終止コドン
の上流にユニーク制限部位ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩおよび５
ａｌＩを有する。合成リンカ−は以下の配列である。

ＡＧＧＴＡＣＣ ｓＣＤ−４配列の塩基１２４−１２５７を含有するプラ
スミドｐＵＣｓＴ４のＮｃｏｌ　−Ｓａｔ　Ｉフラグメ
ントを、ｐＹｓＫ１３７またはｐＹｓＫ１３８切断のＮ
ｃｏｌ−Ｋｐｎｌに挿入し、各々、ｐｙ　Ｓ　Ｋ１４７
およびｐＹｓＫ１４８を得た。

ｐＹｓＫ１５４およびｐＹｓＫ１５５の構成：ユヒキチ
ン融合遺伝子発現用のベクターは、プロモーターとｃｙ
ｃ　をターミネータ−の間に、合成酵母ユビキチン遺伝
子に適合したカセツトを有する（エカーら（Ｅｃｋｅｒ
、　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナル・オフ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、２６２：３５２４　（１９８７））
。ユビキチン配列は、ターミナルＡｆｌＩ［−ＫｐｎＩ
フラグメントが、３″末端にてＮｃｏＩ制限部位を含有
するオリゴヌクレオチド配列によって置き換えられてい
る以外は、エカーらにより公表されたものと同一である
。所望のｓＣＤ−４配列を有するｐＹｓＫ１４７のＮｃ
ｏＩ　−ＫｐｎＩ７ラグメントを、ＣＹＣｌフラグメン
Ｉ・の５゛末端にてこのＮｃｏＩ部位とＫｐｎ１部位の
間に挿入し、ｐＹｓＫ１５４を得た。ｐＹｓＫ１５４の
ｓＣＤ　　４配列の最初の７アミノーターミナルアミノ
酸に対する配列（リーダーペプチド配列）が欠失したｐ
ＹｓＫＩ５４の誘導体を、ｐＹｓＫ１５４をＫｐｎｌで
開裂し、つづいてイー・コリＤＮＡポリメラーゼ■のフ
レノウ・フラグメント（Ｋ　ｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅ
ｎｔ）　　（ｐｏｔ　Ｉ　Ｋ）でフィル・インし、ｐｏ
ｌＩＫで処理したｐｓＴ４ＢＢＶＩＩ）ＨＦＲからのＫ
ｐｎＩ　−Ｘｂａｌｓ　ＣＤ　−４配列（ｓ　ＣＤ４の
塩基！４５ないし１２５７）をステイソキイー末端にフ
ィル・イン挿入することにより構成した。このプラスミ
ドを、ｐＹｓＫ１５’５と称する。

ｐＹｓＫ１５９およびｐＹｓＫ’１６１の構成：切形ｓ
ＣＤ−４配列（塩基１２４−６０３）を有するベクター
は、ｓ’ＣＤ−４配列の５ａｃｌ部位（塩基６０２）に
て、終止コドンを有する合成オリゴヌクレオチドを挿入
することにより構成した。該合成リンカ−（２ｘ標準）
は以下の配列を有する。

この合成配列を、ｐＹｓＫ１４８およびｐＹｓＫ１５４
切断の５ａｃｌおよびＮａｒｌに挿入し、各々、ｐＹ、
５Ｋ１５９およびｐＹｓＫ１６１を得た。かくして、ｐ
ＹｓＫ１５９のＣＤ、−４ＤＮＡは、アミノ酸−９（ア
ラニン）〜１５．＋（ロイシン）（ＹＶｌ）に対するコ
ドンを有する。

実施例４ 酵母培養におけるｓＴ４の発現 プラスミドＤＮＡ　（２〜ｌＯμｇ／−）を用い、トリ
プトファン原栄養体を選択する標準法（シェルマンら（
Ｓｈｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｔ、）　、メソッド・イン・
イースト・ゲネテンクス（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅ
ａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ）　、コールド・スプリング・
ハーバ−１９８６）を用いて、酵母（サッカロミセス・
セレビシエ）を形質転換した。用いた系統は、系統Ｆ７
６２　（マタ（ＭａＬａ）　、ｔｒｐｌΔｌ、ｕｒａ３
５２）またはＰＥＣ１”８Ｂ（マタ、ｐｒｏＡΔ：：　
ＵＲＡ３、ｕｒａ３　”　５２、ｔｒｐｌ−２８９、ｈ
ｉｓ３）であった。選択された被形質転換体の培養株を
、補足物（２％グルコース、２０μｇ／＋ｎ＋２ウラシ
ル、２０μｇ　／　ｍ１２ヒスチジン）を有する酵母ナ
イトログエン１ベース（Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ
　Ｂａ５ｅ）（ＹＮＢ、　ミシガン州、デトロイト、デ
イ７コ（Ｄｉｒｃｏ、　ＤｅＬｒｏｉＬ、　Ｍｉｃｈｉ
ｇａｎ）　）にて増殖させた。ＣＵＰＩプロモーターを
用いるプラスミドとしては、１．００マイクロモルでの
硫酸銅が挙げられる。培養株を、後期対数期において遠
心分離により収穫し、洗浄し、崩壊させた。標準的タン
パク質イムノプロット検定により、細胞溶解物をｓＣＤ
−４について解析した。

ｐＹｓＫ１４７およびｐＹ、ＳＫ　１４８を有するニス
・セレビシェにおいて、ｓＣＤ−４タンパク質、５ＫＢ
ＹｓＣＤ−４（アミノ酸−９＝３６’９　）　　を、低
レベル（約Ｑ、５ｎｇ／（ｌ以下）にて発現させた。

活性度は、パーティクル・フラクンヨン（ｐａｒｔｉｃ
ｕｌａｒ−ｅ’　ｆｒａｃｔｉｏｎ）に付随するが、非
イオン性清浄剤で抽出することにより容易に可溶化させ
ることができることが判明した。ｐＹｓＫ１５４を含有
するニス・セレビシェの培養株における５ＫＢＹｓＣＤ
−４（アミノ酸−９−３６９）の量は、約２〜約６ｍｇ
／　Ｑ　（２ｘ　ｌ　Ｏ’細胞／−）の間にあった。こ
れは、ｐＹｓＫ１４７およびｐＹＳＫ１４８で、すなわ
ち、安定しているユビキチン配列の不在下にて発現させ
たＣＤ−４タンパク質の量に比べて約５倍であった。合
成したｓＣＤ４タンパク質の推定サイズは、すべて同一
であり、該タンパク質のユビキチン部がＳＫＢｓＣＤ４
から開裂したことを示す。これは、抗体を酵母ユビキチ
ンに用いるイムノブ日ソ１−操作により確認した。

ｐＹｓＫ１５９およびｐＹｓＫ１６１における切形ｓＣ
Ｄ−４タンパク質（ＹＶＩ）の発現レベルは、ユビキチ
ン融合として発現したｓＣＤ−４タンパク質のレベルと
近似していた。検出したｓＣＤ−４ｆｆｉは、試験した
各宿主系統において近似していた。

ｐＹｓＫ１５４を有する系統Ｆ７６２からのＳＫＢｓＹ
ＣＤ−４を、Ｓ−セファロースカラムを介することによ
り部分的に精製した。１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ６，
０，１％ツイーン−２０において調製した粗製抽出物を
、３００００ｘｇにて遠心分離に付した。上澄液をｐＨ
４，０に調整し、５０ｍＭ酢酸塩緩衝液で平衡にしたＳ
−セファロースカラム中に適合させた。試料を、０．５
ＭＮａＣＱを含をする５０ｍＭ　ＭＥＳ　（２（Ｎ−モ
ルホリノ）−エタンスルホン酸、ｌ）Ｈ６，０）　ｔＭ
衝液でバッチ溶出した。該溶出液中に存在している５Ｋ
ＢＹｓＣＤ−４を、イムノプロット検定により確認した
。該物質を、ＣＨＯ細胞からの精製ＳＫＢ　ｓ　ＣＤ−
４と０ＫＴ４Ａ抗体を用い、酵母誘導のＳＫＢｓＹＣＤ
−４の構造が、哺乳動物細胞（ＣＨＯ）誘導の物質の構
造に似ていることを示唆する競合ＥＬＩＳＡに基づく検
定により測定した場合、該物質は活性であった。

実施例５ ストレプトミセスベクターの構成 組換え体ＤＮＡ操作を用い、ヒトＣＤ−４ｃＤＮＡ配列
のセグメントを、ニス・ロンギスポラス・トリプシン・
インヒビター（ＬＴ　Ｉ）遺伝子およびニス・リビダン
スのβ−ガラクトシダーゼ（βｇａｌ）遺伝子のングナ
ル配列に融合した。ｓＣＤ−４ミニ遺伝子をストレプト
ミセス・プラスミドｐ［Ｊ７０２　（カッツェら、前掲
）およびｐｌＪ３５１　（キーサーら（Ｋ　１ｅｓｅｒ
、　ｅ［ａｌ、）　、前掲）に連結し、プラスミドｐＬ
ＴＩ　：　ｓＴ４／ｌ、ｐＬＴｌ：ｓＴ４／７、ｐＬＴ
Ｉ：ＶＩＶ２およびｐＢｇａｌ：ｓＴ４／７を形成させ
た。該ベクターの構成は以下のとおりであった。

ｐＬＴＩ　：　ｓＴ４／ｌの構成ニブラスミドｐＬＴ１
：ｓＴ４／ｌを、３種の他のプラスミド、ｐＵＣｓＴ４
、ｐｌＪ３５１およびｐＬＴＩ４５０から構成させた。

プラスミドｐＬＴＩ４５０の構成は以下のとおりである
。

ｐＬＴｆ４５０の構成：ＬＴＩ遺伝子を有する０、９２
ｋｂ　５ａｃｌ−Ｋｐｎｌフラグメントを、Ｓａｃ■お
よびＫｐｎＩで消化したｐＵｃ１８に挿入した。

このプラスミド、ｐＬＴＩ５２０を、Ｅａｇｌで部分的
に消化し、５ａｌＩで全面的に消化し、ついでＥａｇＩ
および５ａｉｌ末端を有する合成リンカ−（２Ｘ漂準）
に結合した： この結合により得られたプラスミドを、合成リンカ−を
５ａｃｌ部位から約０．５ｋｂに位置するＥａｇＩ部位
に挿入するのにスクリーンした。このＥａｇＩ部位は、
ＬＴＩ遺伝子の５″末端に関して塩基対８６に位置する
。得られたプラスミドは、シグナルペプチドＬＴＩプロ
モーターおよびコーディング配列ならびにシグナルペプ
チド開裂部位を有している。Ｅａｇｌおよび５ａｌＩの
両方の部位を用い、ｓＣＤ−４ミニ遺伝子をＬＴＩシグ
ナル配列に融合することができる。

ｐＬＴ　Ｉ　：　ｓＴ４／ｌの構成ニブラスミドｐＬＴ
［＋ｓＴ４／１を形成するため、ｓＣＤ−４コディング
配列を、ｐＵＣｓＴ４からの約１　、１　ｋｂＢｂｖＩ
−ＰｓｔＩ７ラグメントにて単離した。このフラグメン
トは、ヒトＣＤ−４ｃＤＮＡ配列の塩基対１４９〜１２
５７を有する。プラスミドｐＵＣｓＴ４を、ＢｂｖＩで
消化し、ついで逆転写酵素で処理し、５″突出末端にフ
ィル・インした。ついで、ＤＮＡをＰｓＬｌで消化した
。ＳＫＢｓＣＤ−４をコード化するこの１．１ｋｂＢｂ
ｖＩ　（ＲＴ）−ＰｓｔＩフラグメントを、５ａｌＩお
よび逆転写酵素で処理し、つづいｊＰｓｔＩ消化を行っ
たｐＬＴＩ４５０に結んだ。この結合は、プラスミドｐ
ＬＴ＋４５０ｓＴ４／ｌをもたらした。ｐＬＴＩ：ｓＴ
４／ｌ構成における最終段階は、ｐＬＴＩ４５０ｓＴ４
／ｌに対するストレプトミセス複製機能の挿入を要した
。このことは、ｐｌＪ３５１（キーサーら、前掲）をＰ
ｓｔｌで消化し、それをｐＬＴＩ４５０ｓＴ４／ｌ消化
のＰｓｔｌに結合することにより達成した。

ｐＬＴＩ　：　ｓＴ４／７の構成ニブラスミドｐＬＴ１
：ｓＴ４／’７を、３種の他のプラスミド、ｐｕＣｓＴ
４、ｐｌＪ７０２およびｐＬＴＩ４５０から構成した。

プラスミドｐＬＴ　Ｉ　：　ｓＴ４／７を形成するため
、ｓＣＤＪコ一デイング配列を、ｐＵＣｓＴ４からの約
１．１ｋｂＮｃｏｌ−ＰｓＬＩフラグメントにて単離し
た。この７ラグメントは、ヒトＣＤ−４ｃＤＮＡ配列の
塩基対１２４−１２５７を有する。これらの塩基対を、
前記実施例１に記載したようにＡＴＧ開始コドンとＴＡ
Ａ終止コドンの間に配列した。開始コドンは、ＮｃｏＩ
認識配列部を組み立てる。このフラグメントを含むｓＣ
Ｄ−４コ一デイング配列は、ＣＤ＝４のリーダー配列か
らの９アミノ酸を有する。ｐＵｃｓＴ４をＮｃｏｆおよ
び逆転写酵素で処理し、つづいてＰｓｔｌで消化した。

ついで、このフラグメントを、ＨｉｎｃＵおよびＰｓｔ
Ｉで処理したｐｔ、Ｔｚｓｏで結合した。この結合が、
プラスミドｐＬＴＩ４５０ｓＴ４／７を付与する。スト
レプトミセス・レプリコンは、プラスミドｐｌＪ７０２
（カツツェら、前掲）により付与された。それを、両方
のプラスミド上のユニークＰｓｔＩ部位を介してｐＬＴ
Ｉ４５０ｓＴ４／７に挿入し、プラスミドｐＬＴＩ：ｓ
　Ｔ　４　／　７を形成させた。

グラスミドｐＬＴＩ：ＶＩＶ２の構成ニブラスミドｐＬ
ＴＩ：ＶＩＶ２を、プラスミドｐｓＴ４゜１８４、ｐＬ
ＴＩ４５０およびｐｌＪ３５１から構成した。　０．５
４ｋｂ　ＸｂａＩ　−ＥｃｏＲＩ　７ラグメントを、ｐ
ｓＴ４．１８４から単離した。この７ラグメントをＢｂ
ｖＩおよび逆転写酵素で地理した。ＢｂｖＩ末端は、ヒ
トＣＤ−４ｃＤＮＡ配列の塩基対１４９に対応する。つ
いで、このプラント−末端フラグメントを５ａｌＩおよ
び逆転写酵素で処理したｐＬＴＩ４５０に結び、プラス
ミドｐＬＴＩ４５０ＶＩＶ２を形成させた。ストレプト
ミセス複製機能は、ｐＩＪ３５１により付与された。こ
のプラスミドを、ｐｌＪ３５１およびｐＬＴ１４５０Ｖ
ＩＶ２上のユニークＰｓＬＩ部位を介してｒｔＬＴｒ４
５０ＶＩＶ２にクローンした。得られたプラスミドはｐ
ＬＴＩ：■ｌｖ２であった。

ｐ７？ｇａｌｓＴ　４　／　７の構成ニゲラスミドｐβ
ｇａｌｓＴ４／７を、プラスミドｐＵＣｓＴ４、ｐｌＪ
７０２およびｐ３ＳＳＸＭＣＰから構成した。ｐ３ＳＳ
ＸＭＣＰは、β−ガラクトシダーゼプロモーターおよび
シグナル配列を含有するｐＵＣ９（ヴイエイラおよびメ
ソシング（Ｖ　１ｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ）、ジ
ン、１９　；　２５９　（１９８２））誘導体である。

シグナルペプチド開裂部位に対するコーディング配列の
下流にある２６塩基対は、ＸｍｎＩ部位である（ニック
ハードら（Ｅｃｋｈａｒｄｔ、　ｅｔ　ａｌ、）　、ジ
ャナル・オフ・バタテリオロジー（Ｊ　、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、）、１６９：４２４９　（１９８７））、Ｂａ
ｍＨＩ認識配列を有する合成リンカ−（マサチューセッ
ツ州、ビバリー、ニュー・イングランド・バイオラブズ
）（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅ
ｖｅｒｌｙ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）をこの部位に挿入し、プ
ラスミドｐ３ｓｓＸｌｏを生成した。このベクターをＢ
ａｍＨＩおよび逆転写酵素で処理し、つづいてＸｈ。

Ｉで消化した。このベクターに、逆転写酵素で処理した
ＮｃｏＩ末端を有する７ラグメントを結合し、プラント
末端および５ａｌＩ部位を形成させた。フィル・インＢ
ａｍＨＩ部位とフィル・インＮｃｏＩ部位との結合は、
ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩ部位の両方を再形成した。得
られたプラスミドはｐ３ＳＳＸＭＣＰであった。ｐＵＣ
ｓＴ４を、Ｘｂａｌおよび逆転写酵素で処理し、つづい
てＮｃｏＩで消化した。ついで、この１．１ｋｂ　Ｎｃ
ｏＩ　−ＸｂａＩ　（ＲＴ）７ラグメントを、５ａｃＩ
およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼＩで処理し、つづいてＮ
ｃｏＩで消化したｐ３ＳＳＸＭＣＰに挿入した。ストレ
プトミセス複製機能は、両方のプラスミド上のユニーク
ＢｇｌＩＩ部位を介してｐ３ＳＳＸｓＴ４に挿入された
ｐｌＪ７０２により付与された。

実施例６ ストレプトミセスにおけるｓＣＤ−４ミニ遺伝子の発現 プラスミドｐＬＴ　Ｉ　：　ｓＴ４／Ｌ　ｐＬＴ　ｒ　
：　ｓＴ４／７、ｐＬＴＩ：ＶＩＶ２およびｐβｇａｌ
：ｓＴ４／７を、ニス・リビダンス１３２６　（ビンら
（Ｂ　ｉｂｂ、　ｅｔ　ａｌ、）　、前掲）に形質転換
した。加えて、ｐＬＴＩ　二ｓＴ４／１ＸｐＬＴＩ　：
　ｓＴ４／７、ｐＬＴｒ：ＶＩＶ２を、ニス・コエリカ
ラーＭ１２４　（ホップウッドら（Ｈｏｐｗｏｏｄ、　
ｅｔ　ａｔ、）、ゲネティノク・マニプレーンヨン・オ
フ・ストレプトミセス−Ａラボラトリ−・マニュアル（
ＧｅｎｅｔｉｃＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓ　
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　−Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　Ｍａｎｕａｌ）　、エフークロウニ＆サンズ（Ｆ　
、　Ｃｒｏｗｅ＆　Ｓ　ｏｎｓ）　、　Ｌ　ｔｄ、、ノ
ルヴイッチ（Ｎｏｒｗｉｃｈ）　、イングランド（Ｅ　
ｎｇｌａｎｄ）　　（１９８５））、ニス・アルプスＪ
１０７４（チャタ−およびワイルド（Ｃｈａｔｅｒおよ
びＷｉｌｄｅ）　、ジャーナル・オフ・ジェネラル・マ
イクロバイオロジー（Ｊ　、　Ｇ　ｅｎ、Ｍ　１ｃｒｏ
ｂｉｏ１．）、１１６：３２３（１９８０））およびニ
ス・ロンギスポラスの白色誘導体（ＡＴＣＣ受は入れ番
号２３９３＋）に導入した。すべてのプラスミドを、以
前にトンプソンら、ジャーナル・オフ・バクテリオロジ
ー、１５＋＋　６６８　（１９８２）に記載されている
方法を用いて種々の宿主に導入した。被形質転換体を、
形質転換プレートを１００μｇ／−チオストレプトンを
含有する０、４％寒天３ｍ１２で上塗りすることにより
選択された。

ＣＤ−４ミニ遺伝子を発現するクローンは、チオストレ
プトン−耐性被形質転換体を、５μｇ／−チオストレプ
トンを加えたトリブチカーゼ・ソイ・ブロス（Ｌｒｙｐ
ｔｉｃａｓｅ　ｓｏｙ　ｂｒｏｔｈ）　ｌ　０−中にて
４８〜７２時間増殖させることにより同定した。

培養上澄液と細胞溶解物を、１２％ポリアクリルアミド
（３０：０．８　　アクリルアミド：ビス）１％ドデン
ル硫酸ナトリウムゲル上で分離し、ついでニトロセルロ
ースに移した（トウビンら（Ｔｏｗｂｉｎ、　ｅｔ　ａ
ｌ、）　、プロシーディング・オフ・ナショナル・アカ
デミ−・オフ・ソサイテー、ニー・ニス・エイ、７６：
４３５０　（１９７９））。該ニトロセルロース濾過は
、ディーンら、前掲に示したようにラビットｓＣＤ−４
−抗血清を用いてプローブした。

ｐＬＴ［：　ｓＴ４／ｉ　ｐＬＴＩ　：　ｓＴ４／７、
およびｐβｇａｌ：ｓＴ４ニス・リビダンス被形質転換
体はすべて、これらのプラスミドによりコード化された
予想サイズのｓＣＤ−４タンパク質である約４５ｋＤの
タンパク質を発現した。同様に、ｐＬＴｒ：ＶＩＶ２ニ
ス・リビダンス被形質転換体は、予想サイズのＶＩＶ２
タンパク質である約２０ｋＤのタンパク質を発現した。

ＳＫＢｓＣＤ−４８よびＶ　ｌ’Ｖ　２　Ｊ　４発現を
また、ニス・コエリカラー、ニス・アルプスおよびニス
会ロンギスポラスにおいて試験した。ニス・リビダンス
と同様に、４５ｋＤ　（ｐＬＴ　Ｉ　：　ｓＴ４／ｌお
よびｐＬＴＩ：ｓ　Ｔ　４　／　７被形質転換体）およ
び２０ｋＤ（ｐＬＴＩ・ＶＩＶ２被形質転換体）のタン
パク質が、他のストレプトミセフ種により発現した。

ニス・リビダンスの培養上澄液および細胞溶解物におい
て存在するＳＫＢｓＣＤ−４量は、１〜５ｍｇ／Ｑのレ
ベルで存在した。ＶＩＶ２Ｊ４では、培養上澄液および
細胞溶解物の両方において２〜１０　ｍｇ／　Ｑで存在
した。ｐβｇａｌ：ｓＴ４　　ニス・リビダンス被形質
転換体では、１ｍｇ／Ｉｚ以下で発現しｊこ。

ｐＬＴ　Ｉ　：　ｓＴ４／７エス・リビダンス細胞系統
ヲ用イ、ＳＫＢｓＣＤ−４発現をまた、１２ｆ２発酵体
にて試験した。小スケールの発現実験と同様に、細胞は
、５μｇ　／　ｍ１２チオストレプトンを加えたトリブ
チカーゼ・ソイ・プロスにおいて増殖した。

培養上澄液と細胞溶解物の両方を、接種の７．５．２４
．３１．５．５４および７２時間後にて、ＳＫＢｓＣＤ
−４発現について解析した。最大容量測定発現レベルは
６０　ｍｇ／　Ｑであり、接種の２４時間後に生じた。

ＳＫＢｓＣＤ−４は、培養上澄液と完全細胞の間に等し
く分配された。

競合ＥＬＩＳＡは、ＶＩＶ２Ｊ４およびＳＫＢｓＣＤ−
４を有する部分的に精製された上澄液が０ＫＴ４Ａと結
合することを示し、これらストレプトミセス誘導のタン
パク質がＨ［Ｖ結合タンパク質であることを示す。

ＨＩＶ結合タンパク質、ＶＩＪ４も同様に、ＬＴＩプロ
モーターに結合し、ウェスタン検定により、ニス・リビ
ダンスにおいて発現することが示されている。

上記実施例は、ＣＤ−４から誘導されたＨＩＶ結合タン
パク質、例えば、本発明の組換え有機体により発現また
は分泌されたＳＫＢｓＣＤ−４，５ＫＢＹｓＣＤ−４、
ＶＩＪ４、ＶＩＶ２Ｊ４およびＹＶＩが、ｓＣＤ−４の
ＨＩＶ結合機能を有するＨＩＶ結合タンパク質であるこ
とを示している。さらに詳しくは、それらは、ＳＫＢｓ
ＣＤ４のＶ１部位のＨＩＶ結合ドメインを有している。

特許出願人　スミスクライン・ベックマン・コーポレイ
ション

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）調節因子に機能的にリンクしたＨＩＶ結合タンパ
   ク質コーディング配列からなるイー・コリ発現ベクター
   。 （２）ＨＩＶ結合タンパク質がｓＣＤ−４タンパク質ま
   たはｓＣＤ−４タンパク質のＨＩＶ結合機能を有するそ
   の誘導体である請求項（１）記載のベクター。 （３）ＨＩＶ結合タンパク質がＳＫＢｓＣＤ−４または
   ＳＫＢｓＣＤ−４のＨＩＶ結合機能を有するその誘導体
   である請求項（１）記載のベクター。 （４）ＨＩＶ結合タンパク質がＳＫＢｓＣＤ−４、ＶＩ
   Ｊ４およびＶＩＶ２Ｊ４からなる群より選択される請求
   項（３）記載のベクター。 （５）調節因子がプロモーターおよびリーダー配列から
   なる請求項（１）、（２）、（３）または（４）記載の
   いずれか１つのベクター。 （６）リーダー配列がＯＭＰＡリーダー配列である請求
   項（５）記載のベクター。 （７）請求項（１）〜（６）記載のいずれか１つのベク
   ターで形質転換されたイー・コリ。 （８）調節因子に機能的にリンクしたＨＩＶ結合タンパ
   ク質コーディング配列からなるベクターで形質転換され
   たイー・コリ細胞を培養し、そこからＨＩＶ結合タンパ
   ク質を収集することを特徴とするＨＩＶ結合タンパク質
   の産生方法。 （９）調節因子に機能的にリンクしたＨＩＶ結合タンパ
   ク質コーディング配列からなるストレプトミセス発現ベ
   クター。 （１０）ＨＩＶ結合タンパク質がｓＣＤ−４タンパク質
   またはｓＣＤ−４タンパク質のＨＩＶ結合機能を有する
   その誘導体である請求項（９）記載のベクター。 （１１）ＨＩＶ結合タンパク質がＳＫＢｓＣＤ−４また
   はＳＫＢｓＣＤ−４のＨＩＶ結合機能を有するその誘導
   体である請求項（９）記載のベクター。 （１２）ＨＩＶ結合タンパク質がＳＫＢｓＣＤ−４、Ｖ
   ＩＪ４およびＶＩＶ２Ｊ４からなる群より選択される請
   求項（１１）記載のベクター。 （１３）調節因子がプロモーターおよびリーダー配列か
   らなる請求項（９）、（１０）、（１１）または（１２
   ）記載のいずれか１つのベクター。 （１４）調節因子がロンギスポラス・トリプシン・イン
   ヒビターのプロモーターおよびリーダー配列またはスト
   レプトミセスβ−ガラクトシダーゼのプロモーターおよ
   びリーダー配列である請求項（１３）記載のベクター。 （１５）請求項（９）〜（１２）記載のいずれか１つの
   ベクターで形質転換されたストレプトミセス。 （１６）請求項（１３）記載のベクターで形質転換され
   たストレプトミセス。 （１７）請求項（１４）記載のベクターで形質転換され
   たストレプトミセス。 （１８）ストレプトミセス・リビダンスである請求項（
   １４）記載のストレプトミセス。（１９）ストレプトミ
   セス・コエリカラー、ストレプトミセス・ロンギスポラ
   ス、ストレプトミセス・リビダンスまたはストレプトミ
   セス・アルブスである請求項（１３）記載のストレプト
   ミセス。 （２０）調節因子に機能的にリンクしたＨＩＶ結合タン
   パク質コーディング配列からなるベクターで形質転換さ
   れたストレプトミセス細胞を培養し、そこからＨＩＶ結
   合タンパク質を収集することを特徴とするＨＩＶ結合タ
   ンパク質の産生方法。 （２１）調節因子に機能的にリンクしたＨＩＶ結合タン
   パク質コーディング配列からなる酵母発現ベクター。 （２２）サッカロミセス・セレビシエベクターであり、
   ＨＩＶ結合タンパク質がｓＣＤ−４タンパク質またはｓ
   ＣＤ−４タンパク質のＨＩＶ結合機能を有するその誘導
   体である請求項（２１）記載のベクター。 （２３）サッカロミセス・セレビシエベクターであり、
   ＨＩＶ結合タンパク質がＳＫＢｓＣＤ−４またはＳＫＢ
   ｓＣＤ−４のＨＩＶ結合機能を有するその誘導体である
   請求項（２１）記載のベクター。 （２４）ＨＩＶ結合タンパク質がＳＫＢｓＹＣＤ−４お
   よびＹＶＩからなる群より選択される請求項（２３）記
   載のベクター。 （２５）調節因子がプロモーターおよびリーダー配列か
   らなる請求項（２１）、（２２）、（２３）または（２
   ４）記載のいずれか１つのベクター。 （２６）ＨＩＶ結合タンパク質コーディング配列が、そ
   の５’末端にて、ＨＩＶ結合タンパク質の発現を安定化
   させるコーディング配列の３’末端に融合する請求項（
   ２１）、（２２）、（２３）または（２４）記載のいず
   れか１つのベクター。 （２７）発現を安定化させるコーディング配列が酵母・
   ユビキチン用のコーディング配列である請求項（２６）
   記載のベクター。 （２８）調節因子がＣＵＰ１プロモーターまたはＴＤＨ
   ３プロモーターである請求項（２７）記載のベクター。 （２９）請求項（２１）〜（２４）記載のいずれか１つ
   のベクターで形質転換された酵母。 （３０）請求項（２６）記載のベクターで形質転換され
   た酵母。 （３１）請求項（２７）記載のベクターで形質転換され
   たサッカロミセス・セレビシエ。（３２）請求項（２８
   ）記載のベクターで形質転換されたサッカロミセス・セ
   レビシエ。（３３）調節因子に機能的にリンクしたＨＩ
   Ｖ結合タンパク質コーディング配列からなるベクターで
   形質転換された酵母細胞を培養し、そこからＨＩＶ結合
   タンパク質を収集することを特徴とするＨＩＶ結合タン
   パク質の産生方法。 （３４）ｓＣＤ−４タンパク質またはｓＣＤ−４タンパ
   ク質のＨＩＶ結合機能を有するその誘導体であり、組換
   え体イー・コリにおいて産生されるＨＩＶ結合タンパク
   質。 （３５）ｓＣＤ−４タンパク質またはｓＣＤ−４タンパ
   ク質のＨＩＶ結合機能を有するその誘導体であり、組換
   え体酵母細胞において産生されるＨＩＶ結合タンパク質
   。 （３６）ｓＣＤ−４タンパク質またはｓＣＤ−４タンパ
   ク質のＨＩＶ結合機能を有するその誘導体であり、組換
   え体ストレプトミセスにおいて産生されるＨＩＶ結合タ
   ンパク質。（３７）調節因子に機能的にリンクしたＤＮ
   Ａコーディング配列からなり、該ＤＮＡコーディング配
   列が、ＸがＯＭＰＡリーダー配列およびＹが異種構造の
   タンパク質であるタンパク質Ｘ−Ｙに対してコード化す
   ることを特徴とするイー・コリにおける輸送タンパク質
   を発現するイー・コリ発現ベクター。