NO813759L - Plasmid, fremgangsmaate for fremstilling av et slikt produkt, samt anvendelse derav - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører plasmid-vektorer og fremstillingen og bruken av disse, nærmere bestemt vedrører den trp attenuator (trp a) - minus ekspresjons-plasmider formet for å motta og uttrykke DNA-fragmenter.

Generelt sett er det en ulempe ved kjente vektorer at de. besørger ekspresjon i en mindre grad enn det som er ønsket. Dette generelle problem er i det minste delvis løst ved foreliggende"oppfinnelse.

De fem genene som koder for enzymet i biosyntese-sporet

for tryptofan hos E. coli, utgjør tryptofan-operonet og kontrolleres negativt av det ubundne regulatorgen trp R. Genet trp/R<+>koder for et protein, trp aporepressoren, (se f.eks-. Zubay, G. , et al., (1972), Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 6_9, 1100-1103). Når dette protein har inngått i kompleks med L-tryptofan,

bindes det til trp operatorsekvensen i promotor-regionen hos trp operonet og undertrykker transkripsjons-initieringen ved fysisk å utelukke RNA-polymerasen fra området i promotoren hvor sammenknytning og initiering- av transkripsjon oppstår.

Når trp aporepressoren ikke aktiveres av tryptofan, kan den ikke bindes til operatoren. Tryptofan-produksjon justeres følgelig etter kravene til cellen.

Transkripsjonen av de strukturelle genene kontrolleres

både ved regulering ved hjelp av gjensidig påvirkning mellom repressor/operator og fra et område i operonet kalt for "attenuatoren", som ligger foran det første' strukturelle gen i biosyntese-sporet. RNA polymerasemolekyler som har initiert transkripsjon ved promotoren, kan enten avslutte transkripsjonen ved attenuatoren, i 160 bp styringsområdet i operonet, eller fortsette transkripsjonen over i de strukturelle genene. Avslutning av transkripsjon ved trp a reguleres og varierer som følge av forandringer i nivåene av ladet v uladet tRNA trp.

Den kritiske faktor som påvirker attenuasjon er oversettelse av styringsområdet i trp. Trp operonet produserer et styrings-polypeptid med 14 aminosyrer som inneholder sekvensen trp - trp - arg ved posisjonene 10, 11 og 12. Nærværet av aminosyren som er sluttproduktet i operonet som reguleres, i dette styrings-peptid, samt kunnskapen om at transkripsjonsavslutning varierer med endringer i nivåene av ladet eller uladet tRNA som er spesifikk for tryptofan, antyder en rolle for styringspeptidet i reguleringen av avslutningen. Denne rollen tillater cellen å kartlegge tilgjengeligheten av tryptofan, følgelig ville syntese av hele styringspeptidet reflektere en rikelig tilførsel av tryptofan og de fleste transkripsjoner ville derfor bli avsluttet ved attenuatoren, på den annen side kunne ikke syntese av styringspeptidet bli fullført dersom det var mangel på tryptofan og transkripsjon ville ikke bli avsluttet ved attenuatoren, men ville fortsette over i de strukturelle genene og føre til syntese av tryptofan.

Nærmere bestemt, under forhold med høyt nivå av cellulært tryptofan, fortsetter omtrent 85% av RNA polymerasemolekylene som initierer transkripsjon.ved trp promotoren, bare så langt som til et AT-rikt område som befinner seg 134-152 nukleotider inn i 162 bp trp styringsområdet, (se f.eks. Bertrand, K., et al,

(1976), J.- Mol.Biol., 103, 319-337). Disse transskripsjonene avsluttes ved en av fem posisjoner innen et område på 8 adenin-nukleotider og gir RNA med nukleotid-lengde 137-141 (se f.eks. Bertrand, K.., et al, (1977), J. Mol. Biol., 117, 227-247). Molart uttrykt utgjør dette et 8 - 10 ganger overskudd av styrings-RNA i forhold til strukturelt gen-RNA, (se Bertrand, et al,

(1976), loe eit). Ved å sultefore celler på tryptofan fjernes transkripsjonsavslutningen ved attenuatorstedet ( se f.eks. Bertrand, K., og Yanofsky, C., (1976), J. Mol. Biol., 103, 339-349) og RNA polymerase fortsetter over i de strukturelle genene. Selv om tryptofan tilsynelatende synes å være effektoren i attenuasjons-responseri, er det faktisk nivået av ladet versus uladet tRNA<TrP>som kartlegges av cellen (se f.eks. Morse, P.E., og Morse, A.N., (1976), J. Mol. Biol., 103, 209-226). Som nevnt ovenfor, er et karakteristisk trekk ved amino-syreattenuator-områder nærværet innen området av en sekvens som koder for et lite peptid som i serier omfatter minst to aminosyrer som er sluttproduktet til operonet. I trp-lederen er en sekvens som koder for et 14 aminosyrers peptid omfattende doble tryptofan kodoner i den tiende og ellevte aminosyreposisjon, beliggende 27 bp fra startpunktet for transkripsjonen. Sekvensen kommer dessuten etter et SD-sted som er vel så effektivt til å binde ribosomer som SD-stedet i trpE (se f.eks. Platt, T., et al, (1976), J. Mol. Biol., 103, 411-420), som skulle antyde dens mulige oversettelse in vivo. Det er blitt foreslått (se f.eks. Zurawski, G., et al, (1978), Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 75, 5988-5992) at nærværet av doble tryptofan-kodoner innen attenuatoren eller styringspeptidet utgjør et middel ved hvilket nivået av cellulært tryptofan kan kartlegges. Oversettelse av denne sekvens i sin helhet ville følgelig indikere én overflod av ladet tRNA<Trp>og resultere i transkripsjonsavslutning ved attenuatoren. Alternativt vil mangel på tryptofan bare tillate oversettelse frem til de doble kodoner, idet denne hendelsen ville resultere, i at transkripsjonen fortsatte over i de strukturelle genene. Selv om oversettelse av hele peptidet så absolutt er en forutsetning for avslutning, er det nøyaktige signalet for at styrings.-RNA skal frigjøres fra RNA polymerase DNA templett-komplekset, dannelsen innen styrings-RNA av en forutbestemt stamme og sløyfe-struktur foran avslutningspunktet. Selv-om tilstedeværelsen av styringspeptidet ikke er påvist in vivo, er det.fremskaffet indirekte bevis for at det virkelig syntetiseres (se f.eks. Miozzari, G.F., og Yanofsky, C., (1978), J. Bacteriol., 133, 1457-1466; og Sommer, H., et al, (1978), J. Mol. Biol., 123, 457-469). Det ble påvist hybrid protein sammensmeltninger syntetisert som et resultat av sammensmeltning mellom en del av den kodende sekvens i styringspeptidet i fase med andre bakteriegener, idet sammensmeltningene inneholder styringspeptid-sekvensen som N-ende-delen. Fire områder innen trp styrings-RNA har mulighet til å danne tre stabile stamme og sløyfestrukturer (se f.eks. Oxender, D.J., et al, (1979), Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 76, 5524-5528). Disse områdene er: område 1 fra nukleotideposisjon 52 til 68 (som omfatter de doble tryptofan-kodonene') , område 2 fra posisjon 74 til 94, område 3 fra posisjon 108 til'121 og område 4 fra posisjon 126 til 134. De.mulige stamme og sløyfestrukturene dannes ved base-paring mellom nukleotider innen områdene 1 og 2 (stamme og sløyfe.1:2), 2 og 3 ( stamme og sløyfe 2:3) og 3 og 4 (stamme og sløyfe 3:4); dannelsen av 3:4 stamme og sløyfe-strukturen signaliserer avslutning. Basert på disse stamme og sløyfe-strukturene er det blitt foreslått en modell for transkripsjonsavslutning ved attenuatoren (se Oxender, et al, loe eit). Under forhold med tryptofan-overskudd, dekker ribosomet som oversetter attenuator-peptid-sekvensen områdene 1 og 2 i den nylig transkriberte RNA, og gir derved områdene 3 og 4 anledning til å base-pares, noe som resulterer i avslutning. Når tryptofan er den begrensende faktor, slår ribosomet seg ned ved de to tryptofan-kodonene i område 1, men dekker ikke til område 2 som base-pares med område 3 ved dens transkripsjon, idet dannelsen av 2:3 sløyfen utelukker 3:4 sløyfen. Transkripsjon ved hjelp av RNA polymerase fortsetter derfor over i de strukturelle genene. Dersom imidlertid attenuator-peptid-sekvensen ikke blir oversatt (f.eks. ved in vitro transkripsjonsreaksjoner som bruker DNA- ■ fragmenter), basepares områdene 1 og 2 ved den øyeblikkelige transkripsjon av disse og utelukker derved dannelsen av 2:3 sløyfen, noe som igjen gir anledning til dannelsen av 3:4 sløyfen som avslutter transkripsjonen. Denne sistnevnte situasjon forklarer derfor den heller høye avslutningsgrad som er observert'in vitro hvor 95% av de initierende RNA polymerasemolekylene avslutter ved attenuatoren (se f.eks. Lee, F., og Yanofsky, C., (1977), Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 74, 4365-4369). En følge av attenuasjon er at fullstendig derepresjon aldri oppnås naturlig ettersom det selv under forhold med mangel på tryptofan må syntetiseres tilstrekkelig med aminosyre til å gi fullføring av attenuator-peptidet i enkelte tilfeller. Fullstendig induksjon kan imidlertid oppnås ved å bruke 3-fJ-indol-akrylsyre (IAA). IAA har tre effekter på celler: (i) Den konkurrerer med tryptofan om repressor proteinet til hvilket den bindes med stor affinitet (se f.eks. Rose, J.K., et al, (1973), Nature New Biol., 245, 133-137). Videre blir cellene effektivt omgjort til trp R" ettersom IAA/repressor-komplekset ikke kan bindes til operatoren. (ii) Den inhiberer ladingen av tryptofan ved hjelp av tryptofanyl - tRNA syntetase og unngår derved attenuasjon (se f.eks. Doolittle, W.F., og Yanofsky, C, (1968), J. Bact. 95, 1283-1294) .

(iii) Den inhiberer tryptofan-dannelse og sulter cellene

på denne aminosyre (se Doolittle og Yanofsky, loe eit).

Mens en kombinasjon av (i) og (ii) fører til fullstendig derepresjon av transkripsjon, en forutsetning for fullgod- gen-ekspresjon,.resulterer det faktum at cellen samtidig er sulte-foret på tryptofan i at disse virkningene ikke blir oppnådd, særlig dersom det aktuelle genproduktet er rikt på tryptofan.

Dersom imidlertid attenuator-området er blitt fjernet, vil kontrollen av transkripsjonen utelukkende være på repressor-

nivå og kunne opprettholdes ved nærværet eller fraværet av tryptofan.

Alternativt kunne plasmidet dyrkes i trp R celler hvor ekspresjon ville være vesentlig.

En rekke E. coli W3110 derivater er blitt konstruert (se Bertrand, et al, (1976), loe eit) , fra hvilke trp-attenuatoren var blitt fjernet, to av disse (trpALE1417 og trpALE1413) ble fjernet fra et punkt innen attenuatorpeptidsekvensen (22 til 25 bp fra N-enden) for å adskille punkter innen trp E, det ble fjernet henholdsvis omtrent.720 og 1200 bp DNA. " Disse derivatene oppviste begge forhøyede nivåer av nedstrøms trp operonenzymer og korresponderende mRNA. På en trp R bakgrunn ble det funnet en økning -i trp B protein og distalt mRNA på 8 - 10 ganger sammenlignet med nivåene i ellers isogene attenuator<+->stammer

(se Bertrand, et al, (1976), loe eit; og Miozzari og Yanofsky,

loe eit). En lignende type mutant-stamme hvor trp attenuatoren ble fjernet ved å sammenkoble lac I repressor-genet med attenuator-peptid-sekvensen (21 bp fra N-enden) produserte 1% av dét løselige proteinet som en hybrid lac repressor i en trp R - stamme (se Sommer, et al, loe eit). Ved kartlegging av DNA-sekvensen i dette området ble det avslørt at en i-fase sammensmeltning var blitt laget som inkorporerte attenuatorpeptidsekvensen, 28 bp av lac I styreren og lac I genet.

Disse to eksempler på attenuatorfjerning illustrerer en

viss fordel ved å fjerne dette området når en 'økning i nedstrøms ekspresjon er ønsket. Basert på nivået av ekspresjon oppnådd ved en enkelt lac I gen sammensmeltning, skulle en økning i gen-antall til 60 teoretisk gi 60% av det løselige protein som repressor. I praksis vil denne verdien befinne seg mer i området rundt 30%. En betraktelig fordel kan imidlertid bli oppnådd ved å uttrykke eukaryotiske gener i attenuator minus plasmider, ettersom den resulterende økning' i mRNA til en viss grad ville kompensere mangler ved oversettelsen.

De to trp DNA områdene hvor deler av kromosomet mangler, trpALE1417 og trpALEl413 ble overført til en Atrp transduserende fag og ColEI-type kloningsbefordrer, pVH51, (se Miozzari og Yanofsky, loe eit). Disse ble så brukt til å undersøke trp operon ekspresjon i trp R og trp R opprinnelser, begge in vitro og in vivo. E. coli-celler som hver for seg var infisert med de to attenuator minus fagene, AtrpEDl0A.LE1413 og XtrpED10ALE1417 produserte nye trp proteiner på henholdsvis 19Kd og 36Kd, størrelsene på disse proteinene tilsvarer sammenkoblinger mellom attenuator-peptid N-enden og det gjenværende av trp E proteinet, idet nivåene av de to proteiner økte ved derepresjon. De samme to proteinene ble produsert av attenuator minus trp plasmidene i et in vitro transkripsjon-oversettelsessystem. Nedbrytning ved hjelp av trypsin og kymotrypsin utførte på de

to proteinene frigjorte fragmenter som, når de ble sammenlignet med de som var produsert av.trp E protein, bekreftet at de først-nevnte er oversettelsesprodukter som resulterer fra i-fase sammenkoblinger mellom attenuator-peptidsekvensen og trp E genet.

Dannelsen av stabile sammenkoblinger med attenuator-peptidet slik som beskrevet ovenfor (se Miozzari og Yanofsky, loe eit; og Sommer, et al, loe eit) antyder at det 14 aminosyrer store peptidet syntetiseres in vivo. Forsøket på å påvise et protein . med denne størrelsen under trp-kontroll (se Miozzari og Yanofsky, loe eit) var imidlertid mislykket. Ettersom sammenkoblinger med dette peptidet er stabile, utgjør det ikke desto mindre en nyttig kilde for en sammenkoblet N-ende inkorporert i et trp ekspresjons-plasmid hvor attenuatoren er fjernet. Videre med-fører evnen hos attenuator peptid SD-setet til å initiere oversettelse at et gen som er plassert på et egnet sted nedstrøms for det (attenuator-peptidsekvensen er blitt fjernet) sannsynligvis ville bli oversatt, slik som det er blitt demonstrert for lac Z SD setet (se f.eks. Goeddel, D.V. et al, (1979),. Nature, 281, 544-548).

Det vises også til den publiserte EP-patentsøknad

nr. 0036776.

Visse nye plasmid vektorer er nå blitt konstruert og overraskende oppviser de betraktelige fordeler, bl.a. med hensyn til ekspresjon.

Foreliggende oppfinnelse frembringer et plasmid som har et innføringssete for et DNA-fragment, f.eks. et eukaryotisk DNA-fragment, som grenser opp til en bakteriell promotor, særlig en trp-promotor, idet attenuatoren til promotoren er blitt fjernet, og nedstrøms fra et prokaryotisk bindingssete for ribosomer og eventuelt et initiator-kodon slik at et innført DNA-fragment er under bakteriell promotorkontroll.

Et slikt plasmid kan fremstilles ved en fremgangsmåte som omfatter å klone en bakteriell promotor, hvis attenuator er blitt fjernet, inn i et isolert plasmid fastlegge posisjonen for et påtenkt innføringssete som grenser opp til og ligger nedstrøms fra promotoren og tilveiebringer et innføringssete dersom det ikke er til stede.

En sekvens som var av spesiell interesse og som ble studert er illustrert på figur 1.

En undersøkelse av den illustrerte trp DNA-sekvens avslører at et område avgrenset av de to Hha I-seter lokalisert ved +60 og -79 inneholder alle nødvendige forutsetninger for de kontrol-lerende elementer hos et attenuator-minus ekspresjons-plasmid av sammenkoblingstypen. Det 139 bp store fragmentet inneholder:

(i) Setet for gjensidig påvirkning mellom RNA polymerase

og promotoren (-59 til +18). In vitro/transkripsjonsprøver med fragmenter fra trp promotor-området indikerer at den venstre avgrensning for promotoraktivitet, oppstrøms fra Hpa I-setet

(se figur 1), ligger mellom posisjonene -39 og -59 i nukleotid-sekvensen (se f.eks.'Brown K.D., et al, (1978), J. Mol. Biol., 121, 153-177).

(ii) Operatorområdet og repressoren som virker på hverandre. Dette overlapper med promotorområdet og er beliggende

.mellom posisjonene -21 og —2.

(iii) Initiator-kodonet for attenuator peptidet i posisjonene +27 til +29 og kodingssekvensen for ytterligere 10 aminosyrer.

Det ble derfor besluttet å bruke et slikt fragment som grunnlag for konstruksjonen av plasmider av den ovenfornevnte type. Kloningsstrategien omfattet utbedring av Hha I endene med DNA polymerase I tilførsel av Hind III sammenknyttere og inn-føring av fragmentet i Hind III-setet hos pAT 153 (se f.eks. Twigg, A.J., og Sherratt, D., (1980), Nature, 283, 216-218).

En slik fremstillings-fremgangsmåte i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse kan for eksempel omfatte: (a) å kutte opp et plasmid av den såkalte "pWT-serie" (se f.eks. Tacon, W.CA. , et al, (1980), Molec. Gen. Genet., 177, 4 2'7) , slik som pWT 111 eller pWT 221 ved hjelp av Hha I (EC 3.1.23.19), (b) å isolere trp-promotor-inneholdende Hha I fragmentet fra en akrylamidgel, (c) å inkubere det resulterende fragment med DNA polymerase I (EC 2.7.7.7) for å fremstille molekyler med butte ender, (d) å tilsette Hind III sammenknyttere og kutte opp ved å bruke Hind III (EC 3.1.23.21), (e) å separere fragmentet fra de gjenværende s.ammenkoblerne på en gel og isolere fragmentet med 140 bp, og

(f) å klone dette inn på Hind III-setet i pAT 153.

En slik fremgangsmåte frembringer ikke-mobiliserbare (nie ) ekspresjons-plasmider, kalt pWT 501 eller pWT 502, avhengig av trp-promotorens orientering^.

Hha'I-fragmentet kan også brukes som en kilde for DNA ved fremstilling av plasmider som egner seg for ekspresjonen av gen-sekvenser•fra disses N-ender. Til stede i dette fragmentet er et Taq I-sete (+22) lokalisert umiddelbart nedstrøms for .attenuator-peptid SD-setet, som ved omdannelse til et egnet klonings-ekspresjons-sete, f.eks. Hind III, tillater innføring av fremmed DNA som koder for et polypeptid og dets derpå følg-ende ekspresjon som et fullt utviklet eller pre-polypeptid. Dette vil bli omtalt i nærmere detaljer nedenfor.

Plasmidet betegnet pWT 501 har en molekyHengde på 3805 bp, et Pst I-sete, et EcoRI-sete 752 bp fra Pst I-setet, et første Hind III-sete 31 bp fra EcoRI-setet, et' Hpa I-sete 72 bp fra det første Hind III-setet, et annet Hind III-sete 75 bp fra Hpa I-setet, et Bam Hl-sete 346 bp fra det annet Hind III-sete, et Sal I-sete 275 bp fra Bam HI-setet og Pst I-setet 2254 bp fra Sal . I-setet.

Dette utgjør én utførelsesform av foreliggende oppfinnelse.

Plasmidet betegnet pWT 502 har en molekyllengde på 3805 bp, et Pst i-sete, et EcoRI-sete 752 bp fra Pst I-setet, et første Hind III-sete 31 bp fra EcoRI-setet, et Hpa I-sete 75 bp fra det første Hind III-setet, et annet Hind III-sete 72 bp fra Hpa I-setet, ét Bam Hl-sete 346 bp fra det annet Hind III-sete, et Sal I-sete 275 bp fra Bam HI-setet og Pst I-setet 2254 bp fra Sal I-setet.

Dette utgjør en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse.

pWT 501 kan fremstilles ved en fremgangsmåte som omfatter

å kutte opp pWT 221 ved hjelp av Hha I, isolere fragmentet som inneholder trp-promotoren, inkubere dette fragmentet med DNA polymerase I, koble sammen det resulterende fragment med butte ender med Hind III sammenkoblere, kutte opp det sammenkoblede materiale ved hjelp av Hind III, isolere fragmentet som inneholder trp-promotoren, koble sammen dette fragmentet med Hind III-oppkuttet, bakteriell alkalisk fosfatase (EC 3.1.3.1)-behandlet pAT 153, transformere E.-coli K 12 HB101, (genotype gal , lac , ara , pro , leu, strr, rec A , r^, , se f.eks. Boyer, H.W., og Roullard-Dussoix, D., J. Mol. Biol., 41, 459-472), bruke det resulterende plasmid og selektere for ampicillin-resistens og tetracyklin-resistens.

pWT 502 kan fremstilles ved en tilsvarende fremgangsmåte, med unntak av at man selekterer for ampicillin-resistens og tetracyklin-sensitivitet.

<y>tterligere utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse gjennomføres på tilsvarende måte.

Som et belysende eksempel illustrerer det følgende oppbygningen av attenuator minus trp ekspresjons-plasmider, særlig pWT 501 og pWT 502, basert på sammenkobling i attenuator-peptidet.

Som en kilde for trp-promotor-fragmentet Hha I med 139 bp, kan det brukes et hvilket som helst plasmid fra pWT 1X1 eller pWT 2X1 seriene. Plasmidene fra pWT 1X1 serien gir imidlertid også et 141 bp stort fragment av pBR 322 når de kuttes opp med Hha I (se f.eks. Bolivar, F., et al, (1977), Gene, 2, 95-113), hvis opphav, (lokalisert i Hae II B fragmentet) skilles ut sammen med trp-promotor-fragmentet. Av denne grunn ble det besluttet å benytte nie pWT 2X1 serie plasmider (pWT 221) .

pWT 221 (5 yg) ble kuttet opp med Hha I, DNA utsatt for elektroforese på en 5% vekt/volum akrylamidgel og 139 bp båndet oppsamlet og gjenvunnet fra akrylamidet ved en vanlig kjent metode (se f.eks. Hindley, J., og Phear, G.A. (1979), Nucleic Acids Res., 1, 361-375). Nærmere bestemt ble 0,5 ml ekstrak-sjons-buffer.for akrylamid-gel (AGEB), (0,5 M NH40Ac, 10 mM Mg(0Ac)2, 0,1% vekt/volum natrium-dodecylsulfat (SDS), 0,1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA)) tilsatt til den oppmalte gel-skiven i et Eppendorf sentrifugerør, og blandingen

ble rystet forsiktig i 16 timer ved 37 C. Dette tillot DNA å spre seg i bufferen og, avhengig av størrelse, resulterte nor-malt i gjenvinninger på > 50% . (DNA større enn 2 Kb ga dårligere gjenvinning.) Akrylamidet ble deretter fjernet ved sentrifager-ing gjennom en Whatman 52 filterpapir-plugg plassert i bunnen av en 2 ml<1>s sprøyte.

Filtratet ble deretter fortynnet fire ganger med- vann og ført gjennom en 1 ml DE52 kolonne forvasket med 1/5 AGEB hvor-ved DNA ble absorbert. Kolonnen ble videre vasket med 1/5 AGEB og DNA ble deretter eluert med 1,5 ml av 1,1 M NaCl i 1/5 AGEB, idet den siste 1 ml<1>s fraksjon ble samlet opp. Etidiumbromid ble fjernet ved to ekstraksjoner med n-butanol og DNA utfelt ved tilsats av 2,5 volum-deler etanol.

Fragmentet med 139 bp beveger seg til en posisjon umiddelbart under et trimert bånd som inneholder fragmenter med 151,

152 og 153 bp. Det kan derfor antas at en liten prosentdel av disse større fragmentene ville bli ekstrahert sammen med trp-fragmentet.

For å gjøre Hind III sammenkoblere i stand til å feste seg, ble Hha I-endene først fjernet ved hjelp av DNA polymerase I ifølge en kjent metode (se f.eks. Seeburg, P.H., et al, (1978), Nature, 276, 795-798). For å fjerne 3'-utvidelsen ble fra

0,5 til 3,5 yg DNA inkubert i 50 mM tris-HCl (tris(hydroksymetyl)-aminometan-hydroklorid), pH 7,8, 10 mM MgCl2, 1 mM 2-merkaptoetanol, i et volum på fra 10 til 50 yl idet man brukte fra 0,25 til 1,5 enheter DNA polymerase I (1 enhet er mengden som inkorporerer 10 n mol av nukleotidene inn i en syre-utfellbar fraksjon på 30 minutter ved 37°C idet det som oppstarter brukes poly-d(A-T) i henhold til Richardson, C.C., et al, (1964),

J. Biol. Chem., 2 39, 222). Blandingen ble inkubert i 20 minutter ved 10°C hvoretter en ekvivalent mengde kan brukes direkte for sammenkobling av butte ender eller det hele kan ekstraheres med like store volumer fenol og kloroform, og DNA utfel.les med etanol.

Fragmentet med butte ender ble deretter knyttet sammen med fosforylert Hind III sammenkoblere (5'-C CAAGCTTGG- 3'), idet det ble brukt et forhold på 50 mol sammenkoblere pr. mol fragment. Hind III-ender ble fremstilt ved å kutte opp det sammenkoblede materiale ved hjelp av Hind III og det hele ble utsatt for elektroforese på en annen 5% vekt/volum akrylamid-gel fra hvilken trp-promotor-båndet ble gjenvunnet.

Sammenkoblingen ble gjennomført på kjent måte (se f.eks. Suigino, A., et al, (1977), J. Biol. Chem., 252, 3987-3994).

Sammenkoblinger ble utført i volumer på fra 10 til 20 yl i 50 mM tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 20 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM ATP idet man brukte fra 0,2 til 1,0 enheter (1 enhet er 32 mengden som katalyserer omdannelsen av 1 n mol P P^ til (a/3 32P)-ATP på 20 minutter ved 37°C i henhold til Weiss, B., et al,. (1968), J. Biol. Chem., 243 , 4543) av T4 DNA ligase (EC 6.5.1.1) og fra 0,1 til 2 yg DNA. Reaksjonene ble inkubert fra 4 til 16 timer ved 25°C.

Når det gjelder gjenvinning så ble DNA utfelt med etanol, resuspendert i 20 yl TE-buffer og utsatt for elektroforese på

en 5% vekt/volum akrylamid-gel. Det sammenkoblede fragment ble deretter ekstrahert fra gelen ved å bruke den ovenfor beskrevne konvensjonelle DEAE (dietylaminoety1)-cellulose fremgangsmåten..

Dette siste trinnet fjerner ubundet Hind III sammenkobler DNA som ellers ville virke inn ved sammenkoblingen til pAT 153. Trp-fragmentet ble deretter koblet sammen med Hind III-oppkuttet, bakterielt alkalisk fosfatase-behandlet pAT 153

(0,1 yg) og de sammenkoblede molekylene transformert inn i E. coli K 12 HB101 idet man anvendte en næringsagar-karbenicillin (100 yg/ml) seleksjon.

Som en forholdsregel ble tryptofan (100 yg/ml) også tilsatt til transformasjonsplatene for å gjøre den trp-kontrollerte ekspresjon så liten som mulig (i fraværet av attenuatoren kunne overproduksjon av det 34kd store tetracyklinresistente protein vise seg å være dødelig). Totalt ble det erholdt 373 transformanter.

For å bestemme den sannsynlige orienteringen av det inn-førte trp-fragment, ble transformantene undersøkte for resistens mot tetracyklin, en resistens som identifiserer innskudd hvor trp-promotoren transkriberer inn i tetracyklin-genet ("R"-, innskudd). 100 trans formanter ble strøket ut på to sett plater med M9-casaminosyrer-minimalagar (100 ml M9-salfer (10 x M9-salter er 60 g Na2HP04, 30 g KH2P04, 5 g NaCl og 10 g NH4C1 i 1 liter destillert vann), 5 g casaminosyrer (Difco), 2 g glukose, 0,25 g MgS04-7H20, 21,9 mg- CaCl.2 • 6 H 2 0, 1 mg tiamin og 15 g agar i 1 liter destillert vann), begge supplert med karbenicillin (natriumsalt av a-karbdksy-benzylpenicillin) og tetracyklin (10 yg/ml), men den ene i tillegg supplert med tryptofan (100 yg/ml) på grunn av det som er nevnt ovenfor. Av de 100 transformantene som ble undersøkt var 64 Ap<r>Tc<r>± tryptofan og 36 Ap<r>Tc<S>± tryptofan, de sistnevnte som et resultat av at trp-fragmentet ble innført i "L"-orientering eller fra pAT 153-fragmenter innført i begge orienteringer.. Videre vokste transformantene like bra ± tryptofan, noe som i tilfellet med "R"-innføringene betyr at attenuator-fjerningen øker frekvensen for transkribering av tetracyklingenet under hemmende forhold sammenlignet med pWT 101 som ikke er i stand til å oppvise resistens mot 10 yg/ml tetracyklin når den hemmes, og, i både "L"- og "R"-innføringer, at delvis fjerning av hemmingen ikke er dødelig. 'Det er interessant å merke seg at nesten dobbelt så mange Tc r -transformanter ble oppnådd sammenlignet med Tc s-transformanter, noe som antyder en slags seleksjon til fordel for den førstnevnte.

Oppkutting ved bruk av Hind III på plasmid-DNA fremstilt fra både Ap<r>Tc<r->og Ap<r>Tc<S->transformanter skulle gi fragmenter med 147 bp og 3658 bp, de førstnevnte svarende til det klonede trp-promotorfragmentet og de sistnevnte svarende til den linje-form-omdannede vektor. Det ble imidlertid funnet at størrelsen på det klonede fragment avvek, et litt større fragment med 160 bp ble fremstilt fra plasmid-DNA isolert fra Ap<r>Tc<S->celler (i alt 8 Tc<S->transformanter ble undersøkt med hensyn til fragmentstørrelse), mens alt DNA fra Ap<r>Tc<r>ga et fragment med den forventede størrelse, ca. 147 bp. Ap Tc -plasmidene må åpenbart inneholde en av de større pAT 153-fragmentene fra pWT 221 og ikke trp-fragmentet. Hvis man antar at få hvis noen trp-fragmenter er blitt klonet i "L"-orientering, ville dette forklare den observerte fordeling av tetracyklin-resistens blant transformantene, ettersom trp-fragmentet skulle foreligge i relativt rikeligere mengde i den ekstraherte DNA-"blanding." enn de større pAT 153-fragmentene. Istedenfor å undersøke ytterligere Ap<r>Tc<S->transformanter for trp-prpmotor-fragmentet i "L"-orientering, ble det besluttet å klone det 147 bp store trp-fragmentet på nytt inn i pAT 153 så snart som det var blittkarakterisert, og å isolere "L"-innskudd fra de resulterende transformanter.

Bekreftelse på nærværet av trp-promotoren i de sannsynlige "R"-innskudd ble tilveiebrakt ved å kutte opp med Hpa I som kutter trp-DNA bare én gang i posisjon -11 (se figur 1 i de vedlagte tegninger) og ikke har noe sete i pAT 153. Orienteringen av trp-promotorfragmentet ble bekreftet ved dobbel oppkutting med Bal I og Pst I. Ved hjelp av polymerase-utbedringén og sammenknytning med Hind III-sammenkoblings-DNA, opprettes det et Bal I-sete ved Hind III-knutepunktet nedstrøms fra trp-promotoren

(se fig. I i de vedlagte tegninger). Det må følgelig fremstilles fragmenter på 925, 1421 og 1459 bp for en "R"-innføring. Bal I og Pst I kutter hver vektormolekylet (pAT 153) én gang i posisjonene 1416 og 2875, henholdsvis, i forhold til Hind III-setet (i urviserens retning). Som vist i en gel-profil, er det minste ba□ ndet fremstilt av et Ap r Tc r-plasmid, som tidligere er vist å inneholde et Hpa I-sete, 9 25 bp, noe som bekrefter "R."-orienteringen. Dette plasmid ble betegnet pWT 501.

To grunner kan fremsettes for hvorfor en "L"-innføring ikke ble isolert ved den forrige kloning, enten at transkripsjonen fra trp-promotoren virket sammen med transkripsjon fra B-laktamase-promotoren slik at ikke noe RNA ble transkribert på den andre siden av promotoren (en usannsynlig hendelse), eller at

i-

overdreven produksjon av (3-laktamase som en følge av transkripsjonen fra trp-promotoren har en dødelig- effekt. Begge hend-elsene er overraskende når man tar i betraktning at trp-promotoren ble hemmet av tryptofan og at et lignende plasmid, pWT 102, er stabilt i det minste under forhold hvor hemmingen er delvis fjernet (trp-minus medium, stabilitet er ikke blitt undersøkt ved IAA-induksjon). Et annet forsøk ble derfor gjort med å klone promotoren i "L"-orientering.

0,8 ug med pWT 501 ble kuttet opp med Hind III og utsatt for elektroforese på en 5% vekt/volum akrylamid-gel fra hvilken 147 bp fragmentet ble fjernet og ekstrahert. Det rensede fragment ble deretter sammenkoblet med Hind III-oppkuttet pAT 153

og de sammenkoblede molekylene transformert og platet ut.

I alt 1442 transformanter ble oppnådd, og av disse ble 100 undersøkt for resistens mot tetracyklin. Ettersom 14 Ap r Tc s-transformanter ble oppnådd, måtte alle de gjenværende være Ap<r>Tc<r>(ettersom pAT 153-bakgrunnen utgjorde bare 2% av de er-holdte transformanter, må Ap<r>Tc<r->transformantene ha inneholdt

pWT 501, dette ble imidlertid ikke undersøkt nærmere).

Oppkutting med Hind III av 8 plasmid-DNA fremstilt fra de

14 Ap r Tc s-transformantene ga både vektormolekylet og 147 bp trp-fragmentet. Fragmentets orientering ble igjen bestemt ved dobbel oppkutting med Bal I og Pst I. I tilfellet med "L"-orientering vil bånd med 783, 1459 og 1555 bp være å forvente. Oppkuttingsprofilene beviser at dette er tilfelle for de to Ap r Tc s-plasmidisolatene (alle 8 gir faktisk de samme bånd). Det viser seg derfor at "L"-inskudd av trp-promotorfragmentet var blitt isolert med hell.

Som en siste kontroll ble 8 "L"-innskutte plasmider kuttet opp med Hae III og sammenlignet med tilsvarende oppkuttet pWT 501. To Hae III-seter er lokalisert i 147 bp trp-fragmentet, en ved hver ende 5 bp fra Hind III-setet, begge frembrakt ved utbedringsreaksjonen med polymerasen og derpå følgende sammenknytning med Hind Ill-sammenkobler. Innføring av det 147 bp store trp-fragment i begge orienteringer ved pAT 153 Hind III-setet som er lokalisert i et 191 bp Hae III-fragment, skulle følgelig resultere for det første i fjerningen av 191 bp-fragmentet og for det annet i fremstillingen av 3 nye Hae III-fragmenter, fragmenter på 54 og 147 bp hver inneholdende et Hind III-sete og et 137 bp trp-promotor-fragment. Alle 8 "L"-innførte plasmider gir de forventede Hae III-fragmenter ved oppkutting som også pWT 501 gjør. Fremstillingen av disse 3 Hae III-fragmenter så vel som å bekrefte at trp-DNA er intakt, bekrefter også den forutsagte nukleotidsekvens frembrakt av polymerase reaksjonene og tilknytning av Hind III-sammenkoblere til endene av utgangsfragmentet Hha I (det er vist ovenfor at Hind III-setene er funksjonelle). Dette eliminerte derfor behovet for å sekvensere DNA i disse områdene. Det "L"-orienterte plasmid ble betegnet pWT 502.

Hind III-setet lokalisert oppstrøms (uønsket) kan fjernes i hvert enkelt tilfelle ved hjelp av vanlig kjente midler (se Tacon, et al, loe eit), og derved gi plasmider betegnet pWT 511 og pWT 512. Fase-endring ved hjelp av eksonuklease (se Tacon,

et al, loe eit), gir pWT 521, 531 og pWT 522, 532.

Plasmidet betegnet pWT 511 har en molekyl-lengde på 3809 bp, et Pst I-sete, et EcoRI-sete 752 bp fra Pst I-setet, et Hpa I-sete 107 bp fra' EcoRI-setet, et Hind III-sete 75 bp fra Hpa I- setet, et Bam Hl-sete 346 bp fra Hind III-setet, et Sal I-sete 275 bp fra Bam HI-setet, og Pst I-setet 2254 bp fra Sal I-setet.

Plasmidet betegnet pWT 512 har en molekyl-lengde på 3809 bp, et Pst I-sete, et EcoRI-sete 752 bp fra Pst I-setet, et Hind III-sete 31 bp fra EcoRI-setet, et Hpa I-sete 75 bp fra Hind III-setet, et Bam Hl-sete 422 bp fra Hpa I-setet, et Sal I-sete 275 bp fra Bam HI-setet, og Pst I-setet 2254 bp fra Sal I-setet.

Plasmidet betegnet pWT 521 har en molekyl-lengde på mindre enn 3809 bp, et Pst I-sete, etEcoRI-sete 752 bp fra Pst I-setet, et Hpa I-sete 107 bp fra EcoRI-setet, et Hind III-sete mindre enn 75 bp fra Hpa I-setet, et Bam Hl-sete 346 bp eller mindre fra Hind III-setet, et Sal I-sete 275 bp fra Bam HI-setet, og Pst I-setet 2254 bp fra Sal I-setet.

Plasmidet betegnet pWT 531 har en molekyl-lengde på mindre enn 3809 bp, et Pst I-sete, et EcoRI-sete 752 bp fra Pst I-setet, et Hpa I-sete 107 bp fra EcoRI-setet, et Hind III-sete mindre enn 75 bp fra Hpa I-setet, et Bam Hl-sete 346 bp eller mindre fra Hind III-setet, et Sal I-sete 275 bp fra Bam HI-setet, og Pst I-setet 2254 bp fra Sal I-setet.

Plasmidet betegnet pWT 522 har en molekyl-lengde på mindre enn 3809 bp, et Pst I-sete, et EcoRI-sete 752 bp fra Pst I-setet, et Hind III-sete 31 bp eller mindre fra EcoRI-setet,-et Hpa I-sete mindre enn 75 bp fra Hind III-setet, et Bam Hl-sete 42.2 bp fra Hpa I-setet, et Sal I-sete 275 bp fra Bam HI-setet, og Pst lesetet 2254 bp fra Sal I-setet.

Plasmidet betegnet pWT 532 har en molekyl-lengde på mindre enn 3809 bp, et Pst I-sete, et EcoRI-sete 752 bp fra Pst I-setet, et Hind III-sete 31 bp eller mindre fra EcoRI-setet, et Hpa I-sete mindre enn 75 bp fra Hind III-setet, et Bam Hl-sete 422 bp fra Hpa I-setet, et Sal I-sete 275 bp fra Bam HI-setet, og Pst I-setet 2254 bp fra Sal I-setet.

Disse utgjør ytterligere utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse.

pWT 511 kan fremstilles ved en fremgangsmåte som omfatter

å delvis kutte opp pWT 501 ved å bruke Hind III, isolere det derved kjedeformede molekyl, inkubere dette molekylet med DNA polymerase I, koble sammen de butte endene, transformere E. coli K 12 HB101 ved å bruke det resulterende plasmid, selektere for ampicillin-resistens og tetracyklin-resistens og

identifisere produksjonen ved restriksjonsenzym-analyse.

pWT 512 kan fremstilles ved en lignende fremgangsmåte ved

å bruke pWT 502.og selektere for ampicillin-resistens og tetracyklin- sens i ti vi tet .

pWT 521 og pWT 531 kan fremstilles ved en fremgangsmåte som omfatter å kutte pWT 511 ved å bruke Hind III, bryte ned de blottlagte Hind III endene i det resulterende kjedeformede molekyl ved å bruke eksonuklease III (EC 3.1.4.27) og Sl nuklease (EC 3.1.4.-), utbedre de oppnådde regulerte ender ved å bruke DNA polymerase I, knytte sammen med Hind III-sammenkoblere, transformere E. coli K 12 HB101 ved å bruke det oppnådde plasmid, selektere for ampicillin-resistens og tetracyklin-resistens og identifisere det fase-omdannede produkt.

pWT 522 og pWT 532 kan fremstilles ved en lignende fremgangsmåte 'ved å bruke pWT 512 og selektere for ampicillin-resistens og tetracyklin-sensitivitet.

Slikt utgjør ytterligere utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse.

Som antydet ovenfor, nødvendiggjør bruken av pWT 501

(eller pWT 502) som ekspresjonsplasmid-hjelpemidler at Hind III-setet som befinner, seg oppstrøms må fjernes for å gjøre Hind III-setet som befinner seg i det DNA som koder for attenuator-peptidet, til klonings-sete. Dette ble utført ved delvis oppkutting av plasmidet ved å bruke Hind III slik at bare ett kutt ble frembrakt.

Nærmere bestemt ble, som et eksempel, 2 yg plasmid-DNA kuttet opp i 60 minutter ved 25°C i et reaksjonsvolum på 400 yl (10 mM tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mil DTT, 100 yg/ml gelatin og 50 mM NaCl) idet det ble brukt 0,6 enheter enzym (1 enhet er mengden som bryter ned 1 yg X-DNA på 15 minutter ved 37°C i 50 yl). DNA-et ble deretter ekstrahert med like volumer fenol og kloroform og utfelt med etanol. Under disse forhold ble mesteparten av plasmidmolekylene delt kun én gang. Disse molekylene som er gjort kjedeformede ble separert fra ikke-kuttet plasmid ved hjelp av preparativ gel-elektroforese.

DNA-et ble deretter utsatt for elektroforese på en 3,5% vekt/volum akrylamid-gel, båndet med kjedeformede molekyler ble samlet opp og gjenvunnet og de Hind III-avdekkede endene fjernet ved utbedring med DNA polymerase I fulgt av butt-ende- sammenkobling. Denne fremgangsmåten fjerner en av de to Hind III-setene avhengig av hvilken som. var avdekket, sammenkoblings-, blandingen bør derfor sammensettes av begge typer i et forhold på 1:1. De sammenkoblede molekylene ble transformert inn i E. coli K 12 HB101 og platet ut på næringsagar (25 g næringsvæske, 15 g agar i 1 liter destillert vann) supplert med ampicillin (karbenicillin) og tryptofan (100 yg/ml). I alt 200 transformanter ble erholdt. Plasmid-DNA ble fremstilt fra en rekke av transformantene for å teste for tap av oppstrøms Hind III-sete.

Fjerningen av Hind III-setet som ligger oppstrøms ble demonstrert ved dobbel oppkutting med Pst I (EC 3.1.23.31) og Hind III. Pst I kutter pWT 501 én gang, 783 bp fra Hind III-setet som ligger oppstrøms. Fjerning av det uønskede Hind III-sete som ligger oppstrøms, gir følgelig bånd på 934 og 2875 bp ved dobbel oppkutting, mens bånd på 783 og 3026 bp fremstilles ved fjerning'av "ekspresjon"-setet som ligger nedstrøms. Begge typer plasmid er blitt isolert. Sistnevnte plasmid hvor Hind III-setet som ligger oppstrøms ér blitt fjernet, ble betegnet pWT 511, fasen ved Hind III-setet hos dette plasmid er den samme som hos pWT 111 og pWT 121.

Som angitt ovenfor, betegnes derivatet av pWT 501 for

pWT 511.

En analog fremgangsmåte kan anvendes for fremstilling av det korresponderende derivatet av pWT 502, pWT 512.

For eksempel pWT 511, som er et sammensmeltet plasmid, er bare i stand til å uttrykke gen-sekvenser innført ved Hind III-setet i én fase, derav behovet for de ovenfornevnte, fase-endrede derivater.

Kloningen av DNA inn i Hind III-setet til pWT 511 eller i virkeligheten pWT 512, hvor fasen til det innførte DNA er i overensstemmelse med den til attenuator-peptidet, vil til sist resultere i.syntesen av et sammensmeltnings-polypeptid som inneholder en N-ende med 12 aminosyrer, 11 avledet fra attenua.tor-p.eptidet og 1 avledet fra Hind IH-sammenkobler. For å redu-sere antallet aminosyrer ved N-enden forutgående for den inn-førte aminosyre-sekvensen, ble fase-endring tilveiebrakt ved fjerning av et antall nukleotider fra N-enden. Dette ble ut-ført ved en kontrollert eksonuklease III, Sl nuklease-nedbrytning av de blottstilte Hind III-ender, utbedring av uregelmessige ender ved bruk av DNA polymerase I, tilknytning med Hind III-sammenkobler og på nytt gjøre molekylet sirkelformet. Mengden DNA fjernet og fasen gjennom Hind III-setet ble bestemt ved å sekvensere Hind IH-området hos plasmid DNA isolert fra et antall bakteriekolonier avledet fra transformasjoner ved å bruke det eksonuklease-behandlede DNA.

Som antydet ovenfor, vedrører foreliggende oppfinnelse og-så fremstillingen av gen-ekspresjons-plasmider konstruert for å gi direkte oversettelse av innførte gen-sekvenser fra deres N-ender.

Det finnes flere fremgangsmåter for fremstilling i E. coli av avledete polypeptider ved hjelp av rekombinant DNA teknologi. Disse kan inndeles i tre grupper avhengig av syntesemåten: (i) Sammensatte proteiner. Det ønskede protein syntetiseres som del av et større sammensatt produkt som har en N-ende bestående av aminosyrer avledet fra et prokaryotisk E. coli-protein (se f.eks. Seeburg, P.H., et al, (1978), Nature, 276, 795). (ii) Oppdelbare sammensatte proteiner. Proteinet fremstilles først som et sammensatt produkt, men kan bli omsatt videre enten ved kjemiske metoder (se f.eks. Itakura, K., et al, (1977), Science, 198, 1056-1063) eller ved enzymatiske metoder (se f.eks. Shine, J.,

et al, (1980), Nature, 285, 456-461, eller Tamladge, K., et al, (1980), Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 77, 3369-3373) til å gi det endelige produkt,

(iii) Polypeptider syntetisert fra sin N-ende. I dette tilfelle startes oversettelsen direkte fra ATG eller GTG

i den innførte gen-sekvensen ved hjelp av at denne er plassert direkte nedstrøms for ribosom-bindings-setet uten noen hjelpende, bakterielle oppstartings-kodoner (se f.eks. Roberts, T.M., et al, (1979), Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 76, 5596-5600).

Alle tre fremgangsmåter har klare fordeler, for eksempel kan fremgangsmåten for fremstilling av det sammensatte protein gi anledning til fremstilling av et større, men stabilt polypeptid i tilfeller hvor det naturlige polypeptid kan være ustabilt, f.eks. følsomt overfor protease-angrep in vivo. Levedyktigheten for stor skala produksjon av det endelige polypeptid ved kjemisk eller enzymatisk oppdeling av et sammensatt polypeptid, ville imidlertid bli.styrt av ekstraomkostningene som denne omsetning ville medføre. Fremstillingen av det endelige eller et-for— stadiums-polypeptid in vivo ville derfor se ut til å være en mer egnet anvendelse, under forutsetning av at produktet er stabilt. Det har også den ytterligere fordel at bare ett ekspresjons-plasmid behøves å konstrueres ettersom, i motsetning til tilfellet med sammensatte produkter, det ikke lenger er noe problem med fasen.

?Forutsetningene for konstruksjonen av et plasmid som er i stand til å gi syntese av ferdig eller forstadiums-polypeptid fra en innført gen-sekvens er:

(i) et bindingssete for ribosomer lokalisert umiddelbart oppstrøms for et oppkuttingssete for endonuklease som er egnet for kloning og som er det eneste i plasmidet, (ii) fullgod transkripsjon gjennom bindingssetet for ribosomer og den innførte sekvens fra et kontrollerbart promotor-operatorområde,

(iii) tilstedeværelse av (i) og (ii) på et egnet plasmid.

Som nevnt ovenfor, kan disse betingelser bli tilfredsstilt ved å benytte et område fra tryptofan-operonet hos E. coli, nemlig DNA-avsnittet som inneholder tryptofan promotor-operatoren og ribosom-bindingssetet for attenuator-peptidet.

Dette kan illustreres ved henvisning til figur 2 i de vedlagte tegninger som vedrører isoleringen av Hae III - Taq I promotor-fragmentet og kloningen av dette i pAT 153: T.rp promotor-operatorområdet og ribosom-bindingssetet for attenuator-peptidet befinner seg på et 137 bp stort fragment fremstilt ved å dele opp for eksempel pWT 501 ved hjelp av Hae III (se figur 2 på de vedlagte tegninger). 100 bp-fragmentet (-78 til +22) som bare inneholder trp promotor-operatoren og ribosom-bindingssetet,isoleres fra dette Hae III-fragmentet ved en særskilt nedbryting ved hjelp av Taq I. Den blottstilte Taq I-enden i dette fragment befinner seg 2 nukleotider fra DNA-sekvensen GGT som er i stand til å danne base-par med et komplementært område ved 3'-enden i 16S ribosomalt RNA (se f.eks. Platt, T., (1978), The Operon, (Eds. Miller and Reznikoff),

Cold Spring Harbor Laboratory, .263-302). Omdannelse av dette setet til et passende klonings-ekspresjonssete, f.eks. Hind III, gir derfor anledning til innføringen av fremmed DNA som koder for et polypeptid og dets derpå følgende ekspresjon som endelig eller forstadiums polypeptid.

Det følgende illustrerer, som eksemplifisering, fremstillingen av pWT 550 og pWT '560 og videre pWT 551. pWT 550 og pWT 560 har to innføringsseter og kan betraktes som forløpere for pWT 551, et attenuator minus trp ekspresjons-plasmid som gir syntesen av et naturlig polypeptid fra en innført gen-sekvens. 20 yg pWT 501 ble kuttet ved hjelp av Hae III og utsatt for

■elektroforese på en 5% vekt/volum akrylamid-gel. 137 bp-båndet ble samlet opp fra gelen og DNA gjenvunnet fra akrylamidet. Fjerning av de uønskede 37 bp Taq I-Hae III fragmentene (som inneholder den'kodende sekvens for 11 aminosyrer av attenuator-peptidet) ble utført ved særskilt kutting av det 137 bp store 'Hae III-fragmentet ved hjelp av Taq I og gjenvinning av 100 bp båndet fra akrylamidet etter elektroforese av de oppdelte produkter på en annen 5% vekt/volum akrylamid-gel.

Nærmere bestemt ble den særskilte oppkutting ved å bruke Taq I utført som følger: 0,42<y>g av det 137 bp store fragment ble kuttet i 12 minutter ved 65°C i et reaksjonsvolum på 200 yl (10 mM tris-HCl,

pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 yg/ml gelatin, 5 mM NaCl) ved å. bruke 0,2 enheter (1 enhet er mengden som nedbryter 1,0 yg XDNA på 15 minutter ved 37°C i en total reaksjonsblanding på 0,05 ml) Taq I- Reaksjonen ble deretter avsluttet ved tilsats av 10 yl 0,4 M EDTA og 4 yl 10% vekt/volum SDS, ekstrahert med like store volumer av fenol og kloroform og utfelt med etanol. Det 100 bp store DNA-fragmentet fremstilt ved denne særskilte oppkutting ble separert fra de andre fragmentene i blandingen ved preparativ gel-elektroforese.

Før tilknytningen av Hind III-sammenkoblerne til' dette fragmentet, ble den blottstilte Taq I uregelmessige enden utbedret ved hjelp av DNA polymerase I. 5<1->utvidelsen ble utbedret ved en vanlig kjent metode (se f.eks. Seeburg, P.H., et al,

(1978), Nature, 276, 795-798). Nærmere bestemt ble fra 0,5 til 3,5 yg DNA inkubert i 50 mM tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 1 mM 2-merkaptoetanol, 0,1 mM av henholdsvis dATP, dCTP, dGTP, dTTP

•i et volum på fra 10 til 50 yl ved å bruke fra 0,25 til 1,5 enheter (1 enhet er mengden som inkorporerer 10 n mol av de samlede nukleotider i en syre-utfellbar fraksjon på 30 minutter ved 37°C ved å bruke poly-d(A-T) som oppstarter i henhold til

Richardson, CC, et al, (1964), J. Biol. Chem., 239 , 222) DNA polymerase I. Blandingen ble inkubert i 20 minutter ved 10°C, hvoretter en prøve kunne brukes direkte til butt-ende sammenkobling eller det hele ble ekstrahert med like store volumer av .fenol og kloroform, og DNA-et ble utf elt med etanol. Sammenkoblere ble knyttet til i et forhold på 50 mol sammenkoblere pr. 'mol fragment. Hind III-ender ble- fremstilt ved å kutte det sammenkoblede materiale-ved-hjelp av Hind III.

Ubundne sammenkoblere ble fjernet fra det sammenkoblede materiale ved kromatografi gjennom en forhåndsekvilibrert (50 mM NaCl/,0,1% vekt/volum SDS) 50 x 0,7 cm kolonne av G 150 "Sephadex" (kuleformet, kryssbundet dekstran-gel), idet det ut-felte DNA var blitt resuspendert i 50 yl 50 mM NaCl, 0,1% vekt/ volum SDS. Den isolerte toppen som inneholder trp-promotor-fragmentet og tilknyttede sammenkoblere, ble samlet opp og DNA ble utfelt med etanol. Dette materialet ble deretter koblet sammen med Hind III-kuttet, bakterielt, alkalisk fosfatase-behandlet pAT 153 og de sammenkoblede molekyler ble transformert inn i E. coli K 12HB101. Det ble selektert for. transformanter på en nærings-agar (25 g næringsvæske, 15 g' agar i 1 liter destillert vann) supplert med karbenicillin.og tryptofan (100 yg/ml)".

I alt 85 trans formanter ble erholdt.

Alle transformantene ble undersøkt for resistens mot tetra-. cyklin ved å stryke den ut på M9-casaminosyrer minimal agar supplert med karbenicillin og tetracyklin (10<y>g/ml) ± tryptofan (100 yg/ml). 34 transformanter ble på denne måten funnet å være Ap r Tc r (sannsynligvis "R"-orienterte innskudd) og 51 Ap r Tcs (sannsynligvis "L"-orienterte innskudd), både i nærvær og fravær av tryptofan. Plasmid DNA-er ble fremstilt både fra " L"- og "R"~transformanter.

Nærværet av klonet DNA ble påvist ved. å kutte opp plasmid- , DNA fra begge typer isolater med Hind III. Av de 4 "R"-innførte plasmider som ble kuttet opp, ga alle et bånd med 111 bp, den forventede størrelse for det klonede trp-fragmentet (101 bp Hae III-Taq I-fragment polymerase-utbedret pluss 10 bp Hind III- sammenkobler), mens bare 3 av de 12 "L"-innførte plasmider som var kuttet opp ga et bånd med denne størrelse (1 av 4). De 9 gjenværende, mulige "L"-innførte plasmider var alle ufullstendige derivater (mindre i størrelse enn et ekte rekombinant plasmid) og ble ikkekarakterisertnærmere, riktignok er det på bakgrunn av dette resultatet ikke mulig å fastslå med sikkerhet hvorvidt de ufullstendige derivatene var "R"- eller "L"-innførte rekombinanter.

Trp-promotororientering ble fastslått ved oppkutting med Hae III. Som det vil sees av figur 2, er det et enkelt Hae III-sete ved enden som ligger til venstre i det 111 bp store Hind III-trp-fragmentet- (-7-8) . Det er ikke noe slikt sete tilstede ved enden som ligger til høyre i fragmentet før eller etter ,DNA polymerase I utbedring og tilknytning med en Hind III-sammenkobler. Avhengig av orienteringen av trp-fragmentet (inn-ført ved Hind III-setet innenfor det 191 bp store Hae III-fragmentet), vil det derfor bli produsert fragmenter med 54 og 248 bp i tillegg til de forventede pAT 153 Hae III-båndene for innskudd som transkriberer mot tetracyklin-genet ('^"-orientering) og 147 og 155 bp for innskudd som transkriberer bort fra tetracyklin-genet ("L"-orientering).

Hae III-nedbrytningene bekreftet nærværet av de forutsagte. fragmenter. Det 248 bp store fragmentet fremstilt av '^"-inn-førte plasmider opptrer imidlertid unormalt ved elektroforese ettersom størrelsen på dette fragmentet er 258 bp beregnet ut fra spredningsprofilen. Oppdeling av dette fragmentet med Hpa I skulle gi fragmenter med 6 7 og 181 bp. Det ble funnet at 67 bp båndet flyttes til den forutsagte posisjon mens 181 bp båndet finnes igjen som en dimer med et pAT 153 bånd på 184'bp.

Plasmidene, som således var bekreftet å være' virkelige

"R"- og "L"-i'nnføringer i det 111 bp store Hind III-trp-fragmentet, ble betegnet henholdsvis pWT 550 og pWT 560.

For å lette bruken av pWT 550 som et Hind III-klonende ekspresjonsplasmid, ble det venstre (oppstrøms) Hind III-setet fjernet på samme måte som ved oppbygningen av pWT 511, ved DNA polymerase I utbedring av plasmid DNA som er særskilt oppkuttet med Hind III (2,0 yg), fulgt av gjendannelse av sirkelformen.

De sammenkoblede molekylene ble transformert inn i E. coli K 12 HB101 og det ble selektert for .transformanter på en karbenicil lin-holdig næringsagar. I alt ble det erholdt 199 transformanter. Fjerning av setet ble sikret ved oppdeling med Hind III og Pst I av plasmid DNA fremstilt fra flere kolonier. Bånd med 783 og 2990 bp (111 + 4 + 2875 bp) fremstilles ved fjerning av "ekspresjons"-setet som befinner seg nedstrøms, og 898

(783 + 4 + 111 bp) og 2875 bp ved fjerning av setet som befinner seg.oppstrøms. Plasmid-isolatet hvor Hind III-setet som befinner seg oppstrøms var fjernet, ble betegnet pWT 551.

Plasmidet betegnet pWT 550 har en molekyl-lengde på 3769 bp, et Pst I-sete, et EcoRI-sete 752 bp fra Pst I-setet, et første Hind III-sete 31 bp fra EcoRI-setet, et Hpa I-sete 72 bp fra det første Hind III-setet, et annet Hind III-sete 39 bp fra Hpa I-setet, et Bam Hl-sete 346 bp fra det annet Hind III-setet, et Sal I-sete 275 bp fra Bam HI-setet, og Pst I-setet 2254 bp fra Sal I-setét.

Plasmidet betegnet pWT 560 har en molekyl-lengde på 3769 bp, et Pst I-sete, et EcoRI-sete 752 bp fra Pst I-setet, et første Hind III-sete 31 bp fra EcoRI-setet, et Hpa I-sete 39 bp fra det første Hind III-setet, et annet Hind III-sete 72 bp fra Hpa I-setet, et Bam Hl-sete 346 bp fra det annet Hind III-setet, et Sal I-sete 275 bp fra Bam HI-setet, og Pst I setet 2254 bp fra Sal I-setet.

Plasmidet betegnet pWT 551 har en molekyl-lengde på 3773 bp, et Pst I-sete, et EcoRI-sete 752 bp fra Pst I-setet, et Hpa I-sete 107 bp fra EcoRI-setet, et Hind III-sete 39 bp fra Hpa I-. setet, et Bam Hl-sete 346 bp fra Hind III-setet, et Sal I-sete 275 bp fra Bam HI-setet, og Pst I-setet 2254 bp fra Sal I-setet.

Plasmidet betegnet pWT 561 har en molekyl-lengde på 3773 bp, et Pst I-sete, et EcoRI-sete 752 bp fra Pst I-setet, et Hind III-sete 31 bp fra EcoRI-setet, et Hpa I-sete 39 bp fra Hind III-setet, et Bam Hl-sete 422 bp fra Hpa I-setet, et Sal I-sete 275 bp fra Bam HI-setet, og Pst I-setet 225.4 bp fra Sal I-setet.

Dette utgjør ytterligere utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse.

pWT 550 kan fremstilles ved en fremgangsmåte som omfatter oppkutting av pWT 501 ved å bruke Hae III, isolere det trp-promotor-inneholdende fragment, delvis kutte opp dette fragment ved å bruke Taq I, isolere det 100 bp store Hae III - Taq I - fragmentet, utbedre den uregelmessige Taq I-enden hos dette frag-

mentet. ved å bruke DNA polymerase I, knytte sammen det resulterende fragment med Hind Ill-sammenkoblere, kutte opp det resulterende fragment ved å bruke Hind III, isolere det trp-promotor-inneholdende fragment, knytte sammen dette fragmentet med Hind III-kuttet, bakterielt alkalisk fos fatase-behandlet pAT 153, transformere E. coli K 12HB101 ved å bruke det resulterende plasmid og selektere for ampicillin-resistens og tetracyklin-resistens.

pWT 560 kan fremstilles ved en lignende fremgangsmåte, med unntak av at man selekterer for ampicillin-resistens og tetracyklin-sensitivitet.

pWT 551 kan fremstilles ved en fremgangsmåte som omfatter delvis oppkutting av pWT 550 ved å bruke Hind III, isolere det kjedeformede molekyl, inkubere dette molekylet med DNA polymerase I, knytte sammen de butte ender, transformere E. coli K 12 HB101 ved å bruke det resulterende plasmid, selektere for ampicillin-resistens og tetracyklin-resistens og identifisere produktet ved restriksjonsenzym-analyse.

pWT 561 kan fremstilles ved en lignende fremgangsmåte ved å bruke pWT 560 og selektere for ampicillin-resistens og tetracyklin-sensitivitet.

Ytterligere utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse utføres tilsvarende.

For eksempel pWT 551 er i stand til å uttrykke en innført gen-sekvens fra sin egen N-ende ved å plassere sekvensen umiddelbart nedstrøms for setet til attenuator-peptidet SD via et eneste Hind III-sete.

Multiple promotor-derivater, spesielt av pWT 551, er også blitt fremstilt.

Det er blitt vist (se f.eks. Backman, K., og Ptashne, M.,

(1978), Cell, 1_3, 6.5-71) at plasseringen av to 205 bp. store

lac promotor-fragmenter (se f.eks. Backman, K., et al, (1976), Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 13, 4174-4178) umiddelbart opp-strøms for et CI (repressor) gen, slik at begge promotorene transkriberer inn i genet, øker nivået av produsert repressor 2,2 ganger over det som produseres når bare et enkelt 205 bp stort fragment er plassert oppstrøms for genet. Det kan være to grunner for hvorfor det er slik. For det første vil en

nøytralisering av lac-repressoren forårsaket av økningen i operatorer frigjøre flere promotorer som kan initiere transkripsjon, og for det andre, en økning i transkripsjonshastigheten på grunn av RNA polymerase molekyler som initierer transkripsjonen,- fra to promotorer istedenfor en (multippel transkripsjon) med det resultat at to mRNA-er blir produsert. Slik øket transkripsjon ville være fordelaktig ved ekspresjon av eukaryote gener som generelt sett ikke blir uttrykt like effektivt som gener av prokaryot opprinnelse.

Multiple promotor-derivater av pWT 551 kan lett konstrueres ved gjentatt kloning ved Hind III-setet hos det 111 bp store Hind III trp promotor-fragmentet, fulgt av fjerning av setet som befinner seg oppstrøms. Videre, dersom nøytralisering av. repressoren er hovedårsaken for øket ekspresjon hos slike plasmider (se f.eks. Goeddel, D.V., et al, (1980), Nature, 2. 87, 411-416), skulle det være mulig å bekrefte dette ved å konstruere multiple promotorplasmider med setet for kloning av ekspresjonen plassert i mellomliggende posisjoner i en serie promotorer. Et gen som er klonet i posisjon 1 i et plasmid med tre promotorer skulle følgelig bli uttrykt vel så effektivt som et gen innført i posisjon 3. Dersom multippel transkripsjonen derimot er grunnen for den økte ekspresjon, skulle et gen inn-ført i den sistnevnte posisjon gi en økning' i ekspresjonen i forhold til ekspresjonen ved innføring i posisjon 1.

Det følgende illustrerer, som en eksemplifisering, konstruksjonen av multiple promotor-derivater av pWT 551: (i) trp promotor kloninger

Det 111 bp store Hind III trp promotor-fragmentet (gjenvunnet fra akrylamid ved å utsette Hind III-oppkuttet pWT 550 for elektroforese) ble knyttet sammen med Hind III-oppkuttet, bakteriell alkalisk fosfatase-behandlet pWT 551 og de sammenknyttede molekyler transformert inn i E. coli K 12 HB101, idet det ble selektert for trans formanter på en næringsagar med karbenicillin. I alt ble det erholdt 2121 transformanter og fra disse ble det valgt ut 12 for fremstilling av plasmid DNA.

Nærværet av klonet DNA ble påvist ved dobbel oppkutting med Pst I og Bam HI. pWT 551 kuttet opp på denne måten, ga bånd med 2529 og 1245 bp, idet det minste båndet inneholdt trp-promotoren. Ved å klone et enkelt 111 bp trp-fragment, økes dette båndet i størrelse til 1356 bp, idet 11 av de 12 plasmid DNA-er som var kuttet opp, har klonet et enkelt trp-fragment. Plasmid-nedbrytningen som ble påvist i de tilfeller hvor det minste båndet har en størrelse på ca. 1467 bp, skyldes sannsynligvis kloning av et dobbelt trp promotor-fragment.

Kutting med Hae III ble.brukt for å bekrefte orienteringen av den eller de klonede trp promotor(ene). Oppkuttingsprofilen for pWT. 551 er som for pWT 550 med unntak av at det 54 bp store Hae III-fragmentet er økt i størrelse til 58 bp (ved polymerase-utbedring av Hind III-setet som befinner seg oppstrøms) og flyttes som en dimer sammen med et pAT 153 bånd med 57 bp. Det ble fremstilt Hae III-profiler for et enkelt og et dobbelt trp-promotor- f ragment som kloner inn i pWT 551. Interessant nok

ga alle 12 plasmidene en identisk profil som synes å indikere at bare en av orienteringene er mulig. I tillegg til de to pWT 551 båndene knyttet til trp promotor-fragmentet (58 og 248 bp), omfatter nedbrytningsproduktet et bånd på 111 bp, og i tilfellet med dobbel kloning er dette båndet dertil en dimer. Et fragment, på 111 bp kan bare fremstilles dersom trp-fragmentet, som har et enkelt Hae III-sete plassert oppstrøms for promotor-regionen, innføres ved Hind III-setet hos pWT 551 i "^'-orienteringen, idet to fragmenter med denne størrelsen fremstilles i tilfelle hvor en dobbel kloning (begge "R"-orientert) har skjedd.

Som en siste kontroll, ble plasmidene med enkle og doble

■ trp-innføringer kuttet opp med Hind III. Oppkuttingsprofilene bekrefter nærværet i plasmidene av 111 bp Hind III trp promotor-fragmentet-. Disse to plasmidene ble betegnet pWT 551-2P (inneholdende dobbel trp promotor) og pWT 551-3P (inneholdende tre trp promotorer).

(ii) Fjerning av uønskede Hind III- seter

Isoleringen av trippel-promotor plasmidet, pWT 551-3P, var et uventet fordelaktig resultat ettersom dette eliminerte behovet for å klone et ytterligere promotor-fragment inn i pWT 551-2P. Tre derivater av pWT 551-3P, hver med et eneste Hind III-sete lokalisert ved enden nedstrøms i det første, andre og tredje promotor-fragment kan fremstilles ved å fjerne de to uønskede Hind III-seter. På samme måte kan det fremstilles to derivater av pWT 551-2P ved å fjerne et av de to Hind III-setene og derved la klonings og ekspresjons-setet' forbli i

posisjon 1 eller 2.

Fjerning av Hind III-sete ble utført som ved fremstillingen av pWT 511 og pWT 551 ved DNA polymerase I utbedring av særskilt Hind III-oppkuttet pWT 551-2P og pWT 551-3P, fulgt av ny sammenkobling. Nærmere bestemt ble 2 yg plasmid-DNA kuttet i 60 minutter ved 25°C i et reaksjonsvolum på 400 yl ved å bruke 0,6 enheter enzym. Reaksjonsblandingen inneholdt 10 mM tris-HCl;

pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 yg/ml gelatin og 50 mM NaCl. DNA-et ble deretter ekstrahert med like store volumer fenol og kloroform og utfelt med etanol. Under disse forhold ble fler-tallet av plasmidmolekylene delt bare én gang. Disse kjedeformede molekylene ble separert fra ukuttet plasmid ved hjelp av preparativ gel-elektroforese.

De sammenkoblede molekylene ble deretter transformert inn i E. coli K 12 HB101 selekterende på næringsagar med karbenicillin. Plasmid DNA-er fremstilt fra et antall transformanter ble under-søkt for tap av et av Hind III-setene ved restriksjonsanalyse. På denne, måten ble dobbel- og trippel-promotor plasmider som har henholdsvis ett og to Hind III-seter, isolert. Den ovenfor nevnte fremgangsmåte ble gjentatt med trippel-promotor isolater . for å fjerne et annet Hind III-sete.

Fjerning av Hind III-sete ble påvist ved dobbel oppkutting med Pst I og Hind III. Som antatt, gir dobbel-promotor plasmidet med kloningssetet beliggende i posisjon 1 et 899 bp stort fragment slik som også pWT 551 gjør, og et fragment med 2990 bp,

idet det sistnevnte fragmentet er 115 bp (111 bp trp fragment +

4 bp fra utbedringen med polymerase) større enn det tilsvarende pWT 551-fragmentet (2875 bp). Med plasmidet i posisjon 2 økes det 899 bp store fragmentet til 1014 bp (899 + 115 bp) og det største fragmentet, 2875 bp, tilsvarer det i pWT 551. Disse av-, bygninger bekrefter nærværet av et Hind III-sete i den fast- . satte posisjon. Plasmidene ble benevnt i overensstemmelse med posisjonen til Hind III-setet., pWT 551-2P1 og pWT 551-2P2, idet det siste tallet angir posisjonen for kloningssetet. Oppkuttings-profiler for trippel-promotor plasmider med kloningssetet beliggende i posisjon 1, 2 og 3 ble erholdt. Det 899 bp store fragmentet til plasmidet i posisjon 1 øker med 115 og 330 bp når kloningssetet plasseres etter det annet og tredje promotor-fragment og gir bånd med 1014 bp og 1129 bp. På samme måte øker det 2875 bp store fragment til plasmidet i posisjon 3 med de samme mengder hos plasmider i posisjon 2 og 1 og gir bånd med 2990 bp og 3105 bp. Etter således å være blitt bekreftet å ha et Hind III-sete i den fastsatte posisjon, ble disse plasmider betegnet pWT 551-3P1, pWT 551-3P2 og pWT 551-3P3.

Den fullgode oversettelse av en innført gen-sekvens av-henger av den korrekte plasseringen av sekvensen i forhold til bindingssetet for ribosomer. Dette kan oppnås ved å fjerne unødvendige nukleotider mellom initiator-kodonet til gen-sekvensen før dens kloning i ekspresjonssetet. Som angitt ovenfor, er pWT 551 blitt konstruert og sekvensen bekreftet slik at S1-nukleasebehandling av det splittede Hind III-sete (fjerning av 5<1->utvidelsen) vil gi en butt DNA-ende og det samme antall nukleotider mellom -GGT- sekvensen i bindingssetet for ribosomer og initiator-kodonet for den innførte gen-sekvensen slik som. med attenuator-peptidet (forutsatt at den innførte DNA-sekvensen begynner ved initiatoren, se figur 3 i de vedlagte tegninger).

Endringer i avstanden mellom bindingssetet for ribosomer (GGT) og initierings-kodonet for genet som skal uttrykkes kan utføres ved å bruke DNA polymerase I i nærvær av ett eller flere deoksynukleotid-trifosfater, fulgt av Sl-nukleasebehandling for å frembringe butte ender.

Korrekt oversettelse av gen-sekvenser innført i Hind III— ekspresjonssetene til pWT 551 er avhengig av nærværet av en initiator, ATG eller GTG, ved begynnelsen av det kodende område.

■Dersom en slik initiator er fraværende slik som hos mange polypeptider som utgjør sluttprodukter, som ikke har en metioningruppe ved N-enden, f.eks. leukocytt interferon, kan sekvensen ikke' oversettes. Oversettelse ville imidlertid være mulig dersom et ATG-kodon var til stede innenfor ekspresjons-kloningssetet umiddelbart foran den første aminosyren i den innførte gen-sekvensen. Det oversatte produktet ville da starte med en f-metioningruppe ved sin N-ende, fulgt.av den første aminosyren i protein-sluttproduktet. Et slikt system er blitt brukt for syntese av fullt utviklet humant veksthormon i E. coli (se Goeddel, et al, loe eit). Et plasmid egnet for denne type ekspresjon kan konstrueres ved å knytte et syntetisk DNA-fragment (sammenkobler) som inneholder en ATG etterfulgt av et egnet, eneste restriks jons-sete, f. eks.. EcoRI eller Bam HI, til den

DNA polymerase I-utbedrede Taq I-enden hos 100 bp Hae III-Taq I-fragmentet brukt ved fremstillingen av pWT 551.

Det 100 bp Hae III-Taq I-fragmentet som inneholder trp-promotoren ble gjenvunnet fra 20 yg pWT 501 og DNA polymerase I-utbedret som beskrevet ovenfor i tilknytning til fremstillingen av pWT 550 og pWT 560. Det syntetiske, 16 bp store sammen-, koblings-fragmentet som ble syntetisert ved vanlig kjente metoder (se f.eks. Hsuing, H.M., et al, (1979), Nucleic Acids Research, _6 , 1371-1385), og som i sentrum inneholder et EcoRI-sete som følger:

ble knyttet til fragmentet i et forhold på 50 mol sammenkobler pr. mol fragment. (Et slikt fragment og fremstillingen av dette ved en fremgangsmåte som omfatter den kjemiske syntesen og sammenknytningen av passende oligonukleotidér utgjør ytterligere utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse.) EcoRI-ender ble frembrakt ved å kutte opp sammenkoblingsblandingen ved å bruke EcoRI (EC 3.1.4.32). ' Ubundet sammenkobler ble fjernet fra det sammenknyttede materiale ved kromatografering gjennom en 50 x 0,7 cm kolonne med G 150 "Sephadex". Den utskilte topp som inneholdt trp-promotor-fragmentet og tilknyttede sammenkoblere ble samlet opp og DNA utfelt. pAT 153 ble brutt opp ved hjelp av EcoRI, behandlet med bakteriell, alkalisk fosfatase og det

100 bp store trp-fragment.

.Sammenkoblede molekyler ble innført i E. coli K 12 HB101

ved transformasjon og satt på seleksjon i en nærings-agar inneholdende ampicillin (100 yg/ml). Plasmid DNA ble fremstilt fra en rekke av transformantene. Etter oppkutting ved hjelp av EcoRI, ga disse et bånd med omtrent 117 bp, den forventede størrelse for det klonede fragment, så vel som for den kjedeformede vektor.

Orienteringén til trp-promotoren ble bestemt ved oppkutting ved hjelp av Taq I. I tillegg til det indre 42 bp Taq I-fragmentet til stede i det klonede trp-fragmentet (Taq I-setet i bindingssetet for ribosomer var blitt gjenskapt ved sammenkobling av EcoRI-sammenkobleren med den utbedrede Taq I-ende)

vil det bli fremstilt to nye fragmenter avhengig av orienteringen.

Når promotoren som transkriberer mot tetracyklin-resistens-genet ble innført i den høyre-vendte orientering, ble bånd på 25 og 418 bp fremstilt. Med den motsatte orientering, ble disse erstattet av bånd på 82 og 361 bp. Plasmidene med disse orienteringene ble betegnet henholdsvis pWT 570 og pWT 580.

Plasmidet betegnet pWT 570 har en molekyl-lengde på 3775 bp, et Pst I-sete, et første EcoRI-sete 752 bp fra Pst I-setet, et Hpa I-sete 75 bp fra det første EcoRI-setet, et annet EcoRI-sete 42 bp fra Hpa I-setet, et Hind III-sete 31 bp fra det annet EcoRI-setet, et Bam Hl-sete 346 bp fra Hind III-setet, et Sal I-sete 275 bp fra Bam HI-setet, og Pst I-setet 2254 bp fra Sal I-setet.

Plasmidet betegnet pWT 580 har en molekyl-lengde på 3775 bp, et Pst I-sete, et første EcoRI-sete 752 bp fra Pst I-setet, et Hpa I-seté 42 bp fra det første EcoRI-setet, et annet EcoRI-sete 75 bp fra Hpa I-setet, et Hind III-sete 31 bp fra det annet EcoRI-setet, et Bam Hl-sete 346 bp fra Hind III-setet, et Sal I-sete 275 bp fra Bam HI-setet, og Pst I-setet 2254 bp fra Sal I-setet.

pWT 570 kan fremstilles ved en fremgangsmåte som omfatter

å kutte opp pWT 501 ved hjelp.av Hae III, isolere det trp-' promotor-inneholdende fragment, delvis kutte opp dette fragmentet ved hjelp av Taq I, isolere det 100 bp store Hae III-Taq I-fragmentet, utbedre den uregelmessige Taq I-enden i dette fragment ved å bruke DNA polymerase I, knytte det resulterende fragment til EcoRI-sammenkoblere ACAATGAATTCATTGT, kutte opp det resulterende fragment ved hjelp av EcoRI, isolere det trp-promotor-inneholdende fragment, koble sammen dette fragmentet med pAT 153, som er blitt brutt ned ved hjelp av EcoRI og behandlet med bakteriell alkalisk" fosfatase, transformere E. coli K 12 HB101 ved å bruke det resulterende plasmid, selektere for ampicillin-resistens og/eller tetracyklin-resistens og identifisere produktet ved restriksjons-enzym-analyse.

pWT 580 kan fremstilles ved en lignende fremgangsmåte..

Dette utgjør ytterligere utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse.

Fjerning av EcoRI-setet som befinner seg oppstrøms ble ut-ført ved DNA polymerase I utbedring av delvis EcoRI-oppkuttet plasmid, fulgt av gjenskapning .av molekylets sirkulære form.

pWT 570 ble behandlet på en slik måte og den i E. coli K 12 HB101 transformerte sammenkoblede blanding ble selektert for Ap r-transformanter. Fjerningen av setet ble bekreftet ved oppkutting av plasmid-isolater fra fra en rekke av transformantene ved hjelp av EcoRI og Ava I. Det ble fremstilt bånd på 1426 bp og 2353 bp, som forutsagt ved fjerning av EcoRI-setet som befinner seg oppstrøms. Det resulterende plasmid er betegnet pWT 571.

Som med plasmidene pWT 502 og pWT 560, kan det benyttes en analog fremgangsmåte for å konstruere det korresponderende derivatet til pWT 580, pWT 581.

Plasmidet betegnet-pWT- 571 har en molekyl-lengde på 3779 bp, et Pst I-sete, et Hpa I-sete 831 bp fra Pst I-setet, et EcoRI-sete 42 bp fra Hpa I-setet, et Hind III-sete 31 bp fra EcoRI-setet, et Bam Hl-sete ,346 bp fra Hind III-setet, et Sal I-sete 275 bp fra Bam HI-setet, et Ava I-sete 774 bp fra Sal I-setet, og Pst I-setet 1480 bp fra Ava I-setet.

Plasmidet betegnet pWT 581 har en molekyl-lengde på 3779 bp, et Pst I-sete, et EcoRI-sete 752 bp fra Pst I-setet, et Hpa I-sete 42 bp fra EcoRI-setet, et Hind III-sete 110 bp fra Hpa I-setet, et Bam Hl-sete 346 bp fra Hind III-setet, et Sal I-sete 275 bp fra Bam HI-setet, et Ava I-sete 774 bp fra Sal I-setet, og Pst I-setet 1480 bp fra Ava I-setet.

pWT 571 kan fremstilles ved en fremgangsmåte som omfatter delvis oppkutting av pWT 570 ved å bruke EcoRI, isolere det kjedeformede molekyl, inkubere dette molekylet med DNA polymerase I, koble sammen de butte endene, transformere E. coli K 12 HB101 ved å bruke det resulterende plasmid, selektere for ampicillin-resistens og/eller tetracyklin-resistens og identifisere produktet ved restriksjonsenzym-analyse.

pWT 581 kan fremstilles ved en lignende fremgangsmåte ved.

å bruke pWT 580.

Dette utgjør ytterligere utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse.

Kutting av pWT 571 ved å bruke EcoRI, fulgt av Sl nuklease - DNA polymerase I utbedring, avdekker ATG-kodonet som er til stede i sammenkoblings fragmentet, og muliggjør derved butt-ende-sammenkobling av en DNA-sekvens som koder for et protein som mangler en metioningruppe ved N-enden, direkte til initiator- kodonet. Nukleotid-sammensetningen av sammenkobleren er slik at de tre nukleotidene foran ATG er slik som i bindingssetet for ribosomer i trp-styrergenet (se figur 1 i de vedlagte tegninger), det fullstendige bindingssetet for ribosomer kan derfor, under forutsetning av at DNA polymerase I-utbedringen av Taq I-enden er nøyaktig, angis som følger:

Dette ble vist ved (i) kutting med Taq I for å vise at Taq I-setet er blitt gjendannet og (ii) sekvensering gjennom EcoRI-setet (sekvensering fra Hpa- I).

Som nevnt ovenfor, kan selvfølgelig ende-til-ende sammenkobling av fragmenter for å fremstille promotorer i serier anvendes på de ovenfor nevnte plasmider.

Forskjellige fragmenter fra de ovenfor nevnte plasmider som inneholder trp-promotoren, kan betraktes som grunnlaget for foreliggende oppfinnelse.

Bestemte, spesielt interessante fragmenter er som følger:

Slike fragmenter kan fremstilles ved en fremgangsmåte som omfatter kjemisk syntese og sammenkobling av passende oligo-nukleotider.

Alternativt kan slike fragmenter fremstilles ved en fremgangsmåte som omfatter å kutte opp et egnet plasmid ved å bruke et eller flere passende enzymer.

Nærmere bestemt kan fragment (1) oppnås ved å kutte pWT 221 ved hjelp av Hha I, fragment (2) kan oppnås ved å kutte pWT 501 ved å bruke Hae III, og "fragment (3) kan oppnås ved å kutte pWT 501 ved å bruke Hae III og kutte særskilt ved å bruke Taq I.

Dette utgjør ytterligere utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et slikt plasmid hvor det i innføringssetet er blitt innført et DNA-fragment, særlig et eukaryotisk DNA-fragment, og fremstillingen av dette.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en celle,

i særdeleshet en E. coli K 12 HB101 celle, som er blitt transformert ved innføringen deri av et slikt plasmid, og fremstillingen av denne.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en fremgangsmåte for ekspresjonen av et protein som omfatter å dyrke en slik celle.

For eksempel er et Hind III-fragment med 1728 bp inneholdende FPV HA genet (se f.eks. Emtage, J.S., et al, (1980), Nature, 283 , 171-174) blitt klonet inn i Hind III-setet hos

pWT 511, slik at det er under trp-promotor kontroll, og transformert inn i E. coli K 12 HB101 hvor ekspresjon oppstår.

Det følgende eksemplifiserer denne utførelsesformen av' foreliggende oppfinnelse.

I tillegg til den 558 aminosyre HA-kodende sekvensen'i det 1728 bp store Hind III FPV-HA fragmentet, er det også til stede et område umiddelbart foran ATG i HA-forløperpeptidet som er delvis komplementær.med 3'-enden til 16S ribosomalt RNA hos E. coli og muliggjør ribosom-binding og oversettelse direkte fra ATG (se Emtage, et al, loe eit)'.

Nærværet av dette prokaryot-lignende bindingssete for ribosomer eliminerer derfor behovet for å uttrykke HA-genet som del av et sammenkoblet peptid i et ekspresjons-plasmid med korrekte faser, eller i virkeligheten å fremstille DNA-et før kloning slik at ATG-et- er plassert grensende opp til et SD-sete hos E. coli (som ville være nødvendig ved ekspresjon i pWT 551). Bindingssetet for ribosomer opptrer imidlertid bare med en effektivitet på ca. 20% sammenlignet med setet hos E. coli. Innføring av genet i Hind III-setet til pWT 121, som er i-fase for korrekt oversettelse av HA-genet som en sammenkobling med trp E aminosyrene, resulterer følgelig i fremstillingen av 20,3 ng HA (pr. 50 yl bakterie-lysat) når hemmingen for trp-kontrollert ekspresjon er delvis opphevet,. sammenlignet -med 5,0 ng HA ved ekspresjon i pWT 111 som er ute-av-fase (se Emtage, et al, loe eit).

Teoretisk kan det forventes en 8 til 10 gangers økning i produkt for et trp-plasmid som mangler attenuator-genet (se Miozzari og Yanofsky, loe eit), men i praksis kan det være, på grunn av den mulige membran-bindende naturen til HÅ-proteinet via den hydrofobe C-enden (se f.eks. Porter, A.G., et al,

(1979), Nature, 282, 471-477), at dette ikke oppnås. Det ble derfor besluttet å klone genet inn i pWT 511 for ute-av-fase ekspresjon (pWT 511 er i fase med pWT 111)' fra det mindre effek-tive prokaryot-lignende bindingssete for ribosomer med et blikk på muligheten for fase-endring (om mulig) over sammenkoblings-punktet for å øke ekspresjonen enda mer.

FPV Hind III DNA ble koblet til Hind III-kuttet pWT .511, transformert inn i E. coli K 12 HB101 og rekombinante kolonier

selektert ved anvendelse av næringsagar, karbenicillin og tryptofan (100 yg/ml) seleksjon. I alt 29 trans formanter ble erholdt og ble undersøkt for plasmid-størrelse på geler med hele celler. Utvalgte kolonier ble undersøkt for plasmid DNA ved kjente metoder (se Twigg og Sherratt, loe eit).

Et representativt utvalg av celler fra en agar-utstrykning av en enkelt koloni (nok celler til å fylle en 1 yl inokulerings-sløyfe) ble resuspendert i 250 yl agarose-gel-elektroforese-buffer (AGEB) inneholdende'1% vekt/volum SDS, 2% vekt/volum Ficoll 70 (en kopolymer av sukrose og epiklorhydrin) og 0,01% vekt/volum bromfenol blå. Blandingen ble inkubert i 30 minutter ved 65 C. 5 yl ribonuklease IA ble deretter tilsatt og lysatet rystet kraftig i 30 sekunder. Det ble funnet å være tilstrekkelig med en 5.0 yl fraksjon av dette lysatet for plasmid-identifi-sering på en 1% vekt/volum gel. 26 av transformantene inneholdt "IT<->orienterte plasmider i full størrelse. Disse rekombinantene ble deretter undersøkt for FPV gen orientering ved testing for tetracyklin-resistens på tetracyklin (10 yg/ml) og karbenicillin-supplert M9-casaminosyrer-minimal agar ± tryptofan (100 yg/ml). En lik fordeling av sannsynlige L- og R-innskudd ble funnet. 11 rekombinanter var Tc tryptofan og var sannsynligvis L-innskudd, mens de gjenværende 12 rekombinanter varTc<r>pluss tryptofan, men vokste ikke i dets fravær (de samme ble observert minus Tc), sannsynligvis R-innskudd. Manglende evne hos det R-orienterte FPV plasmidet til å vokse i fravær av tryptofan skulle tyde på overproduksjon av HA ved delvis derepresjon, en situasjon som man ikke støter på hos pWT 221/FPV(R) i E. coli K 12 HB101. Plasmid DNA-er ble fremstilt fra 4Tc<r->og 4Tc<S->rekombinante kolonier for restriksjons-analyse.

Etter kutting med Hind III, ga alle 8 plasmider det 1728 bp store FPV-HA-fragmentet. Orienteringen ble bekreftet ved kutting med Pst I. Alle 4 Tc IT-plasmider ga bånd med 3425 og 2108 bp, noe som bekrefter R-orienteringen til FPV-innskuddet. Dette plasmidet ble betegnet pWT 511/FPV(R). Tc -plasmidene ga bånd med 4053 og 1480 bp, og bekreftet således korrekt L-innføring..

En bestemmende faktor i valget av FPV-HA fremstilling som

et middel for å fastslå potensialet til trp-ekspresjonsplasmidet pWT 511 med manglende attenuator, var at en sensitiv prøve på

HA (E. coli)-antigenet var tilgjengelig. Dette er basert på en radioimmunoprøve hvor antistoff bindes til antigen i fast fase og som bruker jodert antistoff frembrakt mot viruset.

Nærmere bestemt var den anvendte HA-antigen-prøven en modi-fikasjon av en kjent "sandwich"-teknikk for antistoffer (se f.eks. Broome, S., og Gilbert, W., (1978), Proe. Nati. Acad. Sei.. U.S.A. , 75, 2746-2749) ved hvilken HA-antigener i bakterie-lysater ble

12 5

påvist ved å binde dem til FPV-HA spesifikt I-IgG.

Plasmid-inneholdende celler som skulle undersøkes for HA-antigen, ble dyrket i 5 ml M9-casaminosyrer minimal medium supplert med 100 yg/ml karbenicillin i opp til 8 timer (celler ble vanligvis dyrket til en O.D. på 0,3, dersom dette imidlertid ikke ble oppnådd, ble inkubasjonen fortsatt i opp til 8 timer). Ytterligere tilsetninger (IAA eller tryptofan) var også til stede som angitt. Cellene ble pelletert ved sentrifugering og lysert i et slutt-volum på 1 ml ved å bruke lysozym, "Triton X-100"-teknikk (Triton X-100 er en ikke-ionisk detergent, isooktylfenoksypolyetoksyetanol).

For eksempel ble celler pelletert og resuspendert i 300 ul isavkjølt 25% vekt/volum sukrose i 0,05 M tris-HCl, pH 8,0.

Alle videre reaksjoner ble utført på is. 100 yl 10 mg/ml

lysozym ble tilsatt og reagensrøret rystet i 5 minutter, fulgt

av tilsats av 100 yl 0,4- M EDTA (dinatriumsaltet av etylendiamintetraeddiksyre), pH 8,5. Etter rysting i 5 minutter, ble lyser-ing frembrakt ved tilsats av 500 yl "lyseringsblanding" (2% volum/ volum Triton X-100, 0,05 M tris-HCl, pH 8) og reagensrøret ble rystet i ytterligere 20 minutter. Aktivitet av HA-antigen i lysatene ble undersøkt direkte uten videre behandling.

Prøver ble utført i kultur-rør av polystyren som var blitt behandlet med renset IgG spesifikt for kanin-FPV-HA. IgG-bestanddelen ble isolert ved ammoniumsulfat-utfelling og kromatografering på dietylaminoetyl (DEAE)-cellulose DE 52 (se f.eks. Livingston, D..M. , (1974), Methods Enzymol., 34, 723-731) og

125

merket med I (se f.eks. Hunter, W.M., og Greenwood, F.C.,

(1964), Brit. Med. J., 5386, 804-807). Rør ble dekket med 50 yl 0,2 M NaHCO^, pH 9, som inneholdt 60 yg/ml renset, umerket IgG i 10 minutter ved romtemperatur, vasket med 3 x 1 ml porsjoner med vaskebuffer (0,2 M NaCl, 50 mM KH2P04, pH 7,4, 0,1% vekt/volum BSA (serum albumin fra okse), 0,1% volum/volum NP-40 ("Nonidet P40") og 0,5% vanlig serum fra geit) og deretter inkubert ved romtemperatur enten med. kjente mengder (1-20 ng) Sarkosyl-ødelagte FPV eller med bakterie-lysatene. Etter 2 timer ble rørene vasket med 4 x 1 ml porsjoner vaskebuffer og til slutt inkubert ved 4°C i 16 timer med 50 yl vaskebuffer inneholdende 12 5

200.000 c.p.m. Ianti-HA. Rørene ble på nytt vasket og tellet i en "Packard"Y-teller. Mengde tilstedeværende antigen ble bestemt ut fra standard-kurver for radioaktiviteten knyttet til den tilstedeværende mengde FPV.

E. coli K 12 HB101 celler som inneholdt henholdsvis pWT 511/ FPV(R) og pWT 121/FPV(R), ble først undersøkt for HA antigen- - produksjon i M9-casaminosyrer-karbenicillin-minimal medium med tilsatt tryptofan. I tilfellet med pWT 511/FPV(R), ble celler dyrket ved to konsentrasjoner av tryptofan, 10 og 100 yg/ml. pWT 121/FPV(R) celler ble dyrket med bare 100 yg/ml tryptofan. Veksten ble målt med intervaller på en time inntil en 0D^<00>på 0,3 var oppnådd (omtrent 3 timer), cellene pelletert, lysert med lysozym og "Triton X-100" og 50 yl av lysatet undersøkt for HA-innhold. Det ble' ikke funnet noen forskjell mellom vekst-hastighetene ved 10 og 100 yg/ml tryptofan hos pWT 511/FPV(R) cellene. Resultatene av prøvene indikerte liten forskjell mellom mengdene HA som var produsert ved de to tryptofan-konsen-trasjonene som ble brukt for pWT 511/FPV(R) . Begge verdier er betraktelig høyere enn verdien for hemmet pWT 121/FPV(R); ved Trp^ gir attenuator minus plasmidet 6,4 ganger mer HA enn den førstnevnte og 5,8 ganger mer ved Trp100. Det er blitt funnet at det rekombinante pWT 111/FPV(R), som med hensyn til FPV er ute av fase, produserte, som antatt, enda mindre HA ved Trp^ ®®, 0,157 ng HA/50 yl. Dersom dette tallet brukes som basis-nivå, produserer pWT 511/FPV(R) 10,2 og 9,3 ganger mer HA ved henholdsvis Trp"^ og Trp"<*>"^°. Av disse resultatene fremgår det at pWT 511/FPV(R) uttrykker HA-genet i en større grad enn hver av de to FPV-plasmidene med intakt attenuator/'Videre synes de oppnådde HA-verdiene ikke delvis å skyldes øket kopi-antall, ettersom både pWT511/FPV(R) og (L)-plasmider har et kopi-antall som heller svarer til kopi-antallet hos et pBR 322 basert replikon (se f.eks. Bolivar, F., et al, (1977), Gene, 2_, 95-113). enn til kopi-antallet hos et pAT 153-basert replikon.

Følgelig har ekspresjonen av FPV-HA-genet i pWT 511 vist at dette plasmidet er en mer effektiv ekspressor enn plasmider som inkluderer en attenuator.

Som antydet ovenfor, gir bruken av multiple promotorer visse fordeler. Det følgende illustrerer, som et eksempel, bruken av et trippel promotor plasmid: Det 830 bp store Hind III-fragmentet fra plasmidet pl-24 (se figur 4 i de vedlagte tegninger og figur 11 i GB-patent-søknad nr. 2.068.970), som inneholder trp p/o og FIF-genet, ble klonet inn i Hind III-setet hos pWT 551-2P2 og det ble selektert for transformanter på næringsagar supplert med ampicillin (100 yg/ml). DNA-er ble fremstilt og et R-orientert innskudd .identifisert ved kutting med Pst I (fragmentstørrelser 1028 og ' 3462 bp).

En slik oppbygning bringer interferon-genet under kontroll

■ av tre etter hverandre plasserte trp-promotorer.

E. coli K 12 HB101 celler som henholdsvis inneholder pl-24 og trippel promotor-derivatet, pWT551-2P2/trp FIF, ble indusert for å fremstille interferon. 150 ml kulturer av hver klon

ble dyrket i L-næringsmedium ("Luria"-medium: 1% vekt/volum "Bacto" trypton, 0,5% vekt/volum "Bacto" gjærekstrakt, 0,5% vekt/volum NaCl, 0,2% vekt/volum glukose, 0,004% vekt/volum tymin, pH 7 (N NaOH)) inneholdende ampicillin inntil en O.D-600 på omtrent 0,3. Bakteriene- ble pelletert ved sentrifugering, vasket og deretter resuspendert i induseringsmedium (42 mM Na2HP04, 22 mM KH2P04>8,6 mM NaCl, 18,7 mM NH4C1, 0,1 mM CaCl2, 1,0 mM MgS04, 1 yg/ml vitamin Bl, 0,2% vekt/volum glukose,

0,5% vekt/volum casaminosyrer uten tryptofan ("Difco") og 100 yg/ml ampicillin). Etter inkubering ved 37°C i 4 timer (når O.D.g00nm var omtrent 1,0), ble cellene sentrifugert og ekstrahert. Ekstraksjonsteknikken omfattet å knuse bakteriene med ' lydbølger i 10 mM tris-HCl, pH 8,0, fulgt av sentrifugering i 30 minutter ved 15.000 x g og oppsamling av supernatanten for prøving. Prøving for interferon-aktivitet ble utført ved å registrere beskyttelsen overført til celler fra "Vero"

(unge afrikanske aper) mot cpe (cytopatisk effekt) av EMC (Encephalomyocaditis)-virus i et in vitro mikro-plate prøvings-system (se f.eks. Dahl, H., og Degre, M., (1972), Acta, Path. Microbiol. Sean., 1380, 863).

Utbytte: pl-24: 5,8 x IO<5>enheter/liter

pWT 551-2P2/trp FIF: 1,95 x IO<6>enheter/liter

(1 enhet defineres som den mengde som resulterer i en 50% reduk-sjon av viral replikering i vev-kultur).

Det trippel promotor plasmidet gir omtrent tre ganger så stort utbytte, bestemt som anti-viral aktivitet.

Som det vil forstås av det forutgående, har den foreliggende oppfinnelse bl.a. en praktisk anvendbarhet i det at den gjør det mulig å fremstille nyttige proteiner, som det ellers ville være vanskelig eller umulig å syntetisere, i økte utbytter.

Claims (10)

1. Plasmid med et innføringssete for et DNA-fragment grensende opp til en bakteriell promotor og beliggende nedstrøms fra et prokaryotisk ribosom-bindingssete og om ønsket med et initiator-kodon slik at et innført DNA-fragment er under bakteriell promotor-kontroll, karakterisert ved at attenuatoren for promotoren er blitt fjernet.

2. Plasmid ifølge krav 1, karakterisert ved at promotoren er en trp-promotor.

3. Plasmid ifølge krav 1 eller krav 2, karakterisert ved at det har flere promotorer.

4. Plasmid ifølge krav 1 eller krav 2, karakterisert vedat det har en molekyl-lengde på 3805 bp, et sete for Pst I, et sete for EcoRI 752 bp fra setet for Pst I, et første sete for Hind III 31 bp fra setet for EcoRI, et sete for Hpa I 72 bp fra det første setet for Hind III, et annet sete for Hind III 75 bp fra setet for Hpa I, et sete for Bam HI 346 bp fra det annetsete for Hind III, et sete for Sal I 275 bp fra setet for Bam HI og setet for Pst I 2254 bp fra setet for Sal I, idet plasmidet betegnes pWT 501, eller at det har en molekyl-lengde på 3805 bp, et sete for Pst I, et sete for EcoRI 752 bp fra setet for Pst I, et første sete for Hind III 31 bp fra setet for EcoRI, et sete for Hpa I 75 bp fra det første setet for Hind III, et annet sete for Hind III 72 bp fra setet for Hpa I, et sete for Bam HI 346 bp fra det annet sete for Hind III, et sete for Sal I 275 bp fra setet for Bam HI og setet for Pst I 2254 bp fra setet for Sal I, idet plasmidet betegnes pWT 502, eller at det har en molekyl-lengde på 3809 bp, et sete for Pst I, et sete for EcoRI 752 bp fra setet for Pst I, et sete for Hpa I 107 bp fra setet for EcoRI, et sete for Hind III 75 bp fra setet for Hpa I, et sete for Bam HI 346 bp fra setet for Hind III, et sete for Sal I 275 bp fra setet for Bam HI og setet for Pst I 2254 bp fra setet for Sal I, idet plasmidet betegnes pWT 511, eller at det har en molekyl-lengde på 3809 bp, et sete for Pst I, et sete for EcoRI 752 bp fra setet for Pst I, et sete for Hind III 31 bp fra setet for EcoRI, et sete for Hpa I 75 bp fra setet for Hind III, et sete for Bam HI 422 bp fra setet for Hpa I, et sete for Sal I 275 bp fra setet for Bam HI og setet for Pst I 2254 bp fra setet for Sal I, idet plasmidet betegnes pWT 512, eller at det har en molekyl-lengde på mindre enn 3809 bp, et sete for Pst I, et sete for EcoRI 752 bp fra setet for Pst I, et sete for Hpa I 107 bp fra setet for EcoRI, et sete for Hind III mindre enn 75 bp fra setet for Hpa I, et sete for Bam HI 346 bp eller mindre fra setet for Hind III, et sete for Sal I 275 bp fra setet for Bam HI og setet for Pst I 2254 bp"fra" setet for Sal I, idet plasmidet betegnes pWT 521, eller at det har en molekyl-lengde på mindre enn 3809 bp, et sete for Pst I, et sete for EcoRI 752 bp fra setet forP st I, et sete for Hind III 31 bp eller mindre fra setet for EcoRI, et sete for Hpa I mindre enn 75 bp fra setet for Hind III, et sete for Bam HI 422 bp fra setet for Hpa I, et sete for Sal I 275 bp fra setet for Bam HI og setet for Pst I 2254 bp fra setet for Sal I, idet plasmidet betegnes. pWT 522, eller at det har en molekyl-lengde på mindre enn 3809 bp, et sete for Pst I, et sete for EcoRI 752 bp fra setet for Pst I, et sete for Hpa I 107 bp fra setet for EcoRI, et sete for Hind III mindre enn 75 bp fra setet for Hpa I, et sete for Bam HI 346 bp eller mindre fra setet for Hind III, et sete for Sal I 275 bp fra setet for Bam HI og setet for Pst I 2254 bp fra setet for Sal I, idet plasmidet betegnes pWT 531, eller at det har en molekyl-lengde på mindre enn 3809 bp, et sete for Pst I, et sete for EcoRI 752 bp fra setet for Pst I, et sete for Hind III 31 bp eller mindre fra setet for EcoRI, et sete for Hpa I.mindre enn 75 bp fra setet for Hind III, et sete for Bam HI 422 bp fra setet for Hpa I, et sete for Sal I 275 bp fra setet for Bam HI og setet for Pst I 2254 bp fra setet for Sal I, idet plasmidet betegnes pWT 532, eller at det har en molekyl-lengde på 3769 bp, et sete for Pst I, et sete for EcoRI 752 bp fra setet for Pst I, et første sete for Hind III 31 bp fra setet for EcoRI, et sete for Hpa I 72 bp fra det første setet for Hind III, et annet sete for Hind III 39 bp fra setet for Hpa I, et sete for Bam HI 346 bp fra det annet sete for Hind III, et sete for Sal I 275 bp fra setet for Bam HI og setet for Pst I 2254 bp fra setet for Sal I, idet plasmidet betegnes pWT 550, eller at det har en moleKyl-lengae på 376.9 bp, et sete for Pst I, et sete for EcoRI 752 bp fra setet for Pst I, et første sete for Hind III 31 bp fra setet for EcoRI, et sete for Hpa I 39 bp fra det første setet for Hind III, et annet sete for Hind III 72 bp fra setet for Hpa I, et sete for Bam HI 346 bp fra det annet'sete for Hind III, et sete for Sal I 275 bp fra setet for Bam HI og setet for Pst I 2254 bp fra setet for Sal I, idet plasmidet betegnes pWT 560, eller at det har en molekyl-lengde på 3773 bp, et sete for Pst I, et sete for EcoRI 752 bp fra setet for Pst I, et sete for Hpa I 107 bp fra setet for EcoRI, et sete for Hind III 39 bp fra setet for Hpa I, et sete for Bam HI 346 bp fra setet for Hind III, et sete for Sal I 275 bp fra setet for Bam HI og setet for Pst I 2254 bp fra setet for Sal I, idet plasmidet betegnes pWT 551, eller at det har en molekyl-lengde på 3773 bp, et sete for Pst I, et sete for EcoRI 752 bp fra setet for Pst I, et sete for Hind III 31 bp fra setet for EcoRI, et sete for Hpa I 39 bp fra setet for Hind III, et sete for Bam HI 422 bp fra setet for Hpa I, et sete for Sal I 275 bp fra setet for Bam HI og setet for Pst I 2254 bp fra setet for Sal I, idet plasmidet betegnes pWT 561, eller at det har en molekyl-lengde på 3775 bp, et sete for Pst I, et første sete for EcoRI 752 bp fra setet for Pst I, et sete for Hpa I 75 bp fra det første setet for EcoRI, et annet sete for EcoRI 42 bp fra setet for Hpa I, et sete for Hind III 31 bp fra det annet sete for EcoRI, et sete for Bam HI 346 bp fra setet for Hind III, et sete for Sal I 275 bp fra setet for Bam HI og setet for Pst I 2254,bp fra setet for Sal I, idet plasmidet betegnes pWT 570, eller at det har en molekyl-lengde på 3775 bp, et sete for Pst I, et første sete for -EcoRI 752 bp fra setet for Pst I, et sete for Hpa I 42 bp fra det første setet for EcoRI, et annet sete for EcoRI 75 bp fra setet for Hpa I, et sete for Hind III 31 bp fra det annet sete for EcoRI, et sete for Bam HI 346 bp fra setet for Hind III, et sete for Sal I 275 bp fra setet for Bam HI og setet for Pst I 2254 bp fra setet for Sal I, idet plasmidet'betegnes pWT 580, eller at det har en molekyl-lengde på 3779 bp, et sete for Pst I, et sete for Hpa I 831 bp fra setet for Pst I, et sete for EcoRI 42 bp fra setet for Hpa I, et sete for Hind III 31 bp fra setet for EcoRI, et sete for Bam HI 346 bp fra setet for Hind III, et sete for Sal I' 275 bp fra setet for Bam HI, et sete for Ava I 774 bp fra setet for Sal I og setet for Pst I 1480 bp fra setet for Ava I, idet plasmidet betegnes pWT 571, eller at det har en molekyl-lengde på 3779 bp, et sete for Pst I, et sete for EcoRI- 752 bp fra setet for Pst I, et sete for Hpa I 42 bp fra setet for EcoRI, et sete for Hind III 110 bp fra setet for Hpa I, et sete for-Bam HI 346 bp fra setet for Hind III, et sete for Sal I 275 bp fra setet for Bam HI, et sete for Ava I 774 bp fra setet for Sal I og setet for Pst I 1480 bp fra setet for Ava I, idet plasmidet betegnes pWT 581.

5. Plasmid ifølge kravene 1 til 4, karakterisert ved at det i innføringssetet er innført et DNA-fragment.

6. Plasmid-fragment ifølge kravene 1 til 4, karakterisert ved den bakterielle promotor.

7. Fragment ifølge krav 6, karakterisert ved den følgende sekvens:

Et fragment ifølge.krav _.6 , karakterisert ved den følgende sekvens:

9 . Fragment ifølge krav ,6 , karakterisert ved den følgende sekvens:

10 - Fragment, karakterisert ved den følg-ende sekvens: