NO158880B - Fremgangsmaate for fremstilling av et spesifikt pattedyrhormon. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for fremstilling av et spesifikt pattedyrhormon særlig somatostatin eller A-kjeden eller B-kjeden i humaninsulin, eller mellomprodukt for dette ved ekspresjon av heterolog DNA-sekvens i et rekombinant bakterieplasmid.

Genetisk informasjon kodes på dobbeltkjedet deoksyribo-nukleinsyre ("DNA" eller "gener") etter den rekkefølge i hvilken den DNA-kodende kjede presenterer de karakteristiske basene i sine gjentagende nukleotidkomponenter. "Ekspresjon" av den kodede informasjon for dannelse av polypeptider innebær en todelt prosess. Under styring fra visse kontroll-områder ("reguloner") i genet, kan RNA-polymerase bevirkes til å bevege seg langs den kodende kjede under dannelse av mRNA (ribonukleinsyre) i en prosess som betegnes "transkripsjon". I et etterfølgende "translasjons"-trinn omdanner cellens ribosomer sammen med transfer-RNA (tRNA) nevnte mRNA-"budskap" til polypeptider. Innbefattet i den informasjon som mRNA transkriberer fra DNA er signaler for start og terminering av ribosomal translasjon samt identiteten og sekvensen til aminosyrene som utgjør polypeptidet. Den DNA-kodende kjeden omfatter lange sekvenser av nukleintripletter betegnet "kodoner" fordi de karakteristiske basene i nukleotidene i hver triplett eller kodon koder spesifikke deler av informasjon. F.eks., 3 nukleotider lest som ATG (adenin-tymin-guanin) resulterer i et mRNA-signal tolket som "start translasjon", mens termineringskodoner TAG, TAA og TGA tolkes som "stopp translasjon". Mellom start- og stoppkodonene ligger de såkalte strukturelle gener hvis kodoner definerer aminosyresekvensen som blir translatert til slutt. Denne definisjon forløper ifølge den veletablerte "genetiske kode"

(f.eks. J.D. Watson, Molecular Biology of the Gene, W.A. Benjamin Inc., N.Y., 3. utgave 1976) som beskriver kodonene for de forskjellige aminosyrene. Den genetiske koden er degenerert i den forstand at forskjellige kodoner kan gi den samme aminosyren, men presis siden det for hver aminosyre er en eller flere kodoner for den og ingen annen. Således vil

f.eks. alle kodonene TTT, TTC, TTA og TTG lest som sådanne, kode for serln og Ingen annen aminosyre. Under transkripsjon må den riktige lesefasen eller leserammen opprettholdes. Man kan f.eks. se hva som skjer når den transkriberende RNA-polymerase leser forskjellige baser ved begynnelsen av et kodon (understreket) i sekvensen ...GCTGGTTGTAAG...:

Det polypeptid som til slutt fremstilles, vil da fullt og helt avhenge av romforholdet for det strukturelle gen med hensyn til reguloner.

En klarere forståelse av prosessen med genetisk ekspresjon vil fremgå når visse komponenter i gener er definert: O<p>eron - Et gen omfattende strukturelt gen(er) for polypeptidekspresjon og kontrollområdet ("regulon") som regulerer denne ekspresjon.

Promotor - Et gen i regulonet til hvilket RNA-polymerase må binde seg for initiering av transkripsjon.

Operator - Et gen til hvilket repressor-protein kan binde seg og således hindre RNA-polymerase i å binde seg til tilstøt-ende promotor.

Induser - Et stoff som deaktiverer repressor-protein og derved frigjør operatoren og tillater RNA-polymerase å binde .seg til promotor og begynne transkripsjon.

Katabolittaktivatorprotein (" CAP")- bindingssete - Et gen som binder cyklisk adenosinmonofosfat ("c AMP") - formidlet CAP, også vanligvis nødvendig for initiering av transkripsjon. CAP-bindingssetet kan i spesielle tilfeller være unødvendig. En promotor-mutasjon i laktoseoperonet i fag X-plac UV5 eliminerer f.eks. nødvendigheten av CAMP og CAP for ekspresjon, J. Beckwith et al., J. Mol. Biol. 69, ISS-160 (1972).

Promotor- operator- system - I foreliggende sammenheng så betyr dette et opererbart kontrollområde i et operon, med eller uten hensyn til hvorvidt det inngår i et CAP-bindingssete eller er i stand til å kode for repressor-proteinekspresjon.

For bruk I omtalen av rekombinant DNA i det følgende, gis følgende definisjoner: Kloningsvektor - Ikke-kromosomal dobbeltkjedet DNA omfattende et intakt "replikon" slik at vektoren replikeres når den anbringes i en encellet organisme ("mikrobe") ved en "trans-formasJons"-prosess. En således transformert organisme betegnes en "transformant".

Plasmid - For foreliggende formål er dette en kloningsvektor avledet fra virus eller bakterier, hvor sistnevnte er "bakterielle plasmider".

Kompiementar i tet - En egenskap som gis av basesekvensene i enkeltkjedet DNA og som muliggjør dannelse av dobbeltkjedet DNA gjennom hydrogenbinding mellom komplementære baser på de respektive kjeder. Adenin (A) er et komplement til tymin (T), mens guanin (G) er et komplement til cytosin (C).

Fremskritt innen biokjemi i senere år har ledet til konstruksjonen av "rekombinante" kloningsvektorer hvori f.eks. plasmider behandles slik at de inneholder eksogent DNA. I visse tilfeller kan rekombinanten inneholde "heterologt" DNA, dvs. DNA som koder for polypeptider som vanligvis Ikke produseres av organismen som er mottagelig for transformasjon av den rekombinante vektoren. Således spaltes plasmider for tilveiebringelse av lineær DNA som har ligerbare termini. Disse er bundet til et eksogent gen som har ligerbare termini for tilveiebringelse av en biologisk funksjonell del med et intakt replikon og en ønsket fenotypisk egenskap. Den rekombinante delen innføres i en mikroorganisme ved transformasjon og transformanter isoleres og klones med det formål å oppnå store populasjoner som kan uttrykke den nye genetiske informasjon. Metoder og midler for dannelse av rekombinante kloningsvektorer og omdannelse av organismer med disse er utbredt rapportert i litteraturen. Se f.eks. H.L. Heynecker et al., Nature 263. 748-752 (1976); Cohen et al., Proe. nat. Acad. Sei. USA 69, 2110 (1972); ibid., 70, 1293 (1973); ibid., 70, 3240 (1973); ibid., 71, 1030 (1974); Morrow et al., Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 71, 1743 (1974); Novick, Bacteriological Rev., 33» 210 (1969); Eershfield et al., Proe. Soc. Nat'l. Acad. Sei. U.S.A. 71, 3455 (1974) og Jackon et al., Ibid..69, 2904 (1972). En generalisert omtale av emnet finnes i S. Cohen, Scientific Amer.ican 233, 24 (1975).

En rekke forskjellige teknikker er tilgjengelige for DNA-rekombinasjon ifølge hvilke tilstøtende ender til separate DNA-fragmenter tilpasses på en eller annen måte for å lette ligering. Den sistnevnte betegnelsen refererer til dannelsen av fosfodiester-bindinger mellom tilstøtende nukleotider, mest ofte ved hjelp av enzymet T4 DNA-ligase. Således kan butte ender ligeres direkte. Alternativ begunstiges fragmenter inneholdende komplementære enkeltkjeder ved deres tilstøtende ender ved hydrogenbinding, hvilket innstiller de respektive endene for etterfølgende ligering. Slike enkeltkjeder som betegnes kohesive termini, kan dannes ved addisjon av nukleotider til butte ender under anvendelse av terminal transferase og noen ganger på enkel måte ved å bryte ned en kjede hos en butt ende med et enzym slik som X-eksonuklease. Også her, og mest vanlig, kan man ty til restriksjonsendonukleaser som spalter fosfodiesterbindinger i og omkring unike sekvenser i nukleotider av en lengde på ca. 4-6 basepar. Mange restriksjonsendonukleaser og deres gjenkjennelsesseter er kjente, idet den såkalte EcoRI-endo-nuklease er mest utbredt benyttet. Restriksjonsendonukleaser som spalter dobbeltkjedet DNA ved rotasjonsmesslg symmetriske "pallndromer" etterlater kohesive termini. Således kan et plasmid eller en annen kloningsvektor spaltes og etterlate termini som hver omfatter halvparten av restriksjonsendonuklease-gjenkjennelsessetet. Et spaltningsprodukt av eksogen DNA oppnådd med den samme restriksjonsendonukleasen vil ha ender som er komplementære med de til plasmidets termini. Som beskrevet nedenfor kan alternativt syntetisk DNA omfattende kohesive termini tilveiebringes for innføring i den spaltede vektor. For å motvirke gjenforening av vektorens kohesive termini før innføring av eksogen DNA kan nevnt termini nedbrytes med alkalisk fosfatase for tilveiebringelse av molekylær seleksjon for lukkinger innbefattende det eksogene fragment. Inkorporering av et fragment som har den riktige orientering i forhold til andre aspekter hos vektoren kan forbedres når fragmentet supplerer vektor-DNA uttatt eller fjernet med to forskjellige restriksjonsendonukleaser, og når det selv omfatter termini som respektivt utgjør halvparten av gjenkjennelsessekvensen hos de forskjellige endonukleaser.

Til tross for omfattende arbeid i senere år innen rekombinant DNA-forskning har få resultater som er mottagelige for umiddelbar og praktisk anvendelse blitt oppnådd. Dette har vist seg spesielt å være tilfelle når det gjelder feilslåtte forsøk på å uttrykke polypeptider og lignende som kodes for ved hjelp av "syntetisk DNA", enten ved konstruksjon av nukleotid for nukleotid på konvensjonell måte eller oppnåelse ved revers transkripsjon fra isolert in RNA (komplementær eller "cDNA"). I foreliggende sammenheng beskrives det som synes å representere den første ekspresjon av et funksjonelt polypeptidprodukt fra et syntetisk gen sammen med relaterte utviklinger som kan få stor anvendelse. Det produkt det refereres til er somatostatin (US patent 3.904.594), en inhibitor for sekresjon av veksthormon, insulin og glukagon, hvis effekter foreslår dets anvendelse ved behandling av akromegali, akutt pankreatitis og insulin-avhengig diabetes. Se R. Guillemin et al., Annual Rev. Med. 27, 379 (1976). Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et spesifikt pattedyrpoly-peptid, f.eks. somatostatin eller A-kjeden eller B-kjeden i human insulin, eller et mellomprodukt for dette ved ekspresjon av heterolog DNA-sekvens i et rekombinant bakterie-plasmld, og denne fremgangsmåten, er kjennetegnet ved at det som DNA-sekvens anvendes en heterolog DNA-sekvens som koder for det spesifikke polypeptid, hvilken sekvens forutgåes av en DNA-sekvens som koder for et polypeptid ulikt det spesifikke pattedyrpolypeptidet slik at ekspresjon gir et fusjonspolypeptid omfattende begge nevnte polypeptider, idet det befinner seg et selektiv spaltningssete tilstøtende pattedyr-polypeptid-aminosyresekvensen.

Somatostatin-modellen viser klart anvendbarheten av de nye utviklinger som omfattes av oppfinnelsen på flere og nyttige områder hvilket vil fremgå fra de medfølgende tegninger og fra det som er angitt i det nedenstående.

De medfølgende tegninger illustrerer et felt på hvilket foretrukne utførelser av oppfinnelsen finner anvendelse, dvs. ekspresjon av hormonet somatostatin ved bakterielle transformanter inneholdende rekombinante plasmider. Figur 1. Skjematisk oversikt over fremgangsmåten: Genet for somatostatin, fremstilt ved kjemisk DNA-syntese, sammensmeltes med E. coli p-galaktosidasegenet på plasmidet pBR322. Etter transformasjon i E. coli dirigerer det rekombinante plasmidet syntesen av et forløperprotein som spesifikt kan spaltes in vitro ved metioninrester ved hjelp av cyanogenbromid for oppnåelse av aktivt pattedyrpolypeptidhormon. A, T, C og G betegner de karakteristiske basene (henholdsvis adenin, tymin, cytosin og guanin) i deoksyribonukleotidene i den kodende kjeden til somatostatlngenet. Figur 2. Skjematisk struktur for et syntetisk gen hvis kodende kjede (dvs. den "øvre" kjeden) omfatter kodoner for aminosyresekvensen i somatostatin (gitt). Figur 3. Skjematisk illustrasjon av foretrukken metode for konstruksjon av nukleotidtrimerer benyttet ved konstruksjon av syntetiske gener. I den konven-sjonelle måte som er benyttet for å avbilde nukleotider på figur 3, er 5'-0H til venstre og 3'-OH til høyre, f.eks. Figur 4. Flytskjema for konstruksjonen av et rekombinant plasmid (f.eks. pSOMll-3) som kan uttrykke et somastostatin ("SOM")-holdig protein, begynnende med et opphavelige plasmid pBR322. På figur 4 er den omtrentlige molekylvekt for hvert plasmid angitt i dalton ("d"). Ap<r> og Tc<r> betegner henholdsvis gener for ampicillin- og tetracyklin-resistens, mens Tc<s> betegner tetracyklinfølsomhet resulterende fra fjerning av en del av Tc<r->genet. De relative posisjoner for forskjellige restriksjonsendonuklease-spesifikke spaltningsseter på plasmidene er angitt (f.eks. EcoRI, Baml, osv.). Figurer 5A og 5B. Nukleotidsekvensene til nøkkeldeler i to plasmider er angitt sammen med retningen for en mRNA-transkripsjon, som alltid forløper fra 5<»->enden i den kodende kjeden. Restriksjonsendonuklease-substratseter er som vist. Hver viste sekvens inneholder både kontrollelementene i lac (laktose)-operonet og kodoner for ekspresjon av aminosyresekvensen i somatostatin (kursiv). Aminosyresekvensnumrene for p-galaktosidase ("g-gal") er angitt I parenteser. Figurer 6- 8. Som mer spesielt beskrevet i nedenstående eksperimentelle del angir disse resultatene fra sammenlignende radioimmunanalyseforsøk som demon-strerer somatostatinaktiviteten for produkt uttrykt av de rekombinante plasmidene. Figur 9. Skjematisk struktur for syntetiske gener hvis kodende kjeder omfatter kodoner for aminosyre-sekvensene i A- og B-kjedene i humaninsulin. Figur 10. Flytskjema for konstruksjon av et rekombinant plasmid som kan uttrykke B-kJeden i humaninsulin. 1. Fremstilling av gener som koder for heterologt polypeptid DNA som koder for et hvilket som helst polypeptid med kjent aminosyresekvens kan fremstilles ved å velge kodoner ifølge den genetiske koden. For å lette rensing, osv., blir oligodeoksyribonukleotidfragmenter av f.eks. fra ca. 11 til ca. 16 nukleotider fremstilt separat og deretter sammensatt i den ønskede sekvens. Således fremstilles første og andre serier av oligodeoksyribonukleotidfragmenter av hensiktsmessig størrelse. Den første gir når den er sammenføyet i riktig sekvens en DNA-kodende kjede for polypeptidekspresjon (se f.eks. figur 2, fragmenter A, B, C og D). Den andre serien gir, når den på samme måte er sammenføyet i riktig sekvens, en kjede som er komplementær til den kodende kjeden (f.eks. figur 2, fragmenter E, F, G og H). Fragmentene i de respektive kjedene overlapper fortrinnsvis hverandre slik at komplementaritet fremmer deres selvsammensetning gjennom hydrogenbinding av de kohesive termini i fragmentblokker.

Etter sammensetning blir det strukturelle genet fullført ved ligering på konvensjonell måte.

Degenerasjonen i den genetiske koden tillater vesentlig frihet i valg av kodoner for enhver gitt aminosyresekvens. For foreliggende formål hie imidlertid kodonvalget fordel-aktig styrt av tre betraktninger. For det første ble kodoner og fragmenter valgt, og fragmentsammensetning arrangert, slik at man unngikk urimelige komplementaritet i fragmentene, et med et annet, med unntagelse for fragmenter tilstøtende hverandre i det tilsiktede gen. For det annet unngås sekvenser som er rike på AT-basepar (f.eks. ca. fem eller mer) særlig når de forutgåes av en sekvens som er rik på GO basepar, for å unngå for tidlig terminering av transkripsjon. For det tredje er i det minste størstedelen av de valgte kodoner de som er foretrukket i ekspresjonen av mikrobielle genomer (se f.eks. W. Fiers et al., Nature 260. 500 (1976)). For foreliggende formål defineres det følgende som kodoner "foretrukket for ekspresjon av mikrobielle genomer":

I tilfellet for somatostatin er aminosyre(kodon)-forholdene i det strukturelle genet mest foretrukket: gly (GGT); cys (TGT); lys (AAG); trp (TGG); ala (GCT, GCG); asn (AAT, AAC); phe (TTC, TTT); thr (ACT, ACG); og ser (TCC,

TCG).

Når det strukturelle genet i et ønsket polypeptid skal innføres i en kloningsvektor for ekspresjon som sådan, forutgåes genet av et "start"-kodon (f.eks. ATG) og følges umiddelbart av et eller flere terminerings- eller stopp-kodoner (se fig. 2). Som beskrevet nedenfor kan imidlertid aminosyresekvensen i et spesielt polypeptid uttrykkes med ytterligere protein som går forut for og/eller etterfølger den. Dersom den tilsiktede bruk av polypeptidet krever spalting av det ytterligere proteinet, blir passende spaltningsseter kodet for tilstøtende sammenføyningen polypeptid-ytterligere proteinkodon. På figur 1 som eksempel er således ekspresjonsproduktet et forløperprotein omfattende både somatostatin og størstedelen av P-galaktosidasepolypeptidet. Her er ATG ikke nødvendig for å kode for translasjonsstarten, fordi ribosomal konstruksjon av det ytterligere P-gal-protein leser gjennom inn i det strukturelle somatostatingenet. Inkorporering av ATG-signalet koder imidlertid for produksjonen av metionin, en aminosyre som spesifikt spaltes av cyanogenbromid, hvilket gir en lett metode for omdannelse av forløperprotein til det ønskede polypeptidet.

Figur 2 eksemplifiserer også et ytterligere trekk som er foretrukket i heterolog DNA for rekombinant anvendelse, dvs. tilveiebringelse av kohesive termini, fortrinnsvis omfattende en av de to kjedene i et restriksjonsendonuklease-gjenkjennelsessete. Av ovenfor omtalte grunner blir termini fortrinnsvis konstruert for å skape respektivt forskjellige gjenkjennelsesseter ved rekombinasjon.

Mens de heri beskrevne utviklinger har blitt demonstrert som vellykkede med somatostatinmodellen, vil det forstås at heterolog DNA som koder for praktisk talt en hvilken som helst kjent aminosyresekvens kan benyttes, mutatis mutandis. De teknikker som er omtalt ovenfor og i det følgende er således anvendbare, mutatis mutandis, ved fremstilling av poly(amino)syrer slik som polyleucin og polyalanin; enzymer; serumproteiner; analgetiske polypeptider slik som p-endor-finer, som modulerer smerteterskler, osv. Mest foretrukket vil polypeptidene fremstilt som sådanne være pattedyrhormoner eller mellomprodukter for disse. Blant slike hormoner kan nevnes f.eks. somatostatin, humaninsulin, human- og bovin-veksthormon, leutiniserende hormon, ACTH, pankreatisk polypeptid, osv. Mellomprodukter innbefatter f.eks. human-preproinsulin, human-proinsulin, A- og B-kjedene i humaninsulin, osv. I tillegg til DNA fremstilt in vitro kan den heterologe DNA omfatte cDNA resulterende fra revers transkripsjon fra mRNA, se f.eks. TJllrich et al., Science 196. 1313 (1977).

2. Rekomblnanter som koder for ekspresjonen av forløper-protein

I den prosess som er illustrert skjematisk på figur 1, gir ekspresjon et forløperprotein omfattende både et polypeptid kodet for av et spesifikt heterologt strukturelt gen (somatostatin) og ytterligere protein (omfattende en del av p-galaktosidaseenzymet). Et selektivt spaltningssete til-støtende somatostatin-aminosyresekvensen tillater etter-følgende separering av det ønskede polypeptid fra overflødig protein. Tilfellet som er illustrert, er representativt for en stor klasse av metoder som er gjort tilgjengelig gjennom de heri beskrevne teknikker.

Mest vanlig vil spalting bevirkes utenfor det replikative miljøet i plasmidet eller annen vektor som f.eks. etter innhøsting av den mikrobielle kulturen. På denne måten kan midlertidig konjugasjon av små polypeptider med overflødig protein bevare den førstnevnte mot f.eks. in vivo nedbrytning av endogene enzymer. Samtidig vil det ytterligere proteinet vanligvis berøve det ønskede polypeptid for bioaktivitet inntil ekstracellulær spalting med den virkning at metodens biosikkerhet forøkes. I spesielle tilfeller kan det naturligvis vise seg ønsket å bevirke spalting inne i cellen. F.eks. kan kloningsvektorer tilveiebringes med DNA som koder for enzymer som omdanner lnsulinforløpere til den aktive form, ved operasjon i tandem med annen kodet DNA for ekspresjon av f orløpérformen.

I et foretrukket tilfelle mangler det spesielt ønskede polypeptid indre spaltningsseter tilsvarende de som benyttes for å spre overflødig protein, skjønt det vil forstås at når denne betingelse ikke er tilfredsstilt, vil konkurrerende reaksjoner likevel gi det ønskede produkt, dog i lavere utbytte. Når det ønskede produkt er metioninfritt, har cyanognbromid-spalting ved metionin tilstøtende den ønskede sekvensen vist seg meget effektiv. Likeledes kan arginin- og lysinfrie produkter spaltes enzymatisk med f.eks. trypsin eller kymotrypsin ved arg-arg, lys-lys eller lignende spaltningsseter tilstøtende den ønskede sekvens, I det tilfellet hvor spalting etterlater f.eks. uønsket arginin festet til det ønskede produktet, kan dette fjernes ved karboksypeptidase-nedbrytning. Når trypsin anvendes for å spalte ved arg-arg, kan lysinseter i det ønskede polypeptidet først beskyttes slik som med maleinsyre- eller citrakonsyre-anhydrider. Spaltingsteknikkene som her er omtalt som eksempler er bare representative for de mange variantene som en fagmann på området vil være klar over.

Spaltbart protein kan uttrykkes tilstøtende enten C- eller N-terminalene 1 et spesifikt polypeptid eller endog i selve polypeptidet, slik tilfellet er for den inkluderte sekvens som skiller prolnsulin og insulin. Igjen kan den benyttede vektor kode for ekspresjon av protein omfattende gjentatte sekvenser av det ønskede polypeptid, hvert separert av selektive spaltningsseter. Mest foretrukket vil imidlertid kodoner for overflødig protein bli translatert før det strukturelle gen i det ønskede produkt, slik som i tilfellet illustrert i figurene. I hvert tilfelle bør det sørges for å opprettholde den riktige leseramme i forhold til regulonet.

3. Ekspresjon av immunogener

Evnen til å uttrykke både et spesifikt polypeptid og over-flødig protein representerer nyttige verktøy for produksjon av immunogene stoffer. Polypeptid-"haptener" (dvs. stoffer som inneholder determinanter spesifikt bundet av antistoffer og lignende, men vanligvis for små til å fremkalle en immunrespons) kan uttrykkes som konjugater med ytterligere protein i tilstrekkelig størrelse til å gi immunogenisitet. Det p-gal-somatostatinkonjugat som her er fremstilt som eksempel er i virkeligheten av immunogen størrelse og kan forventes å frembringe antistoffer som binder somatostatin-haptenet. Proteiner omfattende over 100 aminosyrer, mest vanlig over 200 slike, utviser immunogen karakter.

Konjugater fremstilt på ovenstående måte kan benyttes for å frembringe antistoffer som er nyttig i radioimmunanalyser eller andre analyser for haptenet, og alternativt i fremstillingen av vaksiner. I det nedenstående skal det beskrives et eksempel på sistnevnte anvendelse. Cyanogenbromid- eller andre spaltningsprodukter av viralt kappeprotein vil gi oligopeptider som binder til antistoff til selve proteinet. Gitt aminosyresekvensen for et slikt oligopeptid-hapten, kan heterolog DNA derfor uttrykkes som et konjugat med ytterligere protein som gir immunogenisitet. Anvendelsen av slike konjugater som vaksiner kan forventes å minske bivirkninger som ledsager bruken av selve kappeproteinet for å bevirke immunitet.

4. Kontrollelementene

Figur 1 viser en prosess hvor en transformant organisme uttrykker polypeptidprodukt fra heterolog DNA bragt under kontroll av et regulon som er "homologt" til organismen i dens utransformerte tilstand. Således omfatter laktose-avhengig E. coli-kromosomal DNA et laktose eller "lac"-operon som formidler laktosenedbrytning ved blant annet å utløse enzymet P-galaktosidase. I det spesielt illustrerte tilfellet oppnås lac-kontrollelementene fra en bakteriofag, X-plac 5, som er infektiøs for E. coli. Fagens lac-operon er på sin side avledet ved transduksjon fra den samme bakteriearten, følgelig "homologien". Homologe reguloner egnet for bruk i den beskrevne prosess kan alternativt avledes fra plasmidisk DNA som er opprinnelig i organismen.

Enkelheten og effektiviteten til lac-promotor-operator-systemet anbefaler dets bruk i de systemer som heri er beskrevet, noe som også er tilfellet med dets evne til å bli indusert av IPTG (isopropyltio-B-D-galaktosid). Andre operoner eller deler derav kan naturligvis også benyttes, f.eks. X-promotor-operator, arabinose-operon (phi 80 data) eller kollein El, galaktose, alkalisk fosfatase eller tryptofan-operoner. Promotor-operatorer avledet fra sistnevnte (dvs. "tryp-operon") vil forventes å gi 100# under-trykkelse før induksjon (med indolakrylsyre) og innhøsting.

5. Generell plasmidkonstruks. lon

Detaljene i den fremgangsmåte som er illustrert skjematisk på figur 4 fremgår fra nedenstående eksperimentelle del. Det kan imidlertid på dette punkt være nyttig kort å omtale forskjellige av de teknikker som benyttes ved konstruksjon av det rekombinante plasmid i den foretrukne utførelsen.

Kloningen og ekspresjonen av det syntetiske somatostatingenet benytter to plasmider. Hvert plasmid har et EcoRI-substrat-sete ved et forskjellig område det i strukturelle e-galakto-sldasegenet (se figurer 4 og 5). Innføringen av det syntetiske somatostatin-DNA-fragmentet 1 EcoRI-setene i disse plasmidene setter ekspresjonen av den genetiske Informasjon i dette fragmentet under kontroll av de lac-operon-kontrollerende elementer. Etter innføringen av somatostatinfragmentet i disse plasmidene bør translasjon resultere i et somatostatin-polypeptid som forutgås enten av 10 aminosyrer (pSOMl) eller av praktisk talt hele B-galaktosidase-underenhetsstrukturen (pSOMll-3).

Plasmidkonstruksjonsskjemaet starter med plasmid pBR322, en velkarakterisert kloningsvektor. Innføring av lac-elementene i dette plasmidet ble oppnådd ved innføring av et Haelll-restrlksjonsendonukleasefragment (203 nukleotider) Inneholdende lac-promotoren, CAP-blndingssetet, operator, ribosombindingssete og de første 7 aminosyrekodonene i det strukturelle p<->galaktosidasegenet. HaelII-fragmentet var avledet fra X-plac5-DNA. Det EcoRI-spaltede pBR322-plasmldet som hadde sine termini reparert med T4 DNA polymerase og deoksyribonukleotidtrifosfater, ble buttende-ligert til HaelII-fragmentet for å danne EcoRI-termini ved innskudds-punktene. Sammenføyning av disse Haelll- og reparerte EcoRI-termini utvikler EcoRI-restriksjonssete (se figur 4 og 5) ved hver terminus. Transformanter av E. coli RR1 med denne DNA ble valgt for resistens til tetracyklin (Tc) og ampicillin (Ap) på 5-brom-4-klor-indolylgalaktosid (X-gal)-medium. På dette indikatormediet blir kolonier som er grunnleggende for syntesen av P-galaktosldase, i kraft av det forøkede antall av titrerende repressor for lac-operatorer, identifisert ved deres blåfarge. To orienteringer av HaeIII-fragmentet er mulig, men disse var maskert av den asymmetriske beliggenhet til det Hha-restriksjonssetet i fragmentet. Plasmid pBHIO ble ytterligere modifisert for å eliminere EcoRI-endonuklease-setet distalt i forhold til lac-operatoren (pBH20).

De åtte kjemisk syntetiserte oligodeoksyribonukleotidene (figur 2) ble merket ved 5'-terminusene med [^<2>P]--y-ATP ved hjelp av polynukleotidkinase og sammenføyet med T4 DNA ligase. Gjennom hydrogenbinding mellom de overlappende fragmentene setter somatostatingenet seg selv sammen og polymriserer til slutt til store molekyler på grunn av de kohesive restriksjonssete-terminusene. De ligerte produktene ble behandlet med EcoRI- og BamHI-restriksjonsendonukleaser for å utvikle somatostatingenet som vist på figur 2.

Det syntetiske somatostatin-genfragmentet med EcoRI- og BamHI-termini ble ligert til pBH20-plasmidet, på forhånd behandlet med EcoRI- og BamHI-restriksjonsnukleaser og alkalisk fosfatase. Behandlingen med alkalisk fosfatase gir en molekylseleksjon for plasmider som bærer det innsatte fragmentet. Ampicillin-resistente transformanter oppnådd med denne ligerte DNA ble analysert med henblikk på tetracyklin-sensitivitet og flere ble undersøkt med hensyn til innføring av et EcoRI-BamHI-fragment av den hensiktsmessige størrelse.

Begge kjedene til EcoRI-BamHI-fragmentene i plasmider fra to kloner ble analysert ved nukleotidsekvensanalyse med utgangspunkt i BamHI- og EcoRI-setene. Sekvensanalysen ble utvidet inn i de lac-kontrollerende elementer; lac-fragmentsekvensen var intakt, og i et tilfelle, pSOMl, ble nukleotidsekvensen til begge kjedene uavhengig bestemt og hver ga den sekvens som er vist på figur 5A.

EcoRI-Pst-fragmentet i pSOMl-plasmidet, med det lac-kontrollerende element, ble fjernet og erstattet med EcoRI-Pst-fragmentet i pBR322 for fremstilling av plasmidet pSOMll. EcoRI-fragmentet i plac5, som bærer lac-operonkontrollområdet og mesteparten av det strukturelle p<->galaktosidasegenet, ble innsatt I EcoRI-setet i pSOMll. To orienteringer av EcoRI lac-fragmenet 1 X-plac^ var forventet. En av disse orien-teringene ville opprettholde den riktige leserammen i somatostatingenet, den andre ikke. Analyse av uavhengig isolerte kloner for somatostatinaktivitet identifiserte deretter kloner inneholdende det riktig orienterte genet hvorav klonen betegnet pSOMll-3 var en.

6. Mikroorganismen

Forskjellige encellede mikroorganismer har blitt foreslått som kandidater for transformasjon, slik som bakterier, sopp og alger. Dvs. de encellede organismer som kan dyrkes i kulturer eller som kan fermenteres. Bakterier er for det meste de mest hensiktsmessige organismer å arbeide med. Bakterier som er mottagelige for transformasjon innbefatter medlemmer blant Enterobacteriaceae, slik som stammer av Escherichia coli og Salmonella; Bacillaceae slik som Bacillus subtil is; Pneumococcus, Streptococcus og Haemophilus influenzae.

Den spesielt valgte organismen for somatostatinarbeidet som vil bli omtalt i det nedenstående, var E. coli stamme TT1, genotype: Pro-Leu-Thi~RB-Mj} rec A<+> Str<r> Lac y~. E. coli RR1 er avledet fra E. coli HB101 (H.W. Boyer et al., J. Mol. Biol. (1969) 41, 459-472) ved å krysse den med E. coli K12 stamme KL16 som Hfr-donor. Se J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972). Kulturer av både E. coli RR1 og E. coli RR1 (pBR322) har blitt deponert hos American Type Culture Collection uten begrensning hva angår adgang, henholdsvis ATCC nr. 31343 og 31344.

Den somatostatin-produserende organismen har likeledes blitt deponert (ATCC nr. 31447).

I tilfellet for humaninsulin ble A- og B-kjedegenene klonet i E. coli K12 stamme 294 (ende A, thi", hsr~, hsmk<+>), ATCC nr. 31446, og den organismen som ble benyttet ved ekspresjon av A-kjeden (E. coli K12 stamme 294 [pIAl], ATCC nr. 31448). B-kjeden i humaninsulin ble først uttrykt i et derivat av BH101, dvs. E. coli K12 stamme D1210 en lac<+> (i°o<+>z<t>y<+>), og den B-genholdige organismen har likeledes blitt deponert (ATCC nr. 31449). Alternativt kan B-genet innføres i og uttrykkes fra den organismen som ble nevnt først, dvs. stamme 294.

EKSPERIMENTELL DEL

I. SOMATOSTATIN

1. Konstruksjon av somatostatln- genfragmenter Åtte oligodeoksyribonukleotlder henholdsvis merket A til H på figur 2 ble først konstruert, hovedsakelig ifølge den modifiserte triestermetoden til K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975). I tilfellet for fragmentene C, E og H ble det imidlertid benyttet en forbedret teknikk hvori fullstendig beskyttede trimerer først fremstilles som basisenheter for bygging av lengre oligodeoksyribonukleotlder. Den forbedrede teknikken er skjematisk vist på figur 3

hvor B er tymin, N-benzoylert adenin, N-benzoylert cytosin eller N-isobutyrulert guanin. I korthet, og under henvisning til figur 3, gikk koblingsreaksjonen mellom et overskudd av I (2 mmol), og II (1 mmol) nesten til fullendelse i løpet av 60 minutter ved hjelp av en kraftig koblingsreagens, 2,4,6-triisopropylbenzensulfonyltetrazolld (TPSTe, 4 mmol; 2). Etter fjerning av den 5'-beskyttende gruppen med 2% benzen-sulfonsyreoppløsnlng kunne 5 *-hydroksyldimeren V separeres fra et overskudd av 3'-fosfodiestermonomer IV ved enkel oppløsningsmiddelekstraksjon med vandig NaHC03-oppløsnlng i CHCI3. Den fullstendig beskyttede trimerblokken ble fremstilt suksessivt fra 5'-hydroksyldimeren V, I (2 mmol), og TPSTe (4 mmol) og Isolert ved kromatografi på silisiumdioksydgel, som i B.T. Hunt et al., Chem. og Ind. 1967. 1868 (1967). Utbyttene av trimerer fremstilt Ifølge den forbedrede teknikken er vist i tabell II.

De åtte oligodeoksydribonukleotidene ble etter fjerning av alle beskyttende grupper renset ved høytrykksvæskekromato-grafi på "Permaphase AAX" (R.A. Henry et al., J. Chrom. Sei. II. 358 (1973)). Renheten av hver oligomer ble kontrollert ved homokromatografi på tynnsjikt DEAE-cellulose og også ved gelelektroforese i 20# akrylamidplate etter merking av ol i gorner ene med ("Y-<32p>)_ATP i nærvær av polynukleotidkinase. Et merket hovedprodukt ble oppnådd fra hvert DNA-fragment.

2. Ligering og akrvlamldgelanalvse av somatostatin DNA

5' OH-terminiene i de kjemisk syntetiserte fragmentene A til H ble fosforylert separat med T4-polynukleotidkinase. (<32>P)-"Y-ATP ble benyttet i fosforyleringen slik at reaksjons-produktene kunne overvåkes audioradiografisk, skjønt det vil forstås at umerket ATP også kunne benyttes der autoradiografi kunne greie seg uten. Like før kinasereaksjonen ble 25 uCi av (•y-<32>P)ATP (ca 1500 Ci/mmol) (Maxam og Gilbert, Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 74, 1507 (1977)) fordampet til tørrhet i 0,5 ml Eppendorf-rør. 5 pg fragment ble inkubert med 2 enheter av T4 DNA-kinase (hydroksylapatittfraksjon, 2500 enheter/ml; 27), i 70 mM Tris-HCl, pE 7,6, 10 mM MgCl2. 5 mM ditiotreitol i et totalvolum på 150 pl i 20 minutter ved 37*C. For å sikre maksimal fosforylering av fragmentene for ligeringsformål, ble 10 pl av en blanding bestående av 70 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP og 2 enheter DNA-kinase tilsatt og inkuberlng fortsatt i ytterligere 20 minutter ved 7°C. Fragmentene (250 ng/pl) ble lagret ved -20 "C uten ytterligere behandling. Kinasebehand-lede fragmenter av A, B, E og F (1,25 pg hver) ble ligert i et totalvolum på 50 pl i 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP og 2 enheter av T4 DNA-ligase (hydroksylapatittfraksjon, 400 enheter/l; 27), i 16 timer ved 4°C. Fragmenter C, D, G og H ble ligert under lignende betingelser, prøver av 2 pl ble fjernet for analyse ved elektroforese på en 10K> polyakrylamidgel fulgt av autoradiografi (H.L. Heyneker et al., Nature 263. 748 (1976)) hvor ureagerte DNA-fragmenter er representert ved hurtig migrer-ende materiale og hvor den monomere formen av de ligerte fragmentene migrerer med bromfenolblått-fargestoff (BPB). En viss dimerisering forekommer også på grunn av de kohesive endene til de ligerte fragmentene A, B, E og F, og de ligerte fragmentene C, D, G og H. Disse dimerene representerer det

materialet som migrerer langsomst og kan spaltes ved hjelp av restriksjonsendonuklease EcoRI og BamHI, respektivt.

De to halve molekylene (ligert A+B+E+Fog ligert C + D + G + H) ble samenføyet ved et ytterligere ligeringstrinn utført i et sluttvolum på 150 pl ved 4°C i 16 timer. 1 pl ble fjernet for analyse. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet i 15 minutter ved 65"C for å inaktivere T4 DNA-ligasen. Varme-behandlingen påvirker ikke migreringsmønsteret til DNA-blandingen. Tilstrekkelig restriksjonsendonuklease BamHI ble tilsatt til reaksjonsblandingen for å spalte de multimere formene av somatostatin DNA'en i 30 minutter ved 37<*>C. Etter tilsetning av NaCl til 100 mM ble DNA'en nedbrutt med EcoRI-endonuklease. Restriksjonsendonuklease-nedbrytningene ble terminert ved fenol-kloroform-ekstraksjon av DNA'en. Somatostatin DNA-fragmentet ble renset fra ureagerte og delvis ligerte DNA-fragmenter ved preparativ elektroforese på en 10$ polyakrylamidgel. Båndet inneholdende somatostatin DNA-fragmentet ble utskåret fra gelen og DNA'en ble eluert ved oppskjæring av gelen i små stykker og ekstrahering av DNA'en med elueringsbuffer (0,5 M ammoniumacetat, 10 mM MgCl2» 0,1 mM EDTA, 0,1* SDS) natten over ved 65<*>C. DNA * en ble utfelt med 2 volumdeler etanol, sentrifugert, gjenoppløst i 200 pl 10 mM Tris-HCl, pH 7,6 og dialysert mot den samme bufferen resulterende i en somatostatin DNA-konsentrasjon på 4 pg/ml.

3. Konstruksjon av rekombinante plasmider

Figur 4 viser skjematisk den måte på hvilken rekombinante plasmider omfattende somatostatingenet ble konstruert, og kan refereres til i forbindelse med følgende spesielle omtale.

A. Det parentale plasmid pBR322

Plasmidet valgt for eksperimentell somatostatin-kloning var pBR322, et lite (molekylvekt ca. 2,6 megadalton) plasmid inneholdende resistensgener til antibiotikaene ampicillin (Ap) og tetracyklin (Tc). Som angitt på figur 4, innbefatter ampicillin-resistensgenet et spaltningssete for restriksjonsendonukleasen Pstl, tetracyklin-resistensgenet innbefatter et lignende sete for restriksjonsendonuklease BamHI, og et EcoRI-sete er beliggende mellom Ap<r-> og TC<r->genene. Plasmidet pBR322 er avledet fra pBR313, et 5,8 megadalton Ap<r>Tc<r>Col<lmm->plasmid (R.L. Rodriquez et al., ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, 5, 471-77 (1976), R.L. Rodriquez et al., Construction. and Characterization of Cloning Vehicles, in Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression, s. 471-77, Academic Press, Inc. (1976). Plasmid pBR322 er karakterisert og metoden for dets oppnåelse fullt beskrevet i F. Bolivar et al., "Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II. A Multipurpose Cloning System", Gene (november 1977).

B. Konstruksjon av plasmid pBHIO

5 jjg av plasmid pBR322 DNA ble nedbrutt med 10 enheter av restriksjonsendonukleasen EcoRI i 100 mM Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl2 ved 37°C i 30 minutter. Reaksjonen ble terminert ved fenol-kloroform-ekstraksjon; DNA'en ble deretter utfelt med 2% volumdeler etanol og resuspendert i 50 pl T4 DNA-polymerasebuffer (67 mM Tris-HCl, pH 8,8, 6,7 mM MgCl2» 16,6 mM (NH4)2S04, 167 pg/ml bovin-serumalbumin, 50 pM av hver av dNTP'ene; A. Panet et al., Biochem. 12, 5045

(1973). Reaksjonen ble startet ved tilsetning av 2 enheter av T4 DNA-polymerase. Etter inkubasjon i 30 minutter ved 37'C ble reaksjonen terminert ved en fenol-kloroform-ekstraksjon av DNA *en fulgt av utfelling med etanol. 3 pg av X-plac<5> DNA (Shapiro et al., Nature, 224. 768 (1969)) ble nedbrutt i en time ved 37°C med restriksjonsenzymet Haelll (3 enheter) i 6 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6 mM MgCl2, 6 mM P-merkaptoetanol i et sluttvolum på 20 pl. Reaksjonen ble stoppet ved oppvarming i 10 minutter ved 65'C. Den pBR322-behandlede DNA ble blandet med den Hael 11-nedbrutte X-plac<*5> DNA og buttende-ligert I et sluttvolum på 30 pl med 1,2 enheter T4 DNA-ligase (hydroksylapatittfraksjon; A. Panet et al., supra) i 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM gCl2, 10 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP i 12 timer ved 12"C. Den ligerte DNA-blåndingen ble dialysert mot 10 mM Tris-HCl, pH 7,6 og benyttet for transformasjon av E. coli stamme RR1. Transformanter ble valgt for tetracyklin- og ampicillinresistens på minimumplater inneholdende 40 pg/ml 5-brom-4-klor-indolylgalaktosid (X-gal)-medium (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972)). Kolonier som er vesentlige for syntesen av p-galaktosidase ble identifisert ved deres blåfarge. Etter undersøkelse av 45 uavhengig isolerte blå kolonier ble tre av dem funnet å inneholde plasmid-DNA innholdende to EcoRI-seter adskilt ved ca. 200 basepar. Posisjonen for et asymmetrisk beliggende Hhal-fragment i 203 b.p. Haelll lac-kontroll-fragmentet (W. Gilbert et al., i Protein-Ligand Interactions, H. Sand og G. Blauer, Eds. (De Gruyter, Berlin (1975) , s. 193-210) muliggjør bestemmelse av orienteringen til Haelll-fragmentet, nå et EcoRI-fragment i disse plasmidene. Plasmid pBHIO ble vist å inneholde fragmentet i den ønskede orientering, dvs. at lac-transkripsjonen går inn i plasmidets Tc<r->gen.

C. Konstruksjon av plasmid pBH20

Plasmid pBHIO ble deretter modifisert for å eliminere EcoRI-setet distalt til lac-operatoren. Dette ble oppnådd ved selektiv EcoRI-endonukleasespaltlng ved det distale setet innebærende partiell beskyttelse ved hjelp av RNA-polymerase av det andre EcoRI-setet beliggende mellom Tc<r-> og lac-promotorene, som bare er ca. 40 basepar fra hverandre. Etter binding av RNA-polymerase ble DNA'en (5 pg) nedbrutt med EcoRI (1 enhet) i et sluttvolum på 10 pl i 10 minutter ved 37°C. Reaksjonen ble stoppet ved oppvarming ved 65"C i 10 minutter. De EcoRI-kohesive termini ble nedbrutt med Sl-nuklease i 25 mM Na-acetat, pH 4,5, 300 mM NaCl, 1 mM ZnCl2 ved 25°C i 5 minutter. Reaksjonsblandingen ble stoppet ved tilsetning av EDTA (10 mM sluttelig) og Tris-HCl, pH 8 (50 mM sluttelig). DNA'en ble fenol-kloroform-ekstrahert, etanol utfelt og resuspendert i 100 pl 1 T4 DNA-llgeringsbuffer. T4 DNA-ligase (1 pl) ble tilsatt og blandingen inkubert ved 12'C i 12 timer. Den ligerte DNA ble transformert i E. coli stamme RR1, og Ap<r>Tc<r->transformanter "ble selektert på X-gal-anti-biotikum-medium. Restriksjonsenzymanalyse av DNA utvalgt fra 10 isolerte blå kolonier viste at disse koloniene bar plasmid DNA med et EcoRI-sete. Syv av disse koloniene hadde bibeholdt EcoRI-setet beliggende mellom lac- og Tc<r->promotorene. Nukleotidsekvensen fra EcoRI-setet i lac-kontrollområdet i et av disse plasmidene, pBH20, ble bekreftet. Dette plasmidet ble deretter benyttet for å klone somatostatingenet.

D. Konstruksjon av plasmid pSOMl

20 pg av plasmidet pBH20 ble nedbrutt fullstendig med restriksjonsendonukleaser EcoRI og BamHI i et sluttvolum på 50 pl. Bakteriell alkalisk fosfatase ble tilsatt (0,1 enhet av Worthington BAPF) og inkubasjon ble fortsatt i 10 minutter ved 65°C. Reaksjonene ble stoppet ved fenol-kloroform-ekstraksjon og DNA'en ble utfelt med 2 volumdeler etanol, sentrifugert og oppløst 1 50 pl 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA. Behandlingen med alkalisk fosfatase hindrer på effektiv måte selviigering av den EcoRI, BamHI-behandlede pBH20 DNA, men sirkulære rekombinante plasmider Inneholdende somatostatin-DNA kan fremdeles dannes ved ligering. Siden E. coli RR1 transformeres med meget lav effektivitet av lineær plasmid-DNA, vil størsteparten av transformantene inneholde rekombinante plasmider. 50 pl somatostatin-DNA, (4 pg/ml) ble ligert med 25 pl av den BamHI, EcoRI, alkalisk fosfatase-behandlede pBH20 DNA *en 1 et totalvolum på 50 pl inneholdende 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP, og 4 enheter T4 DNA-ligase ved 22°C. Etter 10, 20 og 30 minutter ble ytterligere somatostatin-DNA (40 ng) tilsatt til reaksjonsblandingen (den gradvise tilsetning av somatostatin-DNA kan begunstige ligering til plasmidet over selviigering). Ligering ble fortsatt i en time fulgt av dialyse av blandingen mot 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. I et kontrollforsøk ble BamHI, EcoRI, alkalisk fosfatasebehandlet pBH20 DNA ligert i fravær av somatostatin-DNA under lignende betingelser. Begge preparater ble benyttet uten ytteligere behandling for å transformere E. coli RR1. Transformasjons-forsøkene ble utført 1 et P3-apparat (National Institutes of Health, USA, Recombinant DNA Research Guidelines, 1976). Transformanter ble selektert på minimalmediumplater inneholdende 20 jjg/ml AP og 40 pg/ml X-gal. 10 transformanter, som alle var følsomme overfor Tc, ble isolert. For referanse ble disse betegnet pSOMl, pS0M2, osv pSOMlO. I kontrollforsøket ble det ikke oppnådd noen transformanter. Fire av de ti transformantene inneholdt plasmider med både et EcoRI-sete og BamHI-sete. Størrelsen av det lille EcoRI, BamHI-fragmentet i disse rekombinante plasmidene var i alle tilfeller lik størrelsen til den in vitro-fremstilte somatostatin DNA. Basesekvensanalyse ifølge Maxam og Gilbert, Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 74, 560 (1977), viste at plasmidet pSOMl hadde det ønskede somatostatin DNA-fragmentet innskutt.

DNA-sekvensanalyse av klonen inneholdende plasmid pSOMl forutsier at det skulle produsere et peptid omfattende somatostatin. Ingen somatostatin-radloimmunaktlvitet har Imidlertid blitt detektert i ekstrakter av cellepellets eller kultursupernatanter, heller ikke har tilstedeværelsen av somatostatin blitt detektert når den voksende kulturen til-settes direkte til 70* maursyre og cyanogenbromid. E. coil RRl-ekstrakter har blitt observert å nedbryte eksogent somatostatin meget hurtig. Fraværet av somatostatin-aktivitet i kloner inneholdende plasmid pSOMl kunne godt resultere fra intracellulær nedbrytning av endogene proteolytiske enzymer. Plasmid pSOMl ble følgelig benyttet for å konstruere et plasmid som koder for et forløperprotein omfattende somatostatin og av tilstrekkelig størrelse som kunne forventes å motstå proteolytisk nedbrytning.

E. Konstruksjon av plasmider pSOMll og pSOMll- 3

Det ble konstruert et plasmid hvori somatostatingenet kunne lokaliseres ved C-terminusen i P-galaktosidasegenet, idet translasjonen ble holdt i fase. Tilstedeværelsen av et EcoRI-sete nær C-terminusen i dette genet og den tilgjengelige aminosyresekvensen i dette proteinet (B. Pol isky et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA 73, 3900 (1976), A.V. Fowler et al., Id. at 74, 1507 (1976), A-I- Bukhari et al., Nature New Biology 243, 238 (1973) og K.E. Langley, J. Biol. Chem., 250. 1587 (1975)) tillot Innføring av EcoRI, BamHI-somatostatingenet i EcoRI-setet under opprettholdelse av den riktige leserammen. For konstruksjon av et slikt plasmid, ble pSOMl DNA (50 jjg) nedbrutt med restriksjonsenzymene EcoRI og Pstl i et sluttvolum på 100 jil. En preparativ 5* polyakrylamidgel ble benyttet for å separere det store Pst-EcoRI-fragmentet som bærer somatostatingenet fra det lille fragmentet som bærer lac-kontrollelementene. Det store båndet ble utskåret fra gelen og DNA'en eluert ved oppkutting av gelen i små stykker og ekstrahering av DNA'en ved 65°C natten over. På lignende måte ble plasmid pBR322 DNA (50 jjg) nedbrutt med Pstl- og EcoRI-restriksjonsendonukleaser og de to resulterende DNA-fragmentene renset ved preparativ elektroforese på en 5* polyakrylamidgel. Det lille Pstl-EcoRI-fragmentet fra pBR322 (1 pg) ble ligert med det store Pstl-EcoRI DNA-fragmentet (5 pg) fra pSOMl i et sluttvolum på 50 pl med en enhet av T4 DNA-ligase ved 12 'C i 12 timer. Den ligerte blandingen ble benyttet for å transformere E. coli RR1, og transformanter ble selektert for ampicillinresistens på

X-gal-medium. Som forventet ga nesten alle Ap<r->transformantene (95*) hvite kolonier (ingen lac-operator) på X-gal-indikatorplater. Det resulterende plasmid, pSOMll, ble benyttet i konstruksjonen av plasmid pSOMll-3. En blanding av 5 pg pSOMll DNA og 5 pg \-plac<5> DNA ble nedbrutt med EcoRI (10 enheter i 30 minutter ved 37°C). Restriksjonsendonuklease-nedbrytningen ble terminert ved fenol-kloroform-ekstraksjon. DNA'en ble deretter etanolutfelt og resuspendert i T4 DNA-llgasebuffer (50 pl). T4 DNA-ligase (en enhet) ble tilsatt til blandingen og inkubert ved 12"C i 12 timer. Den ligerte blandingen ble dialysert mot 10 mM Tris-HCl, pH 7,6 og benyttet for å transformere E. coli stamme RR1. Transformanter ble selektert for Ap<r> på X-gal-plater inneholdende ampicillin og utvalgt for grunnleggende P-galaktosidase-produksjon. Omkring 2* av koloniene var blå (pSOMll-1, 11-2, osv.)» Restriksjonsenzymanalyse av plasmid DNA oppnådd fra disse klonene viste at alle plasmidene bar et nytt EcoRI-fragment av ca. 4,4 megadalton, som bærer lac-operon-kon-trollseter og mesteparten av p-galaktosidasegenet. Fordi to orienteringer av EcoRI-fragmentet er mulig, ble den asymmetriske beliggenhet av et Hindlll-restriksjonssete benyttet for å bestemme hvilken av disse koloniene som bar dette EcoRI-fragmentet med lac-transkripsjon videre inn i somatostatingenet. Hindlll-BamHI-dobbeltnedbrytninger indikerte at bare de kloner som bar plasmider pSOMll-3, pSOMll-5, pSOMll-6 og pSOMll-7 inneholdt EcoRI-fragmentet i denne orienteringen. 4. Radioimmunanalvse for somatostatlnaktlvltet Standardradiolmmunanalysene (RIA) for somatostatin (A. Arimura et al., Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 148. 784 (1975)) ble modifisert ved å nedsette analysevolumet og anvendelse av fosfatbuffer. Tyr<*!> somatostatin ble jodert ved bruk av en kloramin-T-metode. (Id.) For å analysere for somatostatin, ble prøven, vanligvis i 70* maursyre inneholdende 5 mg/ml cyanogenbromid, tørket i et konisk polypropylenrør (0,7 ml, Sarstedt) over fuktig KOH under vakuum. 20 pl PBSA-buffer (75 mM NaCl; 75 mM natriumfosfat, pH 7,2; 1 mg/ml bovinserum-albumin; og 0,2 mg/ml natriumazid) ble tilsatt, fulgt av 40 pl av en (<125>I) somatostatin-"cocktail" og 20 pl av en 1000-gangers fortynning PBSA av kanin-antisomatostatinimmunserum S39 (Vale et al., Metabolism, 25, 1491 (1976). Nevnte (<125>I)-somåtostatin-"cocktail" inneholdt pr. ml av PBSA-buffer: 250 pg normalt kanln-gammaglobulin (Antibodies, Inc.), 1500 enheter proteaseinhibitor ("Trasylol", Calbiochem) og ca. 100 000 tellinger av (125I )Tyr1:l-somatostatin. Etter minst 16 timer ved romtemperatur, ble 0,333 ml anti-kanin-gammaglobulin fra geit (Antibodies, Inc., P=0,03) i PBSA-buffer tilsatt til prøverørene. Blandingen ble inkubert i 2 timer ved 37°C, avkjølt til 5"C, deretter sentrifugert ved 10 000 x g i 5 minutter. Supernatanten ble fjernet og pelleten telt i en gamma-tefler. Med den benyttede mengde antiserum ble 20* av tellingene utfelt uten noe umerket konkurrerende somatostatin. Bakgrunnen med uendelig somatostatin (200 ng) var vanligvis 3*. Halvparten av maksimal konkurranse ble oppnådd med 10 pg somatostatin. Innledende forsøk med ekstrakter av E. coil stamme RR1 (resipient-stammen) indikerte at mindre enn 10 pg somatostatin lett kunne detekteres i nærvær av 16 pg eller mer av cyanogenbromid-behandlet bakterielt protein. Mer enn 2 pg protein fra maursyrebehandlede bakterielle ekstrakter forstyrret noe ved å øke bakgrunnen, men cyanogenbromid-spalting reduserte sterkt denne forstyrrelse. Rekonstruksjonsforsøk viste at somatostatin er stabilt i cyanogenbromid-behandlede ekstrakter.

A. Konkurranse av bakterielle ekstrakter

Stammer E. coli RR1 (pSOMll-5) og E. coli RR1 (pSOMll-4) ble dyrket ved 37" C til 5 x 10<8> celler/ml i Luria-bul jong. Deretter ble IPTG tilsatt til 1 mM og vekst fortsatt i 2 timer. 1 ml aliquoter ble sentrifugert i noen sekunder i en Eppendorf-sentrifuge og pelletene ble suspendert i 500 pl 70* maursyre inneholdende 5 mg/ml cyanogenbromid. Etter ca. 24 timer ved romtemperatur ble aliquoter fortynnet 10 ganger i vann og volumene angitt på figur 6A ble analysert i tre paralleller for somatostatin. På figur 6A er "B/Bq" forholdet , for (<125>j)-somatostatin bundet i nærvær av prøve til det som er bundet i fravær av konkurrerende somatostatin. Hvert punkt er i gjennomsnittet av tre parallelle rør. Protelninnholdet i de ufortynnende prøvene ble bestemt til 2,2 mg/ml for E. coli RR1 (pS0Mll-5) og 1,5 mg/ml for E. coli RR1 (pS0M-4).

B. Innledende screening av pSOMll- kloner for somatostatin Cyanogenbromid-behandlede ekstrakter av 11 kloner (pSOMll-2, pSOMll-3, osv.) ble fremstilt som beskrevet ovenfor for tilfellet i figur 6A. 30 pl av hvert ekstrakt ble tatt i tre paralleller for radioimmunanalyse, hvis resultater fremgår fra figur 6B. Området for analysepunkter er angitt. Verdiene for plkogram somatostatin ble avlest fra en standardkurve oppnådd som del av det samme forsøket. Radioimmunanalyseresultatene som hittil er beskrevet kan oppsummeres som følger. I motsetning til resultatene fra forsøk med pSOMl, ble fire kloner (pSOMll-3, 11-5, 11-6 og 11-7) funnet å ha lett detekterbar somatostatin-radioimmunaktivitet, figurer 6A og 6B. Restriksjonsfragmentanalyse viste at pSOMll-3, pSOMll-5, pSOMll-6 og pSOMll-7 hadde den ønskede orientering av lac-operonet, mens pSOMll-2 og 11-4 hadde motsatt orientering. Det er således en perfekt korrela-sjon mellom den korrekte orientering av lac-operonet og produksjonen av somatostatin-radioimmunaktivitet.

C. Effekter av IPTG- induksjon og CNBr- spalting

på positive og negative kloner

Konstruksjonen av somatostatinplasmidet forutsier at syntesen av somatostatin vil være under kontroll av lac-operonet. Lac-repressorgenet er ikke inkludert i plasmidet og resipient-stammen (E. coli RR1) inneholder det kromosomale lac-repressor-villtypegenet som bare produserer 10-20 repressor-molekyler pr. celle (15). Plasmid-kopitallet (og derfor antall lac-operatorer) er omkring 20-30 pr. celle, slik at fullstendig represjon er umulig. Som vist i nedenstående tabell III, ble den spesifikke aktiviteten til somatostatin I E. coli RR1 (pSOMll-3) øket av IPTG, en induser i lac-operonet. Som forventet var induksjonsnivået lavt, og varierte fra 2,4 til 7 ganger. I forsøk 7 (tabell III) ble

a-aktlvitet, som er et mål for de første 92 aminosyrene i

p-gal aktos i dase, også indusert med en faktor på to. I flere forsøk kan det ikke detekteres noen somatostatin-radioimmunaktivitet før cyanogenbromidspaltlng av det totale celleproteinet. Siden antiserumet benyttet i radioimmunanalysen, S39, krever et fritt N-terminalalanin, ble ingen aktivitet forventet før cyanogenbromid-spalting.

D. Gelfiltrering av cyanogenbromid- behandlede ekstrakter

Maursyre og cyanogen-behandlede ekstrakter av de positive klonene (pSOMll-3, 11-5, 11-6 og 11-7) ble oppsamlet (totalt volum 250 pl), tørket og resuspendert i 0,1 ml 50* eddiksyre.

(<3>H)leucin ble tilsatt og prøven ble påført på en 0,7 x 47 cm kolonne av Sephadex G-50 i 50* eddiksyre. 50 pl aliquoter av kolonnefraksjonene ble analysert for somatostatin. Oppsamlede negative kloneekstrakter (11-2, 11-4 og 11-11) ble behandlet

på identisk måte. Resultatene fremgår fra figur 5C. På den samme kolonnen elueres kjent somatostatin (Beckman Corp. ) som angitt (SS). I dette systemet blir somatostatin godt separert fra ekskluderte store peptider og fullstendig inkluderte små molekyler. Bare ekstrakter av kloner som er positive for somatostatin viste radioimmunaktivitet i kolonnefraksjonene og denne aktiviteten elueres i samme posisjon som kjemisk syntetisert somatostatin.

OPPSUMMERING AV AKTIVITETSINFORMASJON

De data som fastslår syntesen av et polypeptid Inneholdende somatostatin-aminosyresekvensen kan oppsummeres som følger: (1) Somatostatin-radioimmunaktivitet er tilstede i E. coli-celler som har plasmidet pSOMll-3, som inneholder et somato-statingen med bevist korrekt sekvens og har den korrekte orientering av lac-EcoRI DNA-fragmentet. Celler med det beslektede plasmid pSOMll-2, som har det samme somatostatingenet, men en motsatt orientering av lac-EcoRI-fragmentet, produserer ingen detekterbar somatostatinaktivitet; (2) som forutsagt av konstruksjonsskjemaet observeres ingen detekterbar somatostatin-radiolmmunaktivitet før etter cyanogen-bromidbehandling av celleekstraktet; (3) somatostatinaktiviteten er under kontroll av lac-operonet hvilket kunne vises ved induksjon av IPTG, en induser for lac-operonet; (4) somatostatinaktiviteten vil utkromatograferes med kjent somatostatin på Sephadex G-50; (5) DNA-sekvensen til det klonede somatostatingenet er korrekt. Dersom translasjon er ute av fase, vil det dannes et peptid som er forskjellig fra somatostatin i hver posisjon. Radioimmunaktivitet detekteres hvilket indikerer at det dannes et peptid som er nær be-slektet med somatostatin, og translasjon må være i fase. Siden translasjon foregår i fase, vil den genetiske koden sørge for at et peptid med den eksakte sekvensen til somatostatin dannes; (6) Til slutt, de ovenfor angitte prøver av E. coli RR1 (pSOMll-3)-ekstrakt inhiberer frigjøringen av veksthormon fra rottehypofyseceller, mens prøver av E. coli RR1 (pSOMll-2) fremstilt i parallell og med identisk protein-konsentrasjon, ikke har noen effekt på veksthormonfrigjøring.

STABILITET. UTBYTTE OG RENSING AV

SOMATOSTATIN

Stammene inneholdende EcoRI-lac-operonfragmentet (pSOMll-2, pSOMll-3, osv.) segregeres med hensyn til plasmid-fenotypen. F.eks., etter ca. 15 generasjoner var ca. halvparten av E. coli RR1 (pSOMll-3)-kulturen konstltutiv for P-galaktosidase, dvs. inneholdt lac-operatoren, og av disse var ca. halvparten ampicillinresistente. Stammer som var positive (pSOMll-3) og negative pSOMll-2) for somatostatin er ustabile og derfor skriver vekstskjevheten seg sannsynligvis fra overproduksjon av stor, men ufullstendig og inaktiv galaktosidase. Utbyttet av somatostatin har variert fra 0,001 til 0,03* av det totale celleprotein (Tabell I) sannsynligvis som resultat av seleksjon for celler i kultur som har plasmider med et fjernet lac-området. De høyeste utbyttene av somatostatin har vært fra preparater hvor vekst ble startet fra en enkelt ampicillinresistent, konstltutiv koloni. Selv i disse tilfellene hadde 30* av cellene ved innhøsting utelatelser av lac-området. Lagring i frosset tilstand, (lyofilisering) og vekst for innhøsting fra en enkel slik koloni er følgelig indikert for det beskrevne system. Utbytter kan økes f.eks. ved å benytte bakteriestammer som overproduserer lac-repressor slik at ekspresjon av forløperprotein blir vesentlig fullstendig undertrykket før induksjon og innhøsting. Alternativt og som tidligere omtalt, kan et tryptofan-system eller annet operator-promotorsystem som vanligvis er fullstendig undertrykket, benyttes.

I råekstraktet som resulterer fra cellenedbrytning 1 f.eks. en Eaton-presse, er p-galaktosidase-somatostatin-forløper-proteinet uoppløselig og finnes i den første pelleten fra lavhastighetssentrifugering. Aktiviteten kan oppløseliggjøres i 70* maursyre, 6M guanididiumhydroklorid, eller 2* natrium-dodecylsulfat. Mest foretrukket blir imidlertid råekstraktet fra Eaton-pressen ekstrahert med 8M urea og resten spaltet med cyanogenbromid. I Innledende forsøk har somatostatin-aktlvltet avledet fra E. coli stamme RR1 (pSOMll-3) blitt anriket omkring 100-ganger ved alkoholekstraksjon av spalt-ningsproduktet og kromatografi på Sephadex G-50 i 50* eddiksyre. Når produktet igjen kromatograferes på Sephadex G-50 og deretter utsettes for høytrykks-væskekromatografi, kan vesentlig ren somatostatin oppnås.

II. HUMANINSULIN

De ovenfor beskrevne teknikker ble deretter benyttet på fremstillingen av humaninsulin. Genene for insulin-B-kjede (104 basepar) og for insulin-A-kjede (77 basepar) ble således konstruert fra aminosyresekvensen i human-polypeptidene, hver med enkelt-kjedede kohesive termini for EcoRI- og BamHI-restrlksjonsendonukleasene og hver konstruert for separat innføring i pBR322-plasmider. De syntetiske fragmentene, deka- til pentadeka-nukleotider, ble syntetisert ved blokk-fosfotriestermetoden under anvendelse av trinukleotider som byggeblokker og til slutt renset ved høyeffektiv væskekromatografi (HPLC). De syntetiske gener for humaninsulin A-og B-kJede ble deretter klonet separat i plasmid pBR322. De klonede syntetiske genene ble sammensmeltet med et E. coli p-galaktosidasegen som tidligere for tilveiebringelse av effektiv transkripsjon, translasjon og et stabilt forløper-protein. Insulinpeptider ble spaltet fra p-galaktosidase-forløper, detektert ved radioimmunoanalyse, og renset. Insulin-radioimmunoanalyseaktivitet ble deretter utviklet ved blanding av E. coli-produktene.

1. Konstruksjon og syntese av humaninsulingener Genene konstruert for humaninsulin er vist på figur 9. Genene for humaninsulin, B-kjede og A-kjede, ble konstruert fra aminosyresekvensen i humanpolypeptidene. 5'-endene i hvert gen har enkeltkjedede kohesive termini for EcoRI- og BamHI-restriksjonsendonukleaser, for korrekt innsetning av hvert gen i plasmid pBR322. Et HindlH-endonukleasegJenkJennelses-sete ble Inkorporert i midten av B-kJedegenet for aminosyresekvensen Glu-Ala for å tillate amplifikasjon og verifisering av hver halvpart av genet separat før konstruksjon av hele B-kjedegenet. B-kJede- og A-kJedegenene ble konstruert til å bli bygget fra 29 forskjellige oligodeoksyribonukleotider, varierende fra dekamer til pentadekamerer. Hver pil indikerer fragmentet syntetisert ved den forbedrede fosfotriester-metoden, Hl til H8 og Bl tiil B12 for B-kJedegenet og Al til All for A-kJedegenet. 2. Kjemisk syntese av oligodeoksyribonukleotider Materialer og metoder for syntese av oligodeoksyribonukleotider var vesentlig de som er beskrevet i Itakura, K. et al.,

(1975) J. Biol. Chem. 250. 4592 og Itakura, K. et al., (1975) J. Amer. Chem. Soc. 97, 7327 med unntagelse for disse modifikasjonene: a) De fullstendig beskyttede mononukleotidene, 5'-0-dimet-oksytrityl-3'-p-klorfenyl-e-cyanoetylfosfater, ble syntetisert fra nukleosldderlvatene under anvendelse av det monofunksjonelle fosforyleringsmldlet p-klorfenyl-p-cyanoetyl-fosforokloridat (1,5 molarekvivalent) i aceto-nitril i nærvær av 1-metylimidazol Van Boom, J.H. et al.,

(1975) Tetrahedron 31, 2953. Produktene ble isolert i stor

målestokk (100-300 g) ved preparativ væskekromatografi (Prep 500 LC, Waters Associates).

b) Ved bruk av oppløsnlngsmiddelekstraksjonsmetoden (Hirose, T. et al., (1978) Tetrahedron Letters, 2249) ble 32

bifunksjonelle trimerer syntetisert (se tabell IV) i 5-10 mmol-målestokk, og 13 trimerer, 3 tetramerer og 4 dimerer som 3'-terminusblokker, 1 en 1 mmol-skala. Homogeniteten til de fullstendig beskyttede trimerene ble kontrollert ved tynnsjiktkromatografi på silislumdioksydgel i to metanol/klorform-oppløsningsmiddelsystemer: Oppløsnings-middel a, 5* v/v og oppløsningsmiddel b, 10* v/v (se

tabell IV). Med utgangspunkt 1 dette bibliotek av forbin-delser ble 29 oligodeoksyribonukleotider med definert sekvens syntetisert, 18 for B-kjedegenet og 11 for A-kjedegenet.

De grunnleggende enheter som ble benyttet for å konstruere polynukleotider var to typer av trimerblokk, dvs. de bifunksjonelle trlmerblokkene i tabell IV og tilsvarende 3'-terminustrimerer beskyttet med en anisoylgruppe ved 3'-hydroksy. Den bifunksjonelle trimeren ble hydrolysert til den tilsvarende 3'-fosfodiesterkomponenten med en blanding av pyridin-trietylamln-vann (3:1:1 v/v) og også til den tilsvarende 5'-hydroksylkomponenten med 2% benzensulfonsyre. Den tidligere nevnte 3'-terminusblokken ble behandlet med 2* benzensulfonsyre for oppnåelse av tilsvarende 5'-hydroksyl. KoblIngsreaksjonen av et overskudd av 3'-fosfodiestertrimeren (1,5 molarekvivalent) med 5'-hydroksylkomponenten, imidlertid oppnådd, (1 molarekvivalent) i nærvær av 2,4,6-triisopropyl-benzensulfonyltetrazolid (TPSTe, 3-4 ekvivalenter) var nesten fullstendig i løpet av 3 timer. For å fjerne overskuddet av 3'-fosfodiester-blokkreaktanten ble reaksjonsblandingen ført gjennom en kort silisiumdioksydgelkolonne montert på et sintret glassfilter. Kolonnen ble vasket, først med CHCI3 for å eluere noen biprodukter og koblingsreagensen, og deretter med CHCl3:MeOH (95:5 v/v) hvori nesten alt av den fullstendig beskyttede polymeren ble eluert. Under disse betingelsene forble den tilførte 3'-fosfodiester-blokkreaktanten i kolonnen. På samme måte ble blokk-koblinger gjentatt inntil den ønskede lengde var konstruert. Høyeffekt-væskekromatografi (HPLC) ble benyttet i omfattende grad tinder ol igonukleotldsyntese for a) analyse av hver trlmer- og tetramer-blokk, b) analyse av mellomproduktfrag-mentene (heksamerer, nonamerer og dekamerer), c) analyse av den siste koblingsreaksjonen, og d) rensing av sluttproduk-tene. HPLC ble foretatt ved bruk av en Spectra-Physics 3500B væskekromatograf. Etter fjerning av alle beskyttende grupper med kons. NH4OH ved 50°C (6 timer) og 80* AcOH ved romtemperatur (15 min.), ble forbindelsene analysert på en Permaphase AAX (DuPont) (Van Boom, J. et al., (1977) J. Chromatography 131. 169)-kolonne (1 mx 2 mm), ved bruk av en lineær gradient av oppløsningsmiddel B (0,05 M KH2<p>o4 - 1,0 M KC1, pH 4,5) i oppløsnlngsmiddel A (0,01M KH2P04, pH 4,5). Gradienten ble dannet ved å starte med buffer A og påføre 3* buffer B pr. minutt. Elueringen ble utført ved 60°C med en strømnings-hastighet på 2 ml pr. minutt. Rensingen av de 29 slutt-oligonukleotidene ble også utført på Permaphase AAX, under de samme betingelsene som rapportert ovenfor. Den ønskede toppen ble oppsamlet, avsaltet ved dialyse og lyofllisert. Etter merking av 5'-terminiene med (7-<32p>)ATP ved bruk av T4 polynukleotidkinase, ble homogeniteten til hvert oligo-nukleotid kontrollert ved elektroforese på en 20* polyakrylamidgel . 3. Sammensetning og kloning av B- k. 1edegenet og A- k. 1edegenet Genet for B-kjeden i insulin ble konstruert til å ha et EcoRI-restriksjonssete på den venstre enden, et Hindlll-sete i midten og BamHI-sete ved den høyre enden. Dette ble foretatt slik at begge halvdeler, den venstre EcoRI-Hindlll-halvdelen (BH) og den høyre Hindlll-BamHI-halvdelen (BB), kunne klones separat i den hensiktsmessige kloningsvektoren pBR322 og etter at deres sekvenser var blitt verifisert, sammenføyes for oppnåelse av det komplette B-gen (figur 10). BB-halvdelen ble sammensatt ved ligering fra 10 oligodeoksyribonukleotider, merket Bl ti B10 på figur 9, fremstilt ved kjemisk fosfotriestersyntese. Bl og B10 ble Ikke fosforylert og derved ble uønsket polymerisering av disse fragmentene gjennom deres kohesive ender (Hindlll og BamHI) eliminert. Etter rensing ved preparativ akrylamidgel-elektroforese og eluering av det største DNA-båndet, ble BB-fragmentet Innsatt i plasmid pBR322 som hadde blitt spaltet med Hindlll og BamHI. Omkring 50* av de ampiclllin-resistente koloniene oppnådd fra DNA'en var følsomme overfor tetracyklin, hvilket indikerer at et lkke-plasmid HindiII-BamHI-fragment hadde blitt innført. De små HindiII-BamHI-fragmentene fra fire av disse koloniene (pBBlOl til pBB104) ble sekvensert og funnet å være korrekte som konstruert.

BH-fragmentet ble fremstilt på lignende måte og innført i pBR322 som hadde blitt spaltet med EcoRI- og Hindlll-restriksjonsendonukleaser. Plasmider fra tre ampiclllin-resistente, tetracyklln-følsomme transformanter (pBHl til pBH3) ble analysert. De små EcoRI-HindiII-fragmentene ble funnet å ha den forventede nukleotldsekvens.

A-kjedegenet ble sammensatt i tre deler. De venstre fire, de midtre fire og de høyre fire oligonukleotidene (se figur 9) ble ligert separat, deretter blandet og ligert (oligo-nukleotlder Al og A12 var ufosforylert). Det sammensatte A-kjedegenet ble fosforylert, renset ved gelelektroforese og klonet i pBR322 ved EcoRI-BaHI-setene. EcoRI-BaHI-fragmentene fra to ampiclllin-resistente, tetracyklin-følsomme kloner (pA10, pAll) inneholdt den ønskede A-gensekvensen. 4. Konstruksjon av <p>lasmider for ekspresjon av A- og B-insulingener .

Figur 10 illustrerer konstruksjonen av lac-insulin B-plasmid (pIBl). Plasmider pBHl og pBBlOl ble nedbrutt med EcoRI- og Hindlll-endonukleaser. Det lille BH-fragmentet i pBHl og det store fragmentet i pBBlOl (inneholdende BB-fragmentet og mesteparten av pBR322) ble renset ved gelelektroforese, blandet og ligert i nærvær av EcoRI-spaltet X-plac 5. EcoRI-megadaltonfragmentet i X-plac 5 inneholder lac-kontrollområdet og størstedelen av det strukturelle p-galaktosidasegenet. Konfigurasjonen av restriksjonssetene sikrer korrekt sammenbinding av BH til BB. Lac-EcoRI-fragmentet kan innføres i to orienteringer; således bør en halvdel av klonene oppnådd etter transformasjon ha den ønskede orientering. Orienteringen av ti ampiclllin-resistente, p-galaktosidase-konstitu-tive kloner ble kontrollert ved restriksjonsanalyse. Fem av disse koloniene inneholdt hele B-gensekvensen og den korrekte leserammen fra p<->galaktosidasegenet inn i B-kjedegenet. Et, pIBl, ble valgt for etterfølgende forsøk.

I et lignende forsøk ble 4,4 lac-megadaltonfragmentet fra X-plac 5 innført i pAll-plasmidet ved EcoRI-setet til dannelse av pIAl. pIAl er identisk med pIBl med unntagelse for at A-genfragmentet er Innsatt Istedenfor B-genfragmentet. DNA-sekvensanalyse viste at de korrekte A- og B-kjedegensekven-sene var bibeholdt i pIAl og pIBl, respektivt.

5. Ekspresjon

De stammer som inneholder insulingenene korrekt festet til p-galaktosidase produserer begge store mengder av et protein som har størrelse som P-galaktosidase. Omkring 20* av det totale celleproteinet var denne p-galaktosidase-insulin A-eller B-kjedehybrid. Hyridproteinene er uoppløselige og ble funnet i den første pelleten oppnådd ved lav hastighet hvor de utgjør ca. 50* av proteinet.

For å detektere ekspresjonen av insulin A- og B-kjedene ble det benyttet en radioimmunoanalyse (RIA) basert på rekonstituering av fullstendig insulin fra de separate kjedene. Insulin-rekonstitueringsmetoden ifølge Katsoyannis et al.

(1967) Biochemistry 6, 2642-2655, tilpasset til et 27-pl analysevolum, representerer en meget egnet analyse. Lett detekterbar insulinaktivitet oppnås etter blanding og rekonstituering av S-sulfonerte derivater i insulinkjedene. De separate S-sulfonerte kjedene i insulin reagerer ikke signifikant etter reduksjon og oksydasjon, med det benyttede anti-insulin-antistoffet.

For å anvende rekonstitueringsanalysen ble e-galaktosidase-A-eller -B-kjedehybridgenet delvis renset, spaltet med cyanogenbromid, og S-sulfonerte derivater ble dannet.

Beviser for at man har oppnådd korrekt ekspresjon fra kjemisk syntetiserte gener for humaninsulin kan oppsummeres som følger: a) Radioimmunaktivitet har blitt detektert for begge kjeder b) DNA-sekvensene oppnådd etter kloning og plasmid-konstruksjon har blitt direkte verifisert til å være korrekte slik som konstruert. Siden radioimmunaktivitet oppnås, må translasjon være i fase. Derfor sørger den genetiske koden for at peptider med sekvensene til humaninsulin produseres. c) E. coli-produktene oppfører seg etter cyanogenbromid-spalting, som Insulinkjeder i tre forskjellige kromato-grafiske systemer som separerer ifølge forskjellige prin-sipper (gelfiltrering, kloneutveksling og reversfase-HPLC). d) Den E. coli-produserte A-kjeden har blitt renset i liten målestokk ved hjelp av HPLC og har den korrekte aminosyre-sammensetning.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et spesifikt pattedyrpoly-peptid, f.eks. somatostatin eller A-kjeden eller B-kjeden i humaninsulin, eller et mellomprodukt for dette ved ekspresjon av heterolog DNA-sekvens i et rekombinant bakterieplasmid,karakterisert ved at det som DNA-sekvens anvendes en heterolog DNA-sekvens som koder for det spesifikke polypeptid, hvilken sekvens forutgåes av en DNA-sekvens som koder for et polypeptid ulikt det spesifikke pattedyrpolypeptidet slik at ekspresjon gir et fusjonspolypeptid omfattende begge nevnte polypeptider, idet det befinner seg et selektiv spaltningssete tilstøtende pattedyrpolypeptid-aminosyresekvensen.