NO841276L - Rekombinant dna-koding for et polypeptid som utviser melkesammenloepende aktivitet - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører koaguleringen av melk som brukes som et trinn i fremgangsmåten for å fremstille ost. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen syntesen hvor rekombinante DNA-teknikker brukes på et polypeptid avledet fra kalverennin som gir melkekoagulerende virkning.

Med fremkomsten av rekombinant DNA-teknologi er det nå mulig å innføre fremmede gener i mikroorganismer og regulere deres ekspresjonsnivå.

De mange proteinene som utgjør levende organismer, er ekspresjonsproduktene av informasjonen som finnes i deoxy-ribonucleinsyre (DNA). Denne informasjon er innkodet ved hjelp av rekkefølgen av nucleinsyrebasene i den rettkjedede DNA-sekvens. De fire basene, adenin (A), thymin (T), cyto-

sin (C) og guanin (G), er arrangert i en rettkjedet sekvens som en enkel kjede av DNA, og hver triplett av baser, kalt et codon, definerer en enkelt aminosyre. Ettersom det er 64 mulige kombinasjoner av baser og kun 20 aminosyrer, kan noen aminosyrer være definert ved hjelp av flere codoner. 3 av codonene angir ikke-aminosyresignaler.

Rekkefølgen av codoner som styrer syntesen av et enkelt polypeptid, er kjent som et strukturelt gen. Regulerende sekvenser på hver side av det strukturelle gen kontrollerer polypeptidnivået som syntetiseres i en celle.

Informasjonen som finnes i DNA* en transkriberes, over i;et mellomprodukt, kalt budbringer-ribonucleinsyre (mRNA);hvor DNA-basen T er erstattet av en særskilt RNA-base ura-;cil (U). Denne mRNA oversettes så til et polypeptid ved hjelp av virkningen av et ribosom. ;Genekspresjon moduleres ved hjelp av de ovenfor nevnte regulerende DNA-sekveriser både i transkripsjon til RNA'en og translasjon til proteinet. Transkripsjon av DNA til mRNA kon-trolleres av promotersekvenser ved siden av det strukturelle gen. ;Etter oppstartingen av transkripsjon binder ribosomer;seg til en bestemt sekvens nær begynnelsen av mRNA-transkriptet. Translasjon initieres ved et startsignal-codon som praktisk talt alltid er et methionin-codon (AUG). For å oppnå virksom transkripsjon og translasjon av nucleinsyre-codonet er det ;således nødvendig å ha et strukturelt gen, et promoterområde,;et sete for ribosombinding og en translasjonsinitiator.;For å fremstille rekombinant DNA som inneholder de ovenfor nevnte elementer og som vil uttrykke fremmede gener i en vertcelle, renser man først mRNA fra vev som uttrykker det ønskede polypeptid. Den strukturelle gen-DNA kan rekonstrueres fra mRNA-sekvensen ved hjelp av enzymet revers transeriptase, som er blitt isolert fra et fugle-retrovirus. Denne komplementære DNA (cDNA) kan så knyttes til den bakterielle DNA ved å bruke enzymet DNA-ligase isolert fra bakteriofag T4. Den bakterielle DNA som brukes i denne ligering, er kjent som kloningsvektoren og er vanligvis en ekstrakromosomal DNA-sekvens som replikerer autonomt, og som kalles et plasmid. ;Denne autonome replikasjon er fordelaktig ettersom cellen ved hjelp av passende manipulering kan bli indusert til å replikere en rekke kopier av det rekombinante plasmid og således fortrinnsvis uttrykke de ønskede produkter. Videre inneholder plasmider vanligvis strukturelle gener som innehar resistens overfor antibiotika og andre vekst-inhibitorer, og celler som inneholder de fullstendige plasmider, kan derfor påvises ved passende utsorteringsteknikker. Det rekonstruerte, rekombinante plasmid kan innføres direkte i vertcellen ved hjelp av en fremgangsmåte som er kjent som transformasjon. ;For å oppnå store mengder av den rekombinante DNA kan plasmid-DNA induseres til å replikere i svært høye kopiantall i vertcellen ved hjelp av en fremgangsmåte kjent som forsterk-ning. Den innførte eukaryote DNA kan så fjernes fra kloningsvektor-DNA'en ved spalting med restriksjons-endonucleaser som spalter DNA'en i nøyaktig definerte sekvenser. Denne spalt- ;ing danner vanligvis cohesive ender sCm lett kan ligeres på nytt. ;Ekspresjon av den eukaryote DNA i fremmede celler be-virkes ved hjelp av innføringen av en sterk promotersekvens og ribosombindende sete ved siden av starten til det strukturelle gen. De mRNA-strukturelle gener "avleses" vanligvis av det cellulære maskineri kun i én retning. Avlesningen skjer fra 5'-enden mot 3'-enden, og dette definerer "strømningsretningen" til RNA'en. Kontrollsekvenser slik som promoterer og ribosombindende seter befinner seg "oppstrøms" fra det strukturelle gen. Disse kontrollsekvenser avledes fra normale vert-cellegener som kan reguleres ved hjelp av passende bakterielle cofaktorer. En virksom ekspresjonsvektor kan konstrueres ved å bruke regulerende sekvenser hos vertcellen og et selekterbart plasmidgen som gir resistens overfor en passende vekstinhibitor. Vertceller som inneholder det fullstendige rekombinante plasmid, kan således påvises, og proteinsyntese-nivåer fra det klonede gen kan forhøyes betydelig ved behandling med den passende cofaktor. ;Så snart det eukaryote gen er blitt uttrykt i vertcellen, må polypeptidet renses og, i mange tilfeller, må enzymet utvinnes . ;Rennin, også kjent som chymosin (EC3.4.23.4), er den aktive bestanddel i rennet som brukes til å koagulere melk i fremgangsmåten for ostefremstilling. Kommersielle preparater av kalverennet fåes fra slimhinnef6ringen av den fjerde magen i ikke-avvente kalver (løypemagen). En reduksjon i dagens kalvemarked og derav følgende økning i ostekonsumering har tvunget meieriindustrien til å finne substitutter for kalverennet. Faktisk finnes det kun tilstrekkelig kalverennet til å forsyne 20% av ostemarkedet. ;Proteinaser isolert fra sopper har vært anvendt i for-bindelse med eller som et substitutt til storferennet. Se f.eks. US patentskrift nr. 3 151 039 og 3 212 905. Disse aspartat-proteinaser har imidlertid et bredere substratområde og er mer stabile under melkekoaguleringsprosessen. Denne økning i proteolytisk aktivitet og i stabilitet kan endre smaken og konsistensen av det endelige osteprodukt. Videre er tap av protein under ostefremstilling ofte større med rennet-substitutter, noe som forårsaker et lavere utbytte. ;For å gi meieriindustrien et enzympreparat som er et polypeptid avledet fra autentisk storfe-rennet og som er renset fra en ikke-animalsk kilde, har rekombinante DNA-teknikker vært anvendt. ;Storfe-rennin syntetiseres i to aktive former, chymosin-A og chymosin-B som adskiller seg fra hverandre bare ved en enkel aminosyre i posisjon nr. 290. Rennin syntetiseres som en forløper som inneholder et enkelt peptid med 16 aminosyrer. Harris, T.J.R., et al., Nucl. Acids Res. 10:2177-87 (1982); Moir, D., et al., Gene, 19:127-38 (1982). Dette signal-peptid spaltes etter hvert som proteinet skilles ut fra cellen. Når zymogenet, kalt prorennin, først er utskilt, gjennomgår det aktivering under de sure betingelser i magen slik at fullt ferdig rennin frembringes. Aktiveringen er åpenbart selv-katalyserende og kan oppstå i trinn. (B. Foltmann, Trav. ;Lab. Carlsberg, 3S:143-231 (1966)). I prorennin kan to peptid-bindinger spaltes autokatalytisk, Phe-Leu-bindingen mellom aminosyrene 28 og 29, og Phe-Gly-bindingen mellom aminosyrene 4 2 og 43. Undersøkelser in vitro har indikert at ved pH 2 spaltes fortrinnsvis den første bindingen slik at pseudorennin frembringes, mens ved pH 4,7 spaltes den andre bindingen slik at fullt ferdig rennin frembringes. Begge rennin-former virker virker koagulerende på melk. ;Det har vært gjort forsøk på å fremstille autentisk rennin ved hjelp av rekombinante DNA-enheter. Se f.eks. Alford, B.L. et al., EP patentsøknad nr. 82100124.5 inngitt 8. januar 1982. Fremgangsmåtene krever imidlertid kompliserte konstruksjonsstrategier for å gjøre det strukturelle rennin-genet fullstendig og lider av lav ekspresjonseffektivitet. ;Det er følgelig et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et aktivt polypeptid som kan brukes av meieriindustrien som et substitutt for storferennin. ;Det er videre et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe levende celler som inneholder rekombinant DNA-materiale som med høy effektivitet syntetiserer et polypeptid med melkekoagulerende virkning. ;Det er nok et mål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe alternativ rekombinant DNA som kan tilpasses bestemte vertcellekulturer. ;Det er et annet formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe DNA-sekvenser avledet fra storferennin som koder for polypeptider med melkekoagulerende virkning. ;Det er et annet formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe fremgangsmåter for syntese av polypeptider som er bestemt av DNA-sekvenser avledet fra storferennin, i en bakteriecelle. ;Det er et annet formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe fremgangsmåter for å utvinne polypeptider som er syntetisert i bakterieceller som inneholder DNA-sekvenser avledet fra storferennin og som er i stand til å koagulere melk. ;Det er nok et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe fremgangsmåter for å konstruere rekombinant DNA som innlemmer DNA-sekvenser avledet fra storferennin. ;Det er enda et annet formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe fremgangsmåter for koagulering av melk ved å bruke polypeptider med melkekoagulerende virkning som er syntetisert fra DNA-sekvenser avledet fra storferennin. ;I henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringes det fremgangsmåter og sammensetninger for syntetisering i en bakterievert av et polypeptid med melkekoagulerende virkning. ;I henhold til en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen kan det konstrueres rekombinant DNA som omfatter et strukturelt gen som koder for et polypeptid med melkekoagulerende virkning. Ved denne fremgangsmåten avledes en DNA-sekvens som koder for polypeptidet, fra storfekilder og innføres i en kloningsvektor med en promoter og et ribosomalt bindingssete oppstrøms for DNA-sekvensen. Denne rekombinante DNA brukes så til å transformere en bakterievert, og verten dyrkes under betingelser som fremmer ekspresjon av polypeptidet. ;I henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringes det også sammensetninger som er i stand til å syntetisere et polypeptid med melkekoagulerende virkning. Ved å bruke fremgangsmåter og sammensetninger tilveiebrakt ifølge oppfinnelsen, fåes et polypeptid med melkekoagulerende virkning og som kan syntetiseres ved høye effektivitetsnivåer i et vertcelle-system. Fig. 1 viser restriksjonsenzymkartene for to DNA-fragmenter erholdt ved hjelp av revers transcriptasebehandling av storfe mRNA og som koder for et polypeptid med melkekoagulerende virkning. Fig. 2 viser nucleotidsekvensen for ett av RNA-fragmentene som er kartlagt i fig. 1. Fig. 2 viser også den tilsvarende aminosyresekvens som dette RNA-fragment koder for. Fig. 3 viser skjematisk fremgangsmåten som brukes i avsnitt 8 for innføring av et DNA-fragment som beskrevet i fig. 2 i en passende ekspresjonsvektor avledet fra plasmid pBR322. Fig. 4 viser DNA-nucleotidsekvensen som koder for et fusjonspeptid og som omfatter promotersekvensen, aminosyrecodoner og rennin-avledede codoner til og med codon 42. Fig. 4 viser også den tilsvarende aminosyresekvens der hvor det er formålstjenlig. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter og preparater for å tilveiebringe et polypeptid med melkekoagulerende virkning ved å bruke rekombinant DNA-teknologi. Sekvenser som koder for storferennin, ble isolert fra magevev, transkribert inn i cDNA og klonet inn i en bakteriekloneride vektor. Nucleotidsekvensene ble så overført til spesielt ut-formede ekspresjonsplasmider for å gi maksimal syntese av polypeptidet. Etter rensing ble forholdene i kalvemagen gjentatt in vitro for å syreaktivere det syntetiske rennin-polypeptid. ;Mager fra ikke-avvente kalver ble valgt for mRNA-isolering ettersom dette vev in vivo produserer de høyeste nivåer med aktivtrennin. Revers transkriptase ble brukt for å transkribere mRNA over i en cDNA-kopi for kloning i bakterier. Revers transkriptase er imidlertid tilbøyelig til for tidlig avslutning av transkripsjon, følgelig ble det utført en størrelsesutvelgelse for å anrike med hensyn på genkopier i full lengde. To kloner ble analysert i detalj. En inneholdt hele det kodende område for A-formen av rennin, mens den andre inneholdt alle sekvensene til den fullt ferdige A-form av rennin, men manglet sekvenser fra spaltningsfragmentet i N-enden av prorennin. Den andre klone inneholdt også sekvenser fra det 3<!->ikke-oversatte område som fortsetter fra poly-A-halen. ;Med disse to renninklonene ble DNA-sekvensene om-arrangert for å gjøre deres ekspresjon maksimal. De klonede DNA-fragmenter kan sammenlignes med "kassetter" som kan inn- føres i en lang rekke spesielt konstruerte ekspresjonsvektorer. Det er nødvendig å bygge inn i en effektiv ekspresjonsvektor en sterk promoter for RNA-polymerase og et effektivt ribosom-bindingssete for å initiere proteinsyntese. Med bruken av bestemte restriksjons-endonucleaser er vi i stand til å inn-føre DNA-sekvensen i et bakterielt ekspresjonsplasmid slik at det strukturelle gen for kalverennin kan transkriberes som respons på bakteriepromoteren. ;Polypeptidet syntetiseres i bakterieceller ved høye nivåer. Rensingen av polypeptidet kompliseres imidlertid av dets tendens til å aggregere og sedimentere med bakterie-membraner. Når polypeptidet er renset sammen med bakterie-membraner, er det ikke aktivt. Aktiviteten kan gjenopprettes ved ekstraksjon av polypeptidet fra membranbestanddelene med urea. Behandling med urea denaturerer åpenbart polypeptid-molekylene som deretter kan gå tilbake til en aktiv konf ormas jon, og enzymaktiviteten kan måles etter syreaktivering. ;1. Isolering av mRNA;Preparering av vev: Rennin syntetiseres ved hjelp av magekjertlene lokalisert i slimhinnevevet til den 4. magen (løypemagen) hos ikke-avvente kalver. Dette vev ble erholdt fra et lokalt slakteri. Magene ble fjernet fra nyslaktede dyr og innpakket i is. Løypemagen som er den mest betydnings-fulle magen i den ikke-avvente kalven, ble inspisert etter tilstedeværelse av "ost" (for å være sikker på at dyret ennå ikke var drøvtygger) og vasket med vann. Slimhinnematerialet ble utskrapet fra magen og hurtig nedfrosset i et bad av tørris og methanol. Et gjennomsnitt på 80 g av vevet ble erholdt fra hvert dyr. Ettersom mRNA brytes hurtig ned, ble vevene frosset umiddelbart etter avlivning av dyret og lagret ved -70°C inntil det var behov for dem. ;Isolering av RNA: Slimhinnevevet inneholder høye nivåer av mRNA for å styre syntesen av rennin. All- ;cellulær RNA ble ekstrahert fra slimhinnevevet^og deretter ble innholdet av mRNA spesifikt isolert. For å beskytte ;cellulær RNA fra nedbrytning ble vevet veiet og deretter hurtig senket ned i en oppløsning av guanidinium-thiocyanat for å inhibere cellulær RNAse slik som beskrevet av Ullrich, A. et al., Science 196, 1313-1319 (1977). Vevet ble grundig macerert i en "Waring"-blander, og RNA'en ble isolert ved sedimentering gjennom en CsCl-pute ved hjelp av fremgangsmåten til V. Glisin, R. Crkvenjakov og C. Byus, Biochem. 13, 2633-2637 (1974) . Den totale vekt av slimhinnevev brukt som utgangsmateriale, var 13,3 g. Fra dette ble 8,5 mg av det totale cellulære RNA utvunnet. Dette utbytte (0,06%) ligger innenfor det forventede område på 0,01 - 1%. ;Rensing av mRNA: mRNA-fraksjonen av det totale cellulære RNA adskiller seg fra andre RNA-arter ved det at den inneholder 15-40 adenylsyrerester på 3'-enden av mole-kylet. Innholdet av mRNA ble renset ved kromatografering på oligo-dT-cellulose slik som beskrevet av Aviz, J. og Leder, P., Proe. Nati. Acad. USA _69, 1408-1412 (1972). mRNA-molekylene fester seg til kolonnen på grunn av den polyadenylerte hale og kan renses selektivt. Ut fra 8,5 mg kalvemage-RNA renset ved den ovenfor nevnte fremgangsmåte, ;ble 30,8yUg mRNA utvunnet. Innholdet av mRNA utgjør omtrent 2% av det totale innhold av RNA. Vårt utbytte på 0,35% er mindre enn 2% og indikerer at ikke-budbringer-RNA-artene er blitt fjernet. Innholdet av mRNA inneholder RNA-templetter for alle proteiner som ble syntetisert på en aktiv måte av løyepagen til den ikke-avvente kalv på tidspunktet for avlivning. Rennin bør utgjøre 1% - 5% av det totale proteininnhold i løypemagen. Dersom mRNA således er 50% ren, skulle 0,5% - 2,5% av de endelige klonene inneholde renninsekvenser. ;2. Translasjon av rennin-mRNA in vitro;Før denne mRNA ble brukt som en templett for DNA-syntesen in vitro, var det vesentlig å bekrefte at molekylene som koder for preprorennin, var tilstede. Et cellefritt ekstrakt av kanin-reticulocytter (reticulocytt-lysat) vil oversette renset mRNA til protein på en korrekt måte in vitro (Pelham, ;H.R.B, og Jackson, R.J., Eur. J. Biochem. 6J7, 247-256, 1976).;I dette system styrte den løypemage-avledede mRNA syntesen;av minst 12 forskjellige polypeptidtyper som varierte med hensyn til molekylvekt fra 17.000 til 102.000 dalton. Båndene var adskilte, og det ble syntetisert få korte peptider. De mest fremtredende typene hadde en tilsynelatende molekylvekt på 38.000-41.000, den omtrentlige størrelsen til preprorennin. Dette er også størrelsen til prepepsinogen, et annet enzym ;som syntetiseres av løypemagevevet. For å bekrefte at den mRNA som var renset fra løypemagen styrte syntesen av preprorennin, ble de in vitro fremstilte translasjonsprodukter utfelt med antiserura frembrakt i kaniner mot renset kalverennin. Bare ett hovedbånd ble utfelt ved hjelp av anti-serumet, og molekylvekten lå mellom 38.000 og 41.000, hvilket er overensstemmende med preprorennin. Lignende translasjons-analyser med preprorennin-mRNA ble også utført i froske-oocytter med det samme resultat. ;3. Identifikasjon av rennin- spesifikke mRNA-arter;I tillegg til in vitro translasjon for å identifisere rennin-mRNA i innholdet av mRNA fra kalve-løypemage, ble det også utført hybridisering av mRNA'en med rennin-spesifikke sonder. Sekvensen til de rennin-spesifikke sondene ble utledet fra aminosyresekvensen publisert av Foltmann, B., et al., J. Biol. Chem. 254, 8447-8456 (1979). Fra den almenngyldige genetiske kode kan den sannsynlige DNA-sekvens til et gen eller.templett forutsies ut fra aminosyresekvensen til proteinet. DNA-sekvensen er bare sannsynlig ettersom koden er degenerert; noen aminosyrer representeres av mer enn ett codon. En analyse av aminosyresekvensen til prorennin pekte mot to områder som inneholder bare aminosyrer med unike codoner. Heldigvis er disse områdene ikke sekvenser som er felles for prorennin og pepsinogen. I disse to små områdene bestemmer den genetiske kode nøyaktig mRNA-sekvensen. Oligomerer som er komplementære til disse korte sekvenser med genetisk informasjon, ble syntetisert for bruk som sonder. ;Den minste sonde med 12 nucleotider (GTTCATCATGTT) er komple- ;mentær med den genetiske informasjon for aminosyrene 18 3-186;i rennin. Den andre sonden inneholder en blanding av to 14-merer (TACTGCTGTTTCTG og TACTGCTGGTTCTG) og er analog med aminosyrene 29-33. ;Hybridisering til rennin-spesifikk RNA ble utført ved å bruke fremgangsmåten til Shinnick, T.M. et al., Nucl. Acids Res. 2, 1911-29, (1975) . Løypemage-mRNA ble størrelse-fraksjonert på en agarosegel som så ble tørket. De syntetiske oligomerer ble merket radioaktivt med<32>P for å tjene som sonder for komplementære mRNA-sekvenser. Den tørkede gel ble inkubert med de radioaktive sonder og deretter vasket. Den radioaktive sonde vil forbli bundet til gelen ved hybridisering til komplementære sekvenser i mRNA'en. Hybridisering til et RNA-bånd i agarosegelen antyder derfor at rennin-spesifikk mRNA var tilstede i en bestemt størrelsesklasse. Disse områder med komplementaritet kunne visualiseres etter autoradiografi. En preprorennin-mRNA i full lengde ville måtte være minst 1095 nucleotider lang for å inneholde codonet for alle 365 aminosyrer i prorennin-polypeptidet. Begge sonder hybridiserte til det samme område av gelen som svarte til mRNA med 1350 baser. Når mRNA utvunnet fra dette område av en parallell gel ble oversatt in vitro ved å bruke kanin-reticulocytt-lysatsystemet, styrte den syntesen av polypeptider med molekylvekter 38-41.000. Disse data gir følgelig sterke bevis for at mRNA-innholdet inneholdt molekyler som spesifikt koder for preprorennin. ;4. Syntese av cDNA;Rennin-mRNA-preparatet ble transkribert inn i cDNA for kloning i bakterier ved hjelp av revers transkriptase slik som beskrevet av Ullrich, A., et al., supra. Transkripsjon ble startet opp ved den 3'-polyadenylerte hale til rennin-mRNA ved å bruke oligo-dT som en starter. Nærmere bestemt ble lOyug oligo-dT ført sammen med lO^ug renset mRNA i nærvær av 50 mM NaCl. Reaksjonsblandingen ble varmet opp til 90°C og deretter avkjølt sakte. Til revers transkriptasereaksjonen ble deoxynucleosidtrifosfater (A,T,G,C) tilsatt inntil 0,5 mM sammen med 40 enheter enzym. Revers transkriptase-reaksjonsbufferen hadde følgende sammensetning: 15 mM Tris-HCl, pH 8,3, 21 mM KC1, 8 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA og 30 mM 2-mercaptoethanol. Denne blanding ble inkubert ved 4 2°C i 45 minutter. RNA-DNA-dupleksen ble brutt opp ved å koke i ;3 minutter.;Den andre DNA-kjeden ble kopiert ved å bruke DNA polymerase (Klenow-fragmentet). Etter transkripsjon av den første DNA-kjede ved hjelp av revers transkriptase frembringes en hårnålsløyfe i enden av DNA-transkriptet som kan brukes til å starte opp fremstillingen av den andre DNA-kjede. ;Revers transkriptasereaksjonsblandingen ble fortynnet 1:1 med Klenow-buffer (35 mM KCl, mM Tris-HCl, pH 8,3, 4 mM MgCl2og 15 mM 2-mercaptoethano]),og det ble tilsatt 15 enheter renset Klenow-fragment. Enzymblandingen ble inkubert ved 14°C i 3 timer og deretter ved 4°C i 16 timer. Dupleks-DNA1 en ble utfelt med ethanol på dette punkt. Nuclease-S^ble brukt til å tilføre cDNA-molekylene butte ender og til å åpne opp hår-nålsløyfen i dupleks-DNA'en. Den utfelte DNA ble oppløst i S-^-buffer (25 mM natriumacetat, pH 4,5, 300 mM NaCl og 1 mM ZnCl2) , og det ble tilsatt 1000 enheter S^. S-^-reaksjonsblandingen ble inkubert i 90 minutter ved 37°C. Etter denne omsetning ble DNA på nytt utfelt med ethanol. ;Transkripsjon av mRNA inn i den første cDNA-kjeden ved;å bruke revers transkriptase er svært ineffektivt, og for tidlig avslutning er ofte forekommende. For å anrike med hensyn på cDNA-kopier i full lengde og eliminere utsorteringen av mange kloner som inneholder korte cDNA-molekyler, ble cDNA-preparatet underkastet polyacrylamidgel-elektroforese. Området i gelen som svarer til molekylstørrelser på 1,0 til 1,5 kb av DNA ble skåret ut, og DNA'en ble fjernet ved elek-troeluering. Av de opprinelige lO^ug renset mRNA ble det utvunnet 300 nanogram elektroforetisk renset cDNA. ;5. Konstruksjon av renni n- cDNA- pla smi det;For isolering av rennin-spesifikk DNA ble de butt-endede cDNA-molekyler innført i bakterieplasmider. Vi an- ;vendte GC-haledanningsfremgangsmåten til Chang, A.C.Y.;Nature 275, 617-624 (1978) for å innføre cDNA-molekylene i plasmidet pBR322 (Bolivar, F. et al., Gene 2, 95-113, 1977). Polycytidylsyrerester ble polymerisert til endene av cDNA-molekylene ved å bruke enzymet terminal-deoxynucleotidyl-transferase, og polyguanidylsyrerester ble føyd til endene av den rettkjedede formen av pBR322. De to halepåhengte DNA-preparatene ble ført sammen for å frembringe rekombinante DNA-molekyler. ;Ved dannelsen av cDNA-plasmider ble det brukt 10 ng renset cDNA. cDNA'en ble tilført den terminale transferase-reaksjonsblanding som inneholdt: 140 mM kaliumcacodylat, 25 mM Tris, pH 7,6, 1 mM CoCl2 og 0,2 mM DTT. Ettersom polycytidylsyrerester ble polymerisert til cDNA-molekylene, ble dCTP tilført til 1,5 mM. Denne blanding ble forvarmet til 37°C, og deretter ble 15 enheter terminal transferase tilsatt. Enzymreaksjonen ble stanset etter 4 minutter ved tilsetningen av EDTA inntil 5 mM. ;Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med fenol, og DNA<1>en ble utfelt med ethanol. Plasmid-DNA'en pBR322 ble spaltet med restriksjonsenzymet Pst I, og deretter ble polyguanidylsyrerester polymerisert til endene av det rettkjedede molekyl slik som beskrevet ovenfor. ;På dette punkt ble de halepåhengte cDNA-molekyler rekombinert med bakterieplasmid-DNA ved å føre sammen de komplementære ender. De to preparater av dC-halepåhengt cDNA og dG-halepåhengt pBR322-DNA ble blandet i sammenførings-buffer (0,1 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 og 0,25 mM EDTA) og oppvarmet til 80°C. Blandingen fikk avkjøle sakte til 37°C og deretter til 26°C. ;De rekombinante DNA-molekyler ble så innført i bakterier ved transformasjon. Det ble brukt Escherichia coli stamme K-12 MM 294 (ATCC tilvekstnummer 31446). Andre vertceller kunne også vært brukt til dette trinn. De transformerte bakterier ble inokulert på agarplater som inneholdt anti-biotikumet tetracyclin. Ettersom plasmidet pBR322 inneholder tetracyclinresistensgenet, vil bare de bakterier som har fått et rekombinant plasmid, overleve. Hver av disse bak terier vil vokse og dele seg slik at det dannes en bakterie-koloni. Hver celle i kolonien vil være en etterkommer av den opprinnelige opphavscellen og vil inneholde det samme rekombinante plasmid. Fra de 10 ng med cDNA som ble brukt til å lage rekombinante plasmider, ble det erholdt 2000 kloner som ble videresortert med hensyn på renninsekvenser. ;6. Identifikasjon av renninkldner;De isolerte kolonier som inneholdt rekombinant plasmid-DNA, ble utsortert ved å bruke fremgangsmåtene til Grunstein, M., og Hogness, D.S., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 72, ;3961-3965 (1975). Hver rekombinant klon ble inokulert i en nummerert brønn på en mikrotiterplate og også på nitro-cellulosefiltere hvor bakteriene kan vokse som isolerte kolonier. Koloniene på filteret ble lysert, og filteret ble så vasket for å fjerne cellemembraner og proteiner. Bakterie-DNA, inkludert kromosomalt og det rekombinante plasmid, ;fester seg spesifikt til nitrocellulosefilteret.;Analysen av det genetiske innhold i plasmid-DNA avhenger av tilgjengeligheten av en passende sonde. Tidligere ble det deomonstrert at 12-meren og 14-meren var spesifikke sonder for rennin ved det at de hybridiserte kun til et enkelt område i RNA-gelene som svarer til prorennin-mRNA. Disse sonder ble derfor brukt til å identifisere rekombinante plasmider som kan inneholde prorenninsekvenser. (Wallace, R.B. et al., Nucl. Acids Res. 9, 879-894, 1981).Nitrocellulosefiltrene som var blitt inokulert med bakteriekloner som inneholdt rekombinante plasmider, ble senket ned i en oppløsning av enten den radioaktivt merkede 12-mer eller 14-mer. De merkede oligonucleotider vil binde seg til filteret bare når de hybridiserer til komplementære sekvenser i den rekombinante DNA. Områder med radioaktivitet på filteret identi-fiseres ved hjelp av autoradiografi. Av de 2000 klonene hvis rekombinante plasmider ble undersøkt, var på denne måte 18 positive ved det at de hybridiserte til de radioaktive sonder. Dette resultatet på 0,9% lå innenfor det forventede område på 0,5-2,5% positive kloner forutsatt ut fra vårt anslag over prosentinnholdet av rennin-mRNA i cellene fra løypemagen. ;7. Analyse av kloner som hybridiserer til rennin-spesifikke kloner ;Kulturene som svarer til de positive plasmider, ble dyrket for ytterligere analyse. Plasmid-DNA ble renset fra alle positive renninkloner og størrelsen av den innførte cDNA bestemt ved spalting med Pst I etterfulgt av gelelektroforese. Bare to kloner inneholdt cDNA-innskudd som var store nok til ;å inneholde hele den genetiske informasjon for en kopi av rennin i full lengde. Dette var ikke et uventet resultat ettersom det første transkripsjonstrinn i syntesen av cDNA ;fra mRNA er utsatt for for tidlig avslutning. De to kloner som ble valgt ut for videre undersøkelser, var 5G3 som inneholdt et innskudd på over 1,4 kb og 15C5 med et innskudd på 1,2 kb. ;De rekombinante plasmider ble spaltet med en lang rekke restriksjons-endonucleaser for å bestemme posisjonen til nøkkelrestriksjonsseter i cDNA-klonene. Fra denne restrik-sjonsanalyse ble de to restriksjonskartene som er vist i fig. 1, frembrakt. Posisjonen til nøkkelrestriksjonsseter i det klonede materiale trenges for å utvikle en strategi for sekvensbestemmelse av rennin-DNA'en. Denne sekvensanalyse var nødvendig for å bekrefte at våre kloner inneholder sekvenser for autentisk rennin. ;Klonene, 5G3 og 15G5, ble sekvensbestemt ved hjelp av fremgangsmåten til Maxam, A. og Gilbert, W. Proe. Nat. Acad. USA J±, 560-564 (1977) .Fragmenter ble frembragt først ved hjelp av restriksjonsenzymspaltning av DNA'en med enten Pst I, Bam HI eller Taq I. Andre enzymer ble også brukt om nødvendig. ;32 ;Fragmentene ble merket med P enten ved hjelp av enzymet T4 polynucleotidkinase eller ved hjelp av DNA-polymerase I (Klenow-fragment) (Maxam og Gilbert, supra). ;Begge kloner ble sekvensbestemt i sin helhet ved å bruke denne fremgangsmåte. I tillegg ble 80% av 5G3 og 70% av 15C5 sekvensbestemt i begge kjeder. Homologien mellom de to kloner er 100% i overlappingsområdene (fig. 1). Bare klonen 5G3 har full lengde og inneholder alle sekvenser som koder for preprorennin. I tillegg inneholder 5G3 ytterligere 250 baser i 5'-enden av det strukturelle gen for rennin. Dette området avledes fra en omvendt gjentagelse av carboxylsyreområdet til rennin sammen med sekvenser fra det ikke-oversatte område mellom avslutningscodonet og addisjonssetet for poly A. Klonen 15C5 begynner ved aminosyre 6 til prorennin og omfatter omtrent 100 ytterligere nucleotider fra det ikke-oversatte område i 3'-enden til det strukturelle gen. Begge klonene koder for sekvenser til A-formen av rennin. ;Sammenligning av 5G3 og 15C5 med de publiserte sekvenser til Harris et al., supra, indikerte svært få forskjeller. Sekvensen varierte i codonene for aminosyre 258 og 320, men disse var enkeltbaseforskjeller som ikke endrer aminosyren. Sekvensen fra Harris et al., supra, viste også en forskjell i codonet for aminosyre 286 som endrer aminosyren i B-formen av rennin. Sekvensen publisert av Moir et al., supra, er A-formen som svarer til 5G3 og 15C5 og viser ingen sekvensfor-skjell. De komplette preprorenninsekvenser til Harris et al., supra, og Moir et al., supra, ble utledet fra sekvensdata for flere overlappende kloner. Ingen av gruppene oppnådde en kopi av preprorenninklonen i full lengde. ;Vår forutsagte aminosyresekvens (fig. 2) stemmer overens med sekvensen til A-formen av rennin publisert av Foltmann et al., supra, med unntak av nærværet av et asparagincodon i aminosyre 202 som erstatter asparaginsyren. Denne forskjell kan eller behøver ikke å være signifikant ettersom et felles problem i proteinsekvensanalyse er vanskeligheten med å differensiere mellom asparagin og asparaginsyre. ;8. Konstruksjon av polypeptid- ekspresjbnsplasmid;Klonet cDNA fra eukaryote kilder inneholder vanligvis i.kke de korrekte signaler for å bevirke korrekt transkripsjon og translasjon i E. coli. Etter isolering av passende cDNA-kloner må den eukaryote DNA manipuleres slik at den kan gjenkjennes av det syntetiske maskineri for protein i den prokaryote celle. For å syntetisere avledet prorennin-avledet polypeptid i E. coli ble det konstruert et rekombinant plasmid som styrer syntesen av et fusjonsprotein mellom noen aminosyrer avledet fra et normalt bakterieprotein, p-galacto sidase, og vårt prorennin-avledede polypeptid. Vår konstruksjon benyttet promoteren, ribosombindingssetet og de forskjellige aminosyrene fra N-enden i 3-galactosidase inkludert initiator-methioninet. Disse sekvenser ble føyd sammen med rennin-avledede sekvenser i fase via felles restriksjons-endonucleaseseter. I bakteriecellen vil prorennin-avledet polypeptid syntetiseres som et fusjonsprotein, men under syreaktivering av polypeptidet spaltes bakterie-aminosyrene fra, og det ferdige polypeptid utvinnes. ;(3-galactosidasesekvensene som brukes ved denne konstruksjon, var avledet fra plasmidet pUC8 (J. Messing, R. Crea, og P. H. Seeburg., Nucl. Acids Res. 9, 309-321, 1981). I dette plasmid ble et syntetisk oligonucleotid som inneholdt be-kvemme spaltningsseter for restriksjons-endonuclease, innført nær sekvensene som koder for N-ende-aminosyrene til 0-galactosidase. De prorennin-avledede sekvenser ble innført i det syntetiske område nedstrøms fra initiatorcodonet og i fase med dette codon. ;I det første trinn av denne konstruksjon ble et 70 bp fragment fjernet fra cDNA-klonen 5G3 ved spaltning med enzymene Bam HI og Pst I. Dette 70 bp fragment inneholdt de kodende sekvenser for aminosyrene 6 til og med 28 i det prorennin-avledede polypeptid. Plasmidet pUC8 ble også spaltet med Bam HI og Pst I, og deretter ligert med det 70 bp store fragment via cohesive ender for å frembringe det rekombinante plasmid pLCl (fig. 3a). Etter ligeringstrinnet var de prorennin-avledede sekvenser ikke i fase med de kodende sekvenser for 3-galactosidase. For å endre avlesningsrammen ble pLCl spaltet med Bam HI for å gjøre plasmidet rettkjedet, og de overhengende ender ble fylt ut med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase. Etter ligering ble et restriksjonssete for Cia I tilveiebrakt på stedet for det tidligere sete for ;Bam HI (fig. 3b).;Dette plasmid (pLC2) ble spaltet med Pst I etterfulgt av behandling med bakteriell alkalisk fosfatase. Den rennin-avledede cDNA-klon 5G3 ble også spaltet med Pst I, og det 1 kb store fragment som inneholdt sekvenser som koder for aminosyrene 29 i carboxylenden i det prorennin-avledede poly peptid, ble isolert. Det 1 kb store Pst I-fragment fra 5G3 ble ligert inn i plasmidet pLC2 som var gjort rettkjedet med Pst I, og kloner ble utsortert etter den korrekte orientering til det 1 kb store Pst I-fragment. En klon (pLC7) inneholdt den prorennin-avledede sekvens kondensert i fase med 3-galactosidase (fig. 3c og 4). Prorennin-ekspresjonsplasmidet pLC7 omfatter sekvenser som koder for både pseudorenninet og de ferdige renninspaltingssetene mellom hhv. aminosyrene 28-29 og aminosyrene 42-43. Denne klon ble brukt til polypeptid-ekspresjon og aktivitetsanalyser. ;9. Ekspresjon og analyse av klonede genprodukter;Proteiner som var kodet for av DNA i pLC7, ble syntetisert og identifisert i tre systemer: for det første ved koblet in vitro transkripsjon/translasjon, for det andre ved radioaktiv merking av minicelle-genprodukter, og for det tredje ved fraksjonering av hele celler av E. coli. Poly-peptidene som ble fremstilt i disse tre systemer, ble elektro-foresebehandlet på polyacrylamidgeler for å sammenligne molekylvektene til de plasmid-kodede produkter med molekylvektene til autenisk prorennin og rennin. ;Systemet med in vitro transkripsjon/translasjon bruker bakterielle bestanddeler som er nødvendige for transkrip-sjonen og translasjonen av plasmid-innkodede gener i et cellefritt miljø slik som beskrevet av Zubay, G. Ann. Rev. Gen. 1_, 267-287 (1973), og modifisert av Andrews, W. og Rawson, J. Plasmid 8, 148 (1982). Når klonet pLC7 DNA ble innført i dette system, kunne radioaktivt merket protein som forflytter seg sammen med kalveprorennin under elektroforese (molekylvekt 41.000), påvises. ;Under sure betingelser gjennomgår kalveprorennin spalting til former med mindre molekylvekt som har melkekoagulerende virkning. Effektiv syreaktivering krever at konsentrasjonen av prorennin er større enn 5^ug/ml. Tilsetningen av umerket kalveprorennin (til en sluttkonsentrasjon på 0,1 mg/ml) til blandingen in vitro som inneholder pLC7-polypeptidprodukt, ;var derfor nødvendig for å visualisere syreaktivering. Etter syreaktivering av en blanding av radioaktivt merket LC7-poly- ;peptid og kalveprorennin, oppviste begge en endring i mobili-tet som svarer til omdannelse av prorennin til pseudorennin (molekylvekt 38.000) når den ble aktivert ved pH 2, eller til rennin (molekylvekt 36.000) når den ble aktivert til pH 4,5. Det pLC7-innkodede polypeptid kan således spaltes ved den passende pH til et polypeptid med mindre molekylvekt som har den samme størrelse som pseudorennin og rennin. ;Syntesen av pLC7-innkodet polypeptid ble også analysert i miniceller. Miniceller er produkter av avvikende celle-deling i stammer som bærer min A- og min B-mutasjoner. Minicellene deler seg fra foreldrecellen ved knoppskyting og inneholder transkripsjons/translasjonssystemet til E. coli, men mangler kromosomal DNA. Miniceller kan lett fraksjoneres fra hele foreldreceller. Når en minicelle-produserende stamme transformeres med plasmid-DNA, vil minicellene inneholde plasmid-DNA og syntetisere plasmid-innkodede proteiner. Isolerte miniceller fra den minicelle-produserende stamme P678-54 transformert med klonet pLC7-DNA produserer spesifikt polypeptid som forflytter seg sammen med kalveprorennin ved elektroforese (molekylvekt = 41.000) og LC7-polypeptidet produsert i in vitro-systemet. Når minicellepreparatet som inneholder det pLC7-innkodede produkt ble fraksjonert i opp-løselige deler og membrandeler, ble det radioaktivt merkede polypeptid med molekylvekt 41.000 renset sammen med membranbestanddelene. ;Hele celler av E. coli ble også transformert med plasmid-DNA fra pLC7. De transformerte celler ble så adskilt i cytoplasma-, innermembran- og yttermembran-fraksjoner, Diedrich, D.L., Summers, A.O. og Schnaitman, C.A., J. Bact. 131, 598-607 (1977) som modifisert av MacGregor, C.H., Bishop, C.W. og Blech, J.E., J. Baot. 137, 574-583 (1979). Plasmidet pLC7 koder for et polypeptid med molekylvekt 41.000 (prorennin-størrelse) som renses sammen med yttermembrandelen av cellen. Det var ikke mulig å demonstrere syreavhengig spalting av pLC7-polypeptidet mens det var forbundet med den uopp-løselige membranfraksjon fra cellen. 10. Ekstraksjon av prorennin-avledet polypeptid fra uoppløselig tilstand ;Ut fra analysene av fraksjonerte hele celler og miniceller syntes det som om pLC7-polypeptidet må renses bort fra de uoppløselige membranbestanddeler for å få frem melkekoagulerende virkning. For å ekstrahere det aktive pLC7-polypeptidet ble cellemembraner behandlet med et ikke-ionisk vaskemiddel for å fjerne forurensende proteinbestanddeler, ;og det gjenværende ikke-oppløste materiale som inneholdt LC7-polypeptidet, ble så oppløst i et proteindenaturerende middel som åpner de fleste proteiner til en tilfeldig spiral-struktur. Formålet ved denne behandling er å ekstrahere LC7-polypeptidet fra materiale fra E. coli og å åpne polypeptidet. Fremstilling av naturlig LC7-polypeptid krever ny sammen-folding av ekstraktet og det denaturerte polypeptid ved fjerning av denatureringsmidlet. Polypeptidet pLC7 kan renses ytterligere ved kromatografering før eller etter denaturer-ingsmidlene fjernes fra proteinoppløsningen. ;Eksempel 1;E. coli stamme JM83 (Bethesda Research Laboratories, Inc.) ble transformert med pLC7 og dyrket i medier med L-næringsvæske supplert med antibiotikum. 5 g JM8 3/pLC7-cellepasta ble suspendert i buffer som inneholdt lysozym, lydbølgebehandlet, og blandingen ble sentrifugert. Membran-pelletten ble suspendert i et utveid overskudd av vaskemidlet Triton* X-100, og det uoppløselige materiale (som inneholdt LC7-polypeptid) ble samlet opp ved sentrifugering. Denne pelletten ble så oppløst i 6-8M urea. Ureaet ble fjernet ved dialyse i et stort volum buffer uten urea. Dette ekstraherte LC7-polypeptidet kan syreaktiveres og viser melkekoagulerende virkning (avsnitt 11).

Eksempel 2

Membranfraksjonen ble isolert og ekstrahert med 6-8M urea slik som beskrevet i eksempel 1. Denne proteinoppløsning ble så brakt i kontakt med en ionisk kromatografiharpiks (DEAE-cellulose), og ureaet ble fjernet ved vasking av protein-harpikskoiriplekset. Proteinet ble så eluert fra harpiksen med en saltoppløsning. Det således oppsamlede opp-løselige protein inneholdt LC7-polypeptidet som kan syreaktiveres og vil koagulere melk (avsnitt 11).

Eksempel 3

Membranfraksjonen som inneholdt LC7-polypeptidet, ble oppløst i urea og brakt i kontakt med DEAE-cellulose som i eksempel 2. LC7-polypeptidet ble renset ved eluering av proteinet med en gradient av NaCl (0-1M) som inneholdt 5-8M urea. Fraksjoner som inneholdt LC7-polypeptidet i urea, ble slått sammen, og ureaet ble så fjernet ved dialyse. Det ekstraherte og rensede LC7-polypeptid kan syreaktiveres og har melkekoagulerende virkning (avsnitt 11).

Etter ekstraksjon av LC7-polypeptidet i denatureringsmidlet ble det forsøkt flere rensingsfremgangsmåter. Tilstedeværelsen av LC7-polypeptid ble demonstrert ved passende størrelse av proteinet etter elektroforese på polyacrylamidgeler (avsnitt 9) og/eller melkekoagulerende virkning (avsnitt 11).

Eksempel 4

Membranfraksjonen av JM83/pLC7 ble isolert og ekstrahert med 5-8M urea slik som beskrevet i eksempel 1. Ureaet ble fjernet ved dialyse. Oppløsningen som inneholdt LC7-polypeptidet, ble så brakt i kontakt med en ionisk kromato-graf eringsharpiks (DEAE-cellulose). LC7-polypeptidet ble eluert fra harpiksen med en gradientoppløsning av NaCl (0-1M). LC7-polypeptidet ble oppløst i to fraksjoner: én som inneholdt LC7-polypeptidet i en form som kan syreaktiveres og kan koagulere melk, og én som inneholdt inaktivt LC7-polypeptid.

Eksempel 5

En oppløsning som inneholdt urea-ekstrahert og dialysert LC7-polypeptid (eksempel 1), ble brakt i kontakt med et hydrofobt kromatograferingsmateriale; f.eks. fenyl-Sepharose^ (Pharmacia). Dette materiale synes å virke som en affinitets-ligandharpiks. Etter eluering av protein-harpiks- komplekset med en gradientoppløsning som inneholdt avtagende konsentrasjoner av salt og økende konsentrasjoner av ikke-ionisk vaskemiddel, oppløses LC7-polypeptidet i adskilte fraksjoner som inneholdt hhv. polypeptid som ikke kunne aktiveres, og polypeptid som kunne syreaktiveres.

Rensing oppstartet etter fjerningen av denatureringsmidlet, kan oppløse LC7-polypeptidet i to former: én som har melkekoagulerende virkning eller aktivering, og én som ikke kan aktiveres i denne tilstand. LC7-polypeptid som forblir inaktivt, kan behandles med gjentatte denatureringstrinn slik som beskrevet i eksempel 4, og deretter på nytt renses. Slik resirkulering av LC7-polypeptid gir maksimal utvinning av aktivt materiale.

Eksempel 6

Et preparat av membranmateriale som inneholdt LC7-polypeptid, ble ekstrahert med 5-8M urea og dialysert. Denne oppløsning ble så brakt i kontakt med en ionisk kromato-graf eringsharpiks (eksempel 4) og oppløst i to fraksjoner: én som kunne syreaktiveres og én som forble inaktiv etter surgjøring. Oppløsningen som inneholdt den inaktive form av LC7-polypeptid, ble på nytt eksponert mot 5-8M urea, dialysert og brakt i kontakt med den samme ioniske kromatograferings-harpiks. Etter eluering fra harpiksen med en saltgradient, ble naturlig LC7-polypeptid utvunnet i betydelige utbytter.

11. Aktivering av og prøve på prorennin-avledet polypeptid

Tilstedeværelsen av aktivtLC7-polypeptid ble demonstrert ved dets evne til å koagulere melk eller syre- eller proteolytisk behandling. Prøven på melkekoagulering er som beskrevet av B. Foltmann, Methods in Enzymology, 19, 421-436 (1970). Prøveoppløsningen er satt sammen av 50 mg pr. ml ikke-fett-holdig melkepulver i vann pluss 50 mM CaCl, idet pH er justert til 6,0. Omsetningen utføres ved 30°C. En aktivitetsenhet er definert som den mengde enzym som vil koagulere 1 ml melke-substrat i løpet av 100 sekunder ved 30°C.

Aktivering av ekstrahert LC7-polypeptid kan oppstå ved behandling av dette protein med syre eller ved proteolytisk spalting av LC7-polypeptidet med andre enzymer. Denne akti-veringsprosess avsluttes så ved tilsetning av forskjellige kjemiske midler. Det resulterende produkt fra aktiveringen av LC7-polypeptidmateriale kan påvises ved analyse på poly-acrylamidgelen eller ved koagulering av en melkeoppløsning på den vanlig kjente måte.

Eksempel 7

En oppløsning av LC7-polypeptid som var blitt urea-ekstrahert og deretter dialysert, ble surgjort (til pH 2 eller pH 4,5) med saltsyre i en tilstrekkelig lang tid til maksimal aktivering slik den måles ved økningen i melkekoagulerings-aktivitet. Oppløsningens aktivitet var upåvirket av nøy-tralisering til pH 5-7 med en basisk oppløsning.

Eksempel 8

En oppløsning av LC7-polypeptid fremstilt som i eksempel 1, ble behandlet med trypsin, et proteolytisk enzym,

i en bufret oppløsning. Den gjensidige påvirkning mellom disse to materialer fortsatte inntil maksimal aktivering var oppnådd slik den ble målt ved økningen i melkekoagulerende aktivitet. Trypsinet ble så inaktivert kjemisk eller fysisk adskilt fra det aktiverte LC7-polypeptidet.

LC7-prorenninpolypeptidet fremstilles i JM83-celler i mengder som utgjør minst 1,0% av det totale proteininnhold i bakterien, i området"10.000-20.000 molekyler pr. celle. Ekspresjonsnivået er 10 ganger større enn tidligere publiserte forsøk på å klone og uttrykke et melkekoagulerende enzym fra rennin-mRNA, (Alford, B.L. et al., supra). Prøver på syreaktivert LC7-polypeptid fremstilt fra E. coli, har en spesifikk aktivitet som er større enn 500 enheter/mg renset protein. Dette er mer enn 20% av den spesifikke aktivitet til renset kalveenzym.

LC7-polypeptidet ble syreaktivert ved pH 4,5 til et materiale med renninstørrelse og dets aktivitet sammenlignet med rennet-prøver som er tilgjengelige i handelen. De to enzymer ble testet ved hjelp av prøver på melkekoagulering og funnet ikke å kunne sjeldnes fra hverandre med hensyn til respons på temperatur (30° - 34,4°C), melk-pH (6,4 - 6,7), calcium-supplementer i melk (0 - 0,03%) og inaktiverings-hastigheten ved oppvarming (65,5°C).

LC7-polypeptidet ble syreaktivert ved pH 2 til et materiale med størrelse som pseudorennin og dets aktivitet sammenlignet med pseudorennin avledet fra renset kalveprorennin. Disse to enzymene lot seg ikke sjeldne fra hverandre ved kriteriene som er beskrevet ovenfor. Disse to enzymer gir også lignende spaltingsprodukter etter tilsetning til en opp-løsning av melk eller rensede caseiner.

Den rekombinante DNA og dens vert-mikroorganisme som her er beskrevet som JM83/pLC7, ble deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, Md. og fikk ATCC tilvekst-nr. 39325.

Selv om oppfinnelsen ovenfor er blitt beskrevet ganske inngående for illustrering og eksemplifisering av hensyn til klarhet i forståelsen, er det åpenbart for et fagmenneske på området at visse endringer og modifikasjoner kan gjøres innenfor omfanget av kravene.

Claims (23)

1. Rekombinant DNA som er i stand til å styre syntese av et polypeptid med melkekoagulerende virkning,

   karakterisert ved at den omfatter:

   en DNA-sekvens som er i stand til autonom replikasjon i en bakterievert og som videre omfatter:

   (1) en bakterie-promotersekvens, etterfulgt av

   (2) et startsignal for translasjon, etterfulgt av

   (3) aminosyrecodoner, etterfulgt av

   (5) en ikke-bakteriell DNA-sekvens innrettet etter av-ledningsrammen for translasjons-startsignal og som koder for et polypeptid med melkekoagulerende virkning.
2. 2. Rekombinant DNA ifølge krav 1,

   karakterisert ved at polypeptidet må aktiveres for å fremvise melkekoagulerende virkning.
3. 3. Rekombinant DNA ifølge krav 2,

   karakterisert ved at polypeptidet aktiveres ved eksponering overfor et medium med en sur pH-verdi.
4. 4. Rekombinant DNA ifølge krav 1,

   karakterisert ved at den ikke-bakterielle DNA-sekvens videre koder for en forløper-peptidsekvens som aktiveres for å fremvise melkekoagulerende virkning.
5. 5. Rekombinant DNA ifølge krav 1,

   karakterisert ved at aminosyrecodonene omfatter:

   (1) et syntetisk oligonucleotid,

   (2) en bakteriell DNA-sekvens, eller

   (3) en kombinasjon av disse.
6. 6. Rekombinant DNA ifølge krav 1,

   karakterisert ved at den ikke-bakterielle DNA-sekvens i det vesentlige svarer til RNA-nucleotidsekvensen slik den er vist i fig. 2.
7. 7. Rekombinant DNA, karakterisert ved at den koder for et fusjonspeptid og omfatter DNA-nucleotidsekvensen som svarer til RNA-nucleotidsekvensen i det vesentlige som vist i fig. 4.
8. 8. Rekombinant DNA-materiale,

   karakterisert ved at det inneholdes i E. coli stamme JM 83/pLC7 deponert ved ATCC og identifisert ved tilvekst-nr. 39325.
9. 9. Mikroorganisme, karakterisert ved at den er E. coli stamme JM 83/pLC7 som er deponert ved ATCC og som er identifisert ved tilvekst-nr. 39325.
10. 10. Polypeptid som er i stand til å fremvise melkekoagulerende virkning, karakterisert ved at det omfatter ekspresjonsproduktet av den rekombinante DNA ifølge krav 1, idet polypeptidet omfatter aminosyresekvensen i det vesentlige som vist i fig. 2.
11. 11. Polypeptid som er i stand til å fremvise melkekoagulerende virkning, karakterisert ved at det omfatter ekspresjonsproduktet av E. coli stamme JM 83/pLC7, ATCC tilvekst-nr. 39325 når stammen dyrkes.
12. 12. Polypeptid ifølge krav 10,

    karakterisert ved at det videre omfatter å aktivere polypeptidet ved eksponering mot et medium med en pH-verdi på 2 hovedsakelig slik at polypeptidet fremviser melkekoagulerende virkning.
13. 13. Polypeptid ifølge krav 10,

    karakterisert ved at det videre omfatter å aktivere polypeptidet ved eksponering mot et medium med en pH-verdi på 4,5 hovedsakelig slik at polypeptidet fremviser melkekoagulerende virkning.
14. 14. Polypeptid ifølge krav 10,

    karakterisert ved at det videre omfatter å aktivere polypeptidet ved eksponering med et medium som inneholder protease slik at polypeptidet fremviser melkekoagulerende virkning.
15. 15. Polypeptid ifølge kravene 12, 13 eller 14, karakterisert ved at det videre omfatter å bringe polypeptidet i kontakt med et medium som inneholder protein-denaturerende middel før aktiveringen.
16. 16. Fremgangsmåte for å syntetisere et polypeptid som er i stand til å fremvise melkekoagulerende virkning, karakterisert ved at den omfatter å:

    (a) isolere en DNA-sekvens som koder for et polypeptid som er i stand til å fremvise melkekoagulerende virkning,

    (b) konstruerer rekombinant DNA ved innføring av DNA-sekvensen i en kloningsvektor med evne til autonom replikering i en bakterievert, hvor kloningsvektoren har en bakteriepromoter, et startsignal for translasjon og aminosyrecodoner slik at DNA-sekvensen foreligger i en avlesningsramme med startsignalet for translasjon,

    (c) transformere bakterleverten med den rekombinante DNA, og

    , (d) dyrke den transformerte bakterievert under betingelser som fremmer syntese av polypeptidet.
17. 17. Fremgangsmåte ifølge krav 16,

    karakterisert ved at den videre omfatter trinnet å:

    ekstrahere polypeptidet fra den transformerte bakterievert.
18. 18. Fremgangsmåte ifølge krav 17,

    karakterisert ved at den videre omfatter trinnet å:

    rense det ekstraherte polypeptid ved å bringe det ekstraherte polypeptid i kontakt med et medium som inneholder protein-denaturerende middel og deretter fjerne det protein-denaturerende middel fra mediet.
19. 19. Fremgangsmåte ifølge krav 18,

    karakterisert ved at den videre omfatter trinnet å:

    aktivere det rensede polypeptid i et medium som inneholder protease.
20. 20. Fremgangsmåte ifølge krav 18,

    karakterisert ved at den videre omfatter trinnet å:

    aktivere polypeptidet i et medium med en sur pH-verdi.
21. 21. Fremgangsmåte for å koagulere melk,

    karakterisert ved å bringe melkebestand-delene i kontakt med et polypeptid erholdt ved fremgangsmåten ifølge krav 16.
22. 22. Fremgangsmåte ifølge krav 16,

    karakterisert ved at den videre omfatter trinnet å:

    ekstrahere polypeptidet fra en uoppløselig tilstand.
23. 23. Fremgangsmåte ifølge krav 22,

    karakterisert ved at den videre omfatter trinnet å:

    reekstrahere polypeptidet som forblir i en inaktiv tilstand.