JP2003512050A - 組換え成熟型リソフスタフィンの発現 - Google Patents

組換え成熟型リソフスタフィンの発現

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JP2003512050A JP2001532186A JP2001532186A JP2003512050A JP 2003512050 A JP2003512050 A JP 2003512050A JP 2001532186 A JP2001532186 A JP 2001532186A JP 2001532186 A JP2001532186 A JP 2001532186A JP 2003512050 A JP2003512050 A JP 2003512050A
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シャム カトゥリ，ガン
シャーマ，ラフル
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バラット バイオテック インターナショナル リミテッド
カウンシル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ（シー・エス・アイ・アール）
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Abstract

(57)【要約】 スタフィロコッカス・シミュランスのリソフスタフィン遺伝子の一部が複製されて、プレプロリソフスタフィン及びプロリソフスタフィンが存在しない、成熟型リソフスタフィンを産出するためにＩＰＴＧ誘発プロモーターの転写制御及びリボソーム結合部位の下でＥ・コリの細胞質で過剰発現された。形質転換された宿主細胞のＩＰＴＧ誘発は、完全にプレプロリソフスタフィン及びプロリソフスタフィンが存在しない、細胞内で可溶の成熟型リソフスタフィン（２７ｋＤａ）を生成する。そのように形成された成熟型リソフスタフィンは、翻訳後の修正を必要としない。そのように形成された成熟型リソフスタフィンは、ブドウ状球菌の伝染病を扱い防ぐために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 ［発明の分野］ 本発明は、誘発プロモーターと機能的に関連している成熟型リソフスタフィン
（ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）をコード化するベクターである、細菌宿主の組換え
において、プレプロリソフスタフィン（ｐｒｅｐｒｏｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）
及びプロリソフスタフィン（ｐｒｏｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）を存在しない、成
熟型リソフスタフィンを発現する方法、及び成熟型リソフスタフィンを発現する
遺伝子工学的に改変された細菌の宿主を導く。
【０００２】 ［従来技術の詳細］ ブドウ状球菌の伝染はブドウ状球菌の食中毒、やけど及び傷によって人類にと
って深刻で悲惨な状況及び多大な経済損失を引き起こし、及び乳を分泌する反芻
動物の乳腺への伝染を引き起こす。これらの伝染病は多くの場合従来の抗生物質
に強いか、あるいは一旦抗生物質が取消されれば再発する傾向がある。スタフィ
ロコッカス・シミュランス生物型スタフィロライティカス（ｓｔａｐｈｙｌｏｌ
ｙｔｉｃｕｓ）は、リソフスタフィン（細胞壁ペプチドグリカンに結合するペン
タグリシンを加水分解する）として些細であり、既知の細胞外の亜鉛メタロプロ
テアーゼグリシルグリシンエンドペプチダーゼを生産する。結果として、リソフ
スタフィンはブドウ状球菌属の種類の破壊において活性であるが、他のすべての
種類に対しては不活性である。存在可能なブドウ状球菌属の細胞に対するリソフ
スタフィンのこのユニークな特性は、現在用いられている反ブドウ状球菌の抗生
物質の作用機構と著しく異なる、抗生メカニズムを提供する。そのため、リソフ
スタフィンは、ブドウ状球菌の疾病の治療及び予防処置に斬新なアプローチの可
能性を提示する。しかしながら、ブドウ状球菌属の伝染病を扱い防ぐことのその
可能性の評価と同様に詳細な物理的と生化学の研究用のスタフィロコッカス・シ
ミュランス生物型スタフィロライティカスからのリソフスタフィンの精製は、自
然源による、低い発現レベル及び有力な毒素の同時分泌のために分かりにくいま
まである。
【０００３】 野生型リソフスタフィン遺伝子は、２４６のアミノ酸を含んでいる疎水性の成
熟型リソフスタフィン自体を後に続けて、１３のアミノ酸配列の７つのタンデム
リピートの親水性で、高度に秩序だった領域によって続く、Ｎ末端の３８のアミ
ノ酸残基の典型的な分泌シグナルペプチドを備えた三つの別個の領域から成るプ
レプロ酵素（ｐｒｅｐｒｏｅｎｚｙｍｅ）をコード化する。成熟型酵素は２７ｋ
Ｄａのモノマーであり、またジスルフィド結合を含んでいない。成熟型リソフス
タフィンへのプロリソフスタフィンの転換が、Ｓ．シミュランスの培養培地にお
いて細胞外で存在し、プロ酵素の親水性のタンデムリピート部分の除去を含んで
いる。
【０００４】 リソフスタフィンエンドペプチダーゼ（末端）におけるの野生型遺伝子は、ス
タフィロコッカス・シミュランス生物型スタフィロライティカスの大きなβ−ラ
クタマーゼポジティブプラスミドに位置している。（Ｈｅａｔｈ， Ｌ．Ｓ．，
Ｈ．Ｅ． Ｈｅａｔｈ ａｎｄ Ｇ．Ｌ．Ｓｌｏａｎ （１９８７） ”Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓ．ｓ
ｉｍｕｌａｎｓ ｂｉｏｖａｒ ｓｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃｕ．”Ａｂｓｔｒ
． Ａｎｎ． Ｍｅｅｔ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｈ５８ｐ１４
９； Ｈｅａｔｈ， Ｌ．Ｓ．， Ｈ．Ｅ．Ｈｅａｔｈ ａｎｄ Ｇ．Ｌ． Ｓ
ｌｏａｎ， （１９８７）” Ｐｌａｓｍｉｄ ｅｎｃｏｄｅｄ ｌｙｓｏｓｔ
ａｐｈｉｎ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓ．ｓｉｍｕｌａ
ｎｓ ｂｉｏｖａｒ ｓｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ．” ＦＥＭＳ Ｍｉｃ
ｒｏｂ． Ｌｅｔｔ． ４４：１２９−１３３．）完全なオペロンが複製され、
【０００５】
【外１】 及び１９９０年６月５日にＲｅｃｓｅｉに発行された米国特許出願番号４９３１
３９０を参照）完全な遺伝子はプロモーター要素に沿ってシークエンスされる。
上記の参照文献は、その後、細胞外にプロリソフスタフィン及びリソフスタフィ
ンに変換されるプレプロリソフスタフィンのＥ．コリの発現を報告する。プロリ
ソフスタフィンは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの転写制御の
下の真核生物のシステムで発現された（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ Ｃ．Ｍ．，Ａ．
Ｊ．Ｂｒａｍｌｅｙ ａｎｄ Ａ．Ｊ．Ｌａｘ （１９９４） ”Ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓ ｉｎ ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ
ｓｙｓｔｅｍ” Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ； ６０（３
）：７７１−７７６）。
【０００６】 リソフスタフィンエンドペプチダーゼの生成のための初期の方法はＳ．シミュ
ランスを酵素から直接精製するか（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ Ｃ．Ａ． ａｎｄ Ｖ
．Ｔ． Ｓｃｈｕａｒｄｔ （１９６５） ”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎ
ｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ： ａ ｌｙｔｉｃ
ａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
．” Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９７：２４２−２５０；ｌ
ｖｅｒｓｏｎ Ｏ．Ｊ． ａｎｄ Ａ． ｇｒｏｖ（１９７３） ”Ｓｔｕｄｉ
ｅｓ ｏｎ ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ． Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｅｎｚｙｍｅ．” Ｅｕｒ
．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８：２９３−３００； Ｖａｌｉｓａｎａ Ｓ．，
Ｆ．Ｅ． Ｖａｒａｌｄｏ ａｎｄ Ｇ． Ｓａｔｔａ （１９８２） ”Ｐ
ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｒｅｅ ｓｅｐａｒａｔｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ
ｅｘｃｒｅｔｅｄ ｂｙ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ， Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ ａｎ
ｄ Ｓ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ．” Ｊ．Ｂａｃｔ． １５１：６３６
−６４７； ＳｕｇａｉＭ．， Ｔ．Ａｋｉｙａｍａ， Ｙ． Ｍｉｙａｋｅ，
Ｅ． Ｉｓｈｉｄａ ａｎｄ Ｈ． Ｓｕｇｉｎａｋａ （１９９０） ”
Ｒａｐｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ ｆｏ
ｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” Ｊ
．Ｍｉｃｒｏｂ． Ｍｅｔｈ． １２：１３３−１３８； ａｎｄ Ｍａｒｏｖ
ａ Ｉ． ａｎｄ Ｖ． Ｄａｄａｋ （１９９３） ”Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓ
ｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙ
ｓｏｓｔａｐｈｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ
ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ ｓｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ．” Ｆ
ｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３８：２４５−２５２）若しくはプロリソフ
スタフィンを発現し、Ｓ．シミュランス抽出物を使用してプロペプチド部分を切
断することによりプロリソフスタフィンを成熟型リソフスタフィンに変換する（
Ｍａｒｏｖａ ａｎｄ Ｄａｄａｋ， ｓｕｐｒａ； Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ）。両方の従来のルートははっきりした不利益を受
ける。自然源から分離した場合、成熟型リソフスタフィンはピロゲン／アレルゲ
ン並びに及び／若しくはプロリソフスタフィン若しくはプレプロリソフスタフィ
ンが混入され得る。プロ酵素として発現された場合、初期に発現されたプロリソ
フスタフィンは、成熟型リソフスタフィンを産出するために、元来の供給源から
の抽出物を用いて酵素的に変換される。これはピロゲン若しくは他の混入物質で
混入されるリソフスタフィンにおける機会を提供する。
【０００７】 上記はクローニングについて記述する先行技術中の報告でなく、リソフスタフ
ィンの成熟型形式の発現がタンパク質のプレプロ若しくはプロ形態（ｐｒｅｐｒ
ｏ− ｏｒ ｐｒｏ−ｆｏｒｍ）の発現の欠如を導く。ここでの記載は、プレプ
ロ若しくはプロリソフスタフィンの迅速な生成を必要としない、リソフスタフィ
ンの直接生成の方法である。結果として、主題の方法により生成されたリソフス
タフィンは、プレプロリソフスタフィン及びプロリソフスタフィンとは異なる。
【０００８】 ［発明の概要］ リソフスタフィンの反ブドウ状球菌の可能性の一層の評価が目的及び非病原性
の源からの高度に浄化された大量のリソフスタフィンの即座の有効性に依存する
ので、主題の発明は、組換えプラスミドを含むために形質転換された好ましくは
、Ｅ．コリである、宿主細胞の細胞質の中で成熟型リソフスタフィンの過剰発現
を作動する組換えプラスミドを主要として導く。
【０００９】 本発明は、さらに、プラスミド（好ましくは形質転換されたＥ．コリ細胞）を
含み発現するために形質転換された宿主細胞、プラスミドで変形された適切な宿
主を使用して、成熟型リソフスタフィンを生産する方法、及び形質転換細胞によ
って生産されたプレプロリソフスタフィン−フリーと、プロリソフスタフィン−
フリーのリソフスタフィンを包含する。本発明により生成された組換えリソフス
タフィンは、下記に記載の二つのクロマトグラフィー段階を含む手法を用いて均
一に精製される。組換え産物は、組換え産物の適切な品質管理アッセイの開発の
ために、生化学、酵素的、及び生物物理学的特徴を有する。
【００１０】 特異的には、本発明の第一実施態様は、プレプロリソフスタフィン及びプロリ
ソフスタフィンを有しない成熟型リソフスタフィンエンドペプチダーゼを生成す
る方法を導く。本発明は、プレプロ及びプロリソフスタフィンをコード化する要
素の欠失において成熟型リソフスタフィンエンドペプチダーゼをコード化する塩
基配列を含む遺伝的構成物、プレプロリソフスタフィンとプロリソフスタフィン
を有しない成熟型リソフスタフィンエンドペプチダーゼをコード化する塩基配列
と機能的にリンクするプロモーターを提供し、成熟型リソスフタフィンのような
遺伝的構成物を含み発現する宿主細胞を形質転換し、宿主の細胞質に蓄積し、次
いで、宿主細胞から成熟型リソフスタフィンを分離することにより特徴づけられ
る。
【００１１】 本発明の第二実施態様は、プレプロリソフスタフィンと、プロリソフスタフィ
ンを有しない成熟型リソフスタフィンエンドペプチダーゼを発現する宿主を形質
転換するための発現構成物が導かれ、上記構成物は、プロリソフスタフィンをコ
ード化する要素の欠失において成熟型リソフスタフィンエンドペプチダーゼをコ
ード化する塩基配列、及び成熟型リソフスタフィンエンドペプチダーゼをコード
化する塩基配列と機能的にリンクしたプロモーターを含有している。
【００１２】 本発明の第三の実施態様は、プレプロリソフスタフィン若しくはプロリソフス
タフィンを伴う混入物を有しない成熟型リソフスタフィンを発現する形質転換さ
れた細胞のようなここに記載された発現構成物と形質転換された遺伝子工学的に
改変された宿主細胞である。
【００１３】 本発明の第四の実施態様は、プレプロリソフスタフィン及びプロリソフスタフ
ィンを有しない、純粋なリソフスタフィンを含有する構成物を導き、上記構成物
は、ここに記載の方法により生成される。
【００１４】 ［本発明の詳細］ 定義： 当該明細書にて明瞭で一貫した理解を提供するために、次の定義はここに使用
される。
【００１５】 構成物若しくは発現構成物−構成物が適切な宿主細胞に形質転換されている場
合、コード化したタンパク質の発現を動作する、一つ以上の調節サブシークエン
スに機能的にリンクしている関心のあるタンパク質をコード化する少なくとも一
つのサブシークエンスを含有するであるＤＮＡ構成物。かかる構成物は、構成物
を含むために形質転換された宿主細胞を選択するためにサブシークエンスをコー
ド化する手段を含んでいるかもしれない。サブシークエンスは、形質転換細胞に
抗生物質耐性若しくは食料制限、複数のクローニングサイト及び同等なものを与
える。
【００１６】 機能的にリンクされた−結合されたＤＮＡ配列に言及する場合、”機能的にリ
ンクされた”は、配列が同一のリーディングフレームで、上流の調節配列が下流
の構造配列に関係するように実行することを与える。機能的にリンクされたＤＮ
Ａ配列は、直接お互いに物理的にリンクしている必要性は必ずしもなく、リンク
した配列の機能的な関係と干渉しない、介在塩基によって分離されているかもし
れない。
【００１７】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）−プライマーのペアを使用して変性、アニー
リングを行ない、ＤＮＡポリメラーゼで伸長反応を行なうサイクルで、所望のポ
リヌクレオチド配列の大量コピーを産出するために使用される技術。反応の詳細
は、米国特許出願番号４６８３１９５及び４６８３２０２を参照すること。ＰＣ
Ｒは、核酸の操作において幅広く活用される。
【００１８】 プロモーター−オペロンの開始のためにＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ
配列部位。一旦結合されると、ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡの５´から３´方向
に向けて移動し、対応するＲＮＡ配列を形成する。プロモーターがＲＮＡ合成の
ための開始信号として機能している一方、プロモーターはそれ自身転写されない
。
【００１９】 遺伝子工学： 制限エンドヌクレアーゼによる消化、ＰＣＲによる増幅、ハイブリダイゼーシ
ョン、ライゲーション、ゲルの電気泳動による分離及び抽出、ヘテロなＤＮＡで
の形質転換細胞、成功した形質転換の選択及び同様な技術を含むＤＮＡの操作の
ための下記に記載の多くの段階は、当業者に周知であり、幅広く活用されて、広
範囲においてはここで詳しくは述べない。もし他の方法で注意されないならば、
ここに利用されたＤＮＡプロトコルはＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ．Ｆ．
Ｆｒｉｔｓｃｈ， ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， （１９８９）， ”Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，” Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．に広範囲に記述される。
【００２０】 宿主細胞： ここに記載の組換えＤＮＡは、プレプロリソフスタフィン及びプロリソフスタ
フィンを有しない成熟型リソフスタフィンの生成を動作する宿主微生物に組み入
れられる。宿主微生物は、任意の細菌若しくは形質転換に従順な真核生物の宿主
である。好ましい宿主は、Ｅ．コリである。簡潔さ及び明瞭のみの目的のために
、続く開示はＥ．コリ形質転換の記載に制限されている。学界及び産業における
両者のその遍在、その迅速な増殖速度、その相当に理解されていて、容易に操作
可能な遺伝子、及び生物のための完全なゲノムシーケンスの存在のために、Ｅ．
コリは好ましい微生物である。しかしながら、本発明は、酵母のような真核細胞
と同様に、バシラス・サチリス及び同様な他の原核細胞においても同一の成功率
で機能する。結果として、次の議論は、本発明をＥ．コリにおけるその例証され
た実施態様に全く限定しない。
【００２１】 プラスミドの構成物： 成熟型リソフスタフィンにおいて遺伝子を選択的に増幅するためのＰＣＲプラ
イマーは、出版されているリソフスタフィンエンドペプチダーゼ（末端）配列（
Ｒｅｃｓｉｅ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａを参照）に基づいて設計され、末端
遺伝子の選択的な増幅はＳ．シミュランス生物型スタフィロライティカス ＮＲ
ＲＬ Ｂ−２６２８株の全ＤＮＡを用いＰＣＲによって実行される（Ａｇｒｉｃ
ｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ， 旧Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒ
ｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １８１５
Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔ．， Ｐｅｏｒｉａ， Ｉｌｌｉｎ
ｏｉｓ ６１６０４−３９９９， ＵＳＡ）。シグナルペプチドのためのコード
配列及びリソフスタフィンの特徴は、ＰＣＲ介在型部位特異的突然変異による成
熟型リソフスタフィン（ＡＡＴＨＥ）が開始される直前に、開始のメチオニンコ
ドン（ＡＴＧ）によって置き換わる。Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨＩにおける制限エン
ドヌクレアーゼサイトは、クローニングの目的のための５´及び３´末端のそれ
ぞれの修正された遺伝子に組み入れられている。プルーフリーディングの熱安定
性酵素”ＶＥＮＴ”ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ， ＵＳＡ）が使用さ
れる。成熟型リソフスタフィンエンドペプチダーゼのための修正された遺伝子は
、ＰＣＲ産物による証明として、アガローズゲル電気泳動でエチジウムブロマイ
ドで染色された７６５ｂｐサイズの単一バンドとして検出されて、成功裡に増幅
された（図１）。
【００２２】 次いで、増幅された成熟型リソフスタフィンは、好ましくは誘発可能なプロモ
ーター配列である、プロモーター配列に機能的にリンクされている。図２に示さ
れているように、下記により詳細に示される、好ましいＴ７φ１０誘発可能なプ
ロモーターは、プロセッサー遺伝子ｌａｃＩ９に機能的にリンクしているバクテ
リオファージのプロモーターである。
【００２３】 ＰＣＲ産物は、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で消化され、オープンリーデ
ィングフレームはｐＥＴ−１１ｂ発現ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ
Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩサ
イト間に挿入され、このようにして、成熟型リソフスタフィンエンドペプチダー
ゼＯＲＦのための遺伝子を、顕著に調節可能なバクテリオファージＴ７φ１０プ
ロモーターの転写制御下に配置する（図２）。
【００２４】 組換え構成物は、ダイターミネーター法を用いてＡＢＩＰｒｉｓｍ３７７自動
ＤＮＡシークエンサーを使用して自動ジデオキシ連鎖型停止法にて確定された。
獲得されたヌクレオチド配列は、成熟型リソフスタフィンをコード化する既知の
配列を伴う完全な合意であった。
【００２５】 成熟型リソフスタフィンの発現： 成熟型リソフスタフィンの遺伝子は、Ｅ．コリＢＬ２１株（ＤＥ３）、ＡＴＣ
Ｃ４７０９２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎ
ａｓｓａｓ， ｖｅｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９， ＵＳＡ）の細胞質
でＴ７φ１０の転写制御下において発現された。ｐＥｎｄ−１１ｂとして設計さ
れた組換えプラスミドは、従来の手法（塩化カルシウム法）で、好ましい宿主細
胞Ｅ．コリＢＬ２１株（ＤＥ３）に形質転換された。イソプロピル−１−チオ−
β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．４ｍＭになるように添加し、ｍ
ｅｔ−リソフスタフィンタンパク質と対応する約２７ｋＤａの分子量バンドの過
剰発現を誘発した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３を参照）によって解析された誘発さ
れたバンドの大きさは、すでに報告されたような成熟型リソフスタフィンの分子
量と完全に合意した。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度計の走査は、誘発されたバ
ンドは、誘発された細胞抽出物の全タンパク質の約２０．２％を構築したことを
示している（図４）。
【００２６】 スタフィロライティックな活性（Ｓｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉ
ｔｙ）は、ポリアクリルアミドゲルに組み入れられたスタフィロコッカス・アウ
レウス細胞の溶解により透明な帯として視覚化されて、同じ２７ｋＤａのバンド
で集中された。上記プロトコールにより形成したリソフスタフィンエンドペプチ
ダーゼは、前述の報告と一致する、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールの中で
煮洗した後でさえ、その活性を回復する（Ｌｅｃｌｅｒｃ Ｄ． ａｎｄ Ａ．
Ａｓｓｅｌｉｎ （１９８９） ”Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗ
ａｌｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ ａｆｔｅｒ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｐｏｌｙ
ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ” Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉ
ｃｒｏｂ．３５：７４９−７５３）。
【００２７】 組換えリソフスタフィンエンドペプチダーゼの精製： ｐＥｎｄ−１１ｂに挿入された塩基配列から翻訳されたｍｅｔ−リソフスタフ
ィンエンドペプチダーゼの配列は、コンピュータープログラムＤＮＡＳＴＡＲ（
ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｕ
ＳＡ）によって解析された。得られたデータは、タンパク質を精製するための効
果的なスキームの設計に有効である。中立のｐＨでの滴定により予測される、ｍ
ｅｔ−リソフスタフィンエンドペプチダーゼのネットチャージは、ｍｅｔ−リソ
フスタフィンが基本残基の８．９１％（頻度）／１１．０４％（質量）を有する
基本タンパク質であることが明らかに示唆されて、＋１１．３９であることが判
明した。陰イオン交換クロマトグラフィーで使用されるｐＨ８．５において、Ｅ
．コリのタンパク質の大きな比率はＱ−セファロースレジンに吸収され、一方で
組換えリソフスタフィンエンドペプチダーゼは１００ｍＭ塩濃度の溶出液に現れ
た。
【００２８】 その後、収集されたポジティブな分画は、ｐＨ ５．５バッファーで透析させ
られて、その時点において多くの宿主（Ｅ．コリ）タンパク質は変性され、溶液
の中にリソフスタフィンの純度の高い調製を残して、溶液から沈澱された。ｐＨ
５．５において、高度な基本タンパク質である、成熟型リソフスタフィンは、＋
１８．６のネットチャージを有する。この高いネットチャージは、陽イオン交換
クロマトグラフィーを用いるリソフスタフィンエンドペプチダーゼ調製からの重
要でない不純物の除去に有効である。純粋なタンパク質を含有する分画は、保存
バッファーで透析されて、−２０℃にて分注して保存される。
【００２９】 従来技術のアプローチにて、リソフスタフィンは硫酸アンモニア沈澱を用いて
精製されて、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーで、４．３ｍｇ／リット
ルの培養を産出した（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕａｒｄｔ， ｓｕ
ｐｒａ）。イオン交換クロマトグラフィー（Ｉｖｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｇｒｏｖ
， ｓｕｐｒａを参照）若しくは等電点電気泳動法及びＧ−１００ゲル濾過の組
み合わせ（Ｗａｄｓｔｒｏｍ Ｔ． ａｎｄ Ｏ． Ｖｅｓｔｅｒｂｅｒｇ （
１９７１） ”Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｅｎｄｏ−ｂｅｔａ−ａｃｅｔｙｌ−ｇ
ｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ， ｓｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄ
ａｓｅ， ａｎｄ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅａｍ
ｉｄａｓｅ ｉｎ ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ ａｎｄ ｆｒｏｍ Ｓ．ａｕｒｅ
ｕｓ．” Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｓｃａｎｄ．
７９：２４８−２６４）を用いてＳ．シミュランスの培養濾過物からリソフスタ
フィンを精製する多くの方法があることが報告されている。チチン（ｃｈｉｔｉ
ｎ）−セファロースＣＬ４Ｂでのアフィニティー精製に基づくリソフスタフィン
の精製はまた、Ｖａｌｉｓｅｎａ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａによって報告さ
れている。Ｓｕｇａｉ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａは、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂ
ｌｕｅ ３Ｇ−Ａ（Ｔｓｋｇｅｌ Ｂｌｕｅ−５ＰＷ）でのダイ−リガンドアフ
ィニティー高圧液体クロマトグラフィーを含む処理を報告している。しかしなが
ら、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅは、リソフスタフィンの活性において不利益で
あることが報告された（Ｍａｒｏｖａ ａｎｄ Ｄａｄａｋ， ｓｕｐｒａ）。
【００３０】 Ｍａｒｏｖａ及びＤａｄａｋはまた、超濾過、ＤＥＡＥ−セルロースクロマト
グラフィー及びセファデックスＧ−５０でのゲル濾過クロマトグラフィーを含む
一連の技術を用いて、７５．６％の産出を与える、Ｓ．スタフィロライティカス
（Ｓ． ｓｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）の培養濾過物からリソフスタフィン
の分離のための精製プロトコールを報告している。このプロトコールの欠点は、
厄介で時間を浪費する処理である、ゲル濾過クロマトグラフィーを含む、３つの
異なるクロマトグラフィー段階に依存することである。
【００３１】 ここで使用される生成処理は、研究用のフラスコ培養の１リットル当たり実質
上均質の純度８．９ｍｇの精製された成熟型リソフスタフィンを産出する（表の
実施例を参照）。良好なスタフィロライティックな活性でのリソフスタフィンエ
ンドペプチダーゼの全面的な１１倍の精製の業績があった（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓｅ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡにより供給された成熟型リソフ
スタフィンと匹敵する、１１９６０Ｕ／ｍｇの特異的な活性）。本発明により生
成されたリソフスタフィンの回収率は、７０％であった。調製の純度は、クマシ
ーブルーで染色された１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで可視できるようにほとんど
均質であった。
【００３２】 したがって、主題の本発明は、実質的に均質なリソフスタフィンエンドペプチ
ダーゼが安全で、非病原性の宿主である、組換え体の合成が可能である。かかる
処理は実験室規模上で実行することができるか、若しくは産業レベルの生産まで
拡大することができる。
【００３３】 本発明により合成された組換えリソフスタフィンエンドペプチダーゼの生化学
及び酵素的特質： アンフォライン（ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）を使用するポリアクリルアミドゲル電
気泳動で等電への集中から得られる実験値は、在来の成熟型リソフスタフィンエ
ンドペプチダーゼの文献からの報告と一致した９．８である。組換えリソフスタ
フィンエンドペプチダーゼのサブユニットの分子量は、移動度（Ｒｆ）対標準分
子量の対数のプロットから計算され、２６．９ｋＤａであることが判明した。か
かる値は、上記に引用された文献に報告されている、理論的に予測された値であ
る２７．２ｋＤａに非常に近似している。
【００３４】 本発明で使用している組換えリソフスタフィンエンドペプチダーゼの分子量は
、”Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉ ＬＫＢ Ｂｏｉｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）ゲル濾過クロマトグラ
フィーを用いて約２７ｋＤａであることが判明し、Ｓ．シミュランスの培養濾過
物から得られた成熟型リソフスタフィンは完全に合意した。本発明により生成さ
れたタンパク質におけるリソフスタフィン活性率は、１乃至１０分まで線形だっ
た。また、その特異的な活性はＳｉｇｍａ社の明確な条件下の商用リソフスタフ
ィン（Ｓｉｇｍａ）に匹敵するように感じられた。組換えの成熟型リソフスタフ
ィンエンドペプチダーゼは、約４７℃、及び約７．０乃至約９．０の範囲のｐＨ
（約８．０でのピーク値で）で最も活性であることが判明した。しかしながら、
著しいことに、本発明によりなされたタンパク質の調製は、約１０．０のｐＨで
約８２％の活性を保持された。異なる時間間隔において異なる温度でインキュベ
ートした場合、本発明によるタンパク質の調製は、約５０℃において、タンパク
質が急速にその活性を失うパラメーターを越える１０分間のインキュベーション
時間まで安定であった（例えば、６０℃で処理した１０分後のタンパク質は約４
０％だけの活性を維持した）。２０℃及び３０℃において、組換えリソフスタフ
ィンは、少なくとも２４時間安定であった。４０℃において、組換えリソフスタ
フィンは、７０％の残存活性を維持して、完全に４時間安定であった。主題の本
発明を用いて得られた組換えリソフスタフィンの特質は、適切な温度とｐＨがそ
れぞれ３７℃と７．５として報告されている、Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｓ
ｃｈｕａｒｄｔ， Ｒｅｃｓｅｉ ｅｔ ａｌ．， 及び Ｇｒｏｖ， ｓｕｐ
ｒａの前述の報告とは異なる。対照的に、本発明により生成されたリソフスタフ
ィンは、約４７℃及びｐＨ８．０で適切な活性を有する。
【００３５】 ［実施例］ 次の例は、ここで記載され請求された本発明についてのより多くの完全な理解
を単独で援助するために含まれている。実施例は、請求された本発明の範囲を任
意の手法で制限しない。
【００３６】 組換え発現ベクターの構成物： 図２について言及すると、分泌シグナルペプチド及び分泌シグナルペプチドの
特質を表現するタンデムリピートは、５´末端のＥｃｏＲＩ制限サイトの生成が
伴った、ＡＴＧ開始コドン及びとプライマーを使用して、ＰＣＲ媒介型部位特異
的突然変異によってリソフスタフィンの構造遺伝子の終止コドンに直ちに続くＢ
ａｍＨＩ制限サイトと置き換えられた。使用されたプライマーは、 ５´−ＡＣＴＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＣＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴ
ＴＣＡＧＣＡＣ−３´ （ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１）（下線はＮｄｅＩ制限サイトである）；及び ５´−ＣＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＴＴＡＴＡＧＴＴＣＣＣＣＡＡＡ
ＧＡＡＣＡＣ−３´ （ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２）（下線はＢａｍＨ１制限サイトである）。
【００３７】 修正された遺伝子は、３´から５´へのエキソヌクレアーゼプルーフリーディ
ング活性を有する”ＶＥＮＴ”ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ サーマルサ
イクラーによって標準反応のＰＣＲによってプラスミドｐＲＪ５（Ｒｅｃｓｅｉ
ｅｔ ａｌ， ｓｕｐｒａ， ＡＴＣＣ６７０７９）から選択的に増幅された
。増幅条件は、９４℃で１分間、６５℃で１分間及び７２℃で４０秒間の２５サ
イクルであった。増幅されたフラグメントは図１に描写され、Ｍは分子量マーカ
ーのレーンで、レーン１及び２は、７６５塩基対の増幅された産物を示す複製し
た増幅である。
【００３８】 分泌シグナル及びタンデムリピートが差し引かれたが、しかしＡＴＧ開始コド
ンと機能的にリンクしている増幅された成熟型リソフスタフィンは、ｌａｃＩ９ リプレッサー及びＩＰＴＧ−誘発Ｔ７φ１０プロモーターに機能的にリンクして
いる、５´末端ＡＴＧ開始コドンを有する成熟型リソフスタフィン遺伝子構成物
を産出する、ｌａｃＩ９リプレッサー及びバクテリオファージＴ７φ１０プロモ
ーターをコード化する配列にライゲートされた。ｌａｃＩ９及びプロモーター配
列は、ｐＥＴ−１１ｂのような容易に利用可能なベクターから有することが可能
である。
【００３９】 プロモーターと機能的にリンクする成熟型リソフスタフィンを有する構成物は
、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化され、Ｔ７φ１０プロ
モーターの転写制御下でリソフスタフィン遺伝子を伴う組換えプラスミドｐＥｎ
ｄ−１１ｂを生成する、対応した消化されたｐＥＴ−１１ｂ発現ベクターに挿入
される。
【００４０】 成熟型リソフスタフィンの細胞質内発現及びスタフィロライティックな活性の
位置確認： 発現宿主Ｅ．コリＢＬ２１株（ＤＥ３）は、ｐＥｎｄ−１１ｂと形質転換され
た。Ｅ．コリＢＬ２１株（ＤＥ３）（ｐＥｎｄ−１１ｂ）のオーバーナイトで生
育させた２００マイクロリットルの培養物は、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含有する２５ｍｌのルリアベルタニブロス（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ Ｂｒ
ｏｔｈ）に植え付けられた。培養物は、０．６の吸光度（Ａ６００ｎｍ）に達す
るまで活発に振とうして３７℃で育成され、次いで、成熟型リソフスタフィンの
発現を誘発するためにＩＰＴＧ０．４ｍＭがＥ．コリの細胞質に添加された。そ
の後の３時間の誘発で、細胞が遠心分離によってペレット化され、２．５ｍｌの
５０ｍＭトリス−塩酸で再懸濁され、超音波で破壊され、微粒子の分画を除去す
るために遠心分離された。全細胞の抽出物及び可溶性の分画は、１２％のＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲルで解析され、続く既知のプロトコール（Ｌａｅｍｍｌｉ Ｕ．Ｋ
． （１９７０） ”Ｃｌｅｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｈｅａｄ ｏｆ ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４．” Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５）によ
りクマシーブリリアントブルーで染色された。１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、組
換えタンパク質の発現レベルを決定するためにＦＵＪＩ ＧＥＬＳＣＡＮ濃度計
を用いるゲルデンシトメトリーによって解析された。図４に示されている結果は
、発現された成熟型リソフスタフィンが、細胞質のタンパク質の２０．２％を占
めたことが明らかにされた。
【００４１】 スタフィロライティックな活性の位置確認： スタフィロライティックな活性バンドは、わずかな修正を施したＳｕｇａｉ
ｅｔ ａｌ．（１９９０）に記載された方法を用い、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルによって位置確認された。電気泳動で使用されたバッファーシステムは、Ｌ
ａｅｍｍｌｉ （１９７０）， ｓｕｐｒａによって報告されたものと同一であ
った。要約すると、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルは、１％（ｗ／ｖ湿
細胞質量）のＳ．アウレウス２３７株細胞を含有して調製された。電気泳動は、
ＢＩＯＲＡＤ Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅａｎ垂直型スラブゲル電気泳動アセンブリを
用い、４℃において２０ｍＡの一定した電流で実行された。続く電気泳動におい
て、ゲルは、冷却した蒸留水で完全に洗浄された（３ｘ１００ｍｌ）。３７℃で
の３０分間の最終浸透が、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭトリス
−ＨＣｌ、ｐＨ８．０にて与えられた。活性バンドは、間接的な光での暗い背景
において可視化された。
【００４２】 成熟型リソフスタフィンの精製： ５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２リットルのＬＢブロスは、Ｅ．コ
リＢＬ２１株（ＤＥ３）（ｐＥｎｄ−１１ｂ）のオーバーナイトで生育した１０
ｍｌの形質転換培養物を植え付けられて、０．６の吸光度（Ａ６００ｎｍ）に達
するまで一定した攪拌（２００ｒｐｍ）により３７℃で成長され、次いで終濃度
が０．４ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加することにより誘発された。誘発後の
細胞は、さらに４２℃で３時間の成長が許容された。次いで、誘発された細胞は
、４℃にてＳｏｒｖａｌｌ ＧＳ−３ローターを用い、１０分間８０００ｒｐｍ
で遠心分離され、１００ｍｌの溶解バッファー（１００ｍＭ塩化ナトリウム及び
０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフロリドを含有する５０ｍＭトリス−ＨＣ
Ｌ， ｐＨ９．５）で再懸濁された。
【００４３】 段階１：陰イオン交換クロマトグラフィー： ガラスのカラムは、７０ｍｌの陰イオン交換レジン”Ｑ−セファロースＦＦ”
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で詰められ、１００ｍｌの溶解バッファーで平衡化され
た。流率は、２ｍｌ／ｍｉｎにて維持された。タンパク質の溶液がカラムに適用
され、次いで溶出が１０ｍｌずつの分画容量で回収された。次いで、カラムは１
００ｍｌの同一のバッファーで洗浄され、分画は前述のように回収された。ピー
クの分画は、前述に記載のように、スタフィロライティックな活性のためにＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによって解析された。
【００４４】 段階ＩＩ：酸性化及び陽イオン交換クロマトグラフィー： リソフスタフィンを含有する分画は収集され、２０体積の陽イオン交換バッフ
ァー（４０ｍＭ トリス−酢酸 ｐＨ５．５， １００ｍＭ 塩化ナトリウム）
に対して４℃で１６時間透析された。透析物は、４℃で１５分間１５０００ｒｐ
ｍで遠心分離され、明確にされた上澄み液は陽イオン交換クロマトグラフィーに
使用された。２０ｍｌ容量のガラスカラムは、Ｓ−セファロース ＦＦ （Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）で詰められ、４０ｍｌの陽イオン交換バッファーで平衡化され
た。毎分２ｍｌの流率は、クロマトグラフィーを通して維持された。
【００４５】 上記から明確にされた上澄み液は、平衡化されたカラムにロードされ、カラム
は１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する同一のバッファーを用いるカラム体積の
５倍の容量により引き続くカラム体積の５倍の容量（１００ｍｌ）の同一バッフ
ァーで洗浄された。マトリックスに結合するリソフスタフィンは、陽イオン交換
バッファーで１５０ｍＭ乃至５００ｍＭ塩化ナトリウムの１００ｍｌ勾配を用い
て溶出された。５ｍｌ容量の分画は回収され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びスタフィロ
ライティックな活性によって成熟型リソフスタフィンエンドペプチダーゼの存在
が解析された。純粋な組換えタンパク質を含有する分画は収集され、均質な調製
は、マイナス２０℃で保存する以前に１０倍量の保存バッファー（５０ｍＭ ト
リス−塩酸、ｐＨ７．５、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０％（Ｖ／Ｖ）グリセ
ロール）に対して透析された。収率は８．９ｍｇ／ｍｌであった。段階ごとの収
率及び活性データは下記の表を参照する。
【００４６】
【表１】 リソフスタフィン活性のアッセイ リソフスタフィンエンドペプチダーゼ活性は、報告された方法の修正によるス
タフィロコッカス・アウレウス２３７株細胞の溶解のモニタリングにより溶液中
でアッセイされた（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｊ．Ｍ．， Ｊ．Ｋ． Ｈａｒｄｍａ
ｎ ａｎｄ Ｇ．Ｌ． Ｓｌｏａｎ （１９７９） ”Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉ
ｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
ｉｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ．”
Ｊ． Ｂａｃｔ． １３７： １１５８−１１６４）。要約すると、Ｓ．アウ
レウス２３７株の活性した成長細胞は濯がれ、活性バッファー（５０ｍＭトリス
−塩酸、ｐＨ７．５、１００ｍＭ塩化ナトリウム）にて懸濁されて、吸光度（Ａ
６００ｎｍ）が０．４００に調節された。典型的なアッセイは、３７℃で維持さ
れる”インサイチュ”の制御された温度キュベットホルダーを有するＳｈｉｍａ
ｄｚｕ ２１０１ 分光光度計において１ｃｍの径路の長さを伴う３．０ｍｌの
水晶キュベットで調製された。適切に希釈した組換えリソフスタフィン溶液の分
注は、懸濁液に添加され、３７℃での５分間の植付け期間が報告された後で、６
００ｎｍにおける細胞のＯＤは減少した。リソフスタフィンの１ユニットは、Ｓ
．アウレウス２３７株細胞の懸濁液のＯＤ（Ａ６００ｎｍ）を３ｍｌの反応容量
で５分間３７℃において０．００１減少するために必要な酵素量として定義され
た。本発明により合成された、精製されたリソフスタフィンは、１１９６０Ｕ／
ｍｇの活性を有する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 分泌シグナル及び５´の繰り返されたモチーフを差し引いた増幅されたリソフ
スタフィン遺伝子を示している電気泳動である。
【図２】 本発明によるプラスミドの構成物である、ｐＥｎｄ−１１ｂの構成物を表す概
略である。
【図３】 誘発前後のｐＥｎｄ−１１ｂを含むために形質転換された溶解されたＥ．コリ
細胞での全タンパク質の電気泳動である。
【図４】 ｐＥｎｄ−１１ｂを含むために形質転換されたＥ．コリで組換え成熟型リソフ
スタフィンの発現レベルを示す１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度計の走査である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 9/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:44） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カトゥリ，ガン シャム インド国 110 007 デリー モール・ロ ード センター・フォー・バイオケミカ ル・テクノロジー（シーエスアイアール) ジェネティック・エンジニアリング・デ ィヴィジョン内（番地なし) (72)発明者 シャーマ，ラフル インド国 110 007 デリー モール・ロ ード センター・フォー・バイオケミカ ル・テクノロジー（シーエスアイアール) ジェネティック・エンジニアリング・デ ィヴィジョン内（番地なし) Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA14 CA04 DA05 DA06 DA11 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B050 CC03 CC07 DD02 FF11 LL01 4B065 AA01X AA26X AA53Y AA57X AB01 BA01 CA33 CA44 4C084 AA13 NA14 ZB352

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 プレプロリソフスタフィン及びプロリソフスタフィンが存在
    しない成熟型リソフスタフィンエンドペプチダーゼを生成する方法であって、 （ａ）プロリソフスタフィンコード化要素を欠失する成熟型リソフスタフィン
    エンドペプチダーゼをコード化する塩基配列からなる遺伝的な構成物、及び前記
    成熟型リソフスタフィンエンドペプチダーゼをコード化する前記塩基配列に機能
    的にリンクするプロモーターの提供と； （ｂ）プレプロリソフスタフィン及びプロリソフスタフィンが存在しない、前
    記成熟型リソフスタフィンが前記宿主の細胞質に蓄積するような、前記段階（ａ
    ）の前記遺伝的な構成物を含み且つ発現するための宿主細胞の形質転換と；及び （ｃ）前記宿主細胞から前記成熟型リソフスタフィンの分離 によって特徴づけられる方法。
  2. 【請求項２】 前記段階（ａ）は、前記プロリソフスタフィンコード化要素
    が欠失する、成熟型リソフスタフィンエンドペプチダーゼをコード化する塩基配
    列からなり、開始する開始配列へ５´末端で機能的にリンクし、誘発可能なプロ
    モーターへ５´末端で機能的にリンクした構成物を提供されることを特徴とする
    請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記段階（ａ）は、ＩＰＴＧの誘発可能なプロモーターから
    なる構成物を提供されることを特徴とする請求項１若しくは２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記段階（ａ）は、バクテリオファージＴ７φ１０プロモー
    ターからなる構成物を提供されることを特徴とする前述までに記載の請求項のう
    ち何れか一つに記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記段階（ａ）はまた、前記プロモーターに機能的にリンク
    するリプレッサーからなる構成物を提供されることを特徴とする前述までに記載
    の請求項のうち何れか一つに記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記段階（ａ）はまた、ｌａｃＩ９リプレッサー遺伝子から
    なる構成物を提供されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記段階（ｂ）において、Ｅ．コリが形質転換されることを
    特徴とする前述までに記載の請求項のうち何れか一つに記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記段階（ｃ）において、前記成熟型リソフスタフィンが ｉ）ライセートを産出するための前記宿主細胞の溶解と； ｉｉ）前記ライセートを陰イオン交換レジンへ通過並びにスタフィロライティ
    ックな活性を表現する分画の回収及び収集と； ｉｉｉ）前記段階ｉｉ）の前記収集された分画の酸性化並びに該酸性化された
    収集された分画を陽イオン交換レジンへ通過並びにスタフィロライティックな活
    性を表現する分画の回収及び収集 によって分離されることを特徴とする前述までに記載の請求項のうち何れか一つ
    に記載の方法。
  9. 【請求項９】 プレプロリソフスタフィン及びプロリソフスタフィンが存在
    しない成熟型リソフスタフィンエンドペプチダーゼを発現する宿主を形質転換す
    るための発現構成物であって、前記プロリソフスタフィンコード化要素を欠失す
    る成熟型リソフスタフィンエンドペプチダーゼをコード化する塩基配列、及び前
    記成熟型リソフスタフィンエンドペプチダーゼをコード化する前記塩基配列に機
    能的にリンクするプロモーターからなることを特徴とする構成物。
  10. 【請求項１０】 前記プロリソフスタフィンコード化要素を欠失する成熟型
    リソフスタフィンエンドペプチダーゼをコード化する前記塩基配列は、開始する
    開始配列へ５´末端で機能的にリンクし、誘発可能なプロモーターへ５´末端で
    機能的にリンクしていることを特徴とする請求項９に記載の構成物。
  11. 【請求項１１】 前記プロモーターが、ＩＰＴＧの誘発可能なプロモーター
    であることを特徴とする請求項９若しくは１０に記載の構成物。
  12. 【請求項１２】 前記プロモーターが、バクテリオファージＴ７φ１０プロ
    モーターであることを特徴とする請求項９、１０若しくは１１に記載のうち何れ
    か一つに記載の構成物。
  13. 【請求項１３】 前記構成物がまた、前記プロモーターに機能的にリンクす
    るリプレッサーからなることを特徴とする請求項９乃至１２に記載のうち何れか
    一つに記載の構成物。
  14. 【請求項１４】 前記リプレッサーが、ｌａｃＩ９リプレッサー遺伝子であ
    ることを特徴とする請求項１３に記載の構成物。
  15. 【請求項１５】 請求項９乃至１４に記載のうち何れか一つによる構成物を
    含むために形質転換された宿主細胞からなる遺伝子工学的に改変された宿主細胞
    であって、上記のように形質転換された前記遺伝子工学的に改変された宿主細胞
    が、プレプロリソフスタフィン及びプロリソフスタフィンが存在せず成熟型リソ
    フスタフィンエンドペプチダーゼを細胞質で発現することを特徴とする遺伝子工
    学的に改変された宿主細胞。
  16. 【請求項１６】 前記宿主細胞がＥ．コリであることを特徴とする請求項１
    ５に記載の遺伝子工学的に改変された宿主細胞。
  17. 【請求項１７】 請求項１乃至８に記載のうち何れか一つによる方法によっ
    て生成される物質の合成物であって、プレプロリソフスタフィン及びプロリソフ
    スタフィンが存在せず成熟型リソフスタフィンエンドペプチダーゼからなること
    を特徴とする物質の合成物。
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