KR100635426B1

KR100635426B1 - 재조합 성숙 리소스타핀의 발현

Info

Publication number: KR100635426B1
Application number: KR1020027004972A
Authority: KR
Inventors: 간 쉬암 카트리; 라울 샤르마
Original assignee: 바라트 바이오테크 인터내셔날, 리미티드; 카운슬 오브 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치
Priority date: 1999-10-19
Filing date: 1999-10-19
Publication date: 2006-10-18
Also published as: AU5995599A; CA2388003A1; KR20020064886A; JP2003512050A; AU784354B2; EP1224271A4; BR9917526B1; BR9917526A; ATE430799T1; WO2001029201A1; NZ518963A; EP1224271A1; CA2388003C; CN1267551C; EP1224271B1; MXPA02003885A; CN1406278A; DE69940859D1; US6897041B1

Abstract

스태필로코쿠스 시뮬란스 (Staphylococcus simulans)의 리소스타핀 유전자의 일부를 클로닝하고, IPTG-유도가능한 프로모터 및 리보좀 결합 부위의 전사 조절 하에 이. 콜라이 (E. coli)의 세포질에서 과발현시켜 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀 없이 성숙 리소스타핀을 얻었다. 형질전환된 숙주 세포의 IPTG 유도는 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀이 전혀 없는 세포내 가용성 성숙 리소스타핀 (27 kDa)을 생산한다. 이렇게 형성된 성숙 리소스타핀은 번역 후 변형을 필요로 하지 않는다. 이렇게 형성된 성숙 리소스타핀은 스태필로코쿠스 감염의 치료 및 예방에 사용할 수 있다.

리소스타핀, 프리프로리소스타핀, 프로리소스타핀, 스태필로코쿠스 시뮬란스

Description

재조합 성숙 리소스타핀의 발현 {Expression of Recombinant Mature Lysostaphin}

본 발명은 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀 없이 성숙 리소스타핀을 재조합 박테리아 숙주에서 발현하는 방법, 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 성숙 리소스타핀을 코딩하는 벡터, 및 성숙 리소스타핀을 발현하는 유전공학적으로 조작된 박테리아 숙주에 관한 것이다.

스태필로코쿠스 감염은 스태필로코쿠스 식중독, 화상 및 상처 감염, 및 수유 반추동물의 유선 감염을 통해 인류에게 매우 많은 육체적 및 경제적 손실을 초래한다. 이들 감염은 종종 통상의 항생제에 대한 내성을 나타내거나, 일단 항생제의 사용이 중단되면 재발하는 경향이 있다. 스태필로코쿠스 시뮬란스 바이오바르 스태필로리티쿠스 (Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus)는 세포벽의 펩티도글리칸에서 펜타글리신 결합을 가수분해하는 속명 "리소스타핀"으로서 공지된 세포외 아연 메탈로프로테아제 글리실글리신 엔도펩티다제를 생산한다. 결과적으로, 리소스타핀은 스태필로코쿠스 종을 파괴하는 활성을 나타내지만, 모든 다른 속에 대해서는 불활성을 나타낸다. 생존가능한 스태필로코쿠스 세포에 대한 리소스타핀의 이러한 독특한 성질은 현재 사용되는 항-스태필로코쿠스 항생제의 작용 메카니즘과는 상당히 다른 항생제 메카니즘을 제공한다. 따라서, 리소스타핀은 스태필로코쿠스 질환의 치료 및 예방의 신규 방법을 제공할 수 있다. 그러나, 자세한 물리적 및 생화학적 연구 뿐만 아니라, 스태필로코쿠스 감염을 치료 및 예방하는 리소스타핀의 잠재력을 평가하기 위해 스태필로코쿠스 시뮬란스 바이오바르 스태필로리티쿠스로부터 리소스타핀을 정제하는 것은 어려운데, 이는 낮은 수준으로 발현되고 동시에 천연 공급원으로부터 강한 독소가 분비되기 때문이다.

야생형 리소스타핀 유전자는 프리프로엔자임을 코딩하는데, 이 효소는 N-말단에 38개의 아미노산 잔기로 된 전형적인 분비 신호 펩티드를 갖는 도메인, 이 펩티드 이어서 13개의 아미노산 서열의 7개 탠덤 반복부로 된, 친수성 및 고도로 정렬된 도메인, 이어서 246개 아미노산을 함유하는 소수성 성숙 리소스타핀 자체를 갖는 도메인으로 구성되어 있다. 성숙 효소는 27 kDa의 단량체이고 디술피드 결합을 함유하지 않는다.

프로리소스타핀이 성숙 리소스타핀으로 전환되는 것은 스태필로코쿠스 시뮬란스의 배양 배지 내의 세포외에서 일어나고, 이 때, 프로엔자임의 친수성 탠덤 반복부의 일부가 제거된다.

리소스타핀 엔도펩티다제의 야생형 유전자 (end)는 스태필로코쿠스 시뮬란스 바이오바르 스태필로리티쿠스의 큰 β-락타마제 양성 플라스미드에 위치한다 (Heath, L. S., H. E. Heath and G. L. Sloan (1987) "Cloning of the lysostaphin gene of S. simulans biovar staphylolyticus" Abstr. Ann. Meet. Am. Soc. Microb. H58p149; Heath, L. S., H. E. Heath and G. L. Sloan, (1987) "Plasmid encoded lysostaphin endopeptidase gene of S. simulans biovar staphylolyticus." FEMS Microb. Lett. 44: 129-133). 완전한 오페론이 클로닝되어 있고 (Recsei P. A., A. D. Gruss and R. P. Novick (1987)"Cloning, sequence, and expression of the lysostaphin gene from Staphylococcus simulans." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1127-1131; Heinrich P., R. Rosenstein, M. Bohmer, P. Sonner and F. Gotz (1987)" The molecular organization of the lysostaphin gene and its sequences repeated in tandem. "Mol. Gen. Genet. 209: 563-569, and U. S. Patent No. 4,931,390, issued June 5,1990 to Recsei), 완전한 유전자는 프로모터 요소를 따라 시퀀싱되었다. 이들 문헌에는 세포외에서 프로리소스타핀 및 리소스타핀으로 전환되는 프리프로리소스타핀을 이. 콜라이 (E. coli)에서 발현하는 것이 보고되어 있다. 이 연구는 야생형 리소스타핀 엔도펩티다제 프로모터를 사용하여 수행하였다. 프로리소스타핀은 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 프로모터의 전사 조절 하에 진핵 시스템에서도 발현된 바있다 (Williamson C. M., A. J. Bramley and A. J. Lax (1994) "Expression of the lysostaphin gene of Staphylococcus simulans in a eukaryotic system." Appl Environ Microbiol ; 60 (3): 771-776).

리소스타핀 엔도펩티다제의 생산을 위한 초기 방법은 스태필로코쿠스 시뮬란스로부터 이 효소를 직접 정제하거나 (Schindler C. A. and V. T. Schuardt (1965) "Purification and properties of lysostaphin : a lytic agent for the Staphylococcus aureus." Biochem. Biophys. Acta. 97: 242-250; Iverson O. J. and A. Grov (1973) "Studies on lysostaphin. separation and characterization of three enzymes." Eur. J. Biochem. 38: 293-300; Valisena S., F. E. Varaldo and G. Satta (1982) "Purification and Characterization of three separate bacteriolytic enzymes excreted by S. aureus, S. simulans and S. saprophyticus." J. Bact. 151: 636-647; Sugai M., T. Akiyama, Y. Miyake, E. Ishida and H. Suginaka (1990) "Rapid purification of lysostaphin for analysis of cell-wall proteins." J. Microb. Meth. 12: 133-138; and Marova I. and V. Dadak (1993) "Modified simplified method for isolation of lysostaphin from the culture filtrate of Staphylococus staphylolyticus." Folia Microbiol. 38: 245-252), 프로리소스타핀을 발현하고 스태필로코쿠스 시뮬란스 추출물을 사용하여 프로펩티드 부위를 절단하여 제거함으로써 프로리소스타핀을 성숙 리소스타핀으로 전환하는 것이었다 (Marova and Dadak, supra; Williamson et al., supra). 이 두 종래 경로는 다른 단점을 갖는다. 성숙 리소스타핀이 천연 공급원으로부터 단리될 때, 성숙 리소스타핀은 피로겐(pyrogen)/알레르겐(allergen) 및(또는) 프로리소스타핀이나 프리프로리소스타핀으로 오염될 수 있다. 먼저 발현된 프로리소스타핀이 프로엔자임으로서 발현될 때, 이 프로리소스타핀은 천연 공급원으로부터 얻은 추출물 효소를 사용하여 성숙 리소스타핀으로 전환되어야 한다. 이 전환 과정에서 리소스타핀이 피로겐 또는 다른 오염물질로 오염될 수 있다.

리소스타핀의 프리프로 형태 또는 프로 형태를 발현하지 않고 성숙한 형태의 리소스타핀을 클로닝 및 직접 발현하는 것은 선행 기술에는 보고된 적없다. 본원에는 프리프로리소스타핀 또는 프로리소스타핀의 중간체 생성을 요하지 않는, 리소스타핀의 직접 생산 방법이 기재되어 있다. 결론적으로, 본원의 방법에 의해 생산되는 리소스타핀에는 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀이 없다.

<발명의 요약>

리소스타핀의 항-스태필로코쿠스 효능을 자세히 평가하는 것은 안전하고 병원성이 없는 공급원으로부터 고도로 정제된 리소스타핀을 대량으로 쉽게 사용할 수 있는 지에 달려 있기 때문에, 본 발명은 첫째로, 재조합 플라스미드를 함유하도록 형질전환된 숙주 세포, 바람직하게는 이. 콜라이 (E. coli)세포의 세포질에서 성숙 리소스타핀의 과발현을 유도하는 재조합 플라스미드에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 플라스미드를 함유하고 발현하도록 형질전환된 숙주 세포 (바람직하게는 형질전환된 이. 콜라이 세포), 상기 플라스미드로 형질전환된 적당한 숙주를 사용하여 성숙 리소스타핀을 생산하는 방법, 및 상기 형질전환된 세포에 의해 생산되고 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀이 없는 리소스타핀을 포함한다. 본 발명에 따라 생산된 재조합 리소스타핀은 하기 본원에 기재된 두 가지 크로마토그래피 단계를 포함하는 방법을 이용하여 균질한 정도가지 정제한다. 재조합 생성물의 생화학적 성질, 효소적 성질 및 생물리적 성질을 특징규명하여 상기 재조합 생성물의 적당한 정성 조절 분석법을 개발하였다.

구체적으로, 본 발명의 제1 실시양태는 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀이 없는 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀을 코딩하는 요소가 없는 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제 코딩 뉴클레오티드 서열, 및 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유전적 제작물을 제공하고; 이 유전적 제작물을 함유하고 발현하도록 숙주 세포를 형질전환하여 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀 없이 성숙 리소스타핀이 상기 숙주의 세포질에 축적되도록 하고; 이어서, 상기 숙주 세포로부터 성숙 리소스타핀을 단리하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제2 실시양태는 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀 없이 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제를 발현하도록 숙주를 형질전환시키기 위한 발현 제작물에 관한 것으로, 이 제작물은 프로리소스타핀-코딩 요소가 없는 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제 코딩 뉴클레오티드 서열; 및 이 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제 코딩 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.

본 발명의 제3 실시양태는 형질전환된 세포가 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀 없이 성숙 리소스타핀을 발현하도록 본원에 기재된 발현 제작물로 형질전환된 유전공학적으로 조작된 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명의 제4 실시양태는 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀 없이 순수한 리소스타핀을 함유하는, 본원의 방법에 따라 제조된 조성물에 관한 것이다.

도 1은 분비 신호 및 5' 반복 모티프가 없는 증폭된 리소스타핀 유전자를 보여주는 전기영동 겔 사진이다.

도 2는 본 발명에 따른 pEnd-11b 플라스미드 제작물의 제작을 보여주는 도식이다.

도 3은 유도 전ㆍ후에 pEnd-11b를 함유하도록 형질전환된 이. 콜라이 세포용해물에 있는 전체 단백질의 전기영동 겔 사진이다.

도 4는 pEnd-11b를 함유하도록 형질전환된 이. 콜라이에서 재조합 성숙 리소스타핀의 발현도를 보여주는 12% SDS-PAGE 겔의 밀도측정 스캔이다.

정의:

본 명세서를 명백하고 일관성이 있게 이해하도록 하기 위해, 본원에서 사용되는 정의는 하기와 같다.

제작물 또는 발현 제작물 - 적당한 숙주 세포내로 형질전환될 때 코딩된 단백질의 발현을 유도하는 하나 이상의 조절 서브-서열에 작동가능하게 연결된 원하는 단백질 코딩 서브-서열 하나 이상을 함유하는 DNA 제작물. 이 제작물은 형질전환 세포에 항생제 내성 또는 영양공급 제한을 부여하는 서브-서열과 같은, 상기 제작물을 함유하도록 형질전환된 숙주 세포를 선별하기 위한 수단을 코딩하는 서브-서열, 다중 클로닝 부위 등을 포함할 수도 있다.

작동가능하게-연결된 - 연결된 DNA 서열을 말할 때, "작동가능하게-연결된"은 서열들이 동일한 리딩 프레임으로 존재하는 것을 말하며, 업스트림 조절 서열은 다운스트림 구조 서열과 작동가능하게 연결되어 있을 때 그 기능을 수행할 것이다. 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 반드시 서로 물리적으로 직접 연결되어 있을 필요는 없지만, 연결된 서열의 작동 관계를 방해하지 않는 뉴클레오티드가 상기 서열 사이에 삽입됨으로써 분리되어 있을 수 있다.

중합효소 연쇄 반응 (PCR) - 변성 주기, 한쌍의 프라이머를 사용한 어닐링 주기, 및 DNA 폴리머라제를 사용한 익스텐션 (extension)을 이용하여 많은 카피 수의 원하는 폴리뉴클레오티드 서열을 생성시키는 기술. 이 반응에 대한 설명은 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호를 참조한다. PCR은 핵산의 조작에 널리 사용된다.

프로모터 - RNA 폴리머라제가 오페론의 시작 부위에 결합하는 DNA 서열 부위. 일단 RNA 폴리머라제가 결합되면, 이 폴리머라제는 5'에서 3' 방향으로 DNA를 따라 이동하여 상응하는 RNA 서열을 합성한다.프로모터가 RNA 합성의 개시 신호로 작용하지만, 프로모터 자체는 전사되지 않는다.

유전공학:

제한효소 엔도뉴클레아제를 사용한 절단, PCR에 의한 증폭, 혼성화, 결찰 (ligation), 겔 전기영동에 의한 분리 및 단리, 이종 DNA를 사용한 세포의 형질전환, 성공적인 형질전환체 선별 등을 포함하는, DNA 조작을 위한 하기 다수의 단계는 당업자에게 잘 공지되어 있고 널리 수행되고 있으므로, 본원에 그다지 상세히 기재되어 있지는 않다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 이용된 DNA 프로토콜은 문헌 (Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis, (1989),"Molecular Cloning : A Laboratory Manual, "Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York, NY)에 자세히 기재되어 있다.

숙주 세포:

본원에 기재된 재조합 DNA를 숙주 미생물에 도입하여 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀 없이 성숙 리소스타핀을 생산한다. 상기 숙주 미생물은 형질전환될 수 있는 임의의 박테리아 또는 진핵 숙주일 수 있다. 바람직한 숙주는 이. 콜라이이다. 간결성 및 명료성을 위해, 하기 개시 내용은 이. 콜라이 형질전환체의 설명으로만 제한되어 있다. 이. 콜라이는 학계 및 산업계 둘다에서 쉽게 사용가능하고, 성장 속도가 빠르고, 그의 유전적 성질이 잘 이해되어 있고 쉽게 조작가능하고, 이. 콜라이에 대한 완전한 게놈 서열이 존재하기 때문에 바람직한 미생물이다. 그러나, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 등과 같은 다른 원핵 미생물 뿐만 아니라, 효모와 같은 진핵생물에서도 동일한 성공률을 나타낸다. 결과적으로, 하기 논의는 어떤 방식으로든 본 발명을 이. 콜라이에서의 그의 예시 실시양태로 제한하지 않는다.

플라스미드 제작:

공개된 리소스타핀 (lysostaphin) 엔도펩티다제 (end) 서열 (문헌 (Recsie et al., supra) 참조)을 기초로 하여 성숙 리소스타핀에 대한 유전자를 선택적으로 증폭시키는 PCR 프라이머를 설계하였으며, 에스. 시뮬란스 (S. simulans) 바이오바르 스태필로리티쿠스 (biovar staphylolyticus) NRRL B-2628의 전체 DNA를 사용하여 PCR에 의해 end 유전자의 선택적인 증폭을 수행하였다 (Agricultural Research Service Culture Collection, formerly Northern Regional Research Laboratory, National Center for Agricultural Utilization Research, 1815 North University St., Peoria, Illinois 61604-3999, USA). 이어서, PCR-매개 부위-지시적 돌연변이유발에 의해 리소스타핀의 신호 펩티드 및 프로펩티드에 대한 코딩 서열을 성숙 리소스타핀 (AATHE)의 개시 직전 개시 메티오닌 코돈 (ATG)으로 대체하였다. 클로닝 목적을 위해 NdeI 및 BamHI에 대한 제한 엔도누클레아제 부위를 변형된 유전자의 5' 및 3' 말단에 각각 혼입시켰다. 프루프-리딩 (proof-reading) 열안정성 효소 "VENT" DNA 폴리머라제 (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, USA)를 사용하였다. PCR 산물에 의해 입증되고, 에티듐 브로마이드 염색된 아가로스 겔 전기영동에서 765 bp 크기의 단일 밴드로 검출된 바와 같이 (도 1), 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제에 대한 변형된 유전자를 성공적으로 증폭시켰다.

이어서, 증폭된 성숙 리소스타핀을 프로모터 서열, 바람직하게는 유도가능한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결시킨다. 하기에 보다 상세히 기술된 도 2에 나타낸 바와 같이, 바람직한 T7φ10 유도가능한 프로모터는 리프레서 유전자 lacI⁹에 작동가능하게 연결된 박테리오파지 프로모터이다.

PCR 산물을 NdeI 및 BamHI 제한 효소로 절단하고, 오픈 리딩 프레임을 pET-11b 발현 벡터 (Stratagene, LaJolla, California, USA)내의 NdeI와 BamHI 부위 사이에 삽입하여, 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제 ORF에 대한 유전자가 강력하고 조절가능한 박테리오파지 T7φ10 프로모터의 전사 조절하에 놓이도록 하였다 (도 2 참조).

염료 종결 화학을 이용한 ABI Prism 377 자동화 DNA 서열분석기로 DNA의 서열을 분석하는 자동화 디데옥시 쇄 종결 방법에 의해 재조합 재작물을 확인하였다. 얻어진 뉴클레오티드 서열은 성숙 리소스타핀을 코딩하는 공지의 서열과 완전히 일 치하였다.

성숙 리소스타핀의 발현:

성숙 리소스타핀에 대한 유전자를 이. 콜라이 (E. coli) BL21 (DE3), ATCC 47092 (American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA)의 세포질에서 T7φ10 프로모터의 전사 조절하에 발현시켰다. 통상의 방법 (염화칼슘법)에 의해 pEnd-11b로 지칭되는 재조합 플라스미드로 바람직한 숙주 세포인 이. 콜라이 BL21 (DE3)을 형질전환시켰다. 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토시드 (IPTG)를 0.4 mM의 최종 농도로 가하여 메트-리소스타핀 단백질에 상응하는 분자량 약 27 kDa인 밴드의 과다발현을 유도하였다. SDS-PAGE에 의해 분석한 바와 같이 (도 3 참조), 유도된 밴드의 크기는 이전에 보고된 바와 같은 성숙 리소스타핀의 분자량과 완전히 일치하였다. 12% SDS PAGE의 농도계측 (densitometric) 스캔 결과는 유도된 밴드가 유도된 세포 추출물내 총 단백질의 약 20.2%를 구성함을 보여주었다 (도 4 참조).

스태필로코쿠스 용해 활성은 폴리아크릴아미드 겔에 혼입된 스태필로코컬 아우레우스 (Staphylococcal aureus)의 용해로 인해 제거 지역으로 시각화된 동일한 27 kDa 밴드에 위치하였다. 상기 프로토콜에 따라 형성된 리소스타핀 엔도펩티다제는 SDS 및 2-메르캅토에탄올 중의 비등 이후에 조차 그의 활성을 회복하며, 이는 선행 연구의 보고 (Leclerc D. and A. Asselin (1989) "Detection of cell wall hydrolases after denaturing polyacrylamide electrophoresis." Can. J. Microb. 35: 749-753)와 일치하였다.

재조합 리소스타핀 엔도펩티다제의 정제:

컴퓨터 프로그램 DNASTAR (DNASTAR, Inc., Maison, Wisconsin, USA)로 pEnd-11b에서 삽입체의 뉴클레오티드 서열로부터 번역된 메트-리소스타핀 엔도펩티다제의 서열을 분석하였다. 얻어진 데이타는 단백질을 정제하는 효과적인 수단을 설계하는데 유용하였다. 메트-리소스타핀 엔도펩티다제의 순 (net) 전하는, 중성 pH에서 적정 곡선으로부터 측정한 바로는, +11.39인 것으로 나타났으며, 이는 메트-리소스타핀이 염기성 잔기의 8.91% (빈도)/11.04% (중량)를 갖는 염기성 단백질임을 분명히 나타낸다. 음이온 교환 크로마토그래피의 경우 사용되는 pH 8.5에서는, 높은 비율의 이. 콜라이 단백질이 Q 세파로스 (Sepharose) 수지에 흡수되었지만, 재조합 리소스타핀 엔도펩티다제는 100 mM의 염 농도에서 용출물 중에 존재하는 것으로 나타났다.

이어서, 취합된 양성 분획을 pH 5.5의 완충액에 대하여 투석하여, 많은 숙주 (이. 콜라이) 단백질이 변성되고 용액으로부터 침전됨으로써 매우 순수한 리소스타핀 용액 제제를 얻었다. pH 5.5에서, 고도로 염기성 단백질인 성숙 리소스타핀은 +18.6의 순 전하를 갖는다. 이렇게 높은 순 양전하는 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 리소스타핀 엔도펩티다제 제제로부터 소량의 오염물질을 제거하는 것을 돕는다. 순수 단백질을 함유하는 분획을 저장 완충액에 대하여 투석하고, -20 ℃에서 분획으로 보관하였다.

선행 기술 연구에서는, 암모늄 술페이트 침전 및 DEAE-셀룰로스 크로마토그래피를 이용하여 리소스타핀을 배양물 1 리터 당 4.3 mg의 수율로 정제하였다 (Schindler and Schuardt, supra). 또한, 이온 교환 크로마토그래피 (Iversen and Grov, supra 참조), 또는 등전점 포커싱과 G-100 겔 여과 (문헌 (Wadstrom T. and O. Vesterberg (1971)"Studies on endo-beta-acetyl-glucosaminidase, staphylolytic peptidase, and N-acetylmuramyl-L-alanineamidase in lysostaphin and from S. aureus."Acta Pathol. Microbiol. Scand. 79: 248-264) 참조)의 조합을 이용하여 에스. 시뮬란스의 배양 여과물로부터 리소스타핀을 정제하는 많은 방법들이 보고되어 왔다. 키틴-세파로스 CL4B 상에서의 친화성 정제를 기초로 하는 리소스타핀의 정제는 또한 문헌 (Valisena et al., supra)에 보고되었다. 문헌 (Sugai et al., supra)에는 시바크론 블루 (Cibacron Blue) 3G-A (Tskgel Blue-5PW) 상에서의 염료-리간드 친화성 고압 액체 크로마토그래피를 포함하는 방법이 보고되어 있다. 그러나, 시바크론 블루는 리소스타핀 활성에 대해 이롭지 못한 것으로 보고되었다 (Marova and Dadak, supra).

마로바 (Marova) 및 다다크 (Dadak)는 또한 에스. 스태필로리티쿠스 (S. staphylolyticus)의 배양 여과물로부터 리소스타핀을 단리하는 정제 프로토콜에 의해, 한외여과 (ultrafiltration), DEAE-셀룰로스 크로마토그래피, 및 세파덱스 (Sephadex) G-50 상에서의 겔 여과 크로마토그래피를 포함한 일련의 기술을 사용하여 리소스타핀을 75.6%의 수율로 얻었음을 보고하였다. 이 프로토콜의 결점은 겔 여과 크로마토그래피를 포함한 세가지 다른 크로마토그래피 단계들에 의존한다는 것인데, 이는 귀찮고 시간 소모적인 방법이다.

본원에서 사용된 생산 방법은 실험 진탕 플라스크 배양물 1 리터 당 실질적 으로 균일한 순도의 정제된 성숙 리소스타핀 8.9 mg을 생산한다 (실시예의 표 참조). 좋은 스태필로코쿠스 용해 활성 (11,960 U/mg의 특이적 활성은 시그마 (Sigma; St. Louis, Missouri, USA)사에 의해 제공되는 성숙 리소스타핀에 필적함)을 갖는 리소스타핀 엔도펩티다제를 총 11-배 정제하였다. 본 발명에 따라 생산된 리소스타핀의 회수율은 70%이었다. 정제 순도는 코마시에 블루 (coomassie blue)로 염색된 12% SDS PAGE 겔 상에서 보이는 바와 같이 거의 균일하였다.

따라서, 본 발명에 의해 실질적으로 균일한 재조합 리소스타핀 엔도펩티다제를 안전하고 비-병원성인 숙주에서 생산할 수 있게 되었다. 이 방법은 실험실 규모로 수행하거나 또는 규모를 늘려 산업 수준의 생산으로 수행할 수 있다.

본 발명에 따라 생산된 재조합 리소스타핀 엔도펩티다제의 생화학적 및 효소적 특성화:

암폴린 (ampholine)을 사용한 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 등전점 포커싱으로부터 얻은 실험값은 9.8이었으며, 이는 천연 성숙 리소스타핀에 대해 문헌에 보고된 것과 일치하였다. 이동성 (Rf) 대 표준 로그 분자량의 곡선으로부터 계산한 재조합 리소스타핀 엔도펩티다제의 서브유닛 분자량은 26.9 kDa인 것으로 나타났다. 이 값은 이론적으로 측정된 값인 27.2 kDa 및 상기 인용된 문헌에 보고된 값에 매우 근접하는 값이다.

본 발명에 의해 "세파크릴 (Sephacryl) S-200" (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden) 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 생산된 재조합 리소스타핀의 분자량은 약 27 kDa인 것으로 밝혀졌으며, 에스. 시뮬란스 (S. simulans) 배양 여과물로부터 얻은 성숙 리소스타핀에 대한 것과 완전히 일치하였다. 본 발명에 따라 생산된 단백질에 대한 리소스타핀 활성 속도는 1 내지 10분의 선형이었으며, 특이적 활성은 시그마사의 (Sigma's) 구체화된 조건하에 시판되는 리소스타핀 (Sigma)에 필적하는 것으로 나타났다. 재조합 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제는 약 47 ℃ 및 약 7.0 내지 약 9.0의 pH 범위 (약 8.0에서 최대값을 가짐)에서 가장 활성적인 것으로 나타났다. 그러나, 특히 본 발명에 따라 제조된 단백질 제제는 약 10.0의 pH에서 그의 활성의 약 82%를 보유하였다. 다른 시간 간격 동안 다른 온도에서 인큐베이션하는 경우, 본 발명에 따른 단백질 제제는 약 10분의 인큐베이션 시간 동안 약 50 ℃ 이하에서 안정하였으며, 이 파라메타를 벗어나는 경우 단백질은 그의 활성을 급속하게 상실하였다 (예를 들어, 단백질은 60 ℃에서 약 10분의 열처리 후에 그의 활성의 약 40 %만을 보유하였다). 20 ℃ 및 30 ℃에서, 재조합 리소스타핀은 24시간 이상 동안 안정하였다. 40 ℃에서, 재조합 리소스타핀은 4시간 동안 매우 안정하였으며, 70 %의 잔류 활성을 보유하였다. 본 발명을 이용하여 얻어진 재조합 리소스타핀의 특성은 보고된 최적 온도 및 pH가 각각 37 ℃ 및 7.5이었다는 점에서 선행 문헌 (Schindler and Schuardt, Recsei et al., and Iverson and Grov, supra)의 기록과는 차이가 있었다. 대조적으로, 본 발명에 따라 생산된 리소스타핀은 약 47 ℃ 및 약 pH 8.0에서 최적의 활성을 갖는다.

하기 실시예는 본원에 기재 및 청구된 본 발명에 대한 보다 완전한 이해를 돕기위하여 포함된 것일 뿐이다. 하기 실시예는 어떤 식으로든지 청구된 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다.

재조합 발현 벡터의 제작:

도 2를 참고로, 하기 프라이머를 사용하는 PCR-매개 부위-지시적 돌연변이유발에 의해, 분비 신호 펩티드, 및 프로펩티드를 나타내는 일렬 반복부를 ATG 개시 코돈으로 대체한 다음, 5' 말단에 EcoRI 제한 부위, 및 리소스타핀에 대한 구조 유전자의 종결 코돈 바로 다음에 BamHI 제한 부위를 생성하였다.

5'-ACTGAATTCCATATGGCTGCAACACATGAACATTCAGCAC-3'

(서열 1) (밑줄 부위는 NdeI 제한 부위임); 및

5'-CAGATCTGGATCCTCACTTTATAGTTCCCCAAAGAACAC-3'

(서열 2) (밑줄 부위는 BamHI 제한 부위임).

퍼킨-엘머 세투스 (Perkin-Elmer Cetus) 열 순환기에서 3'에서 5'으로의 엑소누클레아제 프루프 리딩 활성을 갖는 "VENT" DNA 폴리머라제 (New England Biolabs)를 사용하여 PCR에 의해 표준 반응으로 플라스미드 pRJ5 (Recsei et al, supra, ATCC 67079)로부터 변형된 유전자를 선택적으로 증폭시켰다. 증폭 조건은 94 ℃에서 1분, 65 ℃에서 1분, 및 72 ℃에서 40초의 25 사이클이었다. 증폭된 단편은 도 1에 나타나 있으며, 여기서 M은 분자량 마커의 레인이고, 레인 1 및 2는 765 염기쌍의 증폭 생성물을 나타내는 이중 증폭이다.

증폭된 성숙 리소스타핀 유전자에서 분비 신호 및 일렬 반복부를 빼고 ATG 개시 코돈에 작동가능하게 연결시키고 나서 lacI⁹ 리프레서를 코딩하는 서열 및 박테리오파지 T7φ10 프로모터에 라이게이션하여, 5' ATG 개시 코돈을 갖는 성숙 리소스타핀 유전자가 lacI⁹ 리프레서 및 IPTG 유도가능한 T7φ10 프로모터에 작동가능하게 연결된 제작물을 얻었다. lacI⁹ 및 프로모터 서열은 pET-11b와 같은 쉽게 이용가능한 벡터로부터 얻을 수 있다.

프로모터에 작동가능하게 연결된 성숙 리소스타핀을 포함하는 제작물을 NdeI 및 BamHI 제한 엔도누클레아제를 사용하여 절단하고, 상응하게 절단된 pET-11b 발현 벡터내에 삽입하여 T7φ10 프로모터의 전사 조절하에 있는 리소스타핀 유전자를 갖는 재조합 플라스미드 pEnd-11b를 생성시켰다.

성숙 리소스타핀의 세포질 발현 및 스태필로코쿠스 용해 활성의 위치화:

발현 숙주 이. 콜라이 BL21 (DE3)을 pEnd-11b로 형질전환시켰다. 밤새 배양한 이. 콜라이 BL21 (DE3)(pEnd-11b) 배양물 200 ㎕를 암피실린 50 ㎍/ml를 함유하는 루리아 베르타니 브로쓰 (Luria Bertani Broth) 25 ml 중에 접종하였다. 배양물을 37 ℃에서 강력 진탕하면서 0.6 (A600 nm)의 광학 밀도로 배양하고, 이어서 IPTG 0.4 mM을 첨가하여 이. 콜라이의 세포질에서 성숙 리소스타핀의 발현을 유도하였다. 3시간의 유도 후에, 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 50 mM Tris-HCl 2.5 ml 중에 재현탁시키고, 초음파처리에 의해 분쇄하고 원심분리하여 미립자 분획을 제거하였다. 공지의 프로토콜 (Laemmli U. K. (1970) "Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage T4. "Nature 227: 680-685)에 따라, 전체 세포 추출물 및 가용성 분획을 12% SDS-PAGE 겔 상에서 분석하고 코마 시에 브릴리언트 블루로 염색하였다. FUJI GELSCAN 농도계 (densitometer)를 사용하는 겔 농도계측에 의해 재조합 단백질의 발현 수준을 결정하기 위해 12% SDS PAGE를 분석하였다. 결과는 도 4에 나타내었으며, 이는 발현된 성숙 리소스타핀이 세포질 단백질의 20.2%에 해당함을 나타낸다.

스태필로코쿠스 용해 활성의 위치화:

문헌 (Sugai et al. (1990), supra)에 기재된 방법을 약간 변형하여 12% SDS-PAGE 겔에서 스태필로코쿠스 용해 활성 밴드를 위치화하였다. 전기영동에 사용된 완충계는 문헌 (Laemmli (1970), supra)에 보고된 것과 동일하였다. 요컨대, 1% (w/v 습윤 세포 질량) 에스. 아우레우스 (S. aureus) 237 세포를 포함하는 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 제조하였다. 바이오라드 미니프로테안 (BIORAD Miniprotean) 수직 판 겔 전기영동 어셈블리를 사용하여 4 ℃에서 20 mA의 일정한 전류로 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후에, 겔을 냉각 증류수로 철저히 세척하였다 (3 x 100 ml). 100 mM NaCl을 함유하는 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 중에서 37 ℃에서 30분 동안 최종 액침을 행하였다. 어두운 배경에서 간접광으로 활성 밴드를 가시화하였다.

성숙 리소스타핀의 정제:

밤새 배양한 이. 콜라이 BL21 (DE3)(pEnd-11b)의 형질전환체 배양물 10 ml를 암피실린 50 mg/ml를 함유하는 LB 브로쓰 2 L에 접종하고, 37 ℃에서 일정하게 교반 (200 rpm)하면서 0.6 (A600 nm)의 광학 밀도로 배양한 다음, IPTG를 0.4 mM의 최종 농도로 첨가하여 유도하였다. 유도 후에, 세포를 42 ℃에서 3시간 더 배양하 였다. 이어서, 유도된 세포를 소르발 (Sorvall) GS-3 로우터로 4 ℃에서 10분 동안 8,000 rpm으로 원심분리하고, 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.5, 100 mM NaCl 및 0.5 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 함유) 100 ml 중에 재현탁시켰다.

단계 I: 음이온 교환 크로마토그래피:

유리 칼럼을 음이온 교환 수지 "Q-세파로스 FF" (Pharmacia) 70 ml로 충전하고, 용해 완충액 100 ml로 평형화하였다. 유속을 2 ml/분으로 유지하였다. 단백질 용액을 칼럼에 가하고, 용출물을 각각 10 ml의 분획 부피로 수획하였다. 이어서, 칼럼을 동일한 완충액 100 ml로 세척하고, 앞에서와 같이 분획을 수획하였다. 피크 분획을 상기 기재된 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 스태필로코쿠스 용해 활성에 대하여 분석하였다.

단계 II: 산성화 및 양이온 교환 크로마토그래피:

리소스타핀을 함유하는 분획을 취합하고, 4 ℃에서 16시간 동안 20배 부피의 양이온 교환 완충액 (40 mM Tris-아세테이트 pH 5.5, 100 mM NaCl)에 대해 투석하였다. 투석물을 4 ℃에서 15분 동안 15,000 rpm으로 원심분리하고, 맑은 상청액을 양이온 교환 크로마토그래피에 사용하였다. 20 ml 용량의 유리 칼럼을 S-세파로스 FF (Pharmacia)로 충전하고, 양이온 교환 완충액 40 ml로 평형화하였다. 크로마토그래피 동안 분당 2 ml의 유속을 유지하였다.

상기로부터의 맑은 상청액을 평형화된 칼럼에 로딩하고, 칼럼을 5 베드 (bed) 부피 (100 ml)의 동일한 완충액으로 세척한 다음, 150 mM NaCl을 함유하는 동일한 완충액으로 5 베드 부피 세척을 수행하였다. 양이온 교환 완충액 중 150 mM NaCl 내지 500 mM NaCl의 100 ml 구배를 사용하여 매트릭스에 결합된 리소스타핀을 용출시켰다. 5 ml 부피의 분획을 수획하고, SDS-PAGE에 의한 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제의 존재 및 스태필로코쿠스 용해 활성에 대하여 분석하였다. 순수한 재조합 단백질을 함유하는 분획을 취합하고, 균질한 제제를 10배 부피의 저장 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 50% (v/v) 글리세롤)에 대하여 투석한 다음, -20 ℃에서 보관하였다. 수율은 8.9 mg/ml이었다. 단계별 수율 및 활성 데이타에 대하여는 하기 표를 참조한다:

정제 단계	총 부피 (ml)	총 단백질 (mg)	활성 (U/mg)	수율 (%)	정제 (배)
세포 추출물 (초음파 처리)	100	280	1086	100	-
가용성 분획	100	232	1250	96	1.15
음이온 교환	170	55.25	5169	94	4.76
산성화	174	43.50	5540	78	5.61
양이온 교환	37	17.80	11960	70	11.10

리소스타핀 활성 분석:

보고된 방법 (Robinson, J. M., J. K. Hardman and G. L. Sloan (1979) "Relationship between lysostaphin endopeptidase production and cell wall composition in Staphylococcus staphylolyticus." J. Bact. 137: 1158-1164)의 변형법에 의해 스태필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 237 세포의 용해를 모니터링하여 용액중의 리소스타핀 엔도펩티다제의 활성을 분석하였다. 요컨대, 활발하게 성장하는 에스. 아우레우스 (S. aureus) 237 세포를 씻어내고, 활성 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl) 중에 현탁시키고, 광학 밀도 (A600 nm)를 0.400으로 조정하였다. 통상의 분석은 37 ℃로 유지된 "in situ" 조절된 온도의 큐벳 홀더를 갖는 시마쯔 (Shimadzu) 2101 분광광도계에서 1 cm의 통로 길이 를 갖는 3.0 ml 석영 큐벳에 배열하였다. 적당하게 희석된 재조합 리소스타핀 용액의 분획을 현탁액에 가하고, 37 ℃에서 5분 동안의 인큐베이션 후에 600 nm에서 세포 OD 값의 감소를 기록하였다. 3 ml의 반응 부피로 37 ℃에서 5분 후에 에스. 아우레우스 (S. aureus) 237 세포 현탁액의 OD (A600 nm) 값을 0.001 감소시키는데 요구되는 효소의 양을 리소스타핀 1 유닛으로 정의하였다. 본 발명에 따라 얻어진 정제된 리소스타핀은 11,960 U/mg의 활성을 갖는다.

<110> Bharat Biotech International Limited et al. <120> Expression of Recombinant Mature Lysostaphin <130> pc021461 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer <400> 1 actgaattcc atatggctgc aacacatgaa cattcagcac 40 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer <400> 2 cagatctgga tcctcacttt atagttcccc aaagaacac 39

Claims

(a) 프로리소스타핀 (prolysostaphin) 코딩 요소가 없이 5' 말단에 개시 코돈을 포함하는 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제 (lysostaphin endopeptidase) 코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제 코딩 뉴클레오티드 서열이 5' 말단에서 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 유전적 제작물을 제공하는 단계;

(b) 단계 (a)의 유전적 제작물을 함유하고 발현하도록 숙주 세포를 형질전환하여, 프리프로리소스타핀 (preprolysostaphin) 및 프로리소스타핀 없이 성숙 리소스타핀을 상기 숙주의 세포질에 축적시키는 단계; 및

(c) 상기 숙주 세포로부터 성숙 리소스타핀을 단리하는 단계

를 포함하는, 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀이 없는 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (a)가 유도가능한 프로모터를 포함하는 제작물을 제공하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 (a)가 IPTG-유도가능한 프로모터를 포함하는 제작물을 제공하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 (a)가 박테리오파지 T7ø10 프로모터를 포함하는 제작물을 제공하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 (a)가 프로모터에 작동가능하게 연결된 리프레서 (repressor)를 추가로 포함하는 제작물을 제공하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 단계 (a)가 lac I^q 리프레서 유전자를 추가로 포함하는 제작물을 제공하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (b)가 이. 콜라이 (E. coli)의 형질전환을 포함하는 것인 방법.
(a) 프로리소스타핀 코딩 요소가 없는 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제 코딩 뉴클레오티드 서열, 및 상기 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제 코딩 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 포함하는 유전적 제작물을 제공하는 단계;

(b) 단계 (a)의 유전적 제작물을 함유하고 발현하도록 숙주 세포를 형질전환하여, 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀 없이 성숙 리소스타핀을 상기 숙주의 세포질에 축적시키는 단계; 및

(c) i) 숙주 세포를 용해시켜 세포용해물을 얻는 단계;

ii) 이 세포용해물을 음이온 교환 수지에 통과시키고 스태필로코쿠스 (Staphylococcus) 용해 활성을 나타내는 분획을 취합하는 단계;

iii) 단계 ii)의 합쳐진 분획을 산성화시키고, 산성화된 합한 분획을 양이온 교환 수지에 통과시키고, 스태필로코쿠스 용해 활성을 나타내는 분획을 취합하는 단계

에 의해 상기 숙주 세포로부터 성숙 리소스타핀을 단리하는 단계

를 포함하는, 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀이 없는 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제의 제조 방법.
프로리소스타핀 코딩 요소가 없이 5' 말단에 개시 코돈을 포함하는 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제 코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제 코딩 뉴클레오티드 서열이 5' 말단에서 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀 없이 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제를 발현하도록 숙주를 형질전환하기 위한 발현 제작물.
제9항에 있어서, 유도가능한 프로모터를 포함하는 제작물.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 프로모터가 IPTG-유도가능한 프로모터인 제작물.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 프로모터가 박테리오파지 T7ø10 프로모터인 제작물.
제9항 또는 제10항에 있어서, 프로모터에 작동가능하게 연결된 리프레서 (repressor)를 추가로 포함하는 제작물.
제13항에 있어서, 상기 리프레서가 lac I^q 리프레서 유전자인 제작물.
제9항 또는 제10항에 따른 제작물을 함유하도록 형질전환되어 프리프로리소스타핀 및 프로리소스타핀 없이 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제를 세포질에 발현하는 숙주 세포를 포함하는, 유전공학적으로 조작된 숙주 세포.
제15항에 있어서, 상기 숙주 세포가 이. 콜라이 (E. coli)인 유전공학적으로 조작된 숙주 세포.
삭제
제8항에 있어서, 상기 (a) 단계가, 5' 말단에서 개시 코돈에 작동가능하게 연결되고 프로리소스타핀 코딩 요소가 없는 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제 코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 성숙 리소스타핀 엔도펩티다제 코딩 뉴클레오티드 서열이 5' 말단에서 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 유전적 제작물을 제공하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 단계 (a)가 IPTG-유도가능한 프로모터를 포함하는 제작물을 제공하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 단계 (a)가 박테리오파지 T7ø10 프로모터를 포함하는 제작물을 제공하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 단계 (a)가 프로모터에 작동가능하게 연결된 리프레서를 추가로 포함하는 제작물을 제공하는 것인 방법.
제21항에 있어서, 상기 단계 (a)가 lac I^q 리프레서 유전자를 추가로 포함하는 제작물을 제공하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 단계 (b)가 이. 콜라이 (E. coli)의 형질전환을 포함하는 것인 방법.