JPH01503036A - クローン化リゾスタフィン遺伝子の発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 クローン化リゾスタフィン遺伝子の発現発明の背景 本発明は形質転換した微生物宿主中でリゾスタフィンの遺伝子を発現する新規プ ラスミドに関する。本発明はまた、そのようにして生産したりシスタフインにも 関する。

リゾスタフィンは元は５ｃｈｉｎｄｌｅｒおよび５ｃｈｕｈａｒｄｔ　ニより単 離され、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　５ｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓと命 名された５ｔａｐｈｙ＋ｏｃｏｃｃｕｓ　５ｉｌＬｌｌａｎＳの１株の既知菌株 が分泌するバクテリオシンである。Ｓ、５ｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓによる リゾスタフィンの生産は１９６６年１０月１１日に発行の米国特許番号ＮＱ３． ２７８．３７８およびＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａ ｌ＾ｃａｄｅｓｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　。

５１巻、４１４−４２１頁（１９６４年）に既に報告されている。リゾスタフィ ンを生産する唯一の微生物Ｓ、５ｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ　（Ｎ　ＲＲＬ 　８−２６２８　）は最近５ｌｏａｎら、Ｉｎｔ、Ｊ、５ｙｓｔｅｉｉ、Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、　、３２巻、１７〇−１７４頁（１９８２年）によりＳ、５ｉｌ ｕｌａｎＳの生物変異株として同定された。　Ｓ、５ｔａｐｈｖ１０１ｙｔｉＣ ＵＳは＾ｐｐｒｏｖｅｄＬｉｓｔ　ｏｒ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｎａｍｅｓ（ｌ ｌｆｌｉ名の承認リスト）中に載っていないので、リゾスタフィンを生産する微 生物はＳ、ｓｉ飴ｕｌａｎｓと再命名された。

バクチリオシはバクテリアが分泌し、近緑バクテリアを殺したりＷＩｌｌシたり するたん白質である。例えば、リゾスタフィンは実質的に全てのブドウ球菌の既 知の種を溶菌し、殺すが、全ての他の属のバクテリアに対しては不活性である。

リゾスタフィンの触媒としての性状はよくわかっていないが、ブドウ球菌の細胞 壁に存在するペプチドグリカンのポリグリシン架橋を見かけ上切断するエンドペ プチダーゼであることはわかっている。

リゾスタフィン生産はＳ、５ｉｌｕｌａｒｔＳをある条件下で生育させた時の定 常期に起り、他の細胞外酵素の生産と協調しているようである。リゾスタフィン を生産する菌はその活性に耐性であるが、リゾスタフィン非生産条件下で生育さ せた菌は感受性である。

過去の研究からりシスタフインはＳ、５ｉｓｕｔａｎｓを液体培養で生育させる １１酢技術により生産できることがわかっている。そのような醗酵技術は１９６ ６年１０月１１日発行の米国特許Ｎｃｉ３，２７８，３７８およびＰｒｏｃｅｅ ｄｉｎｇｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉ ｅｎｃｅｓ　。

５１巻、４１４〜４２１頁（１９６４年）に記載されている。醗酵技術によるリ ゾスタフィン生産の種々の改良は１９６８年８月２０日発行の米国特許Ｎｏ３， ３９８゜０５６および１９７１年７月２０日発行の随３，５９４゜２８４に記載 されている。後者２件の参考文献は１１Ｗｓによるリゾスタフィンの生産が促進 され、改良された培養培地および植菌方法の改良を明かにしている。しかしなが ら、既存の技術によるリゾスタフィンの生産および精製ではブドウ球菌の他の生 成物によりある程度汚染した産物が得られる。ブドウ球菌由来の非リゾスタフィ ン免疫原物質で汚染したりシスタフインで動物やヒトを免疫処理すると好ましく ない、副作用となり得る免疫応答を起すかも知れない。

Ｓ、ｓｉ■ｕｌａｎｓの培養減液から単離したりシスタフインは分子口約２５． ０００ダルトンの単一ポリペプチド鎖より成る、亜鉛含為たん白質ということが わかっている。

熱不安定で非透析性であり、等電点がおよそｐＨ１１である。さらに、リゾスタ フィンのブドウ球菌の生国および熱殺菌したブドウ球菌、並びにブドウ球菌細胞 壁を溶解する能力は酵素トリプシンによる処理で失活する。

種々のたん白質の遺伝子をプラスミド、コスミツド或いはファージに挿入してク ローニングし、それで微生物を形質転換する組換えＤＮＡ技術は遺伝子の構造や 発現を研究するため、またいろいろな目的のために各種たん白質を純粋に得る原 料製造のために広く使用されてきた。

しかし、クローニング技術を利用してリゾスタフィンをコードする遺伝子をりＯ −ニングベクターに挿入し、新Ｍｆｘへ’）　９−ヲ１１１．＋ｒＳ、５ｉｌｕ ｌａｎＳ　（Ｎ　ＲＲＬ　−８−２６２８）以外の微生物を形質転換し、多量の りシスタフインを生産されたという報告は今までにない。

１１囚且皇皇１１ 本発明によると、形質転換した微生物宿主中でリゾスタフィンをコードする遺伝 子を発現する組換えプラスミドが記載されている。組換えプラスミドはりシスタ フインをコードする決まったＤＮＡ配列を適当なりローニングベクターに挿入し て得られた。

適当なりローニングベクターとしては、バクテリア、特にＥ　、　Ｇ　Ｏ１ｉ　 １Ｂａｃｉｌｌｕｓ各種、および５ｔｒｅｐｔｏｓｙｃｅｓ。

および酵母中で複製するものが挙げられる。宿主としてはＥ　、ＣＯｊ　ｉ　、 　Ｂａｃｉｌｌｕｓ各種、５ｔｒｅｐｔｏ＊ｙｃｅｓおよび酵母が挙げられる。

しかし本発明は上記ベクターおよび宿主に限定されるものではない。本発明の実 施に於いてはその他のベクターおよび宿主も使用できるのは本分野の熟練者には 明白である。

一つの態様では、リゾスタフィンをコードするＤＮＡ配列をよく知られるクロー ニングベクターであるＥ、Ｃ０１ｉのプラスミドｐｕｃａに挿入し、組換えプラ スミドｐＲＧ５を構築した。ｐＲＧ５で形質転換したＥ、ｃｏｊｉ　ＪＭ１０５ はリゾスタフィンを生産した。

本発明の他の態様ではｐＲＧ５からのりシスタフイン道伝子をＢａｃｉｌｌｕｓ のプラスミドｐｓｃｉ　ａ、１）ＢＤ６４およびｐｓｐｖｉに挿入してそれぞれ 組換えプラスミドＤＪＰＩ、ｐＤＦ８およびＤＲＰｌを得た。リゾスタフィンの 遺伝１を含有するこれら三つの組換えＢａｃｉｌｌｕｓプラスミドのいずれで形 質転換したＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓを含むＢａｃｉｌｌｕｓ種の菌株は多量のりシ スタフインを培１１培地中に分泌した。本発明はざらに、組換えプラスミドＤＪ Ｐ１で形質転換すると天然の生産菌であるＳ、ｓｉｍｕｌａｎｓ（ＮＲＲＬ　Ｂ −２６２８）の培養で得られるリゾスタフィンの量の約５倍のりシスタフインを 生産するＢ、　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　Ｑ　Ｑ株をも提供する。

リゾスタフィン遺伝子を含有する上述のプラスミド或いはその他の７ラスミドで 微生物宿主菌を形質転換した結果発現されるリゾスタフィンはりシスタフイン以 外の混雑物、特に免疫原性ブドウ球菌混雑物による汚染は実質的にない。

さらに本発明は、リゾスタフィンをコードする１、５キロベース対（Ｋｂｐ）の ＤＮＡ断片、その遺伝子の配列、および該ＤＮＡ断片によりコードされる分子量 およそ４２．２００ダルトンの３８９アミノ酸より成るたん白質、プレプロリゾ スタフィンを提供する。プレポリリゾスタフィンの７ミノ末端配列は４Ｉのプラ スの電荷を持つアミノ酸残基を有し、続いて非電荷の疎水性の高い配列があり、 従ってシグナルペプチドの特性を有する。リゾスタフィンのシグナル配列に隣接 してリゾスタフィンのアミノ酸配列がある。″′プロ＃配列は７個のタンデムに 結合した相同の１３個の７ミノ１！歿基のくり返えしを含み、これは成熟酵素へ のプロセシングの過程で除去される。

従ってリゾスタフィンの構造遺伝子を含む１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片はプレプロ 酵素たん白（プレプロリゾスタフィン）をコードし、これが続いておよそ２６， ９２０ダルトンの分子量を有する成熟活性リゾスタフィンへとプロセシングされ る。リゾスタフィンが前駆体として合成され、それが活性酵素へとプロセシング されるということは今まで知られていなかった。

また、１式に示すリゾスタフィンをコードする１、５ｋｂｐのＤＮＡ断片と相同 であって機能的に同等なたん白質をフードするＤＮＡｌ１片も本発明の範囲に包 含される。

本発明はまた、実質的にリゾスタフィン以外の免疫原性ブドウ球ｔｎａ雑物を含 まないプレプロリゾスタフィン、プロリゾスタフィンおよびリゾスタフィンも提 供する。

本発明はさらにリゾスタフィンのシグナルペプチド、プロリゾスタフィン配列お よび成熟活性リゾスタフィンをそれぞれコードする１、５ｋｂｇｌのＤＮＡ断片 の一部分も包含する。リゾスタフィンをコードする１−５ｋｂｐのＤＮＡ断片の これら三つの部分に相同であって機能的に同等なペプチドをコードするＤＮＡ断 片も本発明の範囲内である。

１１立星皇皇１１ 本発明は以下の詳細な記載、例および図面を参考に記載するが、 １１１はＥ、ｃｏｊ　ｉ／ｐＲＧ５形賀転換株およびＳ、ｓｉｍｕｌａｎｓによ るリゾスタフィンおよびプロリゾスタフィンの生産を示すイムノプロット電気泳 動図である。

好ましい　の 本発明はりシスタフインをコードするｉ、５ｋｂｐＤＮＡ断片を種々の宿主微生 物中で複製するクローニングベクターに挿入して創製した組換えプラスミドを提 供する。特に好ましい宿主微生物はＥ、ｃｏ！＋およびＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕ ｂｔｉｌｉｓ　、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　Ｊ５よびその他 のＢａｃｉｌｌｕｓ種の菌株である。１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片はプラスミド保 有のクローン化した形質転換バクテリア中で安定に維持され、高レベルで発現さ れる。リゾスタフィンをコードする１、５ｋｂｐのＤＮＡ断片はＳ、ｓｉｍｕｌ ａｎｓ　（Ｎ　ＲＲＬ　Ｂ　−２６２８）から単離され、この菌株中に大きいペ ニシリナーゼプラスミド上に存在する。分子量がおよそ４２．２００のプＯ酵素 がＳ、５ｉｓｕｌａｎｓにより生産されることがわかった。リゾスタフィンをコ ードする１、５ｋｂ９のＤＮＡ断片を本発明のプラスミドに挿入すると、リゾス タフィンは形質転換微生物によって発現され、細胞から分泌される。成熟リゾス タフィンは形質転換株を培養した培地中に多量に蓄積する。遺伝子操作した形質 転換Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌株の中には、リゾスタフィンの天然生産菌であるＳ、５ ｉｌＬＩＩａｎＳよりも培ｌ濾液１−当たりかなり多量のりシスタフインを生産 するものもある。

本発明は特に、Ｅ、ｃｏｎ　ｉのクローニングベクターｏＵｃ８に由来し、２の ＤＵＣプラスミドのｊａｃｋ’遺伝子にリゾスタフィンをコードする１、５ｋｂ ｐのＤＮＡ断片を挿入して得られるプラスミドＤＲＧ５を提供する。ｐＵＣ８に 由来する組換えプラスミドの宿主パクテ’Ｊ７ＦあるＥ、ｃｏｊｉ　ＪＭ１０５ ａをｐＲＧ５で形質転換した株の対数後期の培養は、その濾液、ペリプラズムお よび細胞質区分にリゾスタフィン活性が検出できた。

さらに本発明はまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種菌株を形質転換するのに使用でき、リ ゾスタフィンをコードする１、５ｋｂｐのＤＮＡ断片を挿入した組換えプラスミ ドも提供する。

即ち本発明は形質転換宿主中でリゾスタフィンを発現する組換えＢａｃｉｌｌｕ ｓプラスミドｐＪＰ１、Ｉ）ＤＦ８およびＤＲＰｌを提供する。これらのプラス ミドはＤＲＧ５から得られるリゾスタフィンをコードするｉ、５ｋｂｐのＤＮＡ 断片をそれぞれＢａｃｉｌｌｕｓのプラスミドｐＢＣ１６，１）ＢＤ６４および ｐｓｐｖｉに挿入して構築された。本発明の態様としてさらに、これらのプラス ミドで形質転換するとりシスタフインを生産し、分泌するＢａｃｉｌｌｕｓ種の 形質転換株をも包含する。プラスミドｐＪＰ１、ｐＤＦ８およびｐＲＰｌはＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ、５ｐｈａｅｒｉＣｕＳを形質転換するのに使用した 。本発明によってＢａｃｉｌｌｕｓ種に使用するのに特に好ましい組換えプラス ミドはＥ）ＪＰｌである。リゾスタフィンを発現するのに特に好ましい形質転換 宿主菌株はフンビーテントなりａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｂ　Ｄ　１ ７０およびＢａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ　ｏ　ｏ株である。

特にＤＪＰｌにより形質転換したＢ、　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　Ｑ　Ｑ株ハｔｇ ｅ液１リットル当たりＳ、５ｉｓｕｌａｎｓ　（Ｎ　ＲＲＬＢ−２６２８）の少 なくとも５倍量のりシスタフインを生産した。Ｂ、５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　ＯＯ 株／ｐＪＰＩより単離した組換産物は、電気泳動での移動度、リゾスタフィン特 異抗体との免疫交叉反応性および触媒活性の点でＳ、　５ｉｉｕｌａｎｓのりシ スタフインと区別できない。本発明による形質転換微生物で生産したりシスタフ インはりシスタフイン以外の混在物、特に免疫原性ブドウ球菌混在物を実質的に 含有しない。

本発明はまたリゾスタフィンをコードし、その配列を第Ｉ式に示すクローン化し た１、５ＫｂｐのＤＮＡ断片を提供する。ＤＮＡ配列は２４５から２４７番目の ヌクレオチドのＴＴＧ開始コドンから１４１２から１４１４１目のヌクレオチド のＴＧＡ終止終止ラドンる読みワクで表わされ、３８９１１のアミノ酸より成る プレプロリゾスタフィンをコードする。第Ｉ式で示す配列と相同なりＮＡ断片で 機能上向等のたん白質をコードするものは本発明の範囲に包含されるものと理解 される。

ｐＲＧ５を保有するＥ、ｃｏｊｉ　ＪＭ１０５、ＡＴＣＣＮ１１６７０７６　： 　ｐＪＰｌを保有するＢ、５ｕｂｔｉｌｉＳＢＤ１７０、ＡＴＣＣ随６７０７８ 　：　ｐＪＰｌを保有するＢ、　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　Ｏ０１ＡＴＣＣＮ＋１ ６７０８０：ＤＤＦ８を保有するＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｂ　Ｄ　１７０、ＡＴ ＣＣＮ１１６７０７６：およびｐＲＰｌを保有するＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｂ　 Ｄ　１７０　、　ＡＴＣＣＮ１１６７０７６　はＡｇ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されテイル。

以下の例は本発明を説明するものであり、決して本発明を限定するものではない 。

１−」 Ｌ１旦ｉ左１１ プラスミドｐＲＧ５はＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ　、　Ｇｅｎｅ。

１９巻、２５９−２６８頁（１９８２年）により記載される遺伝子操作したクロ ーニングベクターｐｕｃｓプラスミドのｊａｃＺ’遺伝子にリゾスタフィンをコ ードする１　、　５ｋｂｐ　（１）ＤＮＡを挿入して構築した。

全ＤＮＡはＳ、５ｉｓｕｌａｎｓ（ＮＲＲＬ　Ｂ−２６２８）より次のように単 離した。

Ｓ、５ｉｌＬＩＩａｎＳをＲｏｂｉｎｓｏｎら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１ ３７巻、１１５８−１１６４頁（１９７９年）により記載されるようにカザミノ 酸培地中で対数中期まで生育させた。菌体を遠心分離により集め、トリスａＩｊ 液（５０ｗＭ）−リス、５０ｓＨＥＤＴＡ、ＤＨ７，８）で洗滌し、５０μｇ／ Ｍｌリゾスタフィン（Ｈｅａｄ−Ｊｏｈｎｓｏｎより入手）およびリゾチーム（ ０，５ｑ／ｍｅ）を含有するトリス１１衝液の原培養２０％量に再けん濁した。

３７℃に２時間インキュベーション後、プロナーゼ（Ｉ　Ｍｌ／ｄ　’）および ドデシル硫酸ナトリウム（０，６％）を添加してさらに３７℃にて２時開インキ ュベーションした。このような処理により得られたＳ、５ｉｓｕｌａｎｓの溶菌 液を標準法を用いて等量のフェノールで２回抽出した。

フェノール抽出溶菌液の水層に２倍容量の冷９５％エタノールを添加して核酸を 沈でんし、遠心分離によって集めてＴＥＩ！Ｉｌｉ液（１０■Ｈトリス、１ｉＨ ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）に溶解した。溶解した核酸を膵リボヌクレアーゼ（３０ μＷ／ａ＋りおよびＴ１リボヌクレアーゼ（２ＬＪ／−）の組合せで３７℃２時 間消化し、試料中に存在するＲＮＡを分解した。ＤＮＡを再びエタノールで沈殿 し、ＴＥ！ｌ衝液に溶解した。中期対数の０．５１の培養物からおよそ１．５〜 のＳ、ｓｉｗｕｌａｎｓ　Ｄ　Ｎ　Ａを単離した。

クローニングはｐＵｃ８をベクターとして、Ｅ、ｃｏｊｉ　Ｋ１２　ＪＭ１０５ 株を宿主として用いて行なった。上述のようにして単離したＳ、ｓｉｍｕｌａｎ ｓの全ＤＮＡをＭｂＯ工で部分消化し、１２ｄの１０−３０％蔗糖勾配にて３５ ．ＯＯＯｒｐｍ　２０時間遠心分離にかけて分画した。５−１５キロ塩基対（ｋ ｂｐ）の大きさの範囲、平均サイズ１０ｋｂｐの１）ＮＡ断片を集め、２μ９の ＢａｍＨＩ消化ｐｕｃｓと結合した。このプラスミドはアンピシリン耐性を呈し 、Ｅ、ｃｏｉ　＋のβ−ガラクトシダーゼの７ミノ末端部分をコードするｚａｃ ｚ’遺伝子を保有する。異種ＤＮＡをｊａｃＺ’道伝Ｉ中にあるクローニング部 位に挿入する結果、β−ガラクトシダーゼが失活する。

この操作で得られるＪＭ１０５形質転換株のおよそ８０％が１ａｃｌ’遺伝子の 不活化 （１ａｃＺ’　−）により示されるように組換えプラスミドを含有し、即ち、そ れら形質転換株はβ−ガラクトシダーゼを望産しなかった。

形質転換株中でのりシスタフイン発現を検索するためにＮ０ＶｉＣｋら、Ｐｌａ ｓｍｉｄ　、　２巻、１０９−１２９頁（１９７９年）により報告され、そこか ら入手したＳ、　ａｕｒｅｕｓＲＮ４９２を指示菌株として使用した。このバク テリア菌株はβ−ラクタマーゼを構成的に生産し、比較的アンピシリンに耐性で ある。５０μ９／ｄのアンピシリン含有り一寒天に生育させたＥ、ｃｏｊｉ　Ｊ Ｍ１０５形質転換株を３０分間クロロホルム蒸気に露出して溶菌し、ＧＬ寒天ニ 定常期まで生育させたＳ、ａｕｒｅｕｓ　ＲＮ　４９２の０．１％（Ｖ／Ｖ）け ん濁液をＩＩＩした。リゾスタフィン遺伝子がうま＜ｐｔＪｃ８に挿入されたこ とを示すＥ、ｃｏｊｉ　ＪＭ１０５形質転換株によるリゾスタフィンの生産は、 ＪＭ１０５形質転換コロニーの上に重なった指示菌細胞の溶菌により判定された ０組換えプラスミド（ａｍＥ）”　、１ａＣＺ’　−）を保有する１　０００１ １のクローンのおよそ９個がリゾスタフィン遺伝子を含有し、Ｓ、ｓｉｍｕｌａ ｎｓ　ＤＮＡ　（および２０００ｋｐｂ）に比較して染色体当たり多コピーのり シスタフイン遺伝子が存在することを示唆した。

リゾスタフィン生産性形質転換株は６．０．６．５或いは８．０ｋｂｐの挿入断 片を持つ組換えプラスミドを保有していた。制限酵素分析の結果、クローニング ベクター中でこれらの挿入断片は両方の方向で存在し、４．３ｋｂρのＤＮＡ断 片を共通に含有していた。リゾスタフィンをコードするＤＮＡ配列はさらに４． ３ｋｂｌ）ＤＮＡ断片から得られた１、５ｋｂＤのＨＤａＩ［−Ｈｉ　ｎｄｎｌ ＤＮＡｌｉ片に限定された。この１．５ｋｔ＋ｐのＤＮＡ断片をｐｕｃｓのＡｃ ｃＩ−Ｈｉ　ｎｄｎ１部位に再クローン化して組換えプラスミドｐＲＧ５を創製 し、これは本発明の好ましい態様である。

例　２ リゾスタフィンをコードする１、５ｋｂ　ＤＮＡ　の１支ｉ」 リゾスタフィンをコードするＤＲＧ５の１．５ｋｂＤＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　７４巻、５４６３−５４６７頁（１９７７年）のジデオキシ・チェー ンターミネーション法により、Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｈｅｔｈ、Ｅｎｚｙ＊ｏ１． １０１　！’、　２０−７８頁（１９８３年）により記載されるようにファージ ベクターＭ１３ｍｏｌＯおよびＭ１３ｒｒｌｌｌを用いて決定した。

リゾスタフィンをコードする１、５ｋｂ（ｌのＤＮＡ断片全体のヌクレオチド配 列は第１式に示す。第Ｉ式を参考に、１．５ｋｂＤのＤＮＡ断片はヌクレオチド ２４５−２４７のＴＴＧＩ始コドンからヌクレオチド１４１２−１４１４のＴＧ Ａ終止コドンまでの１．１６７ヌクレオチドの読みワクを含有する。このＤＮＡ 断片はまた、ヌクレオチド８９−９５および１１０−１１９の−３５および一１ ０領域にプロモーターと考えられる部分を含有し、それを１式では下線を施した 。リゾスタフィンプロモーターはｌｏｎｇら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、　８１響、１１８４−ｉｉｓａ頁（１９８４年）により記載されるＲＮ Ａポリメラーゼのα３７Ｍ御サブユすットにより！！識される８、５ｕｂｔｉｌ ｉｓのプロモーターと相同性があるようだ、１６ＳリポゾームＲＮＡのｍＲＮＡ 結合配列と完全に相補的なりポゾーム結合配列、ＡＧＧＡＧＧＴ、がヌクレオチ ド２３１−２３７の位習に、ｆ−ＭｅｔをコードするＴＴＧｊｌ始コドンの７塩 基対上流に見られる。

読みワクは３８９アミノ酸より成る、分子量および４２．２００ダルトンを有す るプレプロリゾスタフィンをコードし、これはＩＦ素的に活性な成熟リゾスタフ ィンの前駆体である。ＤＮＡ配列から予想されるプレプロリゾスタフィンのアミ ノ酸配列も第１式に示す。リゾスタフィンが前駆体の形で合成されることは今ま で知られていなかった。

プレプロリゾスタフィンの７ミノ末端３６アミノ酸配列はシグナルペプチド、即 ち、分泌たん白質の前駆体に見られる大部分疎水性の領域である。

シグナルペプチドは分泌たん白質が翻訳された時のアミノ末端配列であり、膜結 合リポゾーム上で合成後に膜を通してポリペプチド鎖を伸長するのに関与してい る。

真核ｌｌ胞ではシグナルペプチドは粗面小胞体の管腔側に存在する特有のプロテ アーゼにより、ポリペプチド合成が完了する前にでも、切断される。

粗面小胞体を持たないバクテリアでは、分泌たん白質は細胞質膜の内面に結合す るりポゾーム上で合成される。

生成したバクテリアポリペプチド鎖のシグナルペプチドはたん白質が１ａ胞質躾 を通過して移動するのに関与しているらしい。一般にバクテリアのシグナルペプ チドは細胞質膜を通しての移動の途中または直後に除去され、培養培地中に蓄積 する分泌たん白質はこの配列を持っていない。

第■式にはプレプロリゾスタフィンの７ミノ末端１５２個のアミノ酸（Ａ）およ び３８９−６６１塩基対の１．５ｋｂｐ　ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列（Ｂ） を示すが、これからプレプロリゾスタフィンのいくつかの特徴がわかる。

分泌型或いは膜結合たん白質のシグナルペプチドまたはシグナル配列は第■式に 示すプレプロリゾスタフィンのシグナルペプチドで明かなように疎水性アミノ酸 含量が高いことが特徴である。シグナル配列の疎水性はいずれでも定まって認め られものであるが、そこに含有される実際のアミノ酸、アミノ酸の配列およびペ プチドの長さは大きく変化するものである。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種では通 常長いシグナル配列（３１−４４アミノ酸）が見られる。Ｗａｔｓｏｈ、　Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　１６Ｂ、　１２巻、５１４５−５１６４頁（１９８４ 年）。

プレプロリゾスタフィンシグナル配列の切断部位は３６−３７番目のアミノ酸残 基（第■式）のＡｌａ−８ｅｒ結合である。１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片からプレ プロリゾスタフィンのシグナル配列をコードするＤＮＡを除去すると恐らく非分 泌型たん白質が得られるだろう。

機能的に同等なシグナルペプチドをコードし、リゾスタフィンシグナルペプチド をコードするＤＮＡとＩ！換するＤＮＡ配列は、異なるが機能的なシグナルペプ チドを有する分泌型の１プレプロリゾスタフイン“をコードするだろう。

分泌に必要なシグナル配列の切断に続いてｉＩ積し、さらにプロセシングされる たん白質はプロリゾスタフィンである。第■式にはまた１３個のアミノ酸配列の ７個のタンデムくり返えしを含むプロリゾスタフィンのＡｊａ−４９からＡｒＧ −１３９までの配列も示す。グルタミン酸を多ｌに含み、全体でマイナスに荷電 しているたん白のこの部分がプロリゾスタフィンの成熟リゾスタフィンへのプロ セシングの際に切１１ｉされる。このアミノ酸のくり返えしをコードするｂｐ３ ８９から６６１のＤＮＡ配列は３９　ｂｐの相同配阿の７個のくり返えしから成 る（第１１８式）。７個のタンデムアミノ酸くり返えしく第１ｒＡ式）および対 応するヌクレオチド配列のくり返えしは第５　π式で１−７の番号を付しである 。

■ 第■式 ％式％ いろいろな種類のたん白質が前駆体として合成され、続くプロセシングで成熟活 性たん白質となる。例えばインシュリンはその活性型は二本鎖ポリペプチドであ るが、−末鎖ポリペプチド（プロインシュリン）として合成され、続いて内部ポ リペプチドがたん自分解除去されて成熟インシュリンと変換する。また、Ｂ、５ ｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ、ａｍｙｌｏｌｉａｕｅｆａｃｉｅｎｓのアルカリ性お よび中性プロテアーゼはプレプロ群集として合＃！される。しかし、今までリゾ スタフィンがプレプロ酵素として合成されることは知られていなかった。第工表 に示すように、アルカリ性および中性プロテアーゼのプレ７０酵素の成熟酵素へ の変換は、プロリゾスタフィンからりシスタフインへの変換と同じような切断部 位を介している。

酵　素　プレプロ　成熟　最終切断部位配列 ズブチリシン Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　１０６　２？Ｓ　ＨｉｓＧｌｕＴｙｒ↓＾ＩａＧｌｎＳ ｅｒＶａｌＢ、ｌｏｌ　１ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　１０７　２７５　ＨｉｓＡＬ ａＴｙｒ↓ＡｌａＧｌｎＳｅｒＶａｌ中性プロテアーゼ Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　２２１　３０１）　ＶａｌＧｌｕＨｉｓ　ｊＡｌａＡｌ ａＡｌａＴｈｒＢ、１ｏｌｉ　ｆａｃｉｅｎｓ　２２１　３００　ＶａｌＧｌｕ Ｈｉｓ↓ＡｌａＡｌａＴｈｒＴｈｒリースタフイン　１４３　２４８　ＡｌａＬ ｅｕＡｒｏ↓Ａｌａ＾１ａＴｈｒＨｉｓエドマン分解により決定したＳ、ｓｉｍ ｕｌａｎｓからの精製成熟リゾスタフィンの７ミノ末端配列、Ａｊａ−Ａｊａ− ７ｈｒ−）１ｉｓ−ＧｊｕｌはｐＲＧ５の１．５ｋｂｐＤＮＡ断片によりコード されるプレプロリゾスタフィンのアミノ１１４４−１４８に相当する。ＤＮＡ配 列から予想される成熟リゾスタフィンのアミノ酸組成はＴｒａｙｅｒら、Ｊ、Ｂ ｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、　２４５巻、４８４２−４８４６頁、によりＳ、ｓｉｍｕｌ ａｎｓ（ＮＲＲＬ　Ｂ−２６２８）の培養液から得られた精製リゾスタフィンの アミノ酸組成の実験結果と非常によく相関している。予想配列から決定される成 熟活性リゾスタフィンはおよそ２６．９２０ダルトンの分子量を有する。第１１ Ａ式に示すように、プロ酵素の成熟リゾスタフィンへの変換は１．５ｋｂｐ　Ｄ ＮＡ断片によりコードされるプレプロリゾスタフィンの残基１４３−１４４のＡ ｒｇ−Ａｊａ結合の切断を伴なう。

ｐＲＧ５ｒ形質転換したＥ、ｃｏｊｉ　ＪＭ１０５を５０μｇ／−のアンピシリ ン含有Ｌ［３培地２０＋ｄ中で増殖した後期対数期の菌体を遠心分離により集め 、トリス−食塩！ｌｌ液液ＴＳＢ−１０■Ｈトリス、３０＋ｄＮａＣｊ、１）８ ８．０）で洗した。ペレットを１−のＴＳＢに再けん濁して０℃で２分間音波処 理を行なった。

上澄液を＾■１ｃｏｎ　ＹＭＩＯｍを用いた限外濾過により２０倍に濃縮した。

リゾスタフィンの活性は上澄液（全体の６５％）、ペリプラズム画分（１５％） およびｍ脂質画分（２０％）に認められた。

Ｓ、ｓｉｇｕｌａｎｓの培養液よりＭ製したりシスタフインに対するウサギ抗血 清を調製し、Ｒｅｃｓｅｉら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ　２５７巻、７１９６− ７２０２頁（１９８２年）、に従ってアフイニテイクロマトグラフイーによりＩ Ｉ製した後、Ｅ、ｃｏｊｉ　ＪＭ１０５／Ｉ）ＲＧ５およびＳ、ｓｉｍｕｌａｎ ｓにより生産されるリゾスタフィンおよびプロリゾスタフィンの存在場所および 性状の検討のための免疫プロット実験に使用した。

ウサギ免疫グロブリンに対するヤギ抗体をＳｉ製し、標準法によりアルカリ性フ ォスファターゼ（Ｓｉｇｍａ　）に結合した。免疫プロットには試料を先ずドデ シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、次に分 離したたん白を常法によりニトロセルロース躾に移した。ニトロセルロース躾を 先ずリゾスタフィンに対するウサギ抗体と、次にアルカリ性フォスファターゼと 結合した抗−ウサギ免疫グロブリン抗体とインキュベートして免疫反応性たん白 質を検出した。アルカリ性フォスファターゼ活性を検出するために５−７０モー ４−クロロインドキシルりん酸とニトロブルーテトラゾリウムの色素基質を、５ ｌａｋｅら、＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｓ、　１３６巻、１７５−１７９頁（１９ ８４年）により記載される通り使用した。

第１図は免疫プロット実験の結果を示す。記載のとおりの列に以下の試料をのせ 、電気泳動にかけ、フィルターに移して抗−リゾスタフィン抗体と反応した：対 数期に採取したｓ、　ｓ　ｉａｕ　Ｊａｎｓ＠養からの上澄液（１および６列） 、初期定常期（２列）、中期定常期（３列）、および後期定常期（４列）：Ｅ、 ｃｏｔ　１１０ＲＧ５の後期対数期培養物の上澄液（８列）および菌体抽出液（ ７列）。Ｈｅａｄ−Ｊｏｈｎｓｏｎリゾスタフィンは５列および９ダ１にかけた 。分子量の標準物の位置も第１図に示す。

免疫プロット実験の結果、成熟リゾスタフィン（ＭＷ２６．９２０）がＥ、ｃｏ Ｊｉ　ＪＭ１０５／ｐＲＧ５形質転換株の後期対数増殖培養濃縮濾液中に存在す ることを示した（８列）。同じ電気泳動移動度を有する交叉反応性たん白質がリ ゾスタフィン生産Ｓ、５ｉｌｕｌａｌｌＳ培養上澄液にも観察された。

Ｅ、ｃｏｊｉ　ＪＭ１０５／ｐＲＧ５形質転換株の後期対数Ｊ１１ｒ４のＩｔ胞 抽出物を電気泳動にかけて免疫分析した結果は、リゾスタフィン抗体と反応する 二個のたん白質が存在することを示した。成熟リゾスタフィンは比較的少量した 。さらに、Ｅ、ｃｏｌｔの菌体内分（第１図、７列）には見かけ上の分子１６４ ．０００ダルトンの交叉反応性たん白質が多量に観察された。この大きいたん白 質と同じ電気泳動移動度を有する交叉反応性たん白質が後期対数増殖以後に採取 したＳ、ｓｉｍｕｌａｎｓの培Ｉ！！液にも見られた。交叉反応性のこの大きい たん白質は、Ｓ、ｓｉｍｕｌａｎｓおよびＥ、ｃｏｊｉ　ＪＭ１０５／ｐＲＧ５ のいずれでもリゾスタフィンが現われる前に見られ、成熟リゾスタフィンが蓄積 すると共に消失する（第１図、１−４列および８列）ので、恐らくプロリゾスタ フィンと考えられる。プロリゾスタフィンの見かけ上の分子量が大きいのは、プ ロリゾスタフィン配列中のタンデムくり返えし中にグルタミン酸残ｌが高含量で 含まれるためＳＤＳとの結合が低下した結果と思われる。

このようにリゾスタフィン認７レプロ酵素として合成される。プレプロリゾスタ フィンのシグナル配列はポリペプチド鎖が躾を通過して移動する時に切断される 。生成するプロリゾスタフィンは畿４１で細胞外で成熟リゾスタフィンにプロセ シングされ！、＠熟活性酵素への変換はＡｒＱ　−Ａ１ａ１４４のべ１チド結合 の切断により達成する。プロリゾスタフィンｃ７ミノ末端部分は段階的に切断さ れるらしい。即ち、１０酵素配列が全て同時に除去されるのではない、このプロ セシング反応はＳ、５ｉｓｕｌａｎｓの定常期培養物の振部で起る。成熟ＩＩ素 がＥ、ｃｏＪｉ　ＪＭ１０５／”ｏＲＧ５形賀転換株中で生成することから、プ ロ１．１のプロセシングは自己触媒によるか、或いはＥ、ｃｏｌ）　ＪＭ１０５ とＳ、５ｉｌＵＩａｎＳの両方に存在する類似のプロセシング活性が関与してい ると思われる。しかし、Ｅ、Ｃ０ｊｉ　ＪＭ１０５／ｐＲＧ５形質転換株ではプ ロセシングがＳ、５ｉｓｕｌａｎｓのように細胞外ではなくｍ脂肉で起っている ようで利点である。

例　４ Ｂａｃｉｌｌｕｓ種の′　゛　で１−ス　フィンを　すラスミドの構築 り、ローン化遺伝子生産物の生産のためＢａｃｉｌｌｕｓの発現系はＥ、ｃｏｌ 　ｉを宿主として使用した同様の系よりも有意な利点がある。Ｂａｃｉｌｌｕｓ 種は通常たん白質を周囲培地中に容易に分泌する。この利点のため、リゾスタフ ィンをコードする１、５ｋｂｐのＤＮＡ配列を含有する組換えプラスミドを種々 のＢａｃｉｌｌｕｓ種で複製するプラスミドから創製した。

プラスミドｐＲＧ５をリゾスタフィンをコードするＤＮＡの材料として使用した 。プラスミドｐＲＧ５ＤＮＡをＨｉ　ｎｄｌＩおよびＥｃｏＲＩにより製造元の 指示する条件に従って消化し、１％アガＯ−ス中のＩＩ製製電電気泳動分画した 。リゾスタフィンをコードする１、５ｋｂｐのＤＮＡ断片を臭化エチジウム染色 で検出し、電気泳動によりＤＥＡＥ−ニトロセルロース滅紙片に移動した。ｉ！ ！紙片をＮ　Ｅ　Ｔｌ１ｌｉ液（０，１５８ＮａＣ１゜０．１ｍＨＥＤＴＡ、０ ．０２８　ｔ−リス、ＤＨ８，０）で洗滌し、結合ＤＮＡをＩＨＮａＣ１含有の ＮＥＴＩ衝液中に濾紙片を６５℃１時間インキュベートして溶出した。

ＤＮＡから臭化エチジウムを等量のｎ−７タノールで２回抽出して除去した。水 層に２ｓ量の冷９５％エタノールを添加してＤＮＡを沈でんし、遠心分離により 集めて８０％エタノールにて洗滌後、ＴＥＭ衝液（例１）に溶解した。

ａ、　プラスミドｐＪＰ１ 本発明による好ましい態様である組換えプラスミドｐＪＰ１はリゾスタフィンを コードする１、５ｋｂｐのＤＮＡ断片をテトラサイクリン耐性遺伝子を保有する Ｂａｃ　ｉ　ｌ　ＩｕｓのプラスミドｐＢＣ１６に挿入して構築した。

ニューヨーク州、ニューヨークの公衆衛生研究所（Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）のＲｉｃｈａｒｄＰ、Ｎ０ＶｉＣｋ より入手したプラスミドＤＢＣ１６は土壌分離バチルスから単離され、カナマイ シン耐性を保有するｓ、ａｕｒｅｕｓの７ラスミドＤＵＢ１１０と高い相同性を 示し、不適合性である。ｐＢＣｌ　６ＤＮＡはＢｉｒｎｂｏｉｍ、Ｈｅｔｈ、Ｅ ｎｚｙ＊ｏ１．１００巻、２４３−２５５頁（１９８３年）により記載されるア ルカリ−８ＤＳ法によってＢ、５ｕｂｔｉｌｉＳより単離した。ＶＹ培地（２５ Ｓ　Ｄｉｆｃｏ製子牛浸出物：５　ＳＦ　Ｄｉｆｃｏ製酵母エキス／水１リット ル）に生育さゼた一晩培養物からの菌体を遠心分離によって集め、ＴＥ緩衝液で 洗滌後５Ｊ！！のＴＥＧ！ｌｉＩ液（２５１Ｈトリス、１０＋ＨＥＤＴＡ、５０ ＠８グルコース、１１１８．０）に再けん濁した。リゾチーム（１ｍｙ、／ｄ　 ）を添加して反応液を室温で２０分間インキュベートした。１０ｍの０．２％Ｎ ａＯＨ−１％ＳＤＳを添加後反応液を０℃で４５分間インキュベートした。次に １０ｄの３Ｍ酢酸カリ−１，８Ｍ蟻１１を添加してざらに０℃で３０分間インキ ュベートした。このようにして得られた溶菌物を１５，０００ＸＱを２０分間遠 心分頗した。上澄液に２倍１の９５％エタノールを添加し、空温１５分後に生成 した沈で〜を１０．ＯＯＯｘｇで１０分間遠心分離して集めて８０％エタノール で洗練し、０．５ｔｄのＴＥＷ衝液に溶解した。この方法によりおよそ２００μ グの環状ｐｓｃｉ６ＤＮＡが得られた。

プラスミドＤＮＡをＥＣ０ＲＩで切断して線状とした。

線状化したｐＢｃｌ　６ＤＮＡ　（＋１５よそ１μ９）とりシスタフインをコー ドする１、５ｋｂｐのＤＮＡ断片（およそ１μ９）の混合物をＤＮＡポリメラー ゼ（フレナラ断片）を用いて事情末端とした。次にＤＮＡリガーゼを用いてプラ スミドと断片ＤＮＡとを結合し、閉環プラスミドＤＮＡ分子を形成した。

ニューヨーク州、ニューヨークの公衆衛生研究所（Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ 　Ｒｅ５ｅａｒＣｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）のＤａＶｉｄ　ｏｕｂｎａｕより入 手Ｌ／　ｔ：　コンビ−テントなり、５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｄ　Ｄ　１７０株の１ ＩＩＷ＆をｃｏｎｔｅｎｔｅら、Ｈｏ１．Ｇｅｒ＋、Ｇｅｎｅｔ、　１６７巻１ ２５１−２５８頁（１９７９年）、の方法に従ってライゲーションしたＤＮＡ　 （０，１ｄのｍ胞当たりおよそ１μｇのＤＮＡ）で形質転換した。続いて細胞を ３７℃で９０分間インキュベートしてプラスミドのテトラサイクリン耐性遺伝子 の発現をさせ、選択濃度のテトラサイクリン（５ｔｔｙ／ｄ）および熱殺菌した ｓ、ａｕｒｅｕｓ菌体を含むＴＢＡＢ寒天上にプレートしてリゾスタフィンの生 産を検出した。

ライゲーションしたＤＮＡで形質転換したＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓの１Ｂｌｌａの およそ１％がＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓコロニーの周囲のぶどう球菌の溶菌により示 されるようにリゾスタフィンを生産した。Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓの一株の形質転 換株をリゾスタフィン検出平板上に数回くり返えしストリークして完全に安定し たコロニーを得、それよりＤＪＰＩを得た。

リゾスタフィン活性はＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｂ　Ｄ　１７０／ｐＪＰ１形質転 換株を液体培地中で定常期まで生育させた主としてｓｉｉ波液両液画分在した。

免役プロット分析の結果、リゾスタフィンの前駆体が分泌され、それが続いて成 熟リゾスタフィンに変換することを示した。さらに免疫プロットから、培養濾液 中にリゾスタフィン分解物が存在し、その量はセリン−プロテアーゼ詔書剤であ るフェニルメチルスルホニルフロリドが存在すると最小となることが示された。

従って、セリン−プロテアーゼがＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｂ　Ｄ　１７０１Ｂ胞 から培地中に分泌されるか細胞表層に存在するものと思われる。

ｂ、ｐＤＦＢおよびＤＲＰｌ リゾスタフィン遺伝子を含有する他の２個のプラスミド、１）ＤＦ８およびｐＲ Ｐｌを本質的には例４ａに記載した１）ＪＰＩの構築と同様にＢａｃｉｌｌｕｓ ｌの形質転換のために１！！した。

ｐＤＦＢはりシスタフインをコードする１、５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ニューヨ ーク州、ニューヨークの公衆衛生研究所（Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）のＤａｖｉｄ　Ｄｕｂｎａｕの保存株から入 手したカナマイシン、クロラムフェニコール耐性プラスミドであるｐＢＤ６４の Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　１ｉ１１限部位に挿入して調製した。

ｐＤＦＢは上述と同様にＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｂ　Ｄ　１７０を再閉環したプ ラスミドで形質転換後、形質転換株を５μグ／ｍｅのクロラムフェニコール含有 のりシスタフイン検出平板上にプレートした得た。ｐＤＦＢは陽性クローンをく り返えしストリークした選択した。

同様にして、ｐＲＰｌはリゾスタフィンをコードする１、５ｋｂｐのＤＮＡ断片 を、ニューヨーク州、ニューヨークの公衆衛生研究所（Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌ ｔｈ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　）の５ｔｅｖｅｎ　Ｐｒｏｊａｎ から入手したクロラムフェニコール耐性プラスミドｐｓｐｖｉの）ｌｐａＩＩＩ Ｊｊ１部位に挿入して構築した。ｐＲＰｌの単離のための以後の操作はＤＪＰｌ およびｐＤＦＢの横築のための操作と同じである。

リゾスタフィンの人聞生産のために適当な宿主を得るために多くのＢａｃｉｌｌ ｕｓｌ株をＤＪＰＩで形質転換した。

リゾスタフィン指示平板上で大きい溶菌ハローを形成した形質転換株を単離し、 性状を検討した。検索したＢａｃｉｌｌｕｓ菌株の中でニューヨーク州、ニュー ヨークの公衆衛生研究所で単離され、その保存菌株として維持されていたＢ、　 ５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　Ｏ０株が最大のりシスタフイン生産を示した。

Ｂ、５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　ＯＯ／　Ｉ）　Ｊ　Ｐ　１形質転換株は生菌をリゾ チーム処理して得られたプロトプラストを、ＣｈａｎＱらの方誌、Ｈｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ　１６８巻、１１−１１５頁（１９７９年）に従ってポリエ チレングリコール存在下でｐＪＰＩのＤＮＡで処理して得られた。処理後、菌を リゾスタフィン指示平板上でアッセイする前に、テトラサイクリン存在下（５μ ｇ／ａ＋りでＤＭ３再生用平板で生育させた。

ＶＹ培地、或いはＣＹＧＰｉ８地に生育させたＢ、５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　００ ／ＤＪＰ１形質転換株は１リツトルの培Ｉ１１当たりおよそ１５０■の成熟活性 リゾスタフィンを生産し、分泌した。この飴はＳ、ｓｉｍｕｌａｎｓが現在わか っている最良の醗酵条件下で生産する量の約５倍の量である。活性リゾスタフィ ンがほとんど分解なしに生育培地中に、培養を長期に行なった後にも蓄積し、１ ｌｌｖｉ外全たん白のおよそ８０％を占める。Ｂ、　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　Ｏ Ｏ／ｐＪＰ１形質転換株から単離したりシスタフインはＳ、ｓｉｍｕｌａｎｓの 培養物から得られたものと免疫的、電気泳動上、および触媒活性の点で区別でき ない。リゾスタフィンは生育培地より公知の分画法でん（塩析）手法に従って単 離される。別法としては、リゾスタフィン生産性のＢ、５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　 ＯＯ／　Ｄ　Ｊ　Ｐ　１形質転換株の培ｉ物からのＮＷＩ液を沈でん法とクロマ トグラフィー分画との組合せにより特に有効なＩＩ製が達成できる。

菌体を醗酵液より、例えば遠心分離または限外減退により除去し、上澄液に固型 ＋ａ酸アンモニウムを４０−６０％飽和、好ましくは５０％飽和で添加した。４ ℃で１時間の後にリゾスタフィン含有の沈でんを遠心分離により回収した。この 段階での回収率は８０％以上である。

沈でんを最少量の１（１Ｍりん酸ナトリウム紐笥液（ｐＨ７，００１５０ｇ＋１ ４　ＮａＣｊ）Ｌ再溶解し、１００ｆｆｉｆｌｔの同一！ｌｌ液液対して透析し た。特別の物質を除去した後、透析液を陽イオン交換カラム（好ましくはファル マシアＦＰＬＣモノＳ）でクロマトグラフにかけ、０．０５２’）’ら０．２５ ８　ＮａＣ１ｆ）増加塩ｓ麿勾配ｖＩ物液を用いて溶出した。−回のりＯマドグ ラフィーステップでのりシスタフインの回収は９０％以上であった。リゾスタフ ィン活性は２つの主要ピークに相関する。後ろに溶出するりシスタフインのピー クはたん白質の非共為集合体より成る。この集合体はＷ新液による希釈およびド デシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動の条件下で解離する。

Ｂ、　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　ＯＯ／　ｐＪ　Ｐ　１形質転換株の培養液から精 製したりシスタフインは実質的に非リゾスタフィン混雑物を含有しない。特に意 義あるのはＢ、５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ００／Ｅ）ＪＰｌのリゾスタフィンはぶど う球菌由来の免疫原性混雑物を実質的に含有しないことである。

Ｍ、　（ｘｌｏ−３） ＦＩＧ、１ 補正書の翻訳文提出書　（特り組８４条）ｇｍ）昭和　６３　年　１０　月　１ ４　廓

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．形質転換した徴生物宿主中でリゾスタフインをコードする遺伝子を発現する 組換えプラスミド。
2. ２．リゾスタフインをコードするＤＮＡ配列を含有する組換えプラスミドで形質 転換され、リゾスタフインを生産する形質転換微生物。
3. ３．リゾスタフイン以外の混雑物を実質的に含まないリゾスタフイン。
4. ４．免疫原性ぶどう球菌由来の混雑物を実質的に含まないリゾスタフイン。
5. ５．組換えプラスミドがｐＲＧ５、ｐＪＰ１、ＰＤＦ８およびＰＲＰ１より成る 群から選択される請求の範囲１項記載の組換えプラスミド。
6. ６．組換えプラスミドがｐＲＧ５である請求の範囲１項記載の組換えプラスミド 。
7. ７．組換えプラスミドがＰＪＰ１である請求の範囲１項記載の組換えプラスミド 。
8. ８．組換えプラスミドがＰＤＦ８である請求の範囲１項記載の組換えプラスミド 。
9. ９．組換えプラスミドがｐＲＰ１である請求の範囲１項記載の組換えプラスミド 。
10. １０．微生物かＥ．ｃｏｌｉ、酵母、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種、Ｂ．ｓｕｂ ｔｉｉｉｓ、Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓおよび他のＢａｃｉｌｌｕｓ種より成る 群から選択される請求の範囲２項記載の形質転換微生物。
11. １１．微生物がＥ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｓｐｈａｅｒｉ ｃｕｓより成る群から選択される請求の範囲２項記載の形質転換微生物。
12. １２．微生物がＥ．ｃｏｌｉＫ−１２ＪＭ１０５株である請求の範囲２項記載の 形質転換微生物。
13. １３．組換えプラスミドがｐＲＧ５である請求の範囲１０項記載の形質転換微生 物。
14. １４．微生物がＢ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓＯＯ株である請求の範囲２項記載の形 質転換微生物。
15. １５．組換えプラスミドがＰＪＰ１である請求の範囲１４項記載の形質転換微生 物。
16. １６．微生物がＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＤ１７０である請求の範囲２項記載の形 質転換微生物。
17. １７．組換えプラスミドがＰＪＰ１である請求の範囲１６項記載の形質転換微生 物。
18. １８．組換えプラスミドがｐＤＦ８である請求の範囲１６項記載の形質転換微生 物。
19. １９．組換えプラスミドがｐＲＰ１である請求の範囲１６項記載の形質転換微生 物。
20. ２０．ヌクレオチド８９−９５および１１０−１１９にプロモータ−配列、そし てヌクレオチド２３１−２３５にリポゾーム結合配列を有し、ヌクレオチド２４ ５−２４７のＴＴＧ開始コドンからヌクレオチド１４１２−１４１４のＴＧＡ終 止コドンまでに亘る続みワクを有し、続みワクは成熱活性リゾスタフインの前駆 体で３８９個のアミノ酸配列を有し、シグナルペプチドとプロリゾスタフインか ら成ってプロリゾスタフインのアミノ酸配列中の１４３−１４４残基のＡｒｇ− Ａｌａ結合での切断により成熟リゾスタフインにプロセシングされる、プレプロ リゾスタフインをコードする第１式により示されるヌクレオチド配列より成るリ ゾスタフインをコードする１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片。
21. ２１．成熟リゾスタフインおよびその機能的同等物をコードする請求の範囲２０ 項記載のＤＮＡ断片およびその相同断片。
22. ２２．プレプロリゾスタフインおよびその機能的同等物をコードする請求の範囲 ２０項記載のＤＮＡ断片およびその相同断片。
23. ２３．プロリゾスタフインおよびその機能的同等物をコードする請求の範囲２０ 項記載のＤＮＡ断片およびその相同断片。
24. ２４．リゾスタフインシグナルペプチドおよびその機能的同等物をコードする請 求の範囲２０項記載のＤＮＡ断片およびその相同断片。