JPH03206889A - 組み換えｄｎａ分子 - Google Patents

組み換えｄｎａ分子

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JPH03206889A
JPH03206889A JP2102749A JP10274990A JPH03206889A JP H03206889 A JPH03206889 A JP H03206889A JP 2102749 A JP2102749 A JP 2102749A JP 10274990 A JP10274990 A JP 10274990A JP H03206889 A JPH03206889 A JP H03206889A
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recombinant dna
amylase
dna
dna molecule
plasmid
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Ilkka Palva
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、タンパク質生産用の組み換えＤＮＡ分子に関
する。本発明のＤＮＡ分子は、バチルス属細菌（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　５ｔｒａｉｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ）内で合
成され、この細菌が分泌する細胞外酵素をコードするＤ
ＮＡをもっていることが知られ、そしてバチルス属細菌
内に複数個のコピーで存在する組み換えＤＮＡ分子であ
り、特に、該ＤＮＡ分子で変性されに、いずれのクンバ
ク質の遺伝子もその信号に結合し得る、バチルス・アミ
ロリクエファシエンス（Ｂ、　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆ
ａｃｉｅｎｓ）産生α−アミラーゼの遺伝子の調節信号
と分泌信号を含むＤ　Ｎ　Ａをもっていることが知られ
ている組み換えＤＮＡ分子である。以下に説明されるよ
うに、これらの組み換えＤＮＡ分子は、たとえば、バチ
ルス属細菌内、まｆ二はバチルス属細菌内で任意のタン
パク質を生産する変異株内でのα−アミラーゼ生産を増
強させるのに使用することができる。
分子生物学における最近の進歩によって、組み換えＤＮ
Ａ技術による細菌内タンパク質生産の新たな可能性が生
じた。組み換えＤＮＡ技術による細菌内置核細胞のタン
パク質生産の可能性に加えて、細胞内で望ましい遺伝子
のコピーの数を増加させることにより、細菌自身のタン
パク質合成を箸しく向上させることができる。細菌細胞
内の遺伝子コピーの数は、細胞内に複数個、通常はｌＯ
〜ｌ０ｆｌｔ個、存在するプラスミドまたはウィルスの
ＤＮＡ分子に遺伝子を結合することにより増加さけるこ
とができる。細胞内で遺伝子コピーの数を増加させると
、それに対応して、遺伝子により発現されるタンパク質
合成も増大する。
この種のいくつかの研究が、宿主細菌としてのエシェリ
ヒア・コリ（Ｅ　、　ｃｏｌｉ）と、その中で複製する
プラスミドまたはウィルスのＤＮＡ分子を使用して実施
されてきたが、宿主としてバチルス属細菌を使用するこ
とは、まだ開始されたばかりである（　Ｃｒｙｃｚａｎ
ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔ
。
１７７．４５９−４６７、［９７９：　Ｋｅｇｇｉｎｓ
ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７
５．１４２３−１４２７．１９７８；　　Ｙｏｎｅｄａ
ら、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、９１　、　Ｉ
　５５６−１５６４　。
１９７９）。これまでに公表されたどの方法ら、細胞外
酵素をコードする遺伝子を、複数例のコピーでバチルス
属細菌内に存在するプラスミドに結合させて、その遺伝
子を複製させるようにして、バチルス属細菌群内でバチ
ルス属細菌による細胞外酵素の生産を増大させること（
タンパク質の生産方法）に関するものではなく、また、
公表された方法のいずれも、バチルス属細菌が分泌する
酵素の遺伝子の調節信号と分泌信号を、生産したいタン
パク質の遺伝子に結合させた方法（本発明のＤＮＡ分子
）に関するものではない。該タンパク質の生産方法によ
り、バチルス属細菌の細胞外酵素の生産を、細胞内での
目的とする細胞外酵素遺伝子の数の増加を通して増大さ
せ得るが、その例として、バチルスα−アミラーゼ遺伝
子の転移について示す。
第１図は、前記生産方法の手順を示す。全細菌のゲノム
が、α−アミラーゼを生産するバチルス属細菌から分離
され、制限酵素で切断される。
制限酵素で切断されたプラスミド分子に、所望の長さの
ＤＮＡ鎖が結合される。本発明に従って、細菌のゲノム
は、制限酵素Ｍｂｏｌで切断することができ、またｐＵ
Ｂ　Ｉ　１０は、制限酵素ＢａｍＨＩで切断できるプラ
スミドとして使用することができる。ここで留意さるべ
きことは、相当する組み換えＤＮＡ分子は、ほかの制限
酵素やプラスミドを使用することによってもつくること
ができ、経験のある科学者は、各種の制限酵素／プラス
ミドの組み合わせを選択することができるが、これも本
発明の範囲内である、ということである。
ＤＮＡ鎖をプラスミド分子に結合して得られた組み換え
ＤＮＡ分子は宿主細菌に転移され、そしてプラスミドに
結合された、α−アミラーゼをコートする遺伝子を受容
した細菌細胞が、宿主細菌の集団からスクリーニングさ
れる。スクリーニングは、形質転換細胞がα−アミラー
ゼを生産する能力に基づいて行なわれる。
本発明では、宿主細菌としてバチルス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｕｔｉｌｉｓ）が使用される。
前記の組み換えＤＮＡ分子がこの細菌に転移されると、
α−アミラーゼをコードする遺伝子は、そこに約５０個
のコピーとして存在する。これにより、この細菌のα−
アミラーゼ生産は、正常のバチルス・ズブチリスに比べ
て約５００倍に増大する。α−アミラーゼ生産が５００
倍に増大するのは、ひとつには、最初の菌株として使用
したバチルス・アミロリクエファシエンスのα−アミラ
ーゼ遺伝子の調節信号が、バチルス・ズブチリスα−ア
ミラーゼ遺伝子のそれより約１０倍も有効であるためて
あり、いまひとつには、α−アミラーゼ遺伝子の数が５
０倍に増えるためである。実験室条件では、組み換えＤ
ＮＡ分子を含む枯草菌は、遺伝子の分離に使用されるバ
チルス・アミロリクエファシエンスより、３〜５倍ら多
くα−アミラーゼを生産する。
組み換えＤＮＡ分子は、バチルス・ズブチリスから分離
され、制限酵素と塩基配列の定義により特徴づけられる
。第２図に、得られる組み換えＤＮＡ分子のｐＫＴＨＩ
ｏ、α−アミラーゼの遺伝子またはその調節信号内にお
ける専用制限酵素の切断部位、および組み換えＤＮＡ分
子の一般的構造を示す。ｐＫＴＨｌｏはプラスミドｐＵ
ＢＩ１０から誘導されるものであって、α−アミラーゼ
遺伝子を含む。ｐＫＴＨｌＯはバチルス・アミロリクエ
ファシエンスのα−アミラーゼ遺伝子をＭ　ｂｏ　Ｉ−
Ｔ部分消化して得られる断片を、ＢａｍＨＩで開裂した
ｐＵＢ　ｌ　ｌ　Ｏに連結して得られるものである。第
３図に、制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位から出発するα
−アミラーゼ遺伝子の塩基配列の一部を示す。
本発に関係のある組み換えＤＮＡ分子は、バチルス属細
菌α−アミラーゼ遺伝子の調節信号と分泌信号、および
バチルス属細菌内に複数個のコピーで存在するプラスミ
ド分子から成り、どのタンパク質の遺伝子をら、α−ア
ミラーゼ遺伝子の分泌信号の末端に結合させて、その結
果、所望のタンパク質がバチルス属細菌内で生産される
ように構成されている。この組み換えＤＮＡ分子の調製
法は第４図に示されている。
α−アミラーゼの構造遺伝子の大部分がます、ＥｃｏＲ
Ｉ制限酵素処理により、α−アミラーゼ遺伝子を含む組
み換えＤＮＡ分子から除かれる。得られたＤＮＡ分子は
、制限酵素により切断され、エキソヌクレアーゼ■とＳ
Ｉヌクレアーゼにより短く切断され、残りのα−アミラ
ーゼ構造遺伝子が除かれ、その後、逆転写酵素により、
分子の両端が確実に二本鎖とされる。次に、ＥｃｏＲＩ
切断部位を含むＤＮＡリンカ−分子が、切断されて短く
なった分子に結合される。このＤＮＡリンカ−分子は５
’−ｄ（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）−３°の塩基配列を有する
。組み換えＤＮＡ分子内でのＤＮＡリンカ−分子の位置
は、結合部位におけるＤＮＡの塩基配列を規定すること
により定まる。α−アミラーゼ構造遺伝子の最後のヌク
レオチドは、ＤＮＡポリメラーゼ１処理で除かれ、新し
いＤＮＡリンカ−が、α−アミラーゼ遺伝子の分泌信号
の末端に結合される。ＤＮＡリンカ−分子のこの制限酵
素切断部位に、どれかほかのタンパク質、たとえばエン
エリヒア・コリのβ−ラクタマーゼの構造遺伝子、また
はアミノ酸をコードする、α、βまたはγインターフェ
ロンのＤＮＡ鎖またはその一部を結合させることができ
ろ。次に、結合された遺伝子によってコードされるタン
パク質が、αアミラーゼ遺伝子の調節信号と分泌信号に
より、バチルス属細菌内で生産される。
タンパク質生産方法の手順の詳細な説明バチルス属細菌
からのゲノムの分離、精製および切断 細菌株として、バチルス・アミロリクエファシエンス株
を使用した。この細菌を富栄養溶液中で一晩生育させ、
細胞を集め、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム−〇、
０１５Ｍ　ＮａＣＱａｔ衝液内で洗浄した。洗浄した細
胞を、２０％Ｗ／Ｖサッカロースー５Ｏｎ＋Ｍトリス−
ＨＣＩ２溶液（ｐＨ８，０）２ｙ、Ｑに懸濁させた（２
ＸｔＯ”個の細胞、つまり培地２００　ｘＱ）。２０Ｒ
９のりゾチーム、２０ＪＩ９のプロナーゼおよび２ｘＱ
の１％Ｗ　／　Ｖ　　Ｓ　ａｒｋｏｓｙｌＲ−０，ＩＭ
　　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８，０）を加え、溶液を３７℃
で１５時間培養した。６　、５　ｘＱの水と、溶解生成
物の屈折率を１．４１００にするような量の固体ＣｓＣ
Ｉ２を加え、溶解生成物を遠心した（ベックマンＴｉ５
０ローター、３６００　ｒｐｍ。
１０℃で４８時間）。遠心した溶解生成物を各両分に分
け、各両分の粘度を基準にして細菌ゲノムを含むと推定
される画分を集め、ＩＯｍＭ）リスＨＣＱ−１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ−０，１Ｍ　　ＮａＣ（２ｅｌ衝液（Ｉ）８８
．０）によって、４℃で３０時間透析を行なった。
得られたゲノムプレパラートをフェノールで３回抽出し
、フェノールをエーテル抽出により除去した。密度勾配
１５→３０％Ｗ／Ｖのサッカロース−〇、ｌ　Ｍ　　Ｎ
ａＣｌ２−５０ｍＭ　トリス−ＨＣ（！１ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム（、））（８，
０）中で、ベックマンＳＷ２７０−ター２２００　Ｏｒ
ｐｍによりＤＮＡを２２℃、１６時間遠心にかけて精製
し、その後、この勾配を両分し、ＤＮＡ鎖が＞＋５Ｘ１
０’ダルトンである両分を集め、ＤＮＡをエタノールで
沈澱させた。
こうして分離したバチルス・アミロリクエファシエンス
のゲノムプレパラートを制限酵素Ｍｂｏ［て不完全な切
断を行ない、切断ＤＮＡ鎖を、その大きさに従って、前
記サッカロース勾配液中て分すた（ベックマンＳＷ２７
０−ター、２２００Ｏｒｐｍ、２２°Ｃで１６時間）。
ＤＮＡ鎖が１５−５×１０６ダルトンである両分を集め
、ＤＮＡをエタノール２て沈澱させた。
制限酵素による転移ベクターの分離と切断プラスミドｐ
ＵＢ　Ｉ　Ｉ　Ｏを転移ベクターとして使用した。この
プラスミドは、以前記述された（　Ｃｒｙｃｚａｎら、
Ｊ　、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１３４　、　３１８−
３２９．１９７８）通りに、バチルス・ズブチリス菌Ｓ
　Ｂ　２０２　（Ｒ，Ｈａｒｒｉｓ−Ｗａｒｒｉｃｋ　
＆Ｊ、ＢａｃＬｅｒｉｏ１．，１３３．１２３７−１２
４５゜５ｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖ、　　　ＣＡ　　Ｄ
ｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎより入手）から分離、精製した。精製
プラスミドを、プラスミド分子中に唯１個の切断部位を
有する制限酵素Ｂａｍ［（Ｉで切断した。プラスミド分
子の直線的対応はゲル電気泳動により照査した。
バチルス・アミロリクエファンエンスゲノム鎖を酵素Ｍ
ｂｏｌで切断し、その大きさに基づいて選択し、これを
、酵素ＢａｍＨＩで切断したｐＵＢ１１０プラスミドと
、１０ｍ１ｖ！トリス−１−１ｃｆ２−１ｍＭＥＤＴＡ
緩衝液（ｐＨ８，０）中で、ＤＮＡ１度比率が１＝３、
全容積が１２０μＱ１そして全ＤＮＡ１ｆｉ度が１８０
μ９／ＭＱとなるように混合した。この溶液を６５℃で
５分間加熱し、６６＋ｎＭトリスーＨＣＱ　　６　、６
　ｍＭ　　ＭｇＣＱｔ　　ｌ　ＯＯｍＭノチオトレイッ
ト−１０ｍＭ　　ＡＴＰ緩衝液（ｐＨ７，８）１３μＣ
とＴ４−ＤＮＡリガーゼ（２０ワイス単位）５μｇを冷
溶液に加えた。このリガーゼ含有溶液を２３℃で３時間
培養し、連結結果をゲル電気泳動により照査した。
宿主細菌への、組み換えＤＮＡ分子の転移遺伝型５ａｃ
Ａ　３２１　、　ｍｅｔＢ　５、ａｒｏｌ１９０７ａｍ
ｙ−をもったバチルス・ズブチリス菌ＩＡ２８９（Ｃａ
ｔａｌｏｇ　ｏｆ　５ｔｒａｉｎｓ、第１巻、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓＧｅｎｅｔｉｃ　Ｓ　Ｌｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ
、　１９７９年ｌＯ月発行）を宿主細菌として使用した
。この菌株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５
ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ（米国０ｈ１０州立大学）から
入手したもので、その表現型Ａｍｙ−を、α−アミラー
ゼをコードする、酵素の構造遺伝子における突然変異と
して地図化した。この菌株を、以前記述された（Ａ　ｎ
ａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ、Ｂａｃ−ｔｅｒｉ
ｏｌ、８１，７４１−７４６．１９６１）ようにして、
コンビ−テントに、すなわちＤＮＡを受容し得るように
した。前記の通り連結によって調製した組み換えＤＮＡ
分子を、受容能力のある宿主細菌と混合し、この混合物
を３７℃に３０分間維持した。次に混合物を、抗生物質
カナマイシンを含む細菌平板上にまいて、プラスミドを
受容しなかった細菌のすべての生育を阻止させた。この
平板を３７℃に３０時間維持した。この間に、プラスミ
ドをもった。すなわち、プラスミドに結合したバチルス
・アミロリフファシェンスゲノム鎖をもった宿主細菌が
生育して小さいコロニーの群となった。
前記の細菌コロニーを新しい栄養平板上で複製し、３７
°Ｃで３０時間生育させた。得られた増殖細菌を、以前
記述された（Ｊ　、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　Ｉ　Ｉ　
９４１６−４２４　１９７４）方法を用いて、ＩＫｌ溶
液で処理した。その結果、α−アミラーゼをコートする
遺伝子を含む組み換えＤＮＡ分子を受容した細菌コロニ
ーのまわりに白色の輪が形成された。対応するコロニー
を元の細菌平板から集めて、細菌を連続して数回生育さ
せて精製した。
組み換えＤＮＡ分子の分離と特性決定 以前に記述した（　Ｃｒｙｃｚａｎら、Ｊ　、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ。
１３４．３１８−３２９．１９７８）方法により、宿主
細菌から組み換えＤＮＡ分子を分離し、精製した。この
分子の特性を各種の制限酵素により決定し、またα−ア
ミラーゼをコードする遺伝子の位置を、組み換えＤＮＡ
分子の各種部位に余分なりＮＡ鎖を結合させたときの遺
伝子の不活性化を追跡することにより、予備的に決定し
た。次にαアミラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を
、以前記述された（Ｍ　ａｘａｍ、　Ａ　、とＧ　ｉ　
１ｂｅｖｔ　、　Ｗ　。
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、米国７４，５
６０５６４．１９７７）方法により決定した。
α−アミラーゼの活性の測定 プラス、ミドｐＵＢ　Ｉ　Ｉ　Ｏ内に、α−アミラーゼ
をコードする遺伝子を有する変性宿主細菌枯草菌ＩＨＯ
６０６４（ｓａｃＡ３２１．ｍｅｔＢ５）を、栄養液体
培地（Ｌ　ｕｒｉａブイヨン）内で、３７℃で通気して
生育させた。２時間おきに培養液から試料を採取し、こ
の試料から、ラブバス（Ｒｈａｄｅｂａｓ　　登録商標
）タブレットによってα−アミラーゼの活性を求めた。
本発明のＤＮＡ分子の詳細な説明 プラスミドｐＫＴＨ１ＯからＥｃｏＲＩ断片の除去プラ
スミドｐＫＴＨＩｏを切断部位ＥｃｏＲＩ（第２図）で
切断した。得られたＤＮＡ鎖（約１μｇ）を、６６ｍＭ
トリス−ＨＣＱ−６，６ｍＭ　　ＭｇＣ（！を一１００
ｍＭノヂオトレイットー１０ｍＭ　　ＡＴＰＩＩ衝液（
ｐ樹液１７　、８　）の中で再び連結させ、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ０５μＱ（２ワイス単位）を加えた。
この連結溶液を２３°Ｃで３時間培養した後、この溶液
により、前記のようにして、受容能力のあるバチルス・
ズブチリス菌ＩＨＯ６０６４菌株［バチルス・ズブチリ
ス１Ａ２８９株をバチルス・ズブチリスｌＡ４６株（Ｃ
ａｔａｌｏｇ　ｏｆ　５ｔｒａｉｎｓ、第１巻、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅ
ｒ１９７９年ｌＯ月発行）のＤ　Ｎ　Ａ　（ｒｅｃＥ　
４、ｔｈｒ５、ｔｒｐｃ２）で形質転換し、芳香族アミ
ノ酸を含まない最小培地で増殖できる形質転換を選択し
た、α−アミラーゼが陽性味］を形質転換させた。この
細胞を、カナマインンを含む細菌平板上にまいて、３７
℃で一晩生育させた。得られた形質転換体からα−アミ
ラーゼ陰性コロニーを、デンプンを用いるＩ−ＫＩ法に
よりスクリーニングし、以前に記述された（Ｃｒｙｃｚ
ａｎら、Ｊ　、　Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏｌ。
１３４．３１８−３２９．１９７８）ようにしてプラス
ミドをコロニーから分離した。得られたプラスミドプレ
パラートｐＫＴＨ２９内の欠損ＥｃｏＲ−Ｋｐｎ　Ｉ　
−Ｈ１ｎｄＩＩＩ　−ＥｃｏＲＩ断片をゲル電気泳動に
より照査した。
Ｉ（２９の短縮 プラスミドｐＫ’ｒＨ２９（１００μＣ，ｓｏｏμ９／
ＭＩ２）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した。この処理後
に１．Ｉ　Ｍジチオトレイブト０．５μＱとエキソヌク
レアーゼＩＩＩＩＯμ１２（０，２５単位、ビオラプス
（ｒ３１ｏ１ａｂｓ））を溶液に加えた。この溶液を３
７℃で１〜３時間培養した。ＤＮＡをエタノールで溶液
から沈澱させ、０．３Ｍ　　ＮａＣｌ２−０．０３Ｍ酢
酸ナトリウム−３ｍＭ　　ＺｎＣＬ緩衝液（１）Ｈ４，
５）に溶解した。Ｓｔ−ヌクレアーゼ（２５単位／ＭＱ
、ベーリンガー、マンハイム）１０μＱを加え、溶液を
３７℃で３０分、そして４℃で１０分間培養した。培養
後、プレパラートをフェノールで抽出し、フェノールを
エーテル抽出で除去し、ＤＮＡをエタノールで沈澱させ
た。乾燥させたＤＮＡを、１０ｍＭトリス−ＨＣＱ−１
ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝液（ｐｌ（８，０）４０μＱに溶解
し、１５０ｍＭトリスＩ　８０ｍＭ　　ＫＣＱ−４０ｍ
Ｍ　　ＭｇＣＬ−３，０ジヂオトレイツト緩衝液（ｐＨ
８，３）１０μ（！、ｄＮＴＰ混合物５μＣ（ｇヌクレ
オチド三リン酸に対し１０ｍＭの溶液を等モル比で混合
した）および逆転写酵素（ベアード（Ｂｅａｒｄ）、１
３単位／μＱ）２ｕＱを加えた。この溶液を３７°Ｃで
３０分間培養し、６５°Ｃで７分間培養して反応を停止
させた。ＤＮＡを、分取アガロース電気泳動（ＬＧＴ、
低ゲル化温度）により精製し、臭化エチジウムで染色さ
れていたプラスミド領域をゲルから切除した。
ＤＮＡを、６５℃でフェノールによりアガロースから抽
出し、２０°Ｃでフェノール抽出を繰り返し、フェノー
ルをエーテル抽出により除いた。ＤＮＡをエタノールで
沈澱させ、沈澱物を７０％エタノールで洗浄し、乾燥し
た。
ＥｃｏＲＩリンカ−分子の溶液（５’−ｄ（ＧＧＡＡＴ
ＴＣＣ）−３°の塩基配列を有するＥｃｏｆｌｌリンプ
Ｊ−１Ｃｏ１１ａｂｏｒａＬｉｖｅ　　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ、　　５　０　　μ９／ｍＱ）１０μｇに、”ＰｒＡ
ＴＰ（１０ｍＣ１／ｘ１２．３０００　Ｃｉ／ｍｏｌ）
５　ｕＱ、　　６００ｍＭ　トリスート［ＣＱ−６６ｍ
Ｍ　　ＭｇＣＩＬ　　ｌ　００　ｍＭノヂオトレイ−／
　ｈ緩衝液（ｐＨ８，０）１．７μＱおよびＴ４−ポリ
ヌクレオチドキナーゼ０．５μＱを加えた。この溶液を
３°７℃で３０分間培養した後、ｌｏｍＭ　　ＡＴＰ５
μＱを加え、３７℃で３０分間培養を続けた。
エキソヌクレアーゼで処理した乾燥ＰＫＴＨ２９プレパ
ラートを、前記リン酸化ＥｃｏＲＩリンカー分子を含む
溶液５μｇに溶解した。この溶液に、１０ｍＭＡ’ｌ’
Ｐ０．５μ１２．１ｍＭスペルミジン０．５μＱおよび
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ０．５μＱリガーゼ（２ワイス単
位）を加えた。この溶液を２３℃で３時間培養した後、
４０ｍＭトリス−ＨＣｆ２＋　００ｍＭ　　ＮａＣｌ２
−１０ｍＭ　　ＭｇＣＬ−緩衝液（ｐＨ７，６）中に希
釈して２０μＱにした。１５単位のＥｃｏＲＩ酵素（ビ
オラプス）を加え、溶液を３７℃で１２時間培養した。
６５℃で１０分間の培養により反応を停止させた。Ｅｃ
ｏＲＩて処理したプレパラートを、ＩＪ１１２のセファ
ローゼ４Ｂカラムに通してゲルｔセ過を行なった。２ｍ
Ｍ）リスＨＣＣ−０，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ（ｐＩ−１７
，５）を濾過における溶離緩衝液として用いた。濾液を
各３５μＣの両分として集め、プラスミドを含む各両分
をその放射能により固定し、集めて乾燥した。乾燥ＤＮ
Ａを、６６ｍＭ）リス−ＨＣ＆−６，６ｍＭＭｇＣ（ｈ
−１０ｍＭジチオトレイソト緩衝液（ｐＨ・８．０）２
０μ１２に溶解し、１０ｍＭ　　ＡＴＰｌ、５μＱとＴ
４−ＤＮＡリガーゼ０３μｇを加えた。
この溶液を２３℃で３時間培養した後、受容能力のある
バチルス・ズブチリス菌１）１０６０６４菌味をプラス
ミドプレパラートで形質転換させ、カナマイシンを含む
細菌平板上で細胞を培養した。
この形質転換体から、以前に記述された（　Ｃｒｙｃｚ
ａｎら、Ｊ　、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　＋　３４．３１
８３２９．１９７８）方法でプラスミドを分離し、プラ
スミドをまず、ゲル電気泳動で特性決定を行なった後、
ＥｃｏＲＩリンカ−分子の両末端におけるＤＮＡの塩基
配列を決めた。こうして、プラスミドｐＫＴＨ２９から
プラスミドｐＫＴＨ３８を得１こ。プラスミドｐＫＴ８
３８内では、ＥｃｏＲＩ分子の位置は、α−アミラーゼ
の構造遺伝子領域における分泌信号の切断部位から９０
ヌクレオチド対後方にある。リンカ−分子を分泌信号の
結合部位またはそのごく近くて結合させるため、プラス
シトｐＫＴＨ３８をＥｃｏＲＩて切断した。切断したプ
ラスミド各１０μ９の３部分を２０ｍＭ）リス、６０’
ＯｍＭ　　ＮａＣ１２−１２ｍＭ　　ＭｇＣＣｔ−１２
ｍＭＣｕＣＬ　　ＩｍＭ　　ＥＤＴＡ’ＪＵ衝液（ｐＨ
樹液、　１　）＋１５μＱに＠局させた。ＢＡＬ−３１
酵素（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、　ＢＲＬ４０　Ｕ／ｒｓＱ）Ｉ　Ｏ
μｇを各プラスミド部分に加え、試験管を３０℃の水浴
中で５．６および７分間培養した。最終濃度り月２ｎ＋
Ｍになるように、ｐＨ８，０の０．５Ｍ　　ＥＤＴＡを
加えて反応を停止させた。ＢＡＬ−３１で処理した各Ｄ
ＮＡ部分を一緒に合わせて、フェノールで２回抽出を行
ない、エタノールで沈澱させた。エタノールによる沈澱
物を、６３ｍＭトリス−６、３ｍＭ　！ｖ１ｇｃｉ２．
緩衝液（ｐｔ（８、０）７５μＣ＋、：懸副させ、この
液に、５μＱの１ｍＭ　ｄＡＴＰ、１ｍＭ　ｄＧＴＰ、
１ｍＭｄＣＴＰおよび１ｍＭｄＴＴＰを加え、最後に５
ｕＱのＴ　４−ポリメラーゼ（Ｐ　Ｌ　−Ｂ　ｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ５Ｕ／μＱ）を加えた。この液を１１’
Ｃで８０分間培養した。前記の通り０．５Ｍ　ＥＤＴＡ
を加えて反応を停止させ、溶液をフェノールで抽出し、
ＤＮＡをエタノールで沈澱させた。エタノールによる沈
澱物をｌ０ｍＭトリス−１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液（ｐ）Ｉ
８．０）２５０μｇに溶解した。この溶液の５５μＱに
、リン酸化ＨｉｍｄＩ［Ｉリンカ−分子（ＢＲＬ、　　
７５ｐｍｏｌ）５０　ｔｔＱ、６６０ｍＭ）リス１００
ｍＭ　ＭｇＣＬ−５０ｍＭジチオトレイソト緩衝／＆（
ｐＨ７，５）５μＱおよびＴ４　　ＤＮＡリガーゼ（Ｂ
ｒ（し、２Ｕ／μのＩＯμＱを加えた。この混合物を１
５℃で１５時間、そして６５°Ｃで１０分間培養した。
イソプロパツールを加えてＤＮＡを沈澱させ、ＤＮＡ沈
澱を７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥後に、１００
ｍＭトリス−５０ｍＭ　ＮａＣｌ２５ｍＭ　ＭｇＣ（！
ｙ　　５ｍＭジヂオトレイット緩衝液（ｐｉ−１８，０
）ｌ　００μＱ１．：懸濁さ仕た。この懸濁液に、ｊ−
（ｉｍｄＩＩｌ制限酵素（ＢＲＬ、１ｏｔＪ／μ０３μ
Ｑを加え、この液を３７℃で４時間、そして６５°Ｃで
１０分間培養し、ＤＮＡを、０．８％Ｌ　Ｇ　Ｔ、７ガ
ロースゲル（Ｍａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄ　Ｉ　ｎｃ
、）、３０Ｖて１５時間電気泳動にかけて精製した。ゲ
ルから線状プラスミド領域を切り取り、６５℃でフェノ
ールによりＤＮＡを抽出し、エタノールで沈澱させた。
エタノールによる沈澱物を、６６ｍ１ｖ［トリス−１０
ｍＭ　ＭｇＣ（Ｉｔ　　５ｍＭジチオトレイッ！・緩衝
液（ｐＨ７，５）３５μＱに溶解し、これに、１０ｍＭ
　ｒＡＴＰ　Ｉ　、５１１ＱとＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂ
ＲＬ、２ｔＪ／μｍ２）　１　、５μＱを加えた。この
混合物を２２℃で３時間培養し、受容能力のあるバチル
ス・ズブチリスＩＨＯ６１３５菌株しバチルス・ズブチ
リスＩ　）−１０６０６４株をバチルス・ナツト−（Ｂ
、　　ｎａｔｔｏ）２７　Ａ　１株（Ｃａｊａｌｏｇ　
ｏ「Ｓ　ｔｒａｉｎｓ、第１巻、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋＣｅｒ＋ｔｅｒ、　ｌ　９７
９年ｌＯ月発行）のＤＮＡで形質転換し、メチオニンを
マーカーとしてスキム・ミルク平板上で、プロテアーゼ
産生菌を選択し、これをＸ−メチル−Ｎ−ニトロソ−Ｎ
−二トログアニノンで処理し、これをＩＨＯ６０６４１
ｔｉに再形質転換したらの］に転移させ、カナマイシン
を含む平板栄養培地の上で細胞を培養した。前に記述し
た方法に従って、形質転換体からプラスミドを分離し、
ＨｉｍｄＩＩＩリンカ−分子の位置をＤＮＡ鎖配列によ
り決定した。このようにして、α−アミラーゼの構造遺
伝子領域内でＨｉｍｄＩＩＩリンカ−分子が、分泌信号
の直ぐ次に、または分泌信号の切断部位の次の種々の位
置に存在する一連のプラスミドを得た。
目的とするタンパク質のいずれかのアミノ酸をコードす
るＤＮＡ鎖を、これらのＨｉａ＋ｄ［ｌｌリンカ−分子
により形成された切断部位に結合させることかで４、こ
れにより、前記の例から分かるように、バチルス属細菌
はその基質上に該タンパク質を生産し、分泌する。
本発明により生産することのできるタンパク質としては
次のものが例示される。
Ａ　細菌と原生動物の抗原性タンパク質次の起源からの
、きょう膜、外膜およびフィンブリアのタンパク質・ バタテロイデス・フラギリス （ＢａｃＬｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）フッバ
クテリウム・ニス・ピー （Ｆ　ｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ　ｓｐｐ、　）ボルデ
テラ・ベルツノス （ＢｏｒｄｅＬｅｌ　ｌａ　ｐｅｒＬｕｓｓｉｓ）ヘモ
フィルス・インフルエンザ （Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｒｌｕｅｎｚａｅ）イ
エルノニア・エンテロコリティ （Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）イ
エルンニア・ベスチス 、（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｐｅｓｔｉｓ）ブランハメラ・
カタラリス （Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）
エンエリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）クレブシェラ・
ニラモニア （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）ビブリ
オ・コレラ （Ｖ　１ｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）プロテウス・ミ
ラヒリス （Ｐ　ｒｏｔｅｕｓ　ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ）ツユ−トモ
ナス・エールギノサ （Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）
セラチア・マルセセンス （Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）レジオネ
ラ・ニューモフィラ （Ｌ＋４ｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）カ ナイセリア・ゴノロエア （Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ナイ
セリア・メニンギチジス （Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）サ
ルモネラ・チフィムリウム （Ｓ　ａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）
サルモネラ・チフィ （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）サルモネラ・パ
ラチフィＢ （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｐａｒａｔｙｐｈｉ　Ｂ）マ
イコバクテリウム・ヂューバーキュロシス（Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｙｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）クラミ
ジア・トラコｙチス （Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）シゲ
ラ・ニス・ピー （Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｓｐｐ、　） 次の細菌の生産するタンパク質毒素： スタフィロコツカス・アウレウス （Ｓ　ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）シ
ュードモナス・エールギノサ （Ｐ　ｓｅｕｄｏｇｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）
クロストリジウム・ニス・ピー −（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐｐ、　）エンエリヒ
ア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）イエルシニア・
ペスチス （Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｐｅｓｔｉｓ） ビブリオ・コレラ （Ｖ　１ｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）ボルデテラ・ペ
ルランス （Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ストレ
プトコッカス・ピオゲネス （Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）
のＭ−タンパク質ストレプトコッカス・ミュータンス （Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）の分
泌酵素次の生物の表層タンパク質 ブラズモジウム・ニス・ピー （Ｐ　ｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｓｐｐ、　）トキソプラズ
マ・ニス・ピー （Ｔｏｘｏｐｌｇｓｍａ　ｓｐｐ、　）リューンユマニ
ア・ニス・ピー （Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｓｐｐ、　）すべての成長段
階シストシーマ・ニス・ピー （Ｓｃｈｉｓｏｔｏｓｏｍａ　ｓｐｐ、　）トリバノソ
ーマ・ニス・ピー （Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　５ｐＩ）、　）次の微生物
の膜タンパク質 ミコプラズマ・ニラモニア （Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ミコ
プラズマ・ホモニス （Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｈｏｍｏｎｉｓ）ストレプト
コッカス・ニス・ピーの伝染性タンパク質 （Ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆｓ　ｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐ、　） スタフィロコッカス・アウレウスの伝染性タンパク質 （Ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｒ　　５
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ−ｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ） Ｂ、−ウィルスの抗原性タンパク質 ミク゛ユウイルス（Ｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ）のＨＡと
ＮＡ膜タンパク質インフルエノ”）’Ａ　Ｈ１−Ｈｌ　
２、インフルエンザＢ１インフルエンザＣ）パラミクソ
ウィルスのＨＡとＦタンパク質（バラインフルエンザｌ
−４、ニューカッスル病ウィルス、はしかウィルス、呼
吸器シンシチウムイルス、耳下腺炎ウィルス、ノステン
パーウイルス） ラヒエス（Ｒａｂｉｅｓ）ウィルスのＧタンパク質アル
ファウィルスのＥｌとＥ２タンパク質（Ｃｈｉｋｕｎｇ
ｕｎｙａ、　　Ｗｅｓｔｅｒｎ、　　Ｅａｓｔｅｒ。
Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ　ｅｑｕｉｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａ
ｌｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓＯｎｙｏｎｇ−ｎｙｏｎｇ　　
ｖｉｒｕｓ、　　Ｓｅｍ１ｉｋｉＦｏｒｅｓｔ　　ｖｉ
ｒｕｓ、　　Ｓ　１ｎｄｂｉｓ　　ｖｉｒｕｓ）フラビ
ンウィルスの■１とＶ３タンパク質（Ｄｅｎｑｕｅ　　
ｌ　−４、Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉ
ｓｖｉｒｕｓｌＭｉｔｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ　
　ｖｉｒｕｓｅｓ。
Ｍｕｒｒａｙ　　Ｖａｌｌｅｙ　ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔ
ｉｓ　ｖｉｒｕｓＫｙａｓａｎｕｒ　　Ｆｏｒｅｓｔ　
ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ。
Ｌｏｏｐｉｎｇ　　ｉｌｌ　　ｖｉｒｕｓ、　　０ｍ５
ｋ　ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ１’ｅｖｅｒ　ｖｉｒｕｓ
） 風疹ウィルスの表層タンパク質 豚コレラウィルスの表層タンパク質 馬関節炎ウィルスの表層タンパク質 バニア（Ｂ　ｕｎｙａ）ウィルスのＧｌと６２タンパク
質（Ｒｉｆｔ　Ｖａｌｌｅｙ　ｆｅｖｅｒ　ｖｉｒｕｓ
、　Ｇｒｉｍｅａｎｈｅｍｏｒｒｈａｇｊｃ　ｆｅｖｅ
ｒ　ｖｉｒｕｓ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａｅｎｃｅｐｈ
ａｌｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ　　ＰｈｌｅｂｏＬｏｍｕｓ
　ｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ） アリーナウィルスのＧｌと６２タンパク質（Ｌａｓｓａ
　ｆｅｖｅｒ　ｖｉｒｕｓ、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｒｉｃ
ｃｈｏｒｉｏｎ　ｍｅｎｉｎｇｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ）ヒ
゛コルナウイルスのタンパク質Ｖｌ−Ｖ４（ｐｏｌｉｏ
　　ｌ　−３、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ　Ａ　ｖｉｒｕｓｅ
ｓｌ　−２４Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ　Ｂ　ｖｉｒｕｓｅｓ
　　ｌ−６、ＥＣＨｏ　ｖｉｒｕｓｅｓ　　ｌ　−８１
１−３４［−１ｅｐａｔｉＬｅ　Ａ　ｖｉｒｕｓ、　Ｈ
ｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏ　ｖｉｒｕｓｅｓｌ−１１３） ロウタ（ｒｏｔａ）ウィルスの表層タンパク質゛ヘルペ
スウィルスの表層タンパク質 （１−Ｉ　Ｓ　Ｖ　１　、２　、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ
　ｖｉｒｕｓ、ＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒ　ｖｉｒｕｓ、
　Ｅｑｕｉｎｅ　ａｂｏｒｔｉｏｎ　ｖｉｒｕｓ）パボ
バ（ｐａｐｏｖａ）ウィルスＶＰＩ−ＶＰ３タンパク質 パルホ（ｐａｒｖｏ）ウィルスのタンパク質（Ｍｉｎｋ
　ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ、　Ｂｏｖｉｎｅ　
　ｐａｒｖ。
ｖ＋ｒｕｓ、　　Ｐｅｌ＋ｎｅ　ｐａｒｖｏ　ｖｉｒｕ
ｓ　　Ｐｒｏｃｉｎｅｐａｒｖｏ　ｖｉｒｕｓ） ヒト肝炎Ｂウィルスの構造タンパク質 エポラ（Ｅｂｏｌａ）とマールブルグ（Ｍａｒｂｕｒｇ
）ウィルスの構造タンびり質 アデノウィルスのヘキソン、ベントンと１＆維のタンパ
ク質 （［−（ｕｍａｎ　ａｄｅｎｏ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｌ　
−３３）Ｃ工業酵素 酵素 α−アミラーゼ（Ｂ　、５ｕｂｔｉｌｉｓ、ｍａｌｔ、
　Ａ　、ｏｒｙｚａｅ）アミノアシドアミラーゼ（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　Ｓｐｐ、　）アミログルコンダーゼ（Ａ
、ｎｉｇｅｒ、Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ　ｓｐ、）ブロメライ
ン（Ａ　ｎａｎａｓ） フイノン（Ｆｉｇ） β−ガラクトシダーゼ（Ａ、旧ｇｅｔ）β−グルカナー
ゼ （Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ、　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
　ｓｐ、　）グルコース−イソメラーゼ （Ｌ、ｂｒｅｖｉｓ、　ｐ、ｎｏｔａｎｕｍ、　Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、）り゛ルコースオキシダー
ゼ （Ａ、　ｎｉｇｅｒ） ヘミセルラーゼ （Ａ、ｎｉｇｅｒ、　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅ
ｓｅｉ　Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ、　） インへ゛ルターセ゛（Ｓ　、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
カタラーゼ（Ａ　、　ｎｉｇｅｒ） コラゲナーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｈｉｓｔｏｌ
ｙＬｉｃｕｍ）ギンラナーゼ （Ａ、ｎｉｇｅｒ、　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅ
ｓｅｉ　Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ、　） ラクターゼ （Ｓ、ｒｒａｇｉｌｉｓ、Ｓ、Ｉａｃｔｉｓ、　Ｅ、　
ｃｏｌｉ。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　） すバーセ゛（Ｍｏｕｌｄ、　Ｙ　ｅａｓｔ）ナリンキ′
ナーセ′（Ａ、旧ｇｅｒ） パンクレアチン（Ｐ　ａｎｃｒｅａｓ）パパイン（Ｐ　
ａｐａｙａ） ペクチナーゼ（Ａ　、　ｎｉｇｅｒ、　Ｐ　ｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｍ　　ｓｐ、）ペニシリンアミダーゼ（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ、　）ペニンリナーゼ（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｓｐｐ、　）へ°プシン（Ａｎｉｍａｌ　ａｂ
ｄｏｍａｎ）プロテアーゼ（Ａ、　ｏｒｙｚａｅ、　Ｂ
、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）フ０ルラナーセ’　（Ａ　ｅｒ
ｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｕｇｅｎｅｓ）イソアミラーゼ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｉｎＬｅｒｍｅｄｉａ、　
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ、　） レンニン （Ｃａｌｆ　ｓｔｏｍａｇｅ、　Ｍ、ｍ１ｅｈｅｉ、　
Ｅｎｄｏｔｈｉａｐａｒａｓｉｔｉｃａ） リボヌクレアーゼ （Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｅｓ、　Ｍｏｕｌｄ、　Ａ、　ｎ
ｉｇｅｒ）セルラーゼ （Ａ、　ｎｉｇｅｒ、Ｔｒｅｃｈｏｄｅｒｍａ　　ｒｅ
ｅｓｅｉ）ストレプトキナーゼ （Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｈｅｍｏｌｙｔｉ
ｃｕｓ）トリプシン　（Ｐ　ａｎｃｒｅａｓ） 例１ プラスミドＩ）ＫＴＨをＨｉｍｄｌｌｌ酵素で切り開き
、その切断部位に、プロモーターと分泌信号の領域が取
り除かれた、エノエリヒア・コリのβ−アミラーゼをコ
ードする遺伝子［Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７５．３７３７−３７４１（１９７８
）］を結合させた。プラスミドを受容した細胞をカナマ
イシン耐性に基づいて選択することにより、前記の得ら
れた雑種プラスミドを、受容能力のあるバチルス・ズブ
チリスｌＨＯ［１１１４０菌株［バチルス・ズブチリス
１８０６１３５株をＮ−メチルＮ−ニトロソ−Ｎ−ニト
ログアニジンで処理し、Ｌｕｒｉａ寒天上で一夜培養し
、プロタミン−ＰＮＡ平板（Ｒａｐｐａｐｏｒｔ　ｅｔ
　ａｌ、、　Ｊ　、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。
２４０．７８−７６（１９６５））にレプリカし１、ハ
ロ（ｈａｌｏ）の認められないコロニーを選択したしの
］に転移させ、カナマイシンを含む平板栄養培地の上で
細胞を培養した。Ｏ，１ｍＭニトロセフイン−〇、ＩＭ
リン酸カリウム溶液（ｐＨ７，０）１００μρ中にコロ
ニーを懸濁させて、形成転換体をその産出量に関してス
クリーニングした。生産されるβ−ラクタマーゼの活性
を測定するニトロセフイン試験の結果が陽性である（溶
液の色が赤に変化した）コロニーから液体培養菌をつく
った。プラスミドｐＫＴＨ５０で形質転換されたバチル
ス・ズブチリスＩＨＯ６１４０を対照として用いた。
グリセロール０．５％、可溶性デンプン１％およびカナ
マイノン５μ９／ｍ（ｌを加えた５Ｍ５（Ｓ　ｐｉｚｉ
ｚｅｎ最少塩類）溶液中で菌株を生育さＵた。
培養菌を振とうしながら３７℃で生育した。約５時間の
対数生育期（ｋｌｅｔｔ６７ω２５０）後、培養菌を１
００００９で５分間遠心し、上清を回収した。細胞をＯ
、ｌ　Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７−，０）に懸濁
させて、元の成長容積にらどした。
セファ２０チンの崩壊を分光光度計で追跡して、細胞画
分と上清画分のβ−ラクタマーゼ活性を測定した。測定
値から次の結果が得られた。
β−ラクタ７−セ゛活性（Ｕ／１ｆ２）＊＊）ＩＵのβ
−ラクタマーゼは、３７℃で１分間にｌμモルのベニン
リンＧを崩壊する。この結果から、上清画分中に目的と
するβ−ラクタマーゼか取得されたことが判る。
例２ バチルス・ズブヂリス内での白血球インターフェロンの
生産 プラスミドｐＫＴＨ５３をＨｉｍｄＩＩ［酵素で切断し
、その切断部位に、分泌信号をコードする部分が取り除
かれた、白血球インターフェロン（α−２）をコードす
るＤＮＡ鎖［Ｍａｎｔｅｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　
１０１−１０　（１９８０）；Ｎａｇａｔａ　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ｎａｔｕｒｅ２８７：４０１−４０８（１９８０
）；５ｔｒｅｕｌｉｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　
２０９．１３４３−１３４７（１９８０月を結合させた
。プラスミドを得た細胞をカナマイシン耐性に基づいて
選択することにより、前記の得られた雑種プラスミドを
、受容能力のあるＩＨＯ６１４０枯草菌に転移させた。
コロニー交雑法（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｍ　、とＨｏｇ
ｎｅｓｓ、　Ｄ　、　Ｓ　。
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳ）７
２．３９６１−３９６５．１９７５）によりスクリーニ
ングしたが、その際プローブとして、＋′Ｊで標識され
た、インターフェロンをコードするＤＮＡを用いた。可
溶性デンプン２％とカナマイシン５μ９／Ｈ（ｌを加え
たルリア（Ｉ、ｕｒｉａ）ブイヨン中で、インターフェ
ロン−ＤＮＡを含む細菌コロニーを３７℃て振とうしな
がら生育させた。４時間の対数生前期（ＫＩｅｔｔ６７
ω３００）の後、培養菌を１００００９で５分間遠心し
た。上清を回収し、細胞を、０゛９％ＮａＣＱ溶液中に
懸濁させて元の成長容積に戻した。細胞画分と上清両分
のインターフェロン活性を測定した。測定の際、枯草菌
■１−Ｉ○６１４０／ｐＫＴＨ５３を対照として用いた
。測定値から次の結果が得られた。
インター７Ｉロン活性（＋、Ｕ、／ｆｆｃ）この結果か
ら上清画分中に目的とするインターフェロンが取得され
たことが判る。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の第１の部分の手順を示す図である。 第２図は、プラスミドｐＫＴＨ２１０の構造を示す図で
ある。 第３図は、α−アミラーゼ遺伝子の塩基配列の一部を示
す図である。 第４図は、組み換えＤＮＡ分子の調製法を示す図である
。 第５図は、α−アミラーゼをコードする遺伝子を含むＤ
ＮＡを示す図である。第３図が３°側から５側の方向で
示されているのに対し、第５図では５゛側から３゛側の
方向で示している。 第６図は、α−アミラーゼ遺伝子の分泌信号のヌクレオ
チド配列（最上部のヌクレオチド配列）及び分泌信号を
含むヌクレオチド配列（第２番目から最下部のヌクレオ
チド配列）を示す図である。 ｐＵＢ　１１０、ｐＫＴＨｌｏ、ｐＫＴＨ２９・・・プ
ラスミド。 ＥｃｏＲＩ、　ＢａｍＨＩ、　ＨｉｍｄＩＩＩ、Ｍ　ｂ
ｏ　Ｉ　−制限酵素 Ａ　アデニン、Ｇ・・グアニン、Ｔ・・・チミン、Ｃ、
ノトンン： Ａｌａ・・アラニン、Ａｒｇ・・アルギニン、Ａｓｎ・
・アスパラギン、Ａｓｐ・・アスパラギン酸、Ｃｙｓ・
・・ソスナイン、Ｇｉｎ・・・グルタミン、Ｇｌｕ・・
・グルタミン酸、Ｇｌｙ・グリシノ、Ｈｉｓ・・・ヒス
チジン、Ｉｌｅ　　イソロイシン、Ｌｅｕ・・ロイシン
、Ｌｙｓ・・リジン、Ｍｅｔ・メチオニン、Ｐｈｅ・フ
ェニルアラニン、Ｐｒｏ・プロリン、Ｓｅｒ・・セリン
、Ｔｈｒ・　スレオニン、Ｔｒｐ・・トリプトファン、
Ｔｙｒ・・・チロシン、Ｖａｌ・・・バリン。 ′＄２区

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）バチルス属細菌内で選択されたタンパク質または
    その一部を生産するために用いる組み換えＤＮＡ分子で
    あって、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃ
    ｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の
    α−アミラーゼ遺伝子の調節領域と分泌信号及び選択さ
    れたタンパク質またはその生物学的活性に必須の部分を
    コードするＤＮＡ鎖を含む組み換えＤＮＡ分子。
  2. （２）選択されたタンパク質またはその生物学的活性に
    必須の部分をコードするＤＮＡ鎖が、バチルス属細菌か
    ら単離されたα−アミラーゼをコードする遺伝子または
    その一部である特許請求の範囲第（１）項記載の組み換
    えＤＮＡ分子。
  3. （３）α−アミラーゼをコードする遺伝子が、第５図に
    示した塩基配列またはその一部を含む特許請求の範囲第
    （２）項記載の組み換えＤＮＡ分子。
  4. （４）組み換えＤＮＡ分子がプラスミドｐＵＢ１１０か
    ら得られるものである特許請求の範囲第（１）項〜第（
    ３）項のいずれか１つに記載の組み換えＤＮＡ分子。
  5. （５）選択されたタンパク質またはその生物学的活性に
    関して必須の部分をコードするＤＮＡ鎖が、α−アミラ
    ーゼ遺伝子の第６図に示したヌクレオチド配列のいずれ
    かに結合されている特許請求の範囲第（１）項記載の組
    み換えＤＮＡ分子。
  6. （６）ＤＮＡ鎖が、α−、β−またはγ−インターフェ
    ロン、またはその、生物学的活性に関して必須の部分を
    コードする特許請求の範囲第（１）項に記載の組み換え
    ＤＮＡ分子。
  7. （７）ＤＮＡ鎖が、エシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）のβ−ラクタマ
    ーゼ、またはその生物学的活性に必須の部分をコードす
    る特許請求の範囲第（１）項記載の組み換えＤＮＡ分子
    。
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Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH651308A5 (de) * 1980-07-01 1985-09-13 Hoffmann La Roche Interferone und deren herstellung.
US5380653A (en) * 1980-12-31 1995-01-10 The Finnish National Public Health Institute Expression vectors and methods for intracellular protein production in bascillus
EP0063953A3 (en) * 1981-04-29 1983-10-19 Biogen N.V. Bacillus cloning vectors, recombinant dna molecules, bacillus hosts transformed with them and methods for expressing foreign dna sequences and producing polypeptides coded thereby
AU561343B2 (en) * 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
US5582824A (en) * 1981-10-19 1996-12-10 Genentech, Inc. Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon
AU582112B2 (en) * 1982-02-17 1989-03-16 Lawrence E. D'antonio Purification of parasite protective antigen factors
FR2524487B1 (fr) * 1982-04-05 1985-11-22 Pasteur Institut Fragments d'adn codant pour des polypeptides contenant au moins un determinant antigenique des papillomavirus, notamment du type hpv 1a et polypeptides correspondants
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
SE8204811L (sv) * 1982-08-23 1984-02-24 Sven Lofdahl Dna-fragment innefattande en signalsekvens
JPS5939899A (ja) * 1982-08-27 1984-03-05 Gakuzo Tamura 新規ベクタ−
IT1156317B (it) * 1982-09-08 1987-02-04 Anic Spa Vettori plasmidici ad espressione in bacillus subtilis e procedimento per la loro preparazione
FR2537602B2 (fr) * 1982-09-24 1986-10-24 Centre Nat Rech Scient Nouvel adn recombinant perfectionne utile dans la preparation d'a-amylase par bacillus subtilis
DE3330003A1 (de) * 1982-10-21 1984-10-31 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig Dna-sequenz und dna-strukturen und sie verwendendes verfahren zur herstellung von penicillin-acylase
NO170594C (no) * 1982-11-01 1992-11-04 Solvay Enzymes Inc Fremgangsmaate for heterolog kloning av gen i bacillus mikroorganisme
DE3382547D1 (de) * 1983-01-12 1992-05-27 Chiron Corp Sekretorische expression in eukaryoten.
AU569722B2 (en) * 1983-01-28 1988-02-18 Saramane Pty Ltd Expression of plasmodium falciparum polypeptides from cloned cdna
NO840200L (no) * 1983-01-28 1984-07-30 Cefus Corp Glukoamylase cdna.
SE8300693L (sv) * 1983-02-09 1984-08-10 Sven Lofdahl Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta
EP0316023B1 (en) * 1983-03-08 1993-06-09 Rikagaku Kenkyusho Plasmids, methods for their construction, microorganisms carrying them and methods for the extracellular production of xylanase by cultivation of the microorganisms
US4859600A (en) * 1983-04-25 1989-08-22 Genentech, Inc. Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone
US4755465A (en) * 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
JPS59196092A (ja) * 1983-04-25 1984-11-07 Sanraku Inc 組換えプラスミドによる耐熱性α−アミラ−ゼの新規製造法
US5310675A (en) * 1983-06-24 1994-05-10 Genencor, Inc. Procaryotic carbonyl hydrolases
JPS609487A (ja) * 1983-06-29 1985-01-18 Kunio Yamane 組換ｄｎａ分子
US4554250A (en) * 1983-06-30 1985-11-19 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method of increased production of penicillin acylase and plasmid employed therein
EP0134048B2 (en) * 1983-07-06 1996-08-14 Gist-Brocades N.V. Molecular cloning and expression in industrial microorganism species
CA1311429C (en) * 1983-07-06 1992-12-15 Vasantha Nagarajan Vector for polypeptides in bacilli
JPS6091980A (ja) * 1983-07-06 1985-05-23 ジェネックス・コーポレイション プロテア−ゼ酵素の発現のための徴生物を製造する方法
US5624829A (en) * 1984-07-03 1997-04-29 Gist-Brocades, B.V. Transformed industrial bacillus strains and methods for making and using them
US4536477A (en) * 1983-08-17 1985-08-20 Cpc International Inc. Thermostable glucoamylase and method for its production
JPS6058074A (ja) * 1983-09-09 1985-04-04 Juzo Udaka バチルス・ブレビスを形質転換する方法
AU561372B2 (en) * 1983-10-10 1987-05-07 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma, The Streptokinase-coding recombinant vectors
US4855238A (en) * 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
MX9203641A (es) * 1983-12-16 1992-07-01 Genentech Inc Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion.
DD250546A1 (de) * 1983-12-16 1987-10-14 Adw Ddr Verfahren zur fermentativen herstellung einer streptokinase
US4784949A (en) * 1984-04-19 1988-11-15 Cetus Corporation Universal dominant selectable marker cassette
JPS60188070A (ja) * 1984-03-09 1985-09-25 Kunio Yamane シグナルペプチドをコードするｄｎａ
JPS60188093A (ja) * 1984-03-09 1985-09-25 Teruhiko Beppu 枯草菌に於ける形質発現プラスミド
GB8414271D0 (en) * 1984-06-05 1984-07-11 Cpc International Inc Recombinant dna
US5668255A (en) * 1984-06-07 1997-09-16 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US6022950A (en) * 1984-06-07 2000-02-08 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US4801537A (en) * 1984-06-08 1989-01-31 Genex Corporation Vector for expression of polypeptides in bacilli
JPH062074B2 (ja) * 1984-07-27 1994-01-12 國男 山根 オリゴペプチドの製法
JP2524693B2 (ja) * 1984-07-30 1996-08-14 湧永製薬株式会社 蛋白質の製造法
US5691181A (en) * 1984-08-21 1997-11-25 Celltech Limited DNA encoding lipase from human gastric mucosal tissue
GB8421210D0 (en) * 1984-08-21 1984-09-26 Celltech Ltd Polypeptide and polypeptide composition
US5126264A (en) * 1984-09-11 1992-06-30 The Walter & Eliza Hall Institute Of Medical Research The RESA and FIRA antigens of plasmodium falciparum
JPS61268183A (ja) * 1985-05-24 1986-11-27 Wakamoto Pharmaceut Co Ltd Ｄｎａ，組換体ｄｎａおよびそれらを含む微生物
US4963495A (en) * 1984-10-05 1990-10-16 Genentech, Inc. Secretion of heterologous proteins
IT1177378B (it) * 1984-12-11 1987-08-26 Anic Spa Vettore plasmidico psm112 ad espressione in bacillus subtilis
JPH0817702B2 (ja) * 1984-12-28 1996-02-28 理化学研究所 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物
JP2500311B2 (ja) * 1985-03-19 1996-05-29 工業技術院長 蛋白製造法
JPS61177996A (ja) * 1985-02-02 1986-08-09 Green Cross Corp:The インタ−フエロン−γの製造法
US4783415A (en) * 1985-03-28 1988-11-08 Meiji Seika Kabushiki Kaisha Gene coding for signal peptides and utilization thereof
EP0221923A4 (en) * 1985-03-29 1990-03-22 Bioteknika International SECRETION VECTOR.
SE459503B (sv) * 1985-05-03 1989-07-10 Excorim Kommanditbolag Hybrid-dna-molekyl innefattande dna-sekvens som kodar foer protein g samt foerfarande foer framstaellning av protein g
JPS623796A (ja) * 1985-06-28 1987-01-09 Ajinomoto Co Inc インタ−ロイキン２の製造法
JP2620852B2 (ja) * 1985-07-30 1997-06-18 理化学研究所 新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物
FR2586428B1 (fr) * 1985-08-26 1988-11-25 Pasteur Institut Polypeptides et anticorps, caracteristiques du papillomavirus et leurs applications au diagnostic in vitro, a la prevention et/ou la lutte contre des infections a papillomavirus
US5024943A (en) * 1985-11-07 1991-06-18 Gist-Brocades Regulatory region cloning and analysis plasmid for bacillus
JPH0669377B2 (ja) * 1985-11-25 1994-09-07 工業技術院長 Ｄｎａ塩基配列およびベクタ−
US5278059A (en) * 1985-12-04 1994-01-11 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaki Kenkyujo Polypeptide possessing cyclomaltodextrin glucanotransferase activity
GB2191491B (en) * 1986-04-25 1990-12-05 Labofina Sa Dna segment coding for a specific lipase, vectors for the expression thereof, microorganisms transformed by these vectors and use of these microorganisms for
US5486473A (en) * 1986-05-06 1996-01-23 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University A DNA coding for a Flavivirus antigen
US5200509A (en) * 1987-04-06 1993-04-06 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Human somatomedin carrier protein subunits and process for producing them; recombinant DNA molecules, hosts, processes and human somatomedin carrier protein-like polypeptides
US5885770A (en) * 1987-04-22 1999-03-23 Institut Pasteur Polypeptides and antibodies characteristic of papillomavirus, and diagnostic procedures and vaccines making use of them
AU5027890A (en) * 1989-02-10 1990-09-05 Genesit Oy A method for producing pertussis toxin subunits
ES2120409T3 (es) * 1989-02-10 1998-11-01 Spectrum Medical Sciences Ltd Nuevos vectores de expresion y metodos para la produccion de proteinas intracelulares.
US5162207A (en) * 1989-07-07 1992-11-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Sucrose inducible expression vectors for bacillus sp.
DK16490D0 (da) * 1990-01-19 1990-01-19 Novo Nordisk As Enzym
NL9001388A (nl) 1990-06-19 1992-01-16 Unilever Nv Recombinant dna, cel die daarvan afgeleid dna bevat, enzym waarvoor het recombinant dna codeert en toepassingen daarvan.
US5705362A (en) * 1992-05-25 1998-01-06 Gist-Brocades, N.V. Modified signal sequences
US5712118A (en) * 1993-09-29 1998-01-27 Research Foundation Of State University Of New York Vaccine for branhamella catarrhalis
US6121427A (en) * 1994-10-24 2000-09-19 Connaught Laboratories Limited Major outer membrane protein CD of branhamella
US20160367620A1 (en) 2015-06-19 2016-12-22 Harry B. Demopoulos Glutathione
CN111378646A (zh) * 2018-12-27 2020-07-07 北京贝瑞和康生物技术有限公司 一种快速单反应管提取长片段基因组dna的方法和试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5519092A (en) * 1978-06-08 1980-02-09 Harvard College Selected protein producing method

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1521032A (en) * 1974-08-08 1978-08-09 Ici Ltd Biological treatment
DE2712615A1 (de) * 1977-03-18 1978-09-21 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur herstellung von filamentoesen phagen als vektor fuer synthetische rekombinate
AT373279B (de) * 1977-11-08 1984-01-10 Genentech Inc Verfahren zur herstellung eines rekombinationsclonbildungstraegers
DE2759053A1 (de) * 1977-12-30 1979-07-12 Uhlin Verfahren zum herstellen von genprodukten von plasmid-dns
IL58308A (en) * 1978-10-23 1983-10-31 Upjohn Co Process for preparing glucose isomerase using a recombinant plasmid
GB2048894A (en) * 1979-05-11 1980-12-17 Gist Brocades Nv Plasmid
IL61982A (en) * 1980-02-15 1984-01-31 Cpc International Inc Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes
AU545912B2 (en) * 1980-03-10 1985-08-08 Cetus Corporation Cloned heterologous jive products in bacillies
ES8205432A1 (es) * 1980-03-17 1982-06-01 Harvard College Un metodo de determinar la cantidad de un polipeptido enca- riotico o procariotico producido por un microorganismo
US4338397A (en) * 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
JP2718033B2 (ja) * 1987-08-13 1998-02-25 日産自動車株式会社 自律走行車両制御装置

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5519092A (en) * 1978-06-08 1980-02-09 Harvard College Selected protein producing method

Also Published As

Publication number Publication date
AT380695B (de) 1986-06-25
SE452632B (sv) 1987-12-07
US5010015A (en) 1991-04-23
SE8107812L (sv) 1982-07-01
JPS57132895A (en) 1982-08-17
FI64813C (fi) 1984-01-10
DE3152001C2 (ja) 1992-05-21
SE8702885L (sv) 1987-07-16
CH668080A5 (de) 1988-11-30
GB2091268A (en) 1982-07-28
GB2133408A (en) 1984-07-25
ATA560181A (de) 1985-11-15
US5010000A (en) 1991-04-23
SE8702885D0 (sv) 1987-07-16
GB2133408B (en) 1985-01-30
BE891659A (fr) 1982-04-16
FR2501230A1 (fr) 1982-09-10
GB8332576D0 (en) 1984-01-11
DE3153403C2 (ja) 1992-01-02
FI64813B (fi) 1983-09-30
CH659480A5 (de) 1987-01-30
FR2501230B1 (fr) 1985-09-13
DE3152001A1 (de) 1982-07-29
FI804081L (fi) 1982-07-01
SE453513B (sv) 1988-02-08
GB2091268B (en) 1984-12-05
FR2526040A1 (fr) 1983-11-04
FR2526040B1 (fr) 1985-08-30
CA1211726A (en) 1986-09-23

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